CN113692444A - 用于抑制cyp27a1的表达的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本公开涉及可用于降低CYP27A1表达，特别是肝细胞中CYP27A1表达的寡核苷酸、组合物和方法。用于降低CYP27A1表达的所公开寡核苷酸可为双链的或单链的，并且可被修饰以达成改善的特征，诸如更强的核酸酶抗性和更低的免疫原性。用于降低CYP27A1表达的所公开寡核苷酸还可包括靶向配体以靶向特定细胞或器官，诸如肝脏的肝细胞，并且可用于治疗肝胆疾病和相关疾患(例如肝纤维化)。

Description

用于抑制CYP27A1的表达的方法和组合物

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年2月12日提交的序列号为62/804,410的美国临时申请的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请涉及寡核苷酸及其用途，特别是与调节肝的代谢功能相关的用途。

对序列表的引用

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背景技术

在由肝执行的许多代谢功能之中，胆汁的合成和流动对于肠肝系统的最优功能发挥是重要的。胆汁是一种由肝产生的液体，储存在胆囊中，并且分泌至肠中，在肠中，它帮助吸收膳食性脂肪和脂溶性维生素以及排泄废物诸如胆红素(bilirubin)和过量胆固醇。胆汁酸还作为激素调控物起作用。

在肝中合成的胆汁酸被称为初级胆汁酸，其与甘氨酸或牛磺酸缀合，并且分泌至肠道中。在结肠中，肠道细菌进一步修饰胆汁酸以形成次级胆汁酸。这些次级胆汁酸接着被吸收，并且通过肠肝循环返回至肝中。主要初级胆汁酸是胆酸和鹅脱氧胆酸，而主要次级胆汁酸包括脱氧胆酸和石胆酸。除这些胆汁酸之外，还可存在鼠胆酸。

胆汁酸的两亲性质允许它们充当表面活性剂或清洁剂；这转而赋予它们与膳食性脂肪形成胶束的能力，从而使脂肪乳化，并且增强它们的通过肠达成的摄取。此外，胆汁酸的清洁剂性质促成它们的毒性。

全胃肠外营养(“TPN”)是用于不能通过管饲配方食品或经口进行进食或吸收足够食物以维持良好营养状况的患者的静脉内营养物施用，所述营养物可包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质和电解质、维生素以及其他微量元素。这通过绕过肠道实现。以及时方式获得恰当营养摄入可帮助抗击并发症，并且可为患者的康复的重要部分。然而，尽管TPN在其中通过经肠途径的热量供给不能满足生物体的必要需求的情形下提供救命性营养支持，但它确实具有严重不利影响，包括胃肠外营养相关的肝病(PNALD)。与PN相关的肝损伤的显现是多因素的，包括非特异性肠炎症、肠可渗透性受损、以及与细菌易位增加相关的屏障功能、原发性及继发性胆管炎、胆石病、短肠综合征、肝胆循环障碍、肠营养物缺乏、一些营养物(蛋白质、必需脂肪酸、胆碱、甘氨酸、牛磺酸、肉碱等)的短缺、和营养混合物自身内的组分(葡萄糖、植物固醇、锰、铝等)的毒性。已在啮齿动物模型中注意到在定时喂食期间，胆汁酸使肠道中的类法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)活化，并且增强纤维母细胞生长因子19(FGF19)表达水平。(Kumar J.等人,(2014),Newly Identified Mechanisms ofTotal Parenteral Nutrition Related Liver Injury,ADVANCES IN HEPATOLOGY 1-7)。

还已知FGF19调控胆汁酸、脂质和葡萄糖代谢。因此，调节FXR-FGF19路径可克服TPN对肝的负性影响。同样，FXR调控的酶，包括细胞色素P450(CYP)7A1、CYP8B1和CYP27A1、CYP3A4、CYP3A11、磺基转移酶2A1(SULT2A1)和UDP-葡萄糖醛酸基转移酶2B4(UGT2B4/UGT2B11)，参与胆汁酸的合成和代谢。胆汁酸的量的导致它们的增加的转变有可能通过促炎性机制、膜损害和细胞毒性反应诱导和增强肝细胞毒性，并且可对脂质体内平衡造成影响。通过RNAi基因沉默靶向诸如CYP27A1的基因来降低胆汁酸表达可具有改变和缓和此损害和包括PNALD的所引起病变或与TPN相关的其他影响的作用。

发明内容

本公开的方面涉及用于降低影响受试者中的肝代谢功能的基因，特别是影响受试者中的胆汁酸水平的基因的表达的组合物和相关方法。在一些实施方案中，本公开涉及认识到CYP27A1是用于治疗肝胆疾病，特别是与胆汁酸积累相关的此类疾病的有用靶标。在其他方面，已发现用于降低CYP27A1的表达或活性的寡核苷酸可用于治疗其中胆汁酸在肝中的积累促成细胞毒性(例如对肝细胞和/或胆管细胞的毒性)并且/或者促进肝纤维化的疾患。因此，在一些实施方案中，本公开涉及用于降低CYP27A1的表达或活性的寡核苷酸，包括RNAi寡核苷酸、反义寡核苷酸和其他类似模态，用于治疗肝胆疾病的用途，所述肝胆疾病包括例如胆汁郁积、胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或阿拉吉欧综合征(alagillesyndrome)。

在其他实施方案中，已开发用于选择性抑制受试者中的CYP27A1表达的强力RNAi寡核苷酸。在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸可用于降低CYP27A1活性，并且由此降低或预防受试者中胆汁酸的积累。在一些实施方案中，在本文中已鉴定CYP27A1活性mRNA的特别可经受使用此类基于寡核苷酸的方法进行的靶向的关键区域(被称为热点)(参见实施例1)。在一些实施方案中，本文开发的用以抑制CYP27A1表达的寡核苷酸可用于减轻或预防与胆汁酸积累相关的肝纤维化(参见例如实施例1、图7和图8)。

本公开的一个方面提供了用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含如以SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788中的任一者阐述的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸还包含有义链，所述有义链包含如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列。在一些实施方案中，反义链由如以SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788中的任一者阐述的序列组成。在一些实施方案中，有义链由如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列组成。

本公开的一个方面提供了用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含在长度方面是15至30个核苷酸的反义链。在一些实施方案中，反义链具有与CYP27A1的如以SEQ ID NO:767-781中的任一者阐述的靶标序列具有互补性的区域。在一些实施方案中，互补性区域在长度方面是至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21或至少22个连续核苷酸。在一些实施方案中，互补性区域完全互补于CYP27A1的靶标序列。在一些实施方案中，与CYP27A1具有互补性的区域在长度方面是至少19个连续核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列。在一些实施方案中，有义链由如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列组成。在一些实施方案中，反义链包含如以SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788中的任一者阐述的序列。在一些实施方案中，反义链由如以SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788中的任一者阐述的序列组成。

在一些实施方案中，反义链在长度方面是19至27个核苷酸。在一些实施方案中，反义链在长度方面是21至27个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸还包含在长度方面是15至40个核苷酸的有义链，其中所述有义链与反义链形成双链体区域。在一些实施方案中，有义链在长度方面是19至40个核苷酸。在一些实施方案中，反义链在长度方面是27个核苷酸，并且有义链在长度方面是25个核苷酸。在一些实施方案中，双链体区域在长度方面是至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21个核苷酸。在一些实施方案中，反义链和有义链形成在长度方面是25个核苷酸的双链体区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含各自在长度方面在21至23个核苷酸的范围内的反义链和有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含在长度方面在19至21个核苷酸的范围内的双链体结构。在一些实施方案中，寡核苷酸还在反义链上包含在长度方面是两个核苷酸的3′-突出部分序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含在长度方面是一个或多个核苷酸的3′-突出部分序列，其中所述3′-突出部分序列存在于反义链、有义链、或反义链和有义链上。在一些实施方案中，寡核苷酸包含在长度方面是两个核苷酸的3′-突出部分序列，其中所述3′-突出部分序列存在于反义链上，并且其中有义链在长度方面是21个核苷酸，并且反义链在长度方面是23个核苷酸，以致所述有义链和所述反义链形成在长度方面是21个核苷酸的双链体。

在一些实施方案中，有义链在它的3′末端包含阐述为S₁-L-S₂的茎-环，其中S₁互补于S₂，并且其中L形成在S₁与S₂之间的在长度方面是3至5个核苷酸的环。

本公开的另一方面提供了一种用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和有义链，其中所述反义链在长度方面是21至27个核苷酸，并且具有与CYP27A1具有互补性的区域，其中所述有义链在它的3′末端包含阐述为S1-L-S2的茎-环，其中S1互补于S2，并且其中L形成在S1与S2之间的在长度方面是3至5个核苷酸的环，并且其中所述反义链和所述有义链形成在长度方面是至少19个核苷酸的双链体结构，但不是共价连接的。在一些实施方案中，与CYP27A1 mRNA具有互补性的区域完全互补于CYP27A1 mRNA的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21个连续核苷酸。在一些实施方案中，L是四元环。在一些实施方案中，L在长度方面是4个核苷酸。在一些实施方案中，L包含阐述为GAAA的序列。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷酸。在一些实施方案中，经修饰核苷酸包含2′-修饰。在一些实施方案中，2′-修饰是选自以下的修饰：2′-氨基乙基、2′-氟基、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基、和2′-脱氧-2′-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸都是经修饰的。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，至少一个经修饰核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，反义链的5′-核苷酸的糖的4′-碳包含磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。

在一些实施方案中，寡核苷酸的至少一个核苷酸缀合于一个或多个靶向配体。在一些实施方案中，每个靶向配体包括碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。在一些实施方案中，每个靶向配体包括N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些实施方案中，GalNac部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分、或四价GalNAc部分。在一些实施方案中，茎-环的L的多达4个核苷酸各自缀合于单价GalNAc部分。在其他实施方案中，二价、三价或四价GalNac部分缀合于例如茎环的L的核苷酸中的单一核苷酸。在一些实施方案中，靶向配体包括适体。

本公开的另一方面提供了一种包含本公开的寡核苷酸和赋形剂的组合物。本公开的另一方面提供了一种包括将本公开的组合物施用至受试者的方法。在一些实施方案中，此类方法可用于减弱受试者的肝中的胆汁酸积累。在一些实施方案中，此类方法可用于降低有需要的受试者中的肝纤维化的程度。在一些实施方案中，此类方法可用于降低有需要的受试者中的循环胆汁酸浓度。在一些实施方案中，此类方法可用于治疗肝胆疾病。在一些实施方案中，受试者罹患PNALD。

本公开的另一方面提供了一种用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含在长度方面是15至40个核苷酸的有义链和在长度方面是15至30个核苷酸的反义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域，其中所述有义链包含如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列，并且所述反义链包含选自SEQ IDNO:579-580、598-614、763-766、786和788的互补性序列。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含选自附录A中阐述的表格的一行的一对有义链和反义链。

附图说明

并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图说明某些实施方案，并且连同书面描述一起用于提供本文公开的组合物和方法的某些方面的非限制性实例。

图1是描绘用于选择用以在细胞和动物模型中测试的化合物，并且开发用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸的实验设计的流程图。SAR：结构-活性关系。

图2是显示具有已缀合于四个GalNAc部分(黄色菱形)的切口化四元环结构的双链寡核苷酸的非限制性实例的示意图。

图3是显示在使用人HepG2细胞进行的用于鉴定活性25/27聚体的初级寡核苷酸筛选之后剩余CYP27A1 mRNA的百分比的图。将数据以使用M15修饰的对照，利用Hs HPRT 517-591(FAM)和Hs SFRS9 594-690(Hex)测定的情况作归一化。

图4A和图4B是描绘在人HepG2细胞的情况下评估切口化四元环寡核苷酸(36/22聚体)的结果的一组图。将数据以采用模拟转染细胞，使用Hs SFRS9 594-690(Hex)测定的情况作归一化。对于图4A与图4B两者，“S”、“AS”和“M”分别表示有义链、反义链和修饰样式；在“S”和“AS”之后的编号代表SEQ ID NO；在“M”之后的编号代表修饰样式。图4A显示分别由有义序列SEQ ID NO:577和578和反义序列SEQ ID NO:579和580形成的寡核苷酸的数据。图4B显示分别由有义序列SEQ ID NO:577以及581-597和反义序列SEQ ID NO:579以及598-614形成的寡核苷酸的数据。“*”代表其中在反义链的5’末端中的第一核苷酸的碱基被尿嘧啶取代的寡核苷酸。

