BR112021015651A2

BR112021015651A2 - Métodos e composições para inibir a expressão de cyp27a1

Info

Publication number: BR112021015651A2
Application number: BR112021015651-8A
Authority: BR
Inventors: Utsav SAXENA
Original assignee: Dicerna Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2019-02-12
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2021-10-05
Also published as: WO2020167593A1; EP3908661A1; CL2021002120A1; CA3128059A1; IL285367A; JP2022520653A; US20220186229A1; AU2020221892A1; KR20210132661A; CN113692444A; SG11202108532RA; MX2021009754A

Abstract

métodos e composições para inibir a expressão de cyp27a1. a presente invenção refere-se a oligonucleotídeos, composições e métodos úteis para reduzir a expressão de cyp27a1, particularmente em hepatócitos. os oligonucleotídeos divulgados para a redução da expressão de cyp27a1 podem ser de fita dupla ou de fita simples e podem ser modificados para características melhoradas, como maior resistência a nucleases e menor imunogenicidade. os oligonucleotídeos divulgados para a redução da expressão de cyp27a1 também podem incluir ligandos direcionados para uma célula ou órgão específico, como os hepatócitos do fígado, e podem ser usados para tratar doenças hepatobiliares e condições relacionadas (por exemplo, fibrose hepática).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTO-

DOS E COMPOSIÇÕES PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE CYP27A1”.

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC §119(e) do Pedido Provisório dos Estados Unidos 62/804.410, depositado em 12 de fevereiro de 2019, todo o conteúdo do qual é incorporado neste do- cumento por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos e usos dos mesmos, particularmente usos relacionados à modulação das fun- ções metabólicas do fígado.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0003] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado 400930- 012WO_SEQ.txt criado em 6 de fevereiro de 2020, com 162 kilobytes de tamanho. As informações no formato eletrônico da listagem de se- quências estão incorporadas neste documento por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Dentre as muitas funções metabólicas desempenhadas pe- lo fígado, a síntese e o fluxo da bile são importantes para o funciona- mento ideal dos sistemas entero-hepáticos. A bile é um fluido produzi- do pelo fígado, armazenado na vesícula biliar e secretado no intestino, onde auxilia na absorção da gordura da dieta e das vitaminas liposso- lúveis, bem como na excreção de resíduos como a bilirrubina e o ex- cesso de colesterol. Os ácidos biliares também atuam como regu- ladores hormonais.

[0005] Os ácidos biliares sintetizados no fígado são conhecidos como ácidos biliares primários, que são conjugados com glicina ou taurina e secretados no intestino. No cólon, a bactéria intestinal, modi- fica ainda mais os ácidos biliares para formar ácidos biliares secundá- rios. Esses ácidos biliares secundários são então absorvidos e devol- vidos ao fígado por meio da circulação entero-hepática. Os principais ácidos biliares primários são o ácido cólico e o ácido quenodesoxicóli- co, enquanto os principais ácidos biliares secundários incluem o ácido desoxicólico e o ácido litocólico. Além desses ácidos biliares, ácidos muricólicos também podem estar presentes.

[0006] A natureza anfipática dos ácidos biliares permite que funci- onem como tensoativos ou detergentes; isso, por sua vez, lhes dá a capacidade de formar micelas com gorduras alimentares, emulsionan- do as gorduras e aumentando sua absorção pelos intestinos. Além disso, a natureza detergente dos ácidos biliares contribui para sua to- xicidade.

[0007] Nutrição Parenteral Total ("TPN") é a administração intra- venosa de nutrição, que pode incluir proteínas, carboidratos, gorduras, minerais e eletrólitos, vitaminas e outros oligoelementos para pacien- tes que não podem comer ou absorver alimentos suficientes por meio de fórmulas para alimentação por sonda ou pela boca para manter bom estado nutricional. Isso é obtido contornando o intestino. Obter a ingestão nutricional correta em tempo hábil pode ajudar a combater complicações e ser uma parte importante da recuperação do paciente. No entanto, embora a TPN forneça suporte nutricional para salvar vi- das em situações em que o suprimento calórico por via enteral não pode cobrir as necessidades necessárias do organismo, ela tem efei- tos adversos graves, incluindo doença hepática associada à nutrição parenteral (PNALD). O desenvolvimento de lesão hepática associada à PN é multifatorial, incluindo inflamação intestinal inespecífica, per- meabilidade intestinal comprometida e função de barreira associada ao aumento da translocação bacteriana, colangite primária e secundá- ria, colelitíase, síndrome do intestino curto, distúrbio da circulação he- patobiliar, falta de nutrição enteral, carência de alguns nutrientes (pro- teínas, ácidos graxos essenciais, colina, glicina, taurina, carnitina, etc.) e toxicidade dos componentes da própria mistura nutricional (glicose, fitoesteróis, manganês, alumínio, etc.). Foi observado em modelos de roedores que durante a alimentação regular, os ácidos biliares ativam o receptor farnesoide X (FXR) no intestino e intensificam a expressão do nível de fator de crescimento de fibroblastos 19 (FGF19). (Kumar J. et al., (2014), Newly Identified Mechanisms of Total Parenteral Nutri- tion Related Liver Injury, ADVANCES IN HEPATOLOGY 1-7).

[0008] Também é conhecido que o FGF19 regula o metabolismo dos ácidos biliares, lipídeos e glicose. Assim, os moduladores da via do FXR-FGF19 poderiam superar os efeitos negativos da TPN no fí- gado. Da mesma forma, enzimas reguladas por FXR, incluindo cito- cromo P450 (CYP) 7A1, CYP8B1 e CYP27A1, CYP3A4, CYP3A11, sulfotransferase 2A1 (SULT2A1) e UDP-glucuronosiltransferase 2B4 (UGT2B4/UGT2B11) participam da síntese de ácidos e bile. Mudanças na quantidade de ácidos biliares que levam ao seu aumento têm o po- tencial de induzir e potencializar a hepatotoxicidade por meio de me- canismos pró-inflamatórios, danos à membrana e reações citotóxicas e podem ter consequências para a homeostase lipídica. A redução da expressão do ácido biliar por direcionamento de genes como CYP27A1 por meio do silenciamento do gene RNAi pode ter o efeito de modificar e aliviar tais danos e patologias resultantes, incluindo PNALD ou outros efeitos associados à TPN.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] Aspectos da divulgação se referem a composições e méto- dos relacionados para reduzir a expressão de genes que afetam as funções metabólicas do fígado, particularmente genes que afetam os níveis de ácido biliar em um indivíduo. Em algumas modalidades, a di- vulgação se refere ao reconhecimento de que CYP27A1 é um alvo útil para o tratamento de doenças hepatobiliares, particularmente essas doenças que estão associadas ao acúmulo de ácido biliar. Em outros aspectos, foi descoberto que os oligonucleotídeos para reduzir a ex- pressão ou atividade de CYP27A1 são úteis para o tratamento de con- dições em que o acúmulo de ácidos biliares no fígado contribui para a toxicidade celular (por exemplo, para a toxicidade de hepatócitos e/ou colangiócitos) e/ou promove fibrose hepática. Por conseguinte, em al- gumas modalidades, a divulgação se refere ao uso de oligonucleotí- deos, incluindo oligonucleotídeos RNAi, oligonucleotídeos antissenso e outras modalidades semelhantes, para reduzir a expressão ou ativida- de de CYP27A1 para o tratamento de doenças hepatobiliares, incluin- do, por exemplo, colestase, colangite, esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e/ou síndrome de Alagille.

[00010] Em outras modalidades, potentes oligonucleotídeos de RNAi foram desenvolvidos para inibir seletivamente a expressão de CYP27A1 em um indivíduo. Em algumas modalidades, os oligonucleo- tídeos de RNAi são úteis para reduzir a atividade de CYP27A1 e, as- sim, diminuir ou prevenir o acúmulo de ácido biliar em um indivíduo. Em algumas modalidades, regiões-chave de mRNA de atividade de CYP27A1 (referidas como pontos de acesso) foram identificadas neste documento que são particularmente suscetíveis ao direcionamento usando tais abordagens baseadas em oligonucleotídeos (Ver Exemplo 1). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos aqui desenvolvidos para inibir a expressão de CYP27A1 são úteis para reduzir ou prevenir a fibrose hepática associada ao acúmulo de ácido biliar (ver, por exemplo, Exemplo 1, FIG. 7 e FIG. 8).

[00011] Um aspecto da presente divulgação fornece oligonucleotí- deos para reduzir a expressão de CYP27A1. Em algumas modalida-

des, os oligonucleotídeos compreendem uma fita antissenso que com- preende uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 579-580, 598-614, 763-766, 786 e 788. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem ainda uma fita senso que compreende uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787. Em al- gumas modalidades, a fita antissenso consiste em uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 579-580, 598-614, 763-766, 786 e 788. Em algumas modalidades, a fita senso consiste em uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787.

[00012] Um aspecto da presente divulgação fornece oligonucleotí- deos para reduzir a expressão de CYP27A1, em que os oligonucleotí- deos compreendem uma fita antissenso de 15 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita antissenso tem uma re- gião de complementaridade com uma sequência alvo de CYP27A1 conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 767-781. Em algumas modalidades, a região de complementaridade é de pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21 ou pelo menos 22 nucleotídeos contíguos de comprimento. Em algumas modalidades, a região de complementaridade é totalmente complementar à sequência alvo de CYP27A1. Em algumas modalidades, a região de complementaridade com CYP27A1 tem pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de compri- mento. Em algumas modalidades, a fita senso compreende uma se- quência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787. Em algumas modalidades, a fita senso consiste em uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e

787. Em algumas modalidades, a fita antissenso compreende uma se-

quência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 579-580, 598-614, 763-766, 786 e 788. Em algumas modalidades, a fita antissenso consiste em uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 579-580, 598-614, 763-766, 786 e

788.

[00013] Em algumas modalidades, a fita antissenso tem de 19 a 27 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita antis- senso tem 21 a 27 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modali- dades, o oligonucleotídeo compreende ainda uma fita senso de 15 a 40 nucleotídeos de comprimento, em que a fita senso forma uma regi- ão duplex com a fita antissenso. Em algumas modalidades, a fita sen- so tem de 19 a 40 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modali- dades, a fita antissenso tem 27 nucleotídeos de comprimento e a fita senso tem 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalida- des, a região duplex tem pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita antis- senso e a fita senso formam uma região duplex de 25 nucleotídeos de comprimento.

[00014] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreen- de uma fita antissenso e uma fita senso que estão, cada uma, em um intervalo de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento. Em algumas moda- lidades, um oligonucleotídeo compreende uma estrutura duplex em um intervalo de 19 a 21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas moda- lidades, um oligonucleotídeo compreende ainda uma sequência salien- te 3' na fita antissenso de dois nucleotídeos de comprimento. Em al- gumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma sequência saliente 3' de um ou mais nucleotídeos de comprimento, em que a se- quência saliente 3' está presente na fita antissenso, na fita senso ou na fita antissenso e na fita senso. Em algumas modalidades, um oligo-

nucleotídeo compreende uma sequência saliente 3' de dois nucleotí- deos de comprimento, em que a sequência saliente 3' está presente na fita antissenso e em que a fita senso tem 21 nucleotídeos de com- primento e a fita antissenso é 23 nucleotídeos de comprimento, de modo que a fita senso e a fita antissenso formem um duplex de 21 nu- cleotídeos de comprimento.

[00015] Em algumas modalidades, a fita senso compreende em sua extremidade 3' uma haste-alça estabelecida como: S1-L-S2, na qual S1 é complementar a S2, e na qual L forma uma alça entre S1 e S2 de 3 a 5 nucleotídeos de comprimento.

[00016] Outro aspecto da presente divulgação fornece um oligonu- cleotídeo para reduzir a expressão de CYP27A1, o oligonucleotídeo compreendendo uma fita antissenso e uma fita senso, em que a fita antissenso tem 21 a 27 nucleotídeos de comprimento e tem uma regi- ão de complementaridade a CYP27A1, na qual a fita senso compreen- de em sua extremidade 3' uma haste-alça estabelecida como: S1-L- S2, em que S1 é complementar a S2, e na qual L forma uma alça en- tre S1 e S2 de 3 a 5 nucleotídeos de comprimento, e em que a fita an- tissenso e a fita senso formam uma estrutura duplex de pelo menos 19 nucleotídeos de comprimento, mas não estão covalentemente ligadas. Em algumas modalidades, a região de complementaridade ao mRNA de CYP27A1 é totalmente complementar a pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de mRNA de CYP27A1. Em al- gumas modalidades, L é uma tetra-alça. Em algumas modalidades, L tem 4 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, L compreende uma sequência apresentada como GAAA.

[00017] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreen- de pelo menos um nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado compreende uma modificação 2'. Em algu-

mas modalidades, a modificação 2′ é uma modificação selecionada a partir de: 2′-aminoetil, 2′-fluoro, 2′-O-metil, 2′-O-metoxietil e 2′-desóxi- 2′-fluoro- ácido β-d-arabinonucleico. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos de um oligonucleotídeo são modificados.

[00018] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreen- de pelo menos uma ligação internucleotídica modificada. Em algumas modalidades, a pelo menos uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, o carbono 4′ do açúcar do nucleotídeo 5′ da fita antissenso compreende um análogo de fosfato. Em algumas modalidades, o análogo de fosfato é fosfonato de oximetil, fosfonato de vinila ou fosfonato de malonila.

[00019] Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo de um oligonucleotídeo é conjugado a um ou mais ligandos de direciona- mento. Em algumas modalidades, cada ligando de direcionamento compreende um carboidrato, amino açúcar, colesterol, polipeptídeo ou lipídeo. Em algumas modalidades, cada ligando de direcionamento compreende uma porção N-acetilgalactosamina (GalNAc). Em algu- mas modalidades, a porção GalNac é uma porção GalNAc monovalen- te, uma porção GalNAc bivalente, uma porção GalNAc trivalente ou uma porção GalNAc tetravalente. Em algumas modalidades, até 4 nu- cleotídeos de L de uma haste-alça são, cada um, conjugados a uma porção GalNAc monovalente. Em outras modalidades, uma porção GalNac bivalente, trivalente ou tetravalente é conjugada a um único nucleotídeo, por exemplo, dos nucleotídeos de L de uma alça de has- te. Em algumas modalidades, o ligando de direcionamento compreen- de um aptâmero.

[00020] Outro aspecto da presente divulgação fornece uma compo- sição que compreende um oligonucleotídeo da presente divulgação e um excipiente. Outro aspecto da presente divulgação fornece um mé- todo que compreende administrar uma composição da presente divul-

gação a um indivíduo. Em algumas modalidades, tais métodos são úteis para atenuar o acúmulo de ácido biliar no fígado de um indivíduo. Em algumas modalidades, tais métodos são úteis para diminuir a ex- tensão da fibrose hepática em um indivíduo em necessidade do mes- mo. Em algumas modalidades, tais métodos são úteis para diminuir as concentrações de ácido biliar circulante em um indivíduo em necessi- dade do mesmo. Em algumas modalidades, tais métodos são úteis pa- ra o tratamento de doenças hepatobiliares. Em algumas modalidades, o indivíduo sofre de PNALD.

[00021] Outro aspecto da presente divulgação fornece um oligonu- cleotídeo para reduzir a expressão de CYP27A1, o oligonucleotídeo compreendendo uma fita senso de 15 a 40 nucleotídeos de compri- mento e uma fita antissenso de 15 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que a fita senso forma uma região duplex com a fita antissenso, na qual a fita senso compreende uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787 e a fita antissenso compreende uma sequência complementar se- lecionada a partir de SEQ ID NOs: 579-580, 598-614, 763-766, 786 e

788.

[00022] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende um par de fitas senso e antissenso selecionadas de uma linha da tabe- la apresentada no Apêndice A.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00023] Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram certas modalidades e, juntamente com a descrição escrita, servem para fornecer exemplos não limitativos de certos aspectos das composições e métodos divul- gados neste documento.

[00024] A FIG. 1 é um fluxograma que descreve o projeto experi- mental usado para selecionar compostos para teste em modelos de células e animais e para desenvolver oligonucleotídeos para reduzir a expressão de CYP27A1. SAR: Relação Estrutura-Atividade.

[00025] A FIG. 2 é um esquema que mostra um exemplo não limita- tivo de um oligonucleotídeo de fita dupla com uma estrutura de tetra- alça cortada que foi conjugada a quatro frações GalNAc (diamantes amarelos).

[00026] A FIG. 3 é um gráfico que mostra a porcentagem de mRNA de CYP27A1 restante após uma triagem de oligonucleotídeo primária conduzida usando células HepG2 humanas usadas para identificar 25/27mers ativos. Os dados são normalizados para o uso de controles modificados por M15 usando os ensaios Hs HPRT 517-591 (FAM) e Hs SFRS9 594-690 (Hex).

[00027] As FIGs. 4A e 4B são um conjunto de gráficos que repre- sentam os resultados de uma avaliação de oligonucleotídeos de tetra- alça com corte (36/22mers) em células HepG2 humanas. Os dados são normalizados para células falsamente transfectadas usando um ensaio Hs SFRS9 594-690 (Hex). Para ambas as FIGs. 4A e 4B, o “S”, “AS” e “M” designam uma fita senso, fita antissenso e um padrão de modificação, respectivamente; os números após o “S” e “AS” represen- tam as SEQ ID NOs; o número após o “M” representa um padrão de modificação. A FIG. 4A mostra dados para oligonucleotídeos formados por sequências de senso SEQ ID NOs: 577 e 578, e sequências antis- senso SEQ ID NOs: 579 e 580, respectivamente. A FIG. 4B mostra dados para oligonucleotídeos formados por sequências senso SEQ ID NOs: 577 e 581-597, e sequências antissenso SEQ ID NOs: 579 e 598-614, respectivamente. “*” Representa oligonucleotídeos nos quais a base do primeiro nucleotídeo na extremidade 5' da fita antissenso é substituída por um uracil.

[00028] A FIG. 5 é um gráfico que representa os resultados de um ensaio que avalia a redução da expressão de CYP27A1 de camun-

dongo usando oligonucleotídeos de tetra-alça com corte e conjugados com frações GalNAc. O "G" nos nomes dos oligonucleotídeos designa que eles são conjugados a frações GalNAc. Os dados são mostrados para oligonucleotídeos formados por sequências de senso SEQ ID NOs: 759 a 762, e sequências antissenso SEQ ID NOs: 763 a 766, respectivamente, e tendo diferentes padrões de modificação.

[00029] A FIG. 6 é um gráfico que representa os resultados de um ensaio que avalia a redução da expressão de CYP27A1 humano usando oligonucleotídeos de tetra-alça com corte conjugados com fra- ções GalNAc. O "G" nos nomes dos oligonucleotídeos designa que eles são conjugados a frações GalNAc. Os dados são mostrados para oligonucleotídeos usando sequências senso SEQ ID NOs: 577, 581, 582, 584, 586, 588, 590, 591, 593, 594, 595 e 597, e sequências antis- senso SEQ ID NOs: 791, 598, 599, 601 , 603, 605, 607, 608, 610, 611, 612 e 614, respectivamente, e tendo diferentes padrões de modifica- ção. “*” Representa oligonucleotídeos nos quais a base do primeiro nucleotídeo na extremidade 5' da fita antissenso é substituída por um uracil.

[00030] A FIG. 7 é um esquema que mostra a redução nas concen- trações séricas de ácidos biliares após o knockdown de CYP27A1 em um modelo de camundongo com ligação parcial do duto biliar.

[00031] A FIG. 8 é uma série de imagens que mostra a redução na coloração de Sirius Red como um indicador de fibrose no lobo hepáti- co ligado de camundongos ligados ao ducto biliar parcial.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00032] De acordo com alguns aspectos, a divulgação fornece oli- gonucleotídeos direcionados ao mRNA de CYP27A1 que são eficazes para reduzir a expressão de CYP27A1 em células. Estes oligonucleo- tídeos são úteis para a redução de CYP27A1 em, por exemplo, células do fígado (por exemplo, hepatócitos) para o tratamento do acúmulo de ácido biliar (por exemplo, no contexto de doença hepatobiliar). Por conseguinte, em aspectos relacionados, a divulgação fornece métodos de tratamento do acúmulo de ácido biliar que envolvem a redução se- letiva da expressão do gene CYP27A1 no fígado (ver, por exemplo, Exemplo 1 e Figuras 7 e 8). Em certas modalidades, os oligonucleotí- deos de direcionamento de CYP27A1 fornecidos aqui são projetados para distribuição a células selecionadas de tecidos alvo (por exemplo, hepatócitos do fígado) para tratar o acúmulo de ácido biliar nesses te- cidos.

[00033] Outros aspectos da divulgação, incluindo uma descrição dos termos definidos, são fornecidos abaixo. I. Definições

[00034] Aproximadamente: como utilizado neste documento, o termo "aproximadamente" ou "cerca de", conforme aplicado a um ou mais valores de interesse, refere-se a um valor que é semelhante a um valor de referência declarado. Em certas modalidades, o termo "apro- ximadamente" ou "cerca de" refere-se a uma faixa de valores que se encaixam dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou me- nos em qualquer direção (maior ou menor que) do valor de referência indicado, a menos que indicado de outra forma ou de outra forma evi- dente a partir do contexto (exceto quando tal número exceder 100% de um valor possível).

[00035] Administração: Conforme usado neste documento, os termos "administrar" ou "administração" significam fornecer uma subs- tância (por exemplo, um oligonucleotídeo) a um indivíduo de uma ma- neira que seja farmacologicamente útil (por exemplo, para tratar uma condição no indivíduo).

[00036] Receptor de asialoglicoproteína (ASGPR): como utilizado neste documento, o termo "receptor de asialoglicoproteína" ou "AS-

GPR" refere-se a uma lectina tipo C bipartida formada por uma subu- nidade principal de 48 kDa (ASGPR-1) e uma subunidade secundária de 40 kDa (ASGPR-2). O ASGPR é expresso principalmente na super- fície sinusoidal das células do hepatócito e tem um papel importante na ligação, internalização e eliminação subsequente de glicoproteínas circulantes que contêm galactose terminal ou resíduos de N- acetilgalactosamina (asialoglicoproteínas).

[00037] Atenua: Como utilizado neste documento, o termo "atenua" significa reduz ou efetivamente para. Como um exemplo não limitativo, um ou mais dos tratamentos fornecidos neste documento podem redu- zir ou efetivamente interromper o início ou progressão do acúmulo de ácido biliar em um indivíduo. Esta atenuação pode ser exemplificada por, por exemplo, uma diminuição em um ou mais aspectos (por exemplo, sintomas, características do tecido e atividade celular, infla- matória ou imunológica, etc.) do acúmulo de ácido biliar ou sintomas resultantes de tal acúmulo, sem progressão detectável (agravamento) de um ou mais aspectos do acúmulo de ácido biliar ou sintomas resul- tantes de tal acúmulo, ou nenhum acúmulo de ácido biliar detectável ou sintomas resultantes de tal acúmulo em um indivíduo quando, de outra forma, poderiam ser esperados.

[00038] Complementar: como utilizado neste documento, o termo "complementar" se refere a uma relação estrutural entre nucleotídeos (por exemplo, em dois nucleotídeos em ácidos nucleicos opostos ou em regiões opostas de uma única fita de ácido nucleico) que permite que os nucleotídeos formem pares de bases entre si. Por exemplo, um nucleotídeo de purina de um ácido nucleico que é complementar a um nucleotídeo de pirimidina de um ácido nucleico oposto pode empare- lhar bases formando ligações de hidrogênio entre si. Em algumas mo- dalidades, os nucleotídeos complementares podem emparelhar de maneira Watson-Crick ou de qualquer outra maneira que permita a formação de duplexes estáveis. Em algumas modalidades, dois ácidos nucleicos podem ter sequências de nucleotídeos que são complemen- tares entre si, de modo a formar regiões de complementaridade, con- forme descrito neste documento.

[00039] CYP27A1: como utilizado neste documento, o termo “CYP27A1” refere-se ao gene da oxidase do citocromo P450. Este ge- ne codifica uma proteína, citocromo P450 oxidase, que é um membro da superfamília de enzimas do citocromo P450 e que é uma proteína mitocondrial que oxida intermediários de colesterol como parte da via de síntese biliar. Homólogos de CYP27A1 são conservados em uma variedade de espécies, incluindo humanos, camundongos, primatas não humanos e outros (ver, por exemplo, NCBI HomoloGene: 36040). Por exemplo, em humanos, o gene CYP27A1 codifica múltiplas varian- tes de transcrição, incluindo a variante de transcrição 1 (NM_000784.3) e a variante de transcrição 2 (XM_017003488.1). Em camundongos, CYP27A1 codifica múltiplas variantes de transcrição, nomeadamente a variante 1 de transcrição (NM_024264.5) e a varian- te 2 (XM_006495607.2).

[00040] Desoxirribonucleotídeo: como utilizado neste documento, o termo "desoxirribonucleotídeo" refere-se a um nucleotídeo tendo um hidrogênio na posição 2' de seu açúcar pentose em comparação com um ribonucleotídeo. Um desoxirribonucleotídeo modificado é um deso- xirribonucleotídeo tendo uma ou mais modificações ou substituições de átomos diferentes da posição 2', incluindo modificações ou substi- tuições no ou do açúcar, grupo fosfato ou base.

[00041] Oligonucleotídeo de fita dupla: como utilizado neste do- cumento, o termo "oligonucleotídeo de fita dupla" refere-se a um oligo- nucleotídeo que está substancialmente em uma forma duplex. Em al- gumas modalidades, o emparelhamento de base complementar da(s) região(ões) de duplex de um oligonucleotídeo de fita dupla é formado entre sequências antiparalelas de nucleotídeos de fitas de ácido nu- cleico covalentemente separadas. Em algumas modalidades, o empa- relhamento de base complementar da(s) região(ões) de duplex de um oligonucleotídeo de fita dupla é formado entre sequências antiparale- las de nucleotídeos de fitas de ácido nucleico que estão ligadas cova- lentemente. Em algumas modalidades, o emparelhamento de base complementar da(s) região(ões) duplex de um oligonucleotídeo de fita dupla é formado a partir de uma fita de ácido nucleico única que é do- brada (por exemplo, através de um hairpin) para fornecer sequências antiparalelas complementares de nucleotídeos que formam pares de bases. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo de fita dupla compreende duas fitas de ácido nucleico covalentemente separadas que são totalmente duplexadas uma com a outra. No entanto, em al- gumas modalidades, um oligonucleotídeo de fita dupla compreende duas fitas de ácido nucleico covalentemente separadas que são parci- almente duplexadas, por exemplo, tendo saliências em uma ou ambas as extremidades. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo de fita dupla compreende sequências antiparalelas de nucleotídeos que são parcialmente complementares e, portanto, podem ter uma ou mais incompatibilidades, que podem incluir incompatibilidades internas ou incompatibilidades finais.

