ES2300366T3 - Oligonucleotidos antisentido contra el vr1. - Google Patents
Oligonucleotidos antisentido contra el vr1. Download PDFInfo
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Abstract
Oligonucleótido que contiene o se corresponde con una secuencia de bases de acuerdo con una de las subdivisiones (b) a (j) de una de las figuras 1/27, 2/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 10/27, 11/27, 12/27, 13/27, 14/27, 15/27 ó 16/27, o una secuencia que se diferencia de ésta en como máximo una base distinta, no encontrándose dicha diferencia de base en la región de secuencia representada en la subdivisión (a), caracterizado porque el oligonucleótido presenta una longitud de 15 a 30, preferentemente de 15 a 25, en particular de 17 a 19, o de exactamente 18 nucleótidos.
Description
Oligonucleótidos antisentido contra el VR1.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención se refiere a oligodesoxinucleótidos
antisentido contra el VR1, a sus correspondientes constructos de
nucleótidos, a células que contienen estos constructos, a
medicamentos y procedimientos de diagnóstico, a su utilización en
la terapia del dolor y a procedimientos para la diagnosis con
síntomas relacionados con el VR1 y para la identificación de
sustancias moduladoras del dolor.
El tratamiento eficaz del dolor es uno de los
grandes retos de la medicina molecular. El dolor agudo y transitorio
es una importante señal del cuerpo para preservar a las personas
contra daños graves producidos por el entorno o por sobrecarga del
cuerpo. En cambio, el dolor crónico, que dura más que la causa del
dolor y el tiempo previsible de curación, no tiene ninguna función
biológica conocida y afecta a cientos de millones de personas en
todo el mundo. Alrededor de 7,5 millones de personas sufren dolores
crónicos sólo en Alemania. Por desgracia, el tratamiento
farmacológico del dolor crónico todavía no es satisfactorio y, en
consecuencia, sigue siendo un reto para la investigación médica
actual. Los analgésicos existentes en la actualidad con frecuencia
no son suficientes y, en parte, tienen graves efectos
secundarios.
Por ello, a menudo se buscan nuevas dianas
(targets), estructuras endógenas, con los que parezca posible
lograr un efecto modulador del dolor, por ejemplo principios
activos de bajo peso molecular u otros compuestos tales como
oligodesoxinucleótidos (ODN) antisentido, principalmente para el
tratamiento del dolor crónico. El receptor vainilloide subtipo 1
(VR1, conocido también como receptor de capsaicina), clonado por
Caterina y col. (1997), es un punto de partida prometedor para el
desarrollo de nuevos medicamentos para el dolor. Se trata de un
canal de cationes expresado predominantemente por neuronas
sensoriales primarias (Catarina y col. 1997). El VR1 es activado
por la capsaicina, un componente del chile, calor (>43ºC) y pH
bajo (protones) a causa de lesiones tisulares, y provoca una
afluencia de calcio en las aferencias primarias. Ratones
"VR1-knockout" no desarrollaron ninguna
hiperalgesia térmica después de sufrir lesiones tisulares o
inflamaciones (Caterina y col., 2000; Davis y col., 2000).
Los oligodesoxinucleótidos (ODN) antisentido,
ribozimas y otros ácidos nucleicos catalíticos pueden utilizarse
para tratar principalmente el dolor crónico, mediante degradación o
modificación del mRNA de dianas seleccionadas - en el caso de esta
invención del receptor vainilloide subtipo 1 (VR1) arriba descrito
(Catarina y col. 1997) - regulando la reducción de su expresión y,
con ello, disminuyendo la cantidad de receptores por célula. Los
ODN se fijan por adición al mRNA y, por un lado, bloquean la
traducción y, por otro, inician la degradación del mRNA por la
RNAsa H, que disocia el RNA en un dúplex DNA/RNA. Porreca y col.
(1999) lograron demostrar que ODN aplicados por vía intratecal
contra el canal PN3/SNS en la rata impiden el desarrollo de
hiperalgesia y alodinia por lesiones nerviosas o tisulares
crónicas.
Aunque es conocida la secuencia del VR1, para
lograr un bloqueo y la disociación del mRNA es sumamente importante
la selección de los oligodesoxinucleótidos antisentido, ribozimas y
otros ácidos nucleicos catalíticos adecuados. Normalmente, el mRNA
de la diana está plegado y sólo presenta unos pocos lugares
accesibles para una fijación por adición y disociación
subsiguiente. Sin embargo, en el estado actual de la técnica no se
tiene ningún conocimiento sobre cómo seleccionar adecuadamente los
ODN.
Por consiguiente, el objetivo del presente
documento consistía en desarrollar oligodesoxinucleótidos
antisentido y ácidos nucleicos catalíticos y también los ribozimas
correspondientes contra el mRNA del receptor vainilloide. En
consecuencia, un objeto de la invención consiste en un
oligonucleótido que contiene o se corresponde con una secuencia de
bases de acuerdo con una de las subdivisiones (b) a (j) de una de
las Figuras 1/27, 2/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 10/27,
11/27, 12/27, 13/27, 14/27, 15/27 ó 16/27, o una secuencia que se
diferencia de ésta en como máximo una base distinta, no
encontrándose dicha diferencia de base en la región de secuencia
representada en la subdivisión (a). En el sentido de esta invención,
el término "oligonucleótido" significa una molécula de 15 a 30
nucleótidos.
Otro objeto de la invención consiste en un
oligonucleótido que contiene o se corresponde con una secuencia de
bases de acuerdo con una de las subdivisiones (b) a (j) de una de
las Figuras 1/27, 2/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27,
10/27, 11/27, 12/27, 13/27, 14/27, 15/27 ó 16/27.
Otro objeto de la invención consiste en un
oligonucleótido que contiene o se corresponde con una secuencia de
bases de acuerdo con la subdivisión (k) de una de las Figuras 1/27,
2/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 10/27, 11/27, 12/27,
13/27, 14/27, 15/27 ó 16/27, o una secuencia que se diferencia de
ésta en como máximo dos bases distintas, preferentemente en una
base, no encontrándose dicha o dichas diferencias de bases en la
región de secuencia representada en la subdivisión (a).
Otro objeto de la invención consiste en un
oligonucleótido que contiene o se corresponde con una secuencia de
bases de acuerdo con la subdivisión (k) de una de las Figuras 1/27,
2/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 10/27, 11/27,
12/27, 13/27, 14/27, 15/27 ó 16/27.
Un objeto preferente de la invención consiste en
un oligonucleótido según la invención de acuerdo con una de las
formas de oligonucleótidos según la invención anteriormente
mencionadas, que presenta una longitud de 15 a 30, preferentemente
de 15 a 25, en particular de 17 a 19 o exactamente 18
nucleótidos.
Un objeto preferente de la invención consiste en
un oligonucleótido según la invención que presenta como mínimo una
ribosa modificada o no modificada, como mínimo un enlace
fosfodiéster modificado o no modificado y/o como mínimo una base
modificada o no modificada.
Un objeto totalmente preferente de la invención
consiste en un oligonucleótido según la invención en el que como
mínimo uno de los nucleótidos y en particular varios de los
nucleótidos son "locked nucleic acids" ("LNAs")
(ácidos nucleicos bloqueados), o como mínimo uno de los nucleótidos
y en particular todos los nucleótidos son fosfotioatos,
preferentemente uno en el que varios de los nucleótidos son
"locked nucleic acids" ("LNAs"). Los "locked
nucleic acids" ("LNAs") son ribonucleótidos que
contienen un puente metileno que une el oxígeno 2' de la ribosa con
el carbono 4' (véase la Figura 27). Braasch D.A. y Corey D.R. (2001)
presentan una vista de conjunto de los LNAs en Locked Nucleic Acids
(LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA,
Chem. Biol, 8, 1-7. Este artículo forma parte
explícita de la presente descripción y exposición. Se pueden
adquirir los LNAs, por ejemplo, de la firma Proligo, Boulder, CO,
EEUU. Los fosfotioatos también son conocidos por los especialistas
y se pueden encargar por ejemplo a MWG-Biotech AG,
Ebersberg, Alemania.
Aquí son preferentes los oligonucleótidos en los
que los "LNAs" se encuentran en los extremos 5' y 3' de los
oligonucleótidos, preferiblemente, en cada caso, los
2-5 últimos nucleótidos, en particular en cada caso
los 3 ó 4 últimos nucleótidos de los extremos 3' y 5' del
oligonucleótido son "LNAs", y/o
en los que > 6, en particular \geq 8,
nucleótidos seguidos en el oligonucleótido no son "LNAs",
preferiblemente en los que, de los nucleótidos representados en la
región de secuencia de acuerdo con la subdivisión (a)
correspondiente del oligonucleótido según una de las Figuras 1 a 16
subdivisiones (b) a (k), en cada caso, ninguno o como máximo uno de
los nucleótidos es un "LNA".
De forma especialmente preferente, los
oligonucleótidos modificados con LNA o con fosfotioatos consisten en
un oligonucleótido A según la invención o en un oligonucleótido B
según la invención, preferentemente en un oligonucleótido B según
la invención (véase más arriba).
En general, un objeto independiente especial de
la invención consiste en un ácido nucleico, en particular en
oligopéptidos, donde varios de los nucleótidos son "locked
nucleic acids" ("LNAs"), encontrándose los "LNAs"
en los extremos 5' y 3' del oligonucleótido, preferiblemente en cada
caso los 2-5 últimos nucleótidos, en particular en
cada caso los 3 ó 4 últimos nucleótidos, de los extremos 3' y 5' del
oligonucleótido son "LNAs", y/o en los que > 6, en
particular \geq 8, nucleótidos seguidos en el oligonucleótido no
son "LNAs". Las formas de realización descritas hasta ahora
con respecto a los LNAs también son aplicables a este objeto.
Otro objeto preferente consiste en un constructo
de polinucleótido que contiene como mínimo un oligonucleótido según
la invención. El concepto "constructo de polinucleótido" se ha
de entender aquí en un sentido muy amplio. Incluye RNA y DNA y
nucleótidos con una longitud a partir de como mínimo 20 nucleótidos.
En este contexto, "constructo de polinucleótido
(recombinante)" es una designación general para todo tipo de
moléculas de DNA o RNA formadas por ligadura in vitro de
moléculas de DNA o RNA. Por "polinucleótido" se entiende
lo siguiente: el nucleótido básico es un componente fundamental de
los ácidos nucleicos consistente fundamentalmente en una base
nucleína, una pentosa y ácido fosfórico. Éste corresponde a un
polinucleótido de alto peso molecular formado por varios
nucleótidos unidos entre sí a través de la esterificación de ácido
fosfórico-pentosa. No obstante, la invención
también incluye polinucleótidos modificados que, si bien conservan
la secuencia de bases, disponen de un esqueleto modificado en lugar
del ácido fosfórico-pentosa.
Otro objeto preferente consiste en un constructo
de polinucleótido que contiene, en dos regiones separadas entre sí,
las dos secuencias parciales de nucleótidos de la sección I y de la
sección III según una de las subdivisiones (l) - (n) o las dos
secuencias parciales de nucleótidos de la hélice I y la hélice III
según una de las subdivisiones (o) - (q) de una de las Figuras
1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27
ó 15/27, o secuencias parciales de nucleótidos que se diferencian de
estas secuencias parciales de nucleótidos en como máximo una base.
Para más detalles sobre la división de las dos regiones, véase la
Figura 24 (hélice I y hélice III/ribozima) y Santoro y col. (1997),
FIGURA 2, p. 4264 (sección I y sección
III/DNA-enzima).
Otro objeto preferente consiste en un constructo
de polinucleótido que codifica como mínimo un oligonucleótido según
la invención. En este contexto se ha de entender un DNA legible o un
vector que contiene DNA o RNA, cuyo producto es o puede ser un
oligonucleótido según la invención.
Otro objeto preferente consiste en un constructo
de polinucleótido según la invención que se trata de una ribozima,
una DNA-enzima, un vector, en particular un vector
de expresión, o un PNA.
En general, en el sentido de esta invención se
han de tener en cuenta las siguientes definiciones:
- -
- Vector (de clonación): Designación general para moléculas de ácido nucleico que durante la clonación actúan como portadores de genes extraños o de partes de estos genes.
- -
- Vector de expresión: Designación para vectores de clonación especialmente construidos que, después de introducirlos en una célula huésped adecuada, permiten la transcripción y traducción del gen extraño incorporado por clonación en el vector.
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- PNA: Abreviatura internacional usual de peptidic nucleic acids (ácidos nucleicos peptídicos). En este contexto, los aminoácidos enlazados peptídicamente forman una cadena, portando los aminoácidos como cadena lateral una base apta para la hibridación con DNA o RNA.
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- Secuencia: Sucesión de nucleótidos o aminoácidos. En el sentido específico de esta invención, con este término se hace referencia a la secuencia de ácidos nucleicos.
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- Ribozima: Designación para un ácido ribonucleico catalíticamente activo (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa), véanse por ejemplo las ribozimas de cabeza de martillo según las Figuras 24 y 25 y la descripción de las figuras, o véase Vaish, N.K. y col. (1998), Nucl. Acid Res 26, 5237 - 5242.
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- DNA-enzima: Designación para una molécula de DNA que posee actividad catalítica (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa), véase por ejemplo DNA-enzima 10-23 según la Figura 26 y la descripción de la figura, o véase Santaro y Joyce (1997), Proc. Natl. Acad. Sci., EEUU, 94, 4262-4266.
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- RNA/DNA catalítico: Designación general para ribozimas o DNA-enzimas (véase más arriba).
Otro objeto preferente consiste en un constructo
de polinucleótido según la invención que contiene, en dos regiones
separadas entre sí, las dos secuencias parciales de nucleótidos tal
como se describen más arriba, y que consiste en una ribozima,
preferentemente una ribozima de "cabeza de martillo"
("hammerhead"), o una DNA-enzima de
tipo 10-23 ó 12-32. En este
contexto, de forma especialmente preferente y adecuada se trata de
una DNA-enzima que contiene como mínimo las
secuencias parciales de nucleótidos de la sección I y la sección
III según una de las subdivisiones (l) a (n), preferentemente (n),
de una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27,
9/27, 11/27, 12/27 ó 13/27,
- -
- preferentemente 1/27, 3/27, 7/27 u 11/27, en particular 1/27 ó 3/27, o
- -
- preferentemente 4/27, 6/27, 8/27 ó 12/27, en particular 4/27 ó 12/27.
También es especialmente preferente y adecuado
que el constructo de polinucleótido consista en una ribozima
conteniendo como mínimo las secuencias parciales de nucleótidos de
la hélice I y la hélice III según una de las subdivisiones (o) a
(q), preferentemente (o), de una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27,
5/27, 6/27, 8/27, 11/27 ó 12/27,
- -
- preferentemente 1/27, 3/27 u 11/27, en particular 11/27, o
- -
- preferentemente 4/27, 6/27, 8/27 ó 12/27, en particular 4/27 ó 12/27.
En concreto, una forma de realización preferente
se desprende principalmente de las Figuras 24/27 y 25/27. La figura
24/27 muestra una representación general de una ribozima de
"cabeza de martillo" según Vaish, N.K. y col. (1998), Nucl.
Acid Res. 26, 5237 - 5242, con los "brazos de reconocimiento"
de la hélice I y la hélice III donde se insertan respectivamente
las hélices I y III según la invención de acuerdo con las
subdivisiones (o) - (q) de una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27,
5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27, para
obtener las ribozimas de "cabeza de martillo" según la
invención. En este contexto, la sección de la hélice I en cada caso
de una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27,
9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27 sustituye a los nucleótidos
deseados de la hélice I según la Figura 24/27, de modo que el primer
nucleótido del extremo 3' de la hélice I en cada caso de una de las
Figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27,
12/27, 13/27 ó 15/27 sustituye al primer nucleótido "N" deseado
en el extremo 3' de la hélice I de la Figura 24/27, y los
siguientes nucleótidos "N" deseados de la hélice I de la Figura
24/27 en dirección hacia el extremo 5' son sustituidos por los
nucleótidos mostrados en una de las subdivisiones (o) a (q) de la
hélice I en cada caso de una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27,
6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27. Los
nucleótidos "A" y "C" del extremo 5' de la hélice III de
una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27,
11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27 sustituyen respectivamente a los
nucleótidos "A" y "C" de la hélice III de la Figura 24/27,
y los siguientes nucleótidos "N" deseados de la hélice III de
la Figura 24/27 en dirección hacia el extremo 5' son sustituidos por
los nucleótidos mostrados en una de las subdivisiones (o) - (q) de
la hélice III en cada caso de una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27,
5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27. La Figura
25/27 muestra un ejemplo concreto. La ribozima de "cabeza de
martillo" V16 (7/7) se basa en la Figura 24/27 y la Figura 11/27.
El término "Ribozima V16 (7/7)" significa que la enzima está
dirigida contra el sitio GUC del oligo V16 y contiene en cada uno
de los "brazos de reconocimiento" 7 nucleótidos (hélice I y
hélice III), en este caso de acuerdo con la hélice I y la hélice
III de la subdivisión (o) de la Figura 11. Lo mismo es aplicable a
todas las ribozimas de acuerdo con las subdivisiones (o a q) de
cada una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27,
9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27.
Una forma de realización preferente concreta se
desprende principalmente de la Figura 26/27. La Figura 26/27
muestra una representación general de una DNA-enzima
de tipo "10-23" según Santoro y col., 1997,
figura 2, p. 4264. La cadena superior indicada con una flecha es la
cadena de RNA a disociar y la flecha señala el sitio de
disociación, y la inferior es una representación de la
DNA-enzima. En relación con la presente solicitud,
en la cadena superior "Y" = "U" y "R" = "G", y
en dirección hacia el extremo 3' desde "Y" hay un "C". En
consecuencia, el sitio de disociación de la cadena superior es un,
así llamado, sitio GUC (véase más arriba). Correspondientemente, en
la cadena inferior "R" = "A" y en dirección hacia el
extremo 5' desde "R" en la cadena inferior hay igualmente un
"G". A éste se le unen en dirección hacia el extremo 5' los
otros nucleótidos de la sección I de acuerdo con las subdivisiones
(l a n) en cada caso de una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27,
6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27, es decir, 5
nucleótidos adicionales en el caso de la subdivisión l, 6
nucleótidos adicionales en el caso de la subdivisión m y 7
nucleótidos adicionales en el caso de la subdivisión n. En la
sección III de la Figura 25/27 - la segunda sección con
emparejamiento de bases con el RNA -, al "A" no emparejado
contiguo a la sección III se le unen directamente desde la dirección
del extremo 5' hacia el extremo 3' los nucleótidos de la sección
III de acuerdo con las subdivisiones (l a n) en cada caso de una de
las Figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27,
12/27, 13/27 ó 15/27, es decir, 7 nucleótidos adicionales en el
caso de la subdivisión l, 8 nucleótidos adicionales en el caso de la
subdivisión m y 9 nucleótidos adicionales en el caso de la
subdivisión n. La sección III y la sección I son los llamados
"brazos de reconocimiento" de la DNA-enzima
(véase más abajo, Ejemplo 3).
