KR20210132661A - Cyp27a1의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Cyp27a1의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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다이서나 파마수이티컬, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 특히 간세포에서 CYP27A1 발현을 감소시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 방법에 관한 것이다. CYP27A1 발현의 감소를 위한 개시된 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고 뉴클레아제에 대한 더 강한 저항성 및 더 낮은 면역원성과 같은 개선된 특성을 위해 변형될 수 있다. CYP27A1 발현의 감소를 위한 개시된 올리고뉴클레오티드는 또한 특정 세포 또는 기관, 예컨대 간의 간세포를 표적화하는 표적화 리간드를 포함할 수 있고, 간담도 질환 및 관련된 병태 (예를 들어, 간 섬유증)를 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

CYP27A1의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물
관련된 출원
이 출원은 2019년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/804,410의 35 U.S.C.§119 (e) 하에서의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도, 특히 간의 대사 기능의 조절과 관련된 용도에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참고
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출되고 있다. 서열 목록은 2020년 2월 6일에 생성된 400930-012WO_SEQ.txt로 명명된 파일로 제공되며, 그 크기는 162KB이다. 서열 목록의 전자 형식에서의 정보는 그 전체로서 참고로 본 명세서에 포함된다.
간에 의해 수행되는 많은 대사 기능 중에서, 담즙의 합성 및 흐름은 장간 시줄기의 최적 기능화에 중요하다. 담즙은 간에서 생성된 액체이고, 담낭에 저장되었다가 장으로 분비되어, 식이 지방 및 지용성 비타민의 흡수뿐만 아니라 빌리루빈 및 과잉 콜레스테롤과 같은 노폐물의 배출을 돕는다. 담즙산은 또한 호르몬 조절제로서의 역할을 수행한다.
간에서 합성된 담즙산은 일차 담즙산으로 알려져 있으며, 이는 글리신 또는 타우린과 결합하여 장으로 분비된다. 결장에서, 장내 세균은 담즙산을 추가로 변형하여 이차 담즙산을 형성한다. 이들 이차 담즙산은 그 다음 흡수되어 장간 순환을 통해 간으로 되돌아간다. 주요 일차 담즙산은 콜산과 케노데옥시콜산인 반면 주요 이차 담즙산은 데옥시콜산 및 리토콜산을 포함한다. 이들 담즙산 외에도 뮤리콜산이 또한 존재할 수 있다.
담즙산의 양친매성 성질은 담즙산이 계면활성제 또는 디터전트 (detergent)로서 기능하게 하고; 이것은 차례로 식이 지방과 미셀을 형성하여, 지방을 유화시키고 장을 통한 그 흡수를 향상시키는 능력을 제공한다. 더욱이, 담즙산의 디터전트 성질은 그 독성에 기여한다.
전체 비경구 영양 ("TPN")은, 양호한 영양 상태를 유지하기 위해 튜브 공급식을 통하거나 또는 입에 의해 음식을 충분히 먹거나 흡수할 수 없는 환자에 대해 단백질, 탄수화물, 지방, 미네랄 및 전해질, 비타민 및 기타 미량 요소를 포함할 수 있는, 영양의 정맥내 투여이다. 이것은 장을 우회하여 달성된다. 적시에 올바른 영양 섭취를 하면 합병증을 예방할 수 있고 환자의 회복에 중요한 역할을 할 수 있다. 그러나, TPN은 장의 경로를 통한 칼로리 공급이 유기체의 필요한 요구를 충족할 수 없는 상황에서 생명-구조 영양의 지원을 제공하지만, 그것은 비경구 영양-연관된 간 질환 (PNALD)을 포함한 심각한 부작용이 있다. PN과 연관된 간 손상의 발병은 비-특이적 장 염증, 손상된 장 투과성, 및 증가된 세균 전위와 연관된 장벽 기능, 일차 및 이차 담관염, 담석증, 단장 증후군, 간담도 순환의 장애, 장관 영양의 결핍, 일부 영양소 (단백질, 필수 지방산, 콜린, 글리신, 타우린, 카르니틴 등)의 부족, 및 영양 혼합물 그 자체 내의 성분 (포도당, 피토스테롤, 망간, 알루미늄 등)의 독성을 포함하는 다인성이다. 설치류 모델에서 규칙적인 섭식 동안 담즙산은 장에서 파르네소이드 X 수용체 (FXR)를 활성화하고 섬유아세포 성장 인자 19 (FGF19) 수준의 발현을 향상시키는 것으로 나타났다. (Kumar J. 등, (2014), Newly Identified Mechanisms of Total Parenteral Nutrition Related Liver Injury, Advances in Hepatology 1-7).
FGF19는 담즙산, 지질 및 포도당 대사를 조절하는 것으로 또한 알려져 있다. 따라서, FXR-FGF19 경로의 조절제는 TPN의 간에 대한 부정적인 영향을 극복할 수 있다. 마찬가지로, 시토크롬 P450 (CYP) 7A1, CYP8B1 및 CYP27A1, CYP3A4, CYP3A11, 설포트랜스퍼라제 2A1 (SULT2A1) 및 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 2B4 (UGT2B4/UGT2B11)를 포함한 FXR-조절된 효소는 담즙산의 합성 및 대사에 참여한다. 담즙산의 증가로 이어지는 담즙산의 양에서의 전이는 향-염증성 기전, 막 손상 및 세포독성 반응을 통해 간독성을 유도하고 강화할 가능성을 가지고 지질 항상성에 대한 중요성을 가질 수 있다. RNAi 유전자 사일런싱을 통해 CYP27A1과 같은 유전자를 표적화함에 의해 담즙산 발현의 감소는 이러한 손상 및 PNALD 또는 TPN과 연관된 기타 영향을 포함한 결과적인 병리를 변형 및 완화시키는 효과를 가질 수 있다.
발명의 간략한 요약
본 개시내용의 양태는 간 대사 기능에 영향을 미치는 유전자, 특히 대상체에서 담즙산 수준에 영향을 미치는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 조성물 및 관련된 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 CYP27A1이 간담도 질환, 특히 담즙산 축적과 연관된 이러한 질환의 치료에 유용한 표적이라는 인식에 관한 것이다. 추가 양태에서, CYP27A1의 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드가 간에서 담즙산의 축적이 세포 독성 (예를 들어, 독성 간세포 및/또는 담관세포)에 기여하고/하거나 간 섬유증을 증진하는 병태를 치료하는데 유용하다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은, 예를 들어 담즙울체, 담관염, 비알코올성 지방간염 (NASH) 및/또는 알라질 증후군을 포함한, 간담도 질환의 치료를 위한 CYP27A1의 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 RNAi 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 기타 유사한 양식을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
추가 실시형태에서, 대상체에서 CYP27A1 발현을 선택적으로 억제하기 위해 강력한 RNAi 올리고뉴클레오티드가 개발되었다. 일부 실시형태에서, RNAi 올리고뉴클레오티드는 CYP27A1 활성을 감소시키고 이에 의해 대상체에서 담즙산의 축적을 감소 또는 예방하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 이러한 올리고뉴클레오티드-기반 접근법을 사용하여 표적화하기에 특히 적합한 CYP27A1 활성 mRNA의 핵심 영역 (핫스팟으로 지칭됨)이 본 명세서에서 확인되었다 (실시예 1 참고). 일부 실시형태에서, CYP27A1 발현을 억제하기 위해 본 명세서에서 개발된 올리고뉴클레오티드는 담즙산 축적과 연관된 간 섬유증을 감소 또는 예방하는 데 유용하다 (예를 들어, 실시예 1, 도 7 및 도 8 참고).
본 개시내용의 일 양태는 CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 및 788 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 및 788 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 787 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다.
본 개시내용의 일 양태는 CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 길이에서 15 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 서열번호: 767-781 중 임의의 하나에 제시된 CYP27A1의 표적 서열에 대해 상보성의 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, 상보성의 영역은 길이에서 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 또는 적어도 22개의 인접 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 상보성의 영역은 CYP27A1의 표적 서열에 완전히 상보적이다. 일부 실시형태에서, CYP27A1에 대한 상보성의 영역은 길이에서 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 및 788 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 및 788 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다.
일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 길이에서 19 내지 27개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 길이에서 21 내지 27개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 15 내지 40개 뉴클레오티드의 센스 가닥을 추가로 포함하고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥과 이중나선 영역을 형성한다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 길이에서 19 내지 40개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥의 길이는 27개 뉴클레오티드이고 센스 가닥의 길이는 25개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 이중나선 영역은 길이에서 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 또는 적어도 21개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 길이에서 25개 뉴클레오티드의 이중나선 영역을 형성한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 각각 길이에서 21 내지 23개 뉴클레오티드의 범위인 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 19 내지 21개 뉴클레오티드의 범위인 이중나선 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 2개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상에 3'-오버행 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 3'-오버행 서열을 포함하며, 여기서 3'-오버행 서열은 안티센스 가닥, 센스 가닥, 또는 안티센스 가닥과 센스 가닥 상에 존재한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 2개 뉴클레오티드의 3'-오버행 서열을 포함하며, 여기서 3'-오버행 서열은 안티센스 가닥 상에 존재하고, 그리고 센스 가닥과 안티센스 가닥이 21개 뉴클레오티드 길이의 이중나선를 형성하도록, 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, 센스 가닥은 그 3'-말단에 S1-L-S2로 제시된 줄기-루프를 포함하며, 여기서 S1은 S2에 상보적이고, L은 3 내지 5개의 뉴클레오티드 길이의 S1과 S2 사이에 루프를 형성한다.
본 개시내용의 다른 양태는 CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥의 길이는 21 내지 27 뉴클레오티드이고 CYP27A1에- 상보성의 영역을 가지며, 센스 가닥은 그 3'-말단에 S1-L-S2로 제시된 줄기-루프를 포함하며, 여기서 S1은 S2에 상보적이고, L은 3 내지 5개의 뉴클레오티드 길이의 S1과 S2 사이에 루프를 형성하고, 그리고 여기서 안티센스 가닥과 센스 가닥은 적어도 19개 뉴클레오티드 길이의 이중나선 구조를 형성하지만 공유 원자가로 연결되지는 않는다. 일부 실시형태에서, CYP27A1 mRNA에 대한 상보성의 영역은 CYP27A1 mRNA의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개 또는 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드에 완전히 상보적이다. 일부 실시형태에서, L은 테트라루프이다. 일부 실시형태에서, L은 4개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, L은 GAAA로 제시된 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2'-변형은 2'-아미노에틸, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 및 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산으로부터 선택된 변형이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 변형된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥의 5'-뉴클레오티드의 당의 4'-탄소는 포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸 포스포네이트, 비닐 포스포네이트, 또는 말로닐 포스포네이트이다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시형태에서, 각각의 표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 표적화 리간드는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, GalNac 모이어티는 1가 GalNAc 모이어티, 2가 GalNAc 모이어티, 3가 GalNAc 모이어티, 또는 4가 GalNAc 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 줄기-루프의 L의 최대 4개 뉴클레오티드가 각각 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다. 다른 실시형태에서, 2-가, 3-가 또는 4가 GalNac 모이어티는 단일 뉴클레오티드, 예를 들어 줄기 루프의 L의 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 압타머를 포함한다.
본 개시내용의 다른 양태는 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 및 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 또 다른 양태는 본 개시내용의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 대상체의 간에서 담즙산 축적을 약화시키는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 간 섬유증의 정도를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 간 섬유증의 정도를 감소시키는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 순환 담즙산 농도를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 순환 담즙산 농도를 감소시키는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 간담도 질환을 치료하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 대상체는 PNALD를 앓고 있다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 상기 올리고뉴클레오티드는 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 15 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥과 이중나선 영역을 형성하며, 센스 가닥은 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786 및 788로부터 선택된 상보적 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 부록 A에 제시된 표의 행으로부터 선택된 센스 및 안티센스 가닥의 쌍을 포함한다.
이 명세서에 포함되고 그의 일부를 구성하는 첨부 도면은 특정 실시형태를 예시하고, 서면 설명과 함께 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 특정 양태의 비-제한적인 예를 제공하는 역할을 한다.
도 1은 세포 및 동물 모델에서 시험하기 위한 화합물을 선택하고 CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 개발하기 위해 사용된 실험 설계를 나타내는 흐름도이다. SAR: 구조-활성 연관성.
도 2는 4개의 GalNAc 모이어티 (노란색 다이아몬드)에 접합된 틈이 있는 테트라루프 구조를 갖는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 비-제한적인 예를 보여주는 개략도이다.
도 3은 활성 25/27mer를 확인하기 위해 사용된 인간 HepG2 세포를 사용하여 수행된 일차 올리고뉴클레오티드 스크리닝 후에 남아 있는 CYP27A1 mRNA의 백분율을 나타내는 그래프이다. 데이터는 Hs HPRT 517-591 (FAM) 및 Hs SFRS9 594-690 (Hex) 검정을 사용한 M15-변형된 대조군을 사용하여 정규화된다.
도 4a 및 4b는 인간 HepG2 세포에서 틈이 있는 테트라루프 올리고뉴클레오티드 (36/22mer)의 평가 결과를 묘사하는 그래프 세트이다. 데이터는 Hs SFRS9 594-690 (Hex) 검정을 사용하여 모의-형질감염된 세포에 대해 정규화된다. 도 4a 및 4b 둘 모두에 대해, "S", "AS" 및 "M"은 각각 센스 가닥, 안티센스 가닥 및 변형 패턴을 나타내고; "S" 및 "AS" 다음의 숫자는 서열번호를 나타내고; "M" 다음의 숫자는 변형 패턴을 나타낸다. 도 4a는 각각 센스 서열 서열번호: 577 및 578, 및 안티센스 서열 서열번*: 579 및 580으로 형성된 올리고뉴클레오티드에 대한 데이터를 나타낸다. 도 4b는 각각 센스 서열 서열번호: 577 및 581-597, 및 안티센스 서열 서열번호: 579 및 598-614로 형성된 올리고뉴클레오티드에 대한 데이터를 나타낸다. *는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫 번째 뉴클레오티드의 염기가 우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도 5는 틈이 있는 테트라루프 올리고뉴클레오티드를 사용하고 GalNAc 모이어티에 접합된 마우스 CYP27A1 발현의 감소를 평가하는 검정의 결과를 묘사하는 그래프이다. 올리고뉴클레오티드의 명칭에서 "G"는 이들이 GalNAc 모이어티에 접합됨을 나타낸다. 센스 서열 서열번호: 759 내지 762 및 안티센스 서열 서열번호: 763 내지 766으로 각각 형성되고 상이한 변형 패턴을 갖는 올리고뉴클레오티드에 대한 데이터가 도시되어 있다.
도 6은 GalNAc 모이어티에 접합된 틈이 있는 테트라루프 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간 CYP27A1 발현의 감소를 평가하는 검정의 결과를 묘사하는 그래프이다. 올리고뉴클레오티드의 명칭에서 "G"는 이들이 GalNAc 모이어티에 접합됨을 나타낸다. 센스 서열 서열번호: 577, 581, 582, 584, 586, 588, 590, 591, 593, 594, 595 및 597, 및 안티센스 서열 서열번호: 791, 598, 599, 601, 603, 605, 607, 608, 610, 611, 612 및 614를 각각 사용하고 다른 변형 패턴을 갖는 올리고뉴클레오티드에 대한 데이터가 도시되어 있다. *는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 첫 번째 뉴클레오티드의 염기가 우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도 7은 부분 담관 결찰 마우스 모델에서 CYP27A1 녹다운 시 혈청 담즙산 농도에서의 감소를 보여주는 개략도이다.
도 8은 부분 담관 결찰된 마우스의 결찰된 간엽에서 섬유증의 지표로서 시리우스 레드 염색에서의 감소를 나타내는 일련의 이미지이다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 세포에서 CYP27A1 발현을 감소시키는데 효과적인 CYP27A1 mRNA를 표적화하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이들 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 담즙산 축적의 치료 (예를 들어, 간담도 질환의 맥락에서)를 위한 간 세포 (예를 들어, 간세포)에서 CYP27A1의 감소에 유용하다. 따라서, 관련된 양태에서, 개시내용은 간에서 CYP27A1 유전자 발현을 선택적으로 감소시키는 것을 포함하는 담즙산 축적을 치료하는 방법을 제공한다 (예를 들어, 실시예 1 및 도 7 및 8 참고). 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CYP27A1 표적화 올리고뉴클레오티드는 표적 조직 (예를 들어, 간 간세포)의 선택된 세포로의 전달을 위해 설계되어 이들 조직에서 담즙산 축적을 치료한다.
