MXPA01012317A - Prueba de aciltransferasa del diacilglicerol (dgat). - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para medir la actividad acetiltransferasa del diacilglicerol (DGAT) que usa un sistema de solventes novedosos para reducir y/o eliminar las actividades de los compuestos relacionados. La presente invencion tambien describe un metodo para determinar si un compuesto es util para modular la actividad biologica DGAT. El metodo es capaz de ser usado para el analisis en masa de los compuestos como moduladores de la actividad biologica de DGAT.

Description

PRUEBA DE ACILTRANSFERASA DEL DIACILGLICEROL (DGAT) CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención generalmente proporciona un método para medir la actividad biológica de la aciltransferasa del diacilglicerol. (DGAT). Especialmente, la presente invención proporciona un método para analizar en rápidamente masa los compuestos que son capaces de modular la actividad biológica de DGAT. Más específicamente, la presente invención proporciona un sistema de prueba para medir la actividad DGAT que permite una mayor actividad DGAT mientras que se eliminan las actividades de la aciltransferasa de etanol (EAT) y la acilo CoA:aciltransferasa (ACAT) así como reducir significativamente la actividad acilhidrolasa grasa (AH).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hipertrigliceridemia es un factor de riesgo para el desarrollo de las enfermedades cardiovasculares (Gaziano J., Hennekens C, O'Donnell C, Breslow J., Buring J. Fasting triglicéridos, lipoproteínas de alta densidad y riesgo de infarto al miocardio. La circulación 1997;96:2520-2525). Los triglicéridos (TG) también juegan un rol importante en la carga de grasa de adipositos (Coleman R., Bell R. Síntesis de triacilglicerol en células grasas aisladas. J. Biol.

Chem. 1976;251 :4537-4543) y por lo tanto juegan un rol principal en la obesidad. Adicionalmente, los triglicéridos se requieren para el montaje de las lipoproteínas que contienen apoB-100 tales como VLDL y LDL (Bostrom K., Boren J„ Wettesten M., et al. Los estudios en el montaje de las lipoproteínas que contienen el apo B-100 en las células HepG2. J. Biol. Chem. 1998;263:4434- 4442; Pullinger C, North J. Teng B., Rifici V., Ronhild de Brito A; Scott J. El gen B de la apoliproteína se expresa constitutivamente en las células HepG22: regulación de la secreción mediante ácido oleico, albúmina e insulina y la medición de la media vida del mARN, J. Lipid. Res. 1989; 30:1065-1077). Consecuentemente, existe un interés considerable en el desarrollo de terapias para bajar los niveles de triglicéridos. La enzima conocida por catalizar la etapa cometida/final en la biosíntesis de triglicéridos es la aciltransferasa de diacilglicerol (DGAT) I ..A & yx.?LÁyyLy k? (Coleman R. Aciltransferasa del diacilglicerol y la aciltransferasa de monoglicerol del hígado y el intestino. Methods in Enzymology 1992;209:98-104). El DGAT cataliza la transferencia de la coenzima A de los ácidos grasos activados a la posición 3 de los 1 ,2-diacilgliceroles, que forman una molécula de triglicéridos (Lehner R; Kuksis A. Biosíntesis de triacilgliceridos. Prog. Lipid Res. 1996;35 (No. 2):169-201 ; Bell R. Enzimas de la síntesis de glicerolípidos en eucariotas. Ann. Rev. Biochem 1980;49:459-487). Por lo tanto, la inhibición de ia actividad DGAT debería conducir a la producción disminuida de triglicéridos a través de esta vía, que resultaría en la baja concominante del plasma VLDL/LDL y posiblemente se incrementa en el HDL. Sin embargo, un análisis en masa para el aislamiento de los inhibidores DGAT específicos no se ha establecido anteriormente debido a las dificultades técnicas asociadas con el establecimiento de dicha prueba.

Las pruebas DGAT convencionales tienen bajas actividades en el orden de pmoles TG/min/mg de la proteína microsomal y están contaminadas por los productos de varias otras reacciones enzimáticas. Por lo tanto, el producto de la reacción de DGAT catalizado, usualmente se resuelve mediante el análisis TLC, que es impráctico para usarse en un análisis de masa. Se ha descrito previamente un método que usa solventes orgánicos para extraer el TG que generó el DGAT a partir de microsomas aislados (Coleman R.A. Aciltransferasa de Diacilglicerol y aciltransferasa de monoacilglicerol del hígado y del intestino. Meth. Enzymology 1992;209:98-104). Sin embargo, varias etapas se involucran en la extracción haciendo esta técnica muy difícil para adaptar a un análisis de masa. Los solicitantes han desarrollado un sistema solvente que comprende acetona:cloroformo o etanol cloroformo que aprovecha dramáticamente la actividad DGAT mientras que suprime simultáneamente la actividad de las enzimas de interferencia. Además, se ha desarrollado el método de extracción de 1 -etapa que específicamente extrae el TG de la mezcla de reacción catalizada. Para analizar los moduladores de ia actividad DGAT, los solicitantes han modificado la prueba DGAT de la presente ¡nvención y han alterado el método de extracción de 1 -etapa de la presente invención dentro de un formato de 96 pozos que permite un análisis de alto rendimiento de los compuestos/moduladores. Estas modificaciones permiten que la prueba DGAT sea automatizada, es decir, se lleva a cabo mediante un robot.