Por consiguiente, la DNA-enzima
de tipo "10-23" para la subdivisión (n) de la
Figura 1/27 especialmente preferente en el marco de la invención
tendría la siguiente secuencia, donde la sección subrayada estaría
en emparejamiento de bases con el RNA:
ATGTCATGA
(=R) - GGCTAGCTACAACGA -
GGTTAGGGG
Esta DNA-enzima se denominaría
V15 (9/9), indicando esta nomenclatura que la enzima está dirigida
contra el sitio GUC del oligo V15 y contiene 9 nucleótidos en cada
uno de los "brazos de reconocimiento" (secciones I y III), por
ejemplo según la sección I y la sección III de la subdivisión (n) de
la Figura 1. Lo mismo es aplicable a todas las
DNA-enzimas de acuerdo con las subdivisiones (l a n)
en cada caso de una de las Figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27,
7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27.
Otro objeto preferente consiste en un constructo
de polinucleótido según la invención, que presenta como mínimo una
ribosa modificada o no modificada, como mínimo enlace fosfodiéster
modificado o no modificado y/o como mínimo una base modificada o no
modificada.
Otro objeto preferente consiste en un
oligonucleótido según la invención o un constructo de polinucleótido
según la invención, que está unido a un soporte, en particular a
una proteína, preferentemente a tet-, transportina o ferritina, y/o
empaquetado en un liposoma.
Otro objeto preferente consiste en una célula
que contiene como mínimo un oligonucleótido según la invención y/o
un constructo de polinucleótido según la invención.
Otro objeto de la invención consiste en un
medicamento que contiene como mínimo un oligonucleótido según la
invención, un constructo de polinucleótido según la invención y/o
una célula según la invención, y en caso dado también sustancias
auxiliares y/o aditivos adecuados. Los medicamentos según la
invención se pueden administrar como medicamentos líquidos en forma
de soluciones para inyección, gotas o jugos, como medicamentos
semisólidos en forma de granulados, tabletas, pastillas, parches,
cápsulas, emplastos o aerosoles y, además de como mínimo uno de los
objetos de la invención, dependiendo de la forma galénica, también
puede contener en caso dado materiales de carga, sustancias de
relleno, disolventes, diluyentes, colorantes y/o ligantes. La
selección de los materiales auxiliares y de las cantidades a
utilizar de los mismos depende de si el medicamento se ha de
administrar por vía oral, peroral, parenteral, intravenosa,
intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intranasal, bucal,
rectal o local, por ejemplo sobre infecciones de la piel, las
mucosas y en los ojos. Para la administración oral son adecuados
los preparados en forma de tabletas, grageas, cápsulas, granulados,
gotas, jugos y jarabes, y para la administración parenteral, tópica
y por inhalación son adecuadas las soluciones, suspensiones,
preparados secos de fácil reconstitución y aerosoles. Los objetos de
la invención en un depósito, en forma disuelta o en un emplasto,
dado el caso añadiendo agentes promotores de la penetración en la
piel, son preparados adecuados para la administración percutánea.
Los preparados a utilizar por vía oral o percutánea pueden liberar
los objetos de la invención de forma retardada. La cantidad de
principio activo a administrar a los pacientes varía en función del
peso del paciente, del tipo de administración, de la indicación y de
la gravedad de la enfermedad. Normalmente se administran de 2 a 500
mg/kg de como mínimo un objeto de la invención. Si el medicamento
se ha de utilizar principalmente para la terapia genética, como
sustancias auxiliares o aditivos adecuados son recomendables, por
ejemplo, soluciones fisiológicas salinas, estabilizantes,
inhibidores de proteinasa, de DNAsa, etc.
Otro objeto preferente consiste en un
diagnóstico que contiene como mínimo un oligonucleótido según la
invención, un constructo de polinucleótido según la invención y/o
una célula según la invención, y en caso dado también aditivos
adecuados.
En este contexto se han de tener en cuenta las
siguientes definiciones:
- -
- Medicamento: Sustancia correspondiente a la definición dada en el Artículo 1\NAK2 de la Ley Reguladora del Tráfico de Medicamentos (AMG) alemana. Es decir, sustancias o preparados de sustancias designados para ser utilizados en el cuerpo humano o animal con el fin de:
- 1.
- curar, mitigar, prevenir o reconocer enfermedades, dolencias, daños corporales o molestias patológicas;
- 2.
- permitir reconocer la condición, el estado o las funciones del cuerpo o estados anímicos;
- 3.
- sustituir principios activos o fluidos generados por el cuerpo humano;
- 4.
- rechazar, eliminar o hacer inocuos agentes patógenos, parásitos o sustancias exógenas; o
- 5.
- influir en la condición, el estado o las funciones del cuerpo o estados anímicos.
- -
- Diagnóstico: Compuesto o procedimiento a utilizar para diagnosticar una enfermedad.
Otro objeto preferente consiste en la
utilización de como mínimo un oligonucleótido según la invención, un
constructo de polinucleótido según la invención y/o una célula
según la invención, para producir un medicamento para el
tratamiento del dolor, en particular del dolor crónico, alodinia
táctil, dolores provocados térmicamente y/o dolores
inflamatorios.
Otro objeto preferente consiste en la
utilización de como mínimo un oligonucleótido según la invención, un
constructo de polinucleótido según la invención y/o una célula
según la invención, para producir un medicamento para el
tratamiento de la incontinencia urinaria, también de síntomas
vesicales neurógenos; prurito, tumores, inflamaciones, en
particular inflamaciones asociadas al receptor VR1 con síntomas como
asma; y también de todos los síntomas de enfermedad relacionados
con el VR1.
Otro objeto preferente consiste en un
procedimiento para la identificación de sustancias moduladoras del
dolor, caracterizado porque la identificación tiene lugar a través
de una cuantificación de la unión de como mínimo un oligonucleótido
según la invención, preferentemente marcado, o de como mínimo un
constructo de polinucleótido según la invención con un RNA.
Otro objeto preferente consiste en un
procedimiento para la identificación de sustancias moduladoras del
dolor que incluye los siguientes pasos:
- (a)
- manipulación por ingeniería genética de como mínimo una célula (célula de ensayo) con como mínimo un oligonucleótido según la invención y/o con un constructo de polinucleótido según la invención;
- (a')
- manipulación paralela por ingeniería genética de como mínimo una célula idéntica (célula de control) de uno de los siguientes modos
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- (b)
- incubación paralela de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con como mínimo una célula de ensayo y como mínimo una célula de control y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una proteína receptora seleccionada de entre la familia de los receptores vainilloides, preferentemente el receptor VR-1;
- (c)
- medida de la unión de la sustancia de ensayo con la proteína sintetizada por las células o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo con la proteína receptora;
- (d)
- identificación de las sustancias mediante la cuantificación de la diferencia entre el valor de medida en la célula de ensayo y el de la célula de control.
En este contexto, el concepto "modulador del
dolor" se refiere a una influencia reguladora potencial del dolor
fisiológico, en particular a un efecto analgésico. El término
"sustancia" incluye cualquier compuesto adecuado como
principio activo medicamentoso, por consiguiente particularmente
principios activos de bajo peso molecular, pero también otros como
ácidos nucleicos, grasas, azúcares, péptidos o proteínas como
anticuerpos. Por "incubación bajo condiciones adecuadas" se ha
de entender que la sustancia a examinar puede reaccionar con la
célula o con el preparado correspondiente en un medio acuoso
durante un tiempo determinado antes de la medida. La temperatura
del medio acuoso se puede regular, por ejemplo entre 4ºC y 40ºC,
preferentemente a temperatura ambiente o a 37ºC. El tiempo de
incubación puede variar entre unos segundos y varias horas,
dependiendo de la interacción de la sustancia con el receptor. No
obstante son preferentes tiempos de incubación de 1 minuto a 60
minutos. El medio acuoso puede contener sales y/o sistemas tampón
adecuados, de modo que durante la incubación se mantenga en el
medio un pH de por ejemplo entre 6 y 8, preferentemente un pH de 7,0
- 7,5. También se pueden añadir al medio otras sustancias adecuadas
tales como coenzimas, nutrientes, etc. Los especialistas pueden
determinar fácilmente las condiciones adecuadas en función de la
interacción examinada de la sustancia con el receptor basándose en
su experiencia, en la literatura o en ensayos preliminares
sencillos, con el fin de obtener el valor de medida más claro
posible en el procedimiento. Una célula que ha sintetizado un
receptor es una célula que ya ha expresado este receptor de forma
endógena o una célula que ha sido modificada por ingeniería genética
de tal modo que expresa dicho receptor y, por ello, contiene el
receptor antes del comienzo del procedimiento según la invención.
Las células pueden ser células de líneas celulares, dado el caso
inmortalizadas, o células nativas procedentes de tejidos y aisladas
de éstos, estando la agrupación celular disuelta en la mayoría de
los casos. El preparado de estas células incluye principalmente
materiales homogeneizados celulares, el citosol, una fracción de
membrana de las células con fragmentos de membrana, una suspensión
de organelas celulares aisladas, etc.
La escala a través de la cual el procedimiento
permite hallar sustancias de interés consiste bien en la unión al
receptor, que se puede comprobar por ejemplo mediante desplazamiento
de un ligando conocido o mediante la cuantificación de la sustancia
unida, o bien en la modificación de un parámetro funcional debida a
la interacción de la sustancia con el receptor. Esta interacción
puede consistir principalmente en una regulación, inhibición y/o
activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, y los
parámetros funcionales modificados pueden ser, por ejemplo, la
expresión genética, el medio de iones, el pH o el potencial de
membrana, o la variación de la actividad enzimática o de la
concentración del 2º mensajero. En este contexto se han de tener en
cuenta las siguientes definiciones:
- -
- Manipulado por ingeniería genética: Manipulación de células, tejidos u organismos de tal modo que se introduce material genético en los mismos.
- -
- Expresado de forma endógena: Expresión de una proteína que presenta una línea celular bajo condiciones de cultivo adecuadas, sin que dicha expresión de la proteína haya sido inducida mediante manipulación por ingeniería genética.
En otra forma de realización preferente de este
procedimiento está previsto que la célula sea manipulada por
ingeniería genética antes de los pasos de procedimiento (a) y
(a').
En otra forma de realización preferente de este
procedimiento está previsto que la manipulación por ingeniería
genética permita medir como mínimo uno de los parámetros funcionales
modificados por la sustancia de ensayo.
En otra forma de realización preferente de este
procedimiento está previsto que, mediante manipulación por
ingeniería genética, se exprese una forma de un miembro de la
familia de los receptores vainilloides, preferentemente del
receptor VR-1, que no es expresada de forma endógena
en la célula, o se introduzca un gen indicador.
En otra forma de realización preferente de este
procedimiento está previsto que la medida de la unión tenga lugar a
través del desplazamiento de un ligando marcado conocido de un
miembro de la familia de los receptores vainilloides,
preferentemente del receptor VR-1.
En otra forma de realización preferente de este
procedimiento está previsto que entre los pasos de procedimiento
paralelos (a) y (a') y el paso de procedimiento (b) transcurran
\geq 8 h, preferentemente \geq 12 h, en particular \geq 24
h.
Otro objeto preferente consiste en un
procedimiento para la diagnosis de cuadros clínicos relacionados con
la expresión modificada de genes de la familia de los receptores
vainilloides, caracterizado porque la diagnosis tiene lugar a
través de una cuantificación de la unión de un oligonucleótido según
la invención y/o de como mínimo un constructo de polinucleótido
según la invención con un RNA.
Los oligonucleótidos y también los constructos
de polinucleótido se preparan mediante procedimientos conocidos por
los especialistas. En este contexto se sintetizan nucleótidos, en
particular también oligonucleótidos, por ejemplo a modo de la
síntesis de Merryfield, en un soporte insoluble (H.G. Gassen y col.,
Chemical and Enzymatic Synthesis of Genefragments (Editorial
Chemie, Weinheim 1982)) o de otro modo (Beyer/Walter; Lehrbuch der
Organischen Chemie, 20 edición, (Editorial S. Hirzel, Stuttgart
1984), pp. 816 y siguientes).
Otro objeto de la invención consiste en un
procedimiento para el tratamiento, en particular para el tratamiento
del dolor, de un humano o un mamífero no humano que requiera un
tratamiento contra el dolor, en particular el dolor crónico,
mediante la administración de un medicamento según la invención, en
particular de un medicamento que contiene un oligonucleótido según
la invención y/o un constructo de polinucleótido según la invención.
Otro objeto también consiste en los procedimientos correspondientes
para el tratamiento del prurito y/o de la incontinencia
urinaria.
Los siguientes ejemplos y figuras explican la
invención sin que por ello el objeto de la invención quede limitado
a los mismos.
Los términos "Figuras" y "Fig." han de
ser considerados como sinónimos. También son sinónimos los términos
"subtipo" y "subdivisión" en relación con las figuras. Una
"X" en las secuencias mostradas representa cualquier
nucleótido complementario a la base correspondiente en el mRNA del
VR1. Las figuras muestran:
Figura 1/27: En general, secuencias de
nucleótidos que parten de una secuencia de oligodesoxinucleótidos
antisentido contra el mRNA de VR1 de rata, que aquí frecuentemente
se designa como oligo V15, oligonucleótido nº 15 o V15. Las
subdivisiones (a) - (j) muestran fragmentos acortados de esta
secuencia de oligodesoxinucleótidos antisentido; la subdivisión (k)
muestra la secuencia de oligodesoxinucleótidos antisentido completa
con la que se ha realizado el "messenger walk
screening" (screening de recorrido de mensajero); las
subdivisiones (l) - (n) muestran en cada caso dos secuencias
parciales de nucleótidos (sección I y sección III) que parten de la
secuencia de oligodesoxinucleótidos antisentido completa, que en
cada caso incluyen o corresponden a regiones parciales no solapadas
de esta secuencia, las cuales la mayoría de las veces están
separadas en la región GAC y se presentan en determinados
constructos de polinucleótido, en particular
DNA-enzimas, en dos regiones separadas entre sí,
los "brazos de reconocimiento"; las subdivisiones (o) - (q)
muestran en cada caso dos secuencias parciales de nucleótidos
(hélice I y hélice III) (pero en este caso como RNA) que parten de
la secuencia de oligodesoxinucleótidos antisentido completa, que en
cada caso incluyen o corresponden a regiones parciales no solapadas
de esta secuencia, las cuales la mayoría de las veces están
separadas en la región GAC y se presentan en determinados
constructos de polinucleótido, en particular ribozimas, en dos
regiones separadas entre sí, los "brazos de reconoci-
miento".
Figura 2/27: Secuencia de un
desoxioligonucleótido antisentido contra VR1 humano correspondiente
al oligo V15 de la Figura 1/27 en la posición del mRNA. Los
subtipos (a) - (k) corresponden, en cuanto al tipo y al contenido
general, a los ya descritos en relación con la Figura 1/27.
Figura 3/27: En general, secuencias de
nucleótidos que parten de una secuencia de oligodesoxinucleótidos
antisentido contra el mRNA del VR1 de rata, que aquí frecuentemente
se designa como oligo V30, oligonucleótido nº 30 o V30. El tipo y
el contenido de los subtipos corresponden a los ya descritos en
relación con la Figura 1/27.
Figura 4/27: Secuencia de un
desoxioligonucleótido antisentido contra VR1 humano correspondiente
al oligo V30 de la Figura 3/27 en la posición del mRNA. Los
subtipos (a) - (q) corresponden, en cuanto al tipo y el contenido
general, a los ya descritos en relación con la Figura 1/27.
Figura 5/27: En general, secuencias de
nucleótidos que parten de una secuencia de oligodesoxinucleótidos
antisentido contra el mRNA del VR1 de rata, que aquí frecuentemente
se designa como oligo V32, oligonucleótido nº 32 o V32. El tipo y
el contenido de los subtipos corresponden a los ya descritos en
relación con la Figura 1/27.
Figura 6/27: Secuencia de un
desoxioligonucleótido antisentido contra VR1 humano correspondiente
al oligo V32 de la Figura 5/27 en la posición del mRNA. Los
subtipos (a) - (q) corresponden, en cuanto al tipo y el contenido
general, a los ya descritos en relación con la Figura 1/27.
Figura 7/27: En general, secuencias de
nucleótidos que parten de una secuencia de oligodesoxinucleótidos
antisentido contra el mRNA del VR1 de rata, que aquí frecuentemente
se designa como oligo V26, oligonucleótido nº 26 o V26. El tipo y
el contenido de los subtipos corresponden a los ya descritos en
relación con la Figura 1/27.
Figura 8/27: Secuencia de un
desoxioligonucleótido antisentido contra VR1 humano correspondiente
al oligo V26 de la Figura 7/27 en la posición del mRNA. Los
subtipos (a) - (q) corresponden, en cuanto al tipo y el contenido
general, a los ya descritos en relación con la Figura 1/27.
Figura 9/27: En general, secuencias de
nucleótidos que parten de una secuencia de oligodesoxinucleótidos
antisentido contra el mRNA del VR1 de rata, que aquí frecuentemente
se designa como oligo V2, oligonucleótido nº 2 o V2. El tipo y el
contenido de los subtipos corresponden a los ya descritos en
relación con la Figura 1/27.
Figura 10/27: Secuencia de un
desoxioligonucleótido antisentido contra VR1 humano correspondiente
al oligo V2 de la Figura 9/27 en la posición del mRNA. Los subtipos
(a) - (k) corresponden, en cuanto al tipo y el contenido general, a
los ya descritos en relación con la Figura 1/27.
Figura 11/27: En general, secuencias de
nucleótidos que parten de una secuencia de oligodesoxinucleótidos
antisentido contra el mRNA del VR1 de rata, que aquí frecuentemente
se designa como oligo V16, oligonucleótido nº 16 o V16. El tipo y
el contenido de los subtipos corresponden a los ya descritos en
relación con la Figura 1/27.