图5是描绘使用切口化四元环寡核苷酸和缀合于GalNAc部分来评估小鼠CYP27A1表达的降低的测定的结果的图。寡核苷酸的名称中的“G”表示它们缀合于GalNAc部分。显示了分别由有义序列SEQ ID NO:759至762和反义序列SEQ ID NO:763至766形成，并且具有不同修饰样式的寡核苷酸的数据。

图6是描绘使用缀合于GalNAc部分的切口化四元环寡核苷酸评估人CYP27A1表达的降低的测定的结果的图。寡核苷酸的名称中的“G”表示它们缀合于GalNAc部分。显示了分别使用有义序列SEQ ID NO:577、581、582、584、586、588、590、591、593、594、595以及597和反义序列SEQ ID NO:791、598、599、601、603、605、607、608、610、611、612和614，并且具有不同修饰样式的寡核苷酸的数据。“*”代表其中在反义链的5’末端中的第一核苷酸的碱基被尿嘧啶取代的寡核苷酸。

图7是显示在部分胆管结扎小鼠模型中在CYP27A1敲低后血清胆汁酸浓度降低的示意图。

图8是显示作为部分胆管结扎小鼠的结扎肝叶中纤维化的标志的天狼猩红(Sirius Red)染色的降低的一系列图像。

具体实施方式

根据一些方面，本公开提供了有效降低细胞中的CYP27A1表达的靶向CYP27A1mRNA的寡核苷酸。这些寡核苷酸可用于降低例如肝脏细胞(例如肝细胞)中的CYP27A1以治疗胆汁酸积累(例如在肝胆疾病的情形下)。因此，在相关方面，本公开提供了涉及选择性降低肝中的CYP27A1基因表达的治疗胆汁酸积累的方法(参见例如实施例1以及图7和图8)。在某些实施方案中，本文提供的CYP27A1靶向寡核苷酸被设计用于递送至靶标组织的所选细胞(例如肝脏肝细胞)以治疗那些组织中的胆汁酸积累。

以下提供本公开的其他方面，包括对定义术语的描述。

I.定义

近似：如本文所用，如应用于一个或多个目标值的术语“近似”或“约”是指类似于陈述的参考值的数值。在某些实施方案中，除非另外陈述或另外由上下文显而易知，否则术语“近似”或“约”是指落在陈述的参考值的在任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的数值的范围(例外之处是当这种数字将超过可能值的100％时)。

施用：如本文所用，术语“施用(administering/administration)”意指以药理学上有用(例如以治疗受试者中的疾患)的方式对受试者提供物质(例如寡核苷酸)。

无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)：如本文所用，术语“无唾液酸糖蛋白受体”或“ASGPR”是指由48kDa大亚单位(ASGPR-1)和40kDa小亚单位(ASGPR-2)形成的两部分C型凝集素。ASGPR主要在肝细胞的窦状隙表面上表达，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基的循环糖蛋白(无唾液酸糖蛋白)的结合、内化和后续清除方面具有主要作用。

减弱：如本文所用，术语“减弱”意指降低或有效阻止。作为一非限制性实例，本文提供的治疗中的一者或多者可降低或有效阻止受试者中胆汁酸积累的发生或进展。这个减弱可通过例如当胆汁酸积累或由此积累所致的症状否则可能被预期时，在受试者中的以下状况来例示：胆汁酸积累或由此积累所致的症状的一个或多个方面(例如症状、组织特征、以及细胞性、炎症性或免疫性活性等)减退；胆汁酸积累或由此积累所致的症状的一个或多个方面无可检测进展(恶化)；或无可检测胆汁酸积累或由此积累所致的症状。

互补：如本文所用，术语“互补”是指核苷酸之间(例如关于在相对核酸上或在单一核酸链的相对区域上的两个核苷酸)的容许核苷酸彼此形成碱基对的结构关系。举例来说，一个核酸的互补于相对核酸的嘧啶核苷酸的嘌呤核苷酸可通过彼此形成氢键来碱基配对在一起。在一些实施方案中，互补性核苷酸可以沃森-克里克(Watson-Crick)方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。在一些实施方案中，两个核酸可具有彼此互补以便形成如本文所述的互补性区域的核苷酸序列。

CYP27A1：如本文所用，术语“CYP27A1”是指细胞色素P450氧化酶基因。这个基因编码蛋白质即细胞色素P450氧化酶，其是细胞色素P450酶超家族的成员，并且其是一种使胆固醇中间体氧化作为胆汁合成路径的一部分的线粒体蛋白质。在包括人、小鼠、非人灵长类动物和其他物种的一定范围的物种之间，CYP27A1的同源物是保守的(参见例如NCBIHomoloGene：36040)。举例来说，在人中，CYP27A1基因编码多种转录物变体，包括转录物变体1(NM_000784.3)和转录物变体2(XM_017003488.1)。在小鼠中，CYP27A1编码多种转录物变体，即转录物变体1(NM_024264.5)和变体2(XM_006495607.2)。

脱氧核糖核苷酸：如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指相较于核糖核苷酸，在它的戊糖的2′位置处具有氢的核苷酸。经修饰脱氧核糖核苷酸是除在2′位置处以外具有一个或多个原子修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括在糖、磷酸酯基团或碱基中的修饰或取代，或对糖、磷酸酯基团或碱基的修饰或取代。

双链寡核苷酸：如本文所用，术语“双链寡核苷酸”是指大致上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，在共价分开的核酸链的反平行核苷酸序列之间形成双链寡核苷酸的一个或多个双链体区域的互补性碱基配对。在一些实施方案中，在共价连接的核酸链的反平行核苷酸序列之间形成双链寡核苷酸的一个或多个双链体区域的互补性碱基配对。在一些实施方案中，由折叠(例如通过发夹)以提供碱基配对在一起的互补性反平行核苷酸序列的单一核酸链形成双链寡核苷酸的一个或多个双链体区域的互补性碱基配对。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含彼此完全双链体化的两个共价分开的核酸链。然而，在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分双链体化，例如在一个或两个末端具有突出部分的两个共价分开的核酸链。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分互补，因此可具有一个或多个错配的反平行核苷酸序列，所述一个或多个错配可包括内部错配或末端错配。

双链体：如本文所用，关于核酸(例如寡核苷酸)的术语“双链体”是指通过两个反平行核苷酸序列的互补性碱基配对形成的结构。

赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指可包括在组合物中例如以提供或促成所需稠度或稳定作用非治疗剂。

肝细胞：如本文所用，术语“肝细胞(hepatocyte/hepatocytes)”是指肝的实质组织的细胞。这些细胞占肝的质量的约70-85％，并且制造血清白蛋白、纤维蛋白原、以及凝血酶原群组的凝血因子(除因子3和4之外)。肝细胞谱系细胞的标志物可包括但不限于：转甲状腺素蛋白(transthyretin，Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、肝细胞核因子1a(Hnf1a)和肝细胞核因子4a(Hnf4a)。成熟肝细胞的标志物可包括但不限于：细胞色素P450(Cyp3a11)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)、6-磷酸葡萄糖(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8。参见例如Huch等人,(2013),N_ATURE,494(7436):247-250，所述文献的与肝细胞标志物相关的内容通过引用并入本文。

环：如本文所用，术语“环”是指核酸(例如寡核苷酸)的未配对区域，所述未配对区域由所述核酸的彼此充分互补的两个反平行区域侧接，以致在适当杂交条件下(例如在磷酸盐缓冲液中、在细胞中)，侧接于所述未配对区域的所述两个反平行区域杂交以形成双链体(被称为“茎”)。

经修饰核苷酸间键联：如本文所用，术语“经修饰核苷酸间键联”是指相较于包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键联，具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中，经修饰核苷酸是非天然存在的键联。通常，经修饰核苷酸间键联对其中存在所述经修饰核苷酸间键联的核酸赋予一种或多种合乎需要的性质。举例来说，经修饰核苷酸可改善热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解性、生物可用度、生物活性、降低免疫原性等。

经修饰核苷酸：如本文所用，术语“经修饰核苷酸”是指相较于选自以下的相应参考核苷酸，具有一个或多个化学修饰的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸苷脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，经修饰核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰核苷酸在它的糖、核苷碱基和/或磷酸酯基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经修饰核苷酸具有一个或多个缀合于相应参考核苷酸的化学部分。通常，经修饰核苷酸对其中存在所述经修饰核苷酸的核酸赋予一种或多种合乎需要的性质。举例来说，经修饰核苷酸可改善热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解性、生物可用度、生物活性、降低免疫原性等。在某些实施方案中，经修饰核苷酸在核糖环的2’位置处包含2’-O-甲基或2’-F取代。

切口化四元环结构：“切口化四元环结构”是RNAi寡核苷酸的特征在于存在单独有义(过客)链和反义(引导)链的结构，其中所述有义链具有与所述反义链具有互补性的区域，以致两个链形成双链体，并且其中至少一个链，通常是所述有义链，从所述双链体延伸，其中延伸部分含有四元环和形成邻近于所述四元环的茎区域的两个自身互补性序列，其中所述四元环被构造来使由所述至少一个链的所述自身互补性序列形成的所述邻近茎区域稳定。

寡核苷酸：如本文所用，术语“寡核苷酸”是指例如在长度方面小于100个核苷酸的短核酸。寡核苷酸可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或经修饰核苷酸，包括例如经修饰核糖核苷酸。寡核苷酸可为单链的或双链的。寡核苷酸可或可不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可为但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、dicer底物干扰RNA(dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA、或单链siRNA。在一些实施方案中，双链寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。

突出部分：如本文所用，术语“突出部分”是指一个或多个由一个链或区域延伸超出所述一个链或区域与其形成双链体的互补链的末端所致的末端非碱基配对核苷酸。在一些实施方案中，突出部分包含一个或多个在双链寡核苷酸的5′末端或3′末端从双链体区域延伸的未配对核苷酸。在某些实施方案中，突出部分是双链寡核苷酸的反义链或有义链上的3′或5′突出部分。

磷酸酯类似物：如本文所用，术语“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电和/或空间性质的化学部分。在一些实施方案中，磷酸酯类似物代替经常易经受酶促移除的5′-磷酸酯位于寡核苷酸的5′末端核苷酸处。在一些实施方案中，5′磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性键联。磷酸酯类似物的实例包括5′膦酸酯，诸如5′亚甲基膦酸酯(5′-MP)和5′-(E)-乙烯基膦酸酯(5′-VP)。在一些实施方案中，寡核苷酸在5′-末端核苷酸处的糖的4′-碳位置处具有磷酸酯类似物(被称为“4′-磷酸酯类似物”)。4′-磷酸酯类似物的一实例是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子结合于糖部分(例如在它的4′-碳处)或其类似物。参见例如2017年9月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/049909、2016年9月2日提交的美国临时申请第62/383,207号和2016年9月12日提交的美国临时申请第62/393,401号，所述申请中的每一者的与磷酸酯类似物相关的内容通过引用并入本文。已开发对寡核苷酸的5′末端的其他修饰(参见例如WO 2011/133871；美国专利第8,927,513号；以及Prakash等人(2015),Nucleic Acids Res.,43(6):2993-3011，所述专利和文献中的每一者的与磷酸酯类似物相关的内容通过引用并入本文)。

降低的表达：如本文所用，术语某一基因的“降低的表达”是指相较于适当参考细胞或受试者，在细胞或受试者中由所述基因编码的RNA转录物或蛋白质的量的降低，和/或所述基因的活性的量的降低。举例来说，用双链寡核苷酸(例如具有互补于CYP27A1 mRNA序列的反义链的双链寡核苷酸)处理细胞的举动可导致相较于未用所述双链寡核苷酸处理的细胞，RNA转录物、蛋白质和/或酶活性(例如由CYP27A1基因编码)的量的降低。类似地，如本文所用的“降低表达”是指导致基因(例如CYP27A1)的表达降低的举动。

互补性区域：如本文所用，术语“互补性区域”是指核酸(例如双链寡核苷酸)的充分互补于反平行核苷酸序列(例如mRNA内的靶标核苷酸序列)以容许在适当杂交条件下，例如在磷酸盐缓冲液中、在细胞中等等，在两个核苷酸序列之间杂交的核苷酸序列。互补性区域可完全互补于核苷酸序列(例如存在于mRNA或其部分内的靶标核苷酸序列)。举例来说，完全互补于mRNA中存在的核苷酸序列的互补性区域具有在无任何错配或空位下互补于mRNA中的相应序列的连续核苷酸序列。或者，互补性区域可部分互补于核苷酸序列(例如存在于mRNA或其部分中的核苷酸序列)。举例来说，部分互补于mRNA中存在的核苷酸序列的互补性区域具有互补于所述mRNA中的相应序列，但相较于所述mRNA中的所述相应序列，含有一个或多个错配或空位(例如1、2、3个或更多个错配或空位)的连续核苷酸序列，前提是所述互补性区域仍然能够在适当杂交条件下与所述mRNA杂交。

核糖核苷酸：如本文所用，术语“核糖核苷酸”是指具有核糖作为它的戊糖的核苷酸，所述核糖在它的2′位置处含有羟基。经修饰核糖核苷酸是除在2′位置处以外具有一个或多个原子修饰或取代的核糖核苷酸，包括在核糖、磷酸酯基团或碱基中的修饰或取代，或对核糖、磷酸酯基团或碱基的修饰或取代。

RNAi寡核苷酸：如本文所用，术语“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义链(过客)和反义链(引导)的双链寡核苷酸，其中所述反义链或所述反义链的一部分由Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶在裂解靶标mRNA中使用，或(b)具有单一反义链的单链寡核苷酸，其中那个反义链(或那个反义链的一部分)由Ago2核酸内切酶在裂解靶标mRNA中使用。

链：如本文所用，术语“链”是指通过核苷酸间键联(例如磷酸二酯键联、硫代磷酸酯键联)连接在一起的核苷酸的单一连续序列。在一些实施方案中，一个链具有两个游离末端，例如5′末端和3′末端。

受试者：如本文所用，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一个实施方案中，受试者是人或非人灵长类动物。术语“个体”或“患者”可与“受试者”互换使用。

合成：如本文所用，术语“合成”是指核酸或其他分子是人工合成的(例如使用机器(例如固态核酸合成仪))，或以其他方式不源于通常产生所述分子的天然来源(例如细胞或生物体)。

靶向配体：如本文所用，术语“靶向配体”是指选择性结合目标组织或细胞的同源分子(例如受体)，并且可缀合于另一物质以达成使另一物质靶向所述目标组织或细胞的目的的分子(例如碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)。举例来说，在一些实施方案中，靶向配体可缀合于寡核苷酸以达成使所述寡核苷酸靶向特定目标组织或细胞的目的。在一些实施方案中，靶向配体选择性结合细胞表面受体。因此，在一些实施方案中，靶向配体在缀合于寡核苷酸时通过与在细胞的表面上表达的受体的选择性结合以及由所述细胞对包含所述寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的内体内化来促进将所述寡核苷酸递送至特定细胞中。在一些实施方案中，靶向配体通过接头缀合于寡核苷酸，所述接头在细胞内化之后或期间被裂解以致寡核苷酸在细胞中从靶向配体释放。

四元环：如本文所用，术语“四元环”是指增加通过侧接核苷酸序列的杂交形成的邻近双链体的稳定性的环。稳定性的增加可检测为邻近茎双链体的熔解温度(T_m)的增加，所述熔解温度高于平均来说从由随机选择的核苷酸序列组成的具有类似长度的一组环预期的邻近茎双链体的T_m。举例来说，四元环可对包含在长度方面是至少2个碱基对的双链体的发夹赋予在10mM NaHPO₄中至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的熔解温度。在一些实施方案中，四元环可通过堆积相互作用使邻近茎双链体中的碱基对稳定。此外，四元环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非沃森-克里克碱基配对、堆积相互作用、氢键合和接触相互作用(Cheong等人,Nature 1990年8月16日；346(6285):680-2；Heus和Pardi,S_CIENCE 1991年7月12日；253(5016):191-4)。在一些实施方案中，四元环包含3至6个核苷酸或由3至6个核苷酸组成，并且通常是4至5个核苷酸。在某些实施方案中，四元环包含三、四、五或六个核苷酸或由三、四、五或六个核苷酸组成，所述核苷酸可为或可不为经修饰的(例如其可或可不缀合于靶向部分)。在一个实施方案中，四元环由四个核苷酸组成。任何核苷酸都可用于四元环中，并且此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号可如Cornish-Bowden(1985)N_UCL.A_CIDS R_ES.13:3021-3030中所述加以使用。举例来说，字母“N”可用于意指任何碱基可在那个位置中，字母“R”可用于显示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可在那个位置中，并且“B”可用于显示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可在那个位置中。四元环的实例包括UNCG家族的四元环(例如UUCG)、GNRA家族的四元环(例如GAAA)以及CUUG四元环(Woese等人,P_ROC N_ATL A_CAD S_CI USA.1990年11月；87(21):8467-71；Antao等人,N_UCLEICA_CIDS R_ES.1991年11月11日；19(21):5901-5)。DNA四元环的实例包括d(GNNA)家族的四元环(例如d(GTTA))、d(GNRA)家族的四元环、d(GNAB)家族的四元环、d(CNNG)家族的四元环、以及d(TNCG)家族的四元环(例如d(TTCG))。参见例如：Nakano等人B_IOCHEMISTRY,41(48),14281-14292,2002.SHINJI等人N_IPPON K_AGAKKAI K_OEN Y_OKOSHU第78卷；第2期；第731页(2000)，所述文献的相关公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，四元环含于切口化四元环结构内。

治疗：如本文所用，术语“治疗”是指对有需要的受试者提供护理的举动，例如通过将治疗剂(例如寡核苷酸)施用至所述受试者，以达成改善所述受试者的关于现有疾患(例如疾病、病症)的健康状况和/或健康状态的目的，或预防或降低疾患发生的可能性。在一些实施方案中，治疗涉及降低由受试者经受的疾患(例如疾病、病症)的至少一种征象、症状或促成因素的频率或严重性。

II.基于寡核苷酸的抑制剂

i.CYP27A1靶向寡核苷酸

已通过考查包括多个不同物种(人、恒河猴和小鼠(参见例如实施例1))的mRNA的CYP27A1 mRNA以及体外和体内测试在本文中鉴定了强力寡核苷酸。此类寡核苷酸可用于通过降低CYP27A1活性，并且因此通过降低胆汁酸水平和/或肝纤维化来实现对经受胆汁酸积累并且/或者患有肝脏肝胆疾病的受试者的治疗益处。举例来说，本文提供了强力RNAi寡核苷酸，所述强力RNAi寡核苷酸具有有义链，所述有义链包含如以577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列或由所述序列组成，以及反义链，所述反义链包含选自SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788中的任一者的互补性序列或由所述互补性序列组成，如还在附录A中提供的表格中所排列(例如包含如以SEQ ID NO:577阐述的序列的有义链和包含如以SEQ ID NO:579阐述的序列的反义链)。序列可被放置至如本文所述的多种不同结构(或形式)中。

在一些实施方案中，已发现CYP27A1 mRNA的某些区域是靶向热点，因为相比于其他区域，它们更可经受基于寡核苷酸的抑制。在一些实施方案中，CYP27A1的热点区域由如以SEQ ID NO:767-781中的任一者阐述的序列组成。可使用如本文讨论的寡核苷酸靶向CYP27A1 mRNA的这些区域以达成抑制CYP27A1 mRNA表达的目的。

因此，在一些实施方案中，设计本文提供的寡核苷酸以便具有与CYP27A1 mRNA(例如在CYP27A1 mRNA的热点内)具有互补性的区域，以达成靶向细胞中的mRNA，并且抑制它的表达的目的。互补性区域通常具有适合长度和碱基含量以使得寡核苷酸(或其链)能够与CYP27A1 mRNA退火以达成抑制它的表达的目的。

在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含至少部分地互补于如以包括定位于CYP27A1 mRNA的热点区域内的序列的SEQ ID NO:1-288、615-686和789中的任一者阐述的序列的互补性区域(例如在双链寡核苷酸的反义链上)。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含完全互补于如以SEQ ID NO:1-288、615-686和789中的任一者阐述的序列的互补性区域(例如在双链寡核苷酸的反义链上)。在一些实施方案中，寡核苷酸的互补于如以SEQ ID NO:1-288、615-686和789中的任一者阐述的序列的连续核苷酸的互补性区域跨越反义链的整个长度。在一些实施方案中，寡核苷酸的互补于如以SEQ ID NO:1-288、615-686和789中的任一者阐述的序列的连续核苷酸的互补性区域跨越反义链的整个长度的一部分(例如除在反义链的3’末端的两个核苷酸之外的所有)。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含至少部分地(例如完全)互补于跨越如以SEQ ID NO:577-578、581-597以及759-762、785和787中的任一者阐述的序列的核苷酸1-19的连续核苷酸链段的互补性区域(例如在双链寡核苷酸的反义链上)。

在一些实施方案中，互补性区域在长度方面是至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有与CYP27A1 mRNA具有互补性的区域，所述区域在长度方面在12至30(例如12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27、或15至30)个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有与CYP27A1 mRNA具有互补性的区域，所述区域在长度方面是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

在一些实施方案中，相较于CYP27A1 mRNA的相应序列，与CYP27A1 mRNA具有互补性的区域可具有一个或多个错配。寡核苷酸上的互补性区域可具有多达1个、多达2个、多达3个、多达4个等错配，前提是它维持在适当杂交条件下与CYP27A1 mRNA形成互补性碱基对的能力。或者，寡核苷酸上的互补性区域可具有至多1个、至多2个、至多3个、或至多4个错配，前提是它维持在适当杂交条件下与CYP27A1 mRNA形成互补性碱基对的能力。在一些实施方案中，如果在互补性区域中存在超过一个错配，那么它们可连续定位(例如2、3、4个或更多个连续)，或散布在整个互补性区域中，前提是寡核苷酸维持在适当杂交条件下与CYP27A1 mRNA形成互补性碱基对的能力。

此外，在一些实施方案中，本文提供的双链寡核苷酸包含以下或由以下组成：具有如以SEQ ID NO:1-288、615-686和789中的任一者阐述的序列的有义链和包含选自SEQ IDNO:289-576的互补性序列的反义链，如在附录A中提供的表格中所排列(例如包含如以SEQID NO:1阐述的序列的有义链和包含如以SEQ ID NO:289阐述的序列的反义链)。

ii.寡核苷酸结构

存在可用于在本公开的方法中靶向CYP27A1 mRNA的多种寡核苷酸结构，包括RNAi、miRNA等。本文或其他地方所述的任何结构都可作为框架用于合并或靶向本文所述的序列(例如CYP27A1的热点序列，诸如以SEQ ID NO:767-781说明的那些)。用于靶向CYP27A1表达(例如通过RNAi路径)的双链寡核苷酸通常具有彼此形成双链体的有义链和反义链。在一些实施方案中，有义链和反义链不是共价连接的。然而，在一些实施方案中，有义链和反义链是共价连接的。

在一些实施方案中，用于降低CYP27A1表达的双链寡核苷酸衔接RNA干扰(RNAi)。举例来说，已开发RNAi寡核苷酸，其中每个链具有19-25个核苷酸的大小，伴有至少一个具有1至5个核苷酸的3’突出部分(参见例如美国专利第8,372,968号)。还已开发由Dicer酶处理以产生活性RNAi产物的较长寡核苷酸(参见例如美国专利第8,883,996号)。进一步工作产生了延伸的双链寡核苷酸，其中至少一个链的至少一个末端延伸超出双链体靶向区域，包括其中一个链包括热力学稳定化四元环结构的结构(参见例如美国专利第8,513,207和8,927,705号以及WO2010033225，所述专利的对这些寡核苷酸的公开内容通过引用并入本文)。此类结构可包括单链延伸部分(在分子的一侧或两侧上)以及双链延伸部分。

在一些实施方案中，可使用包含两者在长度方面均在17至36个核苷酸的范围内的单独有义链和反义链的寡核苷酸合并或靶向本文所述的序列。在一些实施方案中，提供了并有此类序列的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有在它们的有义链的3’延伸部分内的四元环结构，以及在单独反义链的3’末端的两个末端突出部分核苷酸。在一些实施方案中，两个末端突出部分核苷酸是GG。通常，反义链的两个末端GG核苷酸中的一者或两者互补于或不互补于靶标。

在一些实施方案中，提供了并有此类序列的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有两者在长度方面均在21至23个核苷酸的范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，3’突出部分被提供在有义链、反义链、或有义链与反义链两者上，在长度方面是1或2个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸具有23个核苷酸的引导链和21个核苷酸的过客链，其中过客链的3′末端和引导链的5′末端形成钝性末端，并且其中所述引导链具有两个核苷酸的3′突出部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸在长度方面可在21至23个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，寡核苷酸可在有义链和/或反义链的3’末端中具有突出部分(例如在长度方面是1、2或3个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸(例如siRNA)可包含对于靶标RNA是反义的21个核苷酸的引导链和互补性过客链，其中两个链退火以形成19bp双链体和在任一或两个3’末端的2个核苷酸的突出部分。参见例如US9012138、US9012621和US9193753，所述专利中的每一者的内容中的相关公开内容并入本文。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸具有36个核苷酸的有义链，所述有义链包含延伸超出反义-有义双链体的区域，其中所述延伸区域具有茎-四元环结构，其中所述茎是六碱基对双链体，并且其中所述四元环具有四个核苷酸。在那些实施方案中的某些中，四元环核苷酸中的三者或四者各自缀合于单价GalNac配体。

在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含25个核苷酸的有义链和27个核苷酸的反义链，当由dicer酶作用时，产生并入至成熟RISC中的反义链。

供与本文公开的组合物和方法一起使用的其他寡核苷酸设计包括：16聚体siRNA(参见例如Nucleic Acids in Chemistry and Biology.Blackburn(编),Royal Societyof Chemistry,2006)、shRNA(例如具有19bp或更短的茎；参见例如Moore等人MethodsMol.Biol.2010；629:141-158)、钝性siRNA(例如在长度方面是19bp；参见：例如Kraynack和Baker,RNA第12卷,第163-176页(2006))、不对称siRNA(aiRNA；参见例如Sun等人,N_AT.B_IOTECHNOL.26,1379–1382(2008))、不对称较短双链体siRNA(参见例如Chang等人,M_OLT_HER.2009年4月；17(4):725-32)、分叉siRNA(参见例如Hohjoh,FEBS L_ETTERS,第557卷,第1-3期；2004年1月,第193-198页)、单链siRNA(Elsner；N_ATURE B_IOTECHNOLOGY30,1063(2012))、哑铃形环状siRNA(参见例如Abe等人J A_M C_HEM S_OC 129:15108-15109(2007))、以及小型内部区段化干扰RNA(sisiRNA；参见例如Bramsen等人,N_UCLEIC A_CIDS R_ES.2007年9月；35(17):5886-5897)。前述参考文献中的每一者的相关公开内容通过引用以它的整体并入本文。可在一些实施方案中用于降低或抑制CYP27A1的表达的寡核苷酸结构的其他非限制性实例是微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见例如Hamilton等人,E_MBO J.,2002,21(17):4671-4679；还参见美国申请第20090099115号)。

a.反义链

在一些实施方案中，用于靶向CYP27A1的本文公开的寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含以下或由以下组成：如以SEQ ID NO:289-576、687-758和790或579-580、598-614、763-766、786、788和792中的任一者阐述的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含以下或由以下组成：如以SEQ ID NO:289-576、687-758和790或579-580、598-614、763-766、786、788和792中的任一者阐述的序列的至少12(例如至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23)个连续核苷酸。

在一些实施方案中，双链寡核苷酸可具有在长度方面多达40个核苷酸(例如在长度方面多达40、多达35、多达30、多达27、多达25、多达21、多达19、多达17或多达12个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有在长度方面是至少12个核苷酸(例如在长度方面是至少12、至少15、至少19、至少21、至少22、至少25、至少27、至少30、至少35或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有在长度方面在12至40(例如12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至22、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40、或32至40)个核苷酸的范围内的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有在长度方面是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的反义链。

在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链可被称为“引导链”。举例来说，如果反义链可与RNA诱导的沉默复合物(RISC)衔接并结合Argonaut蛋白，或与一种或多种类似因子衔接或结合，并且使靶标基因直接沉默，那么它可被称为引导链。在一些实施方案中，互补于引导链的有义链可被称为“过客链”。

b.有义链

在一些实施方案中，用于靶向CYP27A1的本文公开的寡核苷酸包含以下或由以下组成：如以SEQ ID NO:1-288、615-686和789或577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的有义链序列。在一些实施方案中，寡核苷酸具有有义链，所述有义链包含以下或由以下组成：如以SEQ ID NO:1-288、615-686和789或577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列的至少12(例如至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23)个连续核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸可具有在长度方面多达40个核苷酸(例如在长度方面多达40、多达36、多达30、多达27、多达25、多达21、多达19、多达17或多达12个核苷酸)的有义链(或过客链)。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有在长度方面是至少12个核苷酸的有义链(例如在长度方面是至少12、至少15、至少19、至少21、至少25、至少27、至少30、至少36或至少38个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有在长度方面在12至40(例如12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40、或32至40)个核苷酸的范围内的有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有在长度方面是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的有义链。

在一些实施方案中，有义链在它的3′末端包含茎-环结构。在一些实施方案中，有义链在它的5′末端包含茎-环结构。在一些实施方案中，茎是在长度方面是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碱基对的双链体。在一些实施方案中，茎-环对分子提供针对降解(例如酶促降解)的更好保护，并且促进靶向特征以达成递送至靶标细胞。举例来说，在一些实施方案中，环提供可在其上进行修饰而不实质上影响寡核苷酸的基因表达抑制活性的附加核苷酸。在某些实施方案中，本文提供了一种寡核苷酸，其中有义链包含(例如在它的3′末端)阐述为S₁-L-S₂的茎-环，其中S₁互补于S₂，并且其中L形成在S₁与S₂之间的在长度方面多达10个核苷酸(例如在长度方面是3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的环。图2描绘此种寡核苷酸的一非限制性实例。

在一些实施方案中，茎-环的环(L)是四元环(例如在切口化四元环结构内)。四元环可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰核苷酸、以及它们的组合。通常，四元环具有4至5个核苷酸。

c.双链体长度

在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体在长度方面是至少12(例如至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体在长度方面在12-30个核苷酸的范围内(例如在长度方面是12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体在长度方面是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链的整个长度。在某些实施方案中，在有义链与反义链之间的双链体跨越有义链与反义链两者的整个长度。

d.寡核苷酸末端

在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链和反义链，以致在有义链或反义链、或有义链与反义链两者上存在3’-突出部分。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有一个相较于另一5’末端具有较小热力学稳定性的5’末端。在一些实施方案中，提供了一种不对称寡核苷酸，所述不对称寡核苷酸包括在有义链的3’末端的钝性末端和在反义链的3’末端的突出部分。在一些实施方案中，在反义链上的3’突出部分在长度方面是1-8个核苷酸(例如在长度方面是1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。

通常，用于RNAi的寡核苷酸在反义(引导)链的3’末端上具有两个核苷酸的突出部分。然而，其他突出部分是可能的。在一些实施方案中，突出部分是包含在一个与六个核苷酸之间，任选是一个至五个、一个至四个、一个至三个、一个至两个、两个至六个、两个至五个、两个至四个、两个至三个、三个至六个、三个至五个、三个至四个、四个至六个、四个至五个、五个至六个核苷酸，或一个、两个、三个、四个、五个或六个核苷酸的长度的3′突出部分。然而，在一些实施方案中，突出部分是包含在一个与六个核苷酸之间，任选是一个至五个、一个至四个、一个至三个、一个至两个、两个至六个、两个至五个、两个至四个、两个至三个、三个至六个、三个至五个、三个至四个、四个至六个、四个至五个、五个至六个核苷酸，或一个、两个、三个、四个、五个或六个核苷酸的长度的5′突出部分。

在一些实施方案中，有义链和/或反义链的3’末端或5’末端的一个或多个(例如2、3、4个)末端核苷酸是经修饰的。举例来说，在一些实施方案中，反义链的3’末端的一个或两个末端核苷酸是经修饰的。在一些实施方案中，在反义链的3'末端的末个核苷酸是经修饰的，例如包含2’-修饰，例如2’-O-甲氧基乙基。在一些实施方案中，在反义链的3’末端的最后一个或两个末端核苷酸互补于靶标。在一些实施方案中，在反义链的3’末端的最后一个或两个核苷酸不互补于靶标。在一些实施方案中，有义链或反义链的5’末端和/或3’末端具有倒置封盖核苷酸。

e.错配

在一些实施方案中，在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如1、2、3或4个)错配。如果在有义链与反义链之间存在超过一个错配，那么它们可连续定位(例如2、3个或更多个连续)，或散布在整个互补性区域中。在一些实施方案中，有义链的3’末端含有一个或多个错配。在一个实施方案中，两个错配并入在有义链的3’末端。在一些实施方案中，在有义链的3’末端的碱基错配或区段去稳定化改善了合成双链体在RNAi中的效能，可能是通过促进由Dicer进行的处理。

iii.单链寡核苷酸

在一些实施方案中，如本文所述的用于降低CYP27A1表达的寡核苷酸是单链的。此类结构可包括但不限于单链RNAi寡核苷酸。新近尝试已证明单链RNAi寡核苷酸的活性(参见例如Matsui等人(2016年5月),Molecular Therapy,第24卷(5),946-955)。然而，在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有以下核苷碱基序列的单链寡核苷酸：所述核苷碱基序列在以5′至3′方向书写时包含特定核酸的所靶向区段的反向互补序列，并且被适合地修饰(例如呈间隙体形式)以便诱导RNA酶H介导的对细胞中它的靶标RNA的裂解，或(例如呈混合体形式)以便抑制细胞中靶标mRNA的翻译。用于本公开中的反义寡核苷酸可以本领域中已知的任何适合方式修饰，包括例如如美国专利第9,567,587号中所示，所述美国专利的关于反义寡核苷酸的修饰的公开内容(包括例如长度、核苷碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分、以及核苷碱基的杂环部分的改变)通过引用并入本文。此外，反义分子已持续数十年用于降低特定靶标基因的表达(参见例如Bennett等人；P_{HARMACOLOGY OF} A_NTISENSE D_RUGS,A_NNUAL R_{EVIEW OF} P_{HARMACOLOGYAND} T_OXICOLOGY,第57卷:81-105)。

iv.寡核苷酸修饰

寡核苷酸可以各种方式修饰以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物可用度、免遭核酸酶降解的抗性、免疫原性、碱基配对性质、RNA分布和细胞摄取、以及与治疗或研究用途相关的其他特征。参见例如Bramsen等人,Nucleic Acids Res.,2009,37,2867-2881；Bramsen和Kjems(F_{RONTIERS IN} G_ENETICS,3(2012):1-22)。因此，在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸可包括一个或多个适合修饰。在一些实施方案中，经修饰核苷酸在它的碱基(或核苷碱基)、糖(例如核糖、脱氧核糖)、或磷酸酯基团中具有修饰。

寡核苷酸上修饰的数目以及那些核苷酸修饰的位置可影响寡核苷酸的性质。举例来说，通过使寡核苷酸缀合于脂质纳米粒子(LNP)或类似载体或将它们包含在脂质纳米粒子(LNP)或类似载体中，它们可在体内递送。然而，当寡核苷酸不通过LNP或类似载体保护时(例如“裸递送”)，修饰它的核苷酸中的至少一些可为有利的。因此，在本文提供的任何寡核苷酸的某些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸中的全部或大致上全部是经修饰的。在某些实施方案中，核苷酸中的超过一半是经修饰的。在某些实施方案中，核苷酸中的少于一半是经修饰的。通常，在裸递送的情况下，每个核苷酸都在那个核苷酸的糖基团的2′位置处经修饰。这些修饰可为可逆的或不可逆的。通常，2′位置修饰是2′-氟基、2′-O-甲基等。在一些实施方案中，如本文公开的寡核苷酸具有足以导致所需特征(例如免遭酶促降解的保护、用以在体内施用之后靶向所需细胞的能力、和/或热力学稳定性)的数目和类型的经修饰核苷酸。

a.糖修饰

在一些实施方案中，经修饰糖(在本文中也被称为糖类似物)包括经修饰脱氧核糖或核糖部分，例如其中一个或多个修饰存在于糖的2′、3′、4′和/或5′碳位置处。在一些实施方案中，经修饰糖还可包括非天然替代性碳结构，诸如存在于锁定核酸(“LNA”)(参见例如Koshkin等人(1998),T_ETRAHEDRON 54,3607-3630)、未锁定核酸(“UNA”)(参见例如Snead等人(2013),M_OLECULAR T_HERAPY–N_UCLEIC A_CIDS,2,e103)、以及桥接核酸(“BNA”)(参见例如Imanishi和Obika(2002),The Royal Society of Chemistry,C_HEM.C_OMMUN.,1653-1659)中的那些。Koshkin等人、Snead等人以及Imanishi和Obika的与糖修饰相关的公开内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，糖中的核苷酸修饰包括2′-修饰。在一些实施方案中，2′-修饰可为2′-氨基乙基、2′-氟基、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基、或2′-脱氧-2′-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。通常，修饰是2′-氟基、2′-O-甲基、或2′-O-甲氧基乙基。然而，已开发用于寡核苷酸中的多种2′位置修饰可用于本文公开的寡核苷酸中。参见例如Bramsen等人,NucleicAcids Res.,2009,37,2867-2881。在一些实施方案中，糖中的修饰包括糖环的修饰，其可包括糖环的一个或多个碳的修饰。举例来说，核苷酸的糖的修饰在糖的2’-碳与1′-碳或4′-碳之间的键联。举例来说，键联可包含亚乙基或亚甲基桥。在一些实施方案中，经修饰核苷酸具有缺乏2′-碳至3′-碳键的无环糖。在一些实施方案中，经修饰核苷酸具有硫醇基团，例如在糖的4′位置中。

在一些实施方案中，末端3′-末端基团(例如3′-羟基)是可例如用于连接接头、衔接物或标记，或用于将寡核苷酸直接连接于另一核酸的磷酸酯基团或其他基团。

b.5′末端磷酸酯

寡核苷酸的5′-末端磷酸酯基团可或在一些情况下增强与Argonaut 2的相互作用。然而，包含5′-磷酸酯基团的寡核苷酸可易经受通过磷酸酶或其他酶达成的降解，此可限制它们的体内生物可用度。在一些实施方案中，寡核苷酸包括5′磷酸酯的对此降解具有抗性的类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物可为氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸链的5′末端连接于模拟天然5′-磷酸酯基团的静电和空间性质的化学部分(“磷酸酯模拟物”)(参见例如Prakash等人(2015),NucleicAcids Res.,Nucleic Acids Res.2015年3月31日；43(6):2993–3011，所述文献的与磷酸酯类似物相关的内容通过引用并入本文)。已开发可连接于5′末端的许多磷酸酯模拟物(参见例如美国专利第8,927,513号，所述专利的与磷酸酯类似物相关的内容通过引用并入本文)。已开发对寡核苷酸的5′末端的其他修饰(参见例如WO 2011/133871，所述专利的与磷酸酯类似物相关的内容通过引用并入本文)。在某些实施方案中，羟基连接于寡核苷酸的5′末端。

在一些实施方案中，寡核苷酸在糖的4′-碳位置处具有磷酸酯类似物(被称为“4′-磷酸酯类似物”)。参见例如2017年9月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/049909、2016年9月2日提交的题为4′-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same的美国临时申请第62/383,207号、以及2016年9月12日提交的题为4′-Phosphate Analogsand Oligonucleotides Comprising the Same的美国临时申请第62/393,401号，所述专利中的每一者的与磷酸酯类似物相关的内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸在5′-末端核苷酸处包含4′-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子结合于糖部分(例如在它的4′-碳处)或其类似物。在其他实施方案中，4′-磷酸酯类似物是硫甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子结合于糖部分或其类似物的4′-碳。在某些实施方案中，4′-磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯。在一些实施方案中，氧基甲基膦酸酯由式–O–CH₂–PO(OH)₂或–O–CH₂–PO(OR)₂代表，其中R独立地选自H、CH₃、烷基、CH₂CH₂CN、CH₂OCOC(CH₃)₃、CH₂OCH₂CH₂Si(CH₃)₃、或保护基。在某些实施方案中，烷基是CH₂CH₃。更通常地，R独立地选自H、CH₃或CH₂CH₃。

c.经修饰核苷间键联

在一些实施方案中，寡核苷酸可包含经修饰核苷间键联。在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代可产生包含至少一个(例如至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个)经修饰核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸中的任一者包含1至10(例如1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3或1至2)个经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸中的任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰核苷酸间键联。

经修饰核苷酸间键联可为二硫代磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联、磷酸三酯键联、硫羰烷基膦酸酯键联、硫羰烷基磷酸三酯键联、亚磷酰胺键联、膦酸酯键联或硼烷磷酸酯键联。在一些实施方案中，如本文公开的寡核苷酸中的任一者的至少一个经修饰核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。

d.碱基修饰

在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有一个或多个经修饰核苷碱基。在一些实施方案中，经修饰核苷碱基(在本文中也被称为碱基类似物)连接在核苷酸糖部分的1′位置处。在某些实施方案中，经修饰核苷碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，经修饰核苷碱基不含有氮原子。参见例如美国公布专利申请第20080274462号。在一些实施方案中，经修饰核苷酸包含通用碱基。然而，在某些实施方案中，经修饰核苷酸不含有核苷碱基(无碱基)。

在一些实施方案中，通用碱基是位于经修饰核苷酸中的核苷酸糖部分的1′位置或核苷酸糖部分取代物中的等效位置处的杂环部分，当存在于双链体中时，所述杂环部分可与超过一种类型的碱基相对地定位，而不实质上改变所述双链体的结构。在一些实施方案中，相较于完全互补于靶标核酸的参考单链核酸(例如寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与所述靶标核酸形成双链体，相比于以互补性核酸形成的双链体，所述双链体具有较低的T_m。然而，在一些实施方案中，相较于其中通用碱基已用碱基替换以产生单一错配的参考单链核酸，含有通用碱基的单链核酸与靶标核酸形成双链体，相比于以包含错配碱基的核酸形成的双链体，所述双链体具有较高的T_m。

通用结合核苷酸的非限制性实例包括肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚、和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(Quay等人的美国专利申请公布第20070254362号；VanAerschot等人,An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguousnucleoside.Nucleic Acids Res.1995年11月11日；23(21):4363-70；Loakes等人,3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNAsequencing and PCR.N_UCLEIC A_CIDS R_ES.1995年7月11日；23(13):2361-6；Loakes和Brown,5-Nitroindole as an universal base analogue.N_UCLEIC A_CIDS R_ES.1994年10月11日；22(20):4039-43。前述专利和文献中的每一者的与碱基修饰相关的公开内容通过引用并入本文)。

e.可逆修饰

尽管可进行用以在到达靶标细胞之前保护寡核苷酸免遭体内环境的影响的某些修饰，但一旦所述寡核苷酸到达靶标细胞的胞质溶胶，它们可降低它的效能或活性。可进行可逆修饰，以致分子在细胞的外部保持合乎需要的性质，所述修饰接着在进入细胞的胞质溶胶环境后被移除。可例如通过细胞内酶的作用或通过在细胞的内部的化学条件(例如通过由细胞内谷胱甘肽达成的还原)移除可逆修饰。

在一些实施方案中，以可逆方式修饰的核苷酸包含谷胱甘肽敏感性部分。通常，核酸分子已用环状二硫部分化学修饰以掩蔽由核苷酸间二磷酸酯键联产生的负电荷，并且改善细胞摄取和核酸酶抗性。参见最初转让给Traversa Therapeutics,Inc.(“Traversa”)的美国公布申请第2011/0294869号，Solstice Biologics,Ltd.(“Solstice”)的PCT公布第WO2015/188197号，Meade等人,N_ATURE B_IOTECHNOLOGY,2014,32:1256-1263(“Meade”)，MerckSharp&Dohme Corp的PCT公布第WO 2014/088920号，所述专利和文献中的每一者的对此类修饰的公开内容通过引用并入本文。核苷酸间二磷酸酯键联的这个可逆修饰被设计来通过胞质溶胶的还原环境(例如谷胱甘肽)在细胞内裂解。更早的实例包括据报道可在细胞内部裂解的中和磷酸三酯修饰(Dellinger等人J.A_M.C_HEM.S_OC.2003,125:940-950)。

在一些实施方案中，此种可逆修饰允许在其中寡核苷酸将暴露于核酸酶和其他严苛环境条件(例如pH)的体内施用(例如通过血液和/或细胞的溶酶体/内体区室进行的运送)期间进行保护。当释放至细胞的相较于细胞外间隙，谷胱甘肽的水平是较高的胞质溶胶中时，修饰被逆转，并且所得物是经裂解寡核苷酸。相较于使用不可逆化学修饰的可用选项，在使用可逆的谷胱甘肽敏感性部分的情况下，有可能将在空间上较大的化学基团引入至目标寡核苷酸中。这是因为这些较大化学基团将在胞质溶胶中被移除，因此，应该不会干扰在细胞的胞质溶胶内部寡核苷酸的生物活性。因此，这些较大化学基团可被工程改造来对核苷酸或寡核苷酸赋予各种优势，诸如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性、以及降低的免疫原性。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分的结构可被工程改造来改变它的释放动力学。

在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分连接于核苷酸的糖。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分连接于经修饰核苷酸的糖的2′-碳。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的5′-碳处，特别是当经修饰核苷酸是寡核苷酸的5′-末端核苷酸时。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的3′-碳处，特别是当经修饰核苷酸是寡核苷酸的3′-末端核苷酸时。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分包含磺酰基。参见例如国际专利申请PCT/US2017/048239和2016年8月23日提交的题为Compositions ComprisingReversibly Modified Oligonucleotides and Uses Thereof的美国临时申请第62/378,635号，所述专利的内容中的相关公开内容通过引用并入本文。

v.靶向配体

在一些实施方案中，可合乎需要的是使本公开的寡核苷酸靶向一种或多种细胞或一种或多种器官。此种策略可帮助避免其他器官中的不合需要的影响，或可避免朝向将不受益于寡核苷酸的细胞、组织或器官的寡核苷酸的不当损失。因此，在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸可被修饰来促进对特定组织、细胞或器官的靶向，例如以促进将寡核苷酸递送至肝。在某些实施方案中，本文公开的寡核苷酸可被修饰来促进将寡核苷酸递送至肝脏的肝细胞。在一些实施方案中，寡核苷酸包含缀合于一个或多个靶向配体的核苷酸。

靶向配体可包括碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如抗体或抗体片段)、或脂质。在一些实施方案中，靶向配体是适体。举例来说，靶向配体可为用于靶向肿瘤血管结构或神经胶质瘤细胞的RGD肽、用以靶向肿瘤血管结构或基质的CREKA肽、转铁蛋白(transferrin)、乳铁传递蛋白(lactoferrin)、或用以靶向在CNS血管结构上表达的转铁蛋白受体的适体、或用以靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。在某些实施方案中，靶向配体是一个或多个GalNAc部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或更多个(例如1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合于单独靶向配体。在一些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自缀合于单独靶向配体。在一些实施方案中，靶向配体在有义链或反义链的任一末端缀合于2至4个核苷酸(例如配体缀合于在有义链或反义链的5′或3′末端上的2至4个核苷酸的突出部分或延伸部分)，以致靶向配体类似于牙刷的刷毛，并且寡核苷酸类似于牙刷。举例来说，寡核苷酸可在有义链的5′或3′末端包含茎-环，并且茎的环的1、2、3或4个核苷酸可单个地缀合于靶向配体，如例如在2016年6月23日公布的国际专利申请公布WO 2016/100401中所述，所述公布的相关内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，合乎需要的是使降低CYP27A1的表达的寡核苷酸靶向受试者的肝脏的肝细胞。任何适合的肝细胞靶向部分都可出于这个目的加以使用。

GalNAc是无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的高亲和力配体，所述无唾液酸糖蛋白受体主要在肝细胞的窦状隙表面上表达，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基的循环糖蛋白(无唾液酸糖蛋白)的结合、内化和后续清除方面具有主要作用。使GalNAc部分缀合(间接或直接)于本公开的寡核苷酸可用于使这些寡核苷酸靶向在这些肝细胞上表达的ASGPR。

在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸直接或间接缀合于单价GalNAc。在一些实施方案中，寡核苷酸直接或间接缀合于超过一个单价GalNAc(即缀合于2、3或4个单价GalNAc部分，并且通常缀合于3或4个单价GalNAc部分)。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸缀合于一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc、或四价GalNAc部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或更多个(例如1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合于GalNAc部分。在一些实施方案中，茎-环的环(L)的2至4个核苷酸各自缀合于单独GalNAc。在一些实施方案中，靶向配体在有义链或反义链的任一末端缀合于2至4个核苷酸(例如配体缀合于在有义链或反义链的5′或3′末端上的2至4个核苷酸的突出部分或延伸部分)，以致GalNAc部分类似于牙刷的刷毛，并且寡核苷酸类似于牙刷。举例来说，寡核苷酸可在有义链的5′或3′末端包含茎-环，并且茎的环的1、2、3或4个核苷酸可单个地缀合于GalNAc部分。在一些实施方案中，GalNAc部分缀合于有义链的核苷酸。举例来说，四个GalNAc部分可缀合于有义链的四元环中的核苷酸，其中每个GalNAc部分缀合于一个核苷酸。

适当方法或化学过程(例如点击化学过程)可用于使靶向配体连接于核苷酸。在一些实施方案中，使用点击接头使靶向配体缀合于核苷酸。在一些实施方案中，基于缩醛的接头用于使靶向配体缀合于本文所述的寡核苷酸中的任一者的核苷酸。基于缩醛的接头例如公开于国际专利申请公布第WO2016100401 A1号中，所述公布于2016年6月23日公布，并且所述公布的与此类接头相关的内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，接头是不稳定接头。然而，在其他实施方案中，接头是相当稳定的。在一些实施方案中，提供了在靶向配体(例如GalNAc部分)与双链寡核苷酸之间的双链体延伸部分(在长度方面多达3、4、5或6个碱基对)。

III.制剂

已开发各种制剂来促进寡核苷酸使用。举例来说，可使用使降解最小化，促进递送和/或摄取，或对制剂中的寡核苷酸提供另外有益性质的制剂将寡核苷酸递送至受试者或细胞环境。在一些实施方案中，本文提供了包含用以降低CYP27A1的表达的寡核苷酸(例如单链或双链寡核苷酸)的组合物。可适合地配制此类组合物，以致当施用至受试者而进入靶标细胞的直接环境中或到达全身时，足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低CYP27A1表达。多种适合寡核苷酸制剂中的任一者可用于递送如本文公开的用于降低CYP27A1的寡核苷酸。在一些实施方案中，在缓冲溶液诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构和衣壳中配制寡核苷酸。

在一些实施方案中，在水中或在水溶液(例如调整了pH的水)中配制裸寡核苷酸或其缀合物。在一些实施方案中，在碱性缓冲水溶液(例如PBS)中配制裸寡核苷酸或其缀合物。具有阳离子脂质的寡核苷酸制剂可用于促进寡核苷酸转染至细胞中。举例来说，可使用诸如脂转染试剂(lipofectin)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如聚赖氨酸)的阳离子脂质。适合脂质包括寡聚转染胺(Oligofectamine)、转脂胺(Lipofectamine)(LifeTechnologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.)或FuGene 6(Roche)，其全都可根据制造商说明书加以使用。

因此，在一些实施方案中，制剂包含脂质纳米粒子。在一些实施方案中，赋形剂包括脂质体、脂质、脂质复合物、微球体、微粒、纳米球体、或纳米粒子，或可以其他方式配制以施用至有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体(参见例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第22版,Pharmaceutical Press,2013)。

在一些实施方案中，如本文公开的制剂包含赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂对组合物赋予活性成分的改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解性和/或治疗增强。在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂(例如柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如缓冲溶液、矿脂、二甲亚砜或矿物油)。在一些实施方案中，将寡核苷酸冻干以延长它的储存期限，接着在使用(例如施用至受试者)之前制备成溶液。因此，包含本文所述的寡核苷酸中的任一者的组合物中的赋形剂可为冻干保护剂(例如甘露糖醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)、或塌陷温度调节剂(例如右旋糖酐、菲科尔(ficoll)或明胶)。

在一些实施方案中，配制药物组合物以可与它的预定施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、真皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(表面)、经粘膜和经直肠施用。通常，施用途径是静脉内或皮下施用途径。

适于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当可溶于水时)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。对于静脉内施用，适合载体包括生理食盐水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可为溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、以及它们的适合混合物。在许多情况下，将为优选的是在组合物中包括等张剂，例如糖；多元醇，诸如甘露糖醇、山梨糖醇；和氯化钠。可通过以下方式制备无菌可注射溶液：将寡核苷酸以所需量与以上列举的成分中的如所需要的一者或组合一起并入所选溶剂中，随后过滤灭菌。

在一些实施方案中，组合物可含有至少约0.1％的治疗剂(例如用于降低CYP27A1表达的寡核苷酸)或更多治疗剂，但一种或多种活性成分的百分比可在总组合物的重量或体积的约1％与约80％之间或更大。诸如溶解性、生物可用度、生物半衰期、施用途径、产品储存期限以及其他药理学考虑事项的因素将由制备此类药物制剂的领域中的技术人员考虑，因此，多种剂量和治疗方案可为合乎需要的。

尽管许多实施方案涉及本文公开的任何寡核苷酸的肝靶向递送，但还考虑靶向其他组织。

IV.使用方法

i.降低细胞中的CYP27A1表达

在一些实施方案中，提供了用于向细胞递送有效量的本文公开的寡核苷酸中的任一者以达成降低所述细胞中CYP27A1的表达的目的的方法。本文提供的方法可用于任何适当细胞类型。在一些实施方案中，细胞是表达CYP27A1的任何细胞(例如肝细胞、巨噬细胞、单核细胞源性细胞、前列腺癌细胞、脑细胞、内分泌组织细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞、肺细胞、胆囊细胞、肝脏细胞、十二指肠细胞、小肠细胞、胰腺细胞、肾细胞、胃肠道细胞、膀胱细胞、脂肪和软组织细胞、以及皮肤细胞)。在一些实施方案中，细胞是已从受试者获得，并且可已经受有限数目的传代，以致细胞大致上维持它的天然表型性质的原代细胞。在一些实施方案中，向其递送寡核苷酸的细胞是离体的或体外的(即可递送至所培养的细胞或细胞驻留在其中的生物体)。在具体实施方案中，提供了用于向细胞递送有效量的本文公开的寡核苷酸中的任一者以达成降低仅仅或主要是肝细胞中CYP27A1的表达的目的的方法。

在一些实施方案中，可使用适当核酸递送方法引入本文公开的寡核苷酸，所述方法包括注射含有寡核苷酸的溶液，用由寡核苷酸覆盖的粒子轰击，使细胞或生物体暴露于含有寡核苷酸的溶液，或在寡核苷酸存在下对细胞膜进行电穿孔。可使用用于将寡核苷酸递送至细胞的其他适当方法，诸如脂质介导的载体运输、化学试剂介导的运输、以及阳离子脂质体转染诸如磷酸钙、以及其他方法。

可通过用以评估细胞或受试者的一种或多种性质的适当测定，或通过评估指示CYP27A1表达的分子(例如RNA、蛋白质)的生物化学技术确认抑制的影响。在一些实施方案中，通过将表达水平(例如CYP27A1的mRNA或蛋白质水平)与适当对照(例如尚未向其递送寡核苷酸或已向其递送阴性对照的细胞或细胞群体中的CYP27A1表达水平)进行比较来评估本文提供的寡核苷酸使CYP27A1的表达水平降低的程度。在一些实施方案中，CYP27A1表达的适当对照水平可为预定水平或数值，以致无需每次测量对照水平。预定水平或数值可采用多种形式。在一些实施方案中，预定水平或数值可为单一截断值，诸如中值或平均值。

在一些实施方案中，如本文所述的寡核苷酸的施用导致细胞中CYP27A1表达水平降低。在一些实施方案中，相较于CYP27A1的适当对照水平，CYP27A1表达水平降低可为降低至1％或更低，5％或更低，10％或更低，15％或更低，20％或更低，25％或更低，30％或更低，35％或更低，40％或更低，45％或更低，50％或更低，55％或更低，60％或更低，70％或更低，80％或更低，或90％或更低。适当对照水平可为尚未与如本文所述的寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的CYP27A1表达水平。在一些实施方案中，在有限时期之后评估根据本文公开的方法将寡核苷酸递送至细胞的影响。举例来说，可在将寡核苷酸引入至细胞中之后至少8小时、12小时、18小时、24小时；或至少一、二、三、四、五、六、七或十四天分析细胞中CYP27A1的水平。

在一些实施方案中，将寡核苷酸以被工程改造来在细胞中表达所述寡核苷酸(例如它的有义链和反义链)的转基因形式递送。在一些实施方案中，使用被工程改造来表达本文公开的任何寡核苷酸的转基因递送寡核苷酸。可使用病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如质粒或合成mRNA)递送转基因。在一些实施方案中，可将转基因直接注射至受试者。

ii.治疗方法

本公开的方面涉及用于降低CYP27A1表达以治疗例如与在肝胆疾病的情形下的胆汁酸积累相关的肝纤维化的方法。在一些实施方案中，方法可包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的寡核苷酸中的任一者。此类治疗可例如用于处于肝纤维化和/或肝胆疾病的风险下(或易患肝纤维化和/或肝胆疾病)的受试者。

在某些方面，本公开提供了一种用于通过向受试者施用治疗剂(例如寡核苷酸或编码所述寡核苷酸的载体或转基因)来预防所述受试者中的如本文所述的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，待治疗的受试者是将在治疗上受益于例如肝中CYP27A1蛋白的量的降低的受试者。

本文所述的方法通常涉及向受试者施用有效量的寡核苷酸，所述有效量即能够产生合乎需要的治疗结果的量。治疗上可接受的量可为能够治疗疾病或病症的量。用于任一受试者的适当剂量将取决于某些因素，包括受试者的身材、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的一种或多种活性成分、施用的时间和途径、总体健康状况、以及并行施用的其他药物。

在一些实施方案中，以经肠(例如口服、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、通过胃造口术或经直肠)、胃肠外(例如皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、肌肉内注射)、表面(例如皮上、吸入、通过滴眼剂、或通过粘膜)方式，或通过直接注射至靶标器官(例如受试者的肝)中，向受试者施用本文公开的组合物中的任一者。通常，以静脉内或皮下方式施用本文公开的寡核苷酸。

在一些实施方案中，在0.1mg/kg至25mg/kg(例如1mg/kg至5mg/kg)的范围内的剂量下施用寡核苷酸。在一些实施方案中，在0.1mg/kg至5mg/kg的范围内或0.5mg/kg至5mg/kg的范围内的剂量下施用寡核苷酸。

作为一组非限制性实例，将通常每年一次、每年两次、每季度(每三个月一次)、两月一次(每两个月一次)、每月或每周施用本公开的寡核苷酸。

在一些实施方案中，待治疗的受试者是人(例如人患者)或非人灵长类动物或其他哺乳动物受试者。其他示例性受试者包括驯化动物诸如狗和猫；家畜诸如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠的动物。

实施例

实施例1:使用基于人和小鼠细胞的测定开发CYP27A1寡核苷酸抑制剂

图1显示使用基于人和小鼠的测定开发用于抑制CYP27A1表达的候选寡核苷酸的工作流程。首先，基于计算机的算法用于产生用于CYP27A1抑制的候选寡核苷酸序列。基于细胞的测定和PCR测定接着用于评估候选寡核苷酸降低CYP27A1表达的能力。

