KR20200127211A - Gys2 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
Gys2 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 특히 간세포에서 GYS2 발현을 감소시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 방법에 관한 것이다. GYS2 발현의 감소를 위한 개시된 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 보다 강한 뉴클레아제 내성 및 보다 낮은 면역원성과 같은 개선된 특징을 위해 변형될 수 있다. GYS2 발현의 감소를 위한 개시된 올리고뉴클레오티드는 또한 특정한 세포 또는 기관, 예컨대 간의 간세포를 표적화하는 표적화 리간드를 포함할 수 있고, 글리코겐 저장 질환 (예를 들어, GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX) 및 관련된 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
Description
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 "GYS2 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법"을 발명의 명칭으로 하는, 2018년 3월 2일에 출원한 미국 가출원 번호 62/637574를 우선권 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 출원은 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도, 특히 글리코겐 저장 질환 및 연관된 상태의 치료와 관련된 용도에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참고
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 132 킬로바이트 크기로 2019년 2월 15일에 생성된 D0800.70014WO00-SEQ.txt 명칭의 파일로 제공된다. 서열 목록의 전자 형식 내의 정보는 그의 전체가 본원에 참고로 포함된다.
글리코겐은 체내에서 글루코스를 저장하기 위해 사용되는 복합 당이다. 신체가 기능하기 위해 더 많은 글루코스를 필요로 할 때, 일반적으로 이는 세포 과정에서 사용하기 위해 저장된 글리코겐을 분해한다. 몇몇 효소는 글루코스를 글리코겐으로서 저장하고 (글리코겐 합성) 글리코겐을 글루코스로 분해하는데 (글리코겐 분해) 이용되는 과정에 참여한다. 이들 효소 중 1종 이상이 억제되면, 이는 글리코겐 저장의 부족, 영향을 받은 세포 (예를 들어, 간 및/또는 근육 세포)에서 글리코겐의 축적, 또는 비정상적으로 구조화된 글리코겐의 형성이 관찰될 수 있는 글리코겐 저장 질환을 일으킬 수 있다. 글리코겐 저장 또는 분해의 장애가 발생하면, 발병한 사람들은 간비대, 증가된 간 독성 (예를 들어, 보다 높은 수준의 AST, ALT 및/또는 ALP), 간 섬유증, 간에서 지방산 침착, 간 과형성, 간세포 선종, 및/또는 간세포 암종을 비롯하여 이로 제한되지 않는 수많은 증상을 앓을 수 있다. 예시적인 글리코겐 저장 질환의 비제한적인 집합에는 GSDI (예를 들어, GSDIa), GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX가 포함될 수 있다.
본 개시내용의 측면은 대상체에서 글리코겐 저장 질환 (예를 들어, 글리코겐 분해 또는 저장에 영향을 미치는 질환 또는 장애, 예컨대 GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI, 또는 GSDIX)을 치료하기 위한 올리고뉴클레오티드 및 관련된 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 GYS2 발현을 선택적으로 억제하기 위한 강한 RNAi 올리고뉴클레오티드가 개발되었다. 일부 실시양태에서, RNAi 올리고뉴클레오티드는 간세포에서 전반적인 GYS2 활성을 감소시키는데 유용하고, 이로써 간비대, 간 독성 (예를 들어, AST, ALT 및/또는 ALP의 수준), 간 섬유증, 간에서 지방산 침착, 간 과형성, 간세포 선종, 및/또는 간세포 암종을 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 실시양태에서, 특히 이러한 올리고뉴클레오티드-기반 접근법을 이용하여 표적화할 수 있는 GYS2 mRNA의 핵심 영역 (핫스팟으로 지칭됨)이 본원에서 확인되었다 (예를 들어, 실시예 1 참고).
본 개시내용의 한 측면은 GYS2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호(SEQ ID NO): 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열식별번호: 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열식별번호: 417-466, 575-580, 586-598, 620-627에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 서열식별번호: 385-416, 569-574, 581-585, 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본 개시내용의 한 측면은 GYS2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 15 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열식별번호: 599-608 중 어느 하나에 제시된 GYS2의 표적 서열에 대해 상보성인 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21 또는 적어도 22개의 연속 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 GYS2의 표적 서열에 대해 완전히 상보성이다. 일부 실시양태에서, GYS2에 대한 상보성 영역은 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19 내지 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21 내지 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥을 추가로 포함하고, 센스 가닥은 안티센스 가닥과 듀플렉스 영역을 형성한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 19 내지 40개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고, 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스 영역은 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20 또는 적어도 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 형성한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 각각 21 내지 23개 범위의 뉴클레오티드 길이인 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 19 내지 21개 범위의 뉴클레오티드 길이인 듀플렉스 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 뉴클레오티드 길이의 3'-오버행 서열을 포함하고, 3'-오버행 서열은 안티센스 가닥, 센스 가닥, 또는 안티센스 가닥 및 센스 가닥 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥 상에 2개 뉴클레오티드 길이의 3'-오버행 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2개 뉴클레오티드 길이의 3'-오버행 서열을 포함하고, 3'-오버행 서열은 안티센스 가닥 상에 존재하고, 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이며, 이에 따라 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 형성한다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열식별번호: 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열식별번호: 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 그의 3'-말단에 S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하고, S1은 S2에 대해 상보성이고, L은 S1과 S2 사이에 3 내지 5개 뉴클레오티드 길이의 루프를 형성한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 GYS2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 21 내지 27개 뉴클레오티드 길이이고, GYS2에 대해 상보성인 영역을 갖고, 센스 가닥은 그의 3'-말단에 S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하고, S1은 S2에 대해 상보성이고, L은 S1과 S2 사이에 3 내지 5개 뉴클레오티드 길이의 루프를 형성하고, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 적어도 19개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 구조를 형성하지만, 공유 연결되지 않는다 (예를 들어, 도 3 참고). 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 GYS2 mRNA의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20 또는 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드에 대해 완전히 상보성이다. 일부 실시양태에서, L은 테트라루프이다. 일부 실시양태에서, L은 4개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, L은 GAAA로 제시된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2'-변형은 2'-아미노에틸, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 및 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산으로부터 선택된 변형이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 변형된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5'-뉴클레오티드의 당의 4'-탄소는 포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트, 비닐포스포네이트, 또는 말로닐포스포네이트이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 1개의 뉴클레오티드는 1개 이상의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적화 리간드는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, GalNac 모이어티는 1가 GalNAc 모이어티, 2가 GalNAc 모이어티, 3가 GalNAc 모이어티, 또는 4가 GalNAc 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 스템-루프의 L의 4개 이하의 뉴클레오티드 각각은 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 압타머를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 및 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 또 다른 측면은 본 개시내용의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 간비대, 간 결절 형성, 간 독성 (예를 들어, AST, ALT 및/또는 ALP의 수준), 간 섬유증, 간세포 증식, 간에서 지방산 침착, 간 과형성, 간세포 선종, 및/또는 간세포 암종의 수준을 감소시키거나 또는 그를 예방한다. 본 개시내용의 또 다른 측면은 글리코겐 저장 질환 또는 글리코겐 저장 질환의 하나 이상의 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 예시적인 글리코겐 저장 질환의 비제한적인 집합에는 GSDI (예를 들어, GSDIa), GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX가 포함될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 GYS2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 15 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 안티센스 가닥과 듀플렉스 영역을 형성하고, 센스 가닥은 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열식별번호: 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627로부터 선택된 상보성 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표 4에 제시된 표의 열로부터 선택된 센스 및 안티센스 가닥의 쌍을 포함한다.
본 명세서의 일부로 포함되고 그를 구성하는 첨부된 도면은 특정 실시양태를 설명하고, 서면 명세서와 함께 본원에 개시된 조성물 및 방법의 특정 측면의 비제한적인 예를 제공하는 역할을 한다.
도 1a 및 1b는 HEK-293 세포에서 264개 GYS2 접합체의 스크리닝후 남아있는 % GYS2 mRNA를 도시하는 그래프이다. 각각의 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 상응하는 NM_021957.3에서의 뉴클레오티드 위치는 x 축에 표시된다.
도 2a 및 2b는 HEK-293 세포에서 2가지 또는 3가지 상이한 농도 (0.1 nM 및 1.0 nM 또는 0.03 nM, 0.1 nM, 및 1.0 nM)의 71개 GYS2 올리고뉴클레오티드의 GYS2 올리고뉴클레오티드 스크리닝후 남아있는 % mRNA를 도시하는 그래프의 세트이다.
도 3은 4개의 GalNAc 모이어티 (다이아몬드 형태)에 접합된 닉킹된 테트라루프 구조를 갖는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예를 도시하는 개략도이다.
도 4는 1가지 또는 2가지 상이한 변형 패턴에서 상이한 염기 서열을 갖는 GYS2 올리고뉴클레오티드를 사용한 HEK-293 세포에서의 스크리닝의 결과를 도시하는 그래프이다. X-축은 평가된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화된 센스 가닥의 3' 말단을 나열한다. 음성 대조군 서열 (NC1), 형질감염되지 않은 세포, 및 모의 형질감염된 세포는 대조군으로서 좌측에 도시된다.
도 5는 닉킹된 테트라루프 구조에서 상이한 염기 서열을 갖는 GYS2 올리고뉴클레오티드를 사용한 원숭이 간세포에서의 스크리닝의 결과를 도시하는 그래프이다. 동일한 변형 패턴을 사용하였고, 올리고뉴클레오티드를 3가지 상이한 농도 (0.1 μM, 0.3 μM, 및 1.0 μM)로 시험하였다. 형질감염되지 않은 세포는 대조군으로서 좌측에 도시된다.
도 6a 및 6b는 HEK-293 세포에서 용량 반응 곡선 스크리닝으로부터 선택된 GYS2 올리고뉴클레오티드에 대한 IC50 결과를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 7은 닉킹된 테트라루프 구조에서 GalNAc-접합된 GYS2 올리고뉴클레오티드의 생체내 활성 평가를 도시하는 그래프이다. 8가지 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 시험하였다. 0.5 mg/kg의 올리고뉴클레오티드를 마우스 발현된 인간 GYS2에 피하 투여하였다. 데이터는 PBS 대조군에 대해 정규화된 투여후 4 일째에 남아있는 GYS2 mRNA의 양을 도시한다.
도 1a 및 1b는 HEK-293 세포에서 264개 GYS2 접합체의 스크리닝후 남아있는 % GYS2 mRNA를 도시하는 그래프이다. 각각의 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 상응하는 NM_021957.3에서의 뉴클레오티드 위치는 x 축에 표시된다.
도 2a 및 2b는 HEK-293 세포에서 2가지 또는 3가지 상이한 농도 (0.1 nM 및 1.0 nM 또는 0.03 nM, 0.1 nM, 및 1.0 nM)의 71개 GYS2 올리고뉴클레오티드의 GYS2 올리고뉴클레오티드 스크리닝후 남아있는 % mRNA를 도시하는 그래프의 세트이다.
도 3은 4개의 GalNAc 모이어티 (다이아몬드 형태)에 접합된 닉킹된 테트라루프 구조를 갖는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예를 도시하는 개략도이다.
도 4는 1가지 또는 2가지 상이한 변형 패턴에서 상이한 염기 서열을 갖는 GYS2 올리고뉴클레오티드를 사용한 HEK-293 세포에서의 스크리닝의 결과를 도시하는 그래프이다. X-축은 평가된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화된 센스 가닥의 3' 말단을 나열한다. 음성 대조군 서열 (NC1), 형질감염되지 않은 세포, 및 모의 형질감염된 세포는 대조군으로서 좌측에 도시된다.
도 5는 닉킹된 테트라루프 구조에서 상이한 염기 서열을 갖는 GYS2 올리고뉴클레오티드를 사용한 원숭이 간세포에서의 스크리닝의 결과를 도시하는 그래프이다. 동일한 변형 패턴을 사용하였고, 올리고뉴클레오티드를 3가지 상이한 농도 (0.1 μM, 0.3 μM, 및 1.0 μM)로 시험하였다. 형질감염되지 않은 세포는 대조군으로서 좌측에 도시된다.
도 6a 및 6b는 HEK-293 세포에서 용량 반응 곡선 스크리닝으로부터 선택된 GYS2 올리고뉴클레오티드에 대한 IC50 결과를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 7은 닉킹된 테트라루프 구조에서 GalNAc-접합된 GYS2 올리고뉴클레오티드의 생체내 활성 평가를 도시하는 그래프이다. 8가지 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 시험하였다. 0.5 mg/kg의 올리고뉴클레오티드를 마우스 발현된 인간 GYS2에 피하 투여하였다. 데이터는 PBS 대조군에 대해 정규화된 투여후 4 일째에 남아있는 GYS2 mRNA의 양을 도시한다.
일부 측면에 따라, 본 개시내용은 글리코겐 저장 질환 (예를 들어, GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX) 또는 글리코겐 저장 질환의 하나 이상의 증상을 치료하기 위해 세포, 특히 간 세포 (예를 들어, 간세포)에서 GYS2 발현을 감소시키는데 효과적인 GYS2 mRNA를 표적화하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 따라서, 관련 측면에서, 본 개시내용은 간에서 GYS2 유전자 발현을 선택적으로 감소시키는 것을 수반하는, 글리코겐 저장 질환 (예를 들어, GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX) 또는 글리코겐 저장 질환의 하나 이상의 증상의 치료 방법을 제공하였다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 GYS2 표적화 올리고뉴클레오티드는 대상체에서 글리코겐 저장 질환 (예를 들어, GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX) 또는 글리코겐 저장 질환의 하나 이상의 증상을 치료하기 위해 표적 조직의 선택된 세포 (예를 들어, 간의 간세포)에게 전달하기 위해 설계된다.
정의된 용어의 기재를 비롯하여 본 개시내용의 추가의 측면이 하기에 제공된다.
I. 정의
투여하는: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 (예를 들어, 대상체에서 상태를 치료하기 위해) 약리학적으로 유용한 방식으로 대상체에게 물질 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)을 제공하는 것을 의미한다.
대략적으로: 본원에서 사용된 바와 같이, 1개 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 달리 명시되지 않거나 또는 문맥으로부터 명백하지 않다면 명시된 기준 값의 어느 한 방향으로 (초과 또는 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다 (이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함).
아시알로당단백질 수용체 (ASGPR): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아시알로당단백질 수용체" 또는 "ASGPR"은 큰 48 kDa (ASGPR-1) 및 작은 40 kDa 서브유닛 (ASGPR-2)에 의해 형성된, 이분된 C-유형 렉틴을 지칭한다. ASGPR은 간세포의 동모양 표면 상에서 주로 발현되고, 말단 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기 (아시알로당단백질)를 함유하는 순환 당단백질의 결합, 내재화 및 후속적인 제거에서 주요 역할을 한다.
상보성: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성"은 뉴클레오티드가 서로 염기 쌍을 형성하는 것을 허용하는, 뉴클레오티드 (예를 들어, 대향 핵산 상에 있는 또는 단일 핵산 가닥의 대향 영역 상에 있는 2개의 뉴클레오티드) 사이의 구조적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 대향 핵산의 피리미딘 뉴클레오티드에 대해 상보성인 한 핵산의 퓨린 뉴클레오티드는 서로 수소 결합을 형성함으로써 함께 염기 쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보성 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 방식으로 또는 적합한 듀플렉스의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기 쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 2개의 핵산은 상보성 영역을 형성하도록 서로 상보성인 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
데옥시리보뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "데옥시리보뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드와 비교하여 그의 펜토스 당의 2' 위치에서 수소를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 데옥시리보뉴클레오티드는 당, 포스페이트 기 또는 염기 내의 또는 그의 변형 또는 치환을 비롯하여, 2' 위치 이외에 있는 원자의 1개 이상의 변형 또는 치환을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드이다.
이중-가닥 올리고뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 실질적으로 듀플렉스 형태인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보성 염기-쌍 형성은 공유적으로 분리된 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보성 염기-쌍 형성은 공유적으로 연결된 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보성 염기-쌍 형성은 함께 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오티드의 상보성 역평행 서열을 제공하기 위해 (예를 들어, 헤어핀을 통해) 폴딩된 단일 핵산 가닥으로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 서로 완전히 듀플렉스화된 2개의 공유적으로 분리된 핵산 가닥을 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 한쪽 또는 양쪽 말단에 오버행을 갖는 부분적으로 듀플렉스화된 2개의 공유적으로 분리된 핵산 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 상보성인 뉴클레오티드의 역평행 서열을 포함하고, 따라서 1개 이상의 미스매치를 가질 수 있으며, 여기에는 내부 미스매치 또는 말단 미스매치가 포함될 수 있다.
듀플렉스: 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 관련하여 용어 "듀플렉스"는 뉴클레오티드의 2개의 역평행 서열의 상보성 염기-쌍 형성을 통해 형성된 구조를 지칭한다.
부형제: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 예를 들어 원하는 점조도 또는 안정화 효과를 제공하거나 또는 부여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 비치료적인 작용제를 지칭한다.
글리코겐 저장 질환: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글리코겐 저장 질환", "GSD" 또는 "글리코겐 저장 질환들"은 글리코겐 합성, 글리코겐 분해, 및/또는 글루코스 분해 (해당작용)에 영향을 미치는 효소 결핍에 의해 초래되는 대사 장애를 지칭한다. GSD 0, GSD I (GSD 1 또는 본 기르케(von Gierke) 질환; 예를 들어, GSDIa로도 공지됨), GSD II (폼페(Pompe) 질환 또는 산 말타제 결핍 질환으로도 공지됨), GSD III (GSD 3, 코리(Cori) 질환, 또는 포브스(Forbes) 질환으로도 공지됨), GSD IV (GSD 4 또는 앤더슨(Andersen) 질환), GSD V (맥아들(McArdle) 질환으로도 공지됨), GSD VI (GSD 6 또는 헤르스(Hers) 질환으로도 공지됨), GSD VII (GSD 7 또는 타루이(Tarui) 질환으로도 공지됨), GSD VIII, 및 GSD IX (GSD 9로도 공지됨)를 비롯하여 다양한 유형의 글리코겐 저장 질환이 특징분석되었다. 일부 실시양태에서, 글리코겐 저장 질환을 가진 개체는 간비대, 증가된 간 독성 (예를 들어, 보다 높은 수준의 AST, ALT 및/또는 ALP), 간 섬유증, 간에서 지방산 침착, 간 과형성, 간세포 선종, 및/또는 간세포 암종을 비롯하여 이로 제한되지 않는 수많은 증상 중 하나 이상을 나타낸다.
GYS2: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "GYS2" 또는 "글리코겐 신타제 2"는 간 글리코겐 신타제 유전자를 지칭한다. 이 유전자는 글리코겐의 합성 (즉, UDP-글루코스로부터 글리코겐 분자의 말단 분지로의 글루코스 분자의 수송)에서 속도-제한 스템을 촉매하는 단백질인 간 글리코겐 신타제를 코딩한다. GYS2는 간의 세포, 예를 들어 간세포에서 발현된다. GYS2의 상동체는 인간, 마우스, 래트, 비-인간 영장류 종 등을 비롯하여 광범위한 종에 걸쳐 보존된다 (예를 들어, NCBI HomoloGene: 56580 참고). 인간에서, GYS2는 진뱅크 수탁 번호 NM_021957.3 (서열식별번호: 609), XM_006719063.3, 및 XM_017019245.1 (각각 상이한 이소형인 진뱅크 수탁 번호 NP_068776.2, XP_006719126.1 (이소형 X1) 및 XP_016874734.1 (이소형 X2) 각각을 코딩함)에 제시된 다중 전사체를 코딩한다. 예시적인 원숭이 (레서스 마카크(Rhesus macaque)) 전사체 서열은 진뱅크 수탁 번호 XM_001098578.2 (서열식별번호: 610)에 제시된다. 예시적인 마우스 전사체는 진뱅크 수탁 번호 NM_145572.2 (서열식별번호: 611)에 제시된다.
간세포: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "간세포" 또는 "간세포들"은 간의 실질 조직의 세포를 지칭한다. 이들 세포는 간 질량의 대략 70-85%를 구성하고, 혈청 알부민, 피브리노겐, 및 응고 인자의 프로트롬빈 그룹 (인자 3 및 4는 제외)을 제조한다. 간세포 계통 세포에 대한 마커에는 트랜스티레틴 (Ttr), 글루타민 신테타제 (Glul), 간세포 핵 인자 1a (Hnf1a), 및 간세포 핵 인자 4a (Hnf4a)가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 성숙한 간세포에 대한 마커에는 시토크롬 P450 (Cyp3a11), 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제 (Fah), 글루코스 6-포스페이트 (G6p), 알부민 (Alb), 및 OC2-2F8이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, [Huch et al., (2013), Nature, 494(7436): 247-250]을 참고하며, 간세포 마커와 관련된 내용은 본원에 참고로 포함된다.
루프: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "루프"는 서로 충분히 상보성인 핵산의 2개의 역평행 영역에 의해 플랭킹된 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 쌍을 형성하지 않은 영역을 지칭하며, 이에 의해 적절한 혼성화 조건하에 (예를 들어, 포스페이트 완충제에서, 세포에서) 쌍을 형성하지 않은 영역을 플랭킹하는 2개의 역평행 영역이 혼성화하여 듀플렉스 ("스템"으로 지칭됨)를 형성한다.
변형된 뉴클레오티드간 연결: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오티드간 연결"은 포스포디에스테르 결합을 포함하는 기준 뉴클레오티드간 연결과 비교하여 1개 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드간 연결을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연 발생 연결이다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 변형된 뉴클레오티드간 연결이 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 성질을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 열 안정성, 분해에 대한 내성, 뉴클레아제 내성, 가용성, 생체이용률, 생활성, 감소된 면역원성 등을 개선시킬 수 있다.
변형된 뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드, 아데닌 데옥시리보뉴클레오티드, 구아닌 데옥시리보뉴클레오티드, 시토신 데옥시리보뉴클레오티드 및 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 상응하는 기준 뉴클레오티드와 비교하여 1개 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연 발생 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 그의 당, 핵염기 및/또는 포스페이트 기에서 1개 이상의 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 상응하는 기준 뉴클레오티드에 접합된 1개 이상의 화학적 모이어티를 갖는다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드가 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 성질을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 열 안정성, 분해에 대한 내성, 뉴클레아제 내성, 가용성, 생체이용률, 생활성, 감소된 면역원성 등을 개선시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 리보스 고리의 2' 위치에서 2'-O-메틸 또는 2'-F 치환을 포함한다.
닉킹된 테트라루프 구조: "닉킹된 테트라루프 구조"는 별개의 센스 (패신저) 및 안티센스 (가이드) 가닥의 존재를 특징으로 하는 RNAi 올리고뉴클레오티드의 구조이며, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 상보성인 영역을 가져서 두 가닥이 듀플렉스를 형성하고, 가닥들 중 적어도 하나, 일반적으로 센스 가닥은 듀플렉스로부터 연장되고, 연장부는 테트라루프, 및 테트라루프에 인접합 스템 영역을 형성하는 2개의 자체-상보성 서열을 함유하고, 테트라루프는 적어도 1개의 가닥의 자체-상보성 서열에 의해 형성된 인접한 스템 영역을 안정화시키도록 형성된다.
올리고뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 예를 들어 100개 미만의 뉴클레오티드 길이인 짧은 핵산을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 듀플렉스 영역을 가질 수 있거나 또는 갖지 않을 수 있다. 비제한적인 예의 세트로서, 올리고뉴클레오티드는 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 다이서 기질 간섭 RNA (dsiRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 siRNA, 또는 단일-가닥 siRNA일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 RNAi 올리고뉴클레오티드이다.
오버행: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "오버행"은 1개의 가닥 또는 영역이 함께 듀플렉스를 형성하는 상보성 가닥의 말단 너머로 연장된 1개의 가닥 또는 영역으로부터 생성된 말단의 염기 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드(들)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 오버행은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에서 듀플렉스 영역으로부터 연장된 쌍을 형성하지 않은 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 오버행은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 상의 3' 또는 5' 오버행이다.
포스페이트 유사체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포스페이트 유사체"는 포스페이트 기의 정전기적 및/또는 입체적 성질을 모방하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 종종 효소적 제거에 민감한 5'-포스페이트 대신에 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드에 위치한다. 일부 실시양태에서, 5' 포스페이트 유사체는 포스파타제-내성 연결을 함유한다. 포스페이트 유사체의 예에는 5' 포스포네이트, 예컨대 5' 메틸렌포스포네이트 (5'-MP) 및 5'-(E)-비닐포스포네이트 (5'-VP)가 포함된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에서 당의 4'-탄소 위치에 포스페이트 유사체 ("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)를 갖는다. 4'-포스페이트 유사체의 예는 옥시메틸 기의 산소 원자가 당 모이어티 (예를 들어, 그의 4'-탄소에서) 또는 그의 유사체에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다. 예를 들어, 2017년 9월 1일에 출원한 국제 특허 출원 PCT/US2017/049909, 2016년 9월 2일에 출원한 미국 가출원 번호 62/383,207, 및 2016년 9월 12일에 출원한 62/393,401을 참고하며, 포스페이트 유사체와 관련된 각각의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 대해 다른 변형이 개발되었다 (예를 들어, WO 2011/133871; 미국 특허 번호 8,927,513; 및 Prakash et al. (2015), Nucleic Acids Res., 43(6):2993-3011, 포스페이트 유사체와 관련된 각각의 내용은 본원에 참고로 포함됨).
감소된 발현: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 유전자의 "감소된 발현"은 적절한 기준 세포 또는 대상체와 비교하여 유전자에 의해 코딩된 RNA 전사체 또는 단백질의 양에서의 감소 및/또는 세포 또는 대상체에서 유전자 활성의 양에서의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, GYS2 mRNA 서열에 대해 상보성인 안티센스 가닥을 갖는 것)로 세포를 처리하는 작용은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로 처리하지 않은 세포와 비교하여 (예를 들어, GYS2 유전자에 의해 코딩된) RNA 전사체, 단백질 및/또는 효소 활성의 양에서의 감소를 일으킬 수 있다. 유사하게, 본원에서 사용된 바와 같이 "발현을 감소시키는"은 유전자 (예를 들어, GYS2)의 감소된 발현을 일으키는 작용을 지칭한다.
상보성 영역: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 영역"은 적절한 혼성화 조건하에, 예를 들어 포스페이트 완충제에서, 세포 등에서 뉴클레오티드의 두 서열 사이에 혼성화를 허용하기 위해 뉴클레오티드의 역평행 서열 (예를 들어, mRNA 내의 표적 뉴클레오티드 서열)에 대해 충분히 상보성인 핵산의 뉴클레오티드의 서열 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드)을 지칭한다. 상보성 영역은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, mRNA 내에 존재하는 표적 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부분)에 대해 완전히 상보성일 수 있다. 예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 대해 완전히 상보성인 상보성 영역은 임의의 미스매치 또는 갭이 없이 mRNA에서 상응하는 서열에 대해 상보성인 뉴클레오티드의 연속적인 서열을 갖는다. 대안적으로, 상보성 영역은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부분)에 대해 부분적으로 상보성일 수 있다. 예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 대해 부분적으로 상보성인 상보성 영역은 mRNA에서 상응하는 서열에 대해 상보성이지만, mRNA에서 상응하는 서열과 비교하여 1개 이상의 미스매치 또는 갭 (예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 초과의 미스매치 또는 갭)을 함유하는 뉴클레오티드의 연속적인 서열을 가지며, 단, 상보성 영역은 적절한 혼성화 조건하에 mRNA와 혼성화할 수 있도록 유지된다.
리보뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "리보뉴클레오티드"는 그의 2' 위치에 히드록실 기를 함유하며 그의 펜토스 당으로서 리보스를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 리보뉴클레오티드는, 리보스, 포스페이트 기 또는 염기 내의 또는 그의 변형 또는 치환을 비롯하여, 2' 위치 이외에 있는 원자의 1개 이상의 변형 또는 치환을 갖는 리보뉴클레오티드이다.
RNAi 올리고뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RNAi 올리고뉴클레오티드"는 (a) 표적 mRNA의 절단에서 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 일부가 아르고너트(Argonaute) 2 (Ago2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 것인, 센스 가닥 (패신저) 및 안티센스 가닥 (가이드)을 갖는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 또는 (b) 표적 mRNA의 절단에서 안티센스 가닥 (또는 해당 안티센스 가닥의 일부)이 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 것인, 단일 안티센스 가닥을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
가닥: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "가닥"은 뉴클레오티드간 연결 (예를 들어, 포스포디에스테르 연결, 포스포로티오에이트 연결)을 통해 함께 연결된 뉴클레오티드의 인접한 단일 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 가닥은 2개의 유리 말단, 예를 들어 5'-말단 및 3'-말단을 갖는다.
대상체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 마우스, 토끼 및 인간을 비롯한 임의의 포유류를 의미한다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 영장류이다. 용어 "개체" 또는 "환자"는 "대상체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
합성: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "합성"은 (예를 들어, 기계 (예를 들어, 고체 상태 핵산 합성기)를 사용하여) 인공적으로 합성되거나, 또는 분자를 정상적으로 생성하는 천연 공급원 (예를 들어, 세포 또는 유기체)으로부터 달리 유래되지 않는 핵산 또는 다른 분자에 대해 지칭한다.
표적화 리간드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적화 리간드"는 관심 조직 또는 세포의 관련 분자 (예를 들어, 수용체)에 선택적으로 결합하고, 다른 물질을 관심 조직 또는 세포에 표적화시키기 위한 목적으로 또 다른 물질에 접합될 수 있는 분자 (예를 들어, 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질)를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 올리고뉴클레오티드를 특이적인 관심 조직 또는 세포에 표적화시키기 위한 목적으로 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 세포 표면 수용체에 선택적으로 결합한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 올리고뉴클레오티드에 접합될 때, 세포의 표면 상에서 발현된 수용체와의 선택적 결합을 통해 및 올리고뉴클레오티드, 표적화 리간드 및 수용체를 포함하는 복합체의 세포에 의한 엔도좀 내재화를 통해, 특정한 세포에게로 올리고뉴클레오티드의 전달을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 올리고뉴클레오티드가 세포에서 표적화 리간드로부터 방출되도록 세포성 내재화 이후에 또는 동안에 절단되는 링커를 통해 올리고뉴클레오티드에 접합된다.
테트라루프: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "테트라루프"는 뉴클레오티드의 플랭킹 서열의 혼성화에 의해 형성된 인접한 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 루프를 지칭한다. 안정성에서의 증가는, 무작위로 선택된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 비등한 길이를 갖는 루프의 세트로부터 평균적으로 예상되는 인접한 스템 듀플렉스의 Tm보다 높은, 인접한 스템 듀플렉스의 융점 (Tm)에서의 증가로서 검출가능하다. 예를 들어, 테트라루프는 적어도 2개 염기 쌍 길이의 듀플렉스를 포함하는 헤어핀에 10 mM NaHPO4 중에서 적어도 50℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 융점을 부여한다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 적층 상호작용에 의해 인접한 스템 듀플렉스에서 염기 쌍을 안정화시킬 수 있다. 또한, 테트라루프에서 뉴클레오티드 사이의 상호작용에는 비-왓슨-크릭 염기 쌍 형성, 적층 상호작용, 수소 결합, 및 접촉 상호작용이 포함되나 이에 제한되지 않는다 (Cheong et al., Nature 1990 Aug. 16; 346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991 Jul. 12; 253(5016):191-4). 일부 실시양태에서, 테트라루프는 3 내지 6개 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 전형적으로 4 내지 5개 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 테트라루프는 변형될 수 있거나 또는 변형되지 않을 수 있는 (예를 들어, 표적화 모이어티에 접합될 수 있거나 또는 접합되지 않을 수 있는) 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 한 실시양태에서, 테트라루프는 4개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 임의의 뉴클레오티드가 테트라루프에서 사용될 수 있고, 이러한 뉴클레오티드에 대한 표준 IUPAC-IUB 기호는 [Cornish-Bowden (1985) Nucl. Acids Res. 13: 3021-3030]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문자 "N"은 임의의 염기가 해당 위치에 있을 수 있음을 의미하기 위해 사용될 수 있고, 문자 "R"은 A (아데닌) 또는 G (구아닌)이 해당 위치에 있을 수 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있고, "B"는 C (시토신), G (구아닌), 또는 T (티민)이 해당 위치에 있을 수 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 테트라루프의 예에는 테트라루프의 UNCG 패밀리 (예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리 (예를 들어, GAAA), 및 CUUG 테트라루프가 포함된다. (Woese et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1990 November; 87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov. 11; 19(21):5901-5). DNA 테트라루프의 예에는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리 (예를 들어, d(GTTA)), 테트라루프의 d(GNRA) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리, 및 테트라루프의 d(TNCG) 패밀리 (예를 들어, d(TTCG))가 포함된다. 예를 들어 [Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281-14292, 2002. SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL. 78th; NO. 2; PAGE. 731 (2000)]을 참고하며, 그들의 관련 개시내용에 대해서는 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 닉킹된 테트라루프 구조 내에 함유된다.
치료하다: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다"는 기존 상태 (예를 들어, 질환, 장애)와 관련하여 대상체의 건강 및/또는 복지를 개선시키기 위해 또는 상태의 발병 가능성을 예방하거나 감소시키기 위해, 예를 들어 대상체에게 치료제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 투여를 통해, 치료를 필요로 하는 대상체에게 치유를 제공하는 작용을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체가 경험한 상태 (예를 들어, 질환, 장애)의 적어도 하나의 징후, 증상 또는 기여 인자의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 수반한다.
II. 올리고뉴클레오티드-기반 억제제
i. GYS2 표적화 올리고뉴클레오티드
강한 올리고뉴클레오티드가 상이한 종 (인간 및 레서스 마카크 (예를 들어, 실시예 1 참고))의 mRNA를 비롯한 GYS2 mRNA의 실험, 및 시험관내 및 생체내 시험을 통해 본원에서 확인되었다. 이러한 올리고뉴클레오티드를 사용하여, GYS2 활성을 감소시키고, 결과적으로 간비대, 간 독성 (예를 들어, AST, ALT 및/또는 ALP의 수준에 의해 입증됨), 간 섬유증, 간에서 지방산 침착, 간 과형성, 간세포 선종, 및/또는 간세포 암종을 감소시키거나 또는 예방함으로써 글리코겐 저장 질환 (예를 들어, GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX) 또는 글리코겐 저장 질환의 하나 이상의 증상을 가진 대상체에 대해 치료적 이익을 달성할 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 센스 가닥, 및 서열식별번호: 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627로부터 선택된 상보성 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 안티센스 가닥을 갖는 강한 RNAi 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공되며, 이는 또한 표 4의 표에 나열된다 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥 및 서열식별번호: 193에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥).
서열은 본원에 기재된 바와 같이 여러 상이한 올리고뉴클레오티드 구조 (또는 포맷)로 표현될 수 있다.
일부 실시양태에서, GYS2 mRNA의 특정한 영역은 올리고뉴클레오티드-기반 억제에 대해 다른 영역에 비해 다루기 더 쉽기 때문에, 이들이 표적화에 대한 핫스팟인 것으로 밝혀졌다. 일부 실시양태에서, GYS2의 핫스팟 영역은 서열식별번호:599-608 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 이들 GYS2 mRNA 영역은 GYS2 mRNA 발현을 억제할 목적으로 본원에서 논의된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적화될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 세포에서 mRNA를 표적화하고 그의 발현을 억제하기 위한 목적으로 GYS2 mRNA (예를 들어, GYS2 mRNA의 핫스팟 내에)에 대해 상보성인 영역을 갖도록 설계된다. 상보성 영역은 일반적으로 그의 발현을 억제하기 위한 목적으로 올리고뉴클레오티드 (또는 그의 가닥)를 GYS2 mRNA에 어닐링하기에 적합한 길이 및 염기 함량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619에 제시된 서열에 대해 적어도 부분적으로 상보성인 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상에) 상보성 영역을 포함하고, 이는 GYS2 mRNA의 핫스팟 영역 내에 맵핑된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619에 제시된 서열에 대해 완전히 상보성인 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상에) 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619에 제시된 서열의 연속 뉴클레오티드에 대해 상보성인 올리고뉴클레오티드의 상보성 영역은 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 이어진다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열의 연속 뉴클레오티드에 대해 상보성인 올리고뉴클레오티드의 상보성 영역은 안티센스 가닥의 전체 길이의 일부분에 걸쳐 이어진다 (예를 들어, 안티센스 가닥의 3' 말단에 있는 2개의 뉴클레오티드를 제외한 모두). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619에 제시된 서열의 뉴클레오티드 1-19에 걸쳐 이어지는 뉴클레오티드의 연속 스트레치에 대해 적어도 부분적으로 (예를 들어, 완전히) 상보성인 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상에) 상보성 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상보성 영역은 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30개 (예를 들어, 12 내지 30, 12 내지 22, 15 내지 25, 17 내지 21, 18 내지 27, 19 내지 27, 또는 15 내지 30개) 범위의 뉴클레오티드 길이인 GYS2 mRNA에 대해 상보성인 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이인 GYS2 mRNA에 대해 상보성인 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, GYS2 mRNA에 대해 상보성인 영역은 GYS2 mRNA의 상응하는 서열과 비교하여 1개 이상의 미스매치를 가질 수 있다. 적절한 혼성화 조건하에 GYS2 mRNA와 상보성 염기 쌍을 형성하는 능력을 유지한다면, 올리고뉴클레오티드 상의 상보성 영역은 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하 등의 미스매치를 가질 수 있다. 대안적으로, 적절한 혼성화 조건하에 GYS2 mRNA와 상보성 염기 쌍을 형성하는 능력을 유지한다면, 올리고뉴클레오티드 상의 상보성 영역은 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하 또는 4개 이하의 미스매치를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역에 1개 초과의 미스매치가 있는 경우, 올리고뉴클레오티드가 적절한 혼성화 조건하에 GYS2 mRNA와 상보성 염기 쌍을 형성하는 능력을 유지한다면, 이들은 상보성 영역에 걸쳐 연속하여 (예를 들어, 연이어 2, 3, 4개 또는 그 초과) 또는 산재하여 위치할 수 있다.
여전히, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥 및 서열식별번호: 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627로부터 선택된 상보성 서열을 갖는 안티센스 가닥을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 이는 또한 표 4의 표에 나열된다 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥 및 서열식별번호: 193에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥).
ii. 올리고뉴클레오티드 구조
본 개시내용의 방법에서 GYS2 mRNA를 표적화하는데 유용한 올리고뉴클레오티드의 다양한 구조, 예컨대 RNAi, 안티센스, miRNA 등이 있다. 본원에 또는 다른 곳에 기재된 임의의 구조가 본원에 기재된 서열 (예를 들어, GYS2의 핫스팟 서열, 예컨대 서열식별번호: 599-608에 제시된 것들, 또는 각각 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619에 제시되거나 또는 서열식별번호: 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 센스 또는 안티센스 가닥)을 포함시키거나 또는 표적화하기 위한 프레임워크로서 사용될 수 있다. (예를 들어, RNAi 경로를 통해) GYS2 발현을 표적화하기 위한 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 서로 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 공유적으로 연결되지 않는다. 그러나, 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 공유적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 서열은 둘 다 17 내지 40개 뉴클레오티드 길이인 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있거나 또는 그를 사용하여 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그들의 센스 가닥의 3' 연장부 내에 테트라루프 구조, 및 그의 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 말단 오버행 뉴클레오티드를 갖는, 이러한 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 2개의 말단 오버행 뉴클레오티드는 GG이다. 전형적으로, 안티센스 가닥의 2개의 말단 GG 뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 다는 표적에 대해 상보성이거나 또는 상보성이 아니다.
일부 실시양태에서, 둘 다 21 내지 23개 범위의 뉴클레오티드 길이인 센스 및 안티센스 가닥을 갖는, 이러한 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 3' 오버행은 1 또는 2개 뉴클레오티드 길이인 센스, 안티센스, 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다에 제공된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 23개 뉴클레오티드의 가이드 가닥 및 21개 뉴클레오티드의 패신저 가닥을 갖고, 패신저 가닥의 3'-말단 및 가이드 가닥의 5'-말단은 평활 말단을 형성하고, 가이드 가닥은 2개 뉴클레오티드 3' 오버행을 갖는다.
일부 실시양태에서, GYS2 발현의 발현을 감소시키기 위한 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 (RNAi)과 결속된다. 예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드는 1 내지 5개 뉴클레오티드의 적어도 1개의 3' 오버행과 함께 19-25개 뉴클레오티드의 크기를 갖는 각각의 가닥으로 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,372,968 참고). 활성 RNAi 생성물을 생성하도록 다이서에 의해 가공된 더 긴 올리고뉴클레오티드 또한 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,883,996 참고). 추가의 작업은, 가닥들 중 하나가 열역학적-안정화 테트라루프 구조를 포함하는 것인 구조를 비롯하여, 적어도 1개의 가닥의 적어도 1개의 말단이 듀플렉스 표적화 영역을 넘어서 연장된 것인, 연장된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하였다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,513,207 및 8,927,705, 뿐만 아니라 WO2010033225 참고, 이들 올리고뉴클레오티드의 개시내용에 대해서는 본원에 참고로 포함됨). 이러한 구조는 단일-가닥 연장부 (분자의 한쪽 또는 양쪽 상에) 뿐만 아니라 이중-가닥 연장부를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 21 내지 23개 범위의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 올리고뉴클레오티드는 센스 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단에 오버행 (예를 들어, 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드 길이)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)는 표적 RNA에 대해 안티센스인 21개 뉴클레오티드 가이드 가닥, 및 상보성 패신저 가닥을 포함할 수 있고, 두 가닥 모두 어닐링되어 19-bp 듀플렉스 및 하나의 또는 둘 다의 3' 말단에 2개 뉴클레오티드 오버행을 형성한다. 예를 들어, US9012138, US9012621 및 US9193753을 참고하며, 이들 각각의 내용은 관련 개시내용에 대해 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 안티센스-센스 듀플렉스를 넘어서 연장되는 영역을 포함하는 36개 뉴클레오티드 센스 가닥을 가지며, 연장 영역은 스템-테트라루프 구조를 갖고, 스템은 6개 염기 쌍 듀플렉스이고, 테트라루프는 4개의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 스템-테트라루프는 S1-L-S2로 제시되고, S1은 듀플렉스를 형성하도록 S2에 대해 상보성이고, L은 S1과 S2 사이에 테트라루프를 형성한다.
이들 특정한 실시양태에서, 테트라루프 뉴클레오티드 중 3개 또는 4개 각각은 1가 GalNac 리간드에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다이서 효소에 의해 작동될 때 성숙 RISC에 도입된 안티센스 가닥을 생성하는 25개 뉴클레오티드 센스 가닥 및 27개 뉴클레오티드 안티센스 가닥을 포함한다.
본원에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 다른 올리고뉴클레오티드 설계에는 다음이 포함된다: 16량체 siRNA (예를 들어, Nucleic Acids in Chemistry and Biology. Blackburn (ed.), Royal Society of Chemistry, 2006 참고), shRNA (예를 들어, 19 bp 또는 그보다 짧은 스템을 가짐; 예를 들어, Moore et al. Methods Mol. Biol. 2010; 629:141-158 참고), 평활 siRNA (예를 들어, 19 bp 길이; 예를 들어, Kraynack and Baker, RNA Vol. 12, p163-176 (2006) 참고), 비대칭 siRNA (aiRNA; 예를 들어, Sun et al., Nat. Biotechnol. 26, 1379-1382 (2008) 참고), 비대칭의 더 짧은-듀플렉스 siRNA (예를 들어, Chang et al., Mol Ther. 2009 Apr; 17(4): 725-32 참고), 포크 siRNA (예를 들어, Hohjoh, FEBS Letters, Vol 557, issues 1-3; Jan 2004, p 193-198 참고), 단일-가닥 siRNA (Elsner; Nature Biotechnology 30, 1063 (2012)), 덤벨-형태의 원형 siRNA (예를 들어, Abe et al. J Am Chem Soc 129: 15108-15109 (2007) 참고), 및 소형의 내부 세그먼트화된 간섭 RNA (sisiRNA; 예를 들어, Bramsen et al., Nucleic Acids Res. 2007 Sep; 35(17): 5886-5897 참고). 상기 각각의 참고문헌은 관련된 개시내용에 대해 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다. GYS2의 발현을 감소시키거나 또는 억제하기 위해 일부 실시양태에서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 구조의 추가의 비제한적인 예는 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 짧은 siRNA (예를 들어, Hamilton et al., Embo J., 2002, 21(17): 4671-4679 참고; 또한 미국 출원 번호 20090099115 참고)이다.
a. 안티센스 가닥
일부 실시양태에서, GYS2를 표적화하기 위한 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 193-384, 417-466, 518-568, 575-580, 586-598 또는 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열의 적어도 12개의 (예를 들어, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 또는 적어도 23개의) 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 40개 이하의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 40개 이하, 35개 이하, 30개 이하, 27개 이하, 25개 이하, 21개 이하, 19개 이하, 17개 이하, 또는 12개 이하의 뉴클레오티드 길이)의 안티센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 19, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 25, 적어도 27, 적어도 30, 적어도 35, 또는 적어도 38개 뉴클레오티드 길이)의 안티센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 12 내지 40개 (예를 들어, 12 내지 40, 12 내지 36, 12 내지 32, 12 내지 28, 15 내지 40, 15 내지 36, 15 내지 32, 15 내지 28, 17 내지 22, 17 내지 25, 19 내지 27, 19 내지 30, 20 내지 40, 22 내지 40, 25 내지 40, 또는 32 내지 40개 범위의) 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 "가이드 가닥"으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 가닥이 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)와 결속될 수 있고 아르고너트 단백질에 결합할 수 있거나, 또는 1개 이상의 유사한 인자와 결속하거나 또는 그와 결합할 수 있고, 표적 유전자의 침묵을 지시할 수 있다면, 이는 가이드 가닥으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥에 대해 상보성인 센스 가닥은 "패신저 가닥"으로 지칭될 수 있다.
b. 센스 가닥
일부 실시양태에서, GYS2를 표적화하기 위한 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 센스 가닥 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-192, 385-416, 467-517, 569-574, 581-585 또는 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열의 적어도 12개의 (예를 들어, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 또는 적어도 23개의) 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 센스 가닥을 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 40개 이하의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 40개 이하, 36개 이하, 30개 이하, 27개 이하, 25개 이하, 21개 이하, 19개 이하, 17개 이하, 또는 12개 이하의 뉴클레오티드 길이)의 센스 가닥 (또는 패신저 가닥)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 19, 적어도 21, 적어도 25, 적어도 27, 적어도 30, 적어도 36, 또는 적어도 38개 뉴클레오티드 길이)의 센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 12 내지 40개 (예를 들어, 12 내지 40, 12 내지 36, 12 내지 32, 12 내지 28, 15 내지 40, 15 내지 36, 15 내지 32, 15 내지 28, 17 내지 21, 17 내지 25, 19 내지 27, 19 내지 30, 20 내지 40, 22 내지 40, 25 내지 40, 또는 32 내지 40개) 범위의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 그의 3'-말단에 스템-루프 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 그의 5'-말단에서 스템-루프 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 염기 쌍 길이의 듀플렉스이다. 일부 실시양태에서, 스템-루프는 분자에게 분해 (예를 들어, 효소적 분해)에 대한 보다 양호한 보호를 제공하고, 표적 세포로의 전달을 위한 표적화 특징을 용이하게 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 루프는 올리고뉴클레오티드의 유전자 발현 억제 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않고 변형이 이루어질 수 있는 부가된 뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 (예를 들어, 그의 3'-말단에서) S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하고, S1은 S2에 대해 상보성이고, L은 S1과 S2 사이에 10개 이하의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오티드 길이)의 루프를 형성하는 것인 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 스템-루프의 루프 (L)는 (예를 들어, 닉킹된 테트라루프 구조 내의) 테트라루프이다. 테트라루프는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 및 이들의 조합물을 함유할 수 있다. 전형적으로, 테트라루프는 4 내지 5개의 뉴클레오티드를 갖는다.
c. 듀플렉스 길이
일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20 또는 적어도 21개) 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 12-30개 범위의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 12 내지 30, 12 내지 27, 12 내지 22, 15 내지 25, 18 내지 30, 18 내지 22, 18 내지 25, 18 내지 27, 18 내지 30, 19 내지 30 또는 21 내지 30개 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 이어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이의 듀플렉스는 센스 또는 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 이어진다. 특정 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이의 듀플렉스는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다의 전체 길이에 걸쳐 이어진다.
d. 올리고뉴클레오티드 말단
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다에 3'-오버행이 있도록 센스 및 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 다른 5' 말단과 비교하여 열역학적으로 덜 안정한 1개의 5' 말단을 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 3' 말단에서 평활 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에서 오버행을 포함하는 비대칭 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 상의 3' 오버행은 1-8개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 뉴클레오티드 길이)이다.
전형적으로, RNAi에 대한 올리고뉴클레오티드는 안티센스 (가이드) 가닥의 3' 말단 상에 2개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 그러나, 다른 오버행이 가능하다. 일부 실시양태에서, 오버행은 1 내지 6개 뉴클레오티드, 임의적으로 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 6개 뉴클레오티드, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드 길이를 포함하는 3' 오버행이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 오버행은 1 내지 6개 뉴클레오티드, 임의적으로 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 6개 뉴클레오티드, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드 길이를 포함하는 5' 오버행이다.
일부 실시양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단의 1개 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4개) 말단 뉴클레오티드가 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단의 1 또는 2개의 말단 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 마지막 뉴클레오티드가 변형되고, 예를 들어 2'-변형, 예를 들어 2'-O-메톡시에틸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 마지막 1 또는 2개의 말단 뉴클레오티드는 표적에 대해 상보성이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 마지막 1 또는 2개의 뉴클레오티드는 표적에 대해 상보성이 아니다. 일부 실시양태에서, 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단은 역전된 캡 뉴클레오티드를 갖는다.
e. 미스매치
일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 1개 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개) 미스매치가 있다. 센스 및 안티센스 가닥 사이에 1개 초과의 미스매치가 있다면, 이들은 상보성 영역에 걸쳐 연속하여 (예를 들어, 연이어 2, 3개 이상) 또는 산재하여 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 3' 말단은 1개 이상의 미스매치를 함유한다. 한 실시양태에서, 2개의 미스매치가 센스 가닥의 3' 말단에 포함된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥의 3'-말단에서 염기 미스매치 또는 세그먼트 탈안정화는 가능하게는 다이서에 의한 가공을 촉진시킴으로써 RNAi에서 합성 듀플렉스의 효능을 개선시켰다.
iii. 단일-가닥 올리고뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 GYS2 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 이러한 구조에는 단일-가닥 RNAi 올리고뉴클레오티드가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 최근의 노력은 단일-가닥 RNAi 올리고뉴클레오티드의 활성을 입증하였다 (예를 들어, Matsui et al. (May 2016), Molecular Therapy, Vol. 24(5), 946-955 참고). 그러나, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 쓰여질 때 특정한 핵산의 표적화된 세그먼트의 역 상보체를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이며, (예를 들어, 갭머로서) 세포에서 그의 표적 RNA의 RNaseH 매개된 절단을 유도하기 위해 또는 (예를 들어, 믹스머로서) 세포에서 표적 mRNA의 번역을 억제하기 위해 적합하게 변형된다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 미국 특허 번호 9,567,587에 기재된 바와 같이 변형될 수 있으며, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 변형 (예를 들어, 길이, 핵염기 (피리미딘, 퓨린)의 당 모이어티, 및 핵염기의 헤테로시클릭 부분의 변경)과 관련된 그의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 추가로, 안티센스 분자는 특이적 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 수십년 동안 사용되어 왔다 (예를 들어, Bennett et al.; Pharmacology of Antisense Drugs, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol. 57: 81-105 참고).
iv. 올리고뉴클레오티드 변형
올리고뉴클레오티드는 특이성, 안정성, 전달, 생체이용률, 뉴클레아제 분해로부터의 내성, 면역원성, 염기-쌍 형성 성질, RNA 분포 및 세포 흡수, 및 치료 또는 연구 사용과 관련된 다른 특징을 개선시키거나 또는 조절하기 위해 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, [Bramsen et al., Nucleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881; Bramsen and Kjems (Frontiers in Genetics, 3 (2012): 1-22)]를 참고한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 적합한 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 그의 염기 (또는 핵염기), 당 (예를 들어, 리보스, 데옥시리보스), 또는 포스페이트 기에서 변형을 갖는다.