Figura 12/27: Secuencia de un
desoxioligonucleótido antisentido contra VR1 humano correspondiente
al oligo V16 de la Figura 11/27 en la posición del mRNA. Los
subtipos (a) - (q) corresponden, en cuanto al tipo y el contenido
general, a los ya descritos en relación con la Figura 1/27.
Figura 13/27: En general, secuencias de
nucleótidos que parten de una secuencia de oligodesoxinucleótidos
antisentido contra el mRNA del VR1 de rata, que aquí frecuentemente
se designa como oligo V28, oligonucleótido nº 28 o V28. El tipo y
el contenido de los subtipos corresponden a los ya descritos en
relación con la Figura 1/27.
Figura 14/27: Secuencia de un
desoxioligonucleótido antisentido contra VR1 humano correspondiente
al oligo V28 de la Figura 13/27 en la posición del mRNA. Los
subtipos (a) - (k) corresponden en cuanto al tipo y el contenido
general a los ya descritos en relación con la Figura 1/27.
Figura 15/27: En general, secuencias de
nucleótidos que parten de una secuencia de oligodesoxinucleótidos
antisentido contra el mRNA del VR1 de rata, que aquí frecuentemente
se designa como oligo V4, oligonucleótido nº 4 o V4. El tipo y el
contenido de los subtipos corresponden a los ya descritos en
relación con la Figura 1/27.
Figura 16/27: Secuencia de un
desoxioligonucleótido antisentido contra VR1 humano correspondiente
al oligo V4 de la figura 15/27 en la posición del mRNA. Los
subtipos (a) - (k) corresponden en cuanto al tipo y el contenido
general a los ya descritos en relación con la Figura 1/27.
Figura 17/27: La Figura 17/27 muestra el
resultado del Messenger Walk Screening. En cada pista, junto
a la banda superior del sustrato no cortado se pueden ver las dos
bandas de producto del mRNA cortado y también algunas bandas no
específicas. Se puede ver el mRNA de VR1 después de la degradación
por RNAsa H en presencia, en cada caso, de uno de 33
oligonucleótidos antisentido (oligo V1 a oligo V33). En cada pista,
junto a la banda superior del sustrato no cortado se pueden ver las
dos bandas de producto del mRNA cortado y también algunas bandas no
específicas.
Pista 1: mRNA de VR1, pistas
2-34: ensayo de RNAsa H con oligodesoxinucleótidos
antisentido contra los 33 sitios GUC del mRNA de VR1 (oligo V1 a
oligo V33).
Figura 18/27: Evaluación cuantitativa del
Messenger Walk Screening. La Figura 18/27 muestra la
proporción porcentual de mRNA no cortado después del ensayo de
RNAsa H con los ODN individuales. Cada valor representa el valor
medio de como mínimo tres experimentos, de modo que la desviación
estándar no supera en ningún caso el 10%. Los
oligodesoxinucleótidos antisentido contra los sitios GUC 15 y 30 se
unen con mayor eficacia al mRNA de VR1, de modo que éste es
degradado hasta un 88 \pm 4 ó 97 \pm 1% por la RNAsa H (oligo
V15 y oligo V30).
Figura 19/27: Imagen de un gel después del
ensayo de RNAsa H con los oligonucleótidos V15, V15ctr.
(mismatch - desapareamiento), V30 y V30ctr.
(mismatch).
Se muestran el mRNA de VR1 (pista 1) y el ensayo
de RNAsa H con los oligodesoxinucleótidos V15, V15ctr., V30 y
V30ctr. (pista 2-5).
Figura 20/27: Evaluación cuantitativa del corte
del mRNA por ribozimas y DNA-enzimas bajo
condiciones de "single turnover" (renovación
simple).
Figura 21/27: Cinética del corte de mRNA de VR1
por ribozimas y DNA-enzimas bajo condiciones de
"single turnover" (renovación simple).
Figura 22/27: Cinética del corte de mRNA de VR1
por ribozimas y DNA-enzimas bajo condiciones de
"multiple turnover" (renovación múltiple).
Figura 23/27: Estimación de la alodinia táctil
durante el tratamiento con oligodesoxinucleótidos antisentido (AS)
y mismatch (MS) de VR1 (V15 y V15ctr.).
Figura 24/27: Representación de una ribozima de
"cabeza de martillo" con los "brazos de reconocimiento"
hélice I y hélice III, donde se insertan en cada caso las hélices I
y III de acuerdo con una de las subdivisiones (o) a (q) de una de
las figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27,
12/27, 13/27 o 15/27, para obtener los ribozimas de "cabeza de
martillo" según la invención (véase la descripción de la Figura
1/27). En este contexto, la sección de la hélice I en cada una de
las figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27,
12/27, 13/27 ó 15/27 sustituye a los nucleótidos deseados de la
hélice I según la Figura 24/27, de modo que el primer nucleótido
del extremo 3' de la hélice I en cada una de las figuras 1/27, 3/27,
4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27
sustituye al primer nucleótido "N" deseado en el extremo 3' de
la hélice I de la Figura 24/27, y los siguientes nucleótidos
"N" deseados de la hélice I de la Figura 24/27 en dirección
hacia el extremo 5' son sustituidos por los nucleótidos mostrados en
una de las subdivisiones (o) a (q) de la hélice I en cada una de
las figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27,
12/27, 13/27 ó 15/27. Los nucleótidos "A" y "C" del
extremo 5' de la hélice III de una de las figuras 1/27, 3/27, 4/27,
5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27 sustituyen
respectivamente a los nucleótidos "A" y "C" de la hélice
III de la Figura 24/27, y los siguientes nucleótidos "N"
deseados de la hélice III de la Figura 24/27 en dirección hacia el
extremo 5' son sustituidos por los nucleótidos mostrados en una de
las subdivisiones (o) - (q) de la hélice III en cada una de las
figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27,
12/27, 13/27 ó 15/27. La Figura 25/27 muestra un ejemplo
concreto.
Figura 25/27: Representación de la ribozima de
"cabeza de martillo" V16 (7/7) (especialmente preferente) según
la Figura 24/27 y la Figura 11/27. El término "Ribozima V16
(7/7)" significa que la enzima está dirigida contra el sitio GUC
del oligo V16 y contiene en cada uno de los "brazos de
reconocimiento" 7 nucleótidos (hélice I y hélice III), en este
caso de acuerdo con la hélice I y la hélice III de la subdivisión
(o) de la Figura 11/27. Lo mismo es aplicable a todas las ribozimas
de acuerdo con las subdivisiones (o a q) de cada una de las figuras
1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27
ó 15/27.
Figura 26/27: Representación de la
DNA-enzima del tipo "10-23"
según Santoro y col., 1997, figura 2, página 4264:
La cadena superior indicada con una flecha es la
cadena de RNA a disociar y la flecha señala el sitio de disociación,
y la inferior es una representación de la
DNA-enzima. En relación con la presente solicitud,
en la cadena superior la "Y" = "U" y la "R" =
"G", y en dirección hacia el extremo 3' desde "Y" hay un
"C". En consecuencia, el sitio de disociación de la cadena
superior es un, así llamado, sitio GUC (véase más arriba).
Correspondientemente, en la cadena inferior "R" = "A" y
en dirección hacia el extremo 5' desde "R" en la cadena
inferior hay correspondientemente un "G". A éste se le unen en
dirección hacia el extremo 5' los otros nucleótidos de la sección I
de acuerdo con las subdivisiones (l a n), en cada caso, de una de
las figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27,
12/27, 13/27 ó 15/27, es decir, 5 nucleótidos adicionales en el caso
de la subdivisión l, 6 nucleótidos adicionales en el caso de la
subdivisión m y 7 nucleótidos adicionales en el caso de la
subdivisión n. En la sección III de la Figura 25/27 - la segunda
sección con emparejamiento de bases con el RNA -, al "A" no
emparejado contiguo a la sección III se le unen directamente desde
la dirección del extremo 5' hacia el extremo 3' los nucleótidos de
la sección III de acuerdo con las subdivisiones (l a n), en cada
caso, de una de las figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27,
8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27, es decir, 7 nucleótidos
adicionales en el caso de la subdivisión l, 8 nucleótidos
adicionales en el caso de la subdivisión m y 9 nucleótidos
adicionales en el caso de la subdivisión n. La sección III y la
sección I son los llamados "brazos de reconocimiento" de la
DNA-enzima (véase más abajo el
Ejemplo 3).
Ejemplo 3).
Por consiguiente, la DNA-enzima
de tipo "10-23" para la subdivisión (n) de la
Figura 1 tendría la siguiente secuencia, en la que la sección
subrayada estaría en emparejamiento de bases con el RNA:
ATGTCATGA
(=R) - GGCTAGCTACAACGA -
GGTTAGGGG
Esta DNA-enzima (especialmente
preferente) se denomina V15 (9/9), indicando esta denominación que
la enzima está dirigida contra el sitio GUC del oligo V15 y
contiene 9 nucleótidos en cada uno de los "brazos de
reconocimiento" (secciones I y III), por ejemplo según la
sección I y la sección III de la subdivisión (n) de la Figura 1. Lo
mismo es aplicable a todas las DNA-enzimas de
acuerdo con las subdivisiones (l a n) en cada caso de una de las
figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27,
12/27, 13/27 ó 15/27.
Figura 27/27: Representación esquemática de un
"locked nucleic acid" ("LNA") (ácido nucleico
bloqueado).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El primer paso de la estrategia de antisentido y
ribozima consiste en la identificación de los sitios accesibles del
mRNA para la unión de oligonucleótidos, pero principalmente también
de ribozimas. Para ello se debe examinar el mRNA de VR1 en cuanto a
dichos sitios de corte. Un análisis del mRNA de VR1 dio como
resultado, en la región codificadora, los siguientes sitios de
reconocimiento potenciales para ribozimas:
33 X secuencias GT(U)C
28 X secuencias GT(U)T
12 X secuencias GT(U)A
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar los sitios accesibles del mRNA
de VR1, en un primer paso se sintetizaron tres mezclas de
nucleótidos independientes con la siguiente secuencia:
Mezcla 1: NNNAACNNN
\hskip1cmdenominada "librería GUU"
Mezcla 2: NNNCACNNN
\hskip1cmdenominada "librería GUA"
Mezcla 3: NNNGACNNN
\hskip1cmdenominada "librería GUC"
Éstas se utilizaron consecutivamente en un
experimento de RNAsa H y se comprobó que únicamente con la librería
GUC se podía observar una degradación del mRNA de VR1 digna de
mención. Por consiguiente, entre las secuencias diana potenciales
para ribozimas, los 33 sitios GUC del mRNA de VR1 son los más
accesibles y éstos fueron utilizados para los análisis
posteriores.
\newpage
Ejemplo
2
Para identificar las regiones del mRNA que son
accesibles para los oligodesoxinucleótidos antisentido, éste se
sometió a rastreo sistemático con ODN en el ensayo de RNAsa H
(messenger walk screening - screening de recorrido de
mensajero). Los ODN tenían una longitud de 18 nucleótidos y
contenían en el centro una secuencia GAC que es complementaria
inversa a las secuencias GUC del mRNA. Este triplete se seleccionó
como diana, ya que mostraba buenos resultados y podía ser utilizado
en un segundo paso para desarrollar ribozimas de cabeza de martillo
y DNA-enzimas. En total se ensayaron 33 ODN,
denominados V1 a V33, contra todos los sitios GUC del mRNA de VR1.
Los ODN se sometieron a screening sistemático mediante la adición,
en cada caso, de un ODN y una RNAsa H al mRNA para determinar su
idoneidad. La RNAsa H corta los dúplex de DNA/RNA formados en todos
los lugares en los que un oligonucleótido se puede unir al mRNA
(Figura 17/27).
En primer lugar, el cDNA del receptor
vainilloide se clonó en el vector pcDNA3.1 (+) de la firma
Invitrogen. A continuación se llevó a cabo la transcripción in
vitro del mRNA con un RiboMAX Large Scale RNA Production System
- T7 de la firma Promega de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
Para comprobar si se había unido un
oligodesoxinucleótido antisentido al mRNA se llevó a cabo un ensayo
de RNAsa H. Para ello, el mRNA de VR1 (100 mM) se incubó con un
exceso de cinco veces de ODN en un volumen total de 10 \mul en
tris/HCl 40 mM pH 7,2; MgCl_{2} 4 mM; DTT 1 mM y NaCl 150 mM
durante 7,5 minutos a 37ºC en presencia de 0,4 u de RNAsa H (de
Promega). Las reacciones se interrumpieron por adición de EDTA
(concentración final 65 mM). Las muestras se separaron mediante un
gel de agarosa al 1,5% y se tiñeron con bromuro de etidio (1
\mug/ml) durante 20 minutos. Los geles se fotografiaron con un Gel
Doc 2000 Gel Documentation System de la firma Biorad y se evaluaron
con el programa Quantity One.
La Figura 17/27 muestra el resultado del
messenger walk screening. En cada pista, junto a la banda
superior del sustrato no cortado, se pueden ver las dos bandas de
producto del mRNA cortado y también algunas bandas no
específicas.
Una cuantificación de la degradación del RNA
mostró que mediante el oligonucleótido antisentido más eficaz
(oligo nº 30 (V30)) se podía cortar/disociar específicamente más del
90% del mRNA de VR1 cuando se utilizaba en un exceso quíntuple con
respecto al mRNA diana (Figura 18/27).
Se evaluaron las intensidades de las bandas
individuales. La Figura 18/27 muestra para los ODN individuales la
proporción de mRNA no cortado para el ensayo de RNAsa H. Los
oligodesoxinucleótidos antisentido contra los sitios GUC 15 y 30
(oligo V15 y oligo V30) son los más eficaces para unirse al mRNA de
VR1, de modo que éste es degradado hasta un 88 \pm 4 ó 97 \pm
1% por la RNAsa H.
Las secuencias de los oligodesoxinucleótidos
antisentido más eficaces se encuentran en las Figuras 1/27, 3/27,
5/27, 7/27, 9/27, 11/27, 13/27 y 15/27, habiéndose tomado en
consideración entre otros los designados como oligo V15 (Figura 1)
y oligo V30 (Figura 3), que aparecen como preferentes.
Como controles de mismatch
(desapareamiento) para estos oligodesoxinucleótidos antisentido,
para los siguientes experimentos se sintetizaron y utilizaron
oligodesoxinucleótidos en los que cada quinta y sexta base (o, si
éstas son idénticas, dos bases contiguas) estaban intercambiadas.
Las secuencias de los oligodesoxinucleótidos control
(mismatch) son las siguientes:
(mismatch) son las siguientes:
Oligo V15ctr.: CAT GCT ATG AGC GTT GAG
Oligo V30ctr.: ATC TGT TTG AGC GTC TAC
Para el control se llevó a cabo el ensayo de
RNAsa H con los oligonucleótidos V15, V15ctr., V30 y V30ctr. (véase
la Figura 19/27). Conforme a lo esperado, el RNA sólo se degrada con
los ODN antisentido, pero no con los controles mismatch, ya
que éstos no se unen al mRNA.
En el ensayo de RNAsa H con
oligodesoxinucleótidos antisentido contra todos los tripletes GUC
del mRNA de VR1, los oligodesoxinucleótidos contra los tripletes
GUC (2, 4, 15, 16, 26, 28, 30 y 32), en particular el 15 y el 30,
fueron identificados como los ODN que mejor se unían. Por
consiguiente, estos oligodesoxinucleótidos y dos controles
mismatch se pueden emplear para ensayos en modelos animales y
otras aplicaciones.
Igualmente interesantes son las secuencias
humanas de acuerdo con las Figuras 2/27, 4/27, 6/27, 8/27, 10/27,
12/27, 14/27, 16/27, que corresponden por la posición a las
encontradas en la rata. El mRNA de la rata y del humano presentan
una alta homología (probablemente también en el pliegue) y, en
consecuencia, está claro que los sitios de corte fácilmente
accesibles identificados en el mRNA de rata también son interesantes
en el caso humano. En este contexto, son especialmente preferentes
las secuencias que también presentan el triplete GUC, las Figuras
4/27, 6/27, 8/27 y 12/27, y, debido a la localización similar a la
de la rata, también las de las Figuras 2/27 y 4/27 correspondientes
a V15 y V30.
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Ejemplo
3
En base a los sitios de unión más eficaces
hallados también se investigaron las ribozimas y
DNA-enzimas correspondientes.
Se construyeron ribozimas de "cabeza de
martillo" y DNA-enzimas de tipo
"10-23" (Santoro y col., 1997) contra los
sitios del mRNA que eran accesibles para los ODN. La longitud de los
"brazos de reconocimiento" era de 7 ó 9 nucleótidos en cada
lado. La evaluación cuantitativa de la disociación/corte de mRNA
bajo condiciones de "single turnover" (renovación
simple) (exceso décuplo de ribozimas y DNA-enzimas)
mostró, después de 20 minutos a 37ºC, que las ribozimas con
"brazos de reconocimiento" más cortos (hélice I y hélice III)
son más activas, mientras que en el caso de las
DNA-enzimas son más activas aquellas que tienen
"brazos" más largos (sección I y sección III) (Figura 20/27).
La Figura 24/27 muestra una representación esquemática de una
ribozima con las hélices I y III y la Figura 25/27 muestra un
ejemplo. En el caso de una DNA-enzima, ésta se puede
tomar (en dirección hacia el extremo 5' (sección I) y en dirección
hacia el extremo 3' (sección III) desde el motivo catalítico) de
Santoro y col. (1997; p. 4264, figura 2) (véase también la Figura
26/27 con la descripción correspondiente).
Los experimentos con ribozimas y
DNA-enzimas se llevaron a cabo en tris/HCl 50 mM, pH
7,5, y MgCl_{2} 10 mM a 37ºC. Para los experimentos de
"single turnover" se utilizaron ribozimas y
DNA-enzimas en un exceso décuplo. En el caso de los
experimentos de "multiple turnover" se utilizó el
sustrato mRNA en un exceso décuplo.