[00042] Duplex: como utilizado neste documento, o termo "duplex", em referência a ácidos nucleicos (por exemplo, oligonucleotídeos), re- fere-se a uma estrutura formada por meio de emparelhamento de base complementar de duas sequências antiparalelas de nucleotídeos.

[00043] Excipiente: como utilizado neste documento, o termo "ex- cipiente" refere-se a um agente não terapêutico que pode ser incluído em uma composição, por exemplo, para fornecer ou contribuir para uma consistência desejada ou efeito estabilizador.

[00044] Hepatócito: como utilizado neste documento, o termo “he-

patócito” ou “hepatócitos” refere-se a células dos tecidos parenquima- tosos do fígado. Essas células constituem aproximadamente 70-85% da massa do fígado e fabricam albumina sérica, fibrinogênio e o grupo protrombina de fatores de coagulação (exceto os Fatores 3 e 4). Os marcadores para células da linhagem de hepatócitos podem incluir, mas não estão limitados a: transtirretina (Ttr), glutamina sintetase (Glul), fator nuclear de hepatócitos 1a (Hnf1a) e fator nuclear de hepa- tócitos 4a (Hnf4a). Os marcadores para hepatócitos maduros podem incluir, mas não estão limitados a: citocromo P450 (Cyp3a11), fumari- lacetoacetato hidrolase (Fah), glicose 6-fosfato (G6p), albumina (Alb) e OC2-2F8. Ver, por exemplo, Huch et al., (2013), NATURE, 494(7436): 247-250, cujo conteúdo relacionado a marcadores de hepatócitos é aqui incorporado por referência.

[00045] Alça: como utilizado neste documento, o termo "loop" refe- re-se a uma região desemparelhada de um ácido nucleico (por exem- plo, oligonucleotídeo) que é flanqueada por duas regiões antiparalelas do ácido nucleico que são suficientemente complementares entre si, de modo que sob condições de hibridação apropriadas (por exemplo, em um tampão de fosfato, em uma célula), as duas regiões antiparale- las, que flanqueiam a região desemparelhada, hibridam para formar um duplex (referido como uma "haste").

[00046] Ligação internucleotídica modificada: Como utilizado neste documento, o termo "ligação internucleotídica modificada" refe- re-se a uma ligação internucleotídica tendo uma ou mais modificações químicas em comparação com uma ligação internucleotídica de refe- rência compreendendo uma ligação fosfodiéster. Em algumas modali- dades, um nucleotídeo modificado é uma ligação de ocorrência não natural. Normalmente, uma ligação internucleotídica modificada confe- re uma ou mais propriedades desejáveis a um ácido nucleico em que a ligação internucleotídica modificada está presente. Por exemplo, um nucleotídeo modificado pode melhorar a estabilidade térmica, resistên- cia à degradação, resistência de nuclease, solubilidade, biodisponibili- dade, bioatividade, imunogenicidade reduzida, etc.

[00047] Nucleotídeo modificado: como utilizado neste documento, o termo "nucleotídeo modificado" refere-se a um nucleotídeo tendo uma ou mais modificações químicas em comparação com um nucleo- tídeo de referência correspondente selecionado de: ribonucleotídeo de adenina, ribonucleotídeo de guanina, ribonucleotídeo de citosina, ribo- nucleotídeo de uracil, desoxirribonucleotídeo de adenina, desoxirribo- nucleotídeo de guanina, citosina desoxirribonucleotídeo e timidina de- soxirribonucleotídeo. Em algumas modalidades, um nucleotídeo modi- ficado é um nucleotídeo de ocorrência não natural. Em algumas moda- lidades, um nucleotídeo modificado tem uma ou mais modificações químicas em seu açúcar, nucleobase e/ou grupo fosfato. Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado tem uma ou mais frações químicas conjugadas a um nucleotídeo de referência correspondente. Normalmente, um nucleotídeo modificado confere uma ou mais propri- edades desejáveis a um ácido nucleico no qual o nucleotídeo modifi- cado está presente. Por exemplo, um nucleotídeo modificado pode melhorar a estabilidade térmica, resistência à degradação, resistência de nuclease, solubilidade, biodisponibilidade, bioatividade, imunogeni- cidade reduzida, etc. Em certas modalidades, um nucleotídeo modifi- cado compreende uma substituição 2'-O-metila ou 2'-F na posição 2' do anel de ribose.

[00048] Estrutura de tetra-alça em corte: Uma "estrutura de tetra- alça em corte" é uma estrutura de um oligonucleotídeo RNAi caracteri- zada pela presença de fitas senso (passageiro) e antissenso (guia) separadas, em que a fita senso tem uma região de complementarida- de à fita antissenso, de modo que as duas fitas formam um duplex, e em que pelo menos uma das fitas, geralmente a fita senso, se estende a partir do duplex em que a extensão contém uma tetra-alça e duas sequências autocomplementares formando uma região de haste adja- cente à tetra-alça, na qual a tetra-alça é configurada para estabilizar a região da haste adjacente formada pelas sequências autocomplemen- tares da pelo menos uma fita.

[00049] Oligonucleotídeo: como utilizado neste documento, o ter- mo "oligonucleotídeo" refere-se a um ácido nucleico curto, por exem- plo, com menos de 100 nucleotídeos de comprimento. Um oligonucleo- tídeo pode compreender ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos e/ou nucleotídeos modificados incluindo, por exemplo, ribonucleotí- deos modificados. Um oligonucleotídeo pode ser de fita simples ou dupla. Um oligonucleotídeo pode ou não ter regiões duplex. Como um conjunto de exemplos não limitativos, um oligonucleotídeo pode ser, mas não está limitado a, um pequeno RNA interferente (siRNA), mi- croRNA (miRNA), RNA em gancho curto (shRNA), RNA interferente do substrato dicer (dsiRNA), oligonucleotídeo antissenso, siRNA curto ou siRNA de fita simples. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo de fita dupla é um oligonucleotídeo RNAi.

[00050] Saliência: Como utilizado neste documento, o termo "sali- ência" refere-se a nucleotídeo(s) terminal(is) de emparelhamento sem base resultante de uma fita ou região que se estende além do término de uma fita complementar com a qual a fita ou região forma um du- plex. Em algumas modalidades, uma saliência compreende um ou mais nucleotídeos desemparelhados que se estendem de uma região duplex no terminal 5' ou terminal 3' de um oligonucleotídeo de fita du- pla. Em certas modalidades, a saliência é uma saliência de 3' ou 5' na fita antissenso ou fita senso de um oligonucleotídeo de fita dupla.

[00051] Análogo de fosfato: como utilizado neste documento, o termo "análogo de fosfato" se refere a uma porção química que imita as propriedades eletrostáticas e/ou estéricas de um grupo fosfato. Em algumas modalidades, um análogo de fosfato é posicionado no nucleo- tídeo terminal 5' de um oligonucleotídeo no lugar de um fosfato 5', que muitas vezes é suscetível à remoção enzimática. Em algumas modali- dades, um análogo de fosfato 5' contém uma ligação resistente à fos- fatase. Exemplos de análogos de fosfato incluem fosfonatos 5', tais como fosfonato de metileno 5' (5'-MP) e 5'-(E)-vinil fosfonato (5'-VP). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem um análogo de fosfato em uma posição de carbono 4' do açúcar (referido como um "análogo de fosfato 4'") em um nucleotídeo de terminal 5'. Um exemplo de um análogo de 4'-fosfato é o oximetil fosfonato, em que o átomo de oxigênio do grupo oximetil está ligado à porção de açúcar (por exem- plo, em seu carbono 4') ou análogo do mesmo. Ver, por exemplo, o Pedido de Patente Internacional PCT/US2017/049909, depositado em 1 de setembro de 2017, o Pedido Provisório U.S. 62/383.207, deposi- tado em 2 de setembro de 2016, e 62/393.401, depositado em 12 de setembro de 2016, o teor de cada um dos quais relacionados com análogos de fosfato são aqui incorporados por referência. Outras mo- dificações foram desenvolvidas para a extremidade 5' de oligonucleo- tídeos (ver, por exemplo, WO 2011/133871; Patente U.S. 8.927.513; e Prakash et al. (2015), Nucleic Acids Res., 43(6):2993-3011, os conteú- dos de cada um dos quais relacionados a análogos de fosfato são aqui incorporados por referência).

[00052] Expressão reduzida: como utilizado neste documento, o termo "expressão reduzida" de um gene refere-se a uma diminuição na quantidade de transcrito de RNA ou proteína codificada pelo gene e/ou uma diminuição na quantidade de atividade do gene em uma célula ou indivíduo, em comparação com uma célula ou indivíduo de referência apropriado. Por exemplo, o ato de tratar uma célula com um oligonu- cleotídeo de fita dupla (por exemplo, um tendo uma fita antissenso que é complementar à sequência de mRNA de CYP27A1) pode resultar em uma diminuição na quantidade de transcrito de RNA, proteína e/ou atividade enzimática (por exemplo, codificado pelo gene CYP27A1) em comparação com uma célula que não é tratada com o oligonucleotídeo de fita dupla. Da mesma forma, "redução da expressão", como utiliza- do neste documento, refere-se a um ato que resulta na expressão re- duzida de um gene (por exemplo, CYP27A1).

[00053] Região de Complementaridade: como utilizado neste do- cumento, o termo "região de complementaridade" refere-se a uma se- quência de nucleotídeos de um ácido nucleico (por exemplo, um oligo- nucleotídeo de fita dupla) que é suficientemente complementar a uma sequência antiparalela de nucleotídeos (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo alvo dentro de um mRNA) para permitir a hibridação entre as duas sequências de nucleotídeos sob condições de hibrida- ção apropriadas, por exemplo, em um tampão de fosfato, em uma cé- lula, etc. Uma região de complementaridade pode ser totalmente com- plementar a uma sequência de nucleotídeos (por exemplo, uma se- quência de nucleotídeos alvo presente em um mRNA ou porção do mesmo). Por exemplo, uma região de complementar que é totalmente complementar a uma sequência de nucleotídeos presente em um mRNA tem uma sequência de nucleotídeos contígua que é comple- mentar, sem quaisquer incompatibilidades ou folgas, a uma sequência correspondente no mRNA. Alternativamente, uma região de comple- mentaridade pode ser parcialmente complementar a uma sequência de nucleotídeos (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos presen- te em um mRNA ou porção do mesmo). Por exemplo, uma região de complementar que é parcialmente complementar a uma sequência de nucleotídeos presente em um mRNA tem uma sequência contígua de nucleotídeos que é complementar a uma sequência correspondente no mRNA, mas que contém uma ou mais incompatibilidades ou folgas (por exemplo, 1, 2 , 3, ou mais incompatibilidades ou folgas) em com-

paração com a sequência correspondente no mRNA, desde que a re- gião de complementaridade permaneça capaz de hibridar com o mRNA sob condições de hibridação apropriadas.

[00054] Ribonucleotídeo: como utilizado neste documento, o ter- mo "ribonucleotídeo" refere-se a um nucleotídeo tendo uma ribose co- mo seu açúcar pentose, que contém um grupo hidroxil em sua posição 2'. Um ribonucleotídeo modificado é um ribonucleotídeo tendo uma ou mais modificações ou substituições de átomos diferentes da posição 2', incluindo modificações ou substituições no ou da ribose, grupo fos- fato ou base.

[00055] Oligonucleotídeo RNAi: como utilizado neste documento, o termo "oligonucleotídeo RNAi" refere-se a (a) um oligonucleotídeo de fita dupla tendo uma fita senso (passageiro) e uma fita antissenso (guia), em que a fita antissenso ou parte da fita antissenso é usada pe- la endonuclease Argonauta 2 (Ago2) na clivagem de um mRNA alvo ou (b) um oligonucleotídeo de fita simples com uma fita única antis- senso, em que essa fita antissenso (ou parte dessa fita antissenso) é usada pela endonuclease Ago2 na clivagem de um mRNA alvo.

[00056] Fita: como utilizado neste documento, o termo "fita" refere- se a uma única sequência contígua de nucleotídeos ligados entre si através de ligações internucleotídicas (por exemplo, ligações fosfodi- éster, ligações fosforotioato). Em algumas modalidades, uma fita tem duas extremidades livres, por exemplo, uma extremidade 5' e uma ex- tremidade 3'.

[00057] Indivíduo: como utilizado neste documento, o termo "indi- víduo" significa qualquer mamífero, incluindo camundongos, coelhos e humanos. Em uma modalidade, o indivíduo é um primata humano ou não humano. Os termos "indivíduo" ou "paciente" podem ser usados indistintamente com "indivíduo".

[00058] Sintético: como utilizado neste documento, o termo "sinté-

tico" refere-se a um ácido nucleico ou outra molécula que é sintetizada artificialmente (por exemplo, usando uma máquina (por exemplo, um sintetizador de ácido nucleico de estado sólido)) ou que de outra forma não é derivado de uma fonte natural (por exemplo, uma célula ou or- ganismo) que normalmente produz a molécula.

[00059] Ligando de direcionamento: como utilizado neste docu- mento, o termo "ligando de direcionamento" refere-se a uma molécula (por exemplo, um carboidrato, amino açúcar, colesterol, polipeptídeo ou lipídeo) que se liga seletivamente a uma molécula cognata (por exemplo, um receptor) de um tecido ou célula de interesse e que é conjugável a outra substância para fins de direcionamento da outra substância para o tecido ou célula de interesse. Por exemplo, em al- gumas modalidades, um ligando de direcionamento pode ser conjuga- do a um oligonucleotídeo para fins de direcionamento do oligonucleo- tídeo a um tecido específico ou célula de interesse. Em algumas mo- dalidades, um ligando de direcionamento se liga seletivamente a um receptor de superfície celular. Por conseguinte, em algumas modalida- des, um ligando de direcionamento quando conjugado a um oligonu- cleotídeo facilita a entrega do oligonucleotídeo em uma célula particu- lar através da ligação seletiva a um receptor expresso na superfície da célula e internalização endossômica pela célula do complexo que compreende o oligonucleotídeo, o ligando de direcionamento e o re- ceptor. Em algumas modalidades, um ligando de direcionamento é conjugado a um oligonucleotídeo por meio de um ligante que é clivado após ou durante a internalização celular de modo que o oligonucleotí- deo seja liberado do ligando de direcionamento na célula.

[00060] Tetra-alça: Como utilizado neste documento, o termo "te- tra-alça" se refere a uma alça que aumenta a estabilidade de um du- plex adjacente formado pela hibridação de sequências de flanquea- mento de nucleotídeos. O aumento na estabilidade é detectável como um aumento na temperatura de fusão (Tm) de um duplex de haste ad- jacente que é maior do que a Tm do duplex de haste adjacente espera- do, em média, de um conjunto de loops de comprimento comparável consistindo em sequências selecionadas aleatoriamente de nucleotí- deos.

Por exemplo, uma tetra-alça pode conferir uma temperatura de fusão de pelo menos 50°C, pelo menos 55°C, pelo menos 56°C, pelo menos 58°C, pelo menos 60°C, pelo menos 65°C ou pelo menos 75°C em 10 mM NaHPO4 para um hairpin compreendendo um duplex de pe- lo menos 2 pares de bases de comprimento.

Em algumas modalida- des, um tetra-alça pode estabilizar um par de bases em um duplex de haste adjacente por meio de interações de empilhamento.

Além disso, as interações entre os nucleotídeos em uma tetra-alça incluem, sem limitação, emparelhamento de bases não Watson-Crick, interações de empilhamento, ligações de hidrogênio e interações de contato (Che- ong et al., Nature 1990 Aug. 16; 346(6285):680-2; Heus and Pardi, SCIENCE 1991 Jul. 12; 253(5016):191-4). Em algumas modalidades, uma tetra-alça compreende ou consiste em 3 a 6 nucleotídeos e é tipi- camente de 4 a 5 nucleotídeos.

Em certas modalidades, uma tetra- alça compreende ou consiste em três, quatro, cinco ou seis nucleotí- deos, que podem ou não ser modificados (por exemplo, que podem ou não ser conjugados a uma porção de direcionamento). Em uma moda- lidade, uma tetra-alça consiste em quatro nucleotídeos.

Qualquer nu- cleotídeo pode ser usado na tetra-alça e os símbolos IUPAC-IUB pa- drão para tais nucleotídeos podem ser usados como descrito em Cor- nish-Bowden (1985) NUCL.

ACIDS RES. 13: 3021-3030. Por exemplo, a letra "N" pode ser usada para significar que qualquer base pode estar nessa posição, a letra "R" pode ser usada para mostrar que A (adeni- na) ou G (guanina) pode estar nessa posição, e "B" pode ser usado para mostrar que C (citosina), G (guanina) ou T (timina) podem estar nessa posição.

Exemplos de tetra-alças incluem a família UNCG de tetra-alças (por exemplo, UUCG), a família GNRA de tetra-alças (por exemplo, GAAA), e a tetra-alça CUUG (Woese et al., PROC NATL ACAD SCI USA. 1990 November; 87(21):8467-71; Antao et al., NUCLEIC ACIDS RES. 1991 Nov. 11; 19(21):5901-5). Exemplos de tetra-alças de DNA incluem a família d(GNNA) de tetra-alças (por exemplo, d(GTTA)), a família d(GNRA) de tetra-alças, a família d(GNAB) de tetra-alças, a família d(CNNG) de tetra-alças, e a família d(TNCG) de tetra-alças (por exemplo, d(TTCG)). Ver, por exemplo: Nakano et al. BIOCHEMISTRY, 41 (48), 14281-14292, 2002. SHINJI et al. NIPPON KAGAKKAI KOEN YOKO- SHU VOL. 78th; NO. 2; PAGE. 731(2000), que são incorporados por referência neste documento para suas divulgações relevantes. Em al- gumas modalidades, o tetra-alça está contido dentro de uma estrutura de tetra-alça em corte.

[00061] Tratar: como utilizado neste documento, o termo "tratar" re- fere-se ao ato de fornecer cuidados a um indivíduo em necessidade do mesmo, por exemplo, através da administração de um agente terapêu- tico (por exemplo, um oligonucleotídeo) ao indivíduo, com o objetivo de melhorar a saúde e/ou bem-estar do indivíduo com relação a uma condição existente (por exemplo, uma doença, distúrbio) ou para pre- venir ou diminuir a probabilidade de ocorrência de uma condição. Em algumas modalidades, o tratamento envolve a redução da frequência ou gravidade de pelo menos um sinal, sintoma ou fator contribuinte de uma condição (por exemplo, doença, distúrbio) experimentada por um indivíduo. II. Inibidores baseados em oligonucleotídeos i. Oligonucleotídeos de direcionamento de CYP27A1

[00062] Oligonucleotídeos potentes foram identificados aqui através do exame do mRNA CYP27A1, incluindo mRNAs de múltiplas espé- cies diferentes (humano, macaco rhesus e camundongo (ver, por exemplo, Exemplo 1)) e testes in vitro e in vivo. Esses oligonucleotí-

deos podem ser usados para atingir o benefício terapêutico para indi- víduos que experimentam acúmulo de ácido biliar e/ou tendo doença hepatobiliar do fígado, reduzindo a atividade do CYP27A1 e, conse- quentemente, diminuindo os níveis de ácido biliar e/ou fibrose hepáti- ca. Por exemplo, potentes oligonucleotídeos de RNAi são fornecidos neste documento que têm uma fita senso compreendendo, ou consis- tindo em, uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NO: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787 e uma fita antis- senso que compreende ou consiste em uma sequência complementar selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 579-580, 598- 614, 763-766, 786 e 788, como também está disposto na tabela forne- cida no Apêndice A (por exemplo, uma fita senso compreendendo uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 577 e uma fita antis- senso compreendendo uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 579). As sequências podem ser colocadas em várias estruturas (ou formatos) diferentes, conforme descrito neste documento.

[00063] Em algumas modalidades, foi descoberto que certas regi- ões do mRNA de CYP27A1 são pontos de acesso para direcionamen- to porque são mais receptivas do que outras regiões à inibição basea- da em oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, uma região de ponto de acesso de CYP27A1 consiste em uma sequência como em qualquer uma das SEQ ID NOs: 767-781. Estas regiões de mRNA de CYP27A1 podem ser direcionadas usando oligonucleotídeos como aqui discutido para fins de inibição da expressão de mRNA de CYP27A1.

[00064] Por conseguinte, em algumas modalidades, os oligonucleo- tídeos fornecidos neste documento são projetados de modo a ter regi- ões de complementaridade com o mRNA de CYP27A1 (por exemplo, dentro de um ponto de acesso do mRNA de CYP27A1) para fins de direcionamento do mRNA em células e inibição de sua expressão. A região de complementaridade é geralmente de um comprimento ade- quado e conteúdo de base para permitir o recozimento do oligonucleo- tídeo (ou uma fita do mesmo) com o mRNA de CYP27A1 para fins de inibição de sua expressão.

[00065] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo aqui divul- gado compreende uma região de complementaridade (por exemplo, em uma fita antissenso de um oligonucleotídeo de fita dupla) que é pe- lo menos parcialmente complementar a uma sequência conforme es- tabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-288, 615-686 e 789, que incluem o mapeamento de sequências nas regiões de ponto de acesso do mRNA de CYP27A1. Em algumas modalidades, um oligo- nucleotídeo aqui divulgado compreende uma região de complementa- ridade (por exemplo, em uma fita antissenso de um oligonucleotídeo de fita dupla) que é totalmente complementar a uma sequência con- forme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-288, 615 - 686 e 789. Em algumas modalidades, uma região de complementari- dade de um oligonucleotídeo que é complementar aos nucleotídeos contíguos de uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-288, 615-686 e 789 abrange todo o comprimento de uma fita antissenso. Em algumas modalidades, uma região de complementaridade de um oligonucleotídeo que é complementar aos nucleotídeos contíguos de uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-288, 615-686 e 789 abrange uma porção de todo o comprimento de uma fita antissenso (por exemplo, todos menos dois nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo aqui divulgado com- preende uma região de complementaridade (por exemplo, em uma fita antissenso de um oligonucleotídeo de fita dupla) que é pelo menos parcialmente (por exemplo, totalmente) complementar a um trecho contíguo de nucleotídeos abrangendo os nucleotídeos 1-19 de uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597 e 759-762, 785 e 787.

[00066] Em algumas modalidades, a região de complementaridade é pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24 ou pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento. Em algu- mas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido neste documento tem uma região de complementaridade ao mRNA de CYP27A1 que está no intervalo de 12 a 30 (por exemplo, 12 a 30, 12 a 22, 15 a 25, 17 a 21, 18 a 27, 19 a 27 ou 15 a 30) nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido aqui tem uma região de complementaridade ao mRNA de CYP27A1 que é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento.

[00067] Em algumas modalidades, uma região de complementari- dade ao mRNA de CYP27A1 pode ter uma ou mais incompatibilidades em comparação com uma sequência correspondente de mRNA de CYP27A1. Uma região de complementaridade em um oligonucleotídeo pode ter até 1, até 2, até 3, até 4, etc. incompatibilidades desde que mantenha a capacidade de formar pares de bases complementares com mRNA de CYP27A1 sob condições de hibridação apropriadas. Alternativamente, uma região de complementaridade em um oligonu- cleotídeo pode ter não mais que 1, não mais que 2, não mais que 3 ou não mais que 4 incompatibilidades, desde que mantenha a capacidade de formar pares de bases complementares com mRNA de CYP27A1 sob condições de hibridação apropriadas. Em algumas modalidades, se houver mais de uma incompatibilidade em uma região de comple- mentaridade, eles podem ser posicionados consecutivamente (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais em uma linha), ou intercalados em toda a re-

gião de complementaridade, desde que o oligonucleotídeo mantenha a capacidade de formar pares de bases complementares com mRNA de CYP27A1 sob condições de hibridação apropriadas.

[00068] Ainda, em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de fita dupla aqui fornecidos compreendem, consistem em, uma fita senso tendo uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NO: 1-288, 615-686 e 789 e uma fita antissenso compreen- dendo um sequência complementar selecionada a partir da SEQ ID NO: 289-576, como está disposta na tabela fornecida no Apêndice A (por exemplo, uma fita senso compreendendo uma sequência confor- me estabelecido na SEQ ID NO: 1 e uma fita antissenso compreen- dendo uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 289). ii. Estruturas de oligonucleotídeo

[00069] Há uma variedade de estruturas de oligonucleotídeos que são úteis para direcionar o mRNA de CYP27A1 nos métodos da pre- sente divulgação, incluindo RNAi, miRNA, etc. Qualquer uma das es- truturas aqui descritas ou em outro lugar pode ser usada como uma estrutura para incorporar ou direcionar uma sequência aqui descrita (por exemplo, uma sequência de ponto de acesso de CYP27A1, como aquelas ilustradas em SEQ ID NOs: 767-781). Os oligonucleotídeos de fita dupla para direcionar a expressão de CYP27A1 (por exemplo, através da via de RNAi) geralmente têm uma fita senso e uma fita an- tissenso que formam um duplex entre si. Em algumas modalidades, as fitas senso e antissenso não estão ligadas covalentemente. No entan- to, em algumas modalidades, as fitas senso e antissenso estão ligadas covalentemente.

[00070] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de fita du- pla para reduzir a expressão de CYP27A1 envolvem interferência de RNA (RNAi). Por exemplo, oligonucleotídeos de RNAi foram desenvol- vidos com cada fita tendo tamanhos de 19-25 nucleotídeos com pelo menos uma saliência 3' de 1 a 5 nucleotídeos (ver, por exemplo, Pa- tente U.S. 8.372.968). Também foram desenvolvidos oligonucleotídeos mais longos que são processados pela enzima Dicer para gerar produ- tos de RNAi ativos (ver, por exemplo, Patente U.S. 8.883.996). Traba- lhos adicionais produziram oligonucleotídeos de fita dupla estendidos onde pelo menos uma extremidade de pelo menos uma fita é estendi- da para além de uma região de direcionamento duplex, incluindo estru- turas onde uma das fitas inclui uma estrutura de tetra-alça de estabili- zação termodinâmica (ver, por exemplo, Patentes U.S. 8.513.207 e

8.927.705, bem como WO2010033225, que são aqui incorporados por referência para a sua divulgação destes oligonucleotídeos). Essas es- truturas podem incluir extensões de fita simples (em um ou ambos os lados da molécula), bem como extensões de fita dupla.