올리고뉴클레오티드 상에서 변형의 개수 및 이들 뉴클레오티드 변형의 위치는 올리고뉴클레오티드의 성질에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 그들을 지질 나노입자 (LNP) 또는 유사한 담체에 접합시키거나 또는 포괄시킴으로써 생체내로 전달될 수 있다. 그러나, 올리고뉴클레오티드가 LNP 또는 유사한 담체에 의해 보호되지 않을 경우에는 (예를 들어, "네이키드 전달"), 그의 뉴클레오티드의 적어도 일부가 변형되는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 임의의 올리고뉴클레오티드의 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 특정 실시양태에서, 절반이 넘는 뉴클레오티드가 변형된다. 특정 실시양태에서, 절반 미만의 뉴클레오티드가 변형된다. 전형적으로, 네이키드 전달에 의해, 모든 뉴클레오티드가 해당 뉴클레오티드의 당 기의 2'-위치에서 변형된다. 이들 변형은 가역적일 수 있거나 또는 비가역적일 수 있다. 전형적으로, 2'-위치 변형은 2'-플루오로, 2'-O-메틸 등이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 원하는 특징 (예를 들어, 효소적 분해로부터의 보호, 생체내 투여 후에 원하는 세포를 표적화하는 능력, 및/또는 열역학적 안정성)을 유발하기에 충분한 개수 및 유형의 변형된 뉴클레오티드를 갖는다.
a. 당 변형
일부 실시양태에서, 변형된 당 (본원에서 당 유사체로도 지칭됨)은 예를 들어 1개 이상의 변형이 당의 2', 3', 4' 및/또는 5' 탄소 위치에서 발생하는 것인 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 당은 또한 비천연의 대안적인 탄소 구조체, 예컨대 록킹된 핵산 ("LNA") (예를 들어, Koshkin et al. (1998), Tetrahedron 54, 3607-3630 참고), 록킹되지 않은 핵산 ("UNA") (예를 들어, Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2, e103 참고), 및 브릿지된 핵산 ("BNA") (예를 들어, Imanishi and Obika (2002), The Royal Society of Chemistry, Chem. Commun., 1653-1659 참고)에 존재하는 것들을 포함할 수 있다. [Koshkin et al., Snead et al., 및 Imanishi and Obika]는 당 변형에 관한 그들의 개시내용에 대해 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 당에서의 뉴클레오티드 변형은 2'-변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2'-변형은 2'-아미노에틸, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산일 수 있다. 전형적으로, 변형은 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 또는 2'-O-메톡시에틸이다. 그러나, 올리고뉴클레오티드에서 사용하기 위해 개발되었던 매우 다양한 2' 위치 변형이 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드에서 이용될 수 있다. 예를 들어, [Bramsen et al., Nucleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881]을 참고한다. 일부 실시양태에서, 당에서의 변형은 당 고리의 변형을 포함하고, 이는 당 고리의 1개 이상의 탄소의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 당의 변형은 당의 2'-탄소와 1'-탄소 또는 4'-탄소 사이의 연결을 포함할 수 있다. 예를 들어, 연결은 에틸렌 또는 메틸렌 브릿지를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-탄소와 3'-탄소의 결합이 결여된 아시클릭 당을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 예를 들어 당의 4' 위치에서 티올 기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 말단의 3'-말단 기 (예를 들어, 3'-히드록실)는 포스페이트 기 또는 다른 기이고, 예를 들어 링커, 어댑터 또는 표지를 부착시키기 위해 또는 올리고뉴클레오티드를 또 다른 핵산에 직접적으로 라이게이션시키기 위해 사용될 수 있다.
b. 5' 말단 포스페이트
올리고뉴클레오티드의 5'-말단 포스페이트 기는 아르고너트 2와의 상호작용을 증강시킬 수 있거나, 또는 일부 실시양태에서 증강시킨다. 그러나, 5'-포스페이트 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 포스파타제 또는 다른 효소를 통해 분해되기 쉬울 수 있고, 이는 생체내에서 그들의 생체이용률을 제한할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이러한 분해에 대해 내성인 5' 포스페이트의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트, 비닐포스포네이트, 또는 말로닐포스포네이트일 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 가닥의 5' 말단은 천연 5'-포스페이트 기의 정전기적 및 입체적 성질을 모방하는 화학적 모이어티 ("포스페이트 모방체")에 부착된다 (예를 들어, Prakash et al. (2015), Nucleic Acids Res., Nucleic Acids Res. 2015 Mar 31; 43(6): 2993-3011 참고, 포스페이트 유사체에 관한 내용은 본원에 참고로 포함됨). 5' 말단에 부착될 수 있는 여러 포스페이트 모방체가 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,927,513 참고, 포스페이트 유사체에 관한 내용은 본원에 참고로 포함됨). 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 대한 다른 변형이 개발되었다 (예를 들어, WO 2011/133871 참고, 포스페이트 유사체에 관한 내용은 본원에 참고로 포함됨). 특정 실시양태에서, 히드록실 기는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 부착된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 당의 4'-탄소 위치에서 포스페이트 유사체 ("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)를 갖는다. 예를 들어, 2017년 9월 1일에 출원한 국제 특허 출원 PCT/US2017/049909, 2016년 9월 2일에 출원한, "4'-포스페이트 유사체 및 그를 포함하는 올리고뉴클레오티드"의 명칭을 갖는 미국 가출원 번호 62/383,207, 및 2016년 9월 12일에 출원한, "4'-포스페이트 유사체 및 그를 포함하는 올리고뉴클레오티드"의 명칭을 갖는 62/393,401을 참고하며, 포스페이트 유사체에 관한 이들 각각의 내용은 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에 4'-포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸 기의 산소 원자가 (예를 들어, 그의 4'-탄소에서) 당 모이어티에 결합되어 있는 옥시메틸포스포네이트 또는 그의 유사체이다. 다른 실시양태에서, 4'-포스페이트 유사체는 티오메틸 기의 황 원자 또는 아미노메틸 기의 질소 원자가 당 모이어티의 4'-탄소에 결합되어 있는 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트, 또는 그의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 4'-포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트이다. 일부 실시양태에서, 옥시메틸포스포네이트는 화학식 -O-CH2-PO(OH)2 또는 -O-CH2-PO(OR)2로 표현되며, 여기서 R은 H, CH3, 알킬 기, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3, 또는 보호기로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시양태에서, 알킬 기는 CH2CH3이다. 더욱 전형적으로, R은 H, CH3 또는 CH2CH3으로부터 독립적으로 선택된다.
c. 변형된 뉴클레오시드간 연결
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 변형 또는 치환은 적어도 1개의 (예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4 또는 적어도 5개) 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나는 1 내지 10개의 (예를 들어, 1 내지 10, 2 내지 8, 4 내지 6, 3 내지 10, 5 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3 또는 1 내지 2개) 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 포스포르아미다이트 연결, 포스포네이트 연결 또는 보라노포스페이트 연결일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
d. 염기 변형
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 핵염기 (본원에서 염기 유사체로도 지칭됨)는 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에서 연결된다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 질소성 염기이다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 20080274462를 참고한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 보편적 염기를 포함한다. 그러나, 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 핵염기를 함유하지 않는다 (무염기).
일부 실시양태에서, 보편적 염기는 변형된 뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에 또는 뉴클레오티드 당 모이어티 치환에서 동등한 위치에 위치하는 헤테로시클릭 모이어티이며, 이는 듀플렉스로 존재할 때 듀플렉스의 구조를 실질적으로 변경시키지 않고 1가지 유형 초과의 염기에 대향하여 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산에 대해 완전히 상보성인 기준 단일-가닥 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 비교하여, 보편적 염기를 함유하는 단일-가닥 핵산은 상보성 핵산과 함께 형성된 듀플렉스보다 낮은 Tm을 갖는, 표적 핵산과의 듀플렉스를 형성한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 보편적 염기가 단일 미스매치를 생성하도록 하는 염기로 대체된 기준 단일-가닥 핵산과 비교하여, 보편적 염기를 함유하는 단일-가닥 핵산은 미스매치된 염기를 포함하는 핵산과 함께 형성된 듀플렉스보다 높은 Tm을 갖는, 표적 핵산과의 듀플렉스를 형성한다.
보편적-결합 뉴클레오티드의 비제한적인 예에는 이노신, 1-β-D-리보푸라노실-5-니트로인돌, 및/또는 1-β-D-리보푸라노실-3-니트로피롤이 포함된다 (Quay 등의 미국 특허 출원 공개 번호 20070254362; Van Aerschot et al., An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 Nov 11;23(21):4363-70; Loakes et al., 3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. Nucleic Acids Res. 1995 Jul 11;23(13):2361-6; Loakes and Brown, 5-Nitroindole as an universal base analogue. Nucleic Acids Res. 1994 Oct 11;22(20):4039-43. 이들 각각은 염기 변형에 관한 그들의 개시내용에 대해 본원에 참고로 포함됨).
e. 가역적인 변형
표적 세포에 도달하기 전에 생체내 환경으로부터 올리고뉴클레오티드를 보호하기 위한 특정한 변형이 이루어질 수 있지만, 이는 올리고뉴클레오티드가 표적 세포의 시토졸에 도달하였을 때 그의 효능 또는 활성을 감소시킬 수 있다. 분자가 세포 밖에서 바람직한 성질을 보유하도록 하는 가역적인 변형이 이루어질 수 있고, 이는 세포의 시토졸 환경에 들어갈 때 제거된다. 가역적인 변형은 예를 들어 세포내 효소의 작용에 의해 또는 세포 내의 화학적 조건에 의해 (예를 들어, 세포내 글루타티온에 의한 감소를 통해) 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가역적으로 변형된 뉴클레오티드는 글루타티온-민감성 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 뉴클레오티드간 디포스페이트 연결에 의해 생성된 음의 전하를 차폐시키고, 세포 흡수 및 뉴클레아제 내성을 개선시키기 위해, 핵산 분자를 시클릭 디술피드 모이어티에 의해 화학적으로 변형시켰다. 트라베르사 테라퓨틱스, 인크.(Traversa Therapeutics, Inc.) ("Traversa")에게 원래 양도된 미국 공개 출원 번호 2011/0294869, 솔스티스 바이올로직스, 리미티드(Solstice Biologics, Ltd.) ("Solstice")에게 양도된 PCT 공개 번호 WO 2015/188197, [Meade et al., Nature Biotechnology, 2014,32:1256-1263] ("Meade"), 머크 샤프 앤 돔 코퍼레이션(Merck Sharp & Dohme Corp)에게 양도된 PCT 공개 번호 WO 2014/088920을 참고하며, 이들 각각은 이러한 변형에 관한 그들의 개시내용에 대해 참고로 포함된다. 뉴클레오티드간 디포스페이트 연결의 이러한 가역적인 변형은 시토졸의 환원 환경 (예를 들어 글루타티온)에 의해 세포 내에서 절단되도록 설계된다. 초기의 예에는 세포 내에서 절단가능한 것으로 보고된 포스포트리에스테르 변형을 중화시키는 것이 포함된다 (Dellinger et al. J. Am. Chem. Soc. 2003,125:940-950).
일부 실시양태에서, 이러한 가역적인 변형은 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 및 다른 혹독한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 노출되는 생체내 투여 (예를 들어, 혈액 및/또는 세포의 리소좀/엔도좀 구획을 통한 이동) 동안에 보호를 가능하게 한다. 글루타티온 수준이 세포외 공간에 비해 높은 세포의 시토졸로 방출될 때, 변형이 역전되고, 결과는 절단된 올리고뉴클레오티드이다. 가역적인 글루타티온 민감성 모이어티를 사용하면, 비가역적인 화학적 변형을 사용하여 이용가능한 옵션과 비교하여 입체적으로 더 큰 화학적 기를 관심 올리고뉴클레오티드에 도입시키는 것이 가능하다. 이는 이들 더 큰 화학적 기가 시토졸에서 제거될 것이고, 따라서 세포의 시토졸 내에서 올리고뉴클레오티드의 생물학적 활성을 방해하지 않아야 하기 때문이다. 결과적으로, 이들 더 큰 화학적 기는 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대해 다양한 이점, 예컨대 뉴클레아제 내성, 친유성, 전하, 열 안정성, 특이성, 및 감소된 면역원성을 부여하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티의 구조는 그의 방출 동역학을 변경시키도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 뉴클레오티드의 당에 부착된다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 변형된 뉴클레오티드의 당의 2'-탄소에 부착된다. 일부 실시양태에서, 특히 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드일 때, 글루타티온-민감성 모이어티는 당의 5'-탄소에 위치한다. 일부 실시양태에서, 특히 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오티드일 때, 글루타티온-민감성 모이어티는 당의 3'-탄소에 위치한다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 술포닐 기를 포함한다. 예를 들어, 2016년 8월 23일에 출원한 "가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도"의 명칭을 갖는 국제 특허 출원 PCT/US2017/048239 (국제 특허 공보 WO2018/039364로서 2018년 3월 1일에 공개됨)를 참고하며, 그의 관련 개시내용에 대한 내용은 본원에 참고로 포함된다.
v. 표적화 리간드
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드를 하나 이상의 세포 또는 하나 이상의 기관에 대해 표적화하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 전략은 다른 기관에서 바람직하지 않은 효과를 피하는데 도움이 될 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드로부터 이익을 얻지 않는 세포, 조직 또는 기관으로의 올리고뉴클레오티드의 과도한 손실을 피할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 특정한 조직, 세포 또는 기관의 표적화를 용이하게 하도록, 예를 들어 간으로 올리고뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하도록 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 간의 간세포로 올리고뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 표적화 리간드에 접합된 뉴클레오티드를 포함한다.
표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질의 일부 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편) 또는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 압타머이다. 예를 들어, 표적화 리간드는 종양 맥관구조 또는 신경교종 세포를 표적화하기 위해 사용되는 RGD 펩티드, 종양 맥관구조 또는 스토마를 표적화하기 위해 사용되는 CREKA 펩티드, CNS 맥관구조 상에서 발현된 트랜스페린 수용체를 표적화하기 위해 사용되는 트랜스페린, 락토페린 또는 압타머, 또는 신경교종 세포 상의 EGFR을 표적화하기 위해 사용되는 항-EGFR 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적화 리간드는 1개 이상의 GalNAc 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 1개 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개) 뉴클레오티드 각각은 별도의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 2 내지 4개 뉴클레오티드 각각은 별도의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드가 칫솔의 강모와 유사하고, 올리고뉴클레오티드가 칫솔과 유사하도록, 표적화 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 2 내지 4개 뉴클레오티드에 접합된다 (예를 들어, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 2 내지 4개 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합됨). 예를 들어 2016년 6월 23일에 공개된 국제 특허 출원 공보 WO 2016/100401 (관련 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 예를 들어 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에서 스템-루프를 포함할 수 있고, 스템의 루프의 1, 2, 3 또는 4개 뉴클레오티드는 표적화 리간드에 개별적으로 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, GYS2의 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오티드를 대상체의 간의 간세포에 대해 표적화시키는 것이 바람직하다. 임의의 적합한 간세포 표적화 모이어티가 이 목적을 위해 사용될 수 있다.
GalNAc는 간세포의 동모양 표면에서 주로 발현되고, 말단 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기를 함유하는 순환 당단백질 (아시알로당단백질)의 결합, 내재화 및 후속적인 제거에서 주요 역할을 하는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR)에 대한 고친화도 리간드이다. GalNAc 모이어티와 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 (간접적인 또는 직접적인) 접합은 이들 올리고뉴클레오티드를 이들 간세포 상에서 발현된 ASGPR에 대해 표적화하기 위해 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 1가 GalNAc에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 초과의 1가 GalNAc에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다 (즉, 2, 3 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 접합되고, 전형적으로 3 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 접합됨). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 2가 GalNAc, 3가 GalNAc, 또는 4가 GalNAc 모이어티에 접합된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 1개 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개) 뉴클레오티드 각각은 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 스템-루프의 루프 (L)의 2 내지 4개 뉴클레오티드 각각은 별도의 GalNAc에 접합된다. 일부 실시양태에서, GalNAc 모이어티가 칫솔의 강모와 유사하고, 올리고뉴클레오티드가 칫솔과 유사하도록, 표적화 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 2 내지 4개 뉴클레오티드에 접합된다 (예를 들어, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상에서 2 내지 4개 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합됨). 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에서 스템-루프를 포함하고, 스템의 루프의 1, 2, 3 또는 4개 뉴클레오티드는 GalNAc 모이어티에 개별적으로 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, GalNAc 모이어티는 센스 가닥의 뉴클레오티드에 접합된다. 예를 들어, 4개의 GalNAc 모이어티가 센스 가닥의 테트라루프에서 뉴클레오티드에 접합될 수 있고, 각각의 GalNAc 모이어티는 1개의 뉴클레오티드에 접합된다.
적절한 방법 또는 화학 (예를 들어, 클릭 화학)을 이용하여 표적화 리간드를 뉴클레오티드에 연결시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 클릭 링커를 이용하여 표적화 리간드를 뉴클레오티드에 접합시킨다. 일부 실시양태에서, 아세탈-기반 링커를 이용하여 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 뉴클레오티드에 표적화 리간드를 접합시킨다. 아세탈-기반 링커는 예를 들어 2016년 6월 23일에 출원한 국제 특허 출원 공개 번호 WO2016100401 A1에 개시되어 있으며, 이러한 링커에 관한 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 링커는 불안정한 링커이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 링커는 상당히 안정하다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스 연장부 (3, 4, 5 또는 6개 이하의 염기 쌍 길이)가 표적화 리간드 (예를 들어, GalNAc 모이어티)와 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 사이에 제공된다.
III. 제형
올리고뉴클레오티드 사용을 용이하게 하기 위해 다양한 제형이 개발되었다. 예를 들어, 분해를 최소화하거나, 전달 및/또는 흡수를 용이하게 하거나, 또는 제형에서 올리고뉴클레오티드에 대해 또 다른 유익한 성질을 제공하는 제형을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 대상체 또는 세포 환경으로 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, GYS2의 발현을 감소시키기 위해 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 단일-가닥 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 표적 세포의 직면한 환경으로 또는 전신으로 대상체에게 투여될 때 올리고뉴클레오티드의 충분한 부분이 세포에 들어가서 GYS2 발현을 감소시키도록 적합하게 제형화될 수 있다. 임의의 다양한 적합한 올리고뉴클레오티드 제형을 이용하여 본원에 개시된 바와 같이 GYS2의 감소를 위해 올리고뉴클레오티드를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 완충제 용액, 예컨대 인산염 완충된 식염수 용액, 리포좀, 미셀 구조체, 및 캡시드 중에서 제형화된다. 일부 실시양태에서, 네이키드 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합체는 물 또는 수성 용액 (예를 들어, pH 조정된 물) 중에서 제형화된다. 일부 실시양태에서, 네이키드 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합체는 염기성 완충된 수성 용액 (예를 들어, PBS) 중에서 제형화된다.
양이온성 지질을 갖는 올리고뉴클레오티드의 제형을 이용하여 올리고뉴클레오티드가 세포에 형질감염되는 것을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예컨대 리포펙션, 양이온성 글리세롤 유도체, 및 다가 양이온성 분자 (예를 들어, 폴리리신)를 이용할 수 있다. 적합한 지질에는 올리고펙타민, 리포펙타민 (라이프 테크놀로지즈(라이프 테크놀로지즈)), NC388 (리보자임 파마슈티컬즈, 인크.(Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.), 콜로라도주 볼더), 또는 퓨진(FuGene) 6 (로쉐(Roche))이 포함되고, 이들 모두는 제조자의 지침에 따라 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 제형은 지질 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 리포좀, 지질, 지질 복합체, 미세구, 미세입자, 나노구, 또는 나노입자를 포함하거나, 또는 그를 필요로 하는 대상체의 세포, 조직, 기관 또는 신체에 투여하기 위해 달리 제형화될 수 있다 (예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition, Pharmaceutical Press, 2013 참고).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제형은 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 조성물에게 활성 성분의 개선된 안정성, 개선된 흡수, 개선된 가용성 및/또는 치료적 증강을 부여한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 완충제 (예를 들어, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 트리스 염기, 또는 수산화나트륨) 또는 비히클 (예를 들어, 완충된 용액, 바셀린, 디메틸 술폭시드, 또는 광유)이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 그의 보관 수명을 연장시키기 위해 동결건조된 다음, 사용하기 (예를 들어, 대상체에게 투여하기) 전에 용액으로 만들어진다. 따라서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 조성물 중의 부형제는 동결건조보호제 (예를 들어, 만니톨, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 폴리비닐 피롤리돈), 또는 붕괴 온도 조정제 (예를 들어, 덱스트란, 피콜 또는 젤라틴)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 전형적으로, 투여 경로는 정맥내 또는 피하이다.
주사 용도에 적합한 제약 조성물은 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위해 멸균 수성 용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 또는 피하 투여의 경우, 적합한 담체에는 생리 식염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) EL.TM. (바스프(BASF), 뉴저지주 파시패니) 또는 인산염 완충된 식염수 (PBS)가 포함된다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 여러 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 멸균성 주사 용액은 선택된 용매 중에 필요한 양의 올리고뉴클레오티드를 필요에 따라 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 그들의 조합물과 함께 도입시킨 후에, 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 약 0.1%의 치료제 (예를 들어, GYS2 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드) 또는 그 초과를 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 총 조성물의 중량 또는 부피의 약 1% 내지 약 80% 또는 그 초과일 수 있다. 가용성, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자가 이러한 제약 제형의 제조에 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이고, 따라서 다양한 용량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
수많은 실시양태가 본원에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드의 간-표적화된 전달에 관한 것이지만, 다른 조직의 표적화 또한 고려된다.
IV. 사용 방법
i. 세포에서 GYS2 발현의 감소
일부 실시양태에서, 세포에서 GYS2의 발현을 감소시키기 위한 목적으로 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 유효량을 세포에 전달하는 방법이 제공된다. 본원에 제공된 방법은 임의의 적절한 세포 유형에서 유용하다. 일부 실시양태에서, 세포는 GYS2를 발현하는 임의의 세포 (예를 들어, 간의 세포, 예컨대 간세포 또는 지방 세포)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 수득되고 제한된 횟수의 계대를 겪을 수 있는 일차 세포이며, 따라서 세포는 그의 천연의 표현형 성질을 실질적으로 유지한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드가 전달되는 세포는 생체외 또는 시험관내에 있다 (즉, 배양물 중의 세포에 또는 세포가 존재하는 유기체에 전달될 수 있음). 구체적인 실시양태에서, 간세포에서 GYS2의 발현만을 또는 주로 그의 발현을 감소시키기 위한 목적으로 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 유효량을 세포에 전달하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액의 주사, 올리고뉴클레오티드로 피복된 입자의 충격, 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액에 세포 또는 유기체의 노출, 또는 올리고뉴클레오티드의 존재하에 세포 막의 전기천공을 비롯하여 적절한 핵산 전달 방법을 이용하여 도입될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하는 다른 적절한 방법, 예컨대 지질-매개된 담체 수송, 화학물질-매개된 수송, 및 양이온성 리포좀 형질감염, 예컨대 인산칼슘 등이 이용될 수 있다.
억제 결과는 세포 또는 대상체의 하나 이상의 성질을 평가하기 위한 적절한 검정에 의해, 또는 GYS2 발현을 나타내는 분자 (예를 들어, RNA, 단백질)를 평가하는 생화학적 기술에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드가 GYS2의 발현 수준을 감소시키는 정도는 GYS2의 발현 수준 (예를 들어, mRNA 또는 단백질 수준)을 적절한 대조군 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 전달되지 않거나 또는 음성 대조군이 전달된 세포 또는 세포 집단에서 GYS2 발현 수준)과 비교함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, GYS2 발현의 적절한 대조군 수준은 예정된 수준 또는 값일 수 있고, 따라서 대조군 수준을 매번 측정할 필요는 없다. 예정된 수준 또는 값은 다양한 형태를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 예정된 수준 또는 값은 단일 컷-오프 값, 예컨대 중간 또는 평균일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드의 투여는 세포에서 GYS2 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, GYS2 발현 수준에서의 감소는 GYS2의 적절한 대조군 수준과 비교하여 1% 이하, 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 또는 90% 이하로의 감소일 수 있다. 적절한 대조군 수준은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드와 접촉하지 않은 세포 또는 세포 집단에서의 GYS2 발현 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 세포로의 올리고뉴클레오티드의 전달 효과는 한정된 기간 후에 평가된다. 예를 들어, GYS2 수준은 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입한지 적어도 8 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간; 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 14 일 후에 세포에서 분석될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 세포에서 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 그의 센스 및 안티센스 가닥)를 발현하도록 조작된 트랜스진의 형태로 전달된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드를 발현하도록 조작된 트랜스진을 이용하여 전달된다. 트랜스진은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 우두 바이러스, 수두 바이러스, 아데노-연관된 바이러스 또는 단순 포진 바이러스) 또는 비-바이러스 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 합성 mRNA)를 이용하여 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 대상체에게 직접적으로 주사될 수 있다.
ii. 치료 방법
본 개시내용의 측면은 대상체에서 글리코겐 저장 질환의 치료를 위해 GYS2 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치료는 예를 들어 대상체에서 간비대, 간 독성 (예를 들어, 보다 높은 또는 감소된 수준의 AST, ALT 및/또는 ALP), 간 섬유증, 간에서 지방산 침착, 간 과형성, 간세포 선종, 및/또는 간세포 암종을 감소시키거나 또는 예방하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 치료는 또한 예를 들어 GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX로 이루어진 목록으로부터 선택된 글리코겐 저장 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 치료하거나 또는 예방하기 위해, 또는 이러한 글리코겐 저장 질환의 하나 이상의 증상을 치료하거나 또는 예방하기 위해 이용될 수 있다. 본 개시내용은 글리코겐 저장 질환 (예를 들어, GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX) 및/또는 글리코겐 저장 질환 (예를 들어, GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX)과 연관된 증상 또는 상태의 위험이 있는 (또는 그에 걸리기 쉬운) 대상체를 치료하는 예방적 및 치료적 방법 둘 다를 제공한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 치료제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 벡터 또는 트랜스진)를 투여함으로써 대상체에서 본원에 기재된 질환, 장애, 증상 또는 상태를 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 대상체는 예를 들어 간에서 GYS2 단백질 양의 감소로부터 치료적으로 이익을 얻을 것인 대상체이다.
본원에 기재된 방법은 전형적으로 대상체에게 올리고뉴클레오티드의 유효량, 즉, 바람직한 치료 결과를 생성할 수 있는 양을 투여하는 것을 수반한다. 치료적으로 허용가능한 양은 질환 또는 장애를 치료할 수 있는 양일 수 있다. 임의의 한 대상체에게 적절한 용량은 대상체의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여되는 특정한 조성물, 조성물 중의 활성 성분(들), 투여 시간 및 경로, 전반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯하여 특정 인자에 따라 좌우될 것이다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나를 장내로 (예를 들어, 경구로, 위 공급관에 의해, 십이지장 공급관에 의해, 위루형성술을 통해 또는 직장으로), 비경구로 (예를 들어, 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입, 동맥내 주사 또는 주입, 근육내 주사), 국소적으로 (예를 들어, 표피, 흡입, 점안제를 통해 또는 점막을 통해), 또는 표적 기관 (예를 들어, 대상체의 간)으로 직접 주사에 의해 투여한다. 전형적으로, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드를 정맥내로 또는 피하로 투여한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 0.1 mg/kg 내지 25 mg/kg (예를 들어, 1 mg/kg 내지 5 mg/kg) 범위의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 0.1 mg/kg 내지 5 mg/kg 범위의 또는 0.5 mg/kg 내지 5 mg/kg 범위의 용량으로 투여된다.
비제한적인 세트의 예로서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 연 1회, 연 2회, 분기별로 (3 개월마다 한번), 격월로 (2 개월마다 한번), 매달 또는 매주 투여될 것이다.
일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 대상체는 인간 (예를 들어, 인간 환자) 또는 비-인간 영장류 또는 다른 포유류 대상체이다. 다른 예시적인 대상체에는 길들여진 동물, 예컨대 개 및 고양이; 가축, 예컨대 말, 소, 돼지, 양, 염소 및 닭; 및 동물, 예컨대 마우스, 래트, 기니피그 및 햄스터가 포함된다.
실시예
실시예 1: 인간 및 마우스 세포-기반 검정을 이용하는 GYS2 올리고뉴클레오티드 억제제의 개발
GYS2 발현의 억제를 위한 후보 올리고뉴클레오티드를 개발하기 위해 인간 및 마우스-기반 검정을 이용하였다. 먼저, 컴퓨터-기반 알고리즘을 이용하여 GYS2 억제에 대한 후보 올리고뉴클레오티드 서열 (25-27량체)을 생성하였다. 이어서, GYS2 발현을 감소시키는 그들의 능력에 대해 후보 올리고뉴클레오티드를 평가하기 위해 세포-기반 검정 및 PCR 검정을 이용하였다.
컴퓨터-기반 알고리즘은 인간 GYS2 mRNA (서열식별번호: 609, 표 1)에 대해 상보성인 올리고뉴클레오티드를 제공하였고, 특정 서열은 레서스 마카크 GYS2 mRNA (서열식별번호: 610, 표 1)에 대해서도 상보성이었다.
표 1. 인간 및 레서스 마카크 GYS2 mRNA의 서열
알고리즘에 의해 제공된 올리고뉴클레오티드 중에서 264개의 올리고뉴클레오티드를 HEK-293 세포-기반 검정에서 실험 평가를 위한 후보로서 선택하였다. 이 검정에서, GYS2를 안정하게 발현하는 HEK-293 인간 배아 신장 세포 (HEK-GYS2 세포로 지칭됨)를 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 이후 소정 시간 동안 유지시킨 다음, 탁맨(TAQMAN)®-기반 qPCR 검정을 이용하여 남아있는 GYS2 mRNA의 수준을 조사하였다. 2가지 qPCR 검정, 3' 검정 및 5' 검정을 이용하여 각각 HEX 및 FAM 프로브에 의해 측정되는 mRNA 수준을 결정하였다. 264개의 올리고뉴클레오티드에 의한 HEK-293 세포-기반 검정의 결과가 도 1a 및 1b에 도시된다. 남아있는 % mRNA가 3' 검정 (원 형태) 및 5' 검정 (다이아몬드 형태) 각각에 대해 도시된다. 음성 대조군과 비교하여 가장 낮은 %의 mRNA가 남게하는 올리고뉴클레오티드는 히트로 고려되었다. 인간 게놈에 대해 낮은 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 음성 대조군으로 사용하였다.
이들 올리고뉴클레오티드의 활성 및 위치를 기반으로 하여, 인간 GYS2 mRNA 상에서의 핫스팟을 정의하였다. 핫스팟은 대조군과 비교하여 검정에서 35% 이하의 mRNA 수준을 초래하는 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드와 연관된 인간 GYS2 mRNA 서열 상의 스트레치로서 확인되었다. 따라서, 인간 GYS2 mRNA 서열 내에서 하기 핫스팟이 확인되었다: 579-618, 691-738, 1089-1125, 1175-1211, 1431-1486, 2341-2383, 2497-2543, 2660-2698, 2808-2851 및 3014-3050.
핫스팟의 서열이 표 2에 요약된다.
표 2. 핫스팟의 서열
용량 반응 분석
초기 HEK-293 세포-기반 검정에서 평가한 264개의 올리고뉴클레오티드 중에서 71개의 특히 활성인 올리고뉴클레오티드가 GYS2 수준을 녹다운시키는 그들의 능력을 기반으로 하여 히트로 선택되었고, 이차 스크리닝에 적용되었다.
이 이차 스크리닝에서, 2가지 또는 3가지 상이한 농도 (1 nM, 0.1 nM 및 0.03 nM)를 제외하고는 일차 스크리닝과 동일한 검정을 이용하여 후보 올리고뉴클레오티드를 시험하였다 (도 2a 및 2b). 일반적으로, 표적 mRNA 수준을 스플라이싱 인자인 아르기닌/세린-풍부 9 (SFRS9) (샘플에 걸쳐 안정한 발현 기준을 제공하는 하우스킵핑 유전자)를 기반으로 하여 정규화하여, 도 2a 및 2b에 도시된 % mRNA를 생성하였다. 도 2a 및 2b 각각에서 시험한 올리고뉴클레오티드는 음성 대조군 서열 (NC1) 및 모의 형질감염과 비교하여 도시된다. 71개의 모든 올리고뉴클레오티드는 M1로 지정된 동일한 변형 패턴을 가졌고, 이는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 및 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유한다. 시험한 71개의 올리고뉴클레오티드의 서열은 표 3에 제공된다.
표 3. HEK-293 세포-기반 검정에 대한 후보 올리고뉴클레오티드 서열
Hs: 인간 및 Rm: 레서스 마카크; 센스 및 안티센스 서열식별번호 컬럼은 각각의 올리고뉴클레오티드를 만들기 위해 혼성화하는 센스 가닥 및 각각의 안티센스 가닥을 상대적인 순서로 제공한다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 센스 가닥은 서열식별번호: 193의 안티센스 가닥과 혼성화한다.
이 단계에서, 시험으로부터 가장 강한 서열 중 36개를 추가 분석을 위해 선택하였다. 선택된 서열을 닉킹된 테트라루프 구조 포맷 (36량체 패신저 가닥과 22량체 가이드 가닥)으로 전환시켰다. 일반적인 테트라루프 구조에 대해서는 도 3을 참고한다. 이어서, 이들 올리고뉴클레오티드를 이전과 같이 시험하였고, HepG2 세포에서 GYS2 mRNA 발현을 감소시키는 그의 능력에 대해 3가지 농도에서 각각의 올리고뉴클레오티드를 평가하였다.
도 4는 각각이 1가지 또는 2가지 상이한 변형 패턴에 대해 적합화된, 닉킹된 테트라루프 구조를 갖는 상이한 염기 서열로부터 제조된 올리고뉴클레오티드에 대한 데이터를 도시한다. X-축은 평가된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화된 센스 가닥의 3' 말단을 나열한다. 표적 mRNA 수준을 상기 기재된 바와 같이 정규화하여, 도 4에 도시된 % mRNA를 생성하였고, 시험한 올리고뉴클레오티드는 음성 대조군 서열 (NC1) 및 모의 형질감염과 비교하여 도시된다.
특정한 테트라루프-변형된 올리고뉴클레오티드를 0.1 μM, 0.3 μM 및 1.0 μM의 각각의 화합물 (도 5)에 대해 동일한 변형 패턴을 이용하여 원숭이 간세포에서 추가로 시험하였다. 도 5에서 시험한 올리고뉴클레오티드는 형질감염되지 않은 세포와 비교하여 도시된다. 각각의 화합물에 대해 최대 억제 농도의 절반 (IC50)을 결정하기 위해 특정한 올리고뉴클레오티드를 HEK-293 세포에서 전체 용량 반응 곡선을 이용하여 추가로 시험하였다 (도 6a 및 6b 참고).
생체내 뮤린 스크리닝
상기 시험관내 실험으로부터의 데이터를 평가하여, 마우스 간세포에서 GYS2 발현의 감소를 위해 활성을 유지하면서 전달 성질을 개선시키는 테트라루프 및 변형 패턴을 확인하였다. 이어서, 이 분석을 기반으로 하여, 선택된 올리고뉴클레오티드를 GalNAc 모이어티에 접합시켰다. 4개의 GalNAc 모이어티를 센스 가닥의 테트라루프에 있는 뉴클레오티드에 접합시켰다. 클릭 링커를 이용하여 접합을 수행하였다. 사용된 GalNAc는 하기에 도시된 것와 같았다:
닉킹된 테트라루프 구조를 갖는 상이한 변형 패턴을 가진, 18가지 상이한 염기 서열로부터 총 65가지의 강한 GalNAc-접합된 GYS2 올리고뉴클레오티드를 시험하였다. 선택된 GYS2 올리고뉴클레오티드 서열은 인간 및 원숭이 mRNA 서열에 대해 활성이었지만, 마우스 Gys2에 대해서는 아니었다. 0.5-5 mg/kg의 인간 GYS2 발현 플라스미드의 유체역학적 주입에 의해 인간 GYS2 mRNA를 일시적으로 발현하는 CD-1 마우스에게 GYS2 올리고뉴클레오티드를 피하 투여하였다. 마우스를 투여후 4 일째에 안락사시켰다. 간 샘플을 수득하였고, RNA를 추출하여 RT-qPCR에 의해 GYS2 mRNA 수준을 평가하였다. PBS 대조군 mRNA와 비교한 % GYS2 mRNA를 이들 측정을 기반으로 하여 결정하였다.
시험한 65가지 접합체로부터, 8가지의 가장 강한 염기 서열을 확인하였고, 이들 각각을 인간 GYS2 mRNA를 일시적으로 발현하는 CD-1 마우스에게 0.5 mg/kg으로 피하 주사함으로써 동일한 변형 패턴으로 시험하였다. 마우스를 투여후 4 일째에 안락사시켰다. 간 샘플을 수득하였고, RNA를 추출하여 RT-qPCR에 의해 GYS2 mRNA 수준을 평가하였다. PBS 대조군 mRNA과 비교한 % GYS2 mRNA를 이들 측정을 기반으로 하여 결정하였고, 도 7에 도시된다.
재료 및 방법
형질감염
첫번째 스크리닝의 경우, 효율적인 형질감염을 위해 리포펙타민 RNAiMAX™를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 복합체화하였다. 올리고뉴클레오티드, RNAiMAX 및 Opti-MEM을 실온에서 20 분 동안 함께 인큐베이션한 다음, 형질감염 이전에 웰당 50 μL의 이 혼합물을 플레이트에 첨가하였다. 활성적으로 계대중인 세포의 플라스크로부터 배지를 흡인시켰고, 세포를 37℃에서 트립신의 존재하에 3-5 분 동안 인큐베이션하였다. 세포가 플라스크에 더 이상 부착되지 않은 후에, 세포 성장 배지 (페니실린 및 스트렙토마이신이 결여됨)를 첨가하여 트립신을 중화시키고, 세포를 현탁시켰다. 10 μL 분취량을 제거하고, 혈구계를 사용하여 카운팅하여, 밀리리터당 기준으로 세포를 정량화하였다. 세포의 경우, 배지 (예를 들어, 100 μL의 배지) 중에서 웰당 10,000 내지 25,000개 세포/웰을 시딩하였다. Opti-MEM 중 올리고뉴클레오티드를 이미 함유한 96-웰 형질감염 플레이트에 희석된 세포 현탁액을 첨가하였다. 이어서, 형질감염 플레이트를 24 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 24 시간 인큐베이션 후에, 배지를 각각의 웰로부터 흡인시켰다. 프로메가(Promega) RNA 단리 키트로부터 용해 완충제를 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해 완충제를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 용해된 세포를 RNA 단리를 위해 코르벳 엑스트랙터진(Corbett XtractorGENE) (퀴아엑스트랙터(QIAxtractor))으로 옮기거나 또는 -80℃에서 보관하였다.
후속적인 스크리닝 및 실험, 예를 들어 이차 스크리닝의 경우, 역 형질감염을 위해 리포펙타민 RNAiMAx를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 복합체화시켰다. RNAiMAX 및 siRNA를 OptiMEM 배지 중에서 15 분 동안 혼합함으로써 복합체를 제조하였다. 형질감염 혼합물을 다중-웰 플레이트로 옮기고, 세포 현탁액을 웰에 첨가하였다. 24 시간 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 프로메가 SV96 키트로부터 용해 완충제를 사용하여 용해시켰다. 진공 매니폴드에서 SV96 플레이트를 사용하여 RNA를 정제하였다. 이어서, 4 마이크로리터의 정제된 RNA를 65℃에서 5 분 동안 가열하고, 4℃로 냉각시켰다. 이어서, 10 마이크로리터 반응으로 고용량 역전사 키트 (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))를 사용하는 역전사를 위해 RNA를 사용하였다. 이어서, cDNA를 뉴클레아제 무함유 물에 의해 50 μL로 희석하였고, 멀티플렉스 5'-엔도뉴클레아제 검정 및 쏘패스트(SSoFast) qPCR 마스터믹스 (바이오-라드 래버러토리즈(Bio-Rad laboratories))에 의한 정량적 PCR을 위해 사용하였다.
cDNA 합성
코르벳 엑스트랙터 진™ (퀴아엑스트랙터)을 사용하여 조직 배양물 중에서 포유류 세포로부터 RNA를 단리하였다. 변형된 수퍼스크립트(SuperScript) II 프로토콜을 이용하여 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 단리된 RNA (대략 5 ng/μL)를 5 분 동안 65℃로 가열하였고, dNP, 무작위 육량체, 올리고 dT 및 물과 함께 인큐베이션하였다. 혼합물을 15 초 동안 냉각시켰다. 물, 5X 제1 가닥 완충제, DTT, 수퍼레이즈ㆍ인(SUPERaseㆍIn)™ (RNA 억제제), 및 수퍼스크립트 II RTase로 이루어진 "효소 혼합물"을 혼합물에 첨가하였다. 써모사이클러를 이용하여 내용물을 1 시간 동안 42℃로 가열한 다음, 15 분 동안 70℃로 가열한 다음, 4℃로 냉각시켰다. 이어서, 생성된 cDNA를 SYBR®-기반 qPCR에 적용하였다. 반응당 2가지 5' 엔도뉴클레아제 검정을 함유하는 qPCR 반응을 멀티플렉싱하였다.
qPCR 검정
SYBR ®-기반 qPCR을 이용하여 프라이머 세트를 초기에 스크리닝하였다. 검정 특이성은 용융 곡선 뿐만 아니라 "마이너스 RT" 대조군을 평가함으로써 검증되었다. HeLa 및 Hepa1-6 세포로부터의 cDNA 주형의 희석액 (반응당 20 ng에서 0.02 ng까지 10배 계열 희석)을 이용하여 각각 인간 (Hs) 및 마우스 (Mm) 검정을 시험하였다. qPCR 검정을 384-웰 플레이트에서 설정하고, 마이크로앰프(MicroAmp) 필름으로 덮고, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터의 7900HT 상에서 작동시켰다. 시약 농도 및 사이클링 조건은 다음을 포함하였다: 2X SYBR 혼합물, 10 μM 정방향 프라이머, 10 μM 역방향 프라이머, DD H2O, 및 cDNA 주형, 10 μL의 총 부피까지.
클로닝
단일 용융-곡선을 제시하는 PCR 앰플리콘을 제조자의 지침에 따라 프로메가로부터의 pGEM ®-T 이지(Easy) 벡터 키트에 라이게이션하였다. 제조자의 프로토콜에 따라, JM109 고효율 세포를 새로 라이게이션된 벡터로 형질전환시켰다. 이어서, 세포를 앰피실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고, 콜로니 성장을 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
PCR 스크리닝 및 플라스미드 미니-프렙
PCR을 이용하여 라이게이션된 관심 앰플리콘을 함유하는 벡터로 형질전환된 이. 콜라이(E. coli)의 콜로니를 확인하였다. 삽입체를 플랭킹하는 벡터-특이적인 프라이머를 PCR 반응에서 사용하였다. 이어서, 모든 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 작동시키고, 염색한 후에 투과조명기에 의해 영상화하였다. 겔을 정성적으로 평가하여, 예상된 크기의 라이게이션된 앰플리콘 (대략 300 bp, 사용된 프라이머에 대해 특이적인 앰플리콘 및 플랭킹 벡터 서열 포함)을 함유하는 것으로 보이는 플라스미드를 결정하였다.
PCR 스크리닝에 의해 확인된 형질전환체인 콜로니를 37℃에서 진탕시키면서 앰피실린과 함께 2 mL LB 브로쓰로 이루어진 배양물에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 이. 콜라이 세포를 용해시키고, 관심 플라스미드를 프로메가의 미니-프렙(Mini-Prep) 키트를 사용하여 단리하였다. 플라스미드 농도는 260 nm에서 UV 흡광도에 의해 측정하였다.
플라스미드 시퀀싱 및 정량화
정제된 플라스미드를 빅다이 터미네이터(BigDye® Terminator) 시퀀싱 키트를 사용하여 시퀀싱하였다. 벡터-특이적인 프라이머, T7을 사용하여 삽입체에 걸쳐 이어지는 판독 길이를 제공하였다. 시퀀싱 반응에 하기 시약을 사용하였다: 물, 5X 시퀀싱 완충제, 빅다이 터미네이터 혼합물, T7 프라이머, 및 플라스미드 (100 ng/μL), 10 μL의 부피까지. 혼합물을 96℃에서 1 분 동안 유지시킨 다음, 96℃에서 10 초 동안, 50℃에서 5 초 동안, 60℃에서 1 분 15 초 동안의 15회 사이클; 96℃에서 10 초 동안, 50℃에서 5 초 동안, 60℃에서 1 분 30 초 동안의 5회 사이클; 및 96℃에서 10 초 동안, 50℃에서 5 초 동안, 및 60℃에서 2 분 동안의 5회 사이클에 적용하였다. 이어서, 어플라이드 바이오시스템즈의 모세관 전기영동 시퀀서를 사용하여 염료 종결 반응을 시퀀싱하였다.
이어서, 서열-검증된 플라스미드를 정량화하였다. 이들을 단일 절단 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화하였다. 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 선형성을 확인하였다. 모든 플라스미드 희석액을 mL 완충제당 100 μg의 tRNA와 함께 TE 완충제 (pH 7.5) 중에서 제조하여, 폴리프로필렌 바이알에 대한 플라스미드의 비특이적인 결합을 감소시켰다.
이어서, 선형화된 플라스미드를 μL당 1,000,000 내지 01 카피로 계열 희석하고, qPCR에 적용하였다. 검정 효율을 계산하였고, 효율이 90-110%의 범위인 경우에는 검정이 허용가능한 것으로 고려되었다.
멀티플렉싱 검정
각각의 표적에 대해, 2가지 5' 뉴클레아제 검정에 의해 mRNA 수준을 정량화하였다. 일반적으로, 몇몇 검정을 각각의 표적에 대해 스크리닝한다. 선택된 2가지 검정은 양호한 효율, 낮은 검출 한계, 및 관심 유전자 (GOI)의 넓은 5'->3' 범위의 조합을 제시하였다. 상이한 형광단이 각각의 프로브에 대해 사용될 때, 하나의 GOI에 대한 두 검정 모두 하나의 반응으로 조합될 수 있었다. 따라서, 검정 검증에서 최종 단계는, 선택된 검정이 동일한 qPCR에서 조합되거나 또는 "멀티플렉싱"될 때 이들의 효율을 결정하는 것이었다.
10배 희석액으로 두 검정 모두에 대해 선형화된 플라스미드를 조합하였고, qPCR을 수행하였다. 각각의 검정 효율을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 허용 효율은 90-110%이었다.
선형화된 플라스미드 표준을 이용하여 멀티플렉싱된 반응을 검증하면서, 주형으로서 cDNA를 사용하여 관심 표적에 대한 Cq 값 또한 평가하였다. 인간 또는 마우스 표적의 경우, HeLa 및 Hepa1-6 cDNA를 각각 사용하였다. 이 경우에, cDNA는 형질감염되지 않은 세포로부터 코르벳 (물 중 ~5 ng/μl) 상에서 단리된 RNA로부터 유래되었다. 이러한 방식으로, 이 샘플 cDNA로부터 관찰된 Cq 값은 96-웰 플레이트 형질감염으로부터 예상된 Cq 값을 대표하였다. Cq 값이 30 초과인 경우에, 관심 유전자의 보다 높은 발현 수준을 나타내는 다른 세포주를 찾았다. 각각의 인간 및 마우스 세포주로부터 코르벳 상에서 고처리량 방법을 통해 단리된 총 RNA의 라이브러리를 생성하였고, 표적 발현의 허용가능한 수준에 대해 스크리닝하기 위해 사용하였다.
올리고뉴클레오티드 명명법에 대한 설명
본원에 기재된 모든 올리고뉴클레오티드는 SN1-ASN2-MN3으로 지칭된다. 하기 명칭이 적용된다:
ㆍ N1: 센스 가닥 서열의 서열 식별 번호
ㆍ N2: 안티센스 가닥 서열의 서열 식별 번호
ㆍ N3: 변형 패턴의 참고 번호, 각각의 번호는 올리고뉴클레오티드에서 변형된 뉴클레오티드의 패턴을 나타냄.
예를 들어, S27-AS219-M1은 서열식별번호: 27에 제시된 센스 서열, 서열식별번호: 219에 제시된 안티센스 서열을 갖고, M1로서 확인된 변형 패턴에 대해 적합화된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
표 4. GYS2 RNAi 올리고뉴클레오티드
본원에 예시적으로 기재된 본 개시내용은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각각의 예에서, 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진" 및 "로 이루어진"은 다른 두 용어와 교체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 기재의 측면에서 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 도시되고 기재된 특징 또는 그의 일부의 임의의 등가물을 제외하려는 의도는 없으며, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 임의적인 특징, 변형 및 변동이 관련 기술분야의 기술자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변동이 상기 기재 및 첨부된 청구항에 의해 한정되는 본 발명의 범위 내에서 고려된다는 것을 이해해야 한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠시(Markush) 그룹 또는 대안적인 다른 그룹에 관하여 기재되는 경우, 관련 기술분야의 기술자는 본 발명이 또한 마쿠시 그룹 또는 다른 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 하위 그룹에 관하여 기재됨을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 서열 목록에 제시된 서열이 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산의 구조를 기재하는데 있어서 지칭될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 실시양태에서, 실제 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산은, 명시된 서열과 본질적으로 동일하거나 유사한 상보성을 유지하면서, 명시된 서열과 비교하여 1개 이상의 대안적인 뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 뉴클레오티드의 RNA 대응물 또는 RNA 뉴클레오티드의 DNA 대응물) 및/또는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결 및/또는 1개 이상의 다른 변형을 가질 수 있다.
본 발명의 기재하는 문맥에서 (특히 하기 청구항의 문맥에서) 단수 용어 및 유사한 지시대상의 사용은 본원에서 달리 지시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 파악되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)"은 달리 언급되지 않는다면 개방형 용어로서 파악되어야 한다 (즉, "포함하나 이에 제한되지 않음"을 의미함). 본원에서 값의 범위의 기재는 단지 본원에서 달리 지시되지 않는다면 상기 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 작용하기 위해 단지 의도되는 것이고, 각각의 별개의 값은 본원에 개별적으로 인용된 것과 같이 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예시 또는 예시적인 표현 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해 의도된 것이고, 달리 청구되지 않는다면 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떠한 표현도 본 발명의 실시에서 필수적인 것으로 청구되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 파악되어서는 안된다.
본 발명의 실시양태가 본원에 기재된다. 이들 실시양태의 변동은 상기 기재를 읽은 후에 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 수 있다.
본 발명자들은 숙련가들이 이러한 변동을 적절하게 이용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명자들은 적용가능한 법률에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 청구항에 인용된 대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 그의 모든 가능한 변동에서 상기 기재된 요소들의 임의의 조합은 본원에서 달리 지시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면 본 발명에 포괄된다. 관련 기술분야의 기술자들은 일상적인 실험만으로도 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 여러 등가물을 인식할 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구항에 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Dicerna Pharmaceuticals, Inc.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING GYS2 EXPRESSION
<130> D0800.70014WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> 62/637,574
<151> 2018-03-02
<160> 627
<170> PatentIn version 3.5
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gccaaugaua ugcugauauu uggat 25
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ccaaugauau gcugauauuu ggatc 25
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aaugauaugc ugauauuugg auctt 25
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augauaugcu gauauuugga ucutt 25
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ugauaugcug auauuuggau cuuta 25
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augcugauau uuggaucuuu aactg 25
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ucuuuaacug ccugguucuu aaaag 25
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uuuaacugcc ugguucuuaa aagag 25
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uuccaugaau ggcaggcugg aautg 25
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ggaaacuucc uauugccaca auatt 25
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gguaucucug ugcagcaaau auuga 25
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uaucucugug cagcaaauau ugatt 25
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cucugugcag caaauauuga uuuct 25
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ucugugcagc aaauauugau uucta 25
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cugugcagca aauauugauu ucuac 25
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ugugcagcaa auauugauuu cuaca 25
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gugcagcaaa uauugauuuc uacaa 25
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ugcagcaaau auugauuucu acaac 25
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gcagcaaaua uugauuucua caacc 25
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cagcaaauau ugauuucuac aacca 25
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agcaaauauu gauuucuaca accat 25
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gcaaauauug auuucuacaa ccatc 25
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auauugauuu cuacaaccau cuuga 25
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uugauuucua caaccaucuu gauaa 25
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gauuucuaca accaucuuga uaagt 25
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auuucuacaa ccaucuugau aagtt 25
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uucuacaacc aucuugauaa guuta 25
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cuacaaccau cuugauaagu uuaac 25
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uacaaccauc uugauaaguu uaaca 25
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acaaccaucu ugauaaguuu aacat 25
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accaucuuga uaaguuuaac auuga 25
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ccaucuugau aaguuuaaca uugac 25
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caucuugaua aguuuaacau ugaca 25
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guucaccacg guuucugaaa uaaca 25
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caccacgguu ucugaaauaa cagca 25
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ccacgguuuc ugaaauaaca gcaat 25
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cacgguuucu gaaauaacag caata 25
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gguuucugaa auaacagcaa uagaa 25
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guuucugaaa uaacagcaau agaag 25
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cugaaauaac agcaauagaa gcuga 25
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aagagaaagc cugauguagu uactc 25
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gcuugaaugu uaagaaauuu ucagc 25
<210> 82
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 82
cuugaauguu aagaaauuuu cagca 25
<210> 83
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 83
uugaauguua agaaauuuuc agcag 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 84
ugaauguuaa gaaauuuuca gcagt 25
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 85
gaauguuaag aaauuuucag cagtg 25
<210> 86
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 86
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 87
agaaauuuuc agcagugcau gagtt 25
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 88
agcagugcau gaguuucaaa aucta 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 89
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 90
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 91
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 92
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<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 93
cgaggucauu ucuaugguca ucucg 25
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 94
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 95
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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gucauuucua uggucaucuc gactt 25
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<220>
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<400> 98
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 99
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 100
aaagacuuug uuccuuuuca uugct 25
<210> 101
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 101
cugaggaugc auaaaaguga cauca 25
<210> 102
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 102
gaggaugcau aaaagugaca ucaca 25
<210> 103
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 103
uuuuucauua ugccugccaa gacaa 25
<210> 104
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 104
ucauuaugcc ugccaagaca aauaa 25
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 105
cauuaugccu gccaagacaa auaat 25
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 106
auuaugccug ccaagacaaa uaatt 25
<210> 107
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 107
augccugcca agacaaauaa uuuca 25
<210> 108
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 108
aauuucaacg uggaaacccu gaaag 25
<210> 109
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 109
auuucaacgu ggaaacccug aaagg 25
<210> 110
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 110
uuucaacgug gaaacccuga aagga 25
<210> 111
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 111
uucaacgugg aaacccugaa aggac 25
<210> 112
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 112
ucaacgugga aacccugaaa ggaca 25
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 113
uugcacauuc ugugaaggaa aagtt 25
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 114
ugcacauucu gugaaggaaa agutt 25
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 115
gcacauucug ugaaggaaaa guutg 25
<210> 116
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 116
auucugugaa ggaaaaguuu ggaaa 25
<210> 117
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 117
gugaaggaaa aguuuggaaa aaaac 25
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 118
gaaaaaaacu cuaugaugca uuatt 25
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 119
aaaaaaacuc uaugaugcau uauta 25
<210> 120
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 120
aaaaaacucu augaugcauu auuaa 25
<210> 121
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 121
aaaaacucua ugaugcauua uuaag 25
<210> 122
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 122
uuauuaagag gagaaauucc ugacc 25
<210> 123
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 123
uauuaagagg agaaauuccu gacct 25
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 124
auuaagagga gaaauuccug acctg 25
<210> 125
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 125
uuaagaggag aaauuccuga ccuga 25
<210> 126
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 126
uaagaggaga aauuccugac cugaa 25
<210> 127
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 127
aagaggagaa auuccugacc ugaac 25
<210> 128
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 128
cgagaugauc uaacaauuau gaaaa 25
<210> 129
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 129
agaugaucua acaauuauga aaaga 25
<210> 130
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 130
gaugaucuaa caauuaugaa aagag 25
<210> 131
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 131
augaucuaac aauuaugaaa agagc 25
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 132
acaauuauga aaagagccau cuutt 25
<210> 133
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 133
gaaaagagcc aucuuuucaa cucag 25
<210> 134
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 134
cccauccuca gcaccauuag acgga 25
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 135
ccauccucag caccauuaga cggat 25
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 136
cauccucagc accauuagac ggatt 25
<210> 137
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 137
auccucagca ccauuagacg gautg 25
<210> 138
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 138
uccucagcac cauuagacgg auugg 25
<210> 139
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 139
cccauggacu augaagaguu uguta 25
<210> 140
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 140
ccauggacua ugaagaguuu guuag 25
<210> 141
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 141
cuuggaguau uuccaucaua cuatg 25
<210> 142
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 142
uggaguauuu ccaucauacu augaa 25
<210> 143
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 143
ggaguauuuc caucauacua ugaac 25
<210> 144
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 144
gaguauuucc aucauacuau gaacc 25
<210> 145
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 145
uauuuccauc auacuaugaa ccctg 25
<210> 146
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 146
auacuccagc ugaaugcacu gugat 25
<210> 147
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 147
ggcagauauu accagcaugc cagac 25
<210> 148
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 148
gcagauauua ccagcaugcc agaca 25
<210> 149
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 149
cagauauuac cagcaugcca gacac 25
<210> 150
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 150
agauauuacc agcaugccag acacc 25
<210> 151
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 151
gauauuacca gcaugccaga cacct 25
<210> 152
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 152
auauuaccag caugccagac acctg 25
<210> 153
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 153
uauuaccagc augccagaca ccuga 25
<210> 154
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 154
auuaccagca ugccagacac cugac 25
<210> 155
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 155
uuaccagcau gccagacacc ugaca 25
<210> 156
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 156
uaccagcaug ccagacaccu gacat 25
<210> 157
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 157
accagcaugc cagacaccug acatt 25
<210> 158
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 158
ccagcaugcc agacaccuga cauta 25
<210> 159
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 159
cagcaugcca gacaccugac auuaa 25
<210> 160
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 160
agcaugccag acaccugaca uuaag 25
<210> 161
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 161
gcaugccaga caccugacau uaagc 25
<210> 162
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 162
ugccagacac cugacauuaa gcaga 25
<210> 163
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 163
ccugacauua agcagagcuu uucca 25
<210> 164
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 164
aagcagagcu uuuccagaua aautc 25
<210> 165
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 165
gcagagcuuu uccagauaaa uucca 25
<210> 166
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 166
ccagauaaau uccaugugga acuaa 25
<210> 167
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 167
cagauaaauu ccauguggaa cuaac 25
<210> 168
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 168
uccucaguac caccuucucc uucag 25
<210> 169
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 169
ccucaguacc accuucuccu ucagg 25
<210> 170
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 170
gaaagggauc gguuaaauau caagt 25
<210> 171
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 171
agggaucggu uaaauaucaa gucac 25
<210> 172
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 172
aucgguuaaa uaucaaguca ccatt 25
<210> 173
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 173
gguuaaauau caagucacca uuutc 25
<210> 174
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 174
guuaaauauc aagucaccau uuuca 25
<210> 175
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 175
aaauaucaag ucaccauuuu cactg 25
<210> 176
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 176
aagaaaaagc ugcaugguga auata 25
<210> 177
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 177
agaaaaagcu gcauggugaa uauaa 25
<210> 178
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 178
aaaaagcugc auggugaaua uaaga 25
<210> 179
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 179
aaaagcugca uggugaauau aagaa 25
<210> 180
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 180
aagcugcaug gugaauauaa gaact 25
<210> 181
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 181
gcugcauggu gaauauaaga acuga 25
<210> 182
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 182
cugcauggug aauauaagaa cugaa 25
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 183
gcauggugaa uauaagaacu gaatt 25
<210> 184
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 184
cauggugaau auaagaacug aautc 25
<210> 185
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 185
auggugaaua uaagaacuga auuct 25
<210> 186
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 186
uggugaauau aagaacugaa uucta 25
<210> 187
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 187
ggugaauaua agaacugaau ucuac 25
<210> 188
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 188
gugaauauaa gaacugaauu cuaca 25
<210> 189
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 189
aauauaagaa cugaauucua caugt 25
<210> 190
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 190
auauaagaac ugaauucuac augtg 25
<210> 191
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 191
auaagaacug aauucuacau gugct 25
<210> 192
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 192
aagaacugaa uucuacaugu gcugc 25
<210> 193
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 193
ucagccaucu uccaaaaugc accuggc 27
<210> 194
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 194
aucagccauc uuccaaaaug caccugg 27
<210> 195
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 195
uaucagccau cuuccaaaau gcaccug 27
<210> 196
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 196
cuaucagcca ucuuccaaaa ugcaccu 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 197
ucuaucagcc aucuuccaaa augcacc 27
<210> 198
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 198
aaaaguacca cauaaggacu uccuucu 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 199
ucaaaaagua ccacauaagg acuuccu 27
<210> 200
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 200
gucaaaaagu accacauaag gacuucc 27
<210> 201
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 201
ugucaaaaag uaccacauaa ggacuuc 27
<210> 202
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 202
augucaaaaa guaccacaua aggacuu 27
<210> 203
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 203
cuaugucaaa aaguaccaca uaaggac 27
<210> 204
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 204
cugaauagcc uaugucaaaa aguacca 27
<210> 205
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 205
auaucagcau aucauuggcu ucucggu 27
<210> 206
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 206
aauaucagca uaucauuggc uucucgg 27
<210> 207
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 207
aaauaucagc auaucauugg cuucucg 27
<210> 208
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 208
caaauaucag cauaucauug gcuucuc 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 209
uccaaauauc agcauaucau uggcuuc 27
<210> 210
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 210
auccaaauau cagcauauca uuggcuu 27
<210> 211
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 211
gauccaaaua ucagcauauc auuggcu 27
<210> 212
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 212
aagauccaaa uaucagcaua ucauugg 27
<210> 213
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 213
aaagauccaa auaucagcau aucauug 27
<210> 214
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 214
uaaagaucca aauaucagca uaucauu 27
<210> 215
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 215
guuaaagauc caaauaucag cauauca 27
<210> 216
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 216
caguuaaaga uccaaauauc agcauau 27
<210> 217
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 217
cuuuuaagaa ccaggcaguu aaagauc 27
<210> 218
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 218
ucuuuuaaga accaggcagu uaaagau 27
<210> 219
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 219
cucuuuuaag aaccaggcag uuaaaga 27
<210> 220
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 220
ccucuuuuaa gaaccaggca guuaaag 27
<210> 221
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 221
accucuuuua agaaccaggc aguuaaa 27
<210> 222
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 222
gccugccauu cauggaauug ggcaacg 27
<210> 223
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 223
agccugccau ucauggaauu gggcaac 27
<210> 224
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 224
cagccugcca uucauggaau ugggcaa 27
<210> 225
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 225
ccagccugcc auucauggaa uugggca 27
<210> 226
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 226
uccagccugc cauucaugga auugggc 27
<210> 227
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 227
uuccagccug ccauucaugg aauuggg 27
<210> 228
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 228
auuccagccu gccauucaug gaauugg 27
<210> 229
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 229
aauuccagcc ugccauucau ggaauug 27
<210> 230
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 230
caauuccagc cugccauuca uggaauu 27
<210> 231
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 231
ccaauuccag ccugccauuc auggaau 27
<210> 232
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 232
aauauugugg caauaggaag uuuccug 27
<210> 233
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 233
ucaauauuug cugcacagag auaccuc 27
<210> 234
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 234
aucaauauuu gcugcacaga gauaccu 27
<210> 235
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 235
aaucaauauu ugcugcacag agauacc 27
<210> 236
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 236
aaaucaauau uugcugcaca gagauac 27
<210> 237
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 237
gaaaucaaua uuugcugcac agagaua 27
<210> 238
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 238
agaaaucaau auuugcugca cagagau 27
<210> 239
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 239
uagaaaucaa uauuugcugc acagaga 27
<210> 240
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 240
guagaaauca auauuugcug cacagag 27
<210> 241
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 241
uguagaaauc aauauuugcu gcacaga 27
<210> 242
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 242
uuguagaaau caauauuugc ugcacag 27
<210> 243
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 243
guuguagaaa ucaauauuug cugcaca 27
<210> 244
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 244
gguuguagaa aucaauauuu gcugcac 27
<210> 245
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 245
ugguuguaga aaucaauauu ugcugca 27
<210> 246
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 246
augguuguag aaaucaauau uugcugc 27
<210> 247
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 247
gaugguugua gaaaucaaua uuugcug 27
<210> 248
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 248
ucaagauggu uguagaaauc aauauuu 27
<210> 249
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 249
uuaucaagau gguuguagaa aucaaua 27
<210> 250
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 250
acuuaucaag augguuguag aaaucaa 27
<210> 251
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 251
aacuuaucaa gaugguugua gaaauca 27
<210> 252
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 252
uaaacuuauc aagaugguug uagaaau 27
<210> 253
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 253
guuaaacuua ucaagauggu uguagaa 27
<210> 254
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 254
uguuaaacuu aucaagaugg uuguaga 27
<210> 255
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 255
auguuaaacu uaucaagaug guuguag 27
<210> 256
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 256
aauguuaaac uuaucaagau gguugua 27
<210> 257
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 257
caauguuaaa cuuaucaaga ugguugu 27
<210> 258
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 258
ucaauguuaa acuuaucaag augguug 27
<210> 259
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 259
gucaauguua aacuuaucaa gaugguu 27
<210> 260
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 260
ugucaauguu aaacuuauca agauggu 27
<210> 261
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 261
uugucaaugu uaaacuuauc aagaugg 27
<210> 262
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 262
uguuauuuca gaaaccgugg ugaacac 27
<210> 263
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 263
ugcuguuauu ucagaaaccg uggugaa 27
<210> 264
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 264
auugcuguua uuucagaaac cguggug 27
<210> 265
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 265
uauugcuguu auuucagaaa ccguggu 27
<210> 266
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 266
ucuauugcug uuauuucaga aaccgug 27
<210> 267
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 267
uucuauugcu guuauuucag aaaccgu 27
<210> 268
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 268
cuucuauugc uguuauuuca gaaaccg 27
<210> 269
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 269
ucagcuucua uugcuguuau uucagaa 27
<210> 270
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 270
gaguaacuac aucaggcuuu cucuuca 27
<210> 271
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 271
ggaguaacua caucaggcuu ucucuuc 27
<210> 272
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 272
cugaaaauuu cuuaacauuc aagccgu 27
<210> 273
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 273
gcugaaaauu ucuuaacauu caagccg 27
<210> 274
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 274
ugcugaaaau uucuuaacau ucaagcc 27
<210> 275
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 275
cugcugaaaa uuucuuaaca uucaagc 27
<210> 276
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 276
acugcugaaa auuucuuaac auucaag 27
<210> 277
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 277
cacugcugaa aauuucuuaa cauucaa 27
<210> 278
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 278
ugcacugcug aaaauuucuu aacauuc 27
<210> 279
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 279
aacucaugca cugcugaaaa uuucuua 27
<210> 280
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 280
uagauuuuga aacucaugca cugcuga 27
<210> 281
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 281
auagaaauga ccucgaacaa aaucuug 27
<210> 282
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 282
gaugaccaua gaaaugaccu cgaacaa 27
<210> 283
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 283
agaugaccau agaaaugacc ucgaaca 27
<210> 284
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 284
gagaugacca uagaaaugac cucgaac 27
<210> 285
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 285
cgagaugacc auagaaauga ccucgaa 27
<210> 286
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 286
ucgagaugac cauagaaaug accucga 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 287
gucgagauga ccauagaaau gaccucg 27
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 288
agucgagaug accauagaaa ugaccuc 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 289
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 290
aaugaaaagg aacaaagucu uuucaag 27
<210> 291
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 291
caaugaaaag gaacaaaguc uuuucaa 27
<210> 292
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 292
agcaaugaaa aggaacaaag ucuuuuc 27
<210> 293
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 293
ugaugucacu uuuaugcauc cucagca 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 294
ugugauguca cuuuuaugca uccucag 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 295
uugucuuggc aggcauaaug aaaaaca 27
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 296
uuauuugucu uggcaggcau aaugaaa 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 297
auuauuuguc uuggcaggca uaaugaa 27
<210> 298
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 298
aauuauuugu cuuggcaggc auaauga 27
<210> 299
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 299
ugaaauuauu ugucuuggca ggcauaa 27
<210> 300
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 300
cuuucagggu uuccacguug aaauuau 27
<210> 301
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 301
ccuuucaggg uuuccacguu gaaauua 27
<210> 302
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 302
uccuuucagg guuuccacgu ugaaauu 27
<210> 303
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 303
guccuuucag gguuuccacg uugaaau 27
<210> 304
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 304
uguccuuuca ggguuuccac guugaaa 27
<210> 305
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 305
aacuuuuccu ucacagaaug ugcaaca 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 306
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 307
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 308
uuuccaaacu uuuccuucac agaaugu 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 309
guuuuuuucc aaacuuuucc uucacag 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 310
aauaaugcau cauagaguuu uuuucca 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 311
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<210> 312
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 312
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 313
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 314
ggucaggaau uucuccucuu aauaaug 27
<210> 315
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 315
aggucaggaa uuucuccucu uaauaau 27
<210> 316
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 316
caggucagga auuucuccuc uuaauaa 27
<210> 317
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 317
ucaggucagg aauuucuccu cuuaaua 27
<210> 318
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 318
uucaggucag gaauuucucc ucuuaau 27
<210> 319
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 319
guucagguca ggaauuucuc cucuuaa 27
<210> 320
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 320
uuuucauaau uguuagauca ucucgau 27
<210> 321
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 321
ucuuuucaua auuguuagau caucucg 27
<210> 322
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 322
cucuuuucau aauuguuaga ucaucuc 27
<210> 323
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 323
gcucuuuuca uaauuguuag aucaucu 27
<210> 324
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 324
aaaagauggc ucuuuucaua auuguua 27
<210> 325
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 325
cugaguugaa aagauggcuc uuuucau 27
<210> 326
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 326
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<210> 327
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 327
auccgucuaa uggugcugag gaugggg 27
<210> 328
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 328
aauccgucua auggugcuga ggauggg 27
<210> 329
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 329
caauccgucu aauggugcug aggaugg 27
<210> 330
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 330
ccaauccguc uaauggugcu gaggaug 27
<210> 331
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 331
uaacaaacuc uucauagucc augggua 27
<210> 332
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 332
cuaacaaacu cuucauaguc caugggu 27
<210> 333
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 333
cauaguauga uggaaauacu ccaagau 27
<210> 334
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 334
uucauaguau gauggaaaua cuccaag 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 335
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 336
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<210> 337
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 337
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<210> 338
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 338
aucacagugc auucagcugg aguauaa 27
<210> 339
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 339
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 340
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<210> 341
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 341
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<210> 342
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 342
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 343
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<210> 344
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 344
caggugucug gcaugcuggu aauaucu 27
<210> 345
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 345
ucaggugucu ggcaugcugg uaauauc 27
<210> 346
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 346
gucagguguc uggcaugcug guaauau 27
<210> 347
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 347
ugucaggugu cuggcaugcu gguaaua 27
<210> 348
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 348
augucaggug ucuggcaugc ugguaau 27
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 349
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 350
uaaugucagg ugucuggcau gcuggua 27
<210> 351
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 351
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<210> 352
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 352
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 353
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 354
ucugcuuaau gucagguguc uggcaug 27
<210> 355
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 355
uggaaaagcu cugcuuaaug ucaggug 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 356
gaauuuaucu ggaaaagcuc ugcuuaa 27
<210> 357
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 357
uggaauuuau cuggaaaagc ucugcuu 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 358
uuaguuccac auggaauuua ucuggaa 27
<210> 359
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 359
guuaguucca cauggaauuu aucugga 27
<210> 360
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 360
cugaaggaga aggugguacu gaggaag 27
<210> 361
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 361
ccugaaggag aaggugguac ugaggaa 27
<210> 362
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 362
acuugauauu uaaccgaucc cuuucag 27
<210> 363
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 363
gugacuugau auuuaaccga ucccuuu 27
<210> 364
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 364
aauggugacu ugauauuuaa ccgaucc 27
<210> 365
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 365
gaaaauggug acuugauauu uaaccga 27
<210> 366
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 366
ugaaaauggu gacuugauau uuaaccg 27
<210> 367
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 367
cagugaaaau ggugacuuga uauuuaa 27
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<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 368
uauauucacc augcagcuuu uucuucc 27
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 369
uuauauucac caugcagcuu uuucuuc 27
<210> 370
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 370
ucuuauauuc accaugcagc uuuuucu 27
<210> 371
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 371
uucuuauauu caccaugcag cuuuuuc 27
<210> 372
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 372
aguucuuaua uucaccaugc agcuuuu 27
<210> 373
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 373
ucaguucuua uauucaccau gcagcuu 27
<210> 374
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 374
uucaguucuu auauucacca ugcagcu 27
<210> 375
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 375
aauucaguuc uuauauucac caugcag 27
<210> 376
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 376
gaauucaguu cuuauauuca ccaugca 27
<210> 377
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 377
agaauucagu ucuuauauuc accaugc 27
<210> 378
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 378
uagaauucag uucuuauauu caccaug 27
<210> 379
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 379
guagaauuca guucuuauau ucaccau 27
<210> 380
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 380
uguagaauuc aguucuuaua uucacca 27
<210> 381
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 381
acauguagaa uucaguucuu auauuca 27
<210> 382
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 382
cacauguaga auucaguucu uauauuc 27
<210> 383
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 383
agcacaugua gaauucaguu cuuauau 27
<210> 384
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 384
gcagcacaug uagaauucag uucuuau 27
<210> 385
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 385
aggugcauuu uggaagaugg gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 386
aggugcauuu uggaagaugg cagccgaaag gcugc 35
<210> 387
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 387
ggugcauuuu ggaagauggc gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 388
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 388
ggugcauuuu ggaagauggg cagccgaaag gcugc 35
<210> 389
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 389
aaggaagucc uuauguggua gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 390
aaggaagucc uuauguggug cagccgaaag gcugc 35
<210> 391
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 391
augauaugcu gauauuugga gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 392
augauaugcu gauauuuggg cagccgaaag gcugc 35
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 393
agcaaauauu gauuucuaca gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 394
agcaaauauu gauuucuacg cagccgaaag gcugc 35
<210> 395
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 395
ccacgguuuc ugaaauaaca gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 396
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 396
ccacgguuuc ugaaauaacg cagccgaaag gcugc 35
<210> 397
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 397
cuugaauguu aagaaauuuu gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 398
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 398
cuugaauguu aagaaauuug cagccgaaag gcugc 35
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 399
ugaauguuaa gaaauuuuca gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 400
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 400
ugaauguuaa gaaauuuucg cagccgaaag gcugc 35
<210> 401
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 401
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<210> 402
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 402
cgaggucauu ucuauggucg cagccgaaag gcugc 35
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 403
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 404
auucugugaa ggaaaaguug cagccgaaag gcugc 35
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 405
cuuggaguau uuccaucaua gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 406
cuuggaguau uuccaucaug cagccgaaag gcugc 35
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 407
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 408
uggaguauuu ccaucauacg cagccgaaag gcugc 35
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 409
gaguauuucc aucauacuau gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 410
gaguauuucc aucauacuag cagccgaaag gcugc 35
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 411
ccagcaugcc agacaccuga gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 412
ccagcaugcc agacaccugg cagccgaaag gcugc 35
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 413
agaaaaagcu gcauggugaa gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 414
agaaaaagcu gcauggugag cagccgaaag gcugc 35
<210> 415
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 415
uggugaauau aagaacugaa gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 416
uggugaauau aagaacugag cagccgaaag gcugc 35
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 417
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 418
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 419
gccaucuucc aaaaugcacc ug 22
<210> 420
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 420
ccaucuucca aaaugcaccu g 21
<210> 421
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 421
uaccacauaa ggacuuccuu cu 22
<210> 422
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 422
uaccacauaa ggacuucctu cu 22
<210> 423
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 423
accacauaag gacuucctuc u 21
<210> 424
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 424
accacauaag gacuuccuuc u 21
<210> 425
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 425
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<210> 426
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 426
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 427
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<210> 428
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 428
ccaaauauca gcauaucauu g 21
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 429
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 430
uguagaaauc aatauutgcu gc 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 431
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 432
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<210> 433
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 433
uguuauuuca gaaaccgugg ug 22
<210> 434
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 434
gtuauuucag aaaccguggu g 21
<210> 435
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 435
guuauuucag aaaccguggu g 21
<210> 436
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 436
aaaauuucuu aacauucaag cc 22
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 437
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 438
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 439
ugaaaauuuc uuaacatuca ag 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 440
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<210> 441
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 441
gaaaauuucu uaacauucaa g 21
<210> 442
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 442
ugaccauaga aaugaccucg aa 22
<210> 443
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 443
ugaccauaga aatgaccucg aa 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 444
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 445
gaccauagaa augaccucga a 21
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 446
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 447
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<210> 448
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 448
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 449
atgauggaaa uacuccaaga u 21
<210> 450
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 450
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<210> 451
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 451
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<210> 452
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 452
aguaugaugg aaauactcca ag 22
<210> 453
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 453
gtaugaugga aauactccaa g 21
<210> 454
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 454
guaugaugga aauacuccaa g 21
<210> 455
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 455
auaguaugau ggaaauacuc ca 22
<210> 456
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 456
ataguaugau ggaaauactc ca 22
<210> 457
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 457
uaguaugaug gaaauactcc a 21
<210> 458
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 458
uaguaugaug gaaauacucc a 21
<210> 459
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 459
ucaggugucu ggcaugcugg ua 22
<210> 460
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 460
caggugucug gcaugcuggu a 21
<210> 461
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 461
uucaccaugc agcuuuuucu uc 22
<210> 462
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 462
utcaccaugc agcuuutucu uc 22
<210> 463
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 463
ucaccaugca gcuuutucuu c 21
<210> 464
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 464
ucaccaugca gcuuuuucuu c 21
<210> 465
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 465
uucaguucuu auauucacca ug 22
<210> 466
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 466
ucaguucuua uauucaccau g 21
<210> 467
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 467
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<210> 468
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 468
ggcaucuaua cugugauuca gacaa 25
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<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 469
gcaucuauac ugugauucag acaaa 25
<210> 470
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 470
guccauauuu ugagcauaau augaa 25
<210> 471
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 471
auauuuugag cauaauauga agact 25
<210> 472
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 472
acggcuugaa uguuaagaaa uuutc 25
<210> 473
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 473
cggcuugaau guuaagaaau uuuca 25
<210> 474
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<210> 572
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 572
cugaaauaac agcaauagaa gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 573
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 573
acggcuugaa uguuaagaaa gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 574
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 574
aguguuuuua aaauggugaa gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 575
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 575
ugaaucacag uauagaugcc gg 22
<210> 576
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 576
cugaaucaca guauagaugc gg 22
<210> 577
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 577
uagaaaucaa uauuugcugc gg 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 578
uucuauugcu guuauuucag gg 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 579
uuucuuaaca uucaagccgu gg 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 580
uucaccauuu uaaaaacacu gg 22
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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gaauguuaag aaauuuucag cagccgaaag gcugc 35
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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ugcaugaguu ucaaaaucua gcagccgaaa ggcugc 36
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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ucgagaugau cuaacaauua gcagccgaaa ggcugc 36
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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agacuaauua uuuaaaauaa gcagccgaaa ggcugc 36
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<220>
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agaauugaug uuguaauuaa gcagccgaaa ggcugc 36
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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uaaauuucuu aacauucaag gg 22
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 588
uucaccaugc agcuuuuucu gg 22
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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ucaccaugca gcuuuuucug g 21
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 590
ugaaaauuuc uuaacauuca gg 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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uucaguucuu auauucacca gg 22
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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aaaauuucuu aacauucaag gg 22
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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ugaaaauuuc uuaacauucg g 21
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<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
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<220>
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uaauuguuag aucaucucga gg 22
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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uuauuuuaaa uaauuagucu gg 22
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<212> RNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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utcaguucuu auauucacca ug 22
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 599
gatagaagga agtccttatg tggtactttt tgacataggc 40
<210> 600
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<213> Homo sapiens
<400> 600
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tccaaacggc ttgaatgtta agaaattttc agcagtg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 602
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<213> Homo sapiens
<400> 603
tgcacattct gtgaaggaaa agtttggaaa aaaactctat gatgcattat taagag 56
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 604
aagctgcatg gtgaatataa gaactgaatt ctacatgtgc tgc 43
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<213> Homo sapiens
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gtggaagaaa ttgagtgaat gacaattttg taatttagga taagatc 47
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<213> Homo sapiens
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tttctcttac tctgtttatt tttaaatgat catcataat 39
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<213> Homo sapiens
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tagctaggtt tttactgatt attttcattt ttcacatgca tcag 44
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<213> Homo sapiens
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tcttactgta acatttttct attgtttaaa tagaaag 37
<210> 609
<211> 3132
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 609
agatactgac agggcagata ccgtcctcac aatacctgcc cagaaagacg agaaagagga 60
ggaagaattc ctccttccac caggaattct gtgggaagca cataagattt catgctacta 120
gtttattccc aagagaagct accaaagcct ggtaactcta ccaactctaa cttttgtgcc 180
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aggactgtaa gaagaatgct tcgaggccga tccctctctg taacatccct gggtgggctt 300
ccccagtggg aagtcgaaga acttcctgtg gaggagttac tgctctttga agttgcttgg 360
gaagtgacca ataaagttgg aggcatctat actgtgattc agacaaaggc caaaacaaca 420
gcagatgaat ggggagagaa ctattttctg ataggtccat attttgagca taatatgaag 480
actcaggtgg aacagtgtga acctgtaaat gatgctgtca gaagagcagt ggacgcaatg 540
aataagcatg gctgccaggt gcattttgga agatggctga tagaaggaag tccttatgtg 600
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ggatctttaa ctgcctggtt cttaaaagag gtgacagatc atgcagatgg taaatatgtc 780
gttgcccaat tccatgaatg gcaggctgga attggactga tcctttctcg agccaggaaa 840
cttcctattg ccacaatatt tacaacccac gctacactac ttgggaggta tctctgtgca 900
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accacggttt ctgaaataac agcaatagaa gctgaacata tgctgaagag aaagcctgat 1080
gtagttactc caaacggctt gaatgttaag aaattttcag cagtgcatga gtttcaaaat 1140
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ctcgactttg atcttgaaaa gactttgttc cttttcattg ctgggaggta tgagttttca 1260
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aacgtggaaa ccctgaaagg acaagcagtg cgaaaacagc tgtgggatgt tgcacattct 1440
gtgaaggaaa agtttggaaa aaaactctat gatgcattat taagaggaga aattcctgac 1500
ctgaacgata ttttagatcg agatgatcta acaattatga aaagagccat cttttcaact 1560
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cggttccgtt ctccagatga ttcttgcaat cagctgacta agtttctcta tggattttgc 1980
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atttggtcaa tcttcataga tgataacttg taaaatccaa gtaaataaac acattaatat 3120
ttaataactt aa 3132
<210> 610
<211> 3149
<212> DNA
<213> Macaca mulatta
<400> 610
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gaaaaattcc tctttccacc aggaattctc tgggaagcac ataggatttc acgctactag 120
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ccttgatctt tcccatgaat gtgcactacc tacatatttt aaatagctag atttttactg 2820
attattttca tttttcacat gcatcagaac catgatttat atgtagtgtt gcagagacaa 2880
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aagatattac catgtgcatg gtaccaacat cttactgtaa catttttcta ttgtttaaat 3060
agaaagactt taaaaaaatt tggtcaatct tcatagatga taagttgtta aatcccagta 3120
aataaatgca ttaatattta ataacttaa 3149
<210> 611
<211> 2671
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 611
tcatgctcag tctgtcctct ggctacctgc cctgctgtga atagtcaggt ttcagctgcg 60
attttttgtt ttgttttgtc ttgttttttt tgtttttggg tgtctgtgtg gattataact 120
gtgaggcact gccctctcct gaaaggcagc aaggagctgg gcacgcttca tccagctgcg 180
ctgggttcat gtgacctcag attgctggct caccctgtag aggctatccc aaggctgctg 240
ctttttctca gtgctgactg cagtcagctg aatcaggtcc caaacggcac cacacagctg 300
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ccaacaaagt tgggggcatc tgtactgtga tccagaccaa ggccaaaacg acagccgatg 480
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gtggcgttgg catccctcat catgaccgag aagctaacga catgctcata tttgggtctt 780
taactgcctg gttcttaaag gaggtgacag accacgcaga cggtaaacac gtcattgccc 840
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ccatgtacaa ggccaggata caggatttcg ttcgaggtca tttctatggt catctggact 1260
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auuaauuaca acaucaauuc gg 22
Claims (54)
- 서열식별번호: 417-466, 575-580, 586-598 및 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는, GYS2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 서열식별번호: 385-416, 569-574, 581-585 및 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥을 추가로 포함하는 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 안티센스 가닥이 서열식별번호: 417-466, 575-580, 586-598 및 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 센스 가닥이 서열식별번호: 385-416, 569-574, 581-585 및 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 15 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하는, GYS2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 안티센스 가닥은 서열식별번호: 599-608 중 어느 하나에 제시된 GYS2의 표적 서열에 대해 상보성인 영역을 갖고, 상보성 영역이 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제5항에 있어서, 상보성 영역이 GYS2의 표적 서열에 대해 완전히 상보성인 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 19 내지 27개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 21 내지 27개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이이고, 센스 가닥이 안티센스 가닥과 듀플렉스 영역을 형성하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제9항에 있어서, 센스 가닥이 19 내지 40개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 듀플렉스 영역이 적어도 19개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 듀플렉스 영역이 적어도 21개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, GYS2에 대해 상보성인 영역이 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, GYS2에 대해 상보성인 영역이 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 서열식별번호: 385-416, 569-574, 581-585 및 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 서열식별번호: 417-466, 575-580, 586-598 및 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 서열식별번호: 385-416, 569-574, 581-585 및 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 서열식별번호: 417-466, 575-580, 586-598 및 620-627 중 어느 하나에 제시된 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 그의 3'-말단에 S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하고, S1이 S2에 대해 상보성이고, L이 S1과 S2 사이에 3 내지 5개 뉴클레오티드 길이의 루프를 형성하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는, GYS2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드이며,
여기서 안티센스 가닥은 21 내지 27개 뉴클레오티드 길이이고, GYS2에 대해 상보성인 영역을 갖고,
센스 가닥은 그의 3'-말단에 S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하고, S1은 S2에 대해 상보성이고, L은 S1과 S2 사이에 3 내지 5개 뉴클레오티드 길이의 루프를 형성하고,
안티센스 가닥 및 센스 가닥은 적어도 19개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 구조를 형성하지만, 공유 연결되지 않은 것인 올리고뉴클레오티드. - 제20항에 있어서, 상보성 영역이 GYS2 mRNA의 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드에 대해 완전히 상보성인 올리고뉴클레오티드.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, L이 테트라루프인 올리고뉴클레오티드.
- 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, L이 4개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, L이 GAAA로 제시된 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 27개 뉴클레오티드 길이이고, 센스 가닥이 25개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
- 제25항에 있어서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥이 25개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 형성하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥 상의 3'-오버행 서열을 추가로 포함하는 올리고뉴클레오티드.
- 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 각각 21 내지 23개 범위의 뉴클레오티드 길이인 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제28항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 19 내지 21개 범위의 뉴클레오티드 길이인 듀플렉스 구조를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 1개 이상의 뉴클레오티드 길이의 3'-오버행 서열을 포함하고, 3'-오버행 서열이 안티센스 가닥, 센스 가닥, 또는 안티센스 가닥 및 센스 가닥 상에 존재하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 2개 뉴클레오티드 길이의 3'-오버행 서열을 포함하고, 3'-오버행 서열이 안티센스 가닥 상에 존재하고, 센스 가닥이 21개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥이 23개 뉴클레오티드 길이이며, 이에 따라 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 21개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 형성하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제32항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드가 2'-변형을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제33항에 있어서, 2'-변형이 2'-아미노에틸, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 및 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산으로부터 선택된 변형인 올리고뉴클레오티드.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 변형되는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제36항에 있어서, 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결인 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥의 5'-뉴클레오티드의 당의 4'-탄소가 포스페이트 유사체를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제38항에 있어서, 포스페이트 유사체가 옥시메틸포스포네이트, 비닐포스포네이트, 또는 말로닐포스포네이트인 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제39 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 1개의 뉴클레오티드가 1개 이상의 표적화 리간드에 접합되는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제40항에 있어서, 각각의 표적화 리간드가 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제41항에 있어서, 각각의 표적화 리간드가 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제42항에 있어서, GalNac 모이어티가 1가 GalNAc 모이어티, 2가 GalNAc 모이어티, 3가 GalNAc 모이어티, 또는 4가 GalNAc 모이어티인 올리고뉴클레오티드.
- 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 스템-루프의 L의 4개 이하의 뉴클레오티드 각각이 1가 GalNAc 모이어티에 접합되는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제40항에 있어서, 표적화 리간드가 압타머를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 및 부형제를 포함하는 조성물.
- 제46항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게 올리고뉴클레오티드를 전달하는 방법.
- 제46항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 글리코겐 저장 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법.
- 제46항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간비대, 간 결절 형성, 간 독성, 간 섬유증, 간세포 증식, 간에서 지방산 침착, 간 과형성, 간세포 선종, 및/또는 간세포 암종을 감소시키거나 또는 예방하는 방법.
- 제49항에 있어서, AST, ALT 및 ALP로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 수준을 감소시키는 것인 방법.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 대상체가 글리코겐 저장 질환을 앓고 있는 것인 방법.
- 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코겐 저장 질환이 GSDIa, GSDIII, GSDIV, GSDVI 및 GSDIX로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 15 내지 50개 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 15 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하는, GYS2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥과 듀플렉스 영역을 형성하고, 센스 가닥은 서열식별번호: 385-416, 569-574, 581-585 및 612-619 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열식별번호: 417-466, 575-580, 586-598 및 620-627로부터 선택된 상보성 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
- 표 4에 제시된 표의 열로부터 선택된 센스 및 안티센스 가닥의 쌍을 포함하는, GYS2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드.
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