计算机算法提供了2114种互补于人CYP27A1 mRNA(SEQ ID NO:782，表1)的寡核苷酸，其中1084种还互补于恒河猴CYP27A1 mRNA(SEQ ID NO:783，表1)，并且24种还互补于小鼠CYP27A1 mRNA(SEQ ID NO:784，表1)。8种寡核苷酸互补于人、小鼠和恒河猴CYP27A1mRNA。CYP27A1 mRNA序列的实例概述于表1中：

表1.人、恒河猴和小鼠CYP27A1 mRNA的序列

物种	GenBank RefSeq#	序列标识符
			人	NM_000784.3	SEQ ID NO:782
恒河猴	NM_001194021.1	SEQ ID NO:783
			小鼠	NM_024264.5	SEQ ID NO:784

在算法提供的2114种寡核苷酸之中，选择288种寡核苷酸作为候选物用于在基于HepG2细胞的测定中的实验评估。在这个测定中，用寡核苷酸转染表达CYP27A1的细胞。在转染之后维持细胞一段时期，接着使用基于

的qPCR测定探询剩余CYP27A1 mRNA的水平。使用两种qPCR测定，即3’测定和5’测定。所有288种寡核苷酸都具有指定为M15的相同修饰样式，其含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基修饰的核苷酸的组合。测试的寡核苷酸的序列提供在表2中。

表2.用于基于人细胞的测定的候选寡核苷酸序列

Hs：人，Rh：恒河猴，并且Mm：小鼠；有义和反义SEQ ID NO列提供杂交以产生每种寡核苷酸的有义链和相应反义链。举例来说，具有SEQ ID NO:1的有义链与具有SEQ ID NO:289的反义链杂交；测试的寡核苷酸中的每一者具有相同修饰样式。

CYP27A1 mRNA中的热点

来自288种候选寡核苷酸的筛选的数据显示于图3中。寡核苷酸基于与人(Hs)基因位置具有互补性的位置加以排列。相较于阴性对照，导致剩余小于或等于25％mRNA的寡核苷酸被视为命中物。未被发现会抑制CYP27A1表达的三种寡核苷酸用作阴性对照。此外，用持家基因次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)转染细胞被用作转染的阳性对照。

基于这个准则鉴定了119个命中物。基于这些寡核苷酸的活性和位置(图3)，确定了人CYP27A1 mRNA上的热点。将热点鉴定为人CYP27A1 mRNA序列上与至少一种在任一测定中，相较于对照，导致mRNA水平小于或等于25％的寡核苷酸相关的链段。这些热点可在图3中目视观察。因此，鉴定了人CYP27A1 mRNA序列内的以下热点：699-711、729-735、822-836、970-1009、1065-1088、1095-1112、1181-1203、1297-1317、1488-1492、1591-1616、1659-1687、1929-1932、1995-2001、2204-2225、和2262-2274。热点的序列概述于表3中。

表3.热点的序列

剂量响应分析

基于被发现在第一筛选中最具活性的119种寡核苷酸的基因位置以及在物种之间的序列保守性，使96种寡核苷酸经受次级筛选。在这个次级筛选中，使用与初级筛选中相同的测定，但在三种不同浓度(1nM、0.1nM和0.01nM)下测试寡核苷酸。选择在两种另外浓度下显示活性的寡核苷酸用于进一步分析。

在这个阶段，对所选寡核苷酸进行修饰以含有四元环，并且改造成不同修饰样式。在有义(过客)链的3’-末端并入茎-环序列，其中环序列是四元环的序列。因此，分子转变成切口化四元环结构(36聚体过客链以及22聚体引导链)。对于通用四元环结构，参见图2。接着在三种不同浓度(0.01nM、0.1nM和1nM)下测试这些分子降低CYP27A1 mRNA表达的能力。图4A显示由两种具有四元环的碱基序列制得的寡核苷酸的数据，每种碱基序列被改造成10种不同修饰样式，指定为M1至M12。对于这个实验，还测试了两种是21聚体而非22聚体的寡核苷酸(即S785-AS786-M26和S787-AS788-M26)。S785-AS786-M26和S787-AS788-M26分别是S577-AS579-M26和S578-AS580-M26的21聚体形式。因为Dicer酶可将较大寡核苷酸裂解成21聚体或22聚体，所以测试了这些寡核苷酸。图4B显示类似数据，但关于的是具有四元环的16碱基序列，各自被改造成1或2种不同修饰样式，指定为M13和M14。寡核苷酸S577-AS579-M1和S577-AS579-M9作为实验间校正物用于产生图4A和图4B中所示的数据的实验中。另外，在图4B中由“*”描绘的寡核苷酸中，反义链的5’末端中第一核苷酸的碱基被尿嘧啶取代以改善活性。

评估来自这些实验的数据以鉴定将改善递送性质，但维持用于降低CYP27A1表达的活性的四元环和修饰样式。基于这个分析，接着使所选寡核苷酸缀合于GalNAc部分，并且加以测定(图6)。对于图6中所示的寡核苷酸，四个GalNAc部分缀合于有义链的四元环中的核苷酸。使用点击接头进行缀合。所用GalNAc如下所示：

N-乙酰基-b-D-半乳糖胺(CAS号：14131-60-3)

寡核苷酸降低CYP27A1表达的能力受修饰样式的影响。举例来说，寡核苷酸S591-AS608-M24G和S591-AS608-M22G是不同的，仅因为S591-AS608-M24G含有在位置1处的胞嘧啶和在反义链上的天然5’磷酸酯，而S591-AS608-M22G含有在位置1处的尿嘧啶和在反义链上的5’磷酸酯类似物。

还将CYP27A1的蛋白质水平连同mRNA水平一起进行了评估。

测试鼠模型

与使用人HepG2细胞的实验并行，还在AML12鼠细胞的情况下筛选寡核苷酸。测试了96种互补于小鼠CYP27A1 mRNA(SEQ ID NO:784)的寡核苷酸。用寡核苷酸转染表达CYP27A1的细胞，并且使用基于

的qPCR测定探询剩余CYP27A1 mRNA的水平。表4概述测试的寡核苷酸的序列。

表4.用于基于鼠细胞的测定的候选寡核苷酸序列：Hs：人，Rh：恒河猴，并且Mm：小鼠；有义和反义SEQ ID NO列提供退火以产生每种寡核苷酸的有义链和相应反义链(相对于彼此依序列出)。举例来说，具有SEQ ID NO:1的有义链与具有SEQ ID NO:289的反义链杂交；测试的寡核苷酸中的每一者具有相同修饰样式。

使用与基于人细胞的测定中类似的准则，接着使这些寡核苷酸中的26者经受在多种浓度下的筛选。接着将不同修饰样式应用于26种寡核苷酸中的8者。基于它们的活性，使具有不同修饰样式的4种序列缀合于GalNAc部分。图5显示这些具有四元环的GalNAc缀合寡核苷酸的活性。对于图5中所示的寡核苷酸，四个GalNAc部分缀合于有义链的四元环中的核苷酸。使所选寡核苷酸经受在部分胆管结扎小鼠模型中的测试。在这个实验中，在脂质纳米粒子中配制的母体寡核苷酸(即25/27聚体)S789-AS790-M27用作对照。这个寡核苷酸未缀合于GalNAc部分。

通过手术将雌性CD-1小鼠中的左侧肝叶胆管结扎，而保留对其他叶进行供给的胆管未处理。在手术之后四周，用PBS或GalXC-CYP27A1缀合物(即GalNAc缀合寡核苷酸)在10mg/kg下每周皮下注射小鼠，再持续4周。在研究结束时，将小鼠处死，并且收集血清和肝组织。从肝纯化RNA以产生cDNA。接着使用小鼠特异性CYP27A1引物/探针，通过qPCR估计CYP27A1 mRNA水平。采用经重同位素标记的胆汁酸标准物，通过LC-MS测量血清胆汁酸浓度。CYP27A1敲低显著降低了循环中胆汁酸的浓度(图7)。

通过手术将雌性CD-1小鼠中的左侧肝叶胆管结扎，而保留对其他叶进行供给的胆管未处理。在从手术恢复之后，用PBS或GalXC-CYP27A1缀合物在10mg/kg下每周皮下注射小鼠，持续4周。在研究结束时，将小鼠处死，并且收集它们的肝。接着用作为特异性染色肝中纤维化区域的染料的天狼猩红染色肝切片。CYP27A1敲低降低了纤维化的量，如通过天狼猩红染色所测量(图8)。

材料和方法

转染

对于第一筛选，转脂胺RNAiMAX^TM用于复合寡核苷酸以达成高效转染。将寡核苷酸、RNAiMAX和Opti-MEM添加至板中，并且在室温下孵育20分钟，随后进行转染。从活跃传代细胞的烧瓶抽吸培养基，并且在37℃下在胰蛋白酶存在下将细胞孵育3-5分钟。在细胞不再粘附于烧瓶之后，添加细胞生长培养基(缺乏青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin))以中和胰蛋白酶，并且悬浮细胞。移除10μL等分试样，并且用血球计计数以基于每毫米来定量细胞。对于HeLa细胞，每孔接种处于100μL培养基中的20,000个细胞。采用已知细胞浓度稀释悬浮液以获得为待转染细胞的数目所需的总体积。将稀释细胞悬液添加至已含有处于Opti-MEM中的寡核苷酸的96孔转染板中。接着在37℃下将转染板孵育24小时。在孵育24小时之后，从每个孔抽吸培养基。使用来自Promega RNA分离试剂盒的溶解缓冲液溶解细胞。将溶解缓冲液添加至每个孔中。接着将经溶解细胞转移至Corbett XtractorGENE(QIAxtractor)中以进行RNA分离，或在-80℃下储存。

对于后续筛选和实验，例如次级筛选，转脂胺RNAiMAx用于复合寡核苷酸以进行反向转染。通过在OptiMEM培养基中混合RNAiMAX和siRNA 15分钟来制备复合物。将转染混合物转移至多孔板中，并且将细胞悬液添加至孔中。在24小时孵育之后，用PBS洗涤细胞一次，接着使用来自Promega SV96试剂盒的溶解缓冲液加以溶解。使用SV96板，在真空歧管中纯化RNA。接着在65℃下将四微升纯化RNA加热5分钟，并且冷却至4℃。RNA接着用于使用高容量逆转录试剂盒(Life Technologies)以10微升反应进行的逆转录。接着用无核酸酶水将cDNA稀释至50μl，并且用于采用多路5’-核酸内切酶测定和SSoFast qPCR主混合物(Bio-Rad laboratories)的定量PCR。

cDNA合成

使用Corbett X-tractor Gene^TM(QIAxtractor)从组织培养中的哺乳动物细胞分离RNA。经修改SuperScript II方案用于从经分离RNA合成cDNA。将经分离RNA(约5ng/μL)加热至65℃，持续五分钟，并且与dNP、随机六聚体、寡dT和水一起孵育。使混合物冷却15秒。将由水、5X第一链缓冲液、DTT、SUPERase·In^TM(一种RNA抑制剂)和SuperScript II RTase组成的“酶混合物”添加至混合物中。使用热循环仪将内含物加热至42℃，持续一小时，接着加热至70℃，持续15分钟，接着冷却至4℃。接着使所得cDNA经受基于

的qPCR。qPCR反应是多路的，每个反应含有两种5’核酸内切酶测定。

qPCR测定

使用基于

的qPCR对引物集合进行初始筛选。通过评估熔解曲线以及“减RT”对照来验证测定特异性。来自HeLa和Hepa1-6细胞的cDNA模板的稀释液(从每个反应20ng并且直至0.02ng的10倍连续稀释液)分别用于测试人(Hs)和小鼠(Mm)测定。在384孔板中设置qPCR测定，用MicroAmp薄膜覆盖，并且在来自Applied Biosystems的7900HT上运行。试剂浓度和循环条件包括以下：2xSYBR混合物、10μM正向引物、10μM反向引物、DD H₂O和cDNA模板，直至10μL的总体积。

克隆

根据制造商说明书使显示单一熔解曲线的PCR扩增子连接至来自Promega的

Easy载体中。遵循制造商方案，用新连接的载体转化JM109高效率细胞。接着将细胞铺于含有氨苄青霉素(ampicillin)的LB板上，并且在37℃下孵育过夜以达成菌落生长。

PCR筛选和质粒小量制备

PCR用于鉴定已用含有连接的目标扩增子的载体转化的大肠杆菌(E.coli)的菌落。侧接于插入物的载体特异性引物用于PCR反应中。接着在1％琼脂糖凝胶上运行所有PCR产物，并且在染色之后通过透射仪成像。定性评估凝胶以确定哪些质粒似乎含有预期大小的连接扩增子(约300bp，包括扩增子和对所用引物具有特异性的侧接载体序列)。

接着在37℃下在振荡下，将作为通过PCR筛选确认的转化子的菌落在由2mL具有氨苄青霉素的LB培养液组成的培养物中孵育过夜。接着使大肠杆菌细胞溶解，并且使用Promega的小量制备试剂盒分离目标质粒。通过在260nm下的紫外吸光度来测定质粒浓度。

质粒测序和定量

使用

终止剂测序试剂盒对纯化质粒测序。载体特异性引物T7用于产生跨越插入物的读段长度。以下试剂用于测序反应中：水、5X测序缓冲液、BigDye终止剂混合物、T7引物和质粒(100ng/μL)，直至10μL的体积。将混合物在96℃下保持一分钟，接着经受15个以下循环：96℃持续10秒，50℃持续5秒，60℃持续1分钟15秒；5个以下循环：96℃持续10秒，50℃持续5秒，60℃持续1分钟30秒；以及5个以下循环：96℃持续10秒，50℃持续5秒，以及60℃持续2分钟。接着使用Applied Biosystems的毛细管电泳测序仪对染料终止反应测序。

接着定量序列经验证的质粒。使用单一切割限制核酸内切酶使它们线性化。使用琼脂糖凝胶电泳确认线性。在每mL缓冲液具有100μg tRNA以降低质粒与聚丙烯小瓶的非特异性结合的TE缓冲液(pH 7.5)中制备所有质粒稀释液。

接着从每μL 1,000,000至01个拷贝连续稀释线性化质粒，并且经受qPCR。计算测定效率，并且如果效率在90-110％的范围内，那么测定被视为可接受。

多路测定

对于每种靶标，通过两种5’核酸酶测定来定量mRNA水平。一般来说，对于每种靶标，筛选若干测定。所选的两种测定显示良好效率、低检测限、以及对目标基因(GOI)的广泛5’→3’覆盖的组合。当在相应探针上使用不同荧光团时，可在一个反应中组合针对一种GOI的两种测定。因此，测定验证中的最终步骤在于确定当所选测定在同一qPCR中组合或被“多路化”时，它们的效率。

将呈10倍稀释液形式的用于两种测定的线性化质粒组合，并且进行qPCR。如上所述测定每个测定的效率。接受的效率是90-110％。

尽管使用线性化质粒标准物验证多路反应，但还使用cDNA作为模板评估了关于目标靶标的C_q值。对于人或小鼠靶标，分别使用HeLa和Hepa1-6 cDNA。在这个情况下，cDNA源于在Corbett上从未转染细胞分离的RNA(约5ng/μl，于水中)。以这个方式，由这个样品cDNA获得的观察C_q值代表由96孔板转染获得的预期C_q值。在其中C_q值大于30的情况下，寻求展现目标基因的更高表达水平的其他细胞系。产生了通过高通量方法在Corbett上从每种人株系和小鼠株系分离的总RNA的文库，并且用于筛选靶标表达的可接受水平。

寡核苷酸命名法的描述

本文所述的所有寡核苷酸都指定为任一SN₁-ASN₂-MN₃。以下标号适用：

·N₁：有义链序列的序列标识符编号

·N₂：反义链序列的序列标识符编号

·N₃：修饰样式的参考编号，其中每个编号代表寡核苷酸中经修饰核苷酸的样式。

举例来说，S27-AS123-M15代表具有由SEQ ID NO:27阐述的有义序列、由SEQ IDNO:123阐述的反义序列，并且被改造成修饰样式编号15的寡核苷酸。

可在不存在本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制下适合地实施本文以说明方式描述的公开内容。因此，例如在本文中的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一者可用另外两个术语中的任一者替换。已采用的术语和表述被用作描述术语而非限制术语，并且不意图在使用此类术语和表述时排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，而是应认识到在要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应了解尽管已通过优选实施方案、任选特征具体公开了本发明，但对本文公开的构思的修改和变化可由本领域技术人员采取，并且此类修改和变化被视为在本发明的如由描述和随附权利要求限定的范围内。

此外，当以马库什群组(Markush group)或替代物的其他分组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到本发明还由此以马库什群组或其他群组的任何单个成员或成员的子组描述。

应了解，在一些实施方案中，可在描述寡核苷酸或其他核酸的结构时提及序列表中呈现的序列。在此类实施方案中，相较于指定序列，实际寡核苷酸或其他核酸可具有一个或多个替代性核苷酸(例如DNA核苷酸的RNA对应物，或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或一个或多个经修饰核苷酸和/或一个或多个经修饰核苷酸间键联和/或一个或多个其他修饰，同时保持与指定序列基本上相同或类似的互补性质。

除非本文另外指示或由上下文明确反驳，否则在描述本发明的情形下(尤其是在以下权利要求的情形下)使用术语“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”以及类似指示物应解释为涵盖单数与复数两者。除非另外指示，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开端术语(即意指“包括但不限于”)。除非本文另外指示，否则在本文中叙述数值范围仅意图充当单独地提及属于范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值就好像它单独地在本文中叙述一样并入说明书中。除非本文另外指示或另外由上下文明确反驳，否则本文所述的所有方法都可以任何适合顺序进行。除非另外要求，否则对本文提供的任何和所有实例或示例性措辞(例如“诸如”)的使用都仅意图更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围造成限制。说明书中的措辞不应解释为指示任何非要求保护的要素为实施本发明所必需。

本文描述了本发明的实施方案。在阅读先前描述后，那些实施方案的变化形式可变得为本领域普通技术人员显而易知。

发明人预期熟练技术人员在适当时采用此类变化形式，并且发明人意图本发明不同于如本文具体描述的那样加以实施。因此，本发明包括随附于其的权利要求中叙述的主题的如由适用法律所容许的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或另外由上下文明确反驳，否则上述要素以其所有可能的变化形式的任何组合都由本发明涵盖。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图由以下权利要求涵盖。

附录A

Claims (51)

1.一种用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含如以SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788中的任一者阐述的序列。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸还包含有义链，所述有义链包含如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列。

3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述反义链由如以SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788中的任一者阐述的序列组成。

4.如权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链由如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列组成。

5.一种用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含在长度方面是15至30个核苷酸的反义链，其中所述反义链具有与CYP27A1具有互补性的区域，所述区域互补于如以SEQ ID NO:767-781阐述的序列的至少15个连续核苷酸。

6.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述反义链在长度方面是19至27个核苷酸。

7.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述反义链在长度方面是21至27个核苷酸。

8.如权利要求2至4中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链在长度方面是15至50个核苷酸，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。

9.如权利要求5所述的寡核苷酸，其中所述有义链在长度方面是19至50个核苷酸。

10.如权利要求5或6所述的寡核苷酸，其中所述双链体区域在长度方面是至少19个核苷酸。

11.如权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中与CYP27A1具有互补性的所述区域互补于如以SEQ ID NO:767-781阐述的序列的至少19个连续核苷酸。

12.如权利要求5至9中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列。

13.如权利要求10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含如以SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788中的任一者阐述的序列。

14.如权利要求5至9中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链由如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列组成。

15.如权利要求10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链由如以SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788中的任一者阐述的序列组成。

16.如权利要求8至15中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链在它的3′末端包含阐述为S₁-L-S₂的茎-环，其中S₁互补于S₂，并且其中L形成在S₁与S₂之间的在长度方面是3至5个核苷酸的环。

17.一种用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和有义链，

其中所述反义链在长度方面是21至27个核苷酸，并且具有与CYP27A1具有互补性的区域，

其中所述有义链在它的3′末端包含阐述为S₁-L-S₂的茎-环，其中S₁互补于S₂，并且其中L形成在S₁与S₂之间的在长度方面是3至5个核苷酸的环，

并且其中所述反义链和所述有义链形成在长度方面是至少19个核苷酸的双链体结构，但不是共价连接的。

18.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述互补性区域互补于CYP27A1mRNA的至少19个连续核苷酸。

19.如权利要求16至18中任一项所述的寡核苷酸，其中L是四元环。

20.如权利要求16至19中任一项所述的寡核苷酸，其中L在长度方面是4个核苷酸。

21.如权利要求16至20中任一项所述的寡核苷酸，其中L包含阐述为GAAA的序列。

22.如权利要求8至15中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链在长度方面是27个核苷酸，并且所述有义链在长度方面是25个核苷酸。

23.如权利要求22所述的寡核苷酸，其中所述反义链和所述有义链形成在长度方面是25个核苷酸的双链体区域。

24.如权利要求19所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸还在所述反义链上包含在长度方面是两个核苷酸的3′-突出部分序列。

25.如权利要求8至15中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含各自在长度方面在21至23个核苷酸的范围内的反义链和有义链。

26.如权利要求25所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含在长度方面在19至21个核苷酸的范围内的双链体结构。

27.如权利要求25或26所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含在长度方面是一个或多个核苷酸的3′-突出部分序列，其中所述3′-突出部分序列存在于所述反义链、所述有义链、或所述反义链和所述有义链上。

28.如权利要求25或26所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含在长度方面是两个核苷酸的3′-突出部分序列，其中所述3′-突出部分序列存在于所述反义链上，并且其中所述有义链在长度方面是21个核苷酸，并且所述反义链在长度方面是23个核苷酸，以致所述有义链和所述反义链形成在长度方面是21个核苷酸的双链体。

29.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷酸。

30.如权利要求29所述的寡核苷酸，其中所述经修饰核苷酸包含2′-修饰。

31.如权利要求30所述的寡核苷酸，其中所述2′-修饰是选自以下的修饰：2′-氨基乙基、2′-氟基、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基、和2′-脱氧-2′-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。

32.如权利要求29至31中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸都是经修饰的。

33.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷酸间键联。

34.如权利要求33所述的寡核苷酸，其中所述至少一个经修饰核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。

35.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链的5′-核苷酸的糖的4′-碳包含磷酸酯类似物。

36.如权利要求35所述的寡核苷酸，其中所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。

37.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸缀合于一个或多个靶向配体。

38.如权利要求37所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。

39.如权利要求38所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。

40.如权利要求39所述的寡核苷酸，其中所述GalNac部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分、或四价GalNAc部分。

41.如权利要求16至19中任一项所述的寡核苷酸，其中所述茎-环的L的多达4个核苷酸各自缀合于单价GalNAc部分。

42.如权利要求37所述的寡核苷酸，其中所述靶向配体包括适体。

43.一种组合物，所述组合物包含前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸和赋形剂。

44.一种将寡核苷酸递送至受试者的方法，所述方法包括将权利要求43所述的组合物施用至所述受试者。

45.一种减弱受试者的肝中的胆汁酸积累的方法，所述方法包括将权利要求43所述的组合物施用至所述受试者。

46.一种降低有需要的受试者中的肝纤维化的程度的方法，所述方法包括将权利要求43所述的组合物施用至所述受试者。

47.一种降低有需要的受试者中的循环胆汁酸浓度的方法，所述方法包括将权利要求43所述的组合物施用至所述受试者。

48.如权利要求35至47中任一项所述的方法，其中所述受试者罹患肝胆疾病。

49.一种用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含在长度方面是15至50个核苷酸的有义链和在长度方面是15至30个核苷酸的反义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域，其中所述有义链包含如以SEQ ID NO:577-578、581-597、759-762、785和787中的任一者阐述的序列，并且其中所述反义链包含选自SEQ ID NO:579-580、598-614、763-766、786和788的互补性序列。

50.一种用于降低CYP27A1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含选自附录A中阐述的表格的一行的一对有义链和反义链。

51.如权利要求35至47中任一项所述的方法，其中所述受试者罹患PNALD。

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