[00071] Em algumas modalidades, as sequências aqui descritas podem ser incorporadas ou direcionadas usando oligonucleotídeos que compreendem fitas senso e antissenso separadas que estão na faixa de 17 a 36 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalida- des, são fornecidos oligonucleotídeos que incorporam tais sequências que têm uma estrutura de tetra-alça dentro de uma extensão 3' de sua fita senso, e dois nucleotídeos salientes terminais na extremidade 3' da fita antissenso separada. Em algumas modalidades, os dois nucleotí- deos salientes terminais são GG. Normalmente, um ou ambos os nu- cleotídeos GG terminais da fita antissenso são ou não complementa- res ao alvo.

[00072] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que incor- poram tais sequências são fornecidos com fitas senso e antissenso que estão na faixa de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento. Em al- gumas modalidades, uma saliência 3' é fornecida nas fitas senso, an- tissenso ou ambas as cadeias senso e antissenso que têm 1 ou 2 nu- cleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucle-

otídeo tem uma fita guia de 23 nucleotídeos e uma fita passageira de 21 nucleotídeos, em que a extremidade 3' da fita passageira e a ex- tremidade 5' da fita guia formam uma extremidade cega e onde a fita guia tem uma saliência de dois nucleotídeos 3'.

[00073] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem es- tar no intervalo de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem ter uma saliência (por exemplo, de 1, 2 ou 3 nucleotídeos de comprimento) na extremidade 3' das fitas senso e/ou antissenso. Em algumas modalidades, os oligo- nucleotídeos (por exemplo, siRNAs) podem compreender uma fita guia de 21 nucleotídeos que é antissenso para um RNA alvo e uma fita passageira complementar, na qual ambas as fitas recozem para for- mar um duplex de 19 pb e saliências de 2 nucleotídeos em uma ou ambas as extremidades 3'. Ver, por exemplo, US9012138, US9012621 e US9193753, os conteúdos de cada um dos quais são incorporados neste documento para suas divulgações relevantes. Em algumas mo- dalidades, um oligonucleotídeo da invenção tem uma fita senso de 36 nucleotídeos que compreende uma região que se estende além do duplex antissenso-senso, onde a região de extensão tem uma estrutu- ra de haste-tetra-alça onde a haste é um duplex de seis pares de ba- ses e onde tem quatro nucleotídeos. Em algumas dessas modalida- des, três ou quatro dos nucleotídeos de tetra-alça são, cada um, con- jugados a um ligando GalNac monovalente. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da invenção compre- ende uma fita senso de 25 nucleotídeos e uma fita antissenso de 27 nucleotídeos que, quando atuada por uma enzima dicer, resulta em uma fita antissenso que é incorporada ao RISC maduro.

[00074] Outros projetos de oligonucleotídeos para uso com as com- posições e métodos aqui divulgados incluem: siRNAs de 16-mer (ver, por exemplo, Nucleic Acids in Chemistry and Biology. Blackburn (ed.),

Royal Society of Chemistry, 2006), shRNAs (por exemplo, tendo 19 bp ou hastes mais curtas; ver, por exemplo, Moore et al. Methods Mol. Bi- ol. 2010; 629: 141-158), siRNAs cegos (por exemplo, de 19 bps de comprimento; ver: por exemplo, Kraynack and Baker, RNA Vol. 12, p163-176 (2006)), siRNAs assimétricos (aiRNA; ver, por exemplo, Sun et al., NAT. BIOTECHNOL. 26, 1379–1382 (2008)), siRNA de duplex mais curto assimétrico (ver, por exemplo, Chang et al., MOL THER. 2009 Apr; 17(4): 725-32), siRNAs de bifurcação (ver, por exemplo, Hohjoh, FEBS LETTERS, Vol 557, edições 1-3; Jan 2004, p 193-198), siRNAs de fita única (Elsner; NATURE BIOTECHNOLOGY 30, 1063 (2012)), siRNAs circu- lares em forma de haltere (ver, por exemplo, Abe et al. J AM CHEM SOC 129: 15108-15109 (2007)), e pequeno RNA de interferência segmen- tado internamente (sisiRNA; ver, por exemplo, Bramsen et al., NUCLEIC ACIDS RES. 2007 Sep; 35(17): 5886–5897). Cada uma das referências anteriores é incorporada por referência em sua totalidade para as di- vulgações relacionadas. Outros exemplos não limitativos de estruturas de oligonucleotídeo que podem ser usados em algumas modalidades para reduzir ou inibir a expressão de CYP27A1 são microRNA (miR- NA), RNA em gancho curto (shRNA) e siRNA curto (ver, por exemplo, Hamilton et al., EMBO J., 2002, 21(17): 4671-4679; ver também Pedido U.S. 20090099115). a. Fitas antissenso

[00075] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo aqui divul- gado para direcionar CYP27A1 compreende uma fita antissenso que compreende ou consiste em uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 289-576, 687-758 e 790 ou 579- 580, 598-614 , 763-766, 786, 788 e 792. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma fita antissenso que compreende ou consiste em pelo menos 12 (por exemplo, pelo menos 12, pelo me- nos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos

17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pe- lo menos 22 ou pelo menos 23) nucleotídeos contíguos de uma se- quência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 289-576, 687-758 e 790 ou 579-580, 598-614, 763-766, 786, 788 e

792.

[00076] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo de fita du- pla pode ter uma fita antissenso de até 40 nucleotídeos de comprimen- to (por exemplo, até 40, até 35, até 30, até 27, até 25, até 21, até 19, até 17 ou até 12 nucleotídeos de comprimento). Em algumas modali- dades, um oligonucleotídeo pode ter uma fita antissenso de pelo me- nos 12 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 19, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 25, pelo menos 27, pelo menos pelo menos 30, pelo menos 35 ou pelo menos 38 nucleotídeos de comprimento). Em algumas modali- dades, um oligonucleotídeo pode ter uma fita antissenso em um inter- valo de 12 a 40 (por exemplo, 12 a 40, 12 a 36, 12 a 32, 12 a 28, 15 a 40, 15 a 36, 15 a 32, 15 a 28, 17 a 22, 17 a 25, 19 a 27, 19 a 30, 20 a 40, 22 a 40, 25 a 40 ou 32 a 40) nucleotídeos de comprimento. Em al- gumas modalidades, um oligonucleotídeo pode ter uma fita antissenso de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucleotídeos de compri- mento.

[00077] Em algumas modalidades, uma fita antissenso de um oligo- nucleotídeo pode ser referida como uma "fita guia". Por exemplo, se uma fita antissenso pode se envolver com o complexo de silenciamen- to induzido por RNA (RISC) e se ligar a uma proteína Argonauta, ou se envolver ou se ligar a um ou mais fatores semelhantes e silenciar dire- to de um gene alvo, isso pode ser referido como uma fita guia. Em al- gumas modalidades, uma fita senso complementar a uma fita guia po- de ser referido como uma "fita de passageiro".

b. Fitas senso

[00078] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo aqui divul- gado para direcionar CYP27A1 compreende ou consiste em uma se- quência de fita senso conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-288, 615-686 e 789 ou 577-578, 581-597, 759 -762, 785 e 787. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem uma fita senso que compreende ou consiste em pelo menos 12 (por exem- plo, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos pelo me- nos 20, pelo menos 21, pelo menos 22 ou pelo menos 23) nucleotí- deos contíguos de uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-288, 615-686 e 789 ou 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787.

[00079] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo pode ter uma fita senso (ou fita passageira) de até 40 nucleotídeos de compri- mento (por exemplo, até 40, até 36, até 30, até 27, até 25, até 21, até 19, até 17 ou até 12 nucleotídeos de comprimento). Em algumas mo- dalidades, um oligonucleotídeo pode ter uma fita senso de pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 19, pelo menos 21, pelo menos 25, pelo menos 27, pelo menos pelo menos 30, pelo menos 36 ou pelo menos 38 nu- cleotídeos de comprimento). Em algumas modalidades, um oligonu- cleotídeo pode ter uma fita senso em um intervalo de 12 a 40 (por exemplo, 12 a 40, 12 a 36, 12 a 32, 12 a 28, 15 a 40, 15 a 36, 15 a 32, 15 a 28, 17 a 21, 17 a 25, 19 a 27, 19 a 30, 20 a 40, 22 a 40, 25 a 40 ou 32 a 40) nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo pode ter uma fita senso de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucleotídeos de comprimento.

[00080] Em algumas modalidades, uma fita senso compreende uma estrutura de haste-alça em sua extremidade 3'. Em algumas modalida- des, uma fita senso compreende uma estrutura de haste-alça em sua extremidade 5'. Em algumas modalidades, uma haste é um duplex de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 pares de bases de compri- mento. Em algumas modalidades, uma haste-alça fornece à molécula uma melhor proteção contra a degradação (por exemplo, degradação enzimática) e facilita as características de direcionamento para distri- buição a uma célula alvo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma alça fornece nucleotídeos adicionados nos quais a modificação pode ser feita sem afetar substancialmente a atividade de inibição da expressão genética de um oligonucleotídeo. Em certas modalidades, um oligonucleotídeo é fornecido neste documento em que a fita senso compreende (por exemplo, em sua extremidade 3′) uma haste-alça estabelecida como: S1-L-S2, na qual S1 é complementar S2, e em que L forma uma alça entre S1 e S2 de até 10 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos de comprimento). A FIG. 2 representa um exemplo não limitativo de tal oligonucleotídeo.

[00081] Em algumas modalidades, uma alça (L) de uma haste-alça é uma tetra-alça (por exemplo, dentro de uma estrutura de tetra-alça em corte). Uma tetra-alça pode conter ribonucleotídeos, desoxirribonu- cleotídeos, nucleotídeos modificados e combinações dos mesmos. Normalmente, uma tetra-alça tem de 4 a 5 nucleotídeos. c. Comprimento Duplex

[00082] Em algumas modalidades, um duplex formado entre uma fita senso e antissenso é de pelo menos 12 (por exemplo, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pe- lo menos 20 ou pelo menos 21) nucleotídeos de comprimento. Em al- gumas modalidades, um duplex formado entre uma fita senso e antis- senso está no intervalo de 12-30 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 12 a 30, 12 a 27, 12 a 22, 15 a 25, 18 a 30, 18 a 22 , 18 a 25,

18 a 27, 18 a 30, 19 a 30 ou 21 a 30 nucleotídeos de comprimento). Em algumas modalidades, um duplex formado entre uma fita senso e antissenso é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modali- dades, um duplex formado entre uma fita senso e antissenso não abrange todo o comprimento da fita senso e/ou antissenso. Em algu- mas modalidades, um duplex entre uma fita senso e antissenso abrange todo o comprimento das fitas senso ou antissenso. Em certas modalidades, um duplex entre uma fita senso e antissenso se estende por todo o comprimento da fita senso e da fita antissenso. d. Extremidades de oligonucleotídeo

[00083] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido aqui compreende fitas senso e antissenso, de modo que haja uma sa- liência 3' na fita senso ou na fita antissenso, ou ambas as fitas senso e antissenso. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos neste documento têm uma extremidade 5' que é termodinamicamente menos estável em comparação com a outra extremidade 5'. Em algu- mas modalidades, é fornecido um oligonucleotídeo assimétrico que in- clui uma extremidade cega na extremidade 3' de uma fita senso e uma saliência na extremidade 3' de uma fita antissenso. Em algumas moda- lidades, uma saliência 3' em uma fita antissenso tem 1-8 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleotídeos de comprimento).

[00084] Normalmente, um oligonucleotídeo para RNAi tem uma sa- liência de dois nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso (guia). No entanto, outras saliências são possíveis. Em algumas moda- lidades, uma saliência é uma saliência 3' compreendendo um compri- mento de entre um e seis nucleotídeos, opcionalmente, um a cinco, um a quatro, um a três, um a dois, dois a seis, dois a cinco, dois a qua- tro, dois a três, três a seis, três a cinco, três a quatro, quatro a seis,

quatro a cinco, cinco a seis nucleotídeos, ou um, dois, três, quatro, cinco ou seis nucleotídeos. No entanto, em algumas modalidades, a saliência é uma saliência de 5′ compreendendo um comprimento de entre um e seis nucleotídeos, opcionalmente, um a cinco, um a quatro, um a três, um a dois, dois a seis, dois a cinco, dois a quatro, dois a três, três a seis, três a cinco, três a quatro, quatro a seis, quatro a cin- co, cinco a seis nucleotídeos, ou um, dois, três, quatro, cinco ou seis nucleotídeos.

[00085] Em algumas modalidades, um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4) nucleotídeos terminais da extremidade 3' ou 5' de uma fita senso e/ou antissenso são modificados. Por exemplo, em algumas modalida- des, um ou dois nucleotídeos terminais da extremidade 3' de uma fita antissenso são modificados. Em algumas modalidades, o último nu- cleotídeo na extremidade 3' de uma fita antissenso é modificado, por exemplo, compreende a modificação 2', por exemplo, um 2'-O- metoxietila. Em algumas modalidades, os últimos um ou dois nucleotí- deos terminais na extremidade 3' de uma fita antissenso são comple- mentares ao alvo. Em algumas modalidades, os últimos um ou dois nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso não são complemen- tares ao alvo. Em algumas modalidades, a extremidade 5' e/ou a ex- tremidade 3' de uma fita senso ou antissenso tem um nucleotídeo cap invertido. e. Incompatibilidades

[00086] Em algumas modalidades, há uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) incompatibilidades entre uma fita senso e antissenso. Se houver mais de uma incompatibilidade entre uma fita senso e antis- senso, elas podem ser posicionadas consecutivamente (por exemplo, 2, 3 ou mais em uma linha) ou intercaladas em toda a região de com- plementaridade. Em algumas modalidades, o terminal 3' da fita senso contém uma ou mais incompatibilidades. Em uma modalidade, duas incompatibilidades são incorporadas no terminal 3' da fita senso. Em algumas modalidades, incompatibilidades de base ou desestabilização de segmentos na extremidade 3' da fita senso do oligonucleotídeo me- lhorou a potência de duplexes sintéticos em RNAi, possivelmente atra- vés da facilitação do processamento por Dicer. iii. Oligonucleotídeos de fita simples

[00087] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo para reduzir a expressão de CYP27A1, conforme descrito neste documento, é de fita simples. Tais estruturas podem incluir, mas não estão limitadas a oligonucleotídeos de RNAi de fita simples. Esforços recentes demons- traram a atividade de oligonucleotídeos de RNAi de fita simples (ver, por exemplo, Matsui et al. (May 2016), Molecular Therapy, Vol. 24(5), 946-955). No entanto, em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos neste documento são oligonucleotídeos antissenso (ASOs). Um oligonucleotídeo antissenso é um oligonucleotídeo de fita simples que tem uma sequência de nucleobase que, quando escrita na direção 5′ para 3′, compreende o complemento reverso de um segmento dire- cionado de um ácido nucleico particular e é adequadamente modifica- do (por exemplo, como um gapmer) para induzir a clivagem mediada por RNaseH de seu RNA alvo em células ou (por exemplo, como um misturador) de modo a inibir a tradução do mRNA alvo em células. Os oligonucleotídeos antissenso para uso na presente divulgação podem ser modificados de qualquer maneira adequada conhecida na técnica incluindo, por exemplo, como mostrado na Patente U.S. 9.567.587, que é incorporada por referência neste documento para sua divulga- ção em relação à modificação de oligonucleotídeos antissenso (inclu- indo, por exemplo, comprimento, frações de açúcar da nucleobase (pi- rimidina, purina) e alterações da porção heterocíclica da nucleobase). Além disso, as moléculas antissenso têm sido usadas há décadas pa- ra reduzir a expressão de genes alvo específicos (ver, por exemplo,

Bennett et al.; PHARMACOLOGY OF ANTISENSE DRUGS, ANNUAL REVIEW OF PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY, Vol. 57: 81-105). iv. Modificações de oligonucleotídeos

[00088] Os oligonucleotídeos podem ser modificados de várias ma- neiras para melhorar ou controlar a especificidade, estabilidade, distri- buição, biodisponibilidade, resistência da degradação de nuclease, imunogenicidade, propriedades de pareamento de base, distribuição de RNA e absorção celular e outras características relevantes para uso terapêutico ou de pesquisa. Ver, por exemplo, Bramsen et al., Nu- cleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881; Bramsen and Kjems (FRON- TIERS IN GENETICS, 3 (2012): 1-22). Por conseguinte, em algumas mo- dalidades, os oligonucleotídeos da presente divulgação podem incluir uma ou mais modificações adequadas. Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado tem uma modificação em sua base (ou nucleo- base), o açúcar (por exemplo, ribose, desoxirribose) ou o grupo fosfa- to.

[00089] O número de modificações em um oligonucleotídeo e as posições dessas modificações de nucleotídeo podem influenciar as propriedades de um oligonucleotídeo. Por exemplo, os oligonucleotí- deos podem ser distribuídos in vivo, conjugando-os ou englobando-os em uma nanopartícula lipídica (LNP) ou transportador semelhante. No entanto, quando um oligonucleotídeo não é protegido por um LNP ou transportador semelhante (por exemplo, "distribuição nua"), pode ser vantajoso para pelo menos alguns de seus nucleotídeos serem modifi- cados. Por conseguinte, em certas modalidades de qualquer um dos oligonucleotídeos aqui fornecidos, todos ou substancialmente todos os nucleotídeos de um oligonucleotídeo são modificados. Em certas mo- dalidades, mais da metade dos nucleotídeos são modificados. Em cer- tas modalidades, menos da metade dos nucleotídeos são modificados. Normalmente, com a distribuição nua, cada nucleotídeo é modificado na posição 2' do grupo de açúcar desse nucleotídeo. Essas modifica- ções podem ser reversíveis ou irreversíveis. Normalmente, a modifica- ção da posição 2' é um 2'-fluoro, 2'-O-metila, etc. Em algumas modali- dades, um oligonucleotídeo conforme divulgado neste documento tem um número e tipo de nucleotídeos modificados suficientes para causar a característica desejada (por exemplo, proteção contra degradação enzimática, capacidade de direcionar uma célula desejada após admi- nistração in vivo e/ou estabilidade termodinâmica). a. Modificações de açúcar

[00090] Em algumas modalidades, um açúcar modificado (também referido aqui como um análogo de açúcar) inclui uma desoxirribose modificada ou porção de ribose, por exemplo, em que uma ou mais modificações ocorrem na posição de carbono 2′, 3′, 4′ e/ou 5′ do açú- car. Em algumas modalidades, um açúcar modificado também pode incluir estruturas de carbono alternativas não naturais, como aquelas presentes em ácidos nucleicos bloqueados ("LNA") (ver, por exemplo, Koshkin et al. (1998), TETRAHEDRON 54, 3607-3630), ácidos nucleicos desbloqueados (“UNA”) (ver, por exemplo, Snead et al. (2013), MO- LECULAR THERAPY – NUCLEIC ACIDS, 2, e103), and bridged nucleic acids (“BNA”) (ver, por exemplo, Imanishi and Obika (2002), The Royal So- ciety of Chemistry, CHEM. COMMUN., 1653-1659). Koshkin et al., Snead et al., and Imanishi and Obika são incorporados neste documento por referência para suas divulgações relacionadas a modificações de açú- car.

[00091] Em algumas modalidades, uma modificação de nucleotídeo em um açúcar compreende uma modificação 2′. Em algumas modali- dades, a modificação 2′ pode ser ácido 2′-aminoetila, 2′-fluoro, 2′-O- metila, 2′-O-metoxietila ou 2′-desóxi-2′-fluoro-β-d-arabinonucleico. Normalmente, a modificação é 2'-fluoro, 2'-O-metila ou 2'-O- metoxietila. No entanto, uma grande variedade de modificações de po-

sição 2'que foram desenvolvidas para uso em oligonucleotídeos po- dem ser usadas em oligonucleotídeos aqui divulgados. Ver, por exem- plo, Bramsen et al., Nucleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881. Em al- gumas modalidades, uma modificação em um açúcar compreende uma modificação do anel de açúcar, que pode compreender a modifi- cação de um ou mais carbonos do anel de açúcar. Por exemplo, uma modificação de um açúcar de um nucleotídeo pode compreender uma ligação entre o carbono 2'e um carbono 1' ou 4 'do açúcar. Por exem- plo, a ligação pode compreender uma ponte de etileno ou metileno. Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado tem um açúcar acíclico que carece de uma ligação de carbono 2' a 3'. Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado tem um grupo tiol, por exem- plo, na posição 4' do açúcar.

[00092] Em algumas modalidades, o grupo terminal 3' (por exemplo, um 3'-hidroxil) é um grupo fosfato ou outro grupo, que pode ser usado, por exemplo, para anexar ligantes, adaptadores ou marcadores ou pa- ra a ligação direta de um oligonucleotídeo para outro ácido nucleico. b. Fosfatos terminais 5'

[00093] Os grupos fosfato 5'-terminais de oligonucleotídeos podem, ou em algumas circunstâncias, intensificam a interação com o Argo- nauta 2. No entanto, os oligonucleotídeos que compreendem um grupo 5'-fosfato podem ser suscetíveis à degradação via fosfatases ou outras enzimas, o que pode limitar sua biodisponibilidade in vivo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos incluem análogos de 5′ fosfatos que são resistentes a tal degradação. Em algumas modalidades, um aná- logo de fosfato pode ser oximetilfosfonato, vinilfosfonato ou malonilfos- fonato. Em certas modalidades, a extremidade 5' de uma fita de oligo- nucleotídeo está ligada a uma porção química que imita as proprieda- des eletrostáticas e estéricas de um grupo fosfato 5' natural ("mimeti- zador de fosfato") (ver, por exemplo, Prakash et al. (2015), Nucleic

Acids Res., Nucleic Acids Res. 2015 Mar 31; 43(6): 2993–3011, cujos conteúdos relativos a análogos de fosfato são incorporados neste do- cumento por referência). Muitos imitadores de fosfato foram desenvol- vidos que podem ser ligados à extremidade 5' (ver, por exemplo, Pa- tente U.S. 8.927.513, cujos conteúdos relacionados a análogos de fos- fato são aqui incorporados por referência). Outras modificações foram desenvolvidas para a extremidade 5' de oligonucleotídeos (ver, por exemplo, WO 2011/133871, cujos conteúdos relacionados a análogos de fosfato são aqui incorporados por referência). Em certas modalida- des, um grupo hidroxil é anexado à extremidade 5' do oligonucleotí- deo.

[00094] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem um análogo de fosfato em uma posição de carbono 4' do açúcar (referido como um "análogo de fosfato 4'"). Ver, por exemplo, o Pedido de Pa- tente Internacional PCT/US2017/049909, depositado em 1 de setem- bro de 2017, Pedido Provisório U.S 62/383.207, intitulado 4′- Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same, depo- sitado em 2 de setembro de 2016, e 62/393.401, depositado em 12 de setembro de 2016, intitulado 4′-Phosphate Analogs and Oligonucleoti- des Comprising the Same, os conteúdos de cada um dos quais relaci- onados a análogos de fosfato são incorporados neste documento por referência. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido aqui compreende um análogo de fosfato 4' em um nucleotídeo terminal 5'. Em algumas modalidades, um análogo de fosfato é um oximetil fos- fonato, em que o átomo de oxigênio do grupo oximetil está ligado à porção de açúcar (por exemplo, em seu carbono 4') ou análogo do mesmo. Em outras modalidades, um análogo de 4 '-fosfato é um fos- fonato de tiometil ou um fosfonato de aminometil, em que o átomo de enxofre do grupo tiometil ou o átomo de nitrogênio do grupo aminome- til está ligado ao carbono 4' da porção de açúcar ou análogo do mes-

mo. Em certas modalidades, um análogo de 4′-fosfato é um oximetifos- fonato. Em algumas modalidades, um oximetil fosfonato é representa- do pela fórmula O–CH2–PO(OH)2 ou –O–CH2–PO(OR)2, em que R é independentemente selecionado a partir de H, CH3, um grupo alquila, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3, ou um grupo de proteção. Em certas modalidades, o grupo alquila é CH2CH3. Mais ti- picamente, R é independentemente selecionado H, CH3, ou CH2CH3. c. Ligações internucleosídicas modificadas

[00095] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo pode com- preender uma ligação internucleosídica modificada. Em algumas mo- dalidades, modificações ou substituições de fosfato podem resultar em um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma (por exemplo, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4 ou pelo me- nos 5) ligação internucleotídica modificada. Em algumas modalidades, qualquer um dos oligonucleotídeos aqui divulgados compreende 1 a 10 (por exemplo, 1 a 10, 2 a 8, 4 a 6, 3 a 10, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3 ou 1 a 2) ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, qualquer um dos oligonucleotídeos aqui divulgados compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações internucleotídicas modificadas.

[00096] Uma ligação internucleotídica modificada pode ser uma li- gação fosforoditioato, uma ligação fosforotioato, uma ligação fosfotri- éster, uma ligação tionoalquilfosfonato, uma ligação tionoalquilfosfotri- éster, uma ligação fosforamidita, uma ligação fosfonato ou uma ligação boranofosfato. Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação in- ternucleotídica modificada de qualquer um dos oligonucleotídeos, con- forme divulgado neste documento, é uma ligação fosforotioato. d. Modificações de base

[00097] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos neste documento têm uma ou mais nucleobases modificadas. Em al- gumas modalidades, as nucleobases modificadas (também referidas aqui como análogos de base) são ligadas na posição 1' de uma porção de açúcar de nucleotídeo. Em certas modalidades, uma nucleobase modificada é uma base nitrogenada. Em certas modalidades, uma nu- cleobase modificada não contém um átomo de nitrogênio. Ver, por exemplo, Pedido de Patente Publicado U.S. 20080274462. Em algu- mas modalidades, um nucleotídeo modificado compreende uma base universal. No entanto, em certas modalidades, um nucleotídeo modifi- cado não contém uma nucleobase (abásico).

[00098] Em algumas modalidades, uma base universal é uma por- ção heterocíclica localizada na posição 1' de uma porção de açúcar de nucleotídeo em um nucleotídeo modificado, ou a posição equivalente em uma substituição de porção de açúcar de nucleotídeo que, quando presente em um duplex, pode ser posicionada oposta mais de um tipo de base sem alterar substancialmente a estrutura do duplex. Em al- gumas modalidades, em comparação com um ácido nucleico de fita simples de referência (por exemplo, oligonucleotídeo) que é totalmente complementar a um ácido nucleico alvo, um ácido nucleico de fita sim- ples contendo uma base universal forma um duplex com o ácido nu- cleico alvo que tem uma Tm menor do que um duplex formado com o ácido nucleico complementar. No entanto, em algumas modalidades, em comparação com um ácido nucleico de fita simples de referência em que a base universal foi substituída por uma base para gerar uma única incompatibilidade, o ácido nucleico de fita simples contendo a base universal forma um duplex com o ácido nucleico alvo que tem uma Tm mais alta do que um duplex formado com o ácido nucleico compreendendo a base incompatível.