^- ,? SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para medir la actividad de la acetiltransferasa de diacilglicerol (DGAT) que usa un sistema solvente novedoso para reducir y/o eliminar las actividades de los compuestos de interferencia o relacionados.

La presente invención también describe un método para determinar si un compuesto es útil para la modulación de la actividad biológica DGAT. El método es capaz de ser usado para el análisis en masa de los compuestos como moduladores de la actividad biológica del DGAT.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra las gráficas de los efectos de varios solventes en las actividades de la enzima microsomal incluyendo el DGAT, en donde (A) muestra los efectos del etanol en las actividades microsomales; (B) muestra los efectos de la acetona en la actividad GDAT; (C) muestra los efectos del cloroformo en la actividad DGAT y (E) muestra los efectos de la acetona y el cloroformo en la actividad DGAT. Todas las prueba se realizaron a 37° C por 5 minutos usando 40 µg de proteína microsomal (etanol, cloroformo, etanokcloroformo) o 1.25 µg de proteína microsomal (acetona, acetona:cloroformo), 33.3 nCi de [14C]oleoil CoA, 403 µM de 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol y etanol, acetona y cloroformo en las concentraciones indicadas para cada reacción. N-(7,10-Dimetil-11-oxo-10,11-dihidro-dibenzo[b,f][1,4]-oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida se realizó en DMSO por 100 veces y se diluyó a las concentraciones finales indicadas. Los valores representan los promedios, n = 3 ± SEM, en donde: A = % de Control B = Etanol (porcentaje) C = Acetona (%) D = Cloroformo (%). ?- á ¿ & A. A¿Ü . „ £ i -í i i La Figura 2 muestra varias pruebas DGAT comparando (A) 0.8 % de etanol; TLC; (B) 0.8 % de etanol, extracción 1-etapa, TLC; (C) 2.1% de acetona loroformo (8:2), TLC; (D) 2.1 % acetona cloroformo (8:2), extracción 1 -etapa, TLC, en donde: E = Ester del colesterol F = Ester del acilo etílico G = Ácido graso H = Triglicéridos I = Acilo CoA y Fosfolípidos.

La Figura 3 es una gráfica que ilustra el porcentaje de inhibición (J) de la actividad DGAT por el compuesto N-(7,10-dimetil-11-oxo-10,11-dihidro-dibenzo[b,f|[1 ,4]-oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida (K) usando varios solventes incluyendo el 0.8 % de etanol y 2.1 % de acetona cloroformo (8:2) y también comparando el TLC en contra de la extracción de 1 -etapa. Las pruebas se realizaron a 37° C por 5 minutos usando 40 µg de proteína microsomal, 20 nCi [14C]oleoil CoA y 403 µM de 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol por reacción para 0.8 % de etanol y 1.25 µg de proteína microsomal, 8.3 nCi [14C]oleoil CoA y 403 µM de 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol por reacción para 2.1 % de acetona:cloroformo. Los valores representan los promedios, n = 3 ± SEM.

La Figura 4 muestra el efecto de N-(7,10-dimetil-11-oxo-10,11-dihidro-dibenzo[b,f]oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida (K) en la actividad DGAT del (A) Grupo 1 , (B) Grupo 2, Grupo 3 y (C) Grupo 4 en las preparaciones de microsomas del hígado de ratas que contienen TLC, extracción etapa 1/TLC y el conteo por destello/extracción 1-etapa. Las pruebas se desarrollaron a 37° C por 5 minutos usando 1.25 µg de la proteína microsomal, 8.3 nCi [14C] oleoil CoA y 403 µM 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol por reacción. Se midió el [14C]triglicérido mediante solo el TLC, extracción de 1 -etapa y TLC o extracción de 1 -etapa y conteo por destello. Los valores representan los porcentajes (J), n = 3 ± SEM. - » _. **• -*, La Figura 5 muestra el efecto del tiempo (T) y la temperatura en la actividad DGAT. Las ¡>as se desarrollaron a 22° C o 37° C para los tiempos indicados usando 1.25 µg de proteína microsomal, 8.3 nCi [14C]oleoil CoA y 403 µM de 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol por reacción. Los valores representan los promedios, n = 3 ± SEM, en donde: S = Producción de Triglicéridos.

La Figura 6 muestra los efectos de DMSO (P) en la actividad DGAT. Las pruebas se realizaron a 22° C durante 20 minutos o 37° C durante 5 minutos usando 1.25 µg de la proteína microsomal, 8.3 nCi[14C]oleo¡l CoA, 403 µM de 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol por reacción y DMSO en las concentraciones indicadas. Los valores representan los promedios, n = 3 ± SEM, en donde: S = Producción de Triglicéridos.

La Figura 7 muestra el efecto de la Mezcla de Solución de Término Etanol Alcalino (AESSM) en la estabilidad del [14C]trigl?cérido producido en la prueba DGAT. Las pruebas se realizaron a 37° C por 5 minutos usando 1.25 µg de la proteína microsomal, 8.3 nCi [14C]oleoil CoA y 403 µM 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol por reacción. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 150 µl de AESSM y se incubaron en los tiempos indicados a temperatura ambiente. Los valores representan porcentajes, n = 3 ± SEM, en donde: T = Tiempo Q = % de Control de Tiempo Cero.

La Figura 8 muestra el efecto de N-(7,10-dimetil-11-oxo-10,11-dihidro-dibenzo[b,f][1,4]oxazepin-2-¡l)-4-hidroxi-benzamida (K) en la actividad DGAT como se midió mediante la extracción del análisis de masa de 96 pozos y la extracción manual. Las pruebas se realizaron a 22° C durante 60 minutos usando 1.25 µg de proteína microsomal, 8.3 nCi [14C]oleoil CoA y 403 µM de 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol por reacción. Los valores para la extracción de la placa representan los promedios, n = 6 ± SEM para la placa y n = 8 ± SEM para la placa 2. Los valores para la extracción manual representan los promedios, n = 2 ± SEM, en donde: J = % de inhibición.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para medir la actividad biológica de la acetiltransferasa de diacilglicerol (DGAT) en una prueba que permite la actividad DGAT incrementada mientras que al mismo tiempo la reduce considerablemente y/o elimina la actividad de otros productos de reacción o los productos de interferencia.

Por "actividad DGAT" se establece la transferencia de la coenzima A de ácidos grasos activados en la posición 3 de los 1 ,2-diacilgliceroles, que forman la molécula del triglicérido.

Como se usa en este documento, el término "triglicérido" (triacilglicerol o grasa neutral) se refiere a un triéster de ácido graso. Los triglicéridos son típicamente no polares e insolubles en agua. Los fosfoglicéridos (o glicerofosfolípidos) son componentes líquidos principales de las membranas biológicas. Los aceites y grasas en animales comprenden mezclas mayores de triglicéridos.

Como se usa en este documento, el término "modulado" significa incrementar o disminuir una función. Preferiblemente, un compuesto que modula la actividad DGAT (es decir, niveles de triglicéridos) lo hace tan cerca en al menos 10%, más preferiblemente en al menos 25% y más preferiblemente en al menos 50% y puede definirse como un "modulador" de la actividad DGAT.

El método generalmente incluye las etapas de combinar al menos un sustrato DGAT con los microsomas del hígado que tienen DGAT asociado en los mismos. Los sustratos DGAT y los microsomas se incubaron de manera conjunta por un determinado periodo de tiempo. Los sustratos preferidos para la presente invención son un 1 ,2-diacilglicerol y un ácido graso activado con la coenzima A. El método de la presente invención preferiblemente usa 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol y oleoil CoA como los sustratos DGAT.

La terminación de la reacción de DGAT con sus sustratos puede llevarse a cabo mediante la adición de una solución que comprende aproximadamente 12.5 % de etanol absoluto, aproximadamente 10% de agua deionizada, aproximadamente 2.5% de NaOH 1 N y aproximadamente 75% de una solución que comprende aproximadamente 78.4 % de ¡sopropanol, aproximadamente 19.6 % de n-heptano y aproximadamente 2.0 % de agua deionizada.

Siguiendo la terminación de la reacción, la fase superior (n-heptano) se analizó por la presencia de triglicéridos como un indicador de la actividad biológica DGAT. La presencia de triglicéridos puede detectarse y medirse mediante el uso de las placas de formación de imágenes de fósforo o medíante el uso del conteo por destello. Preferiblemente, la fase superior se transfiere a una placa de formación de imágenes de fósforo, preferiblemente una PLACA DE DESTELLO (NEN Life Sciences, Inc., Boston, MA) que es una placa de 96 pozos o un soporte sólido comprendido de una microplaca de poliestireno blanca en la cual el interior de cada pozo se cubre con una capa delgada de centelleo con base de poliestireno.

Este proceso puede realizarse mediante máquinas automatizadas o robots para incrementar la proporción en la cual las muestras pueden analizarse. En la presente invención, como se señaló anteriormente, los sistemas de solventes novedosos se usan para disolver los sustratos DGAT. Estