ES2397661T3 - Composiciones y sus usos dirigidos a la diacilglicerol aciltransferasa 1 - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido antisentido dirigido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido DGAT-1 para su uso en lamejora, tratamiento o prevención de la fibrosis hepática

Description

Composiciones y sus usos dirigidos a la diacilglicerol aciltransferasa 1

Listado de secuencias

La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado DIBIS0088WOSEQ.txt, creado el 6 de agosto del 2007 con un tamaño de 72 Kb. La información en el formato electrónico del listado de secuencias se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Antecedentes de la invención

La mala regulación de la diacilglicerol aciltransferasa 1 puede desempeñar un papel en el desarrollo de la obesidad. Después de la diferenciación de células 3T3-L1 de ratón en adipocitos maduros, se observan niveles de diacilglicerol aciltransferasa I aumentados 90 veces. Sin embargo, la sobre expresión forzada de la diacilglicerol aciltransferasa 1 en adipocitos maduros sólo produce un aumento de 2 veces en los niveles de diacilglicerol aciltransferasa 1. Esto conduce a un aumento en la síntesis de triglicéridos celular sin un aumento simultáneo en la lipólisis de triglicéridos, lo que sugiere que la manipulación del nivel de estado estacionario de la diacilglicerol aciltransferasa I puede ofrecer un medio posible para tratar la obesidad (Yu y col., J. Biol Chem., 277, 50876-50884 (2002)).

En una población turca aleatoria, se han identificado cinco polimorfismos en la secuencia no codificante 5’ y promotora de la diacilglicerol aciltransferasa 1 humana. Una variante común, la C79T, reveló actividad promotora reducida para el alelo 79T y está asociada con un índice de masa corporal más bajo, niveles de colesterol HDL mas altos en plasma y una tensión arterial diastólica más baja en mujeres turcas (Ludwig y col., Clin. Genet., 62, 68-73 (2002)).

Ratones knockout con el gen diacilglicerol aciltransferasa 1 desactivado presentan fenotipos de interés que indican la inhibición de la diacilglicerol aciltransferasa como un posible tratamiento para la obesidad y la resistencia a insulina asociada con la obesidad. Los ratones sin diacilglicerol aciltransferasa 1 son viables y aún pueden sintetizar triglicéridos a través de otras rutas biológicas. Aunque los ratones son magros y resistentes a obesidad inducida por la dieta (Smith y col., Nat. Genet., 25, 87-90 (2000)), han disminuido los niveles de triglicéridos tisulares y han aumentado la sensibilidad a la insulina y a la leptina (Chen y col., J. Clin. Invest., 109, 1049-1055 (2002)). Las estrategias con moléculas pequeñas para modular la síntesis de la diacilglicerol aciltransferasa I son ineficaces. (Tabata y col., Phytochemistry, 46, 683-687 (1997); Tomoda y col., J. Antibiot. (Tokio), 52, 689-694 (1999)).

La diacilglicerol transferasa 2 posee actividad de diacilglicerol transferasa que utiliza un amplia serie de sustratos de acil-CoA grasos de cadena larga (Cases y col., J. Biol. Chem., 276, 38870-38876 (2001); Lardizabal y col., J. Biol Chem., 276, 38862-38869 (2001)). La diacilglicerol transferasa 2 es un miembro de una familia de genes cuyas secuencias no están relacionadas con la diacilglicerol aciltransferasa 1. (Cases y col., J.Biol. Chem., 276, 3887038876 (2001)).

De manera preferente, el ARNm de la diacilglicerol transferasa 2 se regula por incremento mediante tratamiento con insulina, como se demuestra mediante ensayos in vitro que miden la actividad diacilglicerol de la fracción de membrana de adipocitos de ratón cultivados. En ratones en ayunas, la expresión de la diacilglicerol transferasa 2 se reduce enormemente, y tras volver a alimentar, aumenta drásticamente. Los modelos de expresión de dos enzimas que participan en la síntesis de ácidos grasos, la acetil-CoA carboxilasa y la ácido graso sintasa, responden al ayuno y a la realimentación de una manera similar. Estos resultados, junto con la observación de que la diacilglicerol transferasa 2 se expresa abundantemente en el hígado, sugieren que la diacilglicerol transferasa 2 está estrechamente relacionada con la ruta de la síntesis de ácidos grasos endógenos (Meegalla y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 298, 317-323 (2002)).

Estudios realizados con ratones que llevan una alteración en el gen de la diacilglicerol aciltransferasa 1 proporcionan pruebas de que la diacilglicerol aciltransferasa 2 contribuye a la síntesis de triglicéridos. Los niveles de expresión de ARNm de la diacilglicerol transferasa 2 son similares en segmentos intestinales tanto de ratones con déficit de diacilglicerol transferasa 1 como de tipo natural. Usando cloruro de magnesio para diferenciar entre la actividad diacilglicerol transferasa 1 y 2, Buhman y col. observaron que, en ratones con déficit de diacilglicerol transferasa 1, la actividad diacilglicerol transferasa se reducía al 50% en el intestino proximal y al 10-15% en el intestino distal (Buhman y col., J. Biol Chem., 277, 25474-25479 (2002)).

Adicionalmente, los niveles de ARNm de la diacilglicerol transferasa 2 no se regulan por incremento en el tejido hepático o adiposo de los ratones con déficit de diacilglicerol transferasa 1, incluso semanas después de una dieta rica en grasas. Sin embargo, en ratones ob/ob, que tienen una mutación en el gen de leptina que produce obesidad, la diacilglicerol transferasa 2 se expresa a niveles más altos que en los ratones de tipo natural, lo que sugiere que la diacilglicerol transferasa 2 puede ser parcialmente responsable de la masa grasa altamente acumulada observada en estos ratones. Adicionalmente, las mutaciones combinadas de la leptina y de la diacilglicerol transferasa 1 conducen a una elevación de tres veces en la expresión de la diacilglicerol transferasa 2 en tejido adiposo blanco, en comparación con los niveles, en los mismos tejidos, de ratones con déficit en diacilglicerol transferasa 1. Estos datos sugieren que la leptina normalmente regula negativamente la expresión de la diacilglicerol transferasa 2 y que la regulación positiva de la diacilglicerol transferasa 2 en tejido adiposo blanco en estos ratones puede proporcionar una ruta alternativa para la síntesis de triglicéridos que aún se produce en ratones con déficit en leptina/diacilglicerol transferasa 1 (Chen y col., J. Clin. Invest., 109, 1049-1055 (2002); Cases y col., J. Biol Chem., 276, 38870-38876 (2001); Chen y col., J. Clin. Invest., 109, 175-181 (2002)).

La fibrosis hepática es la acumulación excesiva de proteínas de la matriz extracelular que se produce en muchos tipos de enfermedades hepáticas crónicas. La fibrosis hepática avanzada da lugar a complicaciones tales como cirrosis, disfunción hepática e hipertensión portal; lo que requiere frecuentemente un trasplante de hígado. Las causas comunes de la fibrosis hepática incluyen infección crónica de hepatitis C, alcoholismo y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). La EHNA se caracteriza por presentar obesidad, diabetes mellitus de tipo 2, dislipidemia y, normalmente, resistencia a insulina. Los mecanismos celulares de la fibrosis hepática incluyen la liberación de factores solubles de células de Kupfer que activarán a las células estrelladas hepáticas (CEH) en mioblastos fibrogénicos. Las CEH activas también secretan citocinas para perpetuar el estado activo. Después de lesión persistente, las CEH activas producen grandes cantidades de proteínas de la matriz extracelular (PME). La degradación de las PME se evita por la acción de citocinas tales como las TIMP. Actualmente, no hay ninguna terapia convencional para la fibrosis hepática. Como tal, el planteamiento que se recomienda seguir es eliminar el agente causante, el que para la EHNA incluiría, la pérdida de peso y tratamientos específicos para el síndrome metabólico. (Véase por ejemplo, Battler, R. y Brenner, D.A., J. Clin. Invest. 115:209-218 (2005) y apéndice; Elsharkawy, A.M., Oakley, F y Mann, D.A., Apoptosis v.10, n.4, 927-939 (2005); y Rockey, D.C. Clinincal Gastroenterology and Hepatology 3:95-107 (2005)). Chen y col., (Artherioscler. Thromb. Vasc. Biol., 25, 482-486 (2004)) investigaron la fisiología de ratones con déficit de DGAT-1. Murry y col (Diabetes, 52, A300 (2003)) usaron inhibidores de DGAT-1 para modular niveles de glucosa en ratones. El documento WO 02/086085 describe anticuerpos que se unen a TIMP-1 para su uso en el tratamiento de diversas enfermedades. El documento US2004185559 describe moduladores de DGAT-1.

Existe una necesidad reconocida en la técnica para un tratamiento para la fibrosis hepática.

Sumario de la invención

La invención proporciona un oligonucleótido antisentido dirigido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de diacilglicerol aciltransferasa 1 (DGAT-1) para su uso en la mejora, tratamiento o prevención de la fibrosis hepática. Otros aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la divulgación

En el presente documento se desvelan compuestos, particularmente compuestos oligoméricos, especialmente ácido nucleico y oligómeros similares a ácido nucleico, que se dirigen a un ácido nucleico que codifica la diacilglicerol aciltransferasa 1 (en lo sucesivo en el presente documento “DGAT-1”). Los compuestos oligoméricos pueden ser oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DGAT-1, particularmente DGAT-1 humana que modula la expresión de DGAT-1. El ácido nucleico que codifica la DGAT-1 puede tener una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente similar al Nº de referencia de GenBank NM_012079.2, registrado el 1 de abril del 2000 (SEC ID Nº: 4). El ácido nucleico puede ser la SEC ID Nº: 4. Los compuestos oligoméricos comprenden al menos una parte de 8 nucleósidos, preferentemente una parte de 12 nucleósidos o al menos una parte de 15 nucleósidos, de las secuencias indicadas en las Tablas 3, 4 ó 6, o tienen al menos una identidad del 80% con segmentos diana validados, o las secuencias indicadas en o a continuación en las Tablas 3, 4 ó 6.

Se desvelan procedimientos para modular la actividad de la DGAT-1 en células o tejidos. La actividad de la DGAT-1 puede modularse mediante un compuesto que es específico para la DGAT-1. El modulador específico de la actividad de la DGAT-1 puede ser un compuesto antisentido que se dirige a un ácido nucleico que expresa el polipéptido DGAT-1. La actividad de la DGAT-1 se modula en células o tejidos poniendo en contacto dicha célula o tejido con dicho modulador. La actividad de la DGAT-1 se modula en un animal que necesita tal modulación administrando el compuesto a dicho animal. El modulador puede administrarse como una sal farmacéuticamente aceptable. El animal que lo necesita padece fibrosis hepática.

También se desvelan procedimientos para modular la expresión de la DGAT-1 en células o tejidos que comprenden poner en contacto las células con al menos un compuesto modulador de la DGAT-1 y analizar las células con respecto a indicadores de una disminución en la expresión de ARNm y/o proteínas de DGAT-1 midiendo directamente los niveles de ARNm y/o proteínas, y/o a indicadores de fibrosis hepática.

Adicionalmente se desvelan procedimientos para la prevención, mejora y/o tratamiento de la fibrosis hepática, deposición de colágeno aumentada en el hígado, niveles elevados de ARNm de a-SMA, niveles elevados de ARNm de TGF.beta, hidroxilprolina elevada, esterificación de retinol reducida en el hígado, activación aumentada de células estrelladas hepáticas y otros indicadores y criterios de valoración de fibrosis hepática que comprende administrar, a un individuo que necesite tal intervención, un modulador de DGAT-1.

Adicionalmente se desvelan procedimientos para la prevención, mejora y/o tratamiento de la fibrosis hepática por tratamiento de un agente causante, en los que el agente causante se trata modulando la expresión de la DGAT-1. El agente causante puede ser, niveles de triglicéridos elevados en plasma, niveles de triglicéridos elevados en hígado, esteatosis hepática, EHNA, EHGNA, obesidad, diabetes mellitus, dislipidemia, resistencia a insulina, síndrome metabólico, colesterolemia o combinaciones de los mismos.

Se desvelan procedimientos de uso de un modulador de la DGAT-1 para la preparación de un medicamento para la prevención, mejora o tratamiento de una enfermedad, especialmente una enfermedad asociada con, e incluyendo al menos un indicador de, fibrosis hepática.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa una serie de gráficos de la expresión de ARNm de DGAT-1 y DGAT-2 de tejido hepático de ratones en los grupos de control (alimentados con pienso normal), grupo placebo (dieta DMC y con solución salina) o grupo de tratamiento (dieta DMC y tratamiento con el ASO DGAT-1). Los resultados son a las 4 y 8 semanas. La Figura 2 representa datos bioquímicos en plasma para los grupos de control, placebo y de tratamiento con DGAT-1. La Figura 3 ilustra que el tratamiento con DGAT-1 no mejoró la esteatosis hepática, como se indica mediante los niveles de triglicéridos en hígado y tinción de Aceite Rojo para los grupos de control, placebo y de tratamiento con DGAT-1. La Figura 4 es un gráfico que muestra cambios en la hidroxiprolina a las 4 y 8 semanas para los tres grupos. La Figura 5 ilustra las diferencias a las 4 y 8 semanas en diversos factores de fibrosis hepática para los grupos de control, placebo y de tratamiento con DGAT-1. La Figura 6 representa una serie de gráficos de la expresión de ARNm de DGAT-1 y de DGAT-2 de tejido hepático de ratones en los grupos de control (dieta con pienso normal), grupo placebo (dieta DMC y con solución salina) o grupo de tratamiento (dieta DMC y tratamiento con el ASO DGAT-2). Los resultados son a las 8 semanas. La Figura 7 ilustra que el tratamiento con DGAT-2 mejoró la esteatosis hepática, como se indica mediante los niveles de triglicéridos en hígado y tinción de Aceite Rojo para los grupos de control, placebo y tratamiento con DGAT-2 La Figura 8 representa un gráfico que muestra cambios en la hidroxiprolina a las 4 y 8 semanas para los tres grupos. La Figura 9 representa una serie de gráficos que ilustran el efecto del tratamiento con DGAT-2 sobre la expresión de ARNm activador de CEH. Estos resultados son a las 8 semanas.

Descripción detallada de la invención

La fibrosis hepática es un problema de salud principal que surge por lesión hepática crónica mediante una diversidad de factores etiológicos, incluyendo virus, alcoholismo y componentes del síndrome metabólico. (Elsharkawy, A.M. y Mann, D.A., Apoptosis, v.10, n.4 (2005). Las intervenciones terapéuticas para estas enfermedades o afecciones no son satisfactorias. (Véase, por ejemplo, Battler, R. y Brenner, D.A., J. Clin. Invest. 115:209-218 (2005) y apéndice; Elsharkaway, A.M., Oakley, F. y Mann, D.A., Apoptosis v.10, n.4, 927-939 (2005); y Rockey, D.C. Clinincal Gastroenterology and Hepatology 3:95-107 (2005)). En el presente documento se proporcionan compuestos para la prevención, mejora y/o tratamiento de la fibrosis hepática.

Como se usa en el presente documento, el término “prevención” significa retrasar o impedir la aparición o desarrollo de una afección o enfermedad durante un período de tiempo de horas a días, preferentemente de semanas a meses. Como se usa en el presente documento, el término “mejora” significa una disminución de al menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas conocidas por los expertos en la técnica. Como se usa en el presente documento, “tratamiento” significa administrar una composición de la invención para efectuar una modificación o mejoría de la enfermedad o afección.