[00099] Exemplos não limitativos de nucleotídeos de ligação univer- sal incluem inosina, 1-β-D-ribofuranosil-5-nitroindol e/ou 1-β-D- ribofuranosil-3-nitropirrol (Pedido Pat. U.S. Publ. 20070254362 de Quay et al.; Van Aerschot et al., An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 Nov 11;23(21):4363-70; Loakes et al., 3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. NUCLEIC AC- IDS RES. 1995 Jul 11;23(13):2361-6; Loakes and Brown, 5-Nitroindole as an universal base analogue. NUCLEIC ACIDS RES. 1994 Oct 11;22(20):4039-43. Cada um dos anteriores é incorporado por refe- rência neste documento para suas divulgações relacionadas a modifi- cações de base). e. Modificações reversíveis

[000100] Embora certas modificações para proteger um oligonucleo- tídeo do ambiente in vivo antes de atingir as células alvo possam ser feitas, elas podem reduzir a potência ou atividade do oligonucleotídeo uma vez que ele atinge o citosol da célula alvo. Modificações reversí- veis podem ser feitas de modo que a molécula retenha propriedades desejáveis fora da célula, que são então removidas ao entrar no ambi- ente citosólico da célula. A modificação reversível pode ser removida, por exemplo, pela ação de uma enzima intracelular ou pelas condições químicas dentro de uma célula (por exemplo, através da redução pela glutationa intracelular).

[000101] Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado re- versivelmente compreende uma porção sensível à glutationa. Normal- mente, as moléculas de ácido nucleico foram quimicamente modifica- das com frações de dissulfeto cíclico para mascarar a carga negativa criada pelas ligações difosfato de internucleotídeo e melhorar a absor- ção celular e a resistência à nuclease. Consulte Pedido Publicado U.S. 2011/0294869 originalmente atribuído a Traversa Therapeutics, Inc. (“Traversa”), Publicação PCT WO 2015/188197 para Solstice Biolo- gics, Ltd. (“Solstice”), Meade et al., NATURE BIOTECHNOLOGY, 2014,32:1256-1263 (“Meade”), Publicação PCT WO 2014/088920 para Merck Sharp & Dohme Corp, cada um dos quais são incorporados por referência para suas divulgações de tais modificações. Esta modifica- ção reversível das ligações difosfato internucleotídeo é projetada para ser clivada intracelularmente pelo ambiente redutor do citosol (por exemplo, glutationa). Exemplos anteriores incluem modificações neu- tralizantes de fosfotriéster que foram relatadas como cliváveis dentro das células (Dellinger et al. J. AM. CHEM. SOC. 2003,125:940-950).

[000102] Em algumas modalidades, tal modificação reversível permi- te proteção durante a administração in vivo (por exemplo, trânsito atra- vés do sangue e/ou compartimentos lisossômicos/endossômicos de uma célula), onde o oligonucleotídeo será exposto a nucleases e ou- tras condições ambientais adversas (por exemplo, pH). Quando libera- do no citosol de uma célula onde os níveis de glutationa são maiores em comparação com o espaço extracelular, a modificação é revertida e o resultado é um oligonucleotídeo clivado. Usando frações reversí- veis sensíveis à glutationa, é possível introduzir grupos químicos este- ricamente maiores no oligonucleotídeo de interesse em comparação com as opções disponíveis usando modificações químicas irreversí- veis. Isso ocorre porque esses grupos químicos maiores serão remo- vidos no citosol e, portanto, não devem interferir na atividade biológica dos oligonucleotídeos dentro do citosol de uma célula. Como resulta- do, esses grupos químicos maiores podem ser projetados para conferir várias vantagens ao nucleotídeo ou oligonucleotídeo, como resistência de nuclease, lipofilicidade, carga, estabilidade térmica, especificidade e imunogenicidade reduzida. Em algumas modalidades, a estrutura da porção sensível à glutationa pode ser engenheirada para modificar a cinética de sua liberação.

[000103] Em algumas modalidades, uma porção sensível à glutatio- na é ligada ao açúcar do nucleotídeo. Em algumas modalidades, uma porção sensível à glutationa é ligada ao carbono 2' do açúcar de um nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, a porção sensível à glutationa está localizada no carbono 5' de um açúcar, particularmente quando o nucleotídeo modificado é o nucleotídeo do terminal 5' do oli- gonucleotídeo. Em algumas modalidades, a porção sensível à glutati- ona está localizada no carbono 3' de um açúcar, particularmente quando o nucleotídeo modificado é o nucleotídeo do terminal 3' do oli- gonucleotídeo. Em algumas modalidades, a porção sensível à glutati- ona compreende um grupo sulfonil. Consulte, por exemplo, Pedido de Patente Internacional PCT/US2017/048239 e U.S. Prov. Pat. U.S. 62/378.635, intitulado Compositions Comprising Reversibly Modified Oligonucleotides and Uses Thereof, que foi depositado em 23 de agos- to de 2016, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referên- cia para suas divulgações relevantes. v. Ligandos de direcionamento

[000104] Em algumas modalidades, pode ser desejável direcionar os oligonucleotídeos da divulgação para uma ou mais células ou um ou mais órgãos. Tal estratégia pode ajudar a evitar efeitos indesejáveis em outros órgãos, ou pode evitar a perda indevida do oligonucleotídeo para células, tecidos ou órgãos que não seriam benéficos para o oli- gonucleotídeo. Por conseguinte, em algumas modalidades, os oligo- nucleotídeos aqui divulgados podem ser modificados para facilitar o direcionamento de um determinado tecido, célula ou órgão, por exem- plo, para facilitar a distribuição do oligonucleotídeo ao fígado. Em cer- tas modalidades, os oligonucleotídeos aqui divulgados podem ser mo- dificados para facilitar a distribuição do oligonucleotídeo aos hepatóci- tos do fígado. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compre- ende um nucleotídeo que é conjugado a um ou mais ligandos de dire- cionamento.

[000105] Um ligando de direcionamento pode compreender um car- boidrato, amino açúcar, colesterol, peptídeo, polipeptídeo, proteína ou parte de uma proteína (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de an-

ticorpo) ou lipídeo. Em algumas modalidades, um ligando de direcio- namento é um aptâmero. Por exemplo, um ligando de direcionamento pode ser um peptídeo RGD que é usado para direcionar a vasculatura tumoral ou células de glioma, o peptídeo CREKA para direcionar a vasculatura tumoral ou estoma, transferrina, lactoferrina ou um aptâ- mero para direcionar os receptores de transferrina expressos na vas- culatura do CNS, ou um anticorpo anti-EGFR para direcionar EGFR em células de glioma. Em certas modalidades, o ligando de direciona- mento é uma ou mais frações de GalNAc.

[000106] Em algumas modalidades, 1 ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) nucleotídeos de um oligonucleotídeo são cada um conjuga- dos a um ligando de direcionamento separado. Em algumas modalida- des, 2 a 4 nucleotídeos de um oligonucleotídeo são, cada um, conju- gados a um ligando de direcionamento separado. Em algumas modali- dades, os ligandos de direcionamento são conjugados a 2 a 4 nucleo- tídeos em ambas as extremidades da fita senso ou antissenso (por exemplo, os ligandos são conjugados a uma saliência ou extensão de 2 a 4 nucleotídeos na extremidade 5′ ou 3′ da fita senso ou antissenso) de modo que os ligandos de direcionamento se assemelhem às cerdas de uma escova de dentes e o oligonucleotídeo se assemelhe a uma escova de dentes. Por exemplo, um oligonucleotídeo pode compreen- der uma haste-alça na extremidade 5' ou 3' da fita senso e 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos da alça da haste podem ser conjugados individualmente a um ligando de direcionamento, conforme descrito, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 2016/100401, que foi publicada em 23 de junho de 2016, cujos conteúdos relevantes são aqui incorporados por referência.

[000107] Em algumas modalidades, é desejável direcionar um oligo- nucleotídeo que reduza a expressão de CYP27A1 para os hepatócitos do fígado de um indivíduo. Qualquer porção de direcionamento de he-

patócitos adequada pode ser usada para este propósito.

[000108] GalNAc é um ligando de alta afinidade para o receptor de asialoglicoproteína (ASGPR), que é expresso principalmente na super- fície sinusoidal das células do hepatócito e tem um papel importante na ligação, internalização e eliminação subsequente de glicoproteínas circulantes que contêm galactose terminal ou resíduos de N- acetilgalactosamina (asialoglicoproteínas). A conjugação (indireta ou direta) de frações GalNAc para oligonucleotídeos da presente divulga- ção pode ser usada para direcionar esses oligonucleotídeos para o ASGPR expresso nessas células de hepatócitos.

[000109] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente divulgação é conjugado direta ou indiretamente a um GalNAc monova- lente. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é conjugado direta ou indiretamente a mais de um GalNAc monovalente (isto é, é conju- gado a 2, 3 ou 4 frações GalNAc monovalentes e é tipicamente conju- gado a 3 ou 4 frações GalNAc monovalentes). Em algumas modalida- des, um oligonucleotídeo da presente divulgação é conjugado a uma ou mais frações GalNAc bivalente, GalNAc trivalente ou GalNAc tetra- valente.

[000110] Em algumas modalidades, 1 ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) nucleotídeos de um oligonucleotídeo são, cada um, conju- gados a uma porção GalNAc. Em algumas modalidades, 2 a 4 nucleo- tídeos da alça (L) da haste-alça são, cada um, conjugados a um Gal- NAc separado. Em algumas modalidades, os ligandos de direciona- mento são conjugados a 2 a 4 nucleotídeos em ambas as extremida- des da fita senso ou antissenso (por exemplo, os ligandos são conju- gados a uma saliência ou extensão de 2 a 4 nucleotídeos na extremi- dade 5′ ou 3′ da fita senso ou antissenso) de modo que as frações de GalNAc se assemelhem às cerdas de uma escova de dentes e o oli- gonucleotídeo se assemelhe a uma escova de dentes. Por exemplo,

um oligonucleotídeo pode compreender uma haste-alça na extremida- de 5' ou 3' da fita senso e 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos da alça da haste podem ser individualmente conjugados a uma porção GalNAc. Em al- gumas modalidades, as frações GalNAc são conjugadas a um nucleo- tídeo da fita senso. Por exemplo, quatro porções GalNAc podem ser conjugadas a nucleotídeos na tetra-alça da fita senso, onde cada por- ção GalNAc é conjugada a um nucleotídeo.

[000111] Métodos apropriados ou química (por exemplo, química de clique) podem ser usados para ligar um ligando de direcionamento a um nucleotídeo. Em algumas modalidades, um ligando de direciona- mento é conjugado a um nucleotídeo usando um ligante de clique. Em algumas modalidades, um ligante à base de acetal é usado para con- jugar um ligando de direcionamento a um nucleotídeo de qualquer um dos oligonucleotídeos aqui descritos. Os ligandos à base de acetal são divulgados, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente Interna- cional Número WO2016100401 A1, publicado em 23 de junho de 2016, e os conteúdos relacionados a tais ligantes são incorporados neste documento por referência. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante lábil. No entanto, em outras modalidades, o ligante é bas- tante estável. Em algumas modalidades, uma extensão duplex (até 3, 4, 5 ou 6 pares de bases de comprimento) é fornecida entre um ligan- do de direcionamento (por exemplo, uma porção GalNAc) e um oligo- nucleotídeo de fita dupla. III. Formulações

[000112] Várias formulações foram desenvolvidas para facilitar o uso de oligonucleotídeos. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser distribuídos a um indivíduo ou um ambiente celular usando uma formu- lação que minimiza a degradação, facilita a distribuição e/ou absorção, ou fornece outra propriedade benéfica para os oligonucleotídeos na formulação. Em algumas modalidades, são fornecidas aqui composi-

ções compreendendo oligonucleotídeos (por exemplo, oligonucleotí- deos de fita simples ou dupla) para reduzir a expressão de CYP27A1. Essas composições podem ser adequadamente formuladas de modo que, quando administradas a um indivíduo, seja no ambiente imediato de uma célula alvo ou sistemicamente, uma porção suficiente dos oli- gonucleotídeos entre na célula para reduzir a expressão de CYP27A1. Qualquer uma de uma variedade de formulações de oligonucleotídeos adequadas pode ser usada para distribuir oligonucleotídeos para a re- dução de CYP27A1 como aqui divulgado. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo é formulado em soluções tampão, como soluções salinas tamponadas com fosfato, lipossomas, estruturas micelares e capsídeos.

[000113] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos nus ou seus conjugados são formulados em água ou em uma solução aquosa (por exemplo, água com ajustes de pH). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos nus ou seus conjugados são formulados em solu- ções aquosas tamponadas básicas (por exemplo, PBS). As formula- ções de oligonucleotídeos com lipídeos catiônicos podem ser usadas para facilitar a transfecção dos oligonucleotídeos em células. Por exemplo, lipídeos catiônicos, tais como lipofectina, derivados catiôni- cos de glicerol e moléculas policatiônicas (por exemplo, poli-lisina) po- dem ser usados. Lipídeos adequados incluem Oligofectamina, Lipofec- tamina (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colorado) ou FuGene 6 (Roche), todos os quais podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante.

[000114] Por conseguinte, em algumas modalidades, uma formula- ção compreende uma nanopartícula de lipídeo. Em algumas modali- dades, um excipiente compreende um lipossoma, um lipídeo, um com- plexo lipídico, uma microesfera, uma micropartícula, uma nanosfera ou uma nanopartícula, ou pode ser formulado de outra forma para admi-

nistração às células, tecidos, órgãos ou corpo de um indivíduo em ne- cessidade (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition, Pharmaceutical Press, 2013).

[000115] Em algumas modalidades, as formulações aqui divulgadas compreendem um excipiente. Em algumas modalidades, um excipien- te confere a uma composição de estabilidade aprimorada, absorção aprimorada, solubilidade aprimorada e/ou intensificação terapêutica do ingrediente ativo. Em algumas modalidades, um excipiente é um agen- te tamponante (por exemplo, citrato de sódio, fosfato de sódio, uma base tris ou hidróxido de sódio) ou um veículo (por exemplo, uma so- lução tamponada, vaselina, dimetil sulfóxido ou óleo mineral). Em al- gumas modalidades, um oligonucleotídeo é liofilizado para estender sua vida útil e, em seguida, transformado em uma solução antes do uso (por exemplo, administração a um indivíduo). Consequentemente, um excipiente em uma composição compreendendo qualquer um dos oligonucleotídeos aqui descritos pode ser um lioprotetor (por exemplo, manitol, lactose, polietilenoglicol ou polivinilpirolidona) ou um modifica- dor de temperatura de colapso (por exemplo, dextrano, ficoll ou gelati- na).

[000116] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é formulada para ser compatível com a sua via de administração preten- dida. Exemplos de vias de administração incluem administração paren- teral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (tópica), transmucosa e retal. Tipicamente. a via de administração é intravenosa ou subcutânea.

[000117] As composições farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração in- travenosa, os transportadores adequados incluem soro fisiológico,

água bacteriostática, Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). O transportador pode ser solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, eta- nol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol lí- quido e semelhantes), e misturas apropriadas dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúca- res, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol e cloreto de sódio na com- posição. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incor- porando os oligonucleotídeos em uma quantidade necessária em um solvente selecionado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização por filtração.

[000118] Em algumas modalidades, uma composição pode conter pelo menos cerca de 0,1% do agente terapêutico (por exemplo, um oligonucleotídeo para reduzir a expressão de CYP27A1) ou mais, em- bora a porcentagem do(s) ingrediente(s) ativo(s) possa estar entre cerca de 1% e cerca de 80% ou mais do peso ou volume da composi- ção total. Fatores como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida bio- lógica, via de administração, vida de prateleira do produto, bem como outras considerações farmacológicas irão ser contempladas por uma pessoa versada na técnica para preparar tais formulações farmacêuti- cas, e como tal, uma variedade de doses e regimes terapêuticos pode ser desejável.

[000119] Mesmo que uma série de modalidades sejam direcionadas à distribuição direcionada ao fígado de qualquer um dos oligonucleotí- deos aqui divulgados, o direcionamento de outros tecidos também é contemplado. IV. Métodos de Uso i. Reduzindo a expressão de CYP27A1 em células

[000120] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para distribuir a uma célula uma quantidade eficaz de qualquer um dos oli- gonucleotídeos aqui divulgados para fins de redução da expressão de CYP27A1 na célula. Os métodos fornecidos neste documento são úteis em qualquer tipo de célula apropriado. Em algumas modalidades, uma célula é qualquer célula que expressa CYP27A1 (por exemplo, hepatócitos, macrófagos, células derivadas de monócitos, células de câncer de próstata, células do cérebro, tecido endócrino, medula ós- sea, nódulos linfáticos, pulmão, vesícula biliar, fígado, duodeno, intes- tino delgado, pâncreas, rim, trato gastrointestinal, bexiga, tecido adipo- so e macio e pele). Em algumas modalidades, a célula é uma célula primária que foi obtida de um indivíduo e que pode ter passado por um número limitado de passagens, de modo que a célula mantenha subs- tancialmente suas propriedades fenotípicas naturais. Em algumas mo- dalidades, uma célula à qual o oligonucleotídeo é distribuída é ex vivo ou in vitro (ou seja, pode ser distribuída a uma célula em cultura ou a um organismo no qual a célula reside). Em modalidades específicas, são fornecidos métodos para distribuir a uma célula uma quantidade eficaz de qualquer um dos oligonucleotídeos aqui divulgados para fins de redução da expressão de CYP27A1 apenas ou principalmente em hepatócitos.

[000121] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos aqui divul- gados podem ser introduzidos usando métodos de distribuição de áci- do nucleico adequados, incluindo injeção de uma solução contendo os oligonucleotídeos, bombardeio por partículas cobertas pelos oligonu- cleotídeos, expondo a célula ou organismo a uma solução contendo os oligonucleotídeos ou eletroporação de membranas celulares na pre- sença dos oligonucleotídeos. Outros métodos apropriados para a dis- tribuição de oligonucleotídeos às células podem ser usados, tais como transporte de portadores mediado por lipídeos, transporte mediado por produtos químicos e transfecção de lipossomas catiônicos, como fos-

fato de cálcio e outros.

[000122] As consequências da inibição podem ser confirmadas por um ensaio apropriado para avaliar uma ou mais propriedades de uma célula ou indivíduo, ou por técnicas bioquímicas que avaliam molécu- las indicativas da expressão de CYP27A1 (por exemplo, RNA, proteí- na). Em algumas modalidades, a extensão em que um oligonucleotí- deo fornecido neste documento reduz os níveis de expressão de CYP27A1 é avaliada comparando os níveis de expressão (por exem- plo, mRNA ou níveis de proteína de CYP27A1 a um controle apropria- do (por exemplo, um nível de expressão de CYP27A1 em uma célula ou população de células às quais um oligonucleotídeo não foi distribu- ído ou para as quais um controle negativo foi distribuído). Em algumas modalidades, um nível de controle apropriado da expressão de CYP27A1 pode ser um nível ou valor predeterminado, de modo que um nível de controle não precise ser medido todas as vezes. O nível ou valor predeterminado pode levar a uma variedade de formas. Em algumas modalidades, um nível ou valor predeterminado pode ser um valor de corte único, como uma mediana ou média.

[000123] Em algumas modalidades, a administração de um oligonu- cleotídeo como aqui descrito resulta em uma redução no nível de ex- pressão de CYP27A1 em uma célula. Em algumas modalidades, a re- dução nos níveis de expressão de CYP27A1 pode ser uma redução para 1% ou inferior, 5% ou inferior, 10% ou inferior, 15% ou inferior, 20% ou inferior, 25% ou inferior, 30% ou inferior, 35% ou inferior, 40% ou inferior, 45% ou inferior, 50% ou inferior, 55% ou inferior, 60% ou inferior, 70% ou inferior, 80% ou inferior, ou 90% ou inferior em compa- ração com um nível apropriado de controle de CYP27A1. O nível de controle apropriado pode ser um nível de expressão de CYP27A1 em uma célula ou população de células que não foi posta em contato com um oligonucleotídeo como aqui descrito. Em algumas modalidades, o efeito da distribuição de um oligonucleotídeo a uma célula de acordo com um método aqui divulgado é avaliado após um período finito de tempo. Por exemplo, os níveis de CYP27A1 podem ser analisados em uma célula pelo menos 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas; ou pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou quatorze dias após a introdução do oligonucleotídeo na célula.

[000124] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo é distribuí- do na forma de um transgene que é engenheirado para expressar em uma célula os oligonucleotídeos (por exemplo, suas fitas senso e an- tissenso). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo é distribuído usando um transgene que é engenheirado para expressar qualquer oligonucleotídeo aqui divulgado. Os transgenes podem ser distribuídos usando vetores virais (por exemplo, adenovírus, retrovírus, vírus vac- cinia, poxvírus, vírus adenoassociado ou vírus herpes simplex) ou ve- tores não virais (por exemplo, plasmídeos ou mRNAs sintéticos). Em algumas modalidades, os transgenes podem ser injetados diretamente em um indivíduo. ii. Métodos de Tratamento

[000125] Aspectos da divulgação referem-se a métodos para reduzir a expressão de CYP27A1 para o tratamento de fibrose hepática, por exemplo, associada ao acúmulo de ácido biliar no contexto de doença hepatobiliar. Em algumas modalidades, os métodos podem compreen- der administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quan- tidade eficaz de qualquer um dos oligonucleotídeos aqui divulgados. Tais tratamentos podem ser usados, por exemplo, para um indivíduo em risco de (ou suscetível a) fibrose hepática e/ou doença hepatobili- ar.

[000126] Em certos aspectos, a divulgação fornece um método para prevenir, em um indivíduo, uma doença ou distúrbio, conforme descrito neste documento, pela administração ao indivíduo de um agente tera-

pêutico (por exemplo, um oligonucleotídeo ou vetor ou transgene que codifica o mesmo). Em algumas modalidades, o indivíduo a ser tratado é um indivíduo que se beneficiará terapeuticamente de uma redução na quantidade da proteína CYP27A1, por exemplo, no fígado.

[000127] Os métodos aqui descritos envolvem tipicamente adminis- trar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo, isto é, uma quantidade capaz de produzir um resultado terapêutico desejá- vel. Uma quantidade terapeuticamente aceitável pode ser uma quanti- dade que é capaz de tratar uma doença ou distúrbio. A dosagem apropriada para qualquer indivíduo dependerá de certos fatores, inclu- indo o tamanho do indivíduo, área de superfície corporal, idade, a composição particular a ser administrada, o(s) ingrediente(s) ativo(s) na composição, tempo e via de administração, saúde geral, e outras drogas sendo administradas concomitantemente.

[000128] Em algumas modalidades, um indivíduo é administrado com qualquer uma das composições aqui divulgadas, quer enterica- mente (por exemplo, oralmente, por tubo de alimentação gástrica, por tubo de alimentação duodenal, via gastrostomia ou retal), parenteral- mente (por exemplo, injeção subcutânea, injeção intravenosa ou infu- são, injeção ou infusão intra-arterial, injeção intramuscular), topica- mente (por exemplo, epicutânea, inalatória, via colírio ou através de uma membrana mucosa) ou por injeção direta em um órgão alvo (por exemplo, o fígado de um indivíduo). Normalmente, os oligonucleotí- deos aqui divulgados são administrados por via intravenosa ou subcu- tânea.

[000129] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são admi- nistrados em uma dose em um intervalo de 0,1 mg/kg a 25 mg/kg (por exemplo, 1 mg/kg a 5 mg/kg). Em algumas modalidades, os oligonu- cleotídeos são administrados em uma dose em um intervalo de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg ou em um intervalo de 0,5 mg/kg a 5 mg/kg.

[000130] Como um conjunto não limitativo de exemplos, os oligonu- cleotídeos da presente divulgação seriam tipicamente administrados uma vez por ano, duas vezes por ano, trimestralmente (uma vez a ca- da três meses), bimestral (uma vez a cada dois meses), mensalmente ou semanalmente.

[000131] Em algumas modalidades, o indivíduo a ser tratado é um ser humano (por exemplo, um paciente humano) ou primata não hu- mano ou outro indivíduo mamífero. Outros indivíduos exemplificativos incluem animais domesticados, como cães e gatos; gado, como cava- los, gado, porcos, ovelhas, cabras e galinhas; e animais como camun- dongos, ratos, porquinhos-da-índia e hamsters.

EXEMPLOS Exemplo 1: Desenvolvimento de inibidores de oligonucleotídeo CYP27A1 usando ensaios baseados em células humanas e de ca- mundongo

[000132] A FIG. 1 mostra fluxos de trabalho usando ensaios huma- nos e baseados em camundongos para desenvolver oligonucleotídeos candidatos para a inibição da expressão de CYP27A1. Primeiro, um algoritmo baseado em computador foi usado para gerar sequências de oligonucleotídeos candidatas para a inibição de CYP27A1. Ensaios baseados em células e ensaios de PCR foram então usados para ava- liação de oligonucleotídeos candidatos quanto à sua capacidade de reduzir a expressão de CYP27A1.

[000133] O algoritmo de computador forneceu 2114 oligonucleotí- deos que eram complementares ao mRNA de CYP27A1 humano (SEQ ID NO: 782, Tabela 1), dos quais 1084 também eram comple- mentares ao mRNA de CYP27A1 rhesus (SEQ ID NO: 783, Tabela 1), e 24 eram também complementar ao mRNA de CYP27A1 de camun- dongo (SEQ ID NO: 784, Tabela 1). 8 oligonucleotídeos eram com- plementares ao mRNA de CYP27A1 humano, de camundongo e de rhesus. Exemplos de sequências de mRNA de CYP27A1 são descritos na Tabela 1: Tabela 1. Sequências de mRNA de CYP27A1 humano, macaco rhesus e camundongo Espécies GenBank RefSeq # Identificador de Sequência Humano NM_000784.3 SEQ ID NO: 782 Macaco rhesus NM_001194021.1 SEQ ID NO: 783 Camundongo NM_024264.5 SEQ ID NO: 784

[000134] Dos 2114 oligonucleotídeos que o algoritmo forneceu, 288 oligonucleotídeos foram selecionados como candidatos para avaliação experimental em um ensaio baseado em células HepG2. Neste ensaio, as células que expressam CYP27A1 foram transfectadas com os oli- gonucleotídeos. As células foram mantidas por um período de tempo após a transfecção e, em seguida, os níveis de mRNA de CYP27A1 restantes foram interrogados usando ensaios de qPCR baseados em SYBR®. Dois ensaios qPCR, um ensaio 3 'e um ensaio 5' foram usa- dos. Todos os 288 oligonucleotídeos tinham o mesmo padrão de modi- ficação, designado M15, que contém uma combinação de ribonucleo- tídeos, desoxirribonucleotídeos e nucleotídeos modificados com 2'-O- metil. As sequências dos oligonucleotídeos testados são fornecidas na Tabela 2. Tabela 2. Sequências de Oligonucleotídeos Candidatos para Ensaio Baseado em Células Humanas Hs Rh Mm Senso SEQ ID NO Antissenso

SEQ ID NO X X 1 a 58; 289-346; 78 a 153; 366 a 441; 155 a 159; 443 a 447; 193; 194; 481; 482; 199 a 250; 487 a 538; 252 a 282 540 a 570

X 59 a 77; 347 a 365; 154; 442; 160 a 170; 448 a 458; 197-198; 485; 486; 251; 539; 283 a 288 571 a 576 X X X 171 a 178 459 a 466 X X 179 a 192; 467 a 480; 195; 196 483; 484 Hs: humano, Rh: macaco rhesus e Mm: camundongo; as colunas SEQ ID NO senso e antissenso fornecem a fita senso e a respectiva fita an- tissenso que são hibridadas para formar cada oligonucleotídeo. Por exemplo, a fita senso com SEQ ID NO: 1 hibrida com a fita antissenso com SEQ ID NO: 289; cada um dos oligonucleotídeos testados tinha o mesmo padrão de modificação. Pontos de acesso no mRNA de CYP27A1

[000135] Os dados da tela dos 288 oligonucleotídeos candidatos são mostrados na FIG. 3. Os oligonucleotídeos são organizados com base na localização de complementaridade com a localização do gene hu- mano (Hs). Os oligonucleotídeos que resultaram em menos ou igual a 25% de mRNA restante em comparação com os controles negativos foram considerados acertos. Três oligonucleotídeos que não inibiram a expressão de CYP27A1 foram usados como controles negativos. Além disso, a transfecção de células com o gene housekeeping Hipoxantina- guanina fosforibosiltransferase (HPRT) foi usada como um controle positivo para a transfecção.

[000136] 119 resultados foram identificados com base neste critério. Com base na atividade e nas localizações desses oligonucleotídeos (FIG. 3), foram definidos pontos de acesso no mRNA de CYP27A1 humano. Um ponto de acesso foi identificado como um trecho na se-

quência de mRNA de CYP27A1 humano associada a pelo menos um oligonucleotídeo resultando em níveis de mRNA que eram menores ou iguais a 25% em qualquer ensaio em comparação com os controles. Esses pontos de acesso podem ser visualizados na FIG. 3. Conse- quentemente, os seguintes pontos de acesso dentro da sequência de mRNA de CYP27A1 humano foram identificados: 699-711, 729-735, 822-836, 970-1009, 1065-1088, 1095-1112, 1181-1203, 1297-1317, 1488-1492, 1591-1616, 1659-1687, 1929-1932, 1995-2001, 2204-2225 e 2262-2274. As sequências dos pontos de acesso são descritas na Tabela 3. Tabela 3. Sequências de pontos de acesso Posição de Sequência SEQ ID NO: ponto de acesso 699-711 CUGCACCAGUUACAGGUGCUUUACAAGGCCAAGUACG 767 729-735 AAGUACGGUCCAAUGUGGAUGUCCUACUUAG 768 822-836 GGCAAGUACCCAGUACGGAACGACAUGGAGCUAUGGAAG 769 970-1009 CAGCGCUCUAUACGGAUGCUUUCAAUGAGGUGAUUGAUGACUUUAUGACUCGACUG- 770

GACCAGCU 1065-1088 UCGGACAUGGCUCAACUCUUCUACUACUUUGCCUUGGAAGCUAUUUGC 771 1095-1112 GCCUUGGAAGCUAUUUGCUACAUCCUGUUCGAGAAACGCAUU 772 1181-1203 CAGAUCCAUCGGGUUAAUGUUCCAGAACUCACUCUAUGCCACCUUCC 773 1297-1317 CCUUUGGGAAGAAGCUGAUUGAUGAGAAGCUCGAAGAUAUGGAGG 774 1488-1492 CUGACAUGGGCCCUGUACCACCUCUCAAA 775 1591-1616 AGGACUUUGCCCACAUGCCGUUGCAAAGCUGUGCUUAAGGAGACUCUG 776 1659-1687 CCCACAAACUCCCGGAUCAUAGAAAAGGAAAUUGAAGUUGAUGGCUUCCUCUU 777 1929-1932 GCAAGGCUGAUCCAGAAGUACAAGGUGG 778 1995-2001 CGCAUUGUCCUGGUUCCCAAUAAGAAAGUGG 779 2204-2225 UUUGCCACUUCUAUCAUUUUUGAGCAACUCCCUCUCAGCUAAAAGG 780 2262-2274 CGCAUUGCUGUCCUUGGGUAGAAUAUAAAAUAAAGGG 781 Análise de resposta à dose

[000137] Com base na localização do gene e na conservação da se- quência entre as espécies, dos 119 oligonucleotídeos considerados mais ativos na primeira triagem, 96 oligonucleotídeos foram submeti- dos a uma triagem secundária. Nesta triagem secundária, os oligonu- cleotídeos foram testados usando o mesmo ensaio que na triagem primária, mas em três concentrações diferentes (1 nM, 0,1 nM e 0,01 nM). Os oligonucleotídeos que mostram atividade em mais duas con- centrações foram selecionados para análise posterior.

[000138] Nesta fase, os oligonucleotídeos selecionados foram modi- ficados para conter tetra-alças e adaptar diferentes padrões de modifi- cação. Sequências de haste-alça foram incorporadas na extremidade 3' da fita senso (passageira), na qual a sequência de laço era a de uma tetra-alça. Assim, as moléculas foram convertidas em estruturas de tetra-alça em cortes (uma fita passageira de 36 mer e uma fita guia de 22 mer). Ver FIG. 2 para uma estrutura de tetra-alça genérica. Es- tes foram então testados em três concentrações diferentes (0,01 nM, 0,1 nM e 1 nM) quanto à sua capacidade de reduzir a expressão do mRNA de CYP27A1. A FIG. 4A mostra dados para oligonucleotídeos feitos a partir de duas sequências de bases com tetra-alças, cada um adaptado a 10 padrões de modificação diferentes, designados de M1 a M12. Para esta experiência, dois oligonucleotídeos (isto é, S785- AS786-M26 e S787-AS788-M26) eram de 21-mers em vez de 22- mers. S785-AS786-M26 e S787-AS788-M26 são versões 21-mer de S577-AS579-M26 e S578-AS580-M26, respectivamente. Estes foram testados porque uma enzima Dicer pode clivar um oligonucleotídeo maior em um 21-mer ou 22-mer. A FIG. 4B mostra dados semelhantes, mas para sequências de 16 bases com tetra-alças, cada um adaptado a 1 ou 2 padrões de modificação diferentes, designados M13 e M14. Os oligonucleotídeos S577-AS579-M1 e S577-AS579-M9 foram usa- dos como calibradores inter-experimentos nas experiências que resul- taram nos dados mostrados nas FIGs. 4A e 4B. Além disso, em oligo- nucleotídeos representados por “*” na FIG. 4B, a base do primeiro nu- cleotídeo na extremidade 5' da fita antissenso é substituída por um uracil para melhorar a atividade.

[000139] Os dados desses experimentos foram avaliados para identi- ficar tetra-alças e padrões de modificação que melhorariam as propri- edades de distribuição, mas manteriam a atividade de redução da ex- pressão de CYP27A1. Com base nesta análise, oligonucleotídeos se-

lecionados foram então conjugados com frações GalNAc e testados (FIG. 6). Para os oligonucleotídeos mostrados na FIG. 6, quatro fra- ções GalNAc foram conjugadas a nucleotídeos na tetra-alça da fita senso. A conjugação foi feita usando um ligante de clique. O GalNAc usado foi como mostrado abaixo: N-Acetil-b-D-galactosamina (CAS#: 14131-60-3)

[000140] A capacidade dos oligonucleotídeos de reduzir a expressão de CYP27A1 foi influenciada por padrões de modificação. Por exem- plo, os oligonucleotídeos S591-AS608-M24G e S591-AS608-M22G são diferentes apenas em que S591-AS608-M24G contém uma citosi- na na posição 1 e um fosfato 5' natural no suporte antissenso, enquan- to S591-AS608-M22G contém um uracil na posição 1 e um análogo de fosfato 5' no suporte antissenso.

[000141] Os níveis de proteína de CYP27A1 também foram avalia- dos juntamente com os níveis de mRNA. Testando modelos murinos

[000142] Paralelamente às experiências com células HepG2 huma- nas, os oligonucleotídeos também foram triados em células AML12 de murino. 96 oligonucleotídeos que eram complementares ao mRNA de CYP27A1 de camundongo (SEQ ID NO: 784) foram testados. As célu- las que expressam CYP27A1 foram transfectadas com os oligonucleo- tídeos e os níveis de mRNA de CYP27A1 restantes foram interrogados usando ensaios qPCR baseados em SYBR®. A Tabela 4 descreve as sequências de oligonucleotídeos que foram testados.

Hs Rh M SEQ ID NO SEQ ID NO m senso Antissenso X 615 a 686 687 a 758 X X X 171 a 178 459 a 466 X X 179 a 196 467 a 484 Tabela 4. Sequências de Oligonucleotídeos Candidatos para Ensaio Baseado em Células Murinas: Hs: humano, Rh: macaco rhesus e Mm: camundongo; as colunas SEQ ID NO senso e antissenso fornecem a fita senso e a respectiva fita antissenso (listadas em ordem uma em relação à outra) que são emparelhadas para formar cada oligonucleo- tídeo. Por exemplo, a fita senso com SEQ ID NO: 1 hibrida com a fita antissenso com SEQ ID NO: 289; cada um dos oligonucleotídeos tes- tados tinha o mesmo padrão de modificação.

[000143] Usando critérios semelhantes aos dos ensaios baseados em células humanas, 26 deles foram então submetidos à triagem em concentrações múltiplas. Diferentes padrões de modificação foram en- tão aplicados a 8 dos 26 oligonucleotídeos. Com base na sua ativida- de, 4 sequências com padrões de modificação variáveis foram conju- gadas com frações GalNAc. A FIG. 5 mostra a atividade destes oligo- nucleotídeos conjugados com GalNAc com tetra-alças. Para os oligo- nucleotídeos mostrados na FIG. 5, quatro frações GalNAc foram con- jugadas a nucleotídeos na tetra-alça da fita senso. Os oligonucleotí- deos selecionados foram submetidos a testes em um modelo de ca- mundongo com ligação parcial do duto biliar. Neste experimento, um oligonucleotídeo parental (isto é, um 25/27-mer) que foi formulado em uma nanopartícula de lipídeo, S789-AS790-M27, foi usado como um controle. Este oligonucleotídeo não foi conjugado com frações GalNAc.

[000144] O duto biliar do lobo esquerdo do fígado foi ligado cirurgi- camente em camundongos CD-1 fêmeas, enquanto os dutos biliares que abastecem os outros lobos foram deixados sem tratamento. Qua-

tro semanas após a cirurgia, os camundongos foram injetados por via subcutânea com conjugados de PBS ou GalXC-CYP27A1 (isto é , oli- gonucleotídeos conjugados com GalNAc) a 10 mg/kg a cada semana por mais 4 semanas. No final do estudo, os camundongos foram sacri- ficados e o soro e o tecido hepático foram coletados. O RNA foi purifi- cado dos fígados para gerar cDNA. Os níveis de mRNA de CYP27A1 foram então estimados por qPCR usando iniciador/sondas CYP27A1 específicos de camundongo. As concentrações séricas de ácidos bilia- res foram medidas por LC-MS com padrões de ácidos biliares marca- dos com isótopos pesados. O knockdown de CYP27A1 diminuiu signi- ficativamente as concentrações de ácidos biliares em circulação (FIG. 7).

[000145] O duto biliar do lobo esquerdo do fígado foi ligado cirurgi- camente em camundongos CD-1 fêmeas, enquanto os dutos biliares que abastecem os outros lobos foram deixados sem tratamento. Após a recuperação da cirurgia, os camundongos foram injetados por via subcutânea com conjugados de PBS ou GalXC-CYP27A1 a 10 mg/kg a cada semana durante 4 semanas. Ao final do estudo, os camundon- gos foram sacrificados e seus fígados coletados. As seções do fígado foram então coradas com Sirius Red, um corante que cora especifica- mente as regiões fibróticas do fígado. O knockdown de CYP27A1 di- minui a quantidade de fibrose medida pela coloração com Sirius Red (FIG. 8). Materiais e Métodos Transfecção

[000146] Para a primeira triagem, Lipofectamine RNAiMAX™ foi usado para complexar os oligonucleotídeos para uma transfecção efi- ciente. Os oligonucleotídeos, RNAiMAX e Opti-MEM foram adiciona- dos a uma placa e incubados à temperatura ambiente por 20 minutos antes da transfecção. O meio foi aspirado de um frasco de células de passagem ativa e as células foram incubadas a 37oC na presença de tripsina por 3-5 minutos. Depois que as células não aderiram mais ao frasco, o meio de crescimento celular (sem penicilina e estreptomicina) foi adicionado para neutralizar a tripsina e suspender as células. Uma alíquota de 10 µL foi removida e contada com um hemocitômetro para quantificar as células por milímetro. Para células HeLa, 20.000 células foram semeadas por poço em 100 µL de meio. A suspensão foi diluída com a concentração de células conhecida para obter o volume total necessário para o número de células a serem transfectadas. A sus- pensão de células diluída foi adicionada às placas de transfecção de 96 poços, que já continham os oligonucleotídeos em Opti-MEM. As placas de transfecção foram então incubadas por 24 horas a 37oC. Após 24 horas de incubação, o meio foi aspirado de cada poço. As cé- lulas foram lisadas usando o tampão de lise do kit Promega RNA Isola- tion. O tampão de lise foi adicionado a cada poço. As células lisadas foram então transferidas para o Corbett XtractorGENE (QIAxtractor) para isolamento de RNA ou armazenadas a -80oC.

[000147] Para rastreios e experiências subsequentes, por exemplo, o rastreio secundário, Lipofectamine RNAiMAx foi usado para complexar os oligonucleotídeos para transfecção reversa. Os complexos foram feitos pela mistura de RNAiMAX e siRNAs em meio OptiMEM por 15 minutos. A mistura de transfecção foi transferida para placas de múlti- plos poços e suspensão de células foi adicionada aos poços. Após 24 horas de incubação, as células foram lavadas uma vez com PBS e de- pois lisadas usando tampão de lise do kit Promega SV96. O RNA foi purificado usando as placas SV96 em um distribuidor de vácuo. Quatro microlitros do RNA purificado foram então aquecidos a 65°C durante 5 minutos e resfriados a 4°C. O RNA foi então usado para a transcrição reversa usando o kit High Capacity Reverse Transcription (Life Technologies) em uma reação de 10 microlitros. O cDNA foi então di-

luído para 50 µl com água livre de nuclease e usado para PCR quanti- tativo com ensaios multiplexados de 5'-endonuclease e SSoFast qPCR mastermix (laboratórios Bio-Rad). Síntese cDNA

[000148] O RNA foi isolado de células de mamíferos em cultura de tecidos usando o Corbett X-tractor Gene™ (QIAxtractor). Um protocolo SuperScript II modificado foi usado para sintetizar cDNA a partir do RNA isolado. O RNA isolado (aproximadamente 5 ng/µL) foi aquecido a 65oC por cinco minutos e incubado com dNPs, hexâmeros aleatórios, oligo dTs e água. A mistura foi resfriada durante 15 segundos. Uma "mistura de enzimas", consistindo em água, tampão de primeira fita 5X, DTT, SUPERase • In ™ (um inibidor de RNA) e SuperScript II RTase foi adicionada à mistura. O conteúdo foi aquecido a 42oC por uma hora, depois a 70oC por 15 minutos e, em seguida, resfriado a 4oC usando um termociclador. O cDNA resultante foi então submetido a qPCR baseado em SYBR®. As reações qPCR foram multiplexadas, contendo dois ensaios de endonuclease 5' por reação. Ensaios qPCR

[000149] Os conjuntos de iniciador foram inicialmente selecionados usando qPCR baseado em SYBR®. A especificidade do ensaio foi ve- rificada avaliando as curvas de fusão, bem como os controles “menos RT”. Diluições de modelo de cDNA (diluições em série de 10 vezes de 20 ng e 0,02 ng por reação) de células HeLa e Hepa1-6 são usadas para testar ensaios humanos (Hs) e de camundongo (Mm), respecti- vamente. Os ensaios qPCR foram configurados em placas de 384 po- ços, cobertos com filme MicroAmp e executados no 7900HT da Appli- ed Biosystems. As concentrações de reagentes e as condições de ci- clo incluíram o seguinte: mistura SYBR 2x, iniciador direto 10 μM, ini- ciador reverso 10 μM, DD H2O e modelo de cDNA até um volume total de 10 μL.

Clonagem

[000150] Os amplicons de PCR que exibiram uma única curva de fu- são foram ligados ao kit de vetor pGEM®-T Easy da Promega de acordo com as instruções do fabricante. Seguindo o protocolo do fabri- cante, as células JM109 de alta eficiência foram transformadas com os vetores recém-ligados. As células foram então semeadas em placas LB contendo ampicilina e incubadas a 37oC durante a noite para cres- cimento da colônia. Triagem de PCR e Mini-Prep de plasmídeo

[000151] A PCR foi usada para identificar colônias de E. coli que ha- viam sido transformadas com um vetor contendo o amplicon ligado de interesse. Iniciadores específicos de vetor que flanqueiam a inserção foram usados na reação de PCR. Todos os produtos de PCR foram então executados em um gel de agarose a 1% e fotografados por um transiluminador após a coloração. Os géis foram avaliados qualitati- vamente para determinar quais plasmídeos pareciam conter um ampli- con ligado do tamanho esperado (aproximadamente 300 pb, incluindo o amplicon e as sequências de vetor de flanqueamento específicas pa- ra os iniciadores usados).

[000152] As colônias que foram confirmadas como transformantes por triagem de PCR foram então incubadas durante a noite em cultu- ras consistindo de 2 mL de caldo LB com ampicilina a 37oC com agita- ção. As células de E. coli foram então lisadas e os plasmídeos de inte- resse foram isolados usando o kit Mini-Prep da Promega. A concentra- ção de plasmídeo foi determinada por absorbância de UV a 260 nm. Sequenciamento e quantificação de plasmídeo

[000153] Os plasmídeos purificados foram sequenciados usando o kit de sequenciamento BigDye® Terminator. O iniciador específico do vetor, T7, foi usado para fornecer comprimentos de leitura que abran- gem a inserção. Os seguintes reagentes foram usados nas reações de sequenciamento: água, tampão de sequenciamento 5X, mistura de terminador BigDye, iniciador T7 e plasmídeo (100 ng/µL) até um volu- me de 10 µL. A mistura foi mantida a 96oC por um minuto, depois submetida a 15 ciclos de 96oC por 10 segundos, 50oC por 5 segundos, 60oC por 1 minuto, 15 segundos; 5 ciclos de 96oC por 10 segundos, 50oC por 5 segundos, 60oC por 1 minuto, 30 segundos; e 5 ciclos de 96oC por 10 segundos, 50oC por 5 segundos, e 60oC por 2 minutos. As reações de terminação de corante foram então sequenciadas usando sequenciadores de eletroforese capilar da Applied Biosystems.

[000154] Os plasmídeos de sequência verificada foram então quanti- ficados. Eles foram linearizados usando uma única endonuclease de restrição de corte. A linearidade foi confirmada por eletroforese em gel de agarose. Todas as diluições de plasmídeo foram feitas em tampão TE (pH 7,5) com 100 µg de tRNA por mL de tampão para reduzir a li- gação não específica do plasmídeo aos frascos de polipropileno.

[000155] Os plasmídeos linearizados foram então diluídos em série de 1.000.000 a 01 cópias por µL e submetidos a qPCR. A eficiência do ensaio foi calculada e os ensaios foram considerados aceitáveis se a eficiência estivesse no intervalo de 90-110%. Ensaios de multiplexação

[000156] Para cada alvo, os níveis de mRNA foram quantificados por dois ensaios de 5' nuclease. Em geral, vários ensaios são seleciona- dos para cada alvo. Os dois ensaios selecionados exibiram uma com- binação de boa eficiência, baixo limite de detecção e ampla cobertura 5'3' do gene de interesse (GOI). Ambos os ensaios contra um GOI puderam ser combinados em uma reação quando diferentes fluorófo- ros foram usados nas respectivas sondas. Assim, a etapa final na vali- dação do ensaio foi determinar a eficiência dos ensaios selecionados quando eles foram combinados no mesmo qPCR ou “multiplexados”.

[000157] Plasmídeos linearizados para ambos os ensaios em dilui-

ções de 10 vezes foram combinados e qPCR foi realizada. A eficiência de cada ensaio foi determinada como descrito acima. A taxa de eficiência aceita foi de 90-110%.

[000158] Ao validar reações multiplexas usando padrões de plasmí- deo linearizado, os valores Cq para o alvo de interesse também foram avaliados usando cDNA como o modelo. Para alvos humanos ou de camundongo, foram usados cDNA de HeLa e Hepa1-6, respectiva- mente. O cDNA, neste caso, foi derivado do RNA isolado no Corbett (~ 5 ng/μl em água) de células não transfectadas. Desta forma, os valo- res de Cq observados a partir desta amostra de cDNA foram represen- tativos dos valores de Cq esperados de uma transfecção de placa de 96 poços. Nos casos em que os valores de Cq eram maiores que 30, foram buscadas outras linhagens celulares que apresentassem níveis de expressão mais elevados do gene de interesse. Uma biblioteca de RNA total isolado via métodos de alto rendimento no Corbett de cada linhagem humana e de camundongo foi gerada e usada para rastrear níveis aceitáveis de expressão alvo. Descrição da nomenclatura do oligonucleotídeo

[000159] Todos os oligonucleotídeos aqui descritos são designados SN1-ASN2-MN3. As seguintes designações se aplicam:  N1: número do identificador de sequência da sequência da fita senso  N2: número do identificador de sequência da sequência da fita antissenso  N3: número de referência do padrão de modificação, em que cada número representa um padrão de nucleotídeos modificados no oligonucleotídeo. Por exemplo, S27-AS123-M15 representa um oligonucleotídeo com uma sequência de senso que é apresentada pela SEQ ID NO: 27, uma sequência antissenso que é apresentada pela SEQ ID NO: 123 e que é adaptada ao padrão de modificação número 15.

[000160] A divulgação ilustrativamente descrita neste documento po- de ser praticada adequadamente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, que não são divulgados especi- ficamente neste documento. Assim, por exemplo, em cada caso aqui, qualquer dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e "consistindo em" pode ser substituído por qualquer um dos ou- tros dois termos. Os termos e expressões que foram usados são utili- zados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção de que, na utilização de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções dos mesmos, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Assim, deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente divulga- da por modalidades preferidas, características opcionais, a modifica- ção e a variação dos conceitos aqui descritos podem ser recorridos pelos versados na técnica e que tais modificações e variações são consideradas como estando dentro do escopo desta invenção, tal co- mo definido pela descrição e pelas reivindicações anexas.

[000161] Além disso, quando características ou aspectos da inven- ção são descritos em termos de grupos Markush ou outro agrupamen- to de alternativas, os versados na técnica reconhecerão que a inven- ção também é descrita desse modo em termos de qualquer membro ou subgrupo individual de membros do Markush grupo ou outro grupo.

[000162] Deve ser apreciado que, em algumas modalidades, as se- quências apresentadas na listagem de sequências podem ser referi- das na descrição da estrutura de um oligonucleotídeo ou outro ácido nucleico. Em tais modalidades, o oligonucleotídeo real ou outro ácido nucleico pode ter um ou mais nucleotídeos alternativos (por exemplo, uma contraparte de RNA de um nucleotídeo de DNA ou uma contra-

parte de DNA de um nucleotídeo de RNA) e/ou um ou mais nucleotí- deos modificados e/ou um ou mais ligações internucleotídicas modifi- cadas e/ou uma ou mais outras modificações em comparação com a sequência especificada, embora mantendo essencialmente as mes- mas propriedades complementares ou semelhantes à sequência es- pecificada.

[000163] O uso dos termos “um” e “uma”, "o" e “a” e os referentes semelhantes no contexto de descrever a invenção (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) devem ser interpretados para cobrir tanto a forma singular quanto o plural, a menos que de outro modo indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser inter- pretados como termos abertos (isto é, "incluindo, mas não limitado a"), a menos que seja indicado de outra forma. A repetição das faixas de valores neste documento se destina apenas a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, salvo indicação do contrário neste documento e cada valor separado está incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente repetido neste documento. Todos os métodos descri- tos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem apro- priada a menos que indicado ao contrário neste documento ou de ou- tra forma claramente contradito pelo contexto. O uso de todo e qual- quer exemplo ou linguagem exemplar (por exemplo, “tal como”) forne- cido aqui é destinado simplesmente a esclarecer melhor a invenção e não impor uma limitação do escopo da invenção a menos que de outra maneira reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicação de nenhum elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[000164] Modalidades preferidas desta invenção são aqui descritas. Variações destas modalidades podem tornar-se evidentes para os ver-

sados na técnica após a leitura da descrição supracitada.