Se llevó a cabo un análisis cinético bajo
condiciones de "single turnover" para las dos ribozimas
y DNA-enzimas más eficaces (Figura 21/27). Los
datos se resumen en la Tabla 1. La DNA-enzima V15
(9/9) (véase la descripción de la Figura 26/27) que corta el mRNA
con una cinética bifásica tiene la tasa más alta (constante de
velocidad), seguida de la ribozima V16 (7/7) (véase la Figura 25),
la DNA-enzima V30 (9/9) y la ribozima más lenta V15
(7/7). En este contexto, por ejemplo DNA-enzima V15
(7/7) significa que la enzima está dirigida contra el sitio GUC del
oligo V15 y contiene 7 nucleótidos en cada uno de los "brazos de
reconocimiento" (secciones I y III), por ejemplo de acuerdo con
la sección I y la sección III del subtipo (l) de la Figura 1/27.
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\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 22/27 muestra la disociación del mRNA
bajo condiciones de "multiple turnover" (exceso décuplo
de sustrato). De nuevo, la DNA-enzima V15 (9/9)
tiene una tasa aparente (constante de velocidad) mayor (factor 3,4)
que la ribozima V16 (7/7) (Tabla 2).
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
En los nervios espinales izquierdos L5/L6 de 20
ratas Sprague-Dawley macho se aplicaron ligaduras de
nervios espinales según Kim y Chung (1992). Al mismo tiempo se
implantaron catéteres espinales según Pogatzki y col.^{6} (2000).
De 4 a 6 días después de la operación se midió la línea base umbral
(umbrales de retirada/withdrawal thresholds) en la
pata trasera ipsilateral y contralateral mediante un
vonFrey-Anesthesiometer electrónico (IITC Life
Science, EEUU). El asiento correcto de los catéteres espinales se
confirmó mediante administración de lidocaína (10 \mul, 2%), que
condujo a una breve parálisis de los dos miembros traseros. Después
del ensayo y de la medida de la línea base, en cada caso se
administraron 45 \mug de oligonucleótidos antisentido
VR-1 (AS, n = 10) o mismatch (MS, n = 10) en
NaCl al 0,9% una vez el primer día y b.i.d. los 4 días siguientes.
Los umbrales de retirada táctiles (withdrawal thresholds) se
midieron 30 minutos después de la primera administración diaria de
oligo. Los resultados se indican como % del efecto máximo posible
(%MPE; % del efecto máximo posible) en el lado ipsilateral, tomando
la línea base como el 0% y el umbral de retirada de un grupo
control como el 100% de MPE. Como antisentido se utilizó oligo V15
(Figura 1/27, subtipo k) y como mismatch se utilizó oligo
V15ctr., como ya se ha descrito más
arriba.
arriba.
El tratamiento de ratas mononeuropáticas con
oligodexoxinucleótidos antisentido pero no con
oligodesoxinucleótidos mismatch indujo una reducción de la
alodinia táctil que comenzó al tercer día del tratamiento y alcanzó
una meseta los días 4 y 5 del tratamiento. No se produjo ningún
efecto en los umbrales de retirada de las patas traseras
contralaterales.
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Ejemplo
5
Se prepararon diferentes oligonucleótidos según
la invención, en particular de acuerdo con el subgrupo (k) de la
Figura 1/27 y en parte también la Figura 3/27. La mayoría de ellos
eran constructos de LNA encargados a PROLIGO en Boulder, Co, EEUU,
y en los que los LNA estaban situados en diferentes lugares (véase
la Tabla 3). También se sintetizó un oligonucleótido no modificado
de acuerdo con el subgrupo (k) de la Figura 1/27 y se encargó un
fosfotioato correspondiente a la secuencia de bases a MWG Biotech
AG, Ebersberg, Alemania.
\newpage
Letras
minúsculas = monómeros de DNA; cursiva y subrayado = fosfotioatos;
letras mayúsculas en negrita = monómeros de
LNA
Con estos oligonucleótidos se realizaron
diferentes ensayos:
a) En primer lugar se investigó el alcance
porcentual de la disociación de RNA de VR1 provocada por el
oligonucleótido mediante RNAsa H. Las condiciones de ensayo
coincidían esencialmente con las condiciones mencionadas en el
Ejemplo 2.
Los resultados se presentan en la Tabla 3. Se
comprobó que los oligonucleótidos con LNA sólo muestran una
disociación comparable a la del oligonucleótido nativo cuando como
mínimo 6 o mejor 8 nucleótidos seguidos no son LNA.
b) Después se midió la temperatura de fusión de
los híbridos de LNA/RNA:DNA mediante métodos estándar (Tabla 4).
Sorprendentemente, los LNA presentaban una temperatura de fusión
elevada en comparación con los oligonucleótidos nativos y los
fosfotioatos. Esto es muy favorable para la estabilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
c) Después se investigó la cinética de la
disociación por RNAsa H bajo condiciones iguales a las arriba
indicadas, pero se utilizaron cantidades equimolares de RNA y
oligonucleótido antisentido (100 nM en cada caso). Los resultados
se presentan en la Tabla 5. Sorprendentemente, el oligonucleótido
con LNA mostró un claro aumento de la actividad en comparación con
los oligonucleótidos nativos y los fosfotioatos.
\vskip1.000000\baselineskip
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d) Por último se determinó la vida media de los
oligonucleótidos con LNA y también del oligonucleótido nativo y del
fosfotioato marcados de forma radiactiva a 37ºC en suero humano a lo
largo de hasta 2 días. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Mientras que el DNA nativo presenta una vida media de 1,5 h y el
fosfotioato de 10 h, los nucleótidos con LNA que tenían 3 ó 4 LNA
en los extremos eran claramente mejores con una t_{1/2} de
aproximadamente 17 h.
Por consiguiente, el mejor corte se lograba con
los nucleótidos con LNA que tenían aproximadamente 8 nucleótidos
seguidos sin LNA y que presentaban 3 ó 4 LNA en los extremos 3' y
5'.
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttgttgac ggtctca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
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\hskip-.1em\dddseqskipatcttgttga cggtctc
\hfill17
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<210> 39
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcttgttga cggtctca
\hfill18
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<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
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<400> 40
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\hfill15
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 41
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\hfill17
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\hfill19
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill15
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<210> 44
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<211> 17
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 44
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill17
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgttgacag tctca
\hfill15
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<210> 48
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill15
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<210> 49
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttgttgac agtct
\hfill15
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<210> 50
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcttgttga cagtc
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgttgaca gtctca
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttgttgac agtctc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcttgttga cagtct
\hfill16
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<211> 17
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttgttgac agtctca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcttgttga cagtctc
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcttgttga cagtctca
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgttganag tctca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgttgana gtctcan
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
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<211> 19
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttgttgan agtctcann
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipucuuguunac agucu
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaucuuguuna cagucuc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnaucuuguun acagucuca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgacctc
\hfill9
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcctgacct caggg
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcctgacc tcagg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcggcctgac ctcag
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcggcctga cctca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcctgacc tcaggg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcggcctgac ctcagg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcggcctga cctcag
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcggcctgac ctcaggg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcggcctga cctcagg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcggcctga cctcaggg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcctganct caggg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcctganc tcaggga
\hfill17
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<213> Rattus norvegicus
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\hfill16
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 106
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtgtgga ctccata
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 107
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
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\hskip-.1em\dddseqskipgtggtgtgga ctccatag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 109
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
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\hfill17
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<210> 110
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<211> 19
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 110
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\hfill19
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
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\hfill15
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<210> 112
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<211> 17
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
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\hskip-.1em\dddseqskipguggugugna cuccaua
\hfill17
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<210> 113
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
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\hfill19
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<210> 114
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<211> 9
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\hfill9
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 124
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<213> Rattus norvegicus
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<212> DNA
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<211> 17
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
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<211> 19
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<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill15
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill16
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
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<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtgggga ctcaga
\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtggggac tcagact
\hfill17
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<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtgggga ctcagac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtgggga ctcagact
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtggggan tcagactcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggugggnac ucaga
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggugggna cucagac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnggggugggn acucagacu
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtccgca
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgggtccgc agcag
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgggtccg cagca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtgggtcc gcagc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
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\hskip-.1em\dddseqskipggagtgggtc cgcag
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
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\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<213> Rattus norvegicus
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 162
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\hfill15
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill16
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill17
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcgcttga caaatct
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
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<211> 18
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcgcttga caaatctg
\hfill18
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<211> 15
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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<210> 173
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<211> 15
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hfill19
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcttgacg aatct
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcgcttgac gaatc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcttgacg aatctg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
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<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcgcttgac gaatct
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcgcttga cgaatc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcgcttgac gaatctg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcgcttga cgaatct
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcgcttga cgaatctg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcttganga atctg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcttgang aatctgn
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcgcttgan gaatctgnn
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
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\hskip-.1em\dddseqskipugcgcuunac gaauc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
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<211> 17
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<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
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\hfill17
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
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\hfill19
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<210> 193
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 201
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctccagac atgtgga
\hfill17
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<210> 202
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 202
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 203
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\hfill18
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 204
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\hfill15
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 205
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 206
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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<211> 15
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<212> RNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 207
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 208
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill17
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 209
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> DNA
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccaggcag gtgga
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 15
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 212
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctccaggca ggtgg
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 213
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 213
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctccaggc aggtg
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211>15
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 215
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 216
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctccaggc aggtgg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 217
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 218
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctccaggc aggtgga
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagctccagg caggtgg
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 220
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagctccagg caggtgga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 221
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill9
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 222
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacgactc ctggt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 223
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtacgact cctgg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 224
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggtacgac tcctg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 225
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtacga ctcct
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 226
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtacgact cctggt
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 227
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggtacgac tcctgg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 228
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtacga ctcctg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 229
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\hskip-.1em\dddseqskipcgggtacgac tcctggt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 230
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtacga ctcctgg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 231
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtacga ctcctggt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 232
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacgantc ctggt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 233
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtacgant cctggta
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 234
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggtacgan tcctggtag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 235
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggguacnac uccug
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 236
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggguacna cuccugg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 237
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnccggguacn acuccuggu
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 238
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcggctct
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 239
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgcggctc ttggc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 240
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtgcggct cttgg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 241
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggtgcggc tcttg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 242
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtgcgg ctctt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 243
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtgcggct cttggc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 244
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggtgcggc tcttgg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 245
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtgcgg ctcttg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 246
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggtgcggc tcttggc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 247
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtgcgg ctcttgg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 248
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtgcgg ctcttggc
\hfill18
Claims (22)
1. Oligonucleótido que contiene o se corresponde
con una secuencia de bases de acuerdo con una de las subdivisiones
(b) a (j) de una de las figuras 1/27, 2/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27,
7/27, 8/27, 9/27, 10/27, 11/27, 12/27, 13/27, 14/27, 15/27 ó 16/27,
o una secuencia que se diferencia de ésta en como máximo una base
distinta, no encontrándose dicha diferencia de base en la región de
secuencia representada en la subdivisión (a), caracterizado
porque el oligonucleótido presenta una longitud de 15 a 30,
preferentemente de 15 a 25, en particular de 17 a 19, o de
exactamente 18 nucleótidos.
2. Oligonucleótido que contiene o se corresponde
con una secuencia de bases de acuerdo con la subdivisión (k) de una
de las figuras 1/27, 2/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27,
10/27, 11/27, 12/27, 13/27, 14/27, 15/27 ó 16/27, o una secuencia
que se diferencia de ésta preferentemente en una y como máximo en
dos bases distintas, no encontrándose dicha o dichas diferencias de
bases en la región de secuencia representada en la subdivisión (a),
caracterizado porque el oligonucleótido presenta una longitud
de 15 a 30, preferentemente de 15 a 25, en particular de 17 a 19, o
exactamente de 18 nucleótidos.
3. Oligonucleótido según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque presenta como
mínimo una ribosa modificada o no modificada, como mínimo un enlace
fosfodiéster modificado o no modificado y/o como mínimo una base
modificada o no modificada.
4. Oligonucleótido según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como mínimo uno
de los nucleótidos y en particular varios de los nucleótidos son
"locked nucleic acids" ("LNA") (ácidos nucleicos
bloqueados) o como mínimo uno de los nucleótidos y en particular
todos los nucleótidos son fosfotioatos, preferentemente porque
varios de los nucleótidos son "locked nucleic acids"
("LNA").
5. Oligonucleótido según la reivindicación 4,
caracterizado porque los "LNA" se encuentran en los
extremos 5' y 3' del oligonucleótido, preferiblemente en cada caso
los 2-5 últimos nucleótidos, en particular en cada
caso los 3 ó 4 últimos nucleótidos de los extremos 3' y 5' del
oligonucleótido son "LNA", y/o
porque > 6, en particular \geq 8
nucleótidos seguidos en el oligonucleótido no son "LNA",
preferiblemente porque, de los nucleótidos representados en la
región de secuencia de acuerdo con la subdivisión (a)
correspondiente del oligonucleótido según una de las Figuras 1 a
16, subdivisiones (b) a (k), en cada caso, ninguno o como máximo
uno de los nucleótidos es un "LNA".
6. Constructo de polinucleótido que contiene en
dos regiones separadas entre sí las dos secuencias parciales de
nucleótidos de la sección I y la sección III según una de las
subdivisiones (l) - (n) o las dos secuencias parciales de
nucleótidos de la hélice I y la hélice III según una de las
subdivisiones (o) - (q) de una de las figuras 1/27, 3/27, 4/27,
5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27, 12/27, 13/27 ó 15/27,
consistiendo el constructo de polinucleótido en una ribozima,
preferentemente una ribozima de "cabeza de martillo"
("hammerhead"), o en una DNA-enzima de
tipo 10-23 ó 12-32.
7. Constructo de polinucleótido según la
reivindicación 6, caracterizado porque se trata de una
DNA-enzima que contiene como mínimo las secuencias
parciales de nucleótidos de la sección I y la sección III según una
de las subdivisiones (l) a (n), preferentemente (n), de una de las
figuras 1/27, 3/27, 4/27, 5/27, 6/27, 7/27, 8/27, 9/27, 11/27,
12/27 ó 13/27,
- -
- preferentemente 1/27, 3/27, 7/27 u 11/27, en particular 1/27 ó 3/27, o
- -
- preferentemente 4/27, 6/27, 8/27 ó 12/27, en particular 4/27 ó 12/27.
8. Constructo de polinucleótido según una de las
reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque presenta como
mínimo una ribosa modificada o no modificada, como mínimo un enlace
fosfodiéster modificado o no modificado y/o como mínimo una base
modificada o no modificada.
9. Oligonucleótido según una de las
reivindicaciones 1 a 5 o constructo de polinucleótido según una de
las reivindicaciones 6 a 8, caracterizados porque están
unidos a un soporte, en particular a una proteína, preferentemente
tet-, transportina o ferritina, y/o porque están empaquetados en un
liposoma.
10. Célula que contiene como mínimo un
oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9 y/o un
constructo de polinucleótido según una de las reivindicaciones 6 a
8.
11. Medicamento que contiene como mínimo un
oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9, un
constructo de polinucleótido según una de las reivindicaciones 6 a 8
y/o una célula según la reivindicación 10, y en caso dado también
sustancias auxiliares y aditivos adecuados.
12. Diagnóstico que contiene como mínimo un
oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9, un
constructo de polinucleótido según una de las reivindicaciones 6 a 8
y/o una célula según la reivindicación 10, y en caso dado también
aditivos adecuados.
13. Utilización de un oligonucleótido según una
de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9, de un constructo de
polinucleótido según una de las reivindicaciones 6 a 8 y/o de una
célula según la reivindicación 10 para producir un medicamento para
el tratamiento del dolor, en particular del dolor crónico, alodinia
táctil, dolores provocados térmicamente y/o dolores
inflamatorios.
14. Utilización de un oligonucleótido según una
de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9, de un constructo de
polinucleótido según una de las reivindicaciones 6 a 8 y/o de una
célula según la reivindicación 9 para producir un medicamento para
el tratamiento de la incontinencia urinaria, también de síntomas
vesicales neurógenos; prurito, tumores, inflamaciones, en
particular inflamaciones asociadas al receptor VR1 con síntomas como
asma; y también de todos los síntomas de enfermedad relacionados
con el VR1.
15. Procedimiento para la identificación de
sustancias moduladoras del color, caracterizado porque la
identificación se lleva a cabo mediante la cuantificación de la
unión de como mínimo un oligonucleótido según una de las
reivindicaciones 1 a 5 ó 9, preferentemente marcado, y/o de un
constructo de polinucleótido según una de las reivindicaciones 6 a
8 con un RNA.
16. Procedimiento para la identificación de
sustancias moduladoras del dolor, que incluye los siguientes
pasos:
- (a)
- manipulación por ingeniería genética de como mínimo una célula (célula de ensayo) con como mínimo un oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9 y/o un constructo de polinucleótido según una de las reivindicaciones 6 a 8;
- (a')
- manipulación paralela por ingeniería genética de como mínimo una célula idéntica (célula de control) de uno de los siguientes modos
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- (b)
- incubación paralela de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con como mínimo una célula de ensayo y como mínimo una célula de control y/o un preparado de una célula de este tipo que ha sintetizado como mínimo una proteína receptora seleccionada de entre la familia de los receptores vainilloides, preferentemente el receptor VR-1;
- (c)
- medida de la unión de la sustancia de ensayo con la proteína sintetizada por las células o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo con la proteína;
- (d)
- identificación de las sustancias mediante la magnitud de la diferencia entre el valor de medida de la célula de ensayo y el de la célula control.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque la célula se manipula por ingeniería
genética antes de los pasos de procedimiento (a) y (a').
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
caracterizado porque la manipulación por ingeniería genética
permite medir como mínimo uno de los parámetros funcionales
modificados por la sustancia de ensayo.
19. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque mediante la
manipulación por ingeniería genética se expresa una forma de un
miembro de la familia de los receptores vainilloides,
preferentemente el receptor VR-1, que no es
expresada de forma endógena en la célula, o se introduce un gen
indicador.
20. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque la medida de
la unión tiene lugar a través del desplazamiento de un ligando
marcado conocido de un miembro de la familia de los receptores
vainilloides, preferentemente del receptor VR-1.
21. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque entre los
pasos de procedimiento paralelos (a) y (a') y el paso de
procedimiento (b) transcurren \geq 8 h, preferentemente \geq 12
h, en particular \geq 24 h.
22. Procedimiento para la diagnosis de cuadros
clínicos relacionados con la expresión modificada de genes de la
familia de los receptores vainilloides, caracterizado porque
la diagnosis tiene lugar a través de una cuantificación de la unión
de un oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9
y/o como mínimo un constructo de polinucleótido según una de las
reivindicaciones 6 a 8 con un RNA.
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