En el presente documento se desvelan compuestos antisentido, incluyendo oligonucleótidos antisentido y otros compuestos antisentido para su uso en la modulación de la expresión de moléculas de ácido nucleico que codifican la DGAT-1. Esto se consigue proporcionando compuestos antisentido que se hibriden con una o más moléculas de ácido nucleico diana que codifican la DGAT-1. Como se usa en el presente documento, las expresiones “ácido nucleico diana” y “molécula de ácido nucleico que codifica la DGAT-1” se han usado por conveniencia para incluir ARN (incluyendo pre-ARNm y ARNm o partes de los mismos), transcritos de ADN que codifican la DGAT-1 y también ADNc derivado de dicho ARN. En una realización preferida, el ácido nucleico diana es un ARNm que codifica la DGAT-1.

Ácidos nucleicos diana

“Dirigir” un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico diana particular puede ser un proceso multietapa. El proceso normalmente comienza con la identificación de un ácido nucleico diana cuya expresión va a modularse. Por ejemplo, el ácido nucleico diana puede ser un gen celular (o ARNm trascrito del gen) cuya expresión se asocia con una patología o trastorno particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. Como se desvela en el presente documento, el ácido nucleico diana codifica la DGAT-1. El “sitio diana” se refiere al nucleósido lo más 5’ sobre un ácido nucleico diana que se hibrida con un compuesto oligomérico. El sitio diana se calcula en base al diseño del compuesto oligomérico con respecto a la secuencia del ácido nucleico diana.

5 Variantes

También se conoce en la técnica que, a partir de la misma región genómica de ADN, pueden producirse transcritos de ARN alternativos. Estos transcritos alternativos se conocen generalmente como “variantes”. Más específicamente, las “variantes de pre-ARNm” son transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico que difieren de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico en su posición de inicio o de terminación y

10 contienen secuencias intrónicas y exónicas. Las variantes pueden dar como resultado variantes de ARNm incluyendo, pero sin limitación, aquellas con puntos de unión de corte y empalme alternos, o codones de inicio y de terminación alternos. Las variantes en secuencias genómicas y de ARNm pueden dar como resultado enfermedades. Dentro del alcance de la presente invención se encuentran compuestos antisentido dirigidos contra dichas variantes.

15 Nombres, sinónimos, características de la diana.

En el presente documento se desvelan composiciones y procedimientos para modular la actividad de la DGAT-1 (diacilglicerol O-aciltransferasa, producto 1 génico relacionado con ACAT; ARGP1; Acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa; DGAT; DGAT1; acil coenzima A:gen 1 relacionado con la colesterol aciltransferasa; diacilglicerol aciltransferasa; diglicérido aciltransferasa). En un ejemplo preferido estas composiciones y procedimientos modulan 20 la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de DGAT-1. La Tabla 1 indica los números de referencia de GenBank de secuencias correspondientes a moléculas de ácido nucleico que codifican la DGAT-1 (nt = nucleótido), la fecha de registro de la versión de la secuencia en el GenBank y la SEC ID Nº correspondiente en la presente solicitud, cuando se asigna, cada una de las cuales se incorpora por referencia en el presente documento. Preferentemente, las composiciones y procedimientos modulan la expresión del polipéptido de 25 DGAT-1 a partir de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que es sustancialmente similar a la SEC ID Nº: 4. La expresión “sustancialmente similar” significa que una secuencia de interés tiene al menos una identidad del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia dada. Sin proporcionar ninguna lista exhaustiva de porcentajes, el uso de al menos en este contexto significa que la similitud entre las secuencias incluye el número indicado anteriormente y todos los cálculos de identidad mayores que, 30 incluyendo números enteros y parciales. Por ejemplo, al menos el 70% incluye todos los números enteros y todos los números decimales desde el 70% al 99,9%. Únicamente como ejemplo, una secuencia de interés y una secuencia dada, ambas con una longitud de 300 nucleósidos consecutivos, pero compartiendo una identidad solo entre 278 nucleósidos, deberían tener una identidad del 92,6%. Un experto habitual en la técnica determinará fácilmente estos porcentajes. La identidad en porcentaje entre dos secuencias puede determinarse mediante

35 algoritmos de alineamiento convencionales tales como ClustalX, cuando las dos secuencias están en el mejor alineamiento de acuerdo con el algoritmo de alineamiento. Lo más preferentemente, las composiciones y procedimientos modulan la expresión del polipéptido de DGAT-1 a partir de una molécula de ácido nucleico que es la SEC ID Nº 4.

Tabla 1

Dianas génicas

Especie

Nº GenBank Fecha GenBank SEC ID Nº

Ser humano

BQ084235.1 4 de abril del 2002 1

Ser humano

AW391923.1_COMP 4 de febrero del 2000 2

Ser humano

NT_031818.5_TRUNC_226000_247000_COMP 1 de agosto del 2002 * 3

Ser humano

NM_012079.2 1 de abril del 2000 4

Ser humano

BI907285.1 16 de octubre del 2001 5

Ser humano

BQ225153.1 2 de mayo del 2002 6

Ratón

AF078752.1 12 de noviembre de 1998 7

Ratón

AI448840.1_COMP 26 de febrero de 1999 8

Ratón

NM_010046.2 19 de junio del 2003 9

Dianas génicas

Especie

Nº GenBank Fecha GenBank SEC ID Nº

*sustituida por NT_037704

Modulación

“Modulación” significa que la actividad de un compuesto está modificada. La modulación de la DGAT-1, por ejemplo, significa que la actividad de la DGAT-1 está modificada mediante la modulación directa del polipéptido de DGAT-1, mediante la modulación de su expresión a partir de ADN o ARNm, o una combinación de las mismas. La modulación 5 directa de la DGAT-1 puede incluir moléculas pequeñas, polipéptidos, ácidos polinucléicos, anticuerpos u otros compuestos que interaccionen con el polipéptido de DGAT-1 para modular (aumentar o disminuir) la actividad de este polipéptido. La modulación de la expresión de un ácido nucleico diana puede conseguirse mediante la modificación de cualquiera de las funciones del ácido nucleico (ADN o ARN). Por ejemplo, y con respecto a la modulación de la expresión de ARNm, modulación significa tanto un aumento (estimulación o inducción) como una 10 disminución (inhibición o reducción) de la expresión del polipéptido de DGAT-1 a partir del ácido nucleico. Como otro ejemplo, la modulación de la expresión puede incluir perturbar la selección del sitio de corte y empalme del procesamiento del pre-ARNm. “Expresión” incluye todas las funciones mediante las cuales una información codificada por un gen se convierte en estructuras presentes y operativas en una célula. Estas estructuras incluyen los productos de transcripción y de traducción. La modulación de la expresión significa la perturbación de dichas 15 funciones. Las funciones del ARN a modular pueden incluir funciones de translocación, que incluyen, pero sin limitación, translocación del ARN a un sitio de traducción de proteínas, translocación del ARN a sitios dentro de la célula que están alejados del sitio de la síntesis del ARN y la traducción de proteínas a partir del ARN. Las funciones de procesamiento del ARN que pueden modularse incluyen, pero sin limitación, el corte y empalme del ARN para producir una o más especies de ARN, protección del ARN, maduración en 3’ del ARN y actividad catalítica o 20 formación de complejos que impliquen al ARN que puedan acoplarse en o facilitarse por el ARN. La modulación de la expresión puede dar como resultado un nivel aumentado de una o más especies de ácido nucleico o un nivel disminuido de una o más especies de ácido nucleico, temporalmente o mediante un nivel en estado estacionario neto. Un resultado de tal interferencia con la función del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de la DGAT-1. Por tanto, en una realización la modulación de la expresión puede significar, aumentar o disminuir los 25 niveles de proteínas o de ARN diana. En otra realización la modulación de la expresión puede significar un aumento

o una disminución de uno o más productos de corte y empalme de ARN, o un cambio en la proporción de dos o más productos de corte y empalme.

El efecto de los compuestos antisentido de la presente invención sobre la expresión de ácido nucleico diana puede someterse a ensayo en cualquiera de una diversidad de tipos celulares siempre que el ácido nucleico diana esté 30 presente a niveles medibles. El efecto de los compuestos antisentido de la presente invención sobre la expresión de ácido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando, por ejemplo, PCR o análisis de transferencia de Northern. Las líneas celulares derivan de tipos de tejidos y células normales y de células asociadas con diversos trastornos (por ejemplo, trastornos hiperproliferativos). Pueden obtenerse líneas celulares derivadas de tejidos y especies múltiples de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) y de otras fuentes de acceso 35 público, bien conocidas por los expertos en la técnica. Las células primarias, o aquellas células que se aíslan de un animal y que no están sometidas a cultivo continuo, pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, o pueden obtenerse a partir de diversos proveedores comerciales. Adicionalmente, las células primarias incluyen las obtenidas a partir de sujetos humanos donantes en un entorno clínico (es decir, donantes de sangre, pacientes quirúrgicos). Las células primarias se preparan a partir de procedimientos conocidos en la técnica.

40 Ensayo de modulación de la DGAT-1

La modulación de la expresión de la DGAT-1 puede someterse ensayo de diversas maneras conocidas en la técnica. Los niveles de ARNm de la DGAT-1 pueden cuantificarse, por ejemplo, por análisis de transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o PCR en tiempo real. El Análisis de ARN puede realizarse sobre ARN celular total o sobre ARNm poli(A)+ mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se

45 explican procedimientos para el aislamiento de ARN, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 1, páginas 4.1.1-4.2.9 y 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993.

El análisis de transferencia de Northern es rutinario en la técnica y se explica, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, páginas 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. La (PCR) cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el sistema de detección de secuencia

50 disponible en el mercado de ABI PRISM™ 7700, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El procedimiento de análisis de modulación de los niveles de ARN no es una limitación de la presente invención.

Los niveles de una proteína codificada por la DGAT-1 pueden cuantificarse de diversas maneras bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia de Western (inmunotransferencia), ELISA o 55 separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Pueden identificarse anticuerpos dirigidos a una proteína

codificada por la DGAT-1 y obtenerse a partir de diversas fuentes, tales como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI) o pueden prepararse mediante procedimientos de generación de anticuerpos convencionales. Se explican procedimientos para la preparación de antisuero policlonal, por ejemplo, en Ausubel,

F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, páginas 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997. La preparación de anticuerpos monoclonales se explica, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, páginas 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.

Los procedimientos de inmunoprecipitación son convencionales en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, páginas 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998. El análisis de transferencia de Western (inmunotransferencia) es convencional en la técnica y puede encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, páginas 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997.

Segmentos diana activos

Las localizaciones sobre el ácido nucleico diana definidas por tener uno o más compuestos antisentido activos dirigidos a ello, se denominan “segmentos diana activos”. Cuando un segmento diana activo está definido por compuestos antisentido múltiples, los compuestos están separados preferentemente por no más de aproximadamente 10 nucleótidos sobre la secuencia diana, más preferentemente no más de aproximadamente 5 nucleótidos sobre la secuencia diana, incluso más preferentemente los compuestos son contiguos, más preferentemente los compuestos se solapan. Dentro de un segmento diana activo, puede haber una variación sustancial en cuanto a la actividad (por ejemplo, definida por la inhibición en porcentaje) de los compuestos antisentido. Los compuestos antisentido activos son aquellos que modulan la expresión de su ARN diana. Los compuestos antisentido activos inhiben la expresión de su ARN diana al menos un 45%, preferentemente al menos un 50%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente incluso al menos un 80%, más preferentemente incluso al menos un 90% y más preferentemente al menos un 95%. Como se ha indicado anteriormente, al menos se usa para incluir el número indicado anteriormente y todos los números enteros y decimales mayores que. En una realización más preferida, el nivel de inhibición necesario para definir un compuesto antisentido activo se define basándose en los resultados de la selección usada para definir los segmentos diana activos.

Hibridación

Como se usa en el presente documento, “hibridación” significa el emparejamiento de cadenas complementarias de compuestos antisentido con su secuencia diana. Aunque sin limitarse a ningún mecanismo particular, el mecanismo de emparejamiento más común requiere puentes de hidrógeno, que pueden ser de Watson-Crick, de Hoogsteen o puentes de hidrógeno de Hoogsteen inversos, entre bases nucleosídicas o nucleotídicas (nucleobases) complementarias. Por ejemplo, la base natural adenina es complementaria a las nucleobases naturales timidina y uracilo que se emparejan mediante la formación de puentes de hidrógeno. La base natural guanina es complementaria a la base natural 5-metil citosina y a la base artificial conocida como G-clamp. La hibridación puede producirse en diversas circunstancias.

Un compuesto antisentido puede hibridarse específicamente cuando existe un grado de complementariedad suficiente para impedir la unión no específica del compuesto antisentido con las secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico y en condiciones como en los casos en los que se realizan ensayos in vitro.

Como se usa en el presente documento, “condiciones de hibridación rigurosas” o “condiciones rigurosas” se refiere a condiciones en las que un compuesto antisentido se hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias y las “condiciones rigurosas” en las que los compuestos antisentido se hibridan con una secuencia diana vendrán determinadas por la naturaleza y la composición de los compuestos antisentido y por los ensayos de investigación que se estén realizando.

Complementariedad

“Complementariedad”, como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de emparejamiento exacto entre dos nucleobases sobre dos cadenas del compuesto oligomérico o un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si en una posición determinada de un compuesto antisentido, una nucleobase es capaz de formar puentes de hidrógeno con una nucleobase en una posición determinada de un ácido nucleico diana, entonces la posición del puente de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera que es una posición complementaria. El compuesto antisentido y el ADN o ARN adicional son complementarios entre sí cuando en cada molécula un número suficiente de posiciones complementarias está ocupado por nucleobases que pueden unirse entre sí por puentes de hidrógeno. Por tanto, “específicamente hibridable” y “complementariedad” son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de emparejamiento o complementariedad exacta sobre un número suficiente de nucleobases de tal manera que entre el compuesto antisentido y un ácido nucleico diana se produce la unión estable y específica.

Identidad

Los compuestos antisentido, o una parte de los mismos, pueden tener un porcentaje de identidad definido con respecto a una SEC ID Nº, o un compuesto que tiene un número de Isis específico. Como se usa en el presente documento, una secuencia es idéntica a la secuencia desvelada en el presente documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en las secuencias desveladas de la presente invención se considera idéntico ya que los dos se emparejan con adenina. De manera similar, una base heterocíclica modificada G-clamp se consideraría idéntica a una citosina o a una 5-Me citosina en las secuencias de la presente solicitud ya que se emparejan con una guanina. Esta identidad puede ser sobre la longitud completa del compuesto oligomérico, o sobre una parte del compuesto antisentido (por ejemplo, para determinar la identidad en porcentaje del compuesto oligomérico con la SEC ID Nº, pueden compararse de 120 nucleobases de un oligómero de 27 unidades con un oligómero de 20 unidades). Los expertos en la técnica saben que un compuesto antisentido no necesita tener una secuencia idéntica con la descrita en el presente documento para funcionar de manera similar con el compuesto antisentido descrito en el presente documento. Versiones más cortas del compuesto antisentido indicado en el presente documento, o versiones no idénticas del compuesto antisentido indicado en el presente documento se encuentran dentro del ámbito de la invención. Son versiones no idénticas aquellas en las que cada base no tiene la misma actividad de emparejamiento que la de los compuestos antisentido desvelados en el presente documento. Las bases no tienen la misma actividad de emparejamiento siendo más pequeñas o teniendo al menos un sitio básico. Como alternativa, una versión no idéntica puede incluir al menos una base sustituida con una base diferente con una actividad de emparejamiento diferente (por ejemplo, G puede sustituirse por C, A o T). En una realización preferida, los compuestos antisentido tendrán no más de tres emparejamientos erróneos con una secuencia de ácido nucleico que codifica la DGAT-1. La expresión “no más de tres emparejamientos erróneos” incluye 0 emparejamientos erróneos, 1 emparejamiento erróneo, 2 emparejamientos erróneos y 3 emparejamientos erróneos. El porcentaje de identidad se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen idéntico emparejamiento de bases correspondiente con la SEC ID Nº o compuesto antisentido con el cual se está comparando. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí, pueden estar dispersas a lo largo del oligonucleótido, o ambas cosas.

Por ejemplo, un oligómero de 16 unidades que tiene la misma secuencia que las nucleobases 2-17 de un oligómero de 20 unidades tiene una identidad del 80% con el oligómero de 20 unidades. Como alternativa, un oligómero de 20 unidades que contiene cuatro nucleobases no idénticas al oligómero de 20 unidades tiene también una identidad de 80% con el oligómero de 20 unidades. Un oligómero de 14 unidades que tiene la misma secuencia que las nucleobases 1-14 de un oligómero de 18 unidades tiene una identidad del 78% con el oligómero 18 unidades. Dichos cálculos se encuentran dentro de la competencia de los expertos en la técnica, y adicionalmente, aquellos expertos en la técnica reconocen fácilmente que los cálculos del porcentaje de identidad pueden equiparase con porcentajes numéricos no enteros.

El porcentaje de identidad se basa en el porcentaje de nucleobases en la secuencia original presente en una parte de la secuencia modificada. Por lo tanto, un compuesto antisentido de 30 nucleobases que comprende la secuencia completa del complemento de un segmento diana activo de 20 nucleobases debe tener una parte de identidad del 100% con el complemento del segmento diana activo de 20 nucleobases, mientras que adicionalmente comprende una parte adicional de 10 nucleobases. En el contexto de la invención, el complemento de un segmento diana activo puede constituir una sola parte. En una realización preferida, los oligonucleótidos de la presente invención tienen al menos aproximadamente una identidad del 80%, más preferentemente al menos aproximadamente del 85%, incluso más preferentemente al menos aproximadamente del 90%, más preferentemente al menos una identidad del 95% con al menos una parte del complemento de los segmentos diana activos presentados en el presente documento.

Los expertos en la técnica saben bien que es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido y/o introducir bases con emparejamiento erróneo sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf y col (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992, se sometió a ensayo una serie de ASO (oligonucleótidos antisentido) de 13-25 nucleobases de longitud para ensayar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los ASO de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de emparejamiento erróneo cerca de los extremos de los ASO pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque a un menor grado que los ASO que no contenían emparejamientos erróneos. De manera similar, se consiguió escisión específica diana usando un ASO de 18 nucleobases, que incluía aquellos con 1 ó 3 emparejamientos erróneos. Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) ensayaron una serie de ASO de 14 nucleobases en tándem, y ASOs de 28 y 42 nucleobases comprendidos por la secuencia de dos o tres de los ASOs en tándem, respectivamente, para detectar su capacidad de detener la traducción de la DHFR humana en un ensayo con reticulocitos en conejos. En solitario, cada uno de los tres ASO de 14 nucleobases pudieron inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los ASO de 28 y 42 nucleobases.

Compuestos terapéuticos

Los compuestos antisentido pueden usarse para modular la expresión de la DGAT-1 en un animal, tal como un ser humano. En un ejemplo no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar a dicho animal que necesita la terapia, para una enfermedad o afección asociada con la DGAT-1, una cantidad eficaz de un compuesto antisentido que inhiba la expresión de la DGAT-1. Una enfermedad o afección asociada con la DGAT-1 incluye, pero sin limitación, fibrosis hepática. En un ejemplo, los compuestos antisentido de la presente invención inhiben eficazmente los niveles o la función del ARN de la DGAT-1. Dado que la reducción en cuanto a los niveles del ARNm de la DGAT-1 también puede conducir a la modificación de los productos de expresión de la proteína DGAT1, dichas modificaciones resultantes también puede medirse. Los compuestos antisentido de la presente invención que inhiben eficazmente el nivel o la función del ARN de la DGAT-1 o los productos de expresión de la proteína se consideran como un compuesto antisentido activo. En una realización, los compuestos antisentido inhiben la expresión de la DGAT-1 produciendo una reducción del ARN en al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98%, al menos un 99%

o al menos un 100%.

Por ejemplo, la reducción de la expresión de la DGAT-1 puede medirse en un fluido, tejido u órgano corporal del animal. Los procedimientos para obtener muestras para análisis, tales como fluidos corporales (por ejemplo, sangre), tejidos (por ejemplo, biopsias) u órganos, y los procedimientos de preparación de las muestras para permitir el análisis son bien conocidos por los expertos en la materia. Los procedimientos para el análisis de los niveles de ARN y proteínas se describen anteriormente y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los efectos del tratamiento pueden valorarse midiendo biomarcadores asociados con la expresión de la DGAT-1 en los fluidos, tejidos u órganos mencionados anteriormente, extraídos de un animal que se ha puesto en contacto con uno o más compuestos de la invención, mediante procedimientos clínicos rutinarios conocidos en la técnica. Estos biomarcadores incluyen, pero sin limitación: transaminasas hepáticas, bilirrubina, albúmina, nitrógeno ureico en sangre, creatina y otros marcadores de función renal y hepática; interleucinas, factores de necrosis tumoral, moléculas de adhesión intracelular, proteína C reactiva, quimiocinas, citocinas y otros marcadores de fibrosis hepática, obesidad, esteatosis hepática, EHNA, EHGNA, diabetes mellitus, dislipidemia, resistencia a insulina, síndrome metabólico y colesterolemia.

Los compuestos antisentido de la presente invención pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y diluyentes aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica. La selección de un diluyente o un transportador se basa en diversos factores, incluyendo, pero sin limitación, la solubilidad del compuesto y la vía de administración. Dichas consideraciones son bien conocidas por lo expertos en la técnica. En un aspecto, los compuestos de la presente invención inhiben la expresión de la DGAT-1. Los compuestos de la invención también pueden usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la expresión de la DGAT-1.

También se contemplan procedimientos mediante los cuales los fluidos, órganos o tejidos corporales se ponen en contacto con una cantidad eficaz de uno o más de los compuestos antisentido o composiciones de la presente invención. Los fluidos, órganos o tejidos corporales pueden ponerse en contacto con uno o más de los compuestos de la invención dando como resultado la modulación de la expresión de la DGAT-1 en las células de los fluidos, órganos o tejidos corporales.

Por tanto, en el presente documento se proporciona el uso de un modulador de la DGAT-1, preferentemente un compuesto antisentido mono- o bicatenario preferentemente aislado dirigido a la DGTA-1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediante el procedimiento descrito anteriormente. En una realización más preferida, el compuesto antisentido es un compuesto antisentido monocatenario. En una realización más preferida, el compuesto es un compuesto antisentido quimérico que comprende un intervalo de longitud de nucleósidos consecutivos, siendo el extremo superior del intervalo de 50 nucleósidos y siendo el extremo inferior del intervalo de 12 nucleósidos, comprendiendo adicionalmente una o más de una modificación de nucleobases, una modificación de enlace internucleosídico, una modificación glucídica de alta afinidad o una combinación de las mismas y adicionalmente comprendiendo no más de tres emparejamientos erróneos con una secuencia de ácido nucleico diana que codifica la DGAT-1.

Kits, reactivos de investigación y diagnóstico

Los compuestos antisentido de la presente invención pueden utilizarse para el diagnóstico y como reactivos y kits de investigación. Adicionalmente, los compuestos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con especificidad, se usan a menudo por los expertos habituales en la técnica para aclarar la función de genes particulares o para diferenciar entre funciones de diversos miembros de una ruta biológica.

Para su uso en kits y diagnósticos, los compuestos antisentido de la presente invención, tanto en solitario o en combinación con otros compuestos o agentes terapéuticos, pueden usarse como herramientas en análisis diferenciales y/o combinatorios para aclarar modelos de expresión de una parte o de todo el complemento de genes expresados dentro de las células y tejidos. Los procedimientos de los análisis de expresión de genes son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Compuestos

La expresión “compuesto oligomérico” se refiere a una estructura polimérica capaz de hibridarse con una región de una molécula de ácido nucleico. Generalmente, los compuestos oligoméricos comprenden una pluralidad de subunidades monoméricas unidas entre sí mediante grupos de enlace internucleosídico y/o miméticos de enlace internucleosídico. Cada una de las subunidades monoméricas comprende un glúcido, un glúcido abásico, un glúcido modificado, o un mimético de glúcido, y a excepción del glúcido abásico incluye una nucleobase, una nucleobase modificada o un mimético de nucleobase. Las subunidades monoméricas preferidas comprenden nucleósidos y nucleósidos modificados.

Un “compuesto antisentido” o “compuesto oligomérico antisentido” se refiere a un compuesto oligomérico que es al menos parcialmente complementario a la región de una molécula de ácido nucleico diana a la cual se hibrida y que modula (aumenta o disminuye) su expresión. Esta expresión incluye oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, compuestos oligoméricos antisentido y combinaciones quiméricas de estos. Por consiguiente, cuando se dice que todos los compuestos antisentido son compuestos oligoméricos, no todos los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido. Un “oligonucleótido antisentido” es un compuesto antisentido que es un oligómero basado en ácido nucleico. Un oligonucleótido antisentido puede, en algunos casos, incluir una o más modificaciones químicas con respecto al glúcido, base y/o enlaces internucleosídicos. Como ejemplos no limitantes de compuestos antisentido se incluyen cebadores, sondas, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia guía externa (SGE), empalmadores alternativos y ARNip. Como tal, estos compuestos pueden introducirse en forma de cadena sencilla, cadena doble, circular, ramificada u horquillas y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias

o bucles internos o terminales. Los compuestos bicatenarios antisentido pueden ser dos cadenas hibridadas para formar compuestos bicatenarios o una cadena sencilla con suficiente auto-complementariedad para permitir la hibridación y formación de un compuesto parcial o completamente bicatenario. Los compuestos de la presente invención no son auto-catalíticos. Como se usa en el presente documento, “auto-catalítico” significa un compuesto que tiene la capacidad de promover la escisión del ARN diana en ausencia de factores accesorios, por ejemplo proteínas.

En una realización, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido monocatenario. En algunas realizaciones de la invención el compuesto antisentido contiene modificaciones químicas. En una realización preferida, el compuesto antisentido es un oligonucleótido quimérico, monocatenario, en el que las modificaciones de glúcidos, bases y enlaces internucleosídicos se seleccionan independientemente. En una realización más preferida el compuesto es un compuesto antisentido quimérico que comprende un intervalo de longitud de nucleósidos consecutivos, en el que el extremo superior del intervalo es de 50 nucleósidos y en el que el extremo inferior del intervalo es de 12 nucleósidos, comprendiendo adicionalmente una o más de una modificación de nucleobases, una modificación de enlace internucleosídico, una modificación glucídica de alta afinidad o una combinación de los mismos y comprendiendo adicionalmente no más de tres emparejamientos erróneos con la secuencia de ácido nucleico diana (SEC ID Nº: 4) que codifica la DGAT-1.

Los compuestos antisentido del presente documento pueden comprender un intervalo de longitud de nucleósidos consecutivos en el que el extremo superior del intervalo es de 50 nucleósidos y en el que el extremo inferior del intervalo es 12 nucleósidos. Más preferentemente, el extremo superior del intervalo es de 35 nucleósidos y el extremo inferior del intervalo es de 14 nucleósidos. Más preferentemente aún, el extremo superior del intervalo es de 24 nucleósidos y en el que el extremo inferior del intervalo es de 17 nucleósidos. Más preferentemente el compuesto antisentido tiene 20 nucleósidos consecutivos. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que el extremo superior del intervalo, como se desvela en el presente documento, comprende 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 nucleósidos consecutivos y el extremo inferior del intervalo comprende 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleósidos consecutivos.

Se considera que los compuestos antisentido, como se describe en el presente documento, que comprenden un tramo de al menos 8, preferentemente de al menos 12, más preferentemente de al menos 15 nucleósidos consecutivos, seleccionado del interior de las regiones diana activas, también son compuestos antisentido adecuados.

En los compuestos antisentido de la presente invención pueden realizarse modificaciones y pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleobases seleccionadas, posiciones glucídicas o a uno de los enlaces internucleosídicos. Las posibles modificaciones incluyen, pero sin limitación, modificaciones glucídicas de alta afinidad 2’-fluoro (2’-F), 2’-OMetilo (2’-OMe), 2’-O-(2-metoxietilo) (2’-MOE), terminaciones abásicas inversas, deoxinucleobases y análogos de nucleobases bicíclicas tales como ácidos nucleicos bloqueados (ANB) y ácidos nucleicos con puentes de etileno (ANE).

En una realización de la invención, los compuestos antisentido bicatenarios incluyen ARN interferente pequeño (ARNip). Como se usa en el presente documento, el término “ARNip” se define como un compuesto bicatenario que tiene una primera cadena y una segunda cadena, teniendo cada cadena una parte central y dos partes terminales independientes. La parte central de la primera cadena es complementaria a la parte central de la segunda cadena, permitiendo la hibridación de las cadenas. Opcionalmente, las partes terminales son independientemente complementarias con la parte terminal correspondiente de la cadena complementaria. Los extremos de las cadenas pueden modificarse añadiendo uno o más nucleósidos naturales o modificados para formar un saliente.

Cada cadena del dúplex de ARNip puede encontrarse dentro de los intervalos de longitud descritos anteriormente. En una realización preferida, cada cadena del dúplex de ARNip es de aproximadamente 17 a aproximadamente 25 nucleósidos. Las dos cadenas pueden ser completamente complementarias (es decir, formar un compuesto de extremos romos), o pueden incluir un saliente en 5’ o 3’ en una o ambas cadenas. Pueden fabricarse compuestos bicatenarios incluyendo modificaciones químicas, como se describe en el presente documento.

Modificaciones químicas

Como se conoce en la técnica, y como se ha indicado en el presente documento, el término “nucleósido” se usa para referirse a una combinación de glúcido-base de una unidad monomérica de ácido nucleico. La parte base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que adicionalmente incluyen un grupo fosfato unido covalentemente a la parte glucídica del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un glúcido de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse al resto 2’, 3’ ó 5’ hidroxilo del glúcido. En la formación de oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. Dentro de los oligonucleótidos, a los grupos fosfato se les denominan normalmente formadores de la estructura internucleósido del oligonucleótido. El enlace o estructura normal del ARN o ADN es un enlace fosfodiéster en dirección 3’ a 5’. Frecuentemente, se prefiere incluir modificaciones químicas en los oligonucleótidos para modificar su actividad. Las modificaciones químicas pueden modificar la actividad del oligonucleótido, aumentando, por ejemplo, la afinidad de un oligonucleótido antisentido por su ARN diana, la resistencia a nucleasas, y/o modificando las propiedades farmacocinéticas del oligonucleótido. El uso de modificaciones químicas para aumentar la afinidad de un oligonucleótido por su diana puede permitir el uso de compuestos oligonucleotídicos más pequeños.

El término “nucleobase” o la expresión “resto de base heterocíclica” como se usa en el presente documento, se refiere a la parte de la base heterocíclica de un oligonucleósido. En general, una nucleobase es cualquier grupo que contiene uno o más átomos o grupos de átomos capaces de formar enlaces de hidrógeno con una base de otro ácido nucleico. Además de nucleobases "no modificadas" o "naturales", tales como las nucleobases purínicas, adenina (A) y guanina (G) y las nucleobases pirimidínicas, timidina (T), citosina (C) y uracilo (U), muchas nucleobases modificadas o miméticos de nucleobases, conocidos por los expertos en la técnica, son factibles para la presente invención. Las expresiones nucleobases modificadas y miméticos de nucleobases pueden solaparse pero generalmente una nucleobase modificada se refiere a una nucleobase que es bastante similar, en cuanto a la estructura, a la nucleobase parental, tal como, por ejemplo, una 7-deaza purina o una 5-metil citosina, mientras que un mimético de nucleobase incluiría estructuras más complicadas, tales como, por ejemplo, un mimético de nucleobase de fenoxazina tricíclica. Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos para fabricar las nucleobases modificadas indicadas anteriormente.

Los compuestos antisentido de la presente invención también pueden contener uno o más nucleósidos que tienen restos glucídicos modificados. El anillo furanosilo del glúcido de un nucleósido puede modificarse de diversas maneras incluyendo, pero sin limitación, la adición de un grupo sustituyente, la formación de puentes de dos átomos de anillo no geminales para formar un ácido nucleico bicíclico (ANB) y la sustitución de oxígeno del anillo en la posición 4 por un átomo o grupo, tal como, S-, N(R) o C(R1)(R2). Se conocen bien restos glucídicos modificados y pueden usarse para modificar, típicamente aumentar, la afinidad del compuesto antisentido por su diana y/o aumentar la resistencia a nucleasas. Un listado representativo de glúcidos modificados preferidos incluye, pero sin limitación, glúcidos bicíclicos modificados (ANB), incluyendo ANL y ANE (puente en 4’-(CH2)2-O-2’); y glúcidos sustituidos, especialmente glúcidos 2’- sustituidos que tienen un grupo sustituyente 2’-F, 2’-OCH2 o un 2’-O(CH2)2-OCH3. Los glúcidos también pueden reemplazarse, entre otros, con grupos miméticos glucídicos. Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos para preparar glúcidos modificados.

Los grupos de enlace internucleosídico unen entre sí nucleósidos o, de otra manera, unidades monoméricas modificadas, formando por tanto un compuesto antisentido. Las dos clases principales de grupos de enlace internucleosídico se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos representativos que contienen fósforo incluyen, pero sin limitación, fosfosdiésteres, fosfostriésteres, metil fosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los grupos de enlace internucleosídico representativos que no contienen fósforo incluyen, pero sin limitación, metilenmetilimino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), tiodiéster (-O-C(O)-S-), tionocarbamato (-O-C(O)(NH)-S-); siloxano (-O-Si(H)2-O-) y N,N’-dimetilhidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Los compuestos antisentido que tienen grupos de enlace internucleosídico que no tienen fósforo se denominan oligonucleósidos. Los enlaces internucleosídicos modificados, en comparación con los enlaces fosfodiéster naturales, pueden usarse para modificar, típicamente aumentar, la resistencia a nucleasas del compuesto antisentido. Los enlaces internucleosídicos que tienen un átomo quiral pueden prepararse racémicos, quirales o mezclados. Los enlaces internucleósido quirales representativos incluyen, pero sin limitación, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos para preparar enlaces que contienen fósforo y enlaces que no contienen fósforo.

Como se usa en el presente documento, el término “mimético” se refiere a grupos que están sustituidos por un glúcido, una nucleobase y/o un enlace internucleosídico. Generalmente, en lugar del glúcido o combinación de enlace internucleosídico-glúcido, se usa un mimético, y la nucleobase se mantiene para la hibridación con una diana seleccionada. Los ejemplos representativos de un mimético glucídico incluyen, pero sin limitación, ciclohexenil o morfolino. Los ejemplos representativos de un mimético para una combinación de enlace internucleosídico-glúcido incluyen, pero sin limitación, ácidos nucleicos peptídicos (ANP) y grupos morfolino unidos mediante enlaces aquirales no cargados. En algunos casos, en lugar de la nucleobase se usa un mimético. Los miméticos de nucleobase representativos se conocen bien en la técnica e incluyen, pero sin limitación, análogos tricíclicos de fenoxazina y bases universales (Berger y col., Nuc Acid Res. 2000, 28: 2911-14). Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos de síntesis de miméticos de glúcidos, nucleósidos y nucleobases.

Como se usa en el presente documento el término "nucleósido" incluye, nucleósidos, nucleósidos abásicos, nucleósidos modificados y nucleósidos que tienen bases miméticas y/o grupos glucídicos.

En el contexto de la presente invención, el término “oligonucleótido” se refiere a un compuesto oligomérico que es un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN). Este término incluye oligonucleótidos compuestos por nucleobases de origen natural y no natural, glúcidos y enlaces internucleosídicos covalentes, posiblemente incluyendo también conjugados de ácido no nucleico.

La presente invención proporciona compuestos que tienen grupos fósforo reactivos útiles para la formación de enlaces internucleosídicos que incluyen por ejemplo enlaces internucleosídicos fosfosdiéster y fosforotioato. Los procedimientos para la preparación y/o purificación de precursores o compuestos antisentido de la presente invención no son una limitación de las composiciones o procedimientos de la invención. Los procedimientos para la síntesis y purificación de ADN, ARN y los compuestos antisentido de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Como se usa en el presente documento la expresión “compuesto quimérico antisentido” se refiere a un compuesto antisentido que tiene al menos un glúcido, nucleobase y/o enlace internucleosídico que está modificado diferencialmente en comparación con los otros glúcidos, nucleobases y enlaces internucleosídicos dentro del mismo compuesto oligomérico. Los restantes glúcidos, nucleobases y enlaces internucleosídicos pueden, o no, modificarse independientemente. En general, un compuesto oligomérico quimérico tendrá nucleósidos modificados que pueden estar en posiciones aisladas o agrupadas entre sí en regiones que definirán un motivo particular. Un compuesto oligomérico quimérico de la presente invención puede comprender cualquier combinación de modificaciones y o grupos miméticos.

Los compuestos oligoméricos quiméricos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir resistencia aumentada a la degradación por nucleasas, captación celular aumentada y/o afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico diana. Una región adicional del compuesto oligomérico puede servir como un sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. Como ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. La activación de la RNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión del ADN diana, por lo tanto potenciando enormemente la eficacia de la inhibición de la expresión génica. Por consiguiente, cuando se usan quimeras, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con compuestos oligoméricos más pequeños, en comparación, por ejemplo, con desoxioligonucleótidos de fosforotioato que se hibridan con la misma región diana. La escisión del ADN diana puede detectarse rutinariamente mediante electroforesis en gel, y si fuera necesario, mediante técnicas de hibridación de ácido nucleico asociadas conocidas en la técnica.

Adicionalmente, pueden describirse determinados compuestos oligoméricos quiméricos, así como no quiméricos, por tener un motivo particular. Como se usa en la presente invención, el término "motivo" se refiere a la orientación de restos glucídicos modificados y/o grupos miméticos glucídicos en un compuesto antisentido con respecto a nucleósidos similares o modificados o no modificados diferencialmente. Como se usa en la presente invención, las expresiones “glúcidos”, "restos glucídicos” y “grupos miméticos glucídicos” se usan de manera indistinta. Tales motivos incluyen, pero sin limitación, motivos con huecos, motivos alternantes, motivos completamente modificados, motivos hemiméricos, motivos en bloque y motivos posicionalmente modificados. La secuencia y la estructura de las nucleobases y tipos de enlaces internucleosídicos no es un factor en la determinación del motivo de un compuesto antisentido.

Como se usa en la presente invención la expresión “motivo con hueco” se refiere a un compuesto antisentido que comprende una secuencia contigua de nucleósidos que está dividida en 3 regiones, una región interna (hueco) flanqueada por dos regiones externas (alas). Las regiones se diferencian entre sí por tener al menos grupos glucídicos diferencialmente modificados que comprenden los nucleósidos. En algunas realizaciones, cada región modificada se modifica uniformemente (por ejemplo los grupos glucídicos modificados en una región determinada son idénticos); sin embargo, a las regiones pueden aplicarse otros motivos. Por ejemplo, las alas en un oligómero con huecos podrían tener un motivo alternante. Los nucleósidos localizados en el hueco de un compuesto antisentido con huecos tienen restos glucídicos que son diferentes a los de los restos glucídicos modificados en cada una de las alas. Como ejemplo únicamente, y no como limitación, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 20 nucleobases comprende cinco modificaciones 2’-O-(2-metoxietilo) glucídicas consecutivas en el extremo 5’ del compuesto, seguido por diez 2’-desoxi glúcidos consecutivos a los que les siguen cinco modificaciones 2’-O-(2-metoxietilo) glucídicas consecutivas en el extremo 3’ del compuesto. Este motivo representa un hueco 2’desoxi flanqueado por alas 2’-O-(2-metoxietilo). En un ejemplo adicional, no limitativo, un compuesto antisentido de 14 nucleobases de longitud comprende tres modificaciones 2’-O-(2-metoxietilo) glucídicas consecutivas en el extremo 5’ del compuesto, seguido de ocho 2’desoxi glúcidos consecutivos a los que les siguen tres modificaciones 2’-O-(2-metoxietilo) glucídicas consecutivas en el extremo 3’ del compuesto. Este motivo también representa un hueco 2’desoxi flanqueado por alas 2’-O-(2-metoxietilo).

Como se usa en la presente invención, la expresión “motivo alternante” se refiere a un compuesto antisentido que comprende una secuencia de nucleósidos contigua que comprende dos nucleósidos glucídicos modificados diferencialmente que se alternan esencialmente a lo largo de toda la secuencia del compuesto antisentido, o esencialmente a lo largo de la secuencia completa de una región de un compuesto antisentido.

Como se usa en la presente invención, la expresión “motivo completamente modificado” se refiere a un compuesto antisentido que comprende una secuencia de nucleósidos contigua en la que esencialmente cada nucleósido es un nucleósido modificado con glúcido que tiene una modificación uniforme.

Como se usa en la presente invención, la expresión “motivo hemimérico” se refiere a una secuencia de nucleósidos que tiene restos glucídicos uniformes (glúcidos idénticos, modificados o no modificados) y en la que el extremo 5’ o el extremo 3’ tiene una secuencia de 2 a 12 nucleósidos que son nucleósidos modificados con glúcido que son diferentes de los otros nucleósidos en el compuesto antisentido hemimérico modificado.

Como se usa en la presente invención, la expresión “motivo en bloque” se refiere a una secuencia de nucleósidos que tiene glúcidos uniformes (glúcidos idénticos, modificados o no modificados) que está internamente interrumpida por un bloque de nucleósidos modificados con glúcido que están uniformemente modificados y en el que la modificación es diferente de la de otros nucleósidos. Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos para preparar compuestos oligonucleotídicos quiméricos.

Como se usa en la presente invención, la expresión “motivo posicionalmente modificado” comprende los motivos restantes. Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos para preparar compuestos oligonucleotídicos posicionalmente modificados.

Los compuestos descritos en el presente documento contienen uno o más centros asimétricos y por tanto dan lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras configuraciones estereoisoméricas que pueden definirse, en cuanto a estereoquímica absoluta, como (R) o (S), a o 1, o como (D) o (L) tal como para aminoácidos y otros. La presente invención pretende incluir todos estos isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras.

En un aspecto de la presente invención, los compuestos antisentido se modifican mediante unión covalente de uno o más grupos conjugados. Los grupos conjugados pueden unirse mediante uniones reversibles o irreversibles. Los grupos conjugados pueden unirse directamente a compuestos antisentido o mediante el uso de un engarce. Los engarces pueden ser engarces mono o bifuncionales. Dichos procedimientos de unión y engarces son bien conocidos por los expertos en la técnica. En general, los grupos conjugados se unen a los compuestos antisentido para modificar una o más propiedades. Dichas consideraciones son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Síntesis de oligómeros

La oligomerización de nucleósidos modificados y no modificados puede realizarse de acuerdo con procedimientos bibliográficos para ADN (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Human Press) y/o ARN (Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait y col., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo y col., (2001), Tetrahedrom 57, 5707-5713).

Los compuestos antisentido de la presente invención pueden fabricarse de manera conveniente y rutinaria mediante técnicas bien conocidas de síntesis de fase sólida. Los equipos para realizar dicha síntesis los comercializan diversos proveedores, incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Para dicha síntesis puede emplearse, de manera adicional o alternativa, cualquier otro medio conocido en la técnica. Se conoce bien el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. La invención no se limita al procedimiento de síntesis de compuestos antisentido.

Purificación y análisis de oligómeros

Los procedimientos de purificación y análisis de oligonucleótidos son conocidos por los expertos en la técnica. Los procedimientos de análisis incluyen electroforesis capilar (EC) y espectroscopia de masas por electropulverización. Dichos procedimientos de síntesis y análisis pueden realizarse en placas multipocillo. El procedimiento de la invención no está limitado por el procedimiento de purificación de oligómeros.

Sales, profármacos y bioequivalentes

Los compuestos pueden comprender cualquiera de las sales, ésteres, o sales de dichos ésteres, farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro equivalente químico funcional que, tras la administración a un animal, incluyendo un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o resto del mismo biológicamente activo. Por consiguiente, la descripción también puede presentar, por ejemplo, profármacos que comprendan los compuestos antisentido, que adicionalmente puedan comprender, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y de otros bioequivalentes.

El término “profármaco” indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva o menos activa que se convierte en una forma activa (es decir, fármaco) dentro del organismo o de las células del mismo mediante la acción de enzimas, productos químicos y/o condiciones endógenas. En particular, las versiones profarmacológicas de los compuestos se preparan como derivados de SATE ((S-acetil-2-tioetil)fosfato) de acuerdo con los procedimientos descritos en los documentos WO 93/24510 o WO 94/26764. Los profármacos pueden incluir compuestos antisentido en los que uno o ambos extremos comprenden nucleósidos que están escindidos (por ejemplo, enlaces estructurales fosfodiéster) para producir el compuesto activo.

La expresión “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos: es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del precursor y que no otorgan a los mismos efectos toxicológicos indeseados. Como ejemplo únicamente, las sales de sodio de los oligonucleótidos antisentido son útiles y bien aceptadas para la administración terapéutica en seres humanos. En otra realización, también se proporcionan sales de sodio de compuestos de ARN bicatenarios.

Formulaciones

Los compuestos también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o, asociarse, de otro modo, con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden un compuesto que modula la actividad de la DGAT-1. Más preferentemente, el compuesto es un inhibidor específico de la actividad de la DGAT-1. Más preferentemente, el compuesto es un compuesto antisentido. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de diversas maneras dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área que vaya a tratarse.

Las formulaciones farmacéuticas, que pueden presentarse convenientemente en forma de farmacéutica unitaria, pueden prepararse de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el vehículo (o vehículos) o excipiente (o excipientes) farmacéutico. En general las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente los principios activos con vehículos líquidos, vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si fuera necesario, dar forma al producto (por ejemplo, en un tamaño de partícula específico para la administración).

Un " vehículo" o "excipiente" farmacéutico puede ser un disolvente, un agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte, farmacéuticamente aceptable, para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal y son conocidos en la técnica. El excipiente puede ser sólido o líquido y se selecciona teniendo en cuenta la manera de administración planificada para proporcionar el volumen, consistencia, etc., deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacológica determinada.

Combinaciones

Las composiciones pueden contener dos o más compuestos. En una realización preferida, los dos o más compuestos son moduladores de la actividad de la DGAT-1. En una realización adicional preferida, los dos o más compuestos son útiles para el tratamiento de la fibrosis hepática, bien directamente o tratando un factor etiológico causante. En otra realización relacionada, las composiciones pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos contra un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos contra una segunda diana de ácido nucleico. En un aspecto de esta realización, el primer ácido nucleico dirigido es la DGAT-1 y el segundo ácido nucleico dirigido está asociado con un factor etiológico subyacente para la fibrosis hepática; por ejemplo la DGAT-2. La DGAT-2 se ha desvelado como un tratamiento para la obesidad, diabetes, esteatosis hepática, colesterolemia y otras indicaciones similares. (Solicitud de Estados Unidos Publicada Nº US2005-0272680). Como alternativa, las composiciones pueden contener dos o más compuestos antisentido dirigidos contra diferentes regiones de la misma diana de ácido nucleico. Pueden usarse dos

o más compuestos juntos o de manera secuencial.

Ejemplo 1: Tipos de células y procedimientos de transfección

Tipos de células. El efecto de los compuestos oligoméricos sobre la expresión de los ácidos nucleicos diana se sometió a ensayo en uno o más de los siguientes tipos de células.

Células HepG2: La línea celular de hepatoblastoma humano HepG2 se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA). Las células HepG2 se cultivaron rutinariamente en MEM Eagle complementado con suero fetal de ternero al 10%, aminoácidos no esenciales y piruvato sódico 1 mM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Cuando las células alcanzaron una confluencia del 90%, se sometieron rutinariamente a pases por tripsinización y dilución Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria Nº 3872) a una densidad de 7000 células/pocillo para uso en análisis RT-PCR.

Células b.END: El Dr. Werner Risau del Instituto Max Plank (Bad Nauheim, Alemania) proporcionó la línea celular de endotelio de cerebro de ratón b.END. Las células b.END se cultivaron rutinariamente en DMEM, glucosa superior (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementada con suero fetal de ternero al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Cuando las células alcanzaron una confluencia del 90%, se sometieron rutinariamente a pases por tripsinización y dilución. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria Nº 3872) a una densidad de 3000 células/pocillo para uso en análisis RT-PCR.

Para el análisis de transferencia Northern u otros, las células pueden sembrarse en placas de cultivo tisular de 100 mm u otras convencionales y tratarse de manera similar, usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótidos.

Tratamiento con los compuestos oligoméricos: cuando las células alcanzan la confluencia apropiada, se tratan con los oligonucleótidos usando, como se describe, un procedimiento de transfección.

Lipofectin™. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 65-75%, se trataron con oligonucleótido. El oligonucleótido se mezcló con LIPOFECTIN™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en medio sérico reducido con Opti-MEM™-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para conseguir la concentración deseada del oligonucleótido y una concentración de LIPOFECTIN™ de 2,5 ó 3 !g/ml por oligonucleótido 100 nM. Esta mezcla de transfección se incubó a temperatura ambiente aproximadamente durante 0,5 horas. Para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavaron una vez con 100 !l de OPTI-MEMTM™-1 y después se trataron con 130 !l de la mezcla de transfección. Las células cultivadas en placas de 24 pocillos o en otras placas de cultivo tisular convencionales se trataron de manera similar, usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido. Las células se trataron y los datos se obtuvieron por duplicado o por triplicado. Después de aproximadamente 4-7 horas de tratamiento a 37 ºC, el medio que contenía la mezcla de transfección se sustituyó por medio de cultivo recién preparado. Las células se recogieron 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido.

Oligonucleótidos de control

Los oligonucleótidos de control se usan para determinar la concentración óptima del compuesto oligomérico para una línea celular particular. Adicionalmente, cuando los compuestos oligoméricos de la invención se someten a ensayo en experimentos de exploración de compuestos oligoméricos o ensayos fenotípicos, los oligonucleótidos de control se someten a ensayo en paralelo con los compuestos de la invención.

La concentración del oligonucleótido usado varía de una línea celular a otra. Para determinar la concentración óptima de oligonucleótido para una línea celular particular, las células se tratan con un oligonucleótido de control positivo a una serie de concentraciones. La concentración de oligonucleótido de control positivo que da como resultado una inhibición del 80% del ARNm diana se utiliza entonces como la concentración de exploración para nuevos oligonucleótidos en experimentos posteriores para esa línea celular. Si no se consigue una inhibición del 80%, la concentración más baja del oligonucleótido de control positivo que da como resultado una inhibición del 60% del ARNm diana se utiliza entonces como la concentración de exploración de oligonucleótidos en experimentos posteriores para esa línea celular. Si no se consigue una inhibición del 60%, esta línea celular particular se considera como inadecuada para los experimentos de transfección de oligonucleótidos. Cuando el oligonucleótido antisentido se transfecta usando un reactivo liposómico, las concentraciones de los oligonucleótidos antisentido usados en el presente documento son de 50 nM a 300 nM y de 1 !M a 40 !M cuando el oligonucleótido antisentido se transfecta por electroporación.

Para células humanas el oligonucleótido de control positivo se selecciona ente el Oligo 13920 (TCCGTCATCGCTCCTCAGGG, SEC ID Nº: 10) que está dirigido a la H-ras humana o el Oligo 18078, (GTGCGCGCGAGCCCGAAATC, SEC ID Nº: 11) que está dirigido a la Jun-N-terminal quinasa-2 (JNK2). Ambos controles son oligómeros con huecos (2’-O-metoxietil (2’-O-metoxietilos mostrados en negrita) con una estructura fosfotioato. Para células de ratón o de rata el oligonucleótido de control positivo es el Oligo 15770 (ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEC ID Nº: 12).

Ejemplo 2: Análisis por PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm de la DGAT-1

La cuantificación de los niveles de ARNm de la DGAT-1 se realizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM™ 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Antes de realizar el análisis por PCR cuantitativa, se evaluaron los conjuntos cebador-sonda específicos para la DGAT-1 que iba a medirse para determinar su capacidad para “formar complejos múltiples” con una reacción de amplificación con GAPDH. Después del aislamiento el ARN se sometió a una reacción de transcriptasa inversa (RT, Reverse Transcriptase) secuencial y PCR en tiempo real, ambas realizadas en el mismo pocillo. Los reactivos de la RT y PCR se obtuvieron de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). La PCR RT, se realizó también añadiendo un cóctel de PCR de 20 !l (tampón PCR 2,5x sin MgCl2, MgCl2 6,6 mM, 375 !M de cada uno de dATP, dCTP y dGTP, 375 nM de cada uno de cebador directo y cebador inverso, 125 nM de sonda, 4 unidades de inhibidor RNAsa, 1,25 unidades de PLATINUM® Taq, 5 unidades de transcriptasa inversa MuLV y colorante ROX 2,5x) a placas de 96 pocillos que contenían una solución de ARN total 30 !l (20-200 ng). La reacción de RT se realizó por incubación durante 30 minutos a 48 ºC. Después de una incubación de 10 minutos a 95 °C para activar el PLATINUM® Taq, se realizaron 40 ciclos de un protocolo de PCR en dos etapas: 95 ºC durante 15 segundos (desnaturalización) seguido por 60 °C durante 1,5 minutos (hibridación/extensión).

Las cantidades de los genes diana obtenidas por RT, PCR en tiempo real, se normalizaron usando el nivel de

5 expresión de la GADPH, un gen cuya expresión es constante, o cuantificando el ARN total usando RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de la GAPDH se cuantificó mediante RT, PCR en tiempo real, realizándose simultáneamente con la diana, formando complejos múltiples o individualmente. El ARN total se cuantificó usando el reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR).

En una placa de 96 pocillos que contenía ARN celular purificado 30 !l se introdujeron, mediante una pipeta, 170 !l

10 de reactivo de trabajo RiboGreen™ (reactivo RiboGreen™ diluido 1:350 en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La placa se leyó en un CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) con una excitación a 485 nm y una emisión a 530 nm.

Las sondas de PCR para la GAPDH tenían JOE unido covalentemente al extremo 5’ y TAMRA o MGB unido covalentemente al extremo 3’, en el que JOE es el colorante indicador fluorescente y TAMRA o MGB es el colorante

15 extintor. En algunos tipos de células, para medir la expresión de la GAPDH, se usaron cebadores y sondas diseñados para una secuencia de GAPDH de una especie diferente. Por ejemplo, para medir la expresión de la GAPDH en células y líneas celulares derivadas de mono se usa un conjunto de cebador y sonda de la GAPDH humana.

Se diseñaron sondas y cebadores para su uso en la PCR en tiempo real para hibridarse con secuencias específicas

20 de la diana. En la Tabla 2 se presentan los cebadores y las sondas y las secuencias de ácido nucleico diana a las cuales se hibridan. Las sondas de PCR específicas diana poseen colorante fluorescente y colorante extintor unidos covalentemente a los compuestos.

Tabla 2

Cebadores y sondas específicos de DGAT-1 para su uso en PCR en tiempo real

Especie

SEC ID Nº diana Descripción de la secuencia Secuencia (5’ a 3’) SEC ID Nº

Ser humano

Cebador directo TCCCCGCATCCGGAA 13

Ser humano

Cebador inverso CTGGGTGAAGAACAGCATCTCA 14

Ser humano

Sonda FAM-CGCTTTCTGCTGCGACGGATCC- TAMRA 15

Ratón

Cebador directo GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 16

Ratón

Cebador inverso GAAGATGGTGATGGGATTTC 17

Ratón

Sonda JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 88

25 Ejemplo 3: Inhibición antisentido de la expresión de la DGAT-1 humana mediante compuestos oligoméricos

Se diseñó una serie de compuestos antisentido para dirigirse a regiones diferentes de ARN de la DGAT-1 humana, usando secuencias publicadas o partes de secuencias publicadas como las indicadas en la Tabla 1. La exploración identificó segmentos diana activos dentro de la secuencia de ARNm de la DGAT-1 humana, específicamente el Nº GenBank (SEC ID Nº: 4). Los compuestos indicados en la Tabla 3 son oligonucleótidos quiméricos (“oligómeros con 30 huecos”) de 20 nucleósidos de longitud, compuestos por una región “hueco” central que consiste en diez 2’desoxinucleótidos que está flanqueada, en ambos lados (direcciones 5’ y 3’), por cinco nucleótidos “alas”. Las alas están compuestas por nucleótidos 2-metoxietilo (2’-MOE). Los enlaces (estructurales) internucleósido son fosforotioato (P = S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos citosina son 5-metil citosina. Los datos son medias de tres experimentos en los que se trataron células HepG2 con 75 nM de los oligonucleótidos antisentido de

35 la presente invención.

Tabla 3

Inhibición de los niveles de ARNm de la DGAT-1 humana mediante oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi

COMPUESTO Nº

REGIÓN SEC ID Nº DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % INHIB SEC ID Nº

191617

5’UTR 4 1 gccgcctctctcgtccattc 57 18

191619

5’UTR 4 21 gagccgctaactaatggacg 37 19

191621

5’UTR 4 41 acaacggctgcgttgctccg 30 20

191623

5’UTR 4 71 ccgcccgcgtcaggcccgtc 40 21

191625

5’UTR 4 91 gcctcaccagcgcgttcaac 20 22

191627

5’UTR 4 120 ccctgccggccgccgtagcc 24 23

191629

5’UTR 4 151 ctccgggccctagacaacgg 45 24

191631

5’UTR 4 181 gttcgtagcgcccgaggcgc 53 25

191633

5’UTR 4 211 cccggccgcagccaagcgtg 44 26

191635

Codón de inicio 4 231 gcccatggcctcagcccgca 77 27

191637

Codificante 4 281 tggctcgagggccgcgaccc 58 28

191639

Codificante 4 301 ccgcaggcccgccgccgccg 49 29

191641

Codificante 4 321 ccgcacctcttcttccgccg 40 30

191643

Codificante 4 401 acgccggcgtctccgtcctt 92 31

191645

Codificante 4 421 gctcccagtggccgctgccc 60 32

191647

Codificante 4 441 ctgcaggcgatggcacctca 85 33

191649

Codificante 4 491 aggatgccacggtagttgct 62 34

191651

Codificante 4 511 gcatcaccacacaccagttc 37 35

191653

Codificante 4 561 gccatacttgatgaggttct 48 36

191655

Codificante 4 651 gacattggccgcaataacca 47 37

191657

Codificante 4 681 cttctcaacctggaatgcag 29 38

191659

Codificante 4 721 gcagtcccgcctgctccgtc 50 39

191661

Codificante 4 741 caggttggctacgtgcagca 31 40

191663

Codificante 4 781 ccagtaagaccacagccgct 62 41

191665

Codificante 4 831 ggtgtgcgccatcagcgcca 59 42

191667

Codificante 4 931 cagcactgctggccttcttc 52 43

191669

Codificante 4 1021 tgagctcgtagcacaaggtg 43 44

191671

Codificante 4 1121 cactgctggatcagccccac 20 45

191673

Codificante 4 1181 atgcgtgagtagtccatgtc 59 46

(continuación)

Inhibición de los niveles de ARNm de la DGAT-1 humana mediante oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi

COMPUESTO Nº

REGIÓN SEC ID Nº DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % INHIB SEC ID Nº

191675

Codificante 4 1231 tgagccagatgaggtgattg 62 47

191677

Codificante 4 1281 gagctcagccacggcattca 76 48

191679

Codificante 4 1351 tctgccagaagtaggtgaca 30 49

191681

Codificante 4 1611 gatgagcgacagccacacag 21 50

191683

Codificante 4 1671 ctcatagttgagcacgtagt 73 51

191685

3’UTR 4 1721 cagtgagaagccaggccctc 68 52

191687

3’UTR 4 1781 ccatccccagcactcgaggc 68 53

191689

3’UTR 4 1801 aggatgctgtgcagccaggc 73 54

191691

3’UTR 4 1851 ggtgcaggacagagccccat 72 55

191693

3’UTR 4 1881 gtgtctggcctgctgtcgcc 71 56

191695

3’UTR 4 1901 ctcccagctggcatcagact 76 57

Como se muestra en la Tabla 3, en este ensayo, las SEC ID Nos 18, 25, 27, 28, 31, 32, 33, 34, 39, 41, 42, 43, 46, 47, 48, 51, 52, 53, 54, 55, 56 y 57 demostraron una inhibición de la expresión de la DGAT-1 humana de al menos el 5 50% y son, por lo tanto, preferidas. Son más preferidas las SEC ID Nos: 31, 33, 27 y 57. En el presente documento, las regiones diana con las que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan “segmentos diana preferidos” y son, por lo tanto, preferidas para dirigirse por los compuestos de la presente invención. En la Tabla 3 se muestras estos segmentos diana preferidos. En la Tabla 1 se muestran las secuencias que representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferidos. El “sitio diana” indica el número del primer

10 nucleótido (5’ - la mayoría) sobre el ácido nucleico diana particular al cual se une el oligonucleótido. En la Tabla 3 también se muestra la especie en la que se encontraron cada uno de los segmentos diana preferidos.

Ejemplo 4: Inhibición antisentido de la expresión de la DGAT-1 de ratón mediante oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi.

De acuerdo con la presente invención, se diseñó una segunda serie de compuestos antisentido para dirigirse a 15 diferentes regiones del ARN de la DGAT-1 de ratón, usando secuencias publicadas (número de acceso GenBank AF078752.1, incorporado en el presente documento como SEC ID Nº: 7). Los compuestos se muestran en la Tabla

4. El “sitio diana” indica el número del primer nucleótido (5’-la la mayoría) sobre el ácido nucleico diana particular al cual se une el compuesto. Todos los compuestos indicados en la Tabla 4 son oligonucleótidos quiméricos (“oligómeros con hueco”) de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” central que consiste en 20 diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “alas” de cinco nucleótidos. Las alas están compuestas por nucleótidos 2’-metoxietilo (2’-MOE). Los enlaces (estructurales) internucleósido son fosfotioato (P = S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos citosina son 5-metil citosina. Los compuestos se analizaron para determinar su efecto sobre los niveles de ARNm de la DGAT-1 de ratón mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en los otros ejemplos en el presente documento. Los datos son medias de tres

25 experimentos en los que células b.END se trataron con los oligonucleótidos antisentido de la presente invención. Si está presente, “N.D.” indica que "no hay datos”.

Tabla 4

Inhibición de los niveles de ARNm de DGAT-1 de ratón mediante oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi

COMPUESTO Nº

REGIÓN SEC ID Nº DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % INHIB SEC ID Nº

191723

5’UTR 7 1 ctacttatttccattcatcc 2 58

191724

5’UTR 7 21 tatcctaagtatgcctaatt 0 59

191725

5’UTR 7 31 gcttgagccctatcctaagt 0 60

191726

5’UTR 7 61 ctcgtcgcggcccaatcttc 21 61

191727

Codón de inicio 7 81 cccatggcttcggcccgcac 48 62

191729

Codificante 7 191 cagccgcgtctcgcacctcg 74 63

191730

Codificante 7 232 cggagccggcgcgtcacccc 63 64

191731

Codificante 7 281 ccacgctggtccgcccgtct 67 65

191732

Codificante 7 301 cagatcccagtagccgtcgc 59 66

191733

Codificante 7 321 tcttgcagacgatggcacct 49 67

191734

Codificante 7 371 tcaggataccacgataattg 48 68

191735

Codificante 7 391 cagcatcaccacacaccaat 52 69

191736

Codificante 7 411 aaccttgcattactcaggat 62 70

191737

Codificante 7 451 atccaccaggatgccatact 29 71

191738

Codificante 7 471 agagacaccacctggatagg 42 72

191740

Codificante 7 601 cagcagccccatctgctctg 63 73

191741

Codificante 7 621 gccaggttaaccacatgtag 58 74

191742

Codificante 7 661 aaccagtaaggccacagctg 16 75

191743

Codificante 7 681 cccactggagtgatagactc 42 76

191744

Codificante 7 711 atggagtatgatgccagagc 53 77

191745

Codificante 7 771 acccttcgctggcggcacca 68 78

191746

Codificante 7 841 tggatagctcacagcttgct 56 79

191747

Codificante 7 861 tctcggtaggtcaggttgtc 32 80

191748

Codificante 7 961 ctcaagaactcgtcgtagca 60 81

191749

Codificante 7 1001 gttggatcagccccacttga 37 82

191750

Codificante 7 1061 gtgaatagtccatatccttg 48 83

191751

Codificante 7 1081 taagagacgctcaatgatcc 18 84

191752

Codificante 7 1161 tctgccacagcattgagaca 50 85

(continuación)

Inhibición de los niveles de ARNm de DGAT-1 de ratón mediante oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi

COMPUESTO Nº

REGIÓN SEC ID Nº DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % INHIB SEC ID Nº

191753

Codificante 7 1201 ccaatctctgtagaactcgc 55 86

191754

Codificante 7 1221 gtgacagactcagcattcca 56 87

191755

Codificante 7 1271 gtctgatgcaccacttgtgc 72 88

191756

Codificante 7 1301 tgccatgtctgagcataggc 70 89

191757

Codificante 7 1331 atactcctgtcctggccacc 65 90

191759

Codificante 7 1471 attgccatagttcccttgga 68 91

191760

Codificante 7 1491 agtgtcacccacacagctgc 66 92

191761

Codificante 7 1511 ccaccggttgcccaatgatg 71 93

191762

Codificante 7 1531 gtggacatacatgagcacag 62 94

191763

Codificante 7 1551 tagttgagcacgtagtagtc 40 95

191764

Codón de terminación 7 1586 ctttggcagtagctcatacc 37 96

191765

3’UTR 7 1621 tccagaactccaggcccagg 59 97

Como se muestra en la Tabla 2, en este ensayo, las SEC ID Nos: 63, 64, 65, 66, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 79, 81, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 y 97 demostraron una inhibición de la expresión de la DGAT-1 de ratón de al 5 menos el 50% y son, por lo tanto, preferidas. Son más preferidas las SEC ID Nos: 63, 88, 91 y 93. En el presente documento, las regiones diana con las que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan “segmentos diana preferidos” y son, por lo tanto, preferidas para dirigirse por los compuestos de la presente invención. En la Tabla 3 estos segmentos diana de ARNm preferidos se muestran como la secuencia de ARN apropiada, en la que la timina (T) se ha sustituido con uracilo (U) para reflejar una representación correcta de una

10 secuencia de ARN. En las Tablas 1 y 2 se muestran las secuencias que representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferidos. El “sitio diana” indica el número del primer nucleótido (5’ - la mayoría) sobre el ácido nucleico diana particular al cual se une el oligonucleótido. En la Tabla 3 también se muestra la especie en la que se encontraron cada uno de los segmentos diana preferidos.

Ejemplo 5: Análisis de transferencia de Western de los niveles de la DGAT-1

15 Usando procedimientos convencionales, se realizó análisis de transferencia de Western (análisis de inmunotransferencia). Las células se recogieron de 16 a 20 horas después del tratamiento con el oligonucleótido, se lavaron una vez con PBS, se suspendieron en tampón de Laemmli (100 !l/pocillo), se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 16%. Los geles se procesaron durante 1,5 horas a 150 V y se transfirieron a una membrana para realizar la transferencia de Western. Se usó un anticuerpo primario apropiado dirigido a la

20 DGAT-1, con un anticuerpo secundario radiomarcado o marcado con un marcador fluorescente dirigido a la especie de anticuerpo primario. Las bandas se visualizaron usando un instrumento PHOSPHORIMAGER® (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA).

Ejemplo 6: Inhibición antisentido de la expresión de la DGAT-1 de ratón: respuesta a la dosis en células b.END

25 De acuerdo con la presente invención, se investigaron adicionalmente seis oligonucleótidos dirigidos contra la DGAT-1 de ratón, el CMP Nº 191729 (SEC ID Nº: 63), CMP Nº 191731 (SEC ID Nº: 65), CMP Nº 191755 (SEC ID Nº: 88), CMP Nº 191756 (SEC ID Nº: 89), CMP Nº 191759 (SEC ID Nº: 91) y CMP Nº 191761 (SEC ID Nº: 93) en un estudio de respuesta a la dosis.

En el experimento de respuesta a la dosis, con los niveles de ARNm como criterio de valoración, las células b.END

30 se trataron con los compuestos CMP Nº 191729, CMP Nº 191731, CMP Nº 191755, CMP Nº 191756, CMP Nº 191759 o CMP Nº 191761 a dosis de 1, 5, 10, 25, 50 y 100 nM del oligonucleótido. Los datos se obtuvieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en otros ejemplos en el presente documento y se realizó el promedio de tres experimentos y se normalizó frente a las células de control no tratadas. Los datos se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

Inhibición de los niveles de ARNm de la DGAT-1 de ratón mediante oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi: respuesta a la dosis

Dosis (nM)

CMP Nº

SEC ID Nº 1 5 10 25 50 100

% de inhibición

191729

63 26 62 78 80 83 83

191731

65 27 58 57 58 82 85

191755

88 41 59 72 75 83 79

191756

89 13 39 59 65 81 75

191759

91 26 44 74 80 82 86

191761

93 23 63 71 80 85 87

Los datos presentados en la Tabla 5 indican que los compuestos antisentido son capaces de reducir los niveles de ARNm de la DGAT-1 de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 7: Efecto de la inhibición antisentido de la DGAT-1 (CMP Nº 191761) sobre la fibrosis hepática – estudios in vivo

10 La leptina es una hormona producida por el tejido adiposo que regula el apetito. Los déficits en esta hormona tanto en seres humanos como en animales no humanos conducen a la obesidad. Los ratones db/db tienen una mutación en el gen receptor de leptina que da como resultado la obesidad, hiperglucemia e hígado graso, y por tanto, estos ratones son buenos modelos de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). En este ejemplo, se sometieron a ensayo los compuestos oligoméricos de la presente invención en el modelo de EHNA de ratones db/db.

15 Se alimentó a ratones macho db/db, C57B1/6J-Lepr (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), de seis semanas de vida, con una dieta de control (pienso, n = 6) o con una dieta deficiente en metionina y colina (dieta DMC). Los ratones alimentados con dieta DMC se separaron posteriormente en grupos placebo (tratamiento con solución salina) o grupos de tratamiento (tratamiento con el compuesto antisentido DGAT-1). A los grupos de placebo y de tratamiento se les inyectó, por vía intraperitoneal, solución salina o el compuesto antisentido, dos veces a la semana

20 durante cuatro semanas (n = 8) o durante ocho semanas (n = 7). Para ambos, el tratamiento de cuatro semanas y el tratamiento de nueve semanas hubo miembros de ratones placebo y miembros de ratones con tratamiento. El grupo de tratamiento recibió 25 mg/kg del CMP Nº 191761 en cada inyección. Al final del período de tratamiento se extrajo suero y se sacrificó a los ratones.

Usando PCR en tiempo real de ARN total, de tejido de hígado completo, se evaluó la expresión del ARNm de DGAT

25 1, TNF.alfa, TGF.beta, aSMA, colágeno y TIMP-1. La esteatosis hepática se evaluó mediante el contenido en triglicéridos usando tinción de aceite rojo y Hematoxilina-Eosina (HE). También se midió el ALT y otros parámetros en suero.

Las células estrelladas hepáticas (CEH) y células parenquimáticas se separaron usando técnicas convencionales conocidas por los expertos habituales en la materia y se determinaron los niveles de ARNm de la DGAT-1. Las CEH 30 expresaron siete veces más ARNm de DGAT-1 que los hepatocitos. En el grupo placebo los niveles de ARNm de la DGAT-1 se encontraron aproximadamente al 70% en la semana 4, pero volvieron a la línea basal a la semana 8. No hubo ninguna diferencia significativa en la expresión de la DGAT-2 entre los grupos. Por tanto, el compuesto antisentido DGAT-1 es específico para la DGAT-1: (Figura 1). El ARNm de la DGAT-1 del grupo que recibió tratamiento se encontró aproximadamente al 95% a la semana 4 y permaneció en ese nivel en la semana 8. Sin 35 embargo, el tratamiento con el compuesto antisentido DGAT-1 no protegió al grupo de tratamiento de la esteatosis hepática. Durante el estudio, las puntuaciones del contenido en triglicéridos y esteatosis hepática fueron similares en tanto en el grupo de placebo como en el grupo de tratamiento (siendo en los dos grupos aproximadamente 2-3 veces mayor que en el grupo de control alimentado con pienso). De manera similar, los niveles de AST en suero fueron comparables para los grupos de placebo y de tratamiento (618 ± 80 y 557 ± 49 frente a 130 ± 10 UI/l p <

40 0,01). (Figuras 2 y 3) La inhibición de la DGAT-1 disminuyó la fibrosis hepática inducida por la dieta DMC. En comparación con los hígados del grupo placebo, el grupo de tratamiento tuvo una tinción con rojo sirio menos intensa y niveles más bajos 20-30% de hidroxiprolina hepática (p < 0,05 en ambos). (Figura 4). La expresión hepática del ARNm de TGF.beta, aSMA y colágeno disminuyeron en 48%, 67% y 58%, respectivamente. (Figura 5). La inhibición de la DGAT-1 en el hígado reduce la activación de las CEH y la fibrosis hepática en modelos de ratón de EHNA.

Ejemplo 8: Efectos de la inhibición antisentido de la DGAT-2 (CMP Nº 217376) sobre la fibrosis hepática – estudios in vivo

La DGAT-2 se expresa en los hepatocitos y se asocia con la esteatosis hepática. El tratamiento con un compuesto antisentido que inhibe la expresión de la DGAT-2 mejora la esteatosis hepática en ratones obesos (Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº: US2005-0272680). El hígado graso es un factor etiológico causante de la fibrosis hepática.

Se alimentó a ratones macho db/db, C57B1/6J-Lepr (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), de seis semanas de vida, con una dieta de control (pienso, n = 6) o con una dieta deficiente en metionina y colina (dieta DMC). Los ratones alimentados con dieta DMC se separaron posteriormente en grupos placebo (tratamiento con solución salina) o grupos de tratamiento (tratamiento con el compuesto antisentido DGAT-2). A los grupos de placebo y de tratamiento se les inyectó, por vía intraperitoneal, solución salina o el compuesto antisentido, dos veces a la semana durante cuatro semanas (n = 8) o durante ocho semanas (n = 7). Para ambos, el tratamiento de cuatro semanas y el tratamiento de nueve semanas hubo miembros de ratones placebo y miembros de ratones con tratamiento. El grupo de tratamiento recibió 25 mg/kg del CMP Nº 217376 (tccatttattagtctaggaa; SEC ID Nº: 99) en cada inyección. El CMP Nº 217376 es un oligonucleótido quimérico (“con huecos”) de 20 nucleósidos de longitud y dirigido al ARNm de la DGAT-2 de ratón (Nº de acceso Gen Bank: AK002443.1, 15 de febrero de 2001 y SEC ID Nº: 100), compuesto por una región “hueco” central que consiste en diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “alas” de cinco nucleótidos. Las alas están compuestas por nucleótidos 2-O-metoxietilo (2’-MOE). Los enlaces (estructurales) internucleósido son fosforotioato (P = S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citosina son 5-metil citocinas. Al final del período de tratamiento se extrajo el suero y se sacrificó a los ratones.

Usando PCR en tiempo real de ARN total, de tejido de hígado completo, se evaluó la expresión del ARNm de la DGAT-2, TNF.alfa, TGF.beta, a-SMA, colágeno y TIMP-1 usando PCR en tiempo real del ARN total a partir de tejidos de hígado completo. Las células se aislaron usando técnicas convencionales conocidas por los expertos habituales en la materia. La esteatosis hepática se evaluó mediante el contenido en triglicéridos usando tinción de aceite rojo y Hematoxilina-Eosina (HE). También se midió el ALT y otros parámetros en suero.

Las células estrelladas hepáticas (CEH) y células parenquimáticas se separaron usando técnicas convencionales conocidas por los expertos habituales en la materia y se determinaron los niveles de ARNm de la DGAT-1. Los hepatocitos expresaron aproximadamente 150 veces más ARNm de la DGAT-2 que las CEH. La expresión hepática del ARNm de la DGAT-2 no cambió con alimentación con dieta DMC en comparación con la dieta con pienso normal. Sin embargo, hubo una reducción mayor del 90% en la expresión de la DGAT-2 en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo placebo (8 semanas; p < 0.001 frente a controles). El compuesto antisentido DGAT-2 no cambió significativamente la expresión de la DGAT-1 (Figura 6). El contenido de triglicéridos en hígado aumentó aproximadamente 2 veces en el grupo control sobre el grupo placebo. De manera similar, los niveles de ALT en suero y la expresión hepática del ARNm de TGF.beta., a-SMA, TIMP-1 y colágeno aumentó 6 veces, 2 veces, 4 veces, 10 veces y 6 veces, respectivamente, en los ratones de control sobre los ratones placebo (p < 0,01 frente a control). El nivel de hidroxiprolina fue de 40% más elevado en el grupo alimentado con dieta DMC en comparación con el grupo control (8 semanas; p < 0,05) y la tinción con rojo sirio fue más intensa. (Figuras 7 y 8)

El grupo de tratamiento tuvo una puntuación de esteatosis hepática reducida en comparación con el grupo placebo (puntuación 1 del grupo de tratamiento frente a puntuación 4 del grupo placebo), y el contenido hepático de triglicéridos se redujo aproximadamente al 35% en el grupo de tratamiento. Los niveles de ARNm hepáticos para TNF.alfa. y TGF.beta. se redujeron en el grupo de tratamiento, pero hubo un aumento en los niveles de ALT en suero, expresión hepática de ARNm de a-SMA y TIMP-1 de 3 veces, 2 veces y 6 veces, respectivamente. (Figura 9) No hubo diferencias significativas entre el grupo placebo y el grupo de tratamiento para la expresión hepática de ARNm de colágeno y fibronectina. La DGAT-2 es un tratamiento eficaz para la esteatosis hepática; sin embargo, en este modelo de ratón, después de 8 semanas de tratamiento, no hubo ninguna mejoría significativa en la fibrosis hepática.

Ejemplo 9: Inhibición antisentido de la expresión de la DGAT-1 en rata por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi

Se diseñó una serie de compuestos antisentido contra diferentes regiones diana del ARN de la DGAT-1 de rata, usando información de secuencia publicada (número de acceso GenBank AF296131.1, incorporado en el presente documento como SEC ID Nº: 101). Los compuestos se muestran en la Tabla 6. El “sitio diana” indica el número del primer nucleótido (5’ - la mayoría) sobre la secuencia diana particular a la cual se unen los compuestos. Todos los compuestos indicados en la Tabla 6 son oligonucleótidos quiméricos (“con hueco”) de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” central que consiste en diez 2’-desoxinucleótidos que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “alas” de cinco nucleótidos. Las alas están compuestas por nucleótidos 2’-metoxietil (2’-MOE). Los enlaces (estructurales) internucleósido son fosforotioato (P=S) a lo largo del nucleótido. Todos los restos de citosina son 5-metil citosina.

5 Los compuestos se analizaron para determinar su efecto sobre los niveles de ARNm de la DGAT-1 en rata mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se ha descrito en otros ejemplos en el presente documento. Se diseñaron sondas y cebadores contra la DGAT-1 de rata para hibridarse con una secuencia de DGAT-1 de rata usando información de secuencia publicada (número de acceso GenBank AF296131.1, incorporado en el presente documento como SEC ID Nº: 101). Para la DGAT-1 de rata los cebadores de la PCR fueron: cebador directo: 10 CAGACCAGCGTGGGCG (SEC ID Nº: 102); cebador inverso: GAACAAAGAGTCTTGCAGACGATG (SEC ID Nº: 103) y la sonda de la PCR fue: FAM-CGGCCACTGGGAGCTGAGGTG-TAMRA (SEC ID Nº: 104) en la que FAM es el colorante indicador fluorescente y TAMRA es el colorante extintor. Las cantidades génicas diana de rata se normalizaron cuantificando el ARN total usando el reactivo de cuantificación de ARN, RiboGreenTM.

Los datos son medias de tres experimentos en los que se trataron hepatocitos primarios de rata con 50 nM de los

15 oligonucleótidos antisentido de la presente invención. Los datos, mostrados en la Tabla 6, se presentan como inhibición en porcentaje normalizados frente a las muestras de control sin tratar.

Tabla 6

Inhibición de los niveles de ARNm de la DGAT-1 de rata por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi

CMP Nº

REGIÓN SEC ID Nº DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % INHIB SEC ID Nº

191726

5’UTR 7 1 ctcgtcgcggcccaatcttc 0 61

191733

Codificante 7 261 tcttgcagacgatggcacct 68 67

327788

Codón de Inicio 101 24 TCGCCCATGGCTTCGGCCCG 0 105

327789

Codificante 101 44 AGCTTCCCGCGCCTCCGCGG 0 106

327790

Codificante 101 61 GGTCCTGCGACGCCGAGAGC 0 107

327791

Codificante 101 82 CTGGACGGAAACCCGCGAGC 0 108

327792

Codificante 101 103 TACCTTGGGCCCACTACCTC 0 109

327793

Codificante 101 121 TCGCACCTCGTCCTCTTCTA 0 110

327794

Codificante 101 170 GAGCCGGCGCGTCACCCCCG 0 111

327795

Codificante 101 191 TATGGGCTGGAGCCGGAGCC 0 112

327796

Codificante 101 196 CCGGGTATGGGCTGGAGCCG 0 113

327797

Codificante 101 225 TCGCCCACGCTGGTCTGCCG 63 114

327798

Codificante 101 248 GGCACCTCAGCTCCCAGTGG 64 115

327799

Codificante 101 282 CTGTCTGAGCTGAACAAAGA 0 116

327800

Codificante 101 309 AGGATACCACGGTAATTGCT 0 117

327801

Codificante 101 318 CACCAATTCAGGATACCACG 0 118

327802

Codificante 101 345 GCATTACTCAGGATCAGCAT 0 119

327803

Codificante 101 359 CTAAAGATAACCTTGCATTA 0 120

327804

Codificante 101 374 ACTTGATAAGATTCTCTAAA 0 121

327805

Codificante 101 389 CCACCAGGATGCCATACTTG 0 122

327806

Codificante 101 393 GGATCCACCAGGATGCCATA 0 123

327807

Codificante 101 415 AAACAGAGACACCACCTGGA 0 124

327808

Codificante 101 463 GGATGCAATGATCAAGCATG 0 125

327809

Codificante 101 477 ACAATAAAGATATTGGATGC 0 126

327810

Codificante 101 499 CTTCTCAATCTGAAATGTAG 0 127

327811

Codificante 101 504 AGGCGCTTCTCAATCTGAAA 0 128

327812

Codificante 101 527 GCTCTGTCAGGGCACCCACT 0 129

327813

Codificante 101 537 AGCCCCATCTGCTCTGTCAG 20 130

327814

Codificante 101 552 ACCACATGTAGCAGCAGCCC 17 131

327815

Codificante 101 579 GGGAAGCAGATAATTGTGGC 0 132

327816

Codificante 101 594 AAGGCCACAGCTGCTGGGAA 0 133

327817

Codificante 101 607 AGACTCAACCAGTAAGGCCA 25 134

327818

Codificante 101 616 TGGAGTGATAGACTCAACCA 2 135

327819

Codificante 101 649 GGAGTATGATGCCAGAGCAA 0 136

327820

Codificante 101 661 GAGGAAGATGATGGAGTATG 0 137

327821

Codificante 101 679 CCGGTAGGAAGAAAGCTTGA 0 138

(continuación)

Inhibición de los niveles de ARNm de la DGAT-1 de rata por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi

CMP Nº

REGIÓN SEC ID Nº DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % INHIB SEC ID Nº

327822

Codificante 101 709 CCTTCGCTGGCGGCACCACA 29 139

327823

Codificante 101 726 ACAGCTTTGGCCTTGACCCT 0 140

327824

Codificante 101 744 ACCTTCTTCCCTGCAGACAC 0 141

327825

Codificante 101 758 CAGCAGCCCCACTGACCTTC 6 142

327826

Codificante 101 779 GATAGCTTACAGTGTTCTGG 0 143

327827

Codificante 101 797 GGTAGGTCAGGTTGTCCGGA 0 144

327828

Codificante 101 806 AGAGATCTCGGTAGGTCAGG 0 145

327829

Codificante 101 819 AAGATGAAGTAATAGAGATC 0 146

327830

Codificante 101 833 ACAAAGTAGGAGCAAAGATG 0 147

327831

Codificante 101 849 AAGTTGAGTTCATAACACAA 0 148

327832

Codificante 101 912 AAAAAGAGCATCTCAAGAAC 0 149

327833

Codificante 101 934 CAGCCCCACTTGAAGCTGGG 0 150

327834

Codificante 101 949 CATCCACTGCTGGATCAGCC 0 151

327835

Codificante 101 970 GGAGTTCTGGATAGTAGGGA 0 152

327836

Codificante 101 981 AAGGGCTTCATGGAGTTCTG 0 153

327837

Codificante 101 991 CATGTCCTTGAAGGGCTTCA 0 154

327838

Codificante 101 1030 CGCCAGCTTTAAGAGACGCT 0 155

327839

Codificante 101 1103 GCTCTGCCACAGCATTGAGA 0 156

327840

Codificante 101 1131 TAGAACTCGCGGTCTCCAAA 0 157

327841

Codificante 101 1162 GGTGACAGACTCAGCATTCC 0 158

327842

Codificante 101 1186 GATATTCCAGTTCTGCCAAA 0 159

327843

Codificante 101 1212 TGTCTGATGCACCACTTGTG 0 160

327844

Codificante 101 1271 AGACCCCAGTCCTGGCCATC 22 161

327845

Codificante 101 1299 TACTCATGAAAGAAAGCTGA 0 162

327846

Codificante 101 1351 CATTGCTGTGAATGCCCAAA 0 163

327897

Codificante 101 1380 ACAATCCAGGCCAGTGGGAC 0 164

327848

Codificante 101 1414 TGCATTGCCATAGTTCCCTT 0 165

327849

Codificante 101 1442 GCCCAATGATGAGTGTCACC 0 166

327850

Codificante 101 1477 GTAGTCGTGGACATACATGA 0 167

327851

Codón de terminación 101 1524 TTGGCAGTAGCTCATGCCCC 0 168

327852

Codón de terminación 101 1531 CTGGCCTTTGGCAGTAGCTC 12 169

327853

3’ UTR 101 1562 CCTCCAGAACTCCAGGCCCA 55 170

327854

3’ UTR 101 1637 ATCCCCAAGAGCAGGAGTAG 0 171

327855

3’ UTR 101 1670 CCCAGCACTGGCTCAACCAG 0 172

327856

3’ UTR 101 1702 TTGATATCCTAAGCCCCTGG 0 173

327857

3’ UTR 101 1727 TTTTTTTTTTTTAGATAGCT 0 174

Ejemplo 30: Inhibición antisentido de la DGAT-1 de rata por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2’-MOE y un hueco desoxi: respuesta a la dosis

Como se muestra en la Tabla 6, en este ensayo, las SEC ID Nos: 67, 114, 115, 130,131, 134, 139,161, 169 y 170 demostraron una inhibición de la DGAT-1 de rata de al menos un 10%. Las SEC ID Nos: 61 y 67 son 5 oligonucleótidos antisentido ínter especie que se dirigen contra la DGAT-1 tanto de ratón como de rata.

En una realización adicional, se seleccionaron seis oligonucleótidos para realizar una investigación adicional en un experimento de respuesta a la dosis en hepatocitos primarios de rata. Los hepatocitos primarios de rata se trataron 10 con 1, 5, 10, 25, 50 y 100 nM de CMP Nº 191733 (SEC ID Nº: 67), CMP Nº 327798 (SEC ID Nº: 115), CMP Nº 327814 (SEC ID Nº: 131), CMP Nº 327817 (SEC ID Nº: 134), CMP Nº: 327822 (SEC ID Nº: 139), CMP Nº 327844 (SEC ID Nº: 161) y CMP Nº 327853 (SEC ID Nº: 170). Las células sin tratar sirvieron como control. Se midieron los niveles de ARNm diana mediante PCR en tiempo real, como se ha descrito en otros ejemplos en el presente documento. Los datos, presentados en la Tabla 7, son la media de tres experimentos y están normalizados con 15 respecto a muestras de control no tratadas.

Tabla 7

Inhibición de la DGAT-1 de rata por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos: respuesta a la dosis

Dosis de oligonucleótido

CMP Nº

SEC ID Nº 5 10 25 50 100 200

% de inhibición

191733

67 20 53 77 91 97 99

327798

115 0 13 68 88 96 98

327814

131 0 5 37 72 80 89

327817

134 0 0 0 57 76 87

327822

139 0 32 52 73 88 95

327844

161 0 0 17 66 71 87

327853

170 0 0 48 70 80 92

Como se demuestra en la Tabla 7, los siete oligonucleótidos antisentido sometidos a ensayo fueron capaces de inhibir la expresión de la DGAT-1 de una manera dependiente de la dosis.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Isis Pharmaceuticals, Inc. Xiag-Xian Yu Sanjay Bhanot Brett P. Monia 5 <120> COMPOSICIONES Y SUS USOS DIRIGIDOS CONTRA LA DIACILGLICEROL ACILTRANSFERASA 1

<130> BIOL0088WO

<160> 174 10

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 384 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 494

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 21001

<212> ADN

<213> Homo sapiens 35

<220>

<221> misc_feature

<222> 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781,

782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 40 804, 805, 806, 807, 808

<223> n = A, T, C o G

<220>

<221> misc_feature

45 <222> 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855

<223> n = A, T, C o G

50 <220> <221> misc_feature

<222> 856, 857, 858, 859, 860, 861, 10947, 10948, 10949, 10950, 10951, 10952, 10953, 10954, 10955, 10956, 10957, 10958, 10959, 10960, 10961, 10962, 10963, 10964, 10965, 10966, 10967, 10968, 10969, 10970, 10971, 10972, 10973, 10974, 10975

<223> n = A, T, C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> 10976, 10977, 10978, 10979, 10980, 10981, 10982, 10983, 10984, 10985, 10986, 10987, 10988, 10989, 10990, 10991, 10992, 10993, 10994, 10995, 10996, 10997, 10998, 10999, 11000, 11001, 11002, 11003, 11004, 11005, 11006, 11007, 11008

<223> n = A, T, C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> 11009, 11010, 11011, 11012, 11013, 11014, 11015, 11016, 11017, 11018, 11019, 11020, 11021, 11022, 11023, 11024, 11025, 11026, 11027, 11028, 11029, 11030, 11031, 11032, 11033, 11034, 11035, 11036, 11037, 11038, 11039, 11040, 11041

<223> n = A, T, C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> 11042, 11043, 11044, 11045, 11046

<223> n = A, T, C o G

<400> 3

<210> 4

<211> 1976

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

10 <210> 5

<211> 170

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 5

<210> 6 20 <211> 913

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 25 <221> misc_feature

<222> 913

<223> n = A, T, C o G

<400> 6

<210> 7

<211> 1650

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 7

<210> 8

<211> 490

<212>

ADN 15 <213> Mus musculus

<400> 8

<210> 9

<211> 1776

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212>

ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 10 20 tccgtcatcg ctcctcaggg 20

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Compuesto oligomérico

<400> 11 gtgcgcgcga gcccgaaatc

20

<210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Compuesto oligomérico

<400> 12 atgcattctg cccccaagga

20

<210> 13 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador directo

<400> 13 tccccgcatc cggaa

15

<210> 14 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador inverso

<400> 14 ctgggtgaag aacagcatct ca

22

<210> 15 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sonda

<400> 15 cgctttctgc tgcgacggat cc

22

<210> 16 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador directo

<400> 16 gaaggtgaag gtcggagtc

19

<210> 17 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 17 gaagatggtg atgggatttc 20

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 18 gccgcctctc tcgtccattc 20

<210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 19 gagccgctaa ctaatggacg 20

<210> 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 20 acaacggctg cgttgctccg 20

<210> 21

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 21 ccgcccgcgt caggcccgtc 20

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 22 gcctcaccag cgcgttcaac 20

<210> 23

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 23 ccctgccggc cgccgtagcc 20

<210> 24

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 24 ctccgggccc tagacaacgg 20

<210> 25

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 25 gttcgtagcg cccgaggcgc 20

<210> 26

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 26 cccggccgca gccaagcgtg 20

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 27 gcccatggcc tcagcccgca 20

<210> 28

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 28 tggctcgagg gccgcgaccc 20

<210> 29

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 29 ccgcaggccc gccgccgccg 20

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 30 ccgcacctct tcttccgccg 20

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 31 acgccggcgt ctccgtcctt 20

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 32 gctcccagtg gccgctgccc 20

<210> 33

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 33 ctgcaggcga tggcacctca 20

<210> 34

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 34 aggatgccac ggtagttgct 20

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 35 gcatcaccac acaccagttc 20

<210> 36

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 36 gccatacttg atgaggttct 20

<210> 37

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 37 gacattggcc gcaataacca 20

<210> 38

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 38 cttctcaacc tggaatgcag 20

<210> 39

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 39 gcagtcccgc ctgctccgtc 20

<210> 40

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 40 caggttggct acgtgcagca 20

<210> 41

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 41 ccagtaagac cacagccgct 20

<210> 42

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 42 ggtgtgcgcc atcagcgcca 20

<210> 43

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 43 cagcactgct ggccttcttc 20

<210> 44

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 44 tgagctcgta gcacaaggtg 20

<210> 45

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 45 cactgctgga tcagccccac 20

<210> 46

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 46 atgcgtgagt agtccatgtc 20

<210> 47

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 47 tgagccagat gaggtgattg 20

<210> 48

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 48 gagctcagcc acggcattca 20

<210> 49

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 49 tctgccagaa gtaggtgaca 20

<210> 50

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 50 gatgagcgac agccacacag 20

<210> 51

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 51 ctcatagttg agcacgtagt 20

<210> 52

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 52 cagtgagaag ccaggccctc 20

<210> 53

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 53 ccatccccag cactcgaggc 20

<210> 54

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 54 aggatgctgt gcagccaggc 20

<210> 55

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 55 ggtgcaggac agagccccat 20

<210> 56

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 56 gtgtctggcc tgctgtcgcc 20

<210> 57

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 57 ctcccagctg gcatcagact 20

<210> 58

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 58 ctacttattt ccattcatcc 20

<210> 59

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 59 tatcctaagt atgcctaatt 20

<210> 60

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 60 gcttgagccc tatcctaagt 20

<210> 61

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 61 ctcgtcgcgg cccaatcttc 20

<210> 62

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 62 cccatggctt cggcccgcac 20

<210> 63

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 63 cagccgcgtc tcgcacctcg 20

<210> 64

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 64 cggagccggc gcgtcacccc 20

<210> 65

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 65 ccacgctggt ccgcccgtct 20

<210> 66

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 66 cagatcccag tagccgtcgc 20

<210> 67

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 67 tcttgcagac gatggcacct 20

<210> 68

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 68 tcaggatacc acgataattg 20

<210> 69

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 69 cagcatcacc acacaccaat 20

<210> 70

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 70 aaccttgcat tactcaggat 20

<210> 71

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 71 atccaccagg atgccatact 20

<210> 72

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 72 agagacacca cctggatagg 20

<210> 73

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 73 cagcagcccc atctgctctg 20

<210> 74

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 74 gccaggttaa ccacatgtag 20

<210> 75

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 75 aaccagtaag gccacagctg 20

<210> 76

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 76 cccactggag tgatagactc 20

<210> 77

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 77 atggagtatg atgccagagc 20

<210> 78

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 78 acccttcgct ggcggcacca 20

<210> 79

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 79 tggatagctc acagcttgct 20

<210> 80

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 80 tctcggtagg tcaggttgtc 20

<210> 81

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 81 ctcaagaact cgtcgtagca 20

<210> 82

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 82 gttggatcag ccccacttga 20

<210> 83

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 83 gtgaatagtc catatccttg 20

<210> 84

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 84 taagagacgc tcaatgatcc 20

<210> 85

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 85 tctgccacag cattgagaca 20

<210> 86

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 86 ccaatctctg tagaactcgc 20

<210> 87

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 87 gtgacagact cagcattcca 20

<210> 88

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 88 gtctgatgca ccacttgtgc 20

<210> 89

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 89 tgccatgtct gagcataggc 20

<210> 90

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 90 atactcctgt cctggccacc 20

<210> 91

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 91 attgccatag ttcccttgga 20

<210> 92

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 92 agtgtcaccc acacagctgc 20

<210> 93

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 93 ccaccggttg cccaatgatg 20

<210> 94

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 94 gtggacatac atgagcacag 20

<210> 95

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 95 tagttgagca cgtagtagtc 20

<210> 96

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 96 ctttggcagt agctcatacc 20

<210> 97

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 97 tccagaactc caggcccagg 20

<210> 98

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 98 caagcttccc gttctcagcc 20

<210> 99

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 99 tccatttatt agtctaggaa 20

<210> 100

<211> 2262

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 100

<210> 101

<211> 1751

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 101

<210> 102

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 102 cagaccagcg tgggcg 16

<210> 103

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda inversa

<400> 103 gaacaaagag tcttgcagac gatg 24

<210> 104

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador <400> 104 cggccactgg gagctgaggt g

<210> 105

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 105 tcgcccatgg cttcggcccg 20

<210> 106

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 106 agcttcccgc gcctccgcgg 20

<210> 107

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 107 ggtcctgcga cgccgagagc 20

<210> 108

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 108 ctggacggaa acccgcgagc 20

<210> 109

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 109 taccttgggc ccactacctc 20

<210> 110

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 110 tcgcacctcg tcctcttcta 20

<210> 111

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 111 gagccggcgc gtcacccccg 20

<210> 112

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 112 tatgggctgg agccggagcc 20

<210> 113

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 113 ccgggtatgg gctggagccg 20

<210> 114

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 114 tcgcccacgc tggtctgccg 20

<210> 115

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 115 ggcacctcag ctcccagtgg 20

<210> 116

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 116 ctgtctgagc tgaacaaaga 20

<210> 117

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 117 aggataccac ggtaattgct 20

<210> 118

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 118 caccaattca ggataccacg 20

<210> 119

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 119 gcattactca ggatcagcat 20

<210> 120

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 120 ctaaagataa ccttgcatta 20

<210> 121

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 121 acttgataag attctctaaa 20

<210> 122

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 122 ccaccaggat gccatacttg 20

<210> 123

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 123 ggatccacca ggatgccata 20

<210> 124

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 124 aaacagagac accacctgga 20

<210> 125

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 125 ggatgcaatg atcaagcatg 20

<210> 126

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 126 acaataaaga tattggatgc 20

<210> 127

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 127 cttctcaatc tgaaatgtag 20

<210> 128

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 128 aggcgcttct caatctgaaa 20

<210> 129

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 129 gctctgtcag ggcacccact 20

<210> 130

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 130 agccccatct gctctgtcag 20

<210> 131

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 131 accacatgta gcagcagccc 20

<210> 132

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 132 gggaagcaga taattgtggc 20

<210> 133

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 133 aaggccacag ctgctgggaa 20

<210> 134

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 134 agactcaacc agtaaggcca 20

<210> 135

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 135 tggagtgata gactcaacca 20

<210> 136

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 136 ggagtatgat gccagagcaa 20

<210> 137

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 137 gaggaagatg atggagtatg 20

<210> 138

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 138 ccggtaggaa gaaagcttga 20

<210> 139

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 139 ccttcgctgg cggcaccaca 20

<210> 140

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 140 acagctttgg ccttgaccct 20

<210> 141

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 141 accttcttcc ctgcagacac 20

<210> 142

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 142 cagcagcccc actgaccttc 20

<210> 143

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 143 gatagcttac agtgttctgg 20

<210> 144

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 144 ggtaggtcag gttgtccgga 20

<210> 145

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 145 agagatctcg gtaggtcagg 20

<210> 146

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 146 aagatgaagt aatagagatc 20

<210> 147

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 147 acaaagtagg agcaaagatg 20

<210> 148

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 148 aagttgagtt cataacacaa 20

<210> 149

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 149 aaaaagagca tctcaagaac 20

<210> 150

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 150 cagccccact tgaagctggg 20

<210> 151

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 151 catccactgc tggatcagcc 20

<210> 152

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 152 ggagttctgg atagtaggga 20

<210> 153

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 153 aagggcttca tggagttctg 20

<210> 154

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 154 catgtccttg aagggcttca 20

<210> 155

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 155 cgccagcttt aagagacgct 20

<210> 156

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 156 gctctgccac agcattgaga 20

<210> 157

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 157 tagaactcgc ggtctccaaa 20

<210> 158

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 158 ggtgacagac tcagcattcc 20

<210> 159

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 159 gatattccag ttctgccaaa 20

<210> 160

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 160 tgtctgatgc accacttgtg 20

<210> 161

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 161 agaccccagt cctggccatc 20

<210> 162

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 162 tactcatgaa agaaagctga 20

<210> 163

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 163 cattgctgtg aatgcccaaa 20

<210> 164

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 164 acaatccagg ccagtgggac 20

<210> 165

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 165 tgcattgcca tagttccctt 20

<210> 166

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 166 gcccaatgat gagtgtcacc 20

<210> 167

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 167 gtagtcgtgg acatacatga 20

<210> 168

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 168 ttggcagtag ctcatgcccc 20

<210> 169

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 169 ctggcctttg gcagtagctc 20

<210> 170

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 170 cctccagaac tccaggccca 20

<210> 171

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 171 atccccaaga gcaggagtag 20

<210> 172

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 172 cccagcactg gctcaaccag 20

<210> 173

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 173 ttgatatcct aagcccctgg 20

<210> 174

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 174 tttttttttt ttagatagct 20

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un oligonucleótido antisentido dirigido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido DGAT-1 para su uso en la mejora, tratamiento o prevención de la fibrosis hepática

2. 2.

   El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 dirigido a un ácido nucleico que tiene al menos una identidad del 80% con la SEC ID Nº 4 y que expresa la DGAT-1.

3. 3.

   El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que es un compuesto antisentido quimérico que comprende un intervalo de longitud de nucleósidos consecutivos en el que el extremo superior del intervalo es de 50 nucleósidos y en el que el extremo inferior del intervalo es de 12 nucleósidos, que comprende adicionalmente uno o más de

   una modificación de nucleobase,

   una modificación de enlace internucleosídico,

   una modificación glucídica de alta afinidad seleccionada del grupo constituido por n 2’-O-(2-metoxietilo), un 2’-Ometilo, un ácido nucleico bloqueado o un ácido nucleico con puentes de etileno

   o una combinación de las mismas, y que comprende adicionalmente no más de tres emparejamientos erróneos con la secuencia de ácido nucleico diana (SEC ID Nº 4) que codifica la DGAT-1.
4. 4. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 3 en el que:

   a.

   el extremo superior del intervalo es de 35 nucleósidos y el extremo inferior del intervalo es de 14 nucleósidos;

   b.

   el extremo superior del intervalo es de 24 nucleósidos y el extremo inferior del intervalo es de 17 nucleósidos; o

   c.

   el compuesto antisentido quimérico tiene una longitud de 20 nucleósidos consecutivos.

5. 5.

   El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 3 ó 4, en el que al menos un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato, o cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.

6. 6.

   El oligonucleótido antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que la modificación de nucleobase es una 5-metil citosina.

7. 7.

   El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 3, en el que el compuesto antisentido tiene una longitud de 20 nucleósidos consecutivos, que comprende cinco modificaciones 2’-O-(2-metoxietilo) glucídicas consecutivas en el extremo 5’ del compuesto, seguidas por diez 2’desoxi glúcidos consecutivos que están seguidos por cinco modificaciones 2’-O-(2-metoxietilo) glucídicas consecutivas en el extremo 3’ del compuesto, que también comprende una modificación de enlace fosforotioato en cada enlace internucleosídico y una modificación 5-metil citosina en cada resto de citosina en el compuesto y que comprende no más de 3 emparejamientos erróneos con la secuencia de ácido nucleico que codifica la DGAT-1 diana.

8. 8.

   El oligonucleótido antisentido de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que el compuesto antisentido no comprende ningún emparejamiento erróneo con la secuencia de ácido nucleico que codifica la DGAT-1 diana.

9. 9.

   El oligonucleótido antisentido de cualquier reivindicación anterior, en el que la administración del oligonucleótido antisentido:

   a.

   reduce la expresión de ARNm de colágeno;

   b.

   reduce uno o más de un ARNm de a-SMA o un ARNm de TGF.beta.;

   c.

   reduce los niveles de hidroxiprolina;

   d.

   aumenta la esterificación de retinol; o

   e.

   reduce la activación de las células estrelladas hepáticas.

10. 10.

    El oligonucleótido antisentido de cualquier reivindicación anterior para su uso en la mejora, tratamiento o prevención de la fibrosis hepática, siendo dicho uso para prevenir, mejorar o tratar la deposición de colágeno en exceso en el hígado de un animal que necesita dicho tratamiento, poner en contacto al animal con el oligonucleótido antisentido.

11. 11.

    El oligonucleótido antisentido de cualquier reivindicación anterior en un animal que necesita dicho tratamiento, teniendo el animal una afección que produce fibrosis hepática, seleccionándose la afección del grupo constituido por esteatosis hepática, EHNA, EHGNA, obesidad, diabetes mellitus, dislipidemia, resistencia a insulina, síndrome metabólico, colesterolemia o combinaciones de los mismos.

    Figura 1

    Datos bioquímicos

    Figura 2 Figura 3 Figura 4

    Expresión de ARNm de colágeno-1, aSMA y TGFb-1 en hígado de ratones db/db

    Figura 5

    Expresión de ARNm de DGAT1, 2 y TNFa en ratones db/db

    Figura 6 Figura 7 Figura 8

    Expresión de ARNm de colágeno, aSMA, TGFb-1 y TIMP-1 en hígado de ratones db/db

    Figura 9