[000165] Os inventores esperam que versados na técnica usem tais variações, como apropriado, e os inventores pretendem que a inven- ção seja praticada de modo diferente do especificamente descrito aqui. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e os equivalentes do assunto citados nas reivindicações anexas a este do- cumento como permitido pela legislação aplicável. Além disso, qual- quer combinação dos elementos acima descritos, em todas as varia- ções possíveis dos mesmos é abrangida pela invenção a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capa- zes de confirmar usando não mais que experimentação de rotina, mui- tos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritas no presente documento. Tais equivalentes se destinam a ser abrangidos pelas seguintes reivindicações. Apêndice A Nome do oligonucle- S SEQ ID AS SEQ ID Sequência de detecção/mRNA seq Sequência antissenso otídeo NO NO ACU- S1-AS289-M15 CCAGAGUUCAGACCAAGCGAAAAGT 1 UUUCGCUUGGUCUGAACU- 289

CUGGGC AACU- S2-AS290-M15 CAGAGUUCAGACCAAGCGAAAAGTT 2 UUUCGCUUGGUCUGAACU- 290

CUGGG UAACU- S3-AS291-M15 AGAGUUCAGACCAAGCGAAAAGUTA 3 UUUCGCUUGGUCUGAACU- 291

CUGG AUAACU- S4-AS292-M15 GAGUUCAGACCAAGCGAAAAGUUAT 4 292

UUUCGCUUGGUCUGAACUCUG AAUAACU- S5-AS293-M15 AGUUCAGACCAAGCGAAAAGUUATT 5 293

UUUCGCUUGGUCUGAACUCU AAAUAACU- S6-AS294-M15 GUUCAGACCAAGCGAAAAGUUAUTT 6 294

UUUCGCUUGGUCUGAACUC CAAAUAACU- S7-AS295-M15 UUCAGACCAAGCGAAAAGUUAUUTG 7 295

UUUCGCUUGGUCUGAACU UCAAAUAACU- S8-AS296-M15 UCAGACCAAGCGAAAAGUUAUUUGA 8 296

UUUCGCUUGGUCUGAAC CUCAAAUAACU- S9-AS297-M15 CAGACCAAGCGAAAAGUUAUUUGAG 9 297

UUUCGCUUGGUCUGAA UCUCAAAUAACU- S10-AS298-M15 AGACCAAGCGAAAAGUUAUUUGAGA 10 298

UUUCGCUUGGUCUGA CUCUCAAAUAACU- S11-AS299-M15 GACCAAGCGAAAAGUUAUUUGAGAG 11 299

UUUCGCUUGGUCUG CCUCUCAAAUAACU- S12-AS300-M15 ACCAAGCGAAAAGUUAUUUGAGAGG 12 300

UUUCGCUUGGUCU S13-AS301-M15 CCAAGCGAAAAGUUAUUUGAGAGGC 13 GCCUCUCAAAUAACU- 301

UUUCGCUUGGUC UGUAAAGCACCUGU- S14-AS302-M15 CUGCACCAGUUACAGGUGCUUUACA 14 302

AACUGGUGCAGUU UUGUAAAGCACCUGU- S15-AS303-M15 UGCACCAGUUACAGGUGCUUUACAA 15 303

AACUGGUGCAGU CUUGUAAAGCACCUGU- S16-AS304-M15 GCACCAGUUACAGGUGCUUUACAAG 16 304

AACUGGUGCAG CCUUGUAAAGCACCUGU- S17-AS305-M15 CACCAGUUACAGGUGCUUUACAAGG 17 305

AACUGGUGCA GGCCUUGUAAAGCACCUGU- S18-AS306-M15 CCAGUUACAGGUGCUUUACAAGGCC 18 306

AACUGGUG UGGCCUUGUAAAGCACCUGU- S19-AS307-M15 CAGUUACAGGUGCUUUACAAGGCCA 19 307

AACUGGU UUGGCCUUGUAAAGCAC- S20-AS308-M15 AGUUACAGGUGCUUUACAAGGCCAA 20 308

CUGUAACUGG UACUUGGCCUUGUAAAGCAC- S21-AS309-M15 UACAGGUGCUUUACAAGGCCAAGTA 21 309

CUGUAAC GUACUUGGCCUUGUAAA- S22-AS310-M15 ACAGGUGCUUUACAAGGCCAAGUAC 22 310

GCACCUGUAA CGUACUUGGCCUUGUAAA- S23-AS311-M15 CAGGUGCUUUACAAGGCCAAGUACG 23 311

GCACCUGUA AGGACAUCCACAUUGGAC- S24-AS312-M15 AAGUACGGUCCAAUGUGGAUGUCCT 24 312

CGUACUUGG GUAGGACAUCCACAUUGGAC- S25-AS313-M15 GUACGGUCCAAUGUGGAUGUCCUAC 25 313

CGUACUU AAGUAGGACAUCCACAUUG- S26-AS314-M15 ACGGUCCAAUGUGGAUGUCCUACTT 26 314

GACCGUAC UAAGUAGGACAUCCACAUUG- S27-AS315-M15 CGGUCCAAUGUGGAUGUCCUACUTA 27 315

GACCGUA CUAAGUAGGACAUCCACAU- S28-AS316-M15 GGUCCAAUGUGGAUGUCCUACUUAG 28 316

UGGACCGU UGUCGUUCCGUA- S29-AS317-M15 GGCAAGUACCCAGUACGGAACGACA 29 317

CUGGGUACUUGCCCU UCCAUGUCGUUCCGUA- S30-AS318-M15 AGUACCCAGUACGGAACGACAUGGA 30 318

CUGGGUACUUG CUCCAUGUCGUUCCGUA- S31-AS319-M15 GUACCCAGUACGGAACGACAUGGAG 31 319

CUGGGUACUU CAUAGCUCCAU- S32-AS320-M15 CAGUACGGAACGACAUGGAGCUATG 32 320

GUCGUUCCGUACUGGG UCCAUAGCUCCAU- S33-AS321-M15 GUACGGAACGACAUGGAGCUAUGGA 33 321

GUCGUUCCGUACUG UUCCAUAGCUCCAU- S34-AS322-M15 UACGGAACGACAUGGAGCUAUGGAA 34 322

GUCGUUCCGUACU CUUCCAUAGCUCCAU- S35-AS323-M15 ACGGAACGACAUGGAGCUAUGGAAG 35 323

GUCGUUCCGUAC CUGGCUUCAGCAAC- S36-AS324-M15 CUGAACCAGCGGUUGCUGAAGCCAG 36 324

CGCUGGUUCAGAG UUGAAAGCAUCCGUAUAGA- S37-AS325-M15 CAGCGCUCUAUACGGAUGCUUUCAA 37 325

GCGCUGCU AUUGAAAGCAUCCGUAUAGA- S38-AS326-M15 AGCGCUCUAUACGGAUGCUUUCAAT 38 326

GCGCUGC CAUUGAAAGCAUCCGUAUAGA- S39-AS327-M15 GCGCUCUAUACGGAUGCUUUCAATG 39 327

GCGCUG UCAUUGAAAGCAUCCGUAUA- S40-AS328-M15 CGCUCUAUACGGAUGCUUUCAAUGA 40 328

GAGCGCU CUCAUUGAAAGCAUCCGUAUA- S41-AS329-M15 GCUCUAUACGGAUGCUUUCAAUGAG 41 329

GAGCGC CCUCAUUGAAA- S42-AS330-M15 CUCUAUACGGAUGCUUUCAAUGAGG 42 330

GCAUCCGUAUAGAGCG ACCUCAUUGAAA- S43-AS331-M15 UCUAUACGGAUGCUUUCAAUGAGGT 43 331

GCAUCCGUAUAGAGC CACCUCAUUGAAA- S44-AS332-M15 CUAUACGGAUGCUUUCAAUGAGGTG 44 332

GCAUCCGUAUAGAG

UCACCUCAUUGAAA- S45-AS333-M15 UAUACGGAUGCUUUCAAUGAGGUGA 45 333

GCAUCCGUAUAGA AUCACCUCAUUGAAA- S46-AS334-M15 AUACGGAUGCUUUCAAUGAGGUGAT 46 334

GCAUCCGUAUAG AAUCACCUCAUUGAAA- S47-AS335-M15 UACGGAUGCUUUCAAUGAGGUGATT 47 335

GCAUCCGUAUA CAAUCACCUCAUUGAAA- S48-AS336-M15 ACGGAUGCUUUCAAUGAGGUGAUTG 48 336

GCAUCCGUAU UCAAUCACCUCAUUGAAA- S49-AS337-M15 CGGAUGCUUUCAAUGAGGUGAUUGA 49 337

GCAUCCGUA AUCAAUCACCUCAUUGAAA- S50-AS338-M15 GGAUGCUUUCAAUGAGGUGAUUGAT 50 338

GCAUCCGU CAUCAAUCACCUCAUUGAAA- S51-AS339-M15 GAUGCUUUCAAUGAGGUGAUUGATG 51 339

GCAUCCG UCAUCAAUCACCUCAUUGAAA- S52-AS340-M15 AUGCUUUCAAUGAGGUGAUUGAUGA 52 340

GCAUCC GUCAUCAAUCACCUCAU- S53-AS341-M15 UGCUUUCAAUGAGGUGAUUGAUGAC 53 341

UGAAAGCAUC AGUCAUCAAUCACCUCAU- S54-AS342-M15 GCUUUCAAUGAGGUGAUUGAUGACT 54 342

UGAAAGCAU AAGUCAUCAAUCACCUCAU- S55-AS343-M15 CUUUCAAUGAGGUGAUUGAUGACTT 55 343

UGAAAGCA AAAGUCAUCAAUCACCUCAU- S56-AS344-M15 UUUCAAUGAGGUGAUUGAUGACUTT 56 344

UGAAAGC UAAAGUCAUCAAUCACCUCAU- S57-AS345-M15 UUCAAUGAGGUGAUUGAUGACUUTA 57 345

UGAAAG AUAAAGUCAUCAAUCAC- S58-AS346-M15 UCAAUGAGGUGAUUGAUGACUUUAT 58 346

CUCAUUGAAA CAUAAAGUCAUCAAUCAC- S59-AS347-M15 CAAUGAGGUGAUUGAUGACUUUATG 59 347

CUCAUUGAA UCAUAAAGUCAUCAAUCAC- S60-AS348-M15 AAUGAGGUGAUUGAUGACUUUAUGA 60 348

CUCAUUGA GUCAUAAAGUCAUCAAUCAC- S61-AS349-M15 AUGAGGUGAUUGAUGACUUUAUGAC 61 349

CUCAUUG AGUCAUAAAGUCAUCAAUCAC- S62-AS350-M15 UGAGGUGAUUGAUGACUUUAUGACT 62 350

CUCAUU GAGUCAUAAAGUCAUCAAU- S63-AS351-M15 GAGGUGAUUGAUGACUUUAUGACTC 63 351

CACCUCAU CGAGUCAUAAAGUCAUCAAU- S64-AS352-M15 AGGUGAUUGAUGACUUUAUGACUCG 64 352

CACCUCA UCGAGUCAUAAAGUCAUCAAU- S65-AS353-M15 GGUGAUUGAUGACUUUAUGACUCGA 65 353

CACCUC GUCGAGUCAUAAAGUCAU- S66-AS354-M15 GUGAUUGAUGACUUUAUGACUCGAC 66 354

CAAUCACCU AGUCGAGUCAUAAAGUCAU- S67-AS355-M15 UGAUUGAUGACUUUAUGACUCGACT 67 355

CAAUCACC CAGUCGAGUCAUAAAGUCAU- S68-AS356-M15 GAUUGAUGACUUUAUGACUCGACTG 68 356

CAAUCAC CCAGUCGAGUCAUAAAGUCAU- S69-AS357-M15 AUUGAUGACUUUAUGACUCGACUGG 69 357

CAAUCA UCCAGUCGAGUCAUAAA- S70-AS358-M15 UUGAUGACUUUAUGACUCGACUGGA 70 358

GUCAUCAAUC GGUCCAGUCGAGUCAUAAA- S71-AS359-M15 GAUGACUUUAUGACUCGACUGGACC 71 359

GUCAUCAA UGGUCCAGUCGAGUCAUAAA- S72-AS360-M15 AUGACUUUAUGACUCGACUGGACCA 72 360

GUCAUCA GCUGGUCCAGUCGAGUCAU- S73-AS361-M15 GACUUUAUGACUCGACUGGACCAGC 73 361

AAAGUCAU AGCUGGUCCAGUCGAGUCAU- S74-AS362-M15 ACUUUAUGACUCGACUGGACCAGCT 74 362

AAAGUCA AGUAGAAGAGUUGAGCCAU- S75-AS363-M15 UCGGACAUGGCUCAACUCUUCUACT 75 363

GUCCGACA GUAGUAGAA- S76-AS364-M15 GGACAUGGCUCAACUCUUCUACUAC 76 364

GAGUUGAGCCAUGUCCGA

AGUAGUAGAA- S77-AS365-M15 GACAUGGCUCAACUCUUCUACUACT 77 365

GAGUUGAGCCAUGUCCG AAGGCAAAGUAGUAGAA- S78-AS366-M15 CUCAACUCUUCUACUACUUUGCCTT 78 366

GAGUUGAGCC UCCAAGGCAAAGUAGUAGAA- S79-AS367-M15 AACUCUUCUACUACUUUGCCUUGGA 79 367

GAGUUGA UUCCAAGGCAAAGUAGUAGAA- S80-AS368-M15 ACUCUUCUACUACUUUGCCUUGGAA 80 368

GAGUUG CUUCCAAGGCAAAGUAGUA- S81-AS369-M15 CUCUUCUACUACUUUGCCUUGGAAG 81 369

GAAGAGUU UAGCUUCCAAGGCAAA- S82-AS370-M15 UUCUACUACUUUGCCUUGGAAGCTA 82 370

GUAGUAGAAGA AUAGCUUCCAAGGCAAA- S83-AS371-M15 UCUACUACUUUGCCUUGGAAGCUAT 83 371

GUAGUAGAAG AAUAGCUUCCAAGGCAAA- S84-AS372-M15 CUACUACUUUGCCUUGGAAGCUATT 84 372

GUAGUAGAA AAAUAGCUUCCAAGGCAAA- S85-AS373-M15 UACUACUUUGCCUUGGAAGCUAUTT 85 373

GUAGUAGA CAAAUAGCUUCCAAGGCAAA- S86-AS374-M15 ACUACUUUGCCUUGGAAGCUAUUTG 86 374

GUAGUAG GCAAAUAGCUUCCAAGGCAAA- S87-AS375-M15 CUACUUUGCCUUGGAAGCUAUUUGC 87 375

GUAGUA AG- S88-AS376-M15 UACUUUGCCUUGGAAGCUAUUUGCT 88 CAAAUAGCUUCCAAGGCAAA- 376

GUAGU UAG- S89-AS377-M15 ACUUUGCCUUGGAAGCUAUUUGCTA 89 CAAAUAGCUUCCAAGGCAAA- 377

GUAG GUAG- S90-AS378-M15 CUUUGCCUUGGAAGCUAUUUGCUAC 90 CAAAUAGCUUCCAAGGCAAA- 378

GUA UGUAG- S91-AS379-M15 UUUGCCUUGGAAGCUAUUUGCUACA 91 379

CAAAUAGCUUCCAAGGCAAAGU AUGUAG- S92-AS380-M15 UUGCCUUGGAAGCUAUUUGCUACAT 92 380

CAAAUAGCUUCCAAGGCAAAG GAUGUAG- S93-AS381-M15 UGCCUUGGAAGCUAUUUGCUACATC 93 381

CAAAUAGCUUCCAAGGCAAA GGAUGUAG- S94-AS382-M15 GCCUUGGAAGCUAUUUGCUACAUCC 94 382

CAAAUAGCUUCCAAGGCAA AGGAUGUAG- S95-AS383-M15 CCUUGGAAGCUAUUUGCUACAUCCT 95 383

CAAAUAGCUUCCAAGGCA CAGGAUGUAG- S96-AS384-M15 CUUGGAAGCUAUUUGCUACAUCCTG 96 384

CAAAUAGCUUCCAAGGC ACAGGAUGUAG- S97-AS385-M15 UUGGAAGCUAUUUGCUACAUCCUGT 97 385

CAAAUAGCUUCCAAGG AACAGGAUGUAG- S98-AS386-M15 UGGAAGCUAUUUGCUACAUCCUGTT 98 386

CAAAUAGCUUCCAAG GAACAGGAUGUAG- S99-AS387-M15 GGAAGCUAUUUGCUACAUCCUGUTC 99 387

CAAAUAGCUUCCAA CGAACAGGAUGUAG- S100-AS388-M15 GAAGCUAUUUGCUACAUCCUGUUCG 100 388

CAAAUAGCUUCCA UCGAACAGGAUGUAG- S101-AS389-M15 AAGCUAUUUGCUACAUCCUGUUCGA 101 389

CAAAUAGCUUCC CUCGAACAGGAUGUAG- S102-AS390-M15 AGCUAUUUGCUACAUCCUGUUCGAG 102 390

CAAAUAGCUUC UCUCGAACAGGAUGUAG- S103-AS391-M15 GCUAUUUGCUACAUCCUGUUCGAGA 103 391

CAAAUAGCUU UUCUCGAACAGGAUGUAG- S104-AS392-M15 CUAUUUGCUACAUCCUGUUCGAGAA 104 392

CAAAUAGCU UUUCUCGAACAGGAUGUAG- S105-AS393-M15 UAUUUGCUACAUCCUGUUCGAGAAA 105 393

CAAAUAGC GUUUCUCGAACAGGAUGUAG- S106-AS394-M15 AUUUGCUACAUCCUGUUCGAGAAAC 106 394

CAAAUAG S107-AS395-M15 UUUGCUACAUCCUGUUCGAGAAACG 107 CGUUUCUCGAACAGGAU- 395

GUAGCAAAUA GCGUUUCUCGAACAGGAU- S108-AS396-M15 UUGCUACAUCCUGUUCGAGAAACGC 108 396

GUAGCAAAU UGCGUUUCUCGAACAGGAU- S109-AS397-M15 UGCUACAUCCUGUUCGAGAAACGCA 109 397

GUAGCAAA AUGCGUUUCUCGAACAGGAU- S110-AS398-M15 GCUACAUCCUGUUCGAGAAACGCAT 110 398

GUAGCAA AAUGCGUUUCUCGAACAG- S111-AS399-M15 CUACAUCCUGUUCGAGAAACGCATT 111 399

GAUGUAGCA GGAACAUUAACCCGAUG- S112-AS400-M15 GUCAGAUCCAUCGGGUUAAUGUUCC 112 400

GAUCUGACGA UGGAACAUUAACCCGAUG- S113-AS401-M15 UCAGAUCCAUCGGGUUAAUGUUCCA 113 401

GAUCUGACG CUGGAACAUUAACCCGAUG- S114-AS402-M15 CAGAUCCAUCGGGUUAAUGUUCCAG 114 402

GAUCUGAC UCUGGAACAUUAACCCGAUG- S115-AS403-M15 AGAUCCAUCGGGUUAAUGUUCCAGA 115 403

GAUCUGA UUCUGGAACAU- S116-AS404-M15 GAUCCAUCGGGUUAAUGUUCCAGAA 116 404

UAACCCGAUGGAUCUG GUUCUGGAACAU- S117-AS405-M15 AUCCAUCGGGUUAAUGUUCCAGAAC 117 405

UAACCCGAUGGAUCU AGUUCUGGAACAU- S118-AS406-M15 UCCAUCGGGUUAAUGUUCCAGAACT 118 406

UAACCCGAUGGAUC GAGUUCUGGAACAU- S119-AS407-M15 CCAUCGGGUUAAUGUUCCAGAACTC 119 407

UAACCCGAUGGAU UGAGUUCUGGAACAU- S120-AS408-M15 CAUCGGGUUAAUGUUCCAGAACUCA 120 408

UAACCCGAUGGA GUGAGUUCUGGAACAU- S121-AS409-M15 AUCGGGUUAAUGUUCCAGAACUCAC 121 409

UAACCCGAUGG AGUGAGUUCUGGAACAU- S122-AS410-M15 UCGGGUUAAUGUUCCAGAACUCACT 122 410

UAACCCGAUG GAGUGAGUUCUGGAACAU- S123-AS411-M15 CGGGUUAAUGUUCCAGAACUCACTC 123 411

UAACCCGAU AGAGUGAGUUCUGGAACAU- S124-AS412-M15 GGGUUAAUGUUCCAGAACUCACUCT 124 412

UAACCCGA UAGAGUGAGUUCUGGAACAU- S125-AS413-M15 GGUUAAUGUUCCAGAACUCACUCTA 125 413

UAACCCG AUAGAGUGAGUUCUG- S126-AS414-M15 GUUAAUGUUCCAGAACUCACUCUAT 126 414

GAACAUUAACCC CAUAGAGUGAGUUCUG- S127-AS415-M15 UUAAUGUUCCAGAACUCACUCUATG 127 415

GAACAUUAACC GCAUAGAGUGAGUUCUG- S128-AS416-M15 UAAUGUUCCAGAACUCACUCUAUGC 128 416

GAACAUUAAC GGCAUAGAGUGAGUUCUG- S129-AS417-M15 AAUGUUCCAGAACUCACUCUAUGCC 129 417

GAACAUUAA UGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S130-AS418-M15 AUGUUCCAGAACUCACUCUAUGCCA 130 418

GAACAUUA GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S131-AS419-M15 UGUUCCAGAACUCACUCUAUGCCAC 131 419

GAACAUU GGUGGCAUAGAGUG- S132-AS420-M15 GUUCCAGAACUCACUCUAUGCCACC 132 420

AGUUCUGGAACAU GAAGGUGGCAUAGAGUG- S133-AS421-M15 CCAGAACUCACUCUAUGCCACCUTC 133 421

AGUUCUGGAA GGAAGGUGGCAUAGAGUG- S134-AS422-M15 CAGAACUCACUCUAUGCCACCUUCC 134 422

AGUUCUGGA UUCCAAC- S135-AS423-M15 GGAAGCGAUACCUGGAUGGUUGGAA 135 423

CAUCCAGGUAUCGCUUCCAG AUUCCAAC- S136-AS424-M15 GAAGCGAUACCUGGAUGGUUGGAAT 136 424

CAUCCAGGUAUCGCUUCCA CAUUCCAAC- S137-AS425-M15 AAGCGAUACCUGGAUGGUUGGAATG 137 425

CAUCCAGGUAUCGCUUCC GCAUUCCAAC- S138-AS426-M15 AGCGAUACCUGGAUGGUUGGAAUGC 138 426

CAUCCAGGUAUCGCUUC

GGCAUUCCAAC- S139-AS427-M15 GCGAUACCUGGAUGGUUGGAAUGCC 139 427

CAUCCAGGUAUCGCUU UGGCAUUCCAAC- S140-AS428-M15 CGAUACCUGGAUGGUUGGAAUGCCA 140 428

CAUCCAGGUAUCGCU AUGGCAUUCCAAC- S141-AS429-M15 GAUACCUGGAUGGUUGGAAUGCCAT 141 429

CAUCCAGGUAUCGC GAUGGCAUUCCAAC- S142-AS430-M15 AUACCUGGAUGGUUGGAAUGCCATC 142 430

CAUCCAGGUAUCG AAGAUGGCAUUCCAAC- S143-AS431-M15 ACCUGGAUGGUUGGAAUGCCAUCTT 143 431

CAUCCAGGUAU AAAGAUGGCAUUCCAAC- S144-AS432-M15 CCUGGAUGGUUGGAAUGCCAUCUTT 144 432

CAUCCAGGUA AAAAGAUGGCAUUCCAAC- S145-AS433-M15 CUGGAUGGUUGGAAUGCCAUCUUTT 145 433

CAUCCAGGU GAAAAGAUGGCAUUCCAAC- S146-AS434-M15 UGGAUGGUUGGAAUGCCAUCUUUTC 146 434

CAUCCAGG GGAAAAGAUGGCAUUCCAAC- S147-AS435-M15 GGAUGGUUGGAAUGCCAUCUUUUCC 147 435

CAUCCAG AGGAAAAGAUGGCAUUCCAAC- S148-AS436-M15 GAUGGUUGGAAUGCCAUCUUUUCCT 148 436

CAUCCA AAGGAAAAGAUGGCAU- S149-AS437-M15 AUGGUUGGAAUGCCAUCUUUUCCTT 149 437

UCCAACCAUCC AAAGGAAAAGAUGGCAU- S150-AS438-M15 UGGUUGGAAUGCCAUCUUUUCCUTT 150 438

UCCAACCAUC CAAAGGAAAAGAUGGCAU- S151-AS439-M15 GGUUGGAAUGCCAUCUUUUCCUUTG 151 439

UCCAACCAU CCAAAGGAAAAGAUGGCAU- S152-AS440-M15 GUUGGAAUGCCAUCUUUUCCUUUGG 152 440

UCCAACCA UUCCCAAAGGAAAA- S153-AS441-M15 GGAAUGCCAUCUUUUCCUUUGGGAA 153 441

GAUGGCAUUCCAA UCAUCAAU- S154-AS442-M15 CCUUUGGGAAGAAGCUGAUUGAUGA 154 442

CAGCUUCUUCCCAAAGGAA GCUUCUCAUCAAU- S155-AS443-M15 GGGAAGAAGCUGAUUGAUGAGAAGC 155 443

CAGCUUCUUCCCAA AGCUUCUCAUCAAU- S156-AS444-M15 GGAAGAAGCUGAUUGAUGAGAAGCT 156 444

CAGCUUCUUCCCA GAGCUUCUCAUCAAU- S157-AS445-M15 GAAGAAGCUGAUUGAUGAGAAGCTC 157 445

CAGCUUCUUCCC CGAGCUUCUCAUCAAU- S158-AS446-M15 AAGAAGCUGAUUGAUGAGAAGCUCG 158 446

CAGCUUCUUCC UCGAGCUUCUCAUCAAU- S159-AS447-M15 AGAAGCUGAUUGAUGAGAAGCUCGA 159 447

CAGCUUCUUC UUCGAGCUUCUCAUCAAU- S160-AS448-M15 GAAGCUGAUUGAUGAGAAGCUCGAA 160 448

CAGCUUCUU CUUCGAGCUUCUCAUCAAU- S161-AS449-M15 AAGCUGAUUGAUGAGAAGCUCGAAG 161 449

CAGCUUCU UCUUCGAGCUUCUCAUCAAU- S162-AS450-M15 AGCUGAUUGAUGAGAAGCUCGAAGA 162 450

CAGCUUC AUCUUCGAGCUUCUCAUCAAU- S163-AS451-M15 GCUGAUUGAUGAGAAGCUCGAAGAT 163 451

CAGCUU UAUCUUCGAGCUUCUCAU- S164-AS452-M15 CUGAUUGAUGAGAAGCUCGAAGATA 164 452

CAAUCAGCU AUAUCUUCGAGCUUCUCAU- S165-AS453-M15 UGAUUGAUGAGAAGCUCGAAGAUAT 165 453

CAAUCAGC CAUAUCUUCGAGCUUCUCAU- S166-AS454-M15 GAUUGAUGAGAAGCUCGAAGAUATG 166 454

CAAUCAG

CCAUAUCUUCGAGCUUCUCAU S167-AS455-M15 AUUGAUGAGAAGCUCGAAGAUAUGG 167 455

CAAUCA

UCCAUAUCUUCGAGCUUCUCA S168-AS456-M15 UUGAUGAGAAGCUCGAAGAUAUGGA 168 456

UCAAUC

CUCCAUAUCUUCGAGCUUCUC S169-AS457-M15 UGAUGAGAAGCUCGAAGAUAUGGAG 169 457

AUCAAU

CCUCCAUAUCUUCGAGCUUCU S170-AS458-M15 GAUGAGAAGCUCGAAGAUAUGGAGG 170 458

CAUCAA

AGAGGUGGUACAGGGCCCAU- S171-AS459-M15 CUGACAUGGGCCCUGUACCACCUCT 171 459

GUCAGCG GAGAGGUGGUA- S172-AS460-M15 UGACAUGGGCCCUGUACCACCUCTC 172 460

CAGGGCCCAUGUCAGC UGAGAGGUGGUA- S173-AS461-M15 GACAUGGGCCCUGUACCACCUCUCA 173 461

CAGGGCCCAUGUCAG UUGAGAGGUGGUA- S174-AS462-M15 ACAUGGGCCCUGUACCACCUCUCAA 174 462

CAGGGCCCAUGUCA UUUGAGAGGUGGUA- S175-AS463-M15 CAUGGGCCCUGUACCACCUCUCAAA 175 463

CAGGGCCCAUGUC CCUCGUGCAAGGCCUCCUG- S176-AS464-M15 GAGAUCCAGGAGGCCUUGCACGAGG 176 464

GAUCUCAG UCCUCGUGCAAGGCCUCCUG- S177-AS465-M15 AGAUCCAGGAGGCCUUGCACGAGGA 177 465

GAUCUCA UUCCUCGUG- S178-AS466-M15 GAUCCAGGAGGCCUUGCACGAGGAA 178 466

CAAGGCCUCCUGGAUCUC GGGCAAAGUCCUUGUG- S179-AS467-M15 GUGCCCCAGCACAAGGACUUUGCCC 179 467

CUGGGGCACUU UGGGCAAAGUCCUUGUG- S180-AS468-M15 UGCCCCAGCACAAGGACUUUGCCCA 180 468

CUGGGGCACU GUGGGCAAAGUCCUUGUG- S181-AS469-M15 GCCCCAGCACAAGGACUUUGCCCAC 181 469

CUGGGGCAC UGUGGGCAAAGUCCUUGUG- S182-AS470-M15 CCCCAGCACAAGGACUUUGCCCACA 182 470

CUGGGGCA AUGUGGGCAAAGUCCUUGUG- S183-AS471-M15 CCCAGCACAAGGACUUUGCCCACAT 183 471

CUGGGGC CAUGUGGGCAAA- S184-AS472-M15 CCAGCACAAGGACUUUGCCCACATG 184 472

GUCCUUGUGCUGGGG GCAUGUGGGCAAA- S185-AS473-M15 CAGCACAAGGACUUUGCCCACAUGC 185 473

GUCCUUGUGCUGGG GGCAUGUGGGCAAA- S186-AS474-M15 AGCACAAGGACUUUGCCCACAUGCC 186 474

GUCCUUGUGCUGG CGGCAUGUGGGCAAA- S187-AS475-M15 GCACAAGGACUUUGCCCACAUGCCG 187 475

GUCCUUGUGCUG ACGGCAUGUGGGCAAA- S188-AS476-M15 CACAAGGACUUUGCCCACAUGCCGT 188 476

GUCCUUGUGCU AACGGCAUGUGGGCAAA- S189-AS477-M15 ACAAGGACUUUGCCCACAUGCCGTT 189 477

GUCCUUGUGC CAACGGCAUGUGGGCAAA- S190-AS478-M15 CAAGGACUUUGCCCACAUGCCGUTG 190 478

GUCCUUGUG GCAACGGCAUGUGGGCAAA- S191-AS479-M15 AAGGACUUUGCCCACAUGCCGUUGC 191 479

GUCCUUGU AGCAACGGCAUGUGGGCAAA- S192-AS480-M15 AGGACUUUGCCCACAUGCCGUUGCT 192 480

GUCCUUG GAGUCUCCUU- S193-AS481-M15 CUCAAAGCUGUGCUUAAGGAGACTC 193 481

AAGCACAGCUUUGAGCA CAGAGUCUCCUU- S194-AS482-M15 CAAAGCUGUGCUUAAGGAGACUCTG 194 482

AAGCACAGCUUUGAG UUUCUAUGAUCCGG- S195-AS483-M15 CCCACAAACUCCCGGAUCAUAGAAA 195 483

GAGUUUGUGGGGA UUUUCUAUGAUCCGG- S196-AS484-M15 CCACAAACUCCCGGAUCAUAGAAAA 196 484

GAGUUUGUGGGG CCUUUUCUAUGAUCCGG- S197-AS485-M15 ACAAACUCCCGGAUCAUAGAAAAGG 197 485

GAGUUUGUGG UCCUUUUCUAUGAUCCGG- S198-AS486-M15 CAAACUCCCGGAUCAUAGAAAAGGA 198 486

GAGUUUGUG CAAU- S199-AS487-M15 UCCCGGAUCAUAGAAAAGGAAAUTG 199 UUCCUUUUCUAUGAUCCGG- 487

GAGU UCAAU- S200-AS488-M15 CCCGGAUCAUAGAAAAGGAAAUUGA 200 UUCCUUUUCUAUGAUCCGG- 488

GAG UUCAAU- S201-AS489-M15 CCGGAUCAUAGAAAAGGAAAUUGAA 201 489

UUCCUUUUCUAUGAUCCGGGA

CUUCAAU- S202-AS490-M15 CGGAUCAUAGAAAAGGAAAUUGAAG 202 490

UUCCUUUUCUAUGAUCCGGG ACUUCAAU- S203-AS491-M15 GGAUCAUAGAAAAGGAAAUUGAAGT 203 491

UUCCUUUUCUAUGAUCCGG AACUUCAAU- S204-AS492-M15 GAUCAUAGAAAAGGAAAUUGAAGTT 204 492

UUCCUUUUCUAUGAUCCG CAACUUCAAU- S205-AS493-M15 AUCAUAGAAAAGGAAAUUGAAGUTG 205 493

UUCCUUUUCUAUGAUCC UCAACUUCAAU- S206-AS494-M15 UCAUAGAAAAGGAAAUUGAAGUUGA 206 494

UUCCUUUUCUAUGAUC AUCAACUUCAAU- S207-AS495-M15 CAUAGAAAAGGAAAUUGAAGUUGAT 207 495

UUCCUUUUCUAUGAU CAUCAACUUCAAU- S208-AS496-M15 AUAGAAAAGGAAAUUGAAGUUGATG 208 496

UUCCUUUUCUAUGA CCAUCAACUUCAAU- S209-AS497-M15 UAGAAAAGGAAAUUGAAGUUGAUGG 209 497

UUCCUUUUCUAUG GCCAUCAACUUCAAU- S210-AS498-M15 AGAAAAGGAAAUUGAAGUUGAUGGC 210 498

UUCCUUUUCUAU AGCCAUCAACUUCAAU- S211-AS499-M15 GAAAAGGAAAUUGAAGUUGAUGGCT 211 499

UUCCUUUUCUA AAGCCAUCAACUUCAAU- S212-AS500-M15 AAAAGGAAAUUGAAGUUGAUGGCTT 212 500

UUCCUUUUCU GAAGCCAUCAACUUCAAU- S213-AS501-M15 AAAGGAAAUUGAAGUUGAUGGCUTC 213 501

UUCCUUUUC GAGGAAGCCAUCAACUUCAAU- S214-AS502-M15 GGAAAUUGAAGUUGAUGGCUUCCTC 214 502

UUCCUU AGAGGAAGCCAUCAACU- S215-AS503-M15 GAAAUUGAAGUUGAUGGCUUCCUCT 215 503

UCAAUUUCCU AAGAGGAAGCCAUCAACU- S216-AS504-M15 AAAUUGAAGUUGAUGGCUUCCUCTT 216 504

UCAAUUUCC CCUUGUACUUCUGGAU- S217-AS505-M15 GCAAGGCUGAUCCAGAAGUACAAGG 217 505

CAGCCUUGCGA ACCUUGUACUUCUGGAU- S218-AS506-M15 CAAGGCUGAUCCAGAAGUACAAGGT 218 506

CAGCCUUGCG CACCUUGUACUUCUGGAU- S219-AS507-M15 AAGGCUGAUCCAGAAGUACAAGGTG 219 507

CAGCCUUGC CCACCUUGUACUUCUGGAU- S220-AS508-M15 AGGCUGAUCCAGAAGUACAAGGUGG 220 508

CAGCCUUG UCUUAUUGGGAACCAG- S221-AS509-M15 CGCAUUGUCCUGGUUCCCAAUAAGA 221 509

GACAAUGCGGG UUCUUAUUGGGAACCAG- S222-AS510-M15 GCAUUGUCCUGGUUCCCAAUAAGAA 222 510

GACAAUGCGG UUUCUUAUUGGGAACCAG- S223-AS511-M15 CAUUGUCCUGGUUCCCAAUAAGAAA 223 511

GACAAUGCG CUUUCUUAUUGGGAACCAG- S224-AS512-M15 AUUGUCCUGGUUCCCAAUAAGAAAG 224 512

GACAAUGC ACUUUCUUAUUGGGAACCAG- S225-AS513-M15 UUGUCCUGGUUCCCAAUAAGAAAGT 225 513

GACAAUG CACUUUCUUAUUGGGAAC- S226-AS514-M15 UGUCCUGGUUCCCAAUAAGAAAGTG 226 514

CAGGACAAU CCACUUUCUUAUUGGGAAC- S227-AS515-M15 GUCCUGGUUCCCAAUAAGAAAGUGG 227 515

CAGGACAA GAUAGAAGUGGCAAAA- S228-AS516-M15 ACCCUGAGCUUUUGCCACUUCUATC 228 516

GCUCAGGGUGU UGAUAGAAGUGGCAAAA- S229-AS517-M15 CCCUGAGCUUUUGCCACUUCUAUCA 229 517

GCUCAGGGUG AUGAUAGAAGUGGCAAAA- S230-AS518-M15 CCUGAGCUUUUGCCACUUCUAUCAT 230 518

GCUCAGGGU AAUGAUAGAAGUGGCAAAA- S231-AS519-M15 CUGAGCUUUUGCCACUUCUAUCATT 231 519

GCUCAGGG AAAUGAUAGAAGUGGCAAAA- S232-AS520-M15 UGAGCUUUUGCCACUUCUAUCAUTT 232 520

GCUCAGG AAAAUGAUAGAAGUGGCAAAA- S233-AS521-M15 GAGCUUUUGCCACUUCUAUCAUUTT 233 521

GCUCAG

AAAAAUGAUAGAAGUG- S234-AS522-M15 AGCUUUUGCCACUUCUAUCAUUUTT 234 522

GCAAAAGCUCA CAAAAAUGAUAGAAGUG- S235-AS523-M15 GCUUUUGCCACUUCUAUCAUUUUTG 235 523

GCAAAAGCUC UCAAAAAUGAUAGAAGUG- S236-AS524-M15 CUUUUGCCACUUCUAUCAUUUUUGA 236 524

GCAAAAGCU CUCAAAAAUGAUAGAAGUG- S237-AS525-M15 UUUUGCCACUUCUAUCAUUUUUGAG 237 525

GCAAAAGC GCUCAAAAAUGAUAGAAGUG- S238-AS526-M15 UUUGCCACUUCUAUCAUUUUUGAGC 238 526

GCAAAAG UGCUCAAAAAUGAUAGAAGUG- S239-AS527-M15 UUGCCACUUCUAUCAUUUUUGAGCA 239 527

GCAAAA UUGCUCAAAAAUGAUAGAA- S240-AS528-M15 UGCCACUUCUAUCAUUUUUGAGCAA 240 528

GUGGCAAA GUUGCUCAAAAAUGAUAGAA- S241-AS529-M15 GCCACUUCUAUCAUUUUUGAGCAAC 241 529

GUGGCAA AGUUGCUCAAAAAUGAUAGAA- S242-AS530-M15 CCACUUCUAUCAUUUUUGAGCAACT 242 530

GUGGCA GAGUUGCUCAAAAAUGAUA- S243-AS531-M15 CACUUCUAUCAUUUUUGAGCAACTC 243 531

GAAGUGGC GGAGUUGCUCAAAAAUGAUA- S244-AS532-M15 ACUUCUAUCAUUUUUGAGCAACUCC 244 532

GAAGUGG GGGAGUUGCUCAAAAAU- S245-AS533-M15 CUUCUAUCAUUUUUGAGCAACUCCC 245 533

GAUAGAAGUG AGGGAGUUGCUCAAAAAU- S246-AS534-M15 UUCUAUCAUUUUUGAGCAACUCCCT 246 534

GAUAGAAGU GAGGGAGUUGCUCAAAAAU- S247-AS535-M15 UCUAUCAUUUUUGAGCAACUCCCTC 247 535

GAUAGAAG AGAGGGAGUUGCUCAAAAAU- S248-AS536-M15 CUAUCAUUUUUGAGCAACUCCCUCT 248 536

GAUAGAA UGA- S249-AS537-M15 AUCAUUUUUGAGCAACUCCCUCUCA 249 GAGGGAGUUGCUCAAAAAU- 537

GAUAG CUGA- S250-AS538-M15 UCAUUUUUGAGCAACUCCCUCUCAG 250 GAGGGAGUUGCUCAAAAAU- 538

GAUA CCUUUUAGCUGA- S251-AS539-M15 GAGCAACUCCCUCUCAGCUAAAAGG 251 539

GAGGGAGUUGCUCAA UAUUCUACCCAAGGACAG- S252-AS540-M15 CGCAUUGCUGUCCUUGGGUAGAATA 252 540

CAAUGCGAU AUAUUCUACCCAAGGACAG- S253-AS541-M15 GCAUUGCUGUCCUUGGGUAGAAUAT 253 541

CAAUGCGA UAUAUUCUACCCAAGGACAG- S254-AS542-M15 CAUUGCUGUCCUUGGGUAGAAUATA 254 542

CAAUGCG UUAUAUUCUACCCAAGGACAG- S255-AS543-M15 AUUGCUGUCCUUGGGUAGAAUAUAA 255 543

CAAUGC

UUUAUAUUCUACCCAAGGACAG S256-AS544-M15 UUGCUGUCCUUGGGUAGAAUAUAAA 256 544

CAAUG

UUUUAUAUUCUACCCAAGGACA S257-AS545-M15 UGCUGUCCUUGGGUAGAAUAUAAAA 257 545

GCAAU AU- S258-AS546-M15 GCUGUCCUUGGGUAGAAUAUAAAAT 258 UUUAUAUUCUACCCAAGGACAG 546

CAA

UAUUUUAUAUUCUACCCAAGGA S259-AS547-M15 CUGUCCUUGGGUAGAAUAUAAAATA 259 547

CAGCA

UUAUUUUAUAUUCUACCCAAGG S260-AS548-M15 UGUCCUUGGGUAGAAUAUAAAAUAA 260 548

ACAGC

UUUAUUUUAUAUUCUACCCAAG S261-AS549-M15 GUCCUUGGGUAGAAUAUAAAAUAAA 261 549

GACAG

CUUUAUUUUAUAUUCUACCCAA S262-AS550-M15 UCCUUGGGUAGAAUAUAAAAUAAAG 262 550

GGACA

CCUUUAUUUUAUAUUCUACCCA S263-AS551-M15 CCUUGGGUAGAAUAUAAAAUAAAGG 263 551

AGGAC S264-AS552-M15 CUUGGGUAGAAUAUAAAAUAAAGGG 264 CCCUUUAUUUUAUAUUCUACCC 552

AAGGA

UCCCUUUAUUUUAUAUUCUACC S265-AS553-M15 UUGGGUAGAAUAUAAAAUAAAGGGA 265 553

CAAGG

GUCCCUUUAUUUUAUAUUCUAC S266-AS554-M15 UGGGUAGAAUAUAAAAUAAAGGGAC 266 554

CCAAG

AGUCCCUUUAUUUUAUAUUCUA S267-AS555-M15 GGGUAGAAUAUAAAAUAAAGGGACT 267 555

CCCAA AAA- S268-AS556-M15 GUAGAAUAUAAAAUAAAGGGACUTT 268 GUCCCUUUAUUUUAUAUUCUAC 556

CC AAAA- S269-AS557-M15 UAGAAUAUAAAAUAAAGGGACUUTT 269 GUCCCUUUAUUUUAUAUUCUAC 557

C UAAAA- S270-AS558-M15 AGAAUAUAAAAUAAAGGGACUUUTA 270 558

GUCCCUUUAUUUUAUAUUCUAC AUAAAA- S271-AS559-M15 GAAUAUAAAAUAAAGGGACUUUUAT 271 559

GUCCCUUUAUUUUAUAUUCUA AAUAAAA- S272-AS560-M15 AAUAUAAAAUAAAGGGACUUUUATT 272 560

GUCCCUUUAUUUUAUAUUCU AAAUAAAA- S273-AS561-M15 AUAUAAAAUAAAGGGACUUUUAUTT 273 561

GUCCCUUUAUUUUAUAUUC GAAAUAAAA- S274-AS562-M15 UAUAAAAUAAAGGGACUUUUAUUTC 274 562

GUCCCUUUAUUUUAUAUU AGAAAUAAAA- S275-AS563-M15 AUAAAAUAAAGGGACUUUUAUUUCT 275 563

GUCCCUUUAUUUUAUAU AAGAAAUAAAA- S276-AS564-M15 UAAAAUAAAGGGACUUUUAUUUCTT 276 564

GUCCCUUUAUUUUAUA UAAGAAAUAAAA- S277-AS565-M15 AAAAUAAAGGGACUUUUAUUUCUTA 277 565

GUCCCUUUAUUUUAU AUAAGAAAUAAAA- S278-AS566-M15 AAAUAAAGGGACUUUUAUUUCUUAT 278 566

GUCCCUUUAUUUUA AAUAAGAAAUAAAA- S279-AS567-M15 AAUAAAGGGACUUUUAUUUCUUATT 279 567

GUCCCUUUAUUUU CAAUAAGAAAUAAAA- S280-AS568-M15 AUAAAGGGACUUUUAUUUCUUAUTG 280 568

GUCCCUUUAUUU CCAAUAAGAAAUAAAA- S281-AS569-M15 UAAAGGGACUUUUAUUUCUUAUUGG 281 569

GUCCCUUUAUU UCCAAUAAGAAAUAAAA- S282-AS570-M15 AAAGGGACUUUUAUUUCUUAUUGGA 282 570

GUCCCUUUAU UUCCAAUAAGAAAUAAAA- S283-AS571-M15 AAGGGACUUUUAUUUCUUAUUGGAA 283 571

GUCCCUUUA UUUCCAAUAAGAAAUAAAA- S284-AS572-M15 AGGGACUUUUAUUUCUUAUUGGAAA 284 572

GUCCCUUU UUUUCCAAUAAGAAAUAAAA- S285-AS573-M15 GGGACUUUUAUUUCUUAUUGGAAAA 285 573

GUCCCUU UUUUUCCAAUAAGAAAUAAAA- S286-AS574-M15 GGACUUUUAUUUCUUAUUGGAAAAA 286 574

GUCCCU UUUUUUCCAAUAAGAAAU- S287-AS575-M15 GACUUUUAUUUCUUAUUGGAAAAAA 287 575

AAAAGUCCC UUUUUUUCCAAUAAGAAAU- S288-AS576-M15 ACUUUUAUUUCUUAUUGGAAAAAAA 288 576

AAAAGUCC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M1 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M2 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M3 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M4 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M5 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M6 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC

UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M7 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M8 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M9 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M10 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M11 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGA- S785-AS786-M26 785 UCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 786 GA_GCAGCCGAAAGGCUGC CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M1 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M2 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M3 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M4 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M5 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M6 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M7 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M8 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M9 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M10 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACUCUAUGCCAC- GUGGCAUAGAGUGAGUUCUG- S578-AS580-M11 578 580

GCAGCCGAAAGGCUGC GA CAGAACUCACU- S787-AS788-M26 787 UGGCAUAGAGUGAGUUCUGGA 788 CUAUGCCA_GCAGCCGAAAGGCUGC UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- S577-AS579-M1 577 UUCUCGAACAGGAUGUAGCAAA 579

GCAGCCGAAAGGCUGC CGGAUGCUUUCAAUGAGGUAG- UACCUCAUUGAAA- S581-AS598-M13 581 598

CAGCCGAAAGGCUGC GCAUCCGGG CGGAUGCUUUCAAUGAGGUAG- UACCUCAUUGAAA- S581-AS598-M14 581 598

CAGCCGAAAGGCUGC GCAUCCGGG AUGAGGUGAUUGAUGACUUUG- S582-AS599-M13 582 AAAGUCAUCAAUCACCUCAUGG 599

CAGCCGAAAGGCUGC AUGAGGUGAUUGAUGACUUUG- S582-AS599-M14 582 AAAGUCAUCAAUCACCUCAUGG 599

CAGCCGAAAGGCUGC AGGUGAUUGAUGACU- S583-AS600-M14 583 CAUAAAGUCAUCAAUCACCUGG 600

UUAUGGCAGCCGAAAGGCUGC AGGUGAUUGAUGACUUUAUAG- S583-AS600-M14* 583 UAUAAAGUCAUCAAUCACCUGG 600

CAGCCGAAAGGCUGC GUGAUUGAUGACUUUAUGAA- S584-AS601-M13 584 UUCAUAAAGUCAUCAAUCACGG 601

GCAGCCGAAAGGCUGC GUGAUUGAUGACUUUAUGAA- S584-AS601-M14 584 UUCAUAAAGUCAUCAAUCACGG 601

GCAGCCGAAAGGCUGC AUUGAUGACUUUAUGACUCAG- S585-AS602-M14 585 UGAGUCAUAAAGUCAUCAAUGG 602

CAGCCGAAAGGCUGC UCUACUACUUUGCCUUGGAA- UUCCAAGGCAAAGUAGUA- S586-AS603-M14 586 603

GCAGCCGAAAGGCUGC GAGG CUACUUUGCCUUGGAAGCUAG- UAGCUUCCAAGGCAAA- S587-AS604-M13 587 604

CAGCCGAAAGGCUGC GUAGGG CUACUUUGCCUUGGAAGCUAG- UAGCUUCCAAGGCAAA- S587-AS604-M14 587 604

CAGCCGAAAGGCUGC GUAGGG

AUUUGCUACAUCCUGUUCGAG- UCGAACAGGAUGUAG- S588-AS605-M13 588 605

CAGCCGAAAGGCUGC CAAAUGG AUUUGCUACAUCCUGUUCGAG- UCGAACAGGAUGUAG- S588-AS605-M14 588 605

CAGCCGAAAGGCUGC CAAAUGG UUGCUACAUCCUGUUCGAGAG- UCUCGAACAGGAUGUAG- S589-AS606-M13 589 606

CAGCCGAAAGGCUGC CAAGG UGUUCCAGAACUCACUCUAUG- AUAGAGUGAGUUCUG- S590-AS607-M13 590 607

CAGCCGAAAGGCUGC GAACAGG UGUUCCAGAACUCACUCUAUG- AUAGAGUGAGUUCUG- S590-AS607-M14 590 607

CAGCCGAAAGGCUGC GAACAGG AGAAGCUGAUUGAUGA- CUUCUCAUCAAU- S591-AS608-M13 591 608

GAAGGCAGCCGAAAGGCUGC CAGCUUCUGG AGAAGCUGAUUGAUGAGAAA- UUUCUCAUCAAU- S591-AS608-M13* 591 608

GCAGCCGAAAGGCUGC CAGCUUCUGG AGGACUUUGCCCACAUGCCAG- UGGCAUGUGGGCAAA- S592-AS609-M14 592 609

CAGCCGAAAGGCUGC GUCCUGG UCCCGGAUCAUAGAAAAGGAG- UCCUUUUCUAUGAUCCGG- S593-AS610-M13 593 610

CAGCCGAAAGGCUGC GAGG UCCCGGAUCAUAGAAAAGGAG- UCCUUUUCUAUGAUCCGG- S593-AS610-M14 593 610

CAGCCGAAAGGCUGC GAGG CGGAUCAUAGAAAAGGAAAUG- AU- S594-AS611-M13 594 611

CAGCCGAAAGGCUGC UUCCUUUUCUAUGAUCCGGG CGGAUCAUAGAAAAGGAAAUG- AU- S594-AS611-M14 594 611

CAGCCGAAAGGCUGC UUCCUUUUCUAUGAUCCGGG GAAAUUGAAGUUGAUGGCUUG- S595-AS612-M13 595 AAGCCAUCAACUUCAAUUUCGG 612

CAGCCGAAAGGCUGC GAAAUUGAAGUUGAUGGCUUG- S595-AS612-M14 595 AAGCCAUCAACUUCAAUUUCGG 612

CAGCCGAAAGGCUGC AAGGCUGAUCCAGAAGUACAG- UGUACUUCUGGAU- S596-AS613-M13 596 613

CAGCCGAAAGGCUGC CAGCCUUGG AAGGCUGAUCCAGAAGUACAG- UGUACUUCUGGAU- S596-AS613-M14 596 613

CAGCCGAAAGGCUGC CAGCCUUGG GUCCUUGGGUAGAAUAUAAA- UUUAUAUUCUACCCAAGGACG S597-AS614-M13 597 614

GCAGCCGAAAGGCUGC G GUCCUUGGGUAGAAUAUAAA- UUUAUAUUCUACCCAAGGACG S597-AS614-M14 597 614

GCAGCCGAAAGGCUGC G CUGGAAUAAAAAU- S789-AS790-M27 CGGAACGCUACAAUUUUUAUUCCAG 789 790

UGUAGCGUUCCGGU CGGAACGCUACAAUUUUUAUG- AUAAAAAU- S759-AS763-M16G 759 763

CAGCCGAAAGGCUGC UGUAGCGUUCCGGU CGGAACGCUACAAUUUUUAUG- AUAAAAAU- S759-AS763-M17G 759 763

CAGCCGAAAGGCUGC UGUAGCGUUCCGGU CGGAACGCUACAAUUUUUAUG- AUAAAAAU- S759-AS763-M18G 759 763

CAGCCGAAAGGCUGC UGUAGCGUUCCGGU ACAAUUUUUAUUCCAGCUAUG- S760-AS764-M16G 760 AUAGCUGGAAUAAAAAUUGUAG 764

CAGCCGAAAGGCUGC ACAAUUUUUAUUCCAGCUAUG- S760-AS764-M19G 760 AUAGCUGGAAUAAAAAUUGUAG 764

CAGCCGAAAGGCUGC ACAAUUUUUAUUCCAGCUAUG- S760-AS764-M18G 760 AUAGCUGGAAUAAAAAUUGUAG 764

CAGCCGAAAGGCUGC ACAAUUUUUAUUCCAGCUAUG- S760-AS764-M20G 760 AUAGCUGGAAUAAAAAUUGUAG 764

CAGCCGAAAGGCUGC ACGAGGUUAUCAGUGACUUUG- S761-AS765-M17G 761 AAAGUCACUGAUAACCUCGUUU 765

CAGCCGAAAGGCUGC ACGAGGUUAUCAGUGACUUUG- S761-AS765-M18G 761 AAAGUCACUGAUAACCUCGUUU 765

CAGCCGAAAGGCUGC AGAUCCAGGAGGCCUUGCAC- GUGCAAGGCCUCCUGGAUCU- S762-AS766-M19G 762 766

GCAGCCGAAAGGCUGC CA UGCUACAUCCUGUUCGAGAA- UUCUCGAACAGGAUGUAG- S577-AS791-M21G 577 791

GCAGCCGAAAGGCUGC CAGG CGGAUGCUUUCAAUGAGGUAG- UACCUCAUUGAAA- S581-AS598-M22G 581 598

CAGCCGAAAGGCUGC GCAUCCGGG AUGAGGUGAUUGAUGACUUUG- S582-AS599-M22G 582 AAAGUCAUCAAUCACCUCAUGG 599

CAGCCGAAAGGCUGC

GUGAUUGAUGACUUUAUGAA- S584-AS601-M22G 584 UUCAUAAAGUCAUCAAUCACGG 601

GCAGCCGAAAGGCUGC UCUACUACUUUGCCUUGGAA- UUCCAAGGCAAAGUAGUA- S586-AS603-M23G 586 603

GCAGCCGAAAGGCUGC GAGG AUUUGCUACAUCCUGUUCGAG- UCGAACAGGAUGUAG- S588-AS605-M23G 588 605

CAGCCGAAAGGCUGC CAAAUGG UGUUCCAGAACUCACUCUAUG- AUAGAGUGAGUUCUG- S590-AS607-M23G 590 607

CAGCCGAAAGGCUGC GAACAGG AGAAGCUGAUUGAUGA- CUUCUCAUCAAU- S591-AS608-M24G 591 608

GAAGGCAGCCGAAAGGCUGC CAGCUUCUGG AGAAGCUGAUUGAUGAGAAA- UUUCUCAUCAAU- S591-AS608-M22G* 591 608

GCAGCCGAAAGGCUGC CAGCUUCUGG UCCCGGAUCAUAGAAAAGGAG- UCCUUUUCUAUGAUCCGG- S593-AS610-M22G 593 610

CAGCCGAAAGGCUGC GAGG CGGAUCAUAGAAAAGGAAAUG- AU- S594-AS611-M23G 594 611

CAGCCGAAAGGCUGC UUCCUUUUCUAUGAUCCGGG GAAAUUGAAGUUGAUGGCUUG- S595-AS612-M23G 595 AAGCCAUCAACUUCAAUUUCGG 612

CAGCCGAAAGGCUGC GUCCUUGGGUAGAAUAUAAA- UUUAUAUUCUACCCAAGGACG S597-AS614-M23G 597 614

GCAGCCGAAAGGCUGC G ACAAUUUUUAUUCCAGCUAUG- S760-AS792-M25G 760 AUAGCUGGAAUAAAAAUUGUGG 792

CAGCCGAAAGGCUGC UGGAAUAAAAAU- S615-AS687-M15 CCGGAACGCUACAAUUUUUAUUCCA 615 687

UGUAGCGUUCCGGUC CUGGAAUAAAAAU- S616-AS688-M15 CGGAACGCUACAAUUUUUAUUCCAG 616 688

UGUAGCGUUCCGGU AUAGCUGGAAUAAAAAU- S617-AS689-M15 ACGCUACAAUUUUUAUUCCAGCUAT 617 689

UGUAGCGUUC AAUAGCUGGAAUAAAAAU- S618-AS690-M15 CGCUACAAUUUUUAUUCCAGCUATT 618 690

UGUAGCGUU UAGAAAUAGCUGGAAU- S619-AS691-M15 ACAAUUUUUAUUCCAGCUAUUUCTA 619 691

AAAAAUUGUAG GUAGAAAUAGCUGGAAU- S620-AS692-M15 CAAUUUUUAUUCCAGCUAUUUCUAC 620 692

AAAAAUUGUA UGUAGAAAUAGCUGGAAU- S621-AS693-M15 AAUUUUUAUUCCAGCUAUUUCUACA 621 693

AAAAAUUGU UUGUAGAAAUAGCUGGAAU- S622-AS694-M15 AUUUUUAUUCCAGCUAUUUCUACAA 622 694

AAAAAUUG CAUACUUGGUCUUGUUCAG- S623-AS695-M15 CAGGUGCUGAACAAGACCAAGUATG 623 695

CACCUGGA UGAUAAAGUCACUGAUAAC- S624-AS696-M15 AACGAGGUUAUCAGUGACUUUAUCA 624 696

CUCGUUUA GUGAUAAAGUCACUGAUAAC- S625-AS697-M15 ACGAGGUUAUCAGUGACUUUAUCAC 625 697

CUCGUUU GGUGAUAAAGUCACUGAUAAC- S626-AS698-M15 CGAGGUUAUCAGUGACUUUAUCACC 626 698

CUCGUU AAACAG- S627-AS699-M15 GGAAGCCAUCACCUAUAUCCUGUTT 627 699

GAUAUAGGUGAUGGCUUCCAA CAAACAG- S628-AS700-M15 GAAGCCAUCACCUAUAUCCUGUUTG 628 700

GAUAUAGGUGAUGGCUUCCA UCAAACAG- S629-AS701-M15 AAGCCAUCACCUAUAUCCUGUUUGA 629 701

GAUAUAGGUGAUGGCUUCC UCUCAAACAG- S630-AS702-M15 GCCAUCACCUAUAUCCUGUUUGAGA 630 702

GAUAUAGGUGAUGGCUU UUCUCAAACAG- S631-AS703-M15 CCAUCACCUAUAUCCUGUUUGAGAA 631 703

GAUAUAGGUGAUGGCU UUUCUCAAACAG- S632-AS704-M15 CAUCACCUAUAUCCUGUUUGAGAAA 632 704

GAUAUAGGUGAUGGC UUUUCUCAAACAG- S633-AS705-M15 AUCACCUAUAUCCUGUUUGAGAAAA 633 705

GAUAUAGGUGAUGG UCCUUUUCUCAAACAG- S634-AS706-M15 ACCUAUAUCCUGUUUGAGAAAAGGA 634 706

GAUAUAGGUGA AUCCUUUUCUCAAACAG- S635-AS707-M15 CCUAUAUCCUGUUUGAGAAAAGGAT 635 707

GAUAUAGGUG

AAUCCUUUUCUCAAACAG- S636-AS708-M15 CUAUAUCCUGUUUGAGAAAAGGATT 636 708

GAUAUAGGU UCUGGAACAUGAUUGCAACA- S637-AS709-M15 AGAUCUGUUGCAAUCAUGUUCCAGA 637 709

GAUCUGA UUCUGGAACAUGAUUG- S638-AS710-M15 GAUCUGUUGCAAUCAUGUUCCAGAA 638 710

CAACAGAUCUG UGAGUUCUGGAACAUGAUUG- S639-AS711-M15 UGUUGCAAUCAUGUUCCAGAACUCA 639 711

CAACAGA CUGAGUUCUGGAACAUGAU- S640-AS712-M15 GUUGCAAUCAUGUUCCAGAACUCAG 640 712

UGCAACAG UAGACUGAGUUCUGGAACAU- S641-AS713-M15 CAAUCAUGUUCCAGAACUCAGUCTA 641 713

GAUUGCA UAUAGACUGAGUUCUG- S642-AS714-M15 AUCAUGUUCCAGAACUCAGUCUATA 642 714

GAACAUGAUUG UGAUAUAGACUGAGUUCUG- S643-AS715-M15 AUGUUCCAGAACUCAGUCUAUAUCA 643 715

GAACAUGA GUGAUAUAGACUGAGUUCUG- S644-AS716-M15 UGUUCCAGAACUCAGUCUAUAUCAC 644 716

GAACAUG AGUGAUAUAGA- S645-AS717-M15 GUUCCAGAACUCAGUCUAUAUCACT 645 717

CUGAGUUCUGGAACAU AAGUGAUAUAGA- S646-AS718-M15 UUCCAGAACUCAGUCUAUAUCACTT 646 718

CUGAGUUCUGGAACA GAAAGUGAUAUAGA- S647-AS719-M15 CCAGAACUCAGUCUAUAUCACUUTC 647 719

CUGAGUUCUGGAA AAGGAAAGUGAUAUAGA- S648-AS720-M15 GAACUCAGUCUAUAUCACUUUCCTT 648 720

CUGAGUUCUG UUCUUUCCAAAGGAGAAAAU- S649-AS721-M15 AUAACAUUUUCUCCUUUGGAAAGAA 649 721

GUUAUCC CUUCUUUCCAAAGGAGAAAAU- S650-AS722-M15 UAACAUUUUCUCCUUUGGAAAGAAG 650 722

GUUAUC GCUUCUUUCCAAAGGA- S651-AS723-M15 AACAUUUUCUCCUUUGGAAAGAAGC 651 723

GAAAAUGUUAU CUUUUUCAUCAAU- S652-AS724-M15 GGAAAGAAGCUGAUUGAUGAAAAAG 652 724

CAGCUUCUUUCCAA ACUUUUUCAUCAAU- S653-AS725-M15 GAAAGAAGCUGAUUGAUGAAAAAGT 653 725

CAGCUUCUUUCCA UGGACUUUUUCAUCAAU- S654-AS726-M15 AGAAGCUGAUUGAUGAAAAAGUCCA 654 726

CAGCUUCUUU UACUGAGCAAUUCAU- S655-AS727-M15 CUGCUGACCAAUGAAUUGCUCAGTA 655 727

UGGUCAGCAGGA AGUACUGAGCAAUUCAU- S656-AS728-M15 GCUGACCAAUGAAUUGCUCAGUACT 656 728

UGGUCAGCAG GAGUACUGAGCAAUUCAU- S657-AS729-M15 CUGACCAAUGAAUUGCUCAGUACTC 657 729

UGGUCAGCA CUGAGUACUGAGCAAUUCAU- S658-AS730-M15 GACCAAUGAAUUGCUCAGUACUCAG 658 730

UGGUCAG CCUGAGUACUGAGCAAU- S659-AS731-M15 ACCAAUGAAUUGCUCAGUACUCAGG 659 731

UCAUUGGUCA UCCUGAGUACUGAGCAAU- S660-AS732-M15 CCAAUGAAUUGCUCAGUACUCAGGA 660 732

UCAUUGGUC UCUCCUGAGUACUGAGCAAU- S661-AS733-M15 AAUGAAUUGCUCAGUACUCAGGAGA 661 733

UCAUUGG GUCUCCUGAGUACUGAG- S662-AS734-M15 AUGAAUUGCUCAGUACUCAGGAGAC 662 734

CAAUUCAUUG UCAGUUUCCUUUUCUGUGAU- S663-AS735-M15 GGAUCAUCACAGAAAAGGAAACUGA 663 735

GAUCCGG

UUCAGUUUCCUUUUCUGUGAU S664-AS736-M15 GAUCAUCACAGAAAAGGAAACUGAA 664 736

GAUCCG UAAU- S665-AS737-M15 AUCACAGAAAAGGAAACUGAAAUTA 665 UUCAGUUUCCUUUUCUGUGAU 737

GA UUAAU- S666-AS738-M15 UCACAGAAAAGGAAACUGAAAUUAA 666 UUCAGUUUCCUUUUCUGUGAU 738

G

AUUAAU- S667-AS739-M15 CACAGAAAAGGAAACUGAAAUUAAT 667 739

UUCAGUUUCCUUUUCUGUGAU CAUUAAU- S668-AS740-M15 ACAGAAAAGGAAACUGAAAUUAATG 668 740

UUCAGUUUCCUUUUCUGUGA AGCCAUUAAU- S669-AS741-M15 GAAAAGGAAACUGAAAUUAAUGGCT 669 741

UUCAGUUUCCUUUUCUG AAGCCAUUAAU- S670-AS742-M15 AAAAGGAAACUGAAAUUAAUGGCTT 670 742

UUCAGUUUCCUUUUCU GAGAAAGCCAUUAAU- S671-AS743-M15 GGAAACUGAAAUUAAUGGCUUUCTC 671 743

UUCAGUUUCCUU GUUAUUAUAAGGUGCU- S672-AS744-M15 AGACAGCAGAGCACCUUAUAAUAAC 672 744

CUGCUGUCUUA UGUUAUUAUAAGGUGCU- S673-AS745-M15 GACAGCAGAGCACCUUAUAAUAACA 673 745

CUGCUGUCUU ACUGUUAUUAUAAGGUGCU- S674-AS746-M15 CAGCAGAGCACCUUAUAAUAACAGT 674 746

CUGCUGUC GACUGUUAUUAUAAGGUGCU- S675-AS747-M15 AGCAGAGCACCUUAUAAUAACAGTC 675 747

CUGCUGU

CAAGGACUGUUAUUAUAAGGU S676-AS748-M15 GAGCACCUUAUAAUAACAGUCCUTG 676 748

GCUCUG AAU- S677-AS749-M15 AUAAUAACAGUCCUUGGGUAUGATT 677 CAUACCCAAGGACUGUUAUUAU 749

AA AUUUUAAAU- S678-AS750-M15 ACAGUCCUUGGGUAUGAUUUAAAAT 678 750

CAUACCCAAGGACUGUUA UAUUUUAAAU- S679-AS751-M15 CAGUCCUUGGGUAUGAUUUAAAATA 679 751

CAUACCCAAGGACUGUU UUAUUUUAAAU- S680-AS752-M15 AGUCCUUGGGUAUGAUUUAAAAUAA 680 752

CAUACCCAAGGACUGU UUUAUUUUAAAU- S681-AS753-M15 GUCCUUGGGUAUGAUUUAAAAUAAA 681 753

CAUACCCAAGGACUG UUUUAUUUUAAAU- S682-AS754-M15 UCCUUGGGUAUGAUUUAAAAUAAAA 682 754

CAUACCCAAGGACU AAUUUUAUUUUAAAU- S683-AS755-M15 CUUGGGUAUGAUUUAAAAUAAAATT 683 755

CAUACCCAAGGA AAAUUUUAUUUUAAAU- S684-AS756-M15 UUGGGUAUGAUUUAAAAUAAAAUTT 684 756

CAUACCCAAGG UAAAUUUUAUUUUAAAU- S685-AS757-M15 UGGGUAUGAUUUAAAAUAAAAUUTA 685 757

CAUACCCAAG UUAAAUUUUAUUUUAAAU- S686-AS758-M15 GGGUAUGAUUUAAAAUAAAAUUUAA 686 758

CAUACCCAA AGAGGUGGUACAGGGCCCAU- S171-AS459-M15 CUGACAUGGGCCCUGUACCACCUCT 171 459

GUCAGCG GAGAGGUGGUA- S172-AS460-M15 UGACAUGGGCCCUGUACCACCUCTC 172 460

CAGGGCCCAUGUCAGC UGAGAGGUGGUA- S173-AS461-M15 GACAUGGGCCCUGUACCACCUCUCA 173 461

CAGGGCCCAUGUCAG UUGAGAGGUGGUA- S174-AS462-M15 ACAUGGGCCCUGUACCACCUCUCAA 174 462

CAGGGCCCAUGUCA UUUGAGAGGUGGUA- S175-AS463-M15 CAUGGGCCCUGUACCACCUCUCAAA 175 463

GAUCUCAG UCCUCGUGCAAGGCCUCCUG- S177-AS465-M15 AGAUCCAGGAGGCCUUGCACGAGGA 177 465

GAUCUCA UUCCUCGUG- S178-AS466-M15 GAUCCAGGAGGCCUUGCACGAGGAA 178 466

CUGGGGCACUU UGGGCAAAGUCCUUGUG- S180-AS468-M15 UGCCCCAGCACAAGGACUUUGCCCA 180 468

CUGGGGCACU GUGGGCAAAGUCCUUGUG- S181-AS469-M15 GCCCCAGCACAAGGACUUUGCCCAC 181 469

CUGGGGCAC S182-AS470-M15 CCCCAGCACAAGGACUUUGCCCACA 182 UGUGGGCAAAGUCCUUGUG- 470

CUGGGGCA AUGUGGGCAAAGUCCUUGUG- S183-AS471-M15 CCCAGCACAAGGACUUUGCCCACAT 183 471

CUGGGGC CAUGUGGGCAAA- S184-AS472-M15 CCAGCACAAGGACUUUGCCCACATG 184 472

GUCCUUGUGCUGGGG GCAUGUGGGCAAA- S185-AS473-M15 CAGCACAAGGACUUUGCCCACAUGC 185 473

GUCCUUGUGCUGGG GGCAUGUGGGCAAA- S186-AS474-M15 AGCACAAGGACUUUGCCCACAUGCC 186 474

GUCCUUGUGCUGG CGGCAUGUGGGCAAA- S187-AS475-M15 GCACAAGGACUUUGCCCACAUGCCG 187 475

GUCCUUGUGCUG ACGGCAUGUGGGCAAA- S188-AS476-M15 CACAAGGACUUUGCCCACAUGCCGT 188 476

GUCCUUGUGCU AACGGCAUGUGGGCAAA- S189-AS477-M15 ACAAGGACUUUGCCCACAUGCCGTT 189 477

GUCCUUGUGC CAACGGCAUGUGGGCAAA- S190-AS478-M15 CAAGGACUUUGCCCACAUGCCGUTG 190 478

GUCCUUGUG GCAACGGCAUGUGGGCAAA- S191-AS479-M15 AAGGACUUUGCCCACAUGCCGUUGC 191 479

GUCCUUGU AGCAACGGCAUGUGGGCAAA- S192-AS480-M15 AGGACUUUGCCCACAUGCCGUUGCT 192 480

GUCCUUG UUUCUAUGAUCCGG- S195-AS483-M15 CCCACAAACUCCCGGAUCAUAGAAA 195 483

GAGUUUGUGGGGA UUUUCUAUGAUCCGG- S196-AS484-M15 CCACAAACUCCCGGAUCAUAGAAAA 196 484

GAGUUUGUGGGG

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Oligonucleotídeo para reduzir a expressão de CYP27A1, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita antissenso com- preendendo uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma de SEQ ID NOs: 579-580, 598-614, 763-766, 786 e 788.

2. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que compreende ainda uma fita senso compreen- dendo uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma de SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787.

3. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a fita antissenso consiste em uma se- quência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 579- 580, 598-614, 763-766, 786 e 788.

4. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fita senso consiste em uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787.

5. Oligonucleotídeo para reduzir a expressão de CYP27A1, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita antissenso de 15 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que a fita antissenso tem uma re- gião de complementaridade a CYP27A1 que é complementar a pelo me- nos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência conforme estabele- cido em SEQ ID NOs: 767-781.

6. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que a fita antissenso tem de 19 a 27 nucleotídeos de comprimento.

7. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que a fita antissenso tem 21 a 27 nucleotídeos de comprimento.

8. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que a fita senso tem de 15 a 50 nucleotídeos de comprimento, em que a fita senso forma uma região duplex com a fita antissenso.

9. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 5, carac- terizado pelo fato de que a fita senso tem de 19 a 50 nucleotídeos de comprimento.

10. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a região de duplex tem pelo menos 19 nucleotídeos de comprimento.

11. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a região de comple- mentaridade com CYP27A1 é complementar a pelo menos 19 nucleotí- deos contíguos de uma sequência conforme estabelecido em SEQ ID NOs: 767-781.

12. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 5 a 9, caracterizado pelo fato de que a fita senso compre- ende uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787.

13. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 10, ca- racterizado pelo fato de que a fita antissenso compreende uma sequên- cia conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 579-580, 598-614, 763-766, 786 e 788.

14. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 5 a 9, caracterizado pelo fato de que a fita senso consiste em uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787.

15. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 10, ca- racterizado pelo fato de que a fita antissenso consiste em uma sequên- cia conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 579-580,

598-614, 763-766, 786 e 788.

16. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que a fita senso compre- ende em sua extremidade 3' uma haste-alça estabelecida como: S1-L- S2, em que S1 é complementar a S2, e em que L forma uma alça entre S1 e S2 de 3 a 5 nucleotídeos em comprimento.

17. Oligonucleotídeo para reduzir a expressão de CYP27A1, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita antissenso e uma fita senso, em que a fita antissenso tem 21 a 27 nucleotídeos de compri- mento e tem uma região de complementaridade com CYP27A1, em que a fita senso compreende em sua extremidade 3' uma haste-alça estabelecida como: S1-L-S2, em que S1 é complementar a S2, e em que L forma uma alça entre S1 e S2 de 3 a 5 nucleotídeos em comprimento, e em que a fita antissenso e a fita senso formam uma estrutura duplex de pelo menos 19 nucleotídeos de comprimento, mas não estão ligadas covalentemente.

18. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 17, ca- racterizado pelo fato de que a região de complementaridade é comple- mentar a pelo menos 19 nucleotídeos contíguos do mRNA de CYP27A1.

19. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que L é uma tetra-alça.

20. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que L tem 4 nucleotídeos de comprimento.

21. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que L compreende uma sequência apresentada como GAAA.

22. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que a fita antissenso tem 27 nucleotídeos de comprimento e a fita senso tem 25 nucleotídeos de comprimento.

23. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 22, ca- racterizado pelo fato de que a fita antissenso e a fita senso formam uma região de duplex de 25 nucleotídeos de comprimento.

24. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 19, ca- racterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência saliente 3' na fita antissenso de dois nucleotídeos de comprimento.

25. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende uma fita antissenso e uma fita senso que estão, cada uma, em um intervalo de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento.

26. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 25, ca- racterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende uma estru- tura duplex em uma faixa de 19 a 21 nucleotídeos de comprimento.

27. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende uma sequência saliente 3' de um ou mais nucleotídeos de comprimento, em que a sequência saliente 3' está presente na fita antissenso, na fita senso ou na fita antissenso e fita senso.

28. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende uma sequência saliente 3' de dois nucleotídeos de comprimento, na qual a sequência saliente 3' está presente na fita antissenso e na qual a fita senso tem 21 nucleotídeos de comprimento e a fita antissenso é 23 nu- cleotídeos de comprimento, de modo que a fita senso e a fita antissenso formem um duplex de 21 nucleotídeos de comprimento.

29. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.

30. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 29, ca- racterizado pelo fato de que o nucleotídeo modificado compreende uma modificação 2'.

31. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 30, ca- racterizado pelo fato de que a modificação 2′ é uma modificação seleci- onada de: 2′-aminoetil, 2′-fluoro, 2′-O-metil, 2′-O-metoxietil e ácido 2′- desoxi-2′-fluoro-β-d-arabinonucleico.

32. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que todos os nucleotí- deos do oligonucleotídeo são modificados.

33. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica modificada.

34. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 33, ca- racterizado pelo fato de que pelo menos uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação fosforotioato.

35. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o carbono 4' do açú- car do nucleotídeo 5' da fita antissenso compreende um análogo de fos- fato.

36. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o análogo de fosfato é oximetil fosfonato, vinil fosfonato ou malonil fosfonato.

37. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nu- cleotídeo do oligonucleotídeo é conjugado a um ou mais ligandos de direcionamento.

38. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 37, ca- racterizado pelo fato de que cada ligando de direcionamento compre- ende um carboidrato, amino açúcar, colesterol, polipeptídeo ou lipídeo.

39. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 38, ca- racterizado pelo fato de que cada ligando de direcionamento compre- ende uma porção N-acetilgalactosamina (GalNAc).

40. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 39, ca- racterizado pelo fato de que a porção GalNac é uma porção GalNAc monovalente, uma porção GalNAc bivalente, uma porção GalNAc triva- lente ou uma porção GalNAc tetravalente.

41. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que até 4 nucleotídeos de L da haste-alça são, cada um, conjugados a uma porção GalNAc monovalente.

42. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 37, ca- racterizado pelo fato de que o ligando de direcionamento compreende um aptâmero.

43. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42, e um excipiente.

44. Método de distribuição de um oligonucleotídeo a um in- divíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a com- posição como definida na reivindicação 43 ao indivíduo.

45. Método para atenuar o acúmulo de ácido biliar no fígado de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição como definida na reivindicação 43 ao indivíduo.

46. Método para diminuir a extensão da fibrose hepática em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição como definida na reivindicação 43 ao indivíduo.

47. Método para diminuir as concentrações de ácido biliar circulante em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição como definida na reivindicação 43 ao indivíduo.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofre de doença he- patobiliar.

49. Oligonucleotídeo para reduzir a expressão de CYP27A1, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita senso de 15 a 50 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissenso de 15 a 30 nucleo- tídeos de comprimento, na qual a fita senso forma uma região duplex com a fita antissenso, na qual a fita senso compreende uma sequência conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 577-578, 581-597, 759-762, 785 e 787 e em que a fita antissenso compreende uma sequência complementar selecionada a partir de SEQ ID NOs: 579- 580, 598-614, 763-766, 786 e 788.

50. Oligonucleotídeo para reduzir a expressão de CYP27A1, caracterizado pelo fato de que compreende um par de fitas senso e an- tissenso selecionadas de uma linha da tabela apresentada no Apêndice A.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofre de PNALD.

52. Uso de um oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que é na pre- paração de uma composição farmacêutica, medicamento ou produto:  para o tratamento de doenças hepatobiliares, e/ou condições em que o acúmulo de ácidos biliares no fígado contribui para a toxici- dade celular e/ou promove fibrose hepática, e/ou  para atenuar o acúmulo de ácido biliar no fígado de um indi- víduo, e/ou

 para diminuir a extensão da fibrose hepática em um indiví- duo, e/ou  para diminuir as concentrações de ácido biliar circulante em um indivíduo;  para distribuição de um oligonucleotídeo a um indivíduo; e/ou  para diminuir as concentrações de ácido biliar circulante em um indivíduo em necessidade do mesmo.

53. Invenção, caracterizada pelo fato de que está sob qual- quer forma das suas concretizações ou em qualquer categoria de rei- vindicação que se possa reivindicar, por exemplo, produto, ou processo, ou uso abrangido pelo objeto inicialmente descrito, revelado, ou ilus- trado no pedido de patente.