정의된 용어의 설명을 포함하여 개시내용의 추가 양태가 아래에 제공된다.
I. 정의
대략적으로: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심 있는 값에 적용되는 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 언급된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 달리 명시되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한 명시된 기준 값의 어느 방향으로 (그보다 크거나 작음) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다 (그러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외).
투여하는 것: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는 것" 또는 "투여"는 약리학적으로 유용한 (예를 들어, 대상체에서 병태를 치료하기 위한) 방식으로 대상체에게 물질 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)을 제공하는 것을 의미한다.
아시알로당단백질 수용체 (ASGPR): 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "아시알로당단백질 수용체" 또는 "ASGPR"은 주요 48 kDa (ASGPR-1) 및 보조 40 kDa 서브유닛 (ASGPR-2)에 의해 형성된 두 부의 C-유형 렉틴을 지칭한다. ASGPR은 주로 간세포 세포의 동양 혈관의 표면에서 발현되고 말단 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기 (아시알로당단백질)를 함유하는 순환 당단백질의 결합, 내재화 및 후속 제거에 주요한 역할을 한다.
감쇠: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "감쇠"는 감소시키거나 효과적으로 정지시키는 것을 의미한다. 비-제한적 예로서, 본 명세서에 제공된 하나 이상의 치료는 대상체에서 담즙산 축적의 발병 또는 진행을 감소시키거나 효과적으로 중단시킬 수 있다. 이 감쇠는, 예를 들어, 담즙산 축적의 하나 이상의 양태 (예를 들어, 증상, 조직 특성, 세포, 염증 또는 면역 활성 등) 또는 이러한 축적으로 인한 증상에서 감소, 담즙산 축적의 하나 이상의 양태 또는 이러한 축적으로 인한 증상의 검출 가능한 진행 (악화) 없음, 또는 그렇지 않으면 예상될 수 있는 대상체에서 감지할 수 없는 담즙산 축적 또는 이러한 축적으로 인한 증상에 의해 예시될 수 있다.
상보적: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적"은 뉴클레오티드가 서로 염기쌍을 형성하도록 허용하는 뉴클레오티드 (예를 들어, 반대 핵산 상의 2개의 뉴클레오티드 또는 단일 핵산 가닥의 반대 영역 상) 사이의 구조적 상관관계를 지칭한다. 예를 들어, 반대 핵산의 피리미딘 뉴클레오티드에 상보적인 한 핵산의 퓨린 뉴클레오티드는 서로 수소 결합을 형성함에 의해 함께 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상보적 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 방식으로 또는 안정한 이중나선의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같이 상보성의 영역을 형성하기 위해 서로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
CYP27A1: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CYP27A1"은 시토크롬 P450 산화효소 유전자를 지칭한다. 이 유전자는 효소의 시토크롬 P450 슈퍼패밀리의 구성원이고 담즙 합성 경로의 일부로 콜레스테롤 중간체를 산화시키는 미토콘드리아 단백질인 시토크롬 P450 산화효소 단백질을 인코딩한다. CYP27A1의 상동체는 인간, 마우스, 비-인간 영장류 및 기타를 포함한 다양한 종에 걸쳐 보존된다 (예를 들어, NCBI HomoloGene: 36040 참고). 예를 들어, 인간에서 CYP27A1 유전자는 전사체 변이체 1 (NM_000784.3) 및 전사체 변이체 2 (XM_017003488.1)를 포함한 다수의 전사체 변이체를 인코딩한다. 마우스에서 CYP27A1은 복수의 전사체 변이체, 즉 전사체 변이체 1 (NM_024264.5) 및 변이체 2 (XM_006495607.2)를 인코딩한다.
데옥시리보뉴클레오티드: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "데옥시리보뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드와 비교하여 그 오탄당 당의 2' 위치에 수소를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 데옥시리보뉴클레오티드는 당, 포스페이트 기 또는 염기 내 또는 그의 변형 또는 치환을 포함하여 2' 위치가 아닌 원자의 하나 이상의 변형 또는 치환을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드이다.
이중-가닥 올리고뉴클레오티드: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 실질적으로 이중나선 형태인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 이중나선 영역(들)의 상보적 염기-쌍은 공유 원자가로 별도 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 이중나선 영역(들)의 상보적 염기-쌍은 공유 원자가로 연결된 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 이중나선 영역(들)의 상보적 염기-쌍은 함께 염기 쌍을 이루는 뉴클레오티드의 상보적 역평행 서열을 제공하기 위해 (예를 들어, 헤어핀을 통해) 접힌 단일 핵산 가닥으로부터 형성된다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 서로 완전히 이중나선화된 2개의 공유 원자가로 별도 핵산 가닥을 포함한다. 그러나, 일부 실시형태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 이중나선화된, 예를 들어 한쪽 또는 양쪽 말단에서 오버행을 갖는 2개의 공유 원자가로 별도 핵산 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드의 역평행 서열을 포함하고, 따라서 내부 미스매치 또는 말단 미스매치를 포함할 수 있는 하나 이상의 미스매치를 가질 수 있다.
이중나선: 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이중나선"은 뉴클레오티드의 2개의 역평행 서열의 상보적 염기-쌍을 통해 형성된 구조를 지칭한다.
부형제: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는, 예를 들어, 원하는 일관성 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 비-치료적 제제를 지칭한다.
간세포: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "간세포" 또는 "간세포들"은 간의 실질 조직의 세포를 지칭한다. 이들 세포는 간 질량의 대략적으로 70-85%를 구성하고 혈청 알부민, 피브리노겐 및 응고 인자 (인자 3 및 4 제외)의 프로트롬빈 군을 생성한다. 간세포 계통 세포에 대한 마커는 트랜스티레틴 (Ttr), 글루타민 합성효소 (Glul), 간세포 핵 인자 1a (Hnf1a) 및 간세포 핵 인자 4a (Hnf4a)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 성숙한 간세포에 대한 마커는 시토크롬 P450 (Cyp3a11), 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소 (Fah), 글루코스 6-포스페이트 (G6p), 알부민 (Alb) 및 OC2-2F8을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Huch 등, (2013), Nature, 494(7436): 247-250을 참고하고, 간세포 마커에 관한 그 내용은 참고로 본 명세서에 포함된다.
루프: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "루프"는 적절한 혼성화 조건 (예를 들어, 인산염 완충액 내, 세포 내) 하에서 짝을 이루지 않은 영역에 측접한 2개의 역평행 영역은 혼성화하여 이중나선 ("줄기"로 지칭됨)을 형성하도록, 서로 충분히 상보적인 핵산의 2개의 역평행 영역에 의해 측접하는 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 짝을 이루지 않은 영역을 지칭한다.
변형된 뉴클레오티드간 연결: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오티드간 연결"은 포스포디에스테르 결합을 포함하는 기준 뉴클레오티드간 연결과 비교하여 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드간 연결을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연적으로 발생하는 연결이다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 변형된 뉴클레오티드간 연결이 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 열 안정성, 분해에 대한 저항성, 뉴클레아제 저항성, 용해도, 생체이용성, 생체활성, 감소된 면역원성 등을 개선할 수 있다.
변형된 뉴클레오티드: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드, 아데닌 데옥시리보뉴클레오티드, 구아닌 데옥시리보뉴클레오티드, 시토신 데옥시리보뉴클레오티드 및 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 상응하는 기준 뉴클레오티드와 비교하여 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연적으로 발생하는 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 그의 당, 핵염기 및/또는 포스페이트 기에서 하나 이상의 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 상응하는 기준 뉴클레오티드에 접합된 하나 이상의 화학적 모이어티를 갖는다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드가 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 열 안정성, 분해에 대한 저항성, 뉴클레아제 저항성, 용해도, 생체이용성, 생체활성, 감소된 면역원성 등을 개선할 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 리보스 고리의 2' 위치에 2'-O-메틸 또는 2'-F 치환을 포함한다.
틈이 있는 테트라루프 구조: "틈이 있는 테트라루프 구조"는 별도 센스 (패신저) 가닥과 안티센스 (가이드) 가닥의 존재를 특징으로 하는 RNAi 올리고뉴클레오티드의 구조이며, 여기서 센스 가닥은 2개의 가닥이 이중나선을 형성하도록 안티센스 가닥에 대해 상보성의 영역을 가지고, 가닥 중 적어도 하나, 일반적으로 센스 가닥은 연장부가 테트라루프 및 테트라루프에 인접한 줄기 영역을 형성하는 2개의 자기-상보적 서열을 함유하는 이중나선으로부터 연장되며, 여기서 테트라루프는 적어도 하나의 가닥의 자기-상보적 서열에 의해 형성된 인접 줄기 영역을 안정화하도록 구성된다.
올리고뉴클레오티드: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드"는, 예를 들어 길이에서 100개 미만의 뉴클레오티드의 짧은 핵산을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 예를 들어 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 이중나선 영역을 가지거나 가지지 않을 수 있다. 일련의 비-제한적 예로서, 올리고뉴클레오티드는 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 다이서 기질 간섭 RNA (dsiRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 siRNA 또는 단일-가닥 siRNA일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 RNAi 올리고뉴클레오티드이다.
오버행: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "오버행"은 한 가닥 또는 영역이 이중나선를 형성하는 상보적 가닥의 말단을 넘어 연장되는 한 가닥 또는 영역으로부터 생성된 말단 비-염기-쌍 뉴클레오티드(들)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 오버행은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에서 이중나선 영역으로부터 연장되는 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 오버행은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 상의 3' 또는 5' 오버행이다.
포스페이트 유사체: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포스페이트 유사체"는 포스페이트 기의 정전기적 및/또는 입체적 특성을 모방하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 유사체는 종종 효소적 제거에 민감한 5'-포스페이트 대신 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드에 위치한다. 일부 실시형태에서, 5' 포스페이트 유사체는 포스파타제-저항성 연결을 함유한다. 포스페이트 유사체의 예는 5' 포스포네이트, 예컨대 5' 메틸렌 포스포네이트 (5'-MP) 및 5'-(E)-비닐 포스포네이트 (5'-VP)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에서 당의 4'-탄소 위치에 포스페이트 유사체 ("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)를 갖는다. 4'-포스페이트 유사체의 예는 옥시메틸 기의 산소 원자가 당 모이어티에 (예를 들어, 그의 4'-탄소에서) 결합된 옥시메틸 포스포네이트 또는 그의 유사체이다. 예를 들어, 2017년 9월 1일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2017/049909, 2016년 9월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 62/383,207 및 2016년 9월 12일에 출원된 62/393,401을 참고하고, 포스페이트 유사체와 관련한 그 각각의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 대한 다른 변형이 개발되었다 (예를 들어, WO 2011/133871; 미국 특허 번호 8,927,513; 및 Prakash 등 (2015), Nucleic Acids Res., 43(6):2993-3011을 참고하고, 포스페이트 유사체와 관련한 그 각각의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다).
감소된 발현: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 유전자의 "감소된 발현"이라는 용어는 적절한 기준 세포 또는 대상체와 비교하여 세포 또는 대상체에서 유전자에 의해 인코딩되는 RNA 전사체 또는 단백질의 양에서 감소 및/또는 유전자의 활성의 양에서 감소를 지칭한다. 예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, CYP27A1 mRNA 서열에 상보적인 안티센스 가닥을 갖는 것)로 세포를 처리하는 행위는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 세포와 비교하여 RNA 전사체, 단백질 및/또는 효소 활성 (예를 들어, CYP27A1 유전자에 의해 인코딩된 것)의 양에서 감소를 초래할 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 사용된 "발현을 감소시키는 것"은 유전자 (예를 들어, CYP27A1)의 감소된 발현을 초래하는 행위를 지칭한다.
상보성의 영역: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성의 영역"은 적절한 혼성화 조건 하에서, 예를 들어 포스페이트 완충액, 세포 등에서 뉴클레오티드의 두 서열 사이의 혼성화를 허용하도록 뉴클레오티드의 역평행 서열 (예를 들어, mRNA 내의 표적 뉴클레오티드 서열)에 충분히 상보적인 핵산 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드)의 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 상보성의 영역은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, mRNA 내에 존재하는 표적 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부)에 완전히 상보적일 수 있다. 예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적인 상보성의 영역은 mRNA에서의 상응하는 서열에 대해 어떠한 미스매치 또는 갭도 없이 상보적인 뉴클레오티드의 인접 서열을 갖는다. 대안적으로, 상보성의 영역은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부)에 부분적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 부분적으로 상보적인 상보성의 영역은, 상보성의 영역이 적절한 혼성화 조건 하에서 mRNA와 혼성화할 수 있는 상태로 남아 있다면, mRNA에서의 상응하는 서열에 상보적이지만 mRNA에서 상응하는 서열과 비교하여 하나 이상의 미스매치 또는 갭 (예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 초과의 미스매치 또는 갭)을 함유하는 뉴클레오티드의 인접 서열을 갖는다.
리보뉴클레오티드: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "리보뉴클레오티드"는 2' 위치에 하이드록실 기를 함유하는 그 오탄당 당으로서 리보스를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 리보뉴클레오티드는 리보스, 포스페이트 기 또는 염기 내 또는 그의 변형 또는 치환을 포함하여 2' 위치가 아닌 원자의 하나 이상의 변형 또는 치환을 갖는 리보뉴클레오티드이다.
RNAi 올리고뉴클레오티드: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "RNAi 올리고뉴클레오티드"는 (a) 센스 가닥 (패신저) 및 안티센스 가닥 (가이드)을 갖는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로, 여기서 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 일부가 표적 mRNA의 절단에서 Argonaute 2 (Ago2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 (b) 단일 안티센스 가닥을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로, 여기서 해당 안티센스 가닥 (또는 그 안티센스 가닥의 일부)은 표적 mRNA의 절단에서 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
가닥: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "가닥"은 뉴클레오티드간 연결 (예를 들어, 포스포디에스테르 연결, 포스포로티오에이트 연결)을 통해 함께 연결된 뉴클레오티드의 단일 인접 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 가닥은 2개의 자유 말단, 예를 들어 5'-말단 및 3'-말단을 갖는다.
대상체: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 마우스, 토끼 및 인간을 포함하는 임의의 포유동물을 의미한다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 영장류이다. 용어 "개체" 또는 "환자"는 "대상체"와 같은 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
합성: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "합성"은 인공적으로 (예를 들어, 기계 (예를 들어, 고체 상태 핵산 합성기)를 사용하여) 합성되거나, 그렇지 않으면 일반적으로 분자를 생산하는 천연 공급원 (예를 들어, 세포 또는 유기체)로부터 유래되지 않은 핵산 또는 기타 분자를 지칭한다.
표적화 리간드: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "표적화 리간드"는 관심 있는 조직 또는 세포의 동족 분자 (예를 들어, 수용체)에 선택적으로 결합하고 관심 있는 조직 또는 세포에 다른 물질을 표적화하기 위한 목적으로 다른 물질에 접합할 수 있는 분자 (예를 들어, 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질)를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 올리고뉴클레오티드를 관심 있는 특정 조직 또는 세포로 표적화하기 위한 목적으로 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 세포 표면 수용체에 선택적으로 결합한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드에 접합되는 경우 표적화 리간드는 세포의 표면 상에 발현된 수용체에 대한 선택적 결합 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복합체의 세포에 의한 엔도솜 내재화, 리간드 및 수용체 표적화를 통해 특정 세포 안으로 올리고뉴클레오티드의 전달을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 올리고뉴클레오티드가 세포 내 표적화 리간드로부터 방출되도록 세포 내재화에 이어서 또는 그 동안 절단되는 링커를 통해 올리고뉴클레오티드에 접합된다.
테트라루프: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "테트라루프"는 뉴클레오티드의 측접하는 서열의 혼성화에 의해 형성된 인접 이중나선의 안정성을 증가시키는 루프를 지칭한다. 안정성의 증가는 뉴클레오티드의 무작위로 선택된 서열로 구성된 비슷한 길이의 일련의 루프로부터 평균적으로 예상되는 인접 줄기 이중나선의 Tm보다 높은 인접 줄기 이중나선의 용융 온도 (Tm)에서의 증가로 감지할 수 있다. 예를 들어, 테트라루프는 적어도 2개의 염기 쌍 길이의 이중나선을 포함하는 헤어핀에 10mM NaHPO4에서 적어도 50℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 용융 온도를 부여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 테트라루프는 적층 상호작용에 의해 인접 줄기 이중나선에서 염기 쌍을 안정화할 수 있다. 부가하여, 테트라루프에서 뉴클레오티드 간의 상호작용은 비-왓슨-크릭 염기-쌍, 적층 상호작용, 수소 결합 및 접촉 상호작용을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (Cheong 등, Nature 1990 Aug. 16; 346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991 Jul. 12; 253(5016):191-4). 일부 실시형태에서, 테트라루프는 3 내지 6개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되고, 전형적으로 4 내지 5개의 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 테트라루프는 3개, 4개, 5개 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되며, 이는 변형될 수 있거나 변형되지 않을 수 있다 (예를 들어, 표적화 모이어티에 접합되거나 접합되지 않을 수 있음). 일 실시형태에서, 테트라루프는 4개의 뉴클레오티드로 구성된다. 임의의 뉴클레오티드가 테트라루프에 사용될 수 있고 이러한 뉴클레오티드에 대한 표준 IUPAC-IUB 기호는 Cornish-Bowden (1985) NUCL. ACIDS RES. 13: 3021-3030에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문자 "N"은 임의의 염기가 그 위치에 있을 수 있음을 의미하기 위해 사용될 수 있고, 문자 "R"은 A (아데닌) 또는 G (구아닌)가 그 위치에 있을 수 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있고, "B"는 C (시토신), G (구아닌) 또는 T (티민)이 그 위치에 있을 수 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 테트라루프의 예에는 테트라루프의 UNCG 패밀리 (예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리 (예를 들어, GAAA) 및 CUUG 테트라루프를 포함한다 (Woese 등, Proc Natl Acad Sci USA. 1990 November; 87(21):8467-71; Antao 등, Nucleic Acids Res. 1991 Nov. 11; 19(21):5901-5). DNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리 (예를 들어, d(GTTA)), 테트라루프의 d(GNRA) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리 및 테트라루프의 d(TNCG) 패밀리 (예를 들어, d(TTCG))를 포함한다. 예를 들어: Nakano 등 BIOCHEMISTRY, 41 (48), 14281-14292, 2002. SHINJI 등 NIPPON KAGAKKAI KOEN YOKOSHU VOL. 78th; NO. 2; PAGE. 731 (2000)을 참고하며, 이는 그 관련 개시내용을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 테트라루프는 틈이 있는 테트라루프 구조 내에 함유된다.
치료하다: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다"는 기존 병태 (예를 들어, 질환, 장애)와 관련하여 대상체의 건강 및/또는 웰빙을 개선할 목적으로 또는 병태의 발생 가능성을 예방 또는 감소시키기 위해 치료를 필요로 하는 대상체에게, 예를 들어 대상체에게 치료제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 투여를 통해 치료를 제공하는 행위를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료는 대상체에 의해 경험된 병태 (예를 들어, 질환, 장애)의 적어도 하나의 징후, 증상 또는 기여 인자의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 포함한다.
Ⅱ. 올리고뉴클레오티드-기반 억제제
i. CYP27A1 표적화 올리고뉴클레오티드
다수의 상이한 종 (인간, 붉은털 원숭이 및 마우스 (예를 들어, 실시예 1 참고))의 mRNA를 포함하는 CYP27A1 mRNA의 검사 및 시험관내 및 생체내 시험을 통해 강력한 올리고뉴클레오티드가 본 명세서에서 동정되었다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 CYP27A1 활성을 감소시키고, 결과적으로 담즙산 수준 및/또는 간 섬유증을 감소시킴에 의해 담즙산 축적을 경험하고/하거나 간 간담도 질환이 있는 대상체에 대한 치료적 이점을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 부록 A에 제공된 표에 배열된 바와 같이, 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 센스 가닥 및 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 및 788 중 임의의 하나로부터 선택된 상보적 서열을 포함하거나 이로 구성된 안티센스 가닥 (예를 들어, 서열번호: 577에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥 및 서열번호: 579에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥)을 갖는 강력한 RNAi 올리고뉴클레오티드가 본 명세서에 제공된다. 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같이 다수의 상이한 구조 (또는 포맷)로 배치될 수 있다.
일부 실시형태에서, CYP27A1 mRNA의 특정 영역은 올리고뉴클레오티드-기반 억제에 대해 다른 영역보다 더 순응성이기 때문에 표적화를 위한 핫스팟인 것으로 밝혀졌다. 일부 실시형태에서, CYP27A1의 핫스팟 영역은 서열번호: 767-781 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. CYP27A1 mRNA의 이들 영역은 CYP27A1 mRNA 발현을 억제하는 목적으로 본 명세서에 논의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적화될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 세포에서 mRNA를 표적화하고 그의 발현을 억제하는 목적으로 CYP27A1 mRNA에 상보성의 영역 (예를 들어, CYP27A1 mRNA의 핫스팟 내)을 갖도록 설계된다. 상보성의 영역은 일반적으로 그 발현을 억제하는 목적으로 CYP27A1 mRNA에 대한 올리고뉴클레오티드 (또는 이의 가닥)의 어닐링을 가능하게 하는 적절한 길이 및 염기 함량의 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드는, CYP27A1 mRNA의 핫스팟 영역 내에 매핑되는 서열을 포함하는, 서열번호: 1-288, 615-686 및 789 중 임의의 하나에 제시된 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 상보성의 영역 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1-288, 615-686 및 789 중 임의의 하나에 제시된 서열에 완전히 상보적인 상보성의 영역 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호: 1-288, 615-686 및 789 중 임의의 하나에 제시된 서열의 인접 뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 상보성의 영역은 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호: 1-288, 615-686 및 789 중 임의의 하나에 제시된 서열의 인접 뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 상보성의 영역은 안티센스 가닥의 전체 길이의 일부 (예를 들어, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 2개를 제외한 모든 뉴클레오티드)에 걸쳐 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 577-578, 581-597, 및 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열의 뉴클레오티드 1-19에 걸쳐 있는 뉴클레오티드의 인접 스트레치에 적어도 부분적으로 (예를 들어, 완전히) 상보적인 상보성의 영역 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상보성의 영역은 길이에서 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 길이에서 12 내지 30 (예를 들어, 12 내지 30, 12 내지 22, 15 내지 25, 17 내지 21, 18 내지 27, 19 내지 27, 또는 15 내지 30) 뉴클레오티드의 범위인 CYP27A1 mRNA에 대한 상보성의 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 길이에서 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 뉴클레오티드인 CYP27A1 mRNA에 대한 상보성의 영역을 갖는다.
일부 실시형태에서, CYP27A1 mRNA에 대한 상보성의 영역은 CYP27A1 mRNA의 상응하는 서열과 비교하여 하나 이상의 미스매치를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드 상의 상보성의 영역은 적절한 혼성화 조건하에서 CYP27A1 mRNA와 상보적 염기 쌍을 형성하는 능력을 유지한다면 최대 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개 등의 미스매치를 가질 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 상의 상보성의 영역은 적절한 혼성화 조건하에서 CYP27A1 mRNA와 상보적 염기 쌍을 형성하는 능력을 유지한다면 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하 또는 4개 이하의 미스매치를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 상보성의 영역에 하나 초과의 미스매치가 있는 경우, 올리고뉴클레오티드가 적절한 혼성화 조건하에서 CYP27A1 mRNA와 상보적 염기 쌍을 형성하는 능력을 유지한다면 상보성의 영역 전반에 걸쳐 연속적으로 (예를 들어, 일렬로 2, 3, 4 또는 그 초과) 위치되거나 산재될 수 있다.
여전히, 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 부록 A에 제공된 표에 배열된 바와 같이, 서열번호: 1-288, 615-686 및 789 중 임의의 하나에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥 및 서열번호: 289-576으로부터 선택된 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하거나 이로 구성된다 (예를 들어, 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥 및 서열번호: 289에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥).
ii. 올리고뉴클레오티드 구조
RNAi, miRNA 등을 포함하여, 본 개시내용의 방법에서 CYP27A1 mRNA를 표적화하는데 유용한 올리고뉴클레오티드의 다양한 구조가 있다. 본 명세서 또는 다른 곳에서 기술된 임의의 구조는 본 명세서에 기술된 서열 (예를 들어, 서열번호: 767-781에 예시된 것과 같은 CYP27A1의 핫팟 서열)을 혼입 또는 표적화하기 위한 프레임워크로서 사용될 수 있다. (예를 들어, RNAi 경로를 통한) CYP27A1 발현을 표적화하기 위한 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 서로 이중나선을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는다. 일부 실시형태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 공유 원자가로 연결되지 않는다. 그러나, 일부 실시형태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 공유 원자가로 연결된다.
일부 실시형태에서, CYP27A1 발현을 감소시키기 위한 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 (RNAi)에 계합한다. 예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드는 1 내지 5개 뉴클레오티드 중 적어도 하나의 3' 오버행을 갖는 19-25개 뉴클레오티드의 크기를 갖는 각 가닥으로 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,372,968 참고). 활성 RNAi 생성물을 생성하기 위해 다이서 효소에 의해 처리되는 더 긴 올리고뉴클레오티드도 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,883,996 참고). 추가 작업은 가닥 중 하나가 열역학적으로-안정화되는 테트라루프 구조를 포함하는 구조를 포함하여, 적어도 하나의 가닥의 적어도 하나의 말단이 이중나선 표적화 영역을 넘어 연장되는 연장된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 생성했다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,513,207 및 8,927,705, 뿐만 아니라 WO2010033225을 참고하며, 이는 이들 올리고뉴클레오티드의 그 개시내용에 대해 본 명세서에 참고로 포함된다). 이러한 구조는 단일-가닥 연장 (분자의 한쪽 또는 양쪽 상에 있음)뿐만 아니라 이중-가닥 연장을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 서열은 둘 모두 길이에서 17 내지 36개 뉴클레오티드의 범위인 별도 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 내로 합체되거나 이를 사용하여 표적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 그 센스 가닥의 3' 연장부 내에 테트라루프 구조 및 별도 안티센스 가닥의 3' 말단에서 2개의 말단 오버행 뉴클레오티드를 갖는 이러한 서열을 합체하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 2개의 말단 오버행 뉴클레오티드는 GG이다. 전형적으로, 안티센스 가닥의 2개의 말단 GG 뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두는 표적에 상보적이거나 상보적이지 않다.
일부 실시형태에서, 둘 모두 21 내지 23개 뉴클레오티드 범위의 길이를 갖는 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 이러한 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 1 또는 2개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 센스, 안티센스, 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두에 3' 오버행이 제공된다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 23개 뉴클레오티드의 가이드 가닥 및 21개 뉴클레오티드의 패신저 가닥을 갖고, 여기서 패신저 가닥의 3'-말단 및 가이드 가닥의 5'-말단은 평활 말단을 형성하고 가이드 가닥은 2개의 뉴클레오티드 3' 오버행을 갖는다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 21 내지 23개 뉴클레오티드 범위 내의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단에 오버행 (예를 들어, 길이에서 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드의 것)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)는 표적 RNA에 대한 안티센스인 21개 뉴클레오티드 가이드 가닥 및 상보적 패신저 가닥을 포함할 수 있으며, 여기서 두 가닥 모두 어닐링되어 19-bp 이중나선를 형성하고 2개 뉴클레오티드는 3' 말단의 어느 하나 또는 둘 모두에 오버행된다. 예를 들어, US9012138, US9012621 및 US9193753을 참고하고, 이들 각각의 내용은 그 관련 개시내용에 대해 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 안티센스-센스 이중나선을 넘어 연장되는 영역을 포함하는 36개 뉴클레오티드 센스 가닥을 갖고, 여기서 연장 영역은 줄기-테트라루프 구조를 가지며 여기서 줄기는 6개 염기 쌍 이중나선이고 테트라루프는 4개 뉴클레오티드를 갖는다. 이들 중 특정 실시형태에서, 테트라루프 뉴클레오티드 중 3개 또는 4개는 각각 1가 GalNac 리간드에 접합된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다이서 효소에 의해 작용될 때 성숙한 RISC 안으로 통합되는 안티센스 가닥을 초래하는 25개 뉴클레오티드 센스 가닥 및 27개 뉴클레오티드 안티센스 가닥을 포함한다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 다른 올리고뉴클레오티드 디자인은 16-mer siRNA (예를 들어, Nucleic Acids in Chemistry and Biology. Blackburn (ed.), Royal Society of Chemistry, 2006 참고), shRNA (예를 들어, 19 bp 또는 그보다 짧은 줄기를 가짐; 예를 들어 Moore 등 Methods Mol. Biol. 2010; 629:141-158 참고), 평활 siRNA (예를 들어, 길이 19 bp의 것, 예를 들어, Kraynack and Baker, RNA Vol. 12, p163-176 (2006) 참고), 비대칭 siRNA (aiRNA; 예를 들어, Sun 등, NAT. BIOTECHNOL. 26, 1379-1382 (2008) 참고), 비대칭 짧은-이중나선 siRNA (예를 들어, Chang 등, MOL THER. 2009 Apr; 17(4): 725-32 참고), 포크 siRNA (예를 들어, Hohjoh, FEBS LETTERS, Vol 557, issues 1-3; Jan 2004, p 193-198 참고), 단일-가닥 siRNA (Elsner; NATURE BIOTECHNOLOGY 30, 1063 (2012)), 덤벨-형상 원형 siRNA (예를 들어, Abe 등 J AM CHEM SOC 129: 15108-15109 (2007) 참고), 및 작은 내부 분할 간섭 RNA (sisiRNA; 예를 들어, Bramsen 등, NUCLEIC ACIDS RES. 2007 Sep; 35 (17): 5886-5897 참고)를 포함한다. 각각의 전술한 참고문헌은 그 안에 관련된 개시내용에 대해 그 전체가 참고로 포함된다. CYP27A1의 발현을 감소 또는 억제하기 위해 일부 실시형태에서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 구조의 추가의 비-제한적인 예는 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 짧은 siRNA이다 (예를 들어, Hamilton 등, EMBO J., 2002, 21 (17): 4671-4679 참고; 또한 미국 출원 번호 20090099115 참고).
a. 안티센스 가닥
일부 실시형태에서, CYP27A1을 표적화하기 위한 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 289-576, 687-758, 및 790 또는 579-580, 598-614, 763-766, 786, 788, 및 792 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 289-576, 687-758, 790 또는 579-580, 598-614, 763-766, 786, 788, 및 792 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 서열의 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개) 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 길이에서 최대 40개 뉴클레오티드 (예를 들어, 최대 40개, 최대 35개, 최대 30개, 최대 27개, 최대 25개, 최대 21개, 최대 19개, 최대 17개 또는 최대 12개 뉴클레오티드 길이)의 안티센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 적어도 12개 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 19개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 25개, 적어도 27개, 적어도 30개, 또는 적어도 35개 또는 적어도 38개 뉴클레오티드 길이)의 안티센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 12 내지 40개 (예를 들어, 12 내지 40, 12 내지 36, 12 내지 32, 12 내지 28, 15 내지 40, 15 내지 36, 15 내지 32, 15 내지 28, 17 내지 22, 17 내지 25, 19 내지 27, 19 내지 30, 20 내지 40, 22 내지 40, 25 내지 40, 또는 32 내지 40) 뉴클레오티드의 범위인 안티센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 "가이드 가닥"으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 가닥이 RNA-유도 사일런싱 복합체 (RISC)와 계합하고 Argonaut 단백질에 결합하거나 하나 이상의 유사한 인자와 계합하거나 이에 결합하고, 표적 유전자의 사일런싱을 지시할 수 있는 경우, 그것은 가이드 가닥으로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 가닥에 상보적인 센스 가닥은 "패신저 가닥"으로 지칭될 수 있다.
b. 센스 가닥
일부 실시형태에서, CYP27A1을 표적화하기 위해 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1-288, 615-686 및 789 또는 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 센스 가닥 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1-288, 615-686 및 789 또는 577-578, 581-597, 759-762, 785 및 787 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 서열의 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개) 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는 센스 가닥을 갖는다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 최대 40개 뉴클레오티드 (예를 들어, 최대 40개, 최대 36개, 최대 30개, 최대 27개, 최대 25개, 최대 21개, 최대 19개, 최대 17개 또는 최대 12개 뉴클레오티드 길이)의 센스 가닥 (또는 패신저 가닥)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 적어도 12개 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 19개, 적어도 21개, 적어도 25개, 적어도 27개, 적어도 30개, 또는 적어도 36개 또는 적어도 38개 뉴클레오티드 길이)의 센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 12 내지 40개 (예를 들어, 12 내지 40, 12 내지 36, 12 내지 32, 12 내지 28, 15 내지 40, 15 내지 36, 15 내지 32, 15 내지 28, 17 내지 21, 17 내지 25, 19 내지 27, 19 내지 30, 20 내지 40, 22 내지 40, 25 내지 40, 또는 32 내지 40) 뉴클레오티드의 범위인 센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 뉴클레오티드의 센스 가닥을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 센스 가닥은 그의 3'-말단에 줄기-루프 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 그의 5'-말단에 줄기-루프 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 줄기는 길이에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 염기 쌍의 이중나선이다. 일부 실시형태에서, 줄기-루프는 분자에 분해 (예를 들어, 효소 분해)에 대한 더 나은 보호를 제공하고 표적 세포로의 전달을 위한 표적화 특성을 용이하게 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 루프는 올리고뉴클레오티드의 유전자 발현 억제 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 변형이 이루어질 수 있는 추가된 뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥이 (예를 들어, 그의 3'-말단에서) S1-L-S2로 제시된 줄기-루프를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 본 명세서에 제공되며, 여기서 S1은 S2에 상보적이고, L은 길이에서 최대 10개 뉴클레오티드 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오티드 길이)의 S1과 S2 사이에 루프를 형성한다. 도 2는 이러한 올리고뉴클레오티드의 비-제한적인 예를 묘사한다.
일부 실시형태에서, 줄기-루프의 루프 (L)는 테트라루프 (예를 들어, 틈이 있는 테트라루프 구조 내)이다. 테트라루프는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 이들의 조합을 함유할 수 있다. 전형적으로 테트라루프는 4 내지 5개 뉴클레오티드를 갖는다.
c. 이중나선 길이
일부 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 형성된 이중나선은 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 또는 적어도 21개) 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 형성된 이중나선은 12-30개 뉴클레오티드 범위 (예를 들어, 12 내지 30개, 12 내지 27개, 12 내지 22개, 15 내지 25개, 18 내지 30개, 18 내지 22개, 18 내지 25개, 18 내지 27개, 18 내지 30개, 19 내지 30개 또는 21 내지 30개 뉴클레오티드 길이)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 이중나선은 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 형성된 이중나선은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 있지 않는다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 이중나선은 센스 또는 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 이중나선은 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두의 전체 길이에 걸쳐 있다.
d. 올리고뉴클레오티드 말단
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두 상에 3'-오버행이 있도록 센스 및 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 다른 5' 말단에 비해 열역학적으로 덜 안정한 하나의 5' 말단을 갖는다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 3' 말단에 평활 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 오버행를 포함하는 비대칭 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥 상의 3' 오버행은 1-8개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 뉴클레오티드 길이)를 갖는다.
전형적으로, RNAi에 대한 올리고뉴클레오티드는 안티센스 (가이드) 가닥의 3' 말단 상에 2개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 그러나, 다른 오버행이 가능하다. 일부 실시형태에서, 오버행은 1 내지 6개 뉴클레오티드, 선택적으로 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 2 내지 3개, 3 내지 6개, 3 내지 5개, 3 내지 4개, 4 내지 6개, 4 내지 5개, 5 내지 6개 뉴클레오티드, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 뉴클레오티드의 길이를 포함하는 3' 오버행이다. 그러나, 일부 실시형태에서, 오버행은 1 내지 6개 뉴클레오티드, 선택적으로 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 2 내지 3개, 3 내지 6개, 3 내지 5개, 3 내지 4개, 4 내지 6개, 4 내지 5개, 5 내지 6개 뉴클레오티드, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 뉴클레오티드의 길이를 포함하는 5' 오버행이다.
일부 실시형태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단의 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4) 말단 뉴클레오티드가 변형된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단의 1개 또는 2개의 말단 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 마지막 뉴클레오티드는 변형되고, 예를 들어 2'-변형, 예를 들어 2'-O-메톡시에틸을 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 마지막 1개 또는 2개의 말단 뉴클레오티드는 표적에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 마지막 1개 또는 2개의 뉴클레오티드는 표적에 상보적이지 않다. 일부 실시형태에서, 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단은 역상의 캡 뉴클레오티드를 갖는다.
e. 미스매치
일부 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)의 미스매치가 있다. 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 하나 초과의 미스매치가 있는 경우, 그것은 연속적으로 (예를 들어, 일렬로 2개, 3개 또는 그 초과) 배치되거나 상보성의 영역 전체에 걸쳐 산재될 수 있다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 3' 종단은 하나 이상의 미스매치를 함유한다. 일 실시형태에서, 2개의 미스매치가 센스 가닥의 3' 종단에 합체된다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥의 3'-말단에서 분절의 염기 미스매치 또는 불안정화는 아마도 다이서에 의한 처리를 용이하게 함을 통해 RNAi에서 합성 이중나선의 효능을 개선시켰다.
iii. 단일-가닥 올리고뉴클레오티드
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CYP27A1 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 이러한 구조는 단일-가닥 RNAi 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 최근의 노력은 단일-가닥 RNAi 올리고뉴클레오티드의 활성을 입증했다 (예를 들어, Matsui 등 (May 2016), Molecular Therapy, Vol. 24(5), 946-955 참고). 그러나, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 쓰여질 때 특정 핵산의 표적화된 세그먼트의 역 상보체를 포함하고, 세포에서 그 표적 RNA의 RNaseH 매개 절단을 유도하기 위해 (예를 들어, gapmer로서) 또는 세포에서 표적 mRNA의 번역을 억제하기 위해 (예를 들어, mixmer로서) 적절하게 변형되는 핵염기 서열을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 미국 특허 번호 9,567,587에 나타난 바와 같은 것을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 적절한 방식으로 변형될 수 있으며, 이는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 변형 (예를 들어, 핵염기(피리미딘, 퓨린)의 길이, 당 모이어티, 및 핵염기의 헤테로사이클릭 부분의 변경을 포함)에 관한 그 개시내용에 대해 본 명세서에 참고로 포함된다. 추가로, 안티센스 분자는 특정 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔다 (예를 들어, Bennett 등; PHARMACOLOGY OF ANTISENSE DRUGS, ANNUAL REVIEW OF PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY, Vol. 57: 81-105 참고).
iv. 올리고뉴클레오티드 변형
올리고뉴클레오티드는 특이성, 안정성, 전달, 생체이용성, 뉴클레아제 분해로부터 저항성, 면역원성, 염기-쌍 특성, RNA 분포와 세포 흡수 및 치료 또는 연구 용도와 관련된 기타 특징을 개선하거나 제어하기 위해 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, Bramsen 등, Nucleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881; Bramsen and Kjems (FRONTIERS IN GENETICS, 3 (2012): 1-22)을 참고한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 적합한 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 그의 염기 (또는 핵염기), 당 (예를 들어, 리보스, 데옥시리보스), 또는 포스페이트 기에서 변형을 갖는다.
올리고뉴클레오티드 상의 변형의 수 및 이들 뉴클레오티드 변형의 위치는 올리고뉴클레오티드의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 지질 나노입자 (LNP) 또는 유사한 담체에 이들을 접합하거나 그 안에 이를 포함함에 의해 생체내 전달될 수 있다. 그러나, 올리고뉴클레오티드가 LNP 또는 유사한 담체에 의해 보호되지 않는 경우 (예를 들어, "네이키드 전달"), 그 뉴클레오티드 중 적어도 일부가 변형되는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 임의의 올리고뉴클레오티드의 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오티드의 절반 초과가 변형된다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오티드의 절반 미만이 변형된다. 전형적으로, 네이키드 전달에서, 모든 뉴클레오티드는 그 뉴클레오티드의 당 그룹의 2'-위치에서 변형된다. 이들 변형은 가역성이거나 비가역성이다. 전형적으로, 2' 위치 변형은 2'-플루오로, 2'-O-메틸 등이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드는 원하는 특성 (예를 들어, 효소 분해로부터 보호, 생체내 투여 후 원하는 세포를 표적화하는 능력 및/또는 열역학적 안정성)을 야기하기에 충분한 수 및 유형의 변형된 뉴클레오티드를 갖는다.
a. 당 변형
일부 실시형태에서, 변형된 당 (또한 본 명세서에서 당 유사체로서 지칭됨)은 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함하며, 예를 들어, 여기서 하나 이상의 변형은 당의 2', 3', 4' 및/또는 5' 탄소 위치에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 변형된 당은 또한 잠금 핵산 ("LNA") (예를 들어, Koshkin 등 (1998), TETRAHEDRON 54, 3607-3630 참고), 비잠금 핵산 ("UNA") (예를 들어, Snead 등 (2013), MOLECULAR THERAPY-NUCLEIC ACIDS, 2, e103 참고) 및 가교 핵산 ("BNA") (예를 들어, Imanishi and Obika (2002), The Royal Society of Chemistry, CHEM. COMMUN., 1653-1659 참고)에 존재하는 것과 같은 비-천연 대안적 탄소 구조를 포함할 수 있다. Koshkin 등, Snead 등, 및 Imanishi and Obika는 당 변형에 관한 그의 개시내용에 대해 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 당에서의 뉴클레오티드 변형은 2'-변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2'-변형은 2'-아미노에틸, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산일 수 있다. 전형적으로, 변형은 2'-플루오로, 2'-O-메틸 또는 2'-O-메톡시에틸이다. 그러나, 올리고뉴클레오티드에 사용하기 위해 개발된 매우 다양한 2' 위치 변형이 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드에 이용될 수 있다. 예를 들어, Bramsen 등, Nucleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881을 참고한다. 일부 실시형태에서, 당에서 변형은 당 고리의 변형을 포함하며, 이는 당 고리의 하나 이상의 탄소의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 당의 변형은 당의 2'-탄소와 1'-탄소 또는 4'-탄소 사이의 연결을 포함할 수 있다. 예를 들어, 연결은 에틸렌 또는 메틸렌 브릿지를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-탄소 대 3'-탄소 결합을 결하는 비고리형 당을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는, 예를 들어 당의 4' 위치에 티올 기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 종단 3'-말단 기 (예를 들어, 3'-하이드록실)는 포스페이트 기 또는 다른 기이며, 이는 예를 들어 링커, 어댑터 또는 표지를 부착하거나 다른 핵산에 올리고뉴클레오티드의 직접적인 결찰을 위해 사용될 수 있다.
b. 5' 말단 포스페이트
올리고뉴클레오티드의 5'-종단 포스페이트 기는 Argonaut 2와의 상호작용을 향상시킬 수 있거나 일부 상황에서 향상시킨다. 그러나, 5'-포스페이트 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 포스파타제 또는 다른 효소를 통한 분해에 민감할 수 있으며, 이는 생체내에서 그 생체이용성을 제한할 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 이러한 분해에 내성인 5' 포스페이트의 유사체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트, 비닐포스포네이트 또는 말로닐포스포네이트일 수 있다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 가닥의 5' 말단은 천연 5'-포스페이트 기의 정전기적 및 입체적 특성을 모방하는 화학적 모이어티 ("포스페이트 모방체")에 부착된다 (예를 들어, Prakash 등 (2015), Nucleic Acids Res., Nucleic Acids Res. 2015 Mar 31; 43(6): 2993-3011을 참고하며, 포스페이트 유사체에 관한 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다). 5' 말단에 부착될 수 있는 많은 포스페이트 모방체가 개발되어 왔다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,927,513을 참고하며, 포스페이트 유사체에 관한 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다). 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 대한 다른 변형이 개발되어 왔다 (예를 들어, WO 2011/133871을 참고하며, 포스페이트 유사체에 관한 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다). 특정 실시형태에서, 하이드록실 기는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 부착된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 당의 4'-탄소 위치에 포스페이트 유사체를 갖는다 ("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨). 예를 들어, 2017년 9월 1일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2017/049909, 2016년 9월 2일에 출원된 4'-포스페이트 유사체 및 이를 포함하는 올리고뉴클레오티드라는 명칭의 미국 가출원 번호 62/383,207 및 4'-포스페이트 유사체 및 이를 포함하는 올리고뉴클레오티드라는 명칭으로 2016년 9월 12일에 출원된 62/393,401을 참고하며, 포스페이트 유사체에 관한 그 각각의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 5'-종단 뉴클레오티드에 4'-포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸 기의 산소 원자가 당 모이어티 (예를 들어, 그의 4'-탄소에서) 또는 그의 유사체에 결합된 옥시메틸 포스포네이트이다. 다른 실시형태에서, 4'-포스페이트 유사체는 티오메틸 기의 황 원자 또는 아미노메틸 기의 질소 원자가 당 모이어티 또는 그의 유사체의 4'-탄소에 결합된 티오메틸 포스포네이트 또는 아미노메틸 포스포네이트이다. 특정 실시형태에서, 4'-포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트이다. 일부 실시형태에서, 옥시메틸 포스포네이트는 식 -O-CH2-PO(OH)2 또는 -O-CH2-PO(OR)2로 표시되며, 여기서 R은 H, CH3, 알킬 기, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3, 또는 보호기로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, 알킬 기는 CH2CH3이다. 보다 전형적으로, R은 H, CH3, 또는 CH2CH3으로부터 독립적으로 선택된다.
c. 변형된 뉴클레오시드간 연결
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 변형 또는 치환은 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개)의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나는 1 내지 10개 (예를 들어, 1 내지 10개, 2 내지 8개, 4 내지 6개, 3 내지 10개, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개 또는 1 내지 2개)의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 포스포라미다이트 연결, 포스포네이트 연결 또는 보라노포스페이트 연결일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 하나의 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
d. 염기 변형
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 핵염기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 핵염기 (본 명세서에서 염기 유사체로도 지칭됨)는 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에서 연결된다. 특정 실시형태에서, 변형된 핵염기는 질소성 염기이다. 특정 실시형태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 20080274462를 참고한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 보편적인 염기를 포함한다. 그러나, 특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 핵염기를 함유하지 않는다 (무염기성).
일부 실시형태에서, 보편적인 염기는 변형된 뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 당 부분의 1' 위치, 또는 이중나선으로 존재할 때 이중나선의 구조를 실질적으로 변경하지 않으면서 일 유형의 염기보다 더 반대편에 위치할 수 있는, 뉴클레오티드 당 모이어티 치환에서 등가 위치에 위치한 헤테로사이클릭 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산에 완전히 상보적인 참고 단일-가닥 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 비교하여, 보편적 염기를 함유하는 단일-가닥 핵산은 상보적 핵산으로 형성된 이중나선보다 더 낮은 Tm을 갖는 표적 핵산과 이중나선을 형성한다. 그러나, 일부 실시형태에서, 보편적 염기가 단일 미스매치를 생성하기 위해 염기로 대체된 참고 단일-가닥 핵산과 비교하여, 보편적 염기를 함유하는 단일-가닥 핵산은 미스매치 염기를 포함하는 핵산으로 형성된 이중나선보다 더 높은 Tm을 갖는 표적 핵산과 이중나선을 형성한다.
보편적-결합 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 이노신, 1-β-D-리보푸라노실-5-니트로인돌, 및/또는 1-β-D-리보푸라노실-3-니트로피롤을 포함한다 (Quay 등의 미국 특허 출원 공개 번호 20070254362; Van Aerschot 등, An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambuous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 Nov 11;23(21):4363-70; Loakes 등, 3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. NUCLEIC ACIDS RES. 1995 Jul 11;23(13):2361-6; Loakes and Brown, 5-Nitroindole as an universal base analogue. NUCLEIC ACIDS RES. 1994 Oct 11; 22(20):4039-43. 상기의 각각은 염기 변형에 관한 그의 개시내용에 대해 본 명세서에 참고로 포함된다).
e. 가역적 변형
표적 세포에 도달하기 전에 생체내 환경으로부터 올리고뉴클레오티드를 보호하기 위한 특정 변형이 이루어질 수 있지만, 일단 그것이 표적 세포의 세포질에 도달하면 올리고뉴클레오티드의 효능 또는 활성을 감소시킬 수 있다. 분자가 세포의 외부에서 바람직한 특성을 유지하도록 가역적 변형이 이루어질 수 있으며, 이는 그 다음 세포의 세포질 환경에 들어갈 때 제거된다. 가역적 변형은, 예를 들어, 세포내 효소의 작용 또는 세포의 내부 화학적 조건에 의해 (예를 들어, 세포내 글루타티온에 의한 환원을 통해) 제거될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가역적으로 변형된 뉴클레오티드는 글루타티온-민감성 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 핵산 분자는 뉴클레오티드간 디포스페이트 연결에 의해 생성된 음전하를 차폐하고 세포 흡수 및 뉴클레아제 저항성을 개선하기 위해 환형 디설파이드 모이어티로 화학적으로 변형되었다. Traversa Therapeutics, Inc. ("Traversa")에 원래 양도된 미국 공개 출원 번호 2011/0294869, Solstice Biologics, Ltd. ("Solstice")의 PCT 공개 번호 WO 2015/188197, Meade 등, NATURE BIOTECHNOLOGY, 2014,32:1256-1263 ("Meade"), Merck Sharp & Dohme Corp의 PCT 공개 번호 WO 2014/088920를 참고하며, 이들 각각은 이러한 변형의 그 개시내용에 대해 참고로 포함된다. 뉴클레오티드간 디포스페이트 연결의 이 가역적 변형은 세포질 (예를 들어, 글루타티온)의 환원 환경에 의해 세포내에서 절단되도록 설계되었다. 이전의 예는 세포 내부에서 절단 가능한 것으로 보고된 중화 포스포트리에스테르 변형을 포함한다 (Dellinger 등 J. AM. CHEM. SOC. 2003,125:940-950).
일부 실시형태에서, 이러한 가역적 변형은 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 및 기타 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 노출될 생체내 투여 (예를 들어, 혈액 및/또는 세포의 리소솜/엔도솜 구획을 통한 통과) 동안 보호를 허용한다. 세포외 공간에 비해 글루타티온의 수준이 더 높은 세포의 세포질로 방출될 때, 변형이 역전되고 그 결과 절단된 올리고뉴클레오티드가 된다. 가역적인 글루타티온 민감성 모이어티를 사용하면, 비가역적 화학적 변형을 사용하여 이용할 수 있는 옵션과 비교하여 관심 있는 올리고뉴클레오티드에 입체적으로 더 큰 화학 기를 도입하는 것이 가능하다. 이는 이들 더 큰 화학 기가 세포질에서 제거될 것이고 따라서 세포의 세포질 내부에서 올리고뉴클레오티드의 생물학적 활성을 방해하지 않아야 하기 때문이다. 결과적으로, 이들 더 큰 화학 기는 뉴클레아제 저항성, 친유성, 전하, 열 안정성, 특이성 및 감소된 면역원성과 같은 다양한 이점을 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부여하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 글루타티온-민감성 모이어티의 구조는 그 방출의 동력학을 변형시키도록 조작될 수 있다.
일부 실시형태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 뉴클레오티드의 당에 부착된다. 일부 실시형태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 변형된 뉴클레오티드의 당의 2'-탄소에 부착된다. 일부 실시형태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 특히 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 5'-종단 뉴클레오티드인 경우 당의 5'-탄소에 위치한다. 일부 실시형태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 특히 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 3'-종단 뉴클레오티드일 때 당의 3'-탄소에 위치한다. 일부 실시형태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 설포닐 기를 포함한다. 예를 들어, 가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 이의 용도라는 명칭의, 국제 특허 출원 PCT/US2017/048239 및 미국 가출원 번호 62/378,635는 2016년 8월 23일 출원되었으며, 그 내용은 관련 개시내용에 대해 본 명세서에 참고로 포함된다.
v. 표적화 리간드
일부 실시형태에서, 개시내용의 올리고뉴클레오티드를 하나 이상의 세포 또는 하나 이상의 기관으로 표적화하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 전략은 다른 기관에서 바람직하지 않은 영향을 피하는 데 도움이 될 수 있거나, 올리고뉴클레오티드에 유익하지 않을 세포, 조직 또는 기관에 대한 올리고뉴클레오티드의 과도한 손실을 피할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드는 특정 조직, 세포 또는 기관의 표적화를 촉진하기 위해, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 간으로의 전달을 촉진하기 위해 변형될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드는 간의 간세포로의 올리고뉴클레오티드의 전달을 촉진하기 위해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드에 접합된 뉴클레오티드를 포함한다.
표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질의 일부 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편) 또는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 압타머이다. 예를 들어, 표적화 리간드는 종양 혈관계 또는 신경교종 세포를 표적화하는 데 사용되는 RGD 펩티드, 종양 혈관계 또는 기공을 표적화하는 CREKA 펩티드, 트랜스페린, 락토페린 또는 CNS 혈관계 상에 발현된 트랜스페린 수용체를 표적화하는 압타머, 또는 신경교종 세포 상에서 EGFR을 표적화하는 항-EGFR 항체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 표적화 리간드는 하나 이상의 GalNAc 모이어티이다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 뉴클레오티드가 각각 별도의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 2 내지 4개 뉴클레오티드가 각각 별도 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 어느 하나의 말단에서 2 내지 4개 뉴클레오티드에 접합되어 (예를 들어, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 2 내지 4개 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합된다) 표적 리간드가 칫솔의 강모에 유사하고 올리고뉴클레오티드가 칫솔에 유사하도록 된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나에 줄기-루프를 포함할 수 있고 줄기의 루프의 1, 2, 3 또는 4개 뉴클레오티드는, 예를 들어, 2016년 6월 23일에 공개된 국제 특허 출원 공개 WO 2016/100401에서 기술된 바와 같이 표적화 리간드에 개별적으로 접합될 수 있으며, 그 관련 내용이 참고로 본 명세서에 포함된다.
일부 실시형태에서, 대상체의 간의 간세포에 대한 CYP27A1의 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오티드를 표적화하는 것이 바람직하다. 이 목적을 위해 임의의 적합한 간세포 표적화 모이어티가 사용될 수 있다.
GalNAc는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR)에 대한 고친화성 리간드이며, 이는 주로 간세포 세포의 동양 혈관의 표면 상에서 발현되고 종단 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기 (아시알로당단백질)를 함유하는 순환 당단백질의 결합, 내재화 및 후속 제거에 중요한 역할을 한다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드에 대한 GalNAc 모이어티의 접합 (간접적 또는 직접적)은 이들 간세포 세포 상에서 발현된 ASGPR에 대해 이들 올리고뉴클레오티드를 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 1가 GalNAc에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나보다 많은 1가 GalNAc에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다 (즉, 2, 3 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 접합되고, 전형적으로 3 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다). 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2가 GalNAc, 3가 GalNAc, 또는 4가 GalNAc 모이어티에 접합된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 뉴클레오티드가 각각 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시형태에서, 줄기-루프의 루프 (L)의 2 내지 4개 뉴클레오티드는 각각 별도 GalNAc에 접합된다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 어느 하나의 말단에서 2 내지 4개 뉴클레오티드에 접합되어 (예를 들어, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 2 내지 4개 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합된다) GalNAc 모이어티가 칫솔의 강모에 유사하고 올리고뉴클레오티드가 칫솔에 유사하도록 된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나에 줄기-루프를 포함할 수 있고 줄기의 루프의 1, 2, 3 또는 4개 뉴클레오티드는 GalNAc 모이어티에 개별적으로 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, GalNAc 모이어티는 센스 가닥의 뉴클레오티드에 접합된다. 예를 들어, 4개의 GalNAc 모이어티는 센스 가닥의 테트라루프에서 뉴클레오티드에 접합될 수 있으며, 여기서 각 GalNAc 모이어티는 하나의 뉴클레오티드에 접합된다.
적절한 방법 또는 화학 (예를 들어, 클릭 화학)을 사용하여 표적 리간드를 뉴클레오티드에 연결할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 클릭 링커를 사용하여 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 실시형태에서, 아세탈-기반 링커가 표적화 리간드를 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나의 뉴클레오티드에 접합시키기 위해 사용된다. 아세탈-기반 링커는, 예를 들어 2016년 6월 23일에 공개된 국제 특허 출원 공개 번호 WO2016100401 A1에 개시되어 있으며, 이러한 링커에 관련한 그것의 내용은 참고로 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, 링커는 불안정한 링커이다. 그러나, 다른 실시형태에서, 링커는 상당히 안정하다. 일부 실시형태에서, 이중나선 연장부 (최대 3, 4, 5, 또는 6개 염기 쌍 길이)가 표적화 리간드 (예를 들어, GalNAc 모이어티)와 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 사이에 제공된다.
III. 제형
올리고뉴클레오티드 사용을 용이하게 하기 위해 다양한 제형이 개발되었다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 분해를 최소화하거나, 전달 및/또는 흡수를 촉진하거나, 제형에서 올리고뉴클레오티드에 또 다른 유익한 특성을 제공하는 제형을 사용하여 대상체 또는 세포 환경에 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 단일-가닥 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 이러한 조성물은 표적 세포의 즉각적인 환경으로 또는 전신적으로 대상체에게 투여될 때 올리고뉴클레오티드의 충분한 부분이 CYP27A1 발현을 감소시키기 위해 세포에 들어가도록 적합하게 제형화될 수 있다. 다양한 적합한 올리고뉴클레오티드 제형 중 임의의 것이 본 명세서에 개시된 바와 같이 CYP27A1의 감소를 위한 올리고뉴클레오티드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 포스페이트-완충된 염수 용액, 리포솜, 미셀 구조 및 캡시드와 같은 완충액 용액에서 제형화된다.
일부 실시형태에서, 네이키드 올리고뉴클레오티드 또는 이의 접합체는 물 또는 수용액 (예를 들어, pH 조정을 한 물)에서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 네이키드 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합체는 염기성 완충된 수용액 (예를 들어, PBS)에서 제형화된다. 양이온성 지질을 갖는 올리고뉴클레오티드의 제형은 올리고뉴클레오티드의 세포 안으로의 형질감염을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질 예컨대 리포펙틴, 양이온성 글리세롤 유도체, 및 다가양이온성 분자 (예를 들어, 폴리리신)가 사용될 수 있다. 적합한 지질은 올리고펙타민, 리포펙타민 (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., 콜로라도주 볼더 소재) 또는 FuGene 6 (Roche)을 포함하며 이들 모두는 제조업체의 지침에 따라 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 제형은 지질 나노입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부형제는 리포솜, 지질, 지질 복합체, 마이크로구체, 마이크로입자, 나노구체 또는 나노입자를 포함하거나, 이를 필요로 하는 대상체의 세포, 조직, 기관 또는 신체에 투여를 위해 달리 제형화될 수 있다 (예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition, Pharmaceutical Press, 2013 참고).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제형은 부형제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부형제는 조성물에 활성 성분의 개선된 안정성, 개선된 흡수, 개선된 용해도 및/또는 치료적 향상을 부여한다. 일부 실시형태에서, 부형제는 완충제 (예를 들어, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 트리스 염기 또는 수산화나트륨) 또는 비히클 (예를 들어, 완충된 용액, 바셀린, 디메틸 술폭시드, 또는 광유)이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 그의 저장-수명을 연장하기 위해 동결건조된 다음 사용 (예를 들어, 대상체에게 투여) 전에 용액으로 제조된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나를 포함하는 조성물에서의 부형제는 동결보호제 (예를 들어, 만니톨, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 폴리비닐 피롤리돈), 또는 붕괴 온도 조절제 (예를 들어, 덱스트란, 피콜 또는 젤라틴)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 전형적으로. 투여 경로는 정맥내 또는 피하이다.
주사 가능한 사용에 적합한 약학적 조성물은 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적절한 담체는 생리 식염수, 정균수, 크레모퍼 EL.TM. (BASF, 뉴저지주 파시퍼니 소재) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨 및 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 멸균 주사 가능한 용액은 필요에 따라 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 선택된 용매에 필요한 양으로 올리고뉴클레오티드를 혼입하고 이어서 여과 멸균에 의하여 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 활성 성분(들)의 백분율이 총 조성물의 중량 또는 부피의 약 1% 내지 약 80% 또는 그 초과일 수 있지만, 적어도 약 0.1%의 치료제 (예를 들어, CYP27A1 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드) 또는 그 초과를 함유할 수 있다. 용해도, 생체이용성, 생물학적 반감기, 투여의 경로, 제품 저장 수명뿐만 아니라 기타 약리학적 고려사항과 같은 인자는 이러한 약학적 제형을 제조하는 기술분야의 숙련가에 의해 고려될 것이고, 그 자체로 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
비록 다수의 실시형태가 본 명세서에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드의 간-표적화된 전달에 대한 것이지만, 다른 조직의 표적화도 또한 고려된다.
IV. 사용 방법
i. 세포에서 CYP27A1 발현 감소
일부 실시형태에서, 세포에서 CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 목적으로 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나를 유효량으로 세포에 전달하는 방법이 제공된다. 본 명세서에 제공된 방법은 임의의 적절한 세포 유형에서 유용하다. 일부 실시형태에서, 세포는 CYP27A1을 발현하는 임의의 세포 (예를 들어, 간세포, 대식세포, 단핵구-유래 세포, 전립선암 세포, 뇌의 세포, 내분비 조직, 골수, 림프절, 폐, 담낭, 간, 십이지장, 소장, 췌장, 신장, 위장관, 방광, 지방조직과 연조직 및 피부)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 대상체로부터 수득되고 제한된 수의 계대를 겪을 수 있는 1차 세포로 세포가 그의 천연 표현형 특성을 실질적으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드가 전달되는 세포는 생체외 또는 시험관내이다 (즉, 배양 중인 세포 또는 세포가 상주하는 유기체에 전달될 수 있음). 특정 실시형태에서, 단독으로 또는 주로 간세포에서 CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 목적으로 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나를 유효량으로 세포에 전달하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액의 주사, 올리고뉴클레오티드에 의해 덮인 입자에 의한 충격, 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액에 세포 또는 유기체를 노출, 또는 올리고뉴클레오티드의 존재에서 세포막의 전기천공을 포함하는 적절한 핵산 전달 방법을 사용하여 도입될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하기 위한 다른 적절한 방법, 예컨대 지질-매개된 운반체 이송, 화합물-매개된 이송 및 인산칼슘과 같은 양이온성 리포솜 형질감염 등이 사용될 수 있다.
억제의 결과는 세포 또는 대상체의 하나 이상의 특성을 평가하기 위한 적절한 검정에 의해, 또는 CYP27A1 발현을 나타내는 분자 (예를 들어, RNA, 단백질)를 평가하는 생화학적 기술에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드가 CYP27A1의 발현 수준을 감소시키는 정도는 발현 수준 (예를 들어, CYP27A1의 mRNA 또는 단백질 수준을 적절한 대조군 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 전달되지 않았거나 음성 대조군이 전달된 세포 또는 세포의 모집단에서 CYP27A1 발현의 수준)과 비교함에 의해 평가된다. 일부 실시형태에서, CYP27A1 발현의 적절한 대조군 수준은 대조군 수준이 매회 측정될 필요가 없도록 미리결정된 수준 또는 값일 수 있다. 미리결정된 수준 또는 값은 다양한 형태를 취할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미리결정된 수준 또는 값은 중앙값 또는 평균과 같은 단일 컷-오프 값일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드의 투여는 세포에서 CYP27A1 발현의 수준에서 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, CYP27A1 발현의 수준에서 감소는 CYP27A1의 적절한 대조군 수준과 비교하여 1% 이하, 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 또는 90% 이하로 감소일 수 있다. 적절한 대조군 수준은 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드와 접촉되지 않은 세포 또는 세포의 모집단에서의 CYP27A1 발현의 수준일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라 세포로 올리고뉴클레오티드의 전달의 효과는 유한한 기간 후에 평가된다. 예를 들어, CYP27A1의 수준은 올리고뉴클레오티드의 세포 안으로의 도입 후 적어도 8시간, 12시간, 18시간, 24시간; 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 14일에서 세포에서 분석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 세포에서 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 이의 센스 및 안티센스 가닥)를 발현하도록 조작된 이식유전자의 형태로 전달된다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드를 발현하도록 조작된 이식유전자를 사용하여 전달된다. 이식유전자는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 단순 포진 바이러스) 또는 비-바이러스 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 합성 mRNA)를 사용하여 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이식유전자는 대상체에게 직접적으로 주사될 수 있다.
ii. 치료 방법
개시내용의 양태는 예를 들어, 간담도 질환의 맥락에서 담즙산 축적과 연관된 간 섬유증의 치료를 위한 CYP27A1 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 간 섬유증 및/또는 간담도 질환의 위험이 있는 (또는 이에 취약한) 대상체에 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 개시내용은 대상체에게 치료제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 벡터 또는 이식유전자)를 투여함에 의해 대상체에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료되는 대상체는, 예를 들어 간에서 CYP27A1 단백질의 양에서의 감소로부터 치료적으로 이익을 얻을 대상체이다.
본 명세서에 기재된 방법은 전형적으로 올리고뉴클레오티드의 유효량, 즉 바람직한 치료 결과를 생성할 수 있는 양을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 치료적으로 허용 가능한 양은 질환 또는 장애를 치료할 수 있는 양일 수 있다. 임의의 하나의 대상체에 대한 적절한 투여량은 대상체의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여되는 특정 조성물, 조성물의 활성 성분(들), 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되어 지는 다른 약물을 포함한 특정 인자들에 의존할 것이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 하나를 장내로 (예를 들어, 위 영양관에 의해, 십이지장 영양관에 의해, 위루를 통해 또는 직장으로), 비경구적으로 (예를 들어, 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입, 동맥-내 주사 또는 주입, 근육내 주사), 국소로 (예를 들어, 피하, 흡입, 점안액을 통해, 또는 점막을 통해), 또는 표적 기관 (예를 들어, 대상체의 간) 안으로 직접적인 주사로 투여받는다. 전형적으로, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드는 정맥내로 또는 피하로 투여된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 0.1mg/kg 내지 25mg/kg (예를 들어, 1mg/kg 내지 5mg/kg)의 범위인 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 0.1mg/kg 내지 5mg/kg의 범위 또는 0.5mg/kg 내지 5mg/kg의 범위인 용량으로 투여된다.
비-제한적 세트의 예로서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 1년에 1회, 1년에 2회, 분기마다 (3개월마다 1회), 격월마다 (2개월마다 1회), 매월, 또는 매주 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료되는 대상체는 인간 (예를 들어, 인간 환자) 또는 비-인간 영장류 또는 기타 포유동물 대상체이다. 다른 예시적인 대상체는 개 및 고양이와 같은 길들여진 동물; 말, 소, 돼지, 양, 염소 및 닭과 같은 가축; 및 마우스, 랫트, 기니피그 및 햄스터와 같은 동물을 포함한다.
실시예
실시예 1: 인간 및 마우스 세포-기반 검정을 사용한 CYP27A1 올리고뉴클레오티드 억제제의 개발
도 1은 CYP27A1 발현의 억제를 위한 후보 올리고뉴클레오티드를 개발하기 위해 인간 및 마우스-기반 검정을 사용한 작업 흐름을 도시한다. 먼저, 컴퓨터-기반 알고리즘을 사용하여 CYP27A1 억제를 위한 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 생성했다. 그런 다음 CYP27A1 발현을 감소시키는 그 능력에 대한 후보 올리고뉴클레오티드의 평가를 위해 세포-기반 분석 및 PCR 검정을 이용하였다.
컴퓨터 알고리즘은 인간 CYP27A1 mRNA (서열번호: 782, 표 1)에 상보적인 2114개 올리고뉴클레오티드를 제공했으며, 그 중 1084개는 또한 붉은털 (rhesus) CYP27A1 mRNA (서열번호: 783, 표 1)에 상보적이었고 24개는 또한 마우스 CYP27A1 mRNA (서열번호: 784, 표 1)에 상보적이었다. 8개 올리고뉴클레오티드는 인간, 마우스 및 붉은털 CYP27A1 mRNA에 상보적이었다. CYP27A1 mRNA 서열의 예는 표 1에 요약되어 있다.
표 1. 인간, 붉은털 원숭이 및 마우스 CYP27A1 mRNA의 서열
Figure pct00001
알고리즘이 제공한 2114개 올리고뉴클레오티드 중에서 288개 올리고뉴클레오티드가 HepG2 세포-기반 검정에서 실험 평가를 위한 후보로 선택되었다. 이 검정에서, CYP27A1을 발현하는 세포를 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 일정 기간 동안 세포를 유지한 다음 SYBR®-기반 qPCR 검정을 사용하여 남아 있는 CYP27A1 mRNA의 수준을 조사했다. 2개의 qPCR 검정인, 3' 검정 및 5' 검정을 사용하였다. 288개 올리고뉴클레오티드 모두는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 및 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드의 조합을 함유하는 M15로 명명된 동일한 변형 패턴을 가졌다. 시험된 올리고뉴클레오티드의 서열은 표 2에 제공되어 있다.
표 2. 인간 세포-기반 검정을 위한 후보 올리고뉴클레오티드 서열
Figure pct00002
Hs: 인간, Rh: 붉은털 원숭이, 및 Mm: 마우스; 센스 및 안티센스 서열번호 컬럼은 각각의 올리고뉴클레오티드를 만들기 위해 혼성화되는 센스 가닥 및 각각의 안티센스 가닥을 제공한다. 예를 들어, 서열번호: 1을 갖는 센스 가닥은 서열번호: 289를 갖는 안티센스 가닥과 혼성화하고; 시험된 각각의 올리고뉴클레오티드는 동일한 변형 패턴을 가졌다.
CYP27A1 mRNA에서 핫스팟
288개 후보 올리고뉴클레오티드의 스크린으로부터의 데이터가 도 3에 도시되어 있다. 올리고뉴클레오티드는 인간 (Hs) 유전자 위치에 대한 상보성의 위치를 기반으로 배열된다. 음성 대조군에 비교하여 잔존하는 mRNA 25% 이하를 초래하는 올리고뉴클레오티드는 히트로 간주되었다. CYP27A1 발현을 억제하는 것으로 밝혀지지 않은 3개 올리고뉴클레오티드가 음성 대조군으로 사용되었다. 부가하여, 하우스-키핑 유전자인 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT)로 세포의 형질감염이 형질감염에 대한 양성 대조군으로 사용되었다.
119개 히트가 이 기준에 기반하여 동정되었다. 이들 올리고뉴클레오티드의 활성 및 위치에 기반하여 (도 3), 인간 CYP27A1 mRNA 상의 핫스팟이 정의되었다. 핫스팟은 대조군과 비교하여 어느 하나의 검정에서 25% 이하인 mRNA 수준을 초래하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드와 연관된 인간 CYP27A1 mRNA 서열 상의 스트레치로 동정되었다. 이들 핫스팟은 도 3에서 시각화될 수 있다. 따라서, 인간 CYP27A1 mRNA 서열 내에서 다음 핫스팟이 확인되었다: 699-711, 729-735, 822-836, 970-1009, 1065-1088, 1095-1112, 1181-1203, 1297-1317, 1488-1492, 1591-1616, 1659-1687, 1929-1932, 1995-2001, 2204-2225, 및 2262-2274. 핫스팟의 서열은 표 3에 요약되어 있다.
표 3. 핫스팟의 서열
Figure pct00003
용량 반응 검정
종 간의 유전자 위치 및 서열 보존에 기반하여, 1차 스크리닝에서 가장 활성인 것으로 밝혀진 119개 올리고뉴클레오티드 중, 96개 올리고뉴클레오티드가 이차 스크린에 적용되었다. 이 이차 스크린에서 올리고뉴클레오티드는 1차 스크린에서와 동일한 검정을 사용하여 시험되었지만 3가지 다른 농도 (1nM, 0.1nM 및 0.01nM)에서 시험되었다. 2가지 이상의 농도에서 활성을 나타내는 올리고뉴클레오티드가 추가 검정을 위해 선택되었다.
이 단계에서, 선택된 올리고뉴클레오티드는 테트라루프를 함유하고 상이한 변형 패턴에 적응하도록 변형되었다. 줄기-루프 서열은 센스 (패신저) 가닥의 3'-말단에 합체되었으며, 여기서 루프 서열은 테트라루프의 서열이었다. 따라서, 분자는 틈이 있는 테트라루프 구조 (22-mer 가이드 가닥이 있는 36-mer 패신저 가닥)로 전환되었다. 일반 테트라루프 구조에 대해서는 도 2를 참고한다. 그런 다음 이들은 CYP27A1 mRNA 발현을 감소시키는 그의 능력에 대해 3가지 상이한 농도 (0.01nM, 0.1nM 및 1nM)에서 시험되었다. 도 4a는 각각 M1 내지 M12로 명명된 10가지 상이한 변형 패턴에 적응된 테트라루프를 갖는 2개 염기 서열로부터 제조된 올리고뉴클레오티드에 대한 데이터를 나타낸다. 이 실험을 위해, 2개 올리고뉴클레오티드 (즉, S785-AS786-M26 및 S787-AS788-M26)가 22-mer인 것 대신에 21-mer이었다는 것도 시험되었다. S785-AS786-M26 및 S787-AS788-M26은 각각 S577-AS579-M26 및 S578-AS580-M26의 21-mer 버전이다. 이것은 다이서 효소가 더 큰 올리고뉴클레오티드를 21-mer 또는 22-mer로 절단할 수 있기 때문에 시험되었다. 도 4b는 유사한 데이터를 나타내지만, 각각 M13 및 M14로 명명된 1 또는 2개 상이한 변형 패턴에 적응된 테트라루프를 갖는 16개 염기 서열에 대한 것이다. 올리고뉴클레오티드 S577-AS579-M1 및 S577-AS579-M9를 실험에서 실험-간 교정자로 사용하여 도 4a 및 4b에 나타낸 데이터를 생성하였다. 추가로, 도 4b에서 "*"에 의해 묘사된 올리고뉴클레오티드에서, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오티드의 염기는 우라실로 치환되어 활성을 향상시킨다.
이들 실험으로부터의 데이터는 전달 특성을 개선하지만 CYP27A1 발현의 감소에 대한 활성을 유지하는 테트라루프 및 변형 패턴을 동정하기 위해 평가되었다. 이 분석에 기반하여, 선택된 올리고뉴클레오티드를 그 다음 GalNAc 모이어티에 접합시키고 검정하였다 (도 6). 도 6에 도시된 올리고뉴클레오티드의 경우, 4개 GalNAc 모이어티가 센스 가닥의 테트라루프에서 뉴클레오티드에 접합되었다. 접합은 클릭 링커를 사용하여 수행되었다. 사용된 GalNAc는 아래 도시된 바와 같다:
Figure pct00004
N-아세틸-b-D-갈락토사민 (CAS#: 14131-60-3)
CYP27A1 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 능력은 변형 패턴에 의해 영향을 받았다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 S591-AS608-M24G 및 S591-AS608-M22G는 S591-AS608-M24G가 위치 1에 시토신 및 안티센스 스탠드 상에 천연 5' 포스페이트를 함유하는 반면, S591-AS608-M22G는 위치 1에 우라실 및 안티센스 스탠드 상에 5' 포스페이트 유사체를 함유한다는 점에서만 상이하다.
CYP27A1의 단백질 수준은 또한 mRNA 수준과 함께 평가되었다.
뮤어라인 모델 시험
인간 HepG2 세포를 사용한 실험과 병행하여, 올리고뉴클레오티드는 또한 AML12 뮤어라인 세포에서 스크리닝되었다. 마우스 CYP27A1 mRNA (서열번호: 784)에 상보적인 96개 올리고뉴클레오티드가 시험되었다. CYP27A1을 발현하는 세포를 올리고뉴클레오티드로 형질감염시키고 SYBR®-기반 qPCR 검정을 사용하여 나머지 CYP27A1 mRNA의 수준을 조사했다. 표 4는 시험된 올리고뉴클레오티드의 서열을 요약한다.
Figure pct00005
표 4. 뮤어라인 세포-기반 검정을 위한 후보 올리고뉴클레오티드 서열: Hs: 인간, Rh: 붉은털 원숭이 및 Mm: 마우스; 센스 및 안티센스 서열번호 컬럼은 각각의 올리고뉴클레오티드를 만들기 위해 어닐링된 센스 가닥 및 각 안티센스 가닥 (서로에 대한 순서대로 열거됨)을 제공한다. 예를 들어, 서열번호: 1을 갖는 센스 가닥은 서열번호: 289를 갖는 안티센스 가닥과 혼성화하고; 시험된 각각의 올리고뉴클레오티드는 동일한 변형 패턴을 가졌다.
인간 세포-기반 검정에서와 유사한 기준을 사용하여, 이들 중 26개를 그 다음 다중 농도에서 스크리닝하였다. 그 다음 26개 올리고뉴클레오티드 중 8개에 상이한 변형 패턴을 적용하였다. 그의 활성에 기반하여, 다양한 변형 패턴을 갖는 4개 서열을 GalNAc 모이어티에 접합하였다. 도 5는 테트라루프를 갖는 이들 GalNAc-접합 올리고뉴클레오티드의 활성을 도시한다. 도 5에 도시된 올리고뉴클레오티드의 경우, 4개 GalNAc 모이어티가 센스 가닥의 테트라루프에 있는 뉴클레오티드에 접합되었다. 선택된 올리고뉴클레오티드는 부분적인 담관 결찰 마우스 모델에서 시험되었다. 이 실험에서, 지질 나노입자, S789-AS790-M27에 제형화된 모 올리고뉴클레오티드 (즉, 25/27-mer)가 대조군으로 사용되었다. 이 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 모이어티에 접합되지 않았다.
좌측 간엽 담관은 암컷 CD-1 마우스에서 외과적으로 결찰되었고, 다른 엽에 공급하는 담관은 비처리된 채로 두었다. 수술 4주 후, 4 초과 주 동안 매주 10mg/kg의 PBS 또는 GalXC-CYP27A1 접합체 (즉, GalNAc-접합 올리고뉴클레오티드) 중 어느 하나를 마우스에 피하로 주사하였다. 연구의 종단에서, 마우스를 희생시키고 혈청과 간 조직을 수집했다. RNA는 cDNA를 생성하기 위해 간에서 정제되었다. 그런 다음 CYP27A1 mRNA 수준은 마우스 특이적 CYP27A1 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR에 의해 추정되었다. 혈청 담즙산 농도는 중동위원소 표지된 담즙산 표준을 사용하여 LC-MS에 의해 측정되었다. CYP27A1 녹다운은 순환에서 담즙산의 농도를 유의하게 감소시켰다 (도 7).
좌측 간엽 담관은 암컷 CD-1 마우스에서 외과적으로 결찰되었고, 다른 엽에 공급하는 담관은 비처리된 채로 두었다. 수술에서 회복 후, 마우스에 PBS 또는 GalXC-CYP27A1 접합체 중 어느 하나를 4주 동안 매주 10mg/kg으로 피하로 주사하였다. 연구의 종단에서, 마우스를 희생시키고 그 간을 수집했다. 그런 다음 간 섹션을 간에서 섬유화 영역을 특이적으로 염색하는 염료인 시리우스 레드 (Sirius Red)로 염색했다. CYP27A1 녹다운은 시리우스 레드 염색에 의해 측정된 바와 같이 섬유증의 양을 감소시킨다 (도 8).
재료 및 방법
형질전환
제1 스크리닝을 위해, 리포펙타민 RNAiMAX™를 사용하여 효율적인 형질감염을 위해 올리고뉴클레오티드를 복합화했다. 올리고뉴클레오티드, RNAiMAX 및 Opti-MEM을 플레이트에 첨가하고 형질감염 이전에 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 활발히 계대되는 세포의 플라스크로부터 배지를 흡인하고 세포를 트립신의 존재에서 37℃에서 3-5분 동안 인큐베이션한다. 세포가 플라스크에 더 이상 부착되지 않은 후, 세포 성장 배지 (페니실린 및 스트렙토마이신 결핍)를 첨가하여 트립신을 중화하고 세포를 현탁시켰다. 10 μL 분취량을 제거하고 혈구계산기로 계수하여 밀리미터 기준당 세포를 정량화했다. HeLa 세포의 경우, 100μL의 배지에 웰당 20,000개 세포를 시딩했다. 현탁액을 알려진 세포 농도로 희석하여 형질감염되어 지는 세포의 수에 필요한 총 부피를 얻었다. 희석된 세포 현탁액을 Opti-MEM에 이미 올리고뉴클레오티드를 함유한 96 웰 형질감염 플레이트에 첨가하였다. 그런 다음 형질감염 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 24시간의 인큐베이션 후, 배지를 각 웰로부터 흡인하였다. 세포는 Promega RNA 단리 키트로부터의 용해 완충액을 사용하여 용해했다. 용해 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음 용해된 세포를 RNA 단리를 위해 Corbett XtractorGENE (QIAxtractor)로 옮기거나 -80℃에서 저장했다.
후속 스크린 및 실험, 예를 들어, 이차 스크린을 위해, 리포펙타민 RNAiMAx를 사용하여 역 형질감염을 위한 올리고뉴클레오티드를 복합화했다. 복합체는 OptiMEM 배지에서 RNAiMAX와 siRNA를 15분 동안 혼합함에 의해 만들었다. 형질감염 혼합물을 다중-웰 플레이트로 옮기고 세포 현탁액을 웰에 첨가하였다. 24시간 인큐베이션 후 세포를 PBS로 1회 세정한 다음 Promega SV96 키트로부터의 용해 완충액을 사용하여 용해하였다. RNA는 진공 매니폴드에서 SV96 플레이트를 사용하여 정제되었다. 4 마이크로리터의 정제된 RNA는 그 다음 65℃에서 5분 동안 가열되고 4℃로 냉각되었다. 그런 다음 RNA는 10 마이크로리터 반응에서 고용량 역전사 키트 (Life Technologies)를 사용한 역전사에 사용되었다. 그런 다음 cDNA는 뉴클레아제가 없는 물로 50μl로 희석되고 다중화된 5'-엔도뉴클레아제 검정 및 SSoFast qPCR 마스터믹스 (Bio-Rad Laboratories)로 정량적 PCR에 사용되었다.
cDNA 합성
Corbett X-tractor Gene™ (QIAxtractor)를 사용하여 조직 배양에서 포유동물 세포로부터 RNA를 분리하였다. 변형된 SuperScript II 프로토콜을 사용하여 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성했다. 단리된 RNA (대략 5ng/μL)를 5분 동안 65℃로 가열하고 dNP, 무작위 헥사머, 올리고 dT 및 물로 인큐베이션했다. 혼합물을 15초 동안 냉각시켰다. 물, 5X 제1 가닥 완충액, DTT, SUPERaseㆍIn™ (RNA 억제제) 및 SuperScript II RTase로 구성된 "효소 혼합물"을 혼합물에 첨가했다. 내용물을 42℃로 1시간 동안, 그 다음 70℃로 15분 동안 가열한 다음 열순환기를 사용하여 4℃로 냉각하였다. 생성된 cDNA를 SYBR®-기반 qPCR에 적용했다. qPCR 반응은 다중화되어, 반응당 2개 5' 엔도뉴클레아제 검정을 함유했다.
qPCR 검정
프라이머 세트는 초기에 SYBR®-기반 qPCR을 사용하여 스크리닝되었다. 검정 특이성은 용융 곡선뿐만 아니라 "마이너스 RT" 대조를 평가함에 의해 확인되었다. HeLa 및 Hepa1-6 세포로부터 cDNA 주형의 희석 (반응당 20ng으로부터 0.02ng으로 10-배 일련의 희석)이 각각 인간 (Hs) 및 마우스 (Mm) 검정을 시험하는데 사용되었다. qPCR 검정을 384-웰 플레이트에 설정하고 MicroAmp 필름으로 덮고 Applied Biosystems로부터의 7900HT 상에서 실행했다. 시약 농도 및 사이클링 조건에는 다음이 포함되었다: 2x SYBR 믹스, 10μM 정방향 프라이머, 10μM 역방향 프라이머, DD H2O 및 cDNA 주형으로 최대 10μL의 총 부피.
클로닝
단일 용융-곡선을 나타내는 PCR 앰플리콘을 제조업체의 지침에 따라 Promega로부터의 pGEM®-T Easy 벡터 키트 안으로 결찰했다. 제조업체의 프로토콜에 따라 JM109 고효율 세포를 새로 결찰된 벡터로 형질전환했다. 그런 다음 세포를 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 도말하고 콜로니 성장을 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션했다.
PCR 스크리닝 및 플라스미드 Mini-Prep
관심 있는 결찰된 앰플리콘을 함유하는 벡터로 형질전환된 E. coli의 콜로니를 동정하기 위해 PCR을 사용하였다. 삽입물 측면에 있는 벡터-특이적 프라이머를 PCR 반응에 사용했다. 그런 다음 모든 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 실행하고 염색에 이어 트랜스일루미네이터로 이미지화했다. 겔을 정성적으로 분석하여 예상된 크기 (사용된 프라이머에 특이적인 측면 벡터 서열 및 앰플리콘을 포함하여, 대략 300bp)의 결찰된 앰플리콘을 함유하는 것으로 보이는 플라스미드를 결정했다.
그런 다음 PCR 스크리닝에 의해 형질전환체로 확인된 콜로니를 37℃에서 진탕하면서 앰피실린을 갖는 2mL LB 브로쓰로 구성된 배양물에서 밤새 인큐베이션했다. 그런 다음 E. coli 세포를 용해하고 Promega의 Mini-Prep 키트를 사용하여 관심 있는 플라스미드를 단리했다. 플라스미드 농도는 260nm에서 UV 흡광도에 의해 결정되었다.
플라스미드 시퀀싱 및 정량화
정제된 플라스미드는 BigDye® Terminator 시퀀싱 키트를 사용하여 시퀀싱되었다. 벡터-특이적 프라이머인, T7은 삽입물에 걸쳐 있는 판독 길이를 제공하는데 사용되었다. 다음 시약이 시퀀싱 반응에 사용되었다: 물, 5X 시퀀싱 완충액, BigDye 터미네이터 믹스, T7 프라이머 및 플라스미드 (100ng/μL)로 10μL의 부피. 혼합물을 96℃에서 1분 동안 유지한 다음, 10초 동안 96℃, 5초 동안 50℃, 1분 15초 동안 60℃의 15주기; 10초 동안 96℃, 5초 동안 50℃, 1분 30초 동안 60℃의 5주기; 10초 동안 96℃, 5초 동안 50℃, 2분 동안 60℃의 5주기를 수행했다. 그런 다음 Applied Biosystems의 모세관 전기영동 시퀀서를 사용하여 염료 종결 반응을 시퀀싱했다.
그 다음, 서열-검증된 플라스미드를 정량화하였다. 그것은 단일 절단 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화되었다. 선형성은 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 확인하였다. 모든 플라스미드 희석은 TE 완충액 (pH 7.5)에서 mL 완충액당 100μg의 tRNA로 이루어져 폴리프로필렌 바이알에 대한 플라스미드의 비-특이적 결합을 감소시켰다.
그런 다음 선형화된 플라스미드를 μL당 1,000,000에서 01 카피로 일련으로 희석하고 qPCR을 수행했다. 검정 효율성이 계산되었고 효율성이 90-110%의 범위 내이면 검정은 허용 가능한 것으로 간주되었다.
멀티- 플렉싱 검정
각각의 표적에 대해, mRNA 수준은 2개 5' 뉴클레아제 검정에 의해 정량화되었다. 일반적으로, 각 표적에 대해 여러 검정이 스크리닝된다. 선택된 2개 검정은 관심 있는 유전자 (GOI)의 양호한 효율성, 낮은 검출 한계 및 광범위한 5'→3' 범위의 조합을 나타냈다. 하나의 GOI에 대한 양 검정은 각각의 프로브에 서로 다른 형광단이 사용될 때 하나의 반응에 조합될 수 있다. 따라서, 검정 검증에서의 마지막 단계는 그것이 동일한 qPCR에서 결합되거나 또는 "멀티-플렉싱"될 때 선택된 검정의 효율성을 결정하는 것이었다.
10-배 희석에서 양 검정에 대해 선형화된 플라스미드를 조합하고 qPCR을 수행했다. 각 검정의 효율성은 상기에 기술된 바와 같이 결정되었다. 허용된 효율성 비율은 90-110%였다.
선형화된 플라스미드 표준을 사용하여 멀티-플렉싱된 반응을 검증하는 동안, 관심 있는 표적에 대한 Cq 값도 cDNA를 주형으로 사용하여 평가되었다. 인간 또는 마우스 표적의 경우, 각각 HeLa 및 Hepa1-6 cDNA가 사용되었다. 이 경우에 cDNA는 형질감염되지 않은 세포로부터 Corbett (물 중 ~5ng/μl) 상에 단리된 RNA에서 파생되었다. 이 방식으로, 이 샘플 cDNA로부터 관찰된 Cq 값은 96-웰 플레이트 형질감염으로부터 예상된 Cq 값을 나타낸다. Cq 값이 30보다 큰 경우에, 관심 있는 유전자의 더 큰 발현 수준을 나타내는 다른 세포주가 모색되었다. 각 인간 및 마우스 계통으로부터 Corbett 상에 고-처리량 방법을 통한 것으로부터 분리된 총 RNA의 라이브러리가 생성되고 허용 가능한 수준의 표적 발현을 스크리닝하는데 사용되었다.
올리고뉴클레오티드 명명법의 설명
본 명세서에 기재된 모든 올리고뉴클레오티드는 어느 하나의 SN1-ASN2-MN3으로 지정된다. 다음 지정이 적용된다:
ㆍ N1: 센스 가닥 서열의 서열 식별자 번호
ㆍ N2: 안티센스 가닥 서열의 서열 식별자 번호
ㆍ N3: 변형 패턴의 참고 번호로, 각 번호는 올리고뉴클레오티드에서 변형된 뉴클레오티드의 패턴을 나타낸다.
예를 들어, S27-AS123-M15는 서열번호: 27로 제시되는 센스 서열, 서열번호: 123으로 제시되는 안티센스 서열을 가지고 변형 패턴 번호 15에 적응된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
본 명세서에 예시적으로 기술된 개시내용은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재에서 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서의 각 경우에 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"은 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 이용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 관점에서 사용되고, 이러한 용어 및 표현을 사용할 때 표시 및 설명된 기능의 등가물 또는 그 일부를 배제하려는 의도는 없으나, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식한다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시형태에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 개념의 선택적 특징, 변형 및 변경이 당업자에 의해 호소될 수 있고, 그러한 변형 및 변경이 설명 및 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내인 것으로 고려되는 것으로 이해되어야 한다.
부가하여, 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹 또는 대안의 다른 그룹화의 관점에서 기술되는 경우, 당업자는 발명이 이에 의해 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 그룹의 관점에서 기술된다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 서열 목록에 제시된 서열은 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산의 구조를 기술하는 데 참고될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 실시형태에서, 실제 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산은 명시된 서열과 본질적으로 동일하거나 유사한 상보적 특성을 유지하면서 명시된 서열과 비교하여 하나 이상의 대체 뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 뉴클레오티드의 RNA 대응물 또는 RNA 뉴클레오티드의 DNA 대응물) 및/또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결 및/또는 하나 이상의 다른 변형을 가질 수 있다.
본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 다음 청구범위의 맥락에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "the"와 유사한 지시어의 사용은 본 명세서에 달리 표시되거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "가지는", "포괄하는" 및 "함유하는"은 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어 (즉, "포함하지만 이에 제한되지 않음"을 의미)로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위의 언급은 본 명세서에서 달리 지시되지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 별개 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서 역할을 하기 위한 것일 뿐이고, 각각의 별개 값은 그것이 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 모든 실시예 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이고 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 제한을 가하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 임의의 비-청구된 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시형태가 본 명세서에서 기재되어 있다. 이들 실시형태의 변경은 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있다.
발명자들은 숙련된 기술자가 그러한 변경을 적절하게 이용하기를 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과는 다르게 본 발명이 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 관련 법률이 허용하는 바에 따라 본 명세서에 첨부된 청구범위에 인용된 대상들의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본 명세서에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 모든 가능한 그 변경에서 상술한 요소의 임의의 조합은 본 발명에 의해 포괄된다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에서 기술된 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음 청구범위에 의해 포괄되도록 의도된다.
부록 A
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SEQUENCE LISTING <110> Dicerna Pharmaceuticals, Inc. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING EXPRESSION OF CYP27A1 <130> 400930-012WO (172294) <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/804,410 <151> February 12, 2019 <160> 792 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 ccagaguuca gaccaagcga aaagt 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 cagaguucag accaagcgaa aagtt 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 agaguucaga ccaagcgaaa aguta 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 gaguucagac caagcgaaaa guuat 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 aguucagacc aagcgaaaag uuatt 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 764 auagcuggaa uaaaaauugu ag 22 <210> 765 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 765 aaagucacug auaaccucgu uu 22 <210> 766 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 766 gugcaaggcc uccuggaucu ca 22 <210> 767 <211> 37 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 767 cugcaccagu uacaggugcu uuacaaggcc aaguacg 37 <210> 768 <211> 31 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 768 aaguacgguc caauguggau guccuacuua g 31 <210> 769 <211> 39 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 769 ggcaaguacc caguacggaa cgacauggag cuauggaag 39 <210> 770 <211> 64 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 770 cagcgcucua uacggaugcu uucaaugagg ugauugauga cuuuaugacu cgacuggacc 60 agcu 64 <210> 771 <211> 48 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 771 ucggacaugg cucaacucuu cuacuacuuu gccuuggaag cuauuugc 48 <210> 772 <211> 42 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 772 gccuuggaag cuauuugcua cauccuguuc gagaaacgca uu 42 <210> 773 <211> 47 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 773 cagauccauc ggguuaaugu uccagaacuc acucuaugcc accuucc 47 <210> 774 <211> 45 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 774 ccuuugggaa gaagcugauu gaugagaagc ucgaagauau ggagg 45 <210> 775 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 775 cugacauggg cccuguacca ccucucaaa 29 <210> 776 <211> 48 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 776 aggacuuugc ccacaugccg uugcaaagcu gugcuuaagg agacucug 48 <210> 777 <211> 53 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 777 cccacaaacu cccggaucau agaaaaggaa auugaaguug auggcuuccu cuu 53 <210> 778 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 778 gcaaggcuga uccagaagua caaggugg 28 <210> 779 <211> 31 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 779 cgcauugucc ugguucccaa uaagaaagug g 31 <210> 780 <211> 46 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 780 uuugccacuu cuaucauuuu ugagcaacuc ccucucagcu aaaagg 46 <210> 781 <211> 37 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 781 cgcauugcug uccuugggua gaauauaaaa uaaaggg 37 <210> 782 <211> 2388 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 782 gggagaagcc gagggcagcu uagccacggc cgguucccgu ucccuccagg acgcgagggu 60 cgccuugggu ggggaaccgc gaccgggcga ggaccuaucc cggugugggg cuucccgauu 120 ucgaaagaau cucgcugcac ccccgcccag aguucagacc aagcgaaaag uuauuugaga 180 ggccucgggg gcgcggggug aggagucgug gcggaggccu uggucggggc gccguggaua 240 uccccgaguc accgcguccc ucuccugcag cucccgcguc gcugggagga gcgagggagc 300 gagcgggaag gggucuagcu ggccuuugcu cggcccuccc cagcgcccgg cuuugaaccc 360 gcccugcacu gcugucuggg cggguccggg gacucagcac ucgacccaaa ggugcaggcg 420 cgcgagcaca acccauggcu gcgcugggcu gcgcgaggcu gaggugggcg cugcgagggg 480 ccggccgugg ccucugcccc cacggggcca gagccaaggc cgcgaucccu gccgcccucc 540 ccucggacaa ggccaccgga gcucccggag ccgggccugg uguccggcgg cggcaacgga 600 gcuuagagga gauuccacgu cuaggacagc ugcgcuucuu cuuucagcug uucguucaag 660 gcuaugcccu gcaacugcac caguuacagg ugcuuuacaa ggccaaguac gguccaaugu 720 ggauguccua cuuagggccu cagaugcacg ugaaccuggc cagugccccg cucuuggagc 780 aagugaugcg gcaagagggc aaguacccag uacggaacga cauggagcua uggaaggagc 840 accgggacca gcacgaccug accuaugggc cguucaccac ggaaggacac cacugguacc 900 agcugcgcca ggcucugaac cagcgguugc ugaagccagc ggaagcagcg cucuauacgg 960 augcuuucaa ugaggugauu gaugacuuua ugacucgacu ggaccagcug cgggcagaga 1020 gugcuucggg gaaccaggug ucggacaugg cucaacucuu cuacuacuuu gccuuggaag 1080 cuauuugcua cauccuguuc gagaaacgca uuggcugccu gcagcgaucc auccccgagg 1140 acaccgugac cuucgucaga uccaucgggu uaauguucca gaacucacuc uaugccaccu 1200 uccuccccaa guggacucgc cccgugcugc cuuucuggaa gcgauaccug gaugguugga 1260 augccaucuu uuccuuuggg aagaagcuga uugaugagaa gcucgaagau auggaggccc 1320 aacugcaggc agcagggcca gauggcaucc aggugucugg cuaccugcac uucuuacugg 1380 ccaguggaca gcucaguccu cgggaggcca ugggcagccu gccugagcug cucauggcug 1440 gaguggacac gacauccaac acgcugacau gggcccugua ccaccucuca aaggacccug 1500 agauccagga ggccuugcac gaggaagugg uggguguggu gccagccggg caagugcccc 1560 agcacaagga cuuugcccac augccguugc ucaaagcugu gcuuaaggag acucugcguc 1620 ucuacccugu gguccccaca aacucccgga ucauagaaaa ggaaauugaa guugauggcu 1680 uccucuuccc caagaacacc caguuugugu ucugccacua uguggugucc cgggacccca 1740 cugccuucuc ugagccugaa agcuuccagc cccaccgcug gcugagaaac agccagccug 1800 cuacccccag gauccagcac ccauuuggcu cugugcccuu uggcuauggg guccgggccu 1860 gccugggccg caggauugca gagcuggaga ugcagcuacu ccucgcaagg cugauccaga 1920 aguacaaggu gguccuggcc ccggagacgg gggaguugaa gaguguggcc cgcauugucc 1980 ugguucccaa uaagaaagug ggccugcagu uccugcagag acagugcuga gcugagucuc 2040 cgccuugcug gggcuugucc uagaggcucc agcucuggca cagugguucc uggcugcugc 2100 caugucucag augaggaggg agagaaggag gccgccagac ucgagaggug ggaggaacuc 2160 cuugcacaca cccugagcuu uugccacuuc uaucauuuuu gagcaacucc cucucagcua 2220 aaaggccacc ccuuuaucgc auugcugucc uuggguagaa uauaaaauaa agggacuuuu 2280 auuucuuauu ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2388 <210> 783 <211> 2301 <212> RNA <213> Macaca mulatta <400> 783 gggagaagcc gggggcagcu uagucgcggc cgguuccugu ucccuucagg acgcgagggu 60 cgccuugggu ggggaacccg cggccgggcg aggaccuguc ccaguguagg acuucccggu 120 uucgaaagaa ucucgcugca cccccgccca gaguucagac caagcgaaaa guuauuugag 180 aggccucggg ggcgcggggu gaggagucgg uggcggaggc cuuggucggg gcgcgguggg 240 uaucccugag ucaccgcguc ccucuccugc agaccccacg acgcugggag gagcgaggga 300 gugagcggga aggggucugg cuggccuuug cucggcccuc cccagcgccc ggccuugaac 360 ccgcccugag cugcugccug ggcggguccg gggguuccgc acucgaccca aaggugcagg 420 cgggcgagca caacccaugg cugcgcuggg cugcgcgagg uugagguggg ugcugcgagg 480 ggccggccgu ggccucugcc cccacggggc cagagccaag gccacgaucc cuaccgcccu 540 ccccucggac aaggccaccg aggcucccgg agccgggccu gguauccggc ggcggcaacg 600 gagcuuaaag gagauuccac gucuagggca gcugcgcuuc uucuuucagc uguuuguuca 660 aggcuaugcc cugcagcugc accaguuaca ggugcuuuac aaggccaagu acgguccaau 720 guggaugucc uacuuagggc cucagaugca cgugaaccug gccagugccc cgcucuugga 780 gcaagugaug cggcaagagg gcaaguaccc aguacggaac gacauggagc uauggaagga 840 gcaccgggac cugcacgacc ugaccuaugg gccguucacc acggaaggac accacuggua 900 ccagcugcgc caggcucuga accagcgguu gcugaagcca gcggaggcag cgcucuauac 960 ggaugcuuuc aaugagguga uugaugauuu uaugauucga cuggaccagc ugcgggcaga 1020 gagugcuucg gggaaccagg ugucggacac ggcucaacuc uucuacuacu uugccuugga 1080 agcuauuugc uacauccugu ucgagaaacg cauuggcugc cugcagcgau ccauccccga 1140 ggacaccgug accuuuguca gauccaucgg guuaauguuc cagaacucac ucuaugccac 1200 cuuccucccc aaguggaccc gccccgugcu gccuuucugg aagcgauacc uggaugguug 1260 gaaugccauc uuuuccuucg ggaagaagcu gauugaugag aaacucgagg auauggaggc 1320 ccaacugcag gcagaggggc cagauggugu ccaggugucu ggcuaccugc acuucuugcu 1380 ggccagugga cagcucaguc cucgggaggc caugggcagc cugccugaac ugcucauggc 1440 uggaguggac acgacaucca acacgcugac augggcccug uaccaccucu caaaggaccc 1500 ugagauccag gaggccuugc acgaggaagu ggugggugug gugccagccg ggcaggugcc 1560 ccagcacaaa gacuuugccc acuugccgcu gcucaaagcu gugcuuaagg agacucugcg 1620 ccucuacccu guggucccca caaauucccg gaucauagaa aaggaaauug aaguugaugg 1680 cuuccucuuc cccaagaaua cccaguuugu guucugccac uacguggugu cccgggaccc 1740 caccaccuuc ucugaaccug agagcuucca gccccaccgc uggcugagga gcagccagcc 1800 ugcuaccccc aggauccaac acccauuugg cucugugccc uuuggcuaug ggguccgggc 1860 cugccugggc cgcaggauug cagagcugga gaugcagcua cuccuggcaa ggcugaucca 1920 gaaguacaag gugguccugg ccccagagac gggggaguug aagagugugg cccgcauugu 1980 ccugguuccc aauaagaaag ugggccugca guuccugcag agacagugcu gagcugaguc 2040 cccaccuugc uggggcuugu ccuagaggcu ccagcccugg cauagugguu ccuggcugcc 2100 gccugucuca gaugaggagg gagagaagga ggccgccaga cuugagaggu gggaggaacu 2160 cccugcacuu cccacagacc cugagcuuuu gccacuucua ucauuuuuga gcaacucccu 2220 cucagauaaa aggccaccgc uuuaucgcau ugcuguccuu ggguagaaua uaaaauaaag 2280 ggacuuuuau uucuuaucgg a 2301 <210> 784 <211> 1936 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 784 gucgccaggu cgcaaagccc gaguucuguc ugccuccuug ccuggauagg gcucauaguc 60 ucuggaucua aacucuuggc uucucgggca cgauccaugg cugcguggag ccgcacgagg 120 cugagaugga cgcuccugga cccgcgugug gugggccgug gccucugccc acaaggggcc 180 agagccaagg ccacgauccc ugcagcccuc caggcacagg agaguacgga ggguccagga 240 acaggucaag accggccgcg ccugcggagu ccggcggagc uuccggggac cggaacgcua 300 caauuuuuau uccagcuauu ucuacaaggc uaugugcugc acuugcccga ccuccaggug 360 cugaacaaga ccaaguaugg uccaaugugg acaaccuccu uugggacuua caccaaugug 420 aaucuggcua gugccccacu cuuggagcaa gugaugagac aggagggcaa guacccaaua 480 agagaccaca uggaucagug gaaggaccac cgagaccaca agggccucac cuaugggauc 540 uucaucgcac aaggagagca augguaccau cugcgucagg cuuugaaaca gaggcugcug 600 aagccugacg aggccgcgcu cuacacggau gccuuaaacg agguuaucag ugacuuuauc 660 acccggcugg accaggugcg ggcagagagu gaaucagggg accaggugcc agacauggcu 720 caucuucucu accaccuugc cuuggaagcc aucaccuaua uccuguuuga gaaaaggauu 780 ggcugccuga aacccuccau uccugaggac acugccgccu ucaucagauc uguugcaauc 840 auguuccaga acucagucua uaucacuuuc cuucccaaau ggacgcgucc ucugcugccc 900 uuuuggaagc gauaccugaa uggcugggau aacauuuucu ccuuuggaaa gaagcugauu 960 gaugaaaaag uccaggagcu aaaagcccag cuacaggaaa cugggccaga uggaguccgg 1020 guaucuggcu accugcacuu ccugcugacc aaugaauugc ucaguacuca ggagaccauc 1080 ggcaccuuuc cugagcugcu uuuggcuggg guggacacga cauccaacac acugacaugg 1140 gcccuguacc accuuucaaa gagcccagag auccaggagg ccuugcacaa ggaagugacu 1200 gguguggugc ccuucgggaa ggugccccag cacaaggacu uugcccacau gccucugcua 1260 aaagcuguga uuaaggagac ccugcgccuc uacccugugg uucccacaaa cucccggauc 1320 aucacagaaa aggaaacuga aauuaauggc uuucucuucc ccaagaauac acaguuugug 1380 uuaugccacu acgugguguc ccgggauccc agugucuuuc cugagcccaa cagcuuccag 1440 ccucaccgau ggcugaggaa gaaagaggcu gauaacccug ggauccuaca uccauucggc 1500 ucugugcccu ucggcuaugg gguucggucu ugccuggguc ggaggauugc agaacuggag 1560 augcaacuga ugcugucaag gcugguacag aaguaugaga uugcccuggc ucccgggaug 1620 ggagaaguaa agacuguguc ccgcaucguc cugguuccca gcaagaaggu gaggcugcau 1680 uuucugcaga gacaguagua ccgagcuggg cucccgccuu cauggagcuc guccagaagc 1740 ccuggcacag aaguucuugg ccagucucau gucacauguc acgaugucag auucaacagg 1800 agaacucugu gcccuuccua uagacaccaa augucuggca caaucucuac ugagcagcac 1860 ccacuuaaga cagcagagca ccuuauaaua acaguccuug gguaugauuu aaaauaaaau 1920 uuaaaauuca aguuuu 1936 <210> 785 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 785 ugcuacaucc uguucgagag cagccgaaag gcugc 35 <210> 786 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 786 ucucgaacag gauguagcaa a 21 <210> 787 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 787 cagaacucac ucuaugccag cagccgaaag gcugc 35 <210> 788 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 788 uggcauagag ugaguucugg a 21 <210> 789 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 789 cggaacgcua caauuuuuau uccag 25 <210> 790 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 790 cuggaauaaa aauuguagcg uuccggu 27 <210> 791 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 791 uucucgaaca ggauguagca gg 22 <210> 792 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 792 auagcuggaa uaaaaauugu gg 22

Claims (51)

  1. CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 및 788 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥을 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 및 788 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
  5. CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이에서 15 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 서열번호: 767-781에 제시된 서열의 적어도 15개 인접 뉴클레오티드에 상보적인 CYP27A1에 대한 상보성의 영역을 갖는, 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 길이에서 19 내지 27개 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 길이에서 21 내지 27개 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  8. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 길이에서 15 내지 50개 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥은 안티센스 가닥과 이중나선 영역을 형성하는, 올리고뉴클레오티드.
  9. 제5항에 있어서, 상기 센스 가닥은 길이에서 19 내지 50개 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  10. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 이중나선 영역은 길이에서 적어도 19개 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CYP27A1과의 상보성의 영역은 서열번호: 767-781에 제시된 서열의 적어도 19개 인접 뉴클레오티드에 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
  12. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  13. 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 및 788 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  14. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
  15. 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 및 788 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되는, 올리고뉴클레오티드.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 그 3'-말단에 S1-L-S2로 제시된 줄기-루프를 포함하며, 여기서 S1은 S2에 상보적이고, L은 길이에서 3 내지 5개 뉴클레오티드의 S1과 S2 사이에 루프를 형성하는, 올리고뉴클레오티드.
  17. CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며,
    상기 안티센스 가닥은 길이에서 21 내지 27개 뉴클레오티드이고 CYP27A1과 상보성의 영역을 가지고,
    상기 센스 가닥은 그 3'-말단에 S1-L-S2로 제시된 줄기-루프를 포함하며, 여기서 S1은 S2에 상보적이고, L은 길이에서 3 내지 5개 뉴클레오티드의 S1과 S2 사이에 루프를 형성하고,
    상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 길이에서 적어도 19개 뉴클레오티드의 이중나선 구조를 형성하지만 공유 원자가로 연결되어 있지는 않은, 올리고뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 상보성의 영역은 CYP27A1 mRNA의 적어도 19개 인접 뉴클레오티드에 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, L은 테트라루프인, 올리고뉴클레오티드.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, L은 길이에서 4개 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, L은 GAAA로 제시된 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  22. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 길이에서 27개 뉴클레오티드이고 상기 센스 가닥은 길이에서 25개 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 길이에서 25개 뉴클레오티드의 이중나선 영역을 형성하는, 올리고뉴클레오티드.
  24. 제19항에 있어서, 길이에서 2개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상에 3'-오버행 서열을 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  25. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 각각 길이에서 21 내지 23개 뉴클레오티드의 범위인 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이에서 19 내지 21개 뉴클레오티드의 범위인 이중나선 구조를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 3'-오버행 서열을 포함하고, 상기 3'-오버행 서열은 안티센스 가닥, 센스 가닥, 또는 안티센스 가닥과 센스 가닥 상에 존재하는, 올리고뉴클레오티드.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이에서 2개 뉴클레오티드의 3'-오버행 서열을 포함하고, 상기 3'-오버행 서열은 안티센스 가닥 상에 존재하고, 상기 센스 가닥은 길이에서 21개 뉴클레오티드이고 상기 안티센스 가닥은 길이에서 23개 뉴클레오티드이어서 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥이 길이에서 21개 뉴클레오티드의 이중나선을 형성하는. 올리고뉴클레오티드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  30. 제29항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 2'-변형을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  31. 제30항에 있어서, 상기 2'-변형은 2'-아미노에틸, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 및 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산으로부터 선택되는 변형인, 올리고뉴클레오티드.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 변형되어 지는, 올리고뉴클레오티드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  34. 제33항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결인, 올리고뉴클레오티드.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 5'-뉴클레오티드의 당의 4'-탄소는 포스페이트 유사체를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  36. 제35항에 있어서, 상기 포스페이트 유사체는 옥시메틸 포스포네이트, 비닐 포스포네이트 또는 말로닐 포스포네이트인, 올리고뉴클레오티드.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드에 접합되는, 올리고뉴클레오티드.
  38. 제37항에 있어서, 각각의 표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  39. 제38항에 있어서, 각각의 표적화 리간드는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  40. 제39항에 있어서, 상기 GalNac 모이어티는 1가 GalNAc 모이어티, 2가 GalNAc 모이어티, 3가 GalNAc 모이어티, 또는 4가 GalNAc 모이어티인, 올리고뉴클레오티드.
  41. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기-루프의 L의 최대 4개 뉴클레오티드는 각각 1가 GalNAc 모이어티에 접합된, 올리고뉴클레오티드.
  42. 제37항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 압타머를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 및 부형제를 포함하는 조성물.
  44. 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 제43항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  45. 대상체의 간에서 담즙산 축적을 약화시키는 방법으로서, 상기 방법은 제43항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  46. 간 섬유증의 정도를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 간 섬유증의 정도를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 제43항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  47. 순환 담즙산 농도를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 순환 담즙산 농도를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 제43항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  48. 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간담도 질환을 앓고 있는, 방법.
  49. CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이에서 15 내지 50개 뉴클레오티드의 센스 가닥 및 길이에서 15 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥과 이중나선 영역을 형성하고, 여기서 상기 센스 가닥은 서열번호: 577-578, 581-597, 759-762, 785, 및 787 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호: 579-580, 598-614, 763-766, 786, 788로부터 선택된 상보적 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  50. CYP27A1의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 부록 A에 제시된 표의 행으로부터 선택된 한 쌍의 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  51. 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 PNALD를 앓고 있는, 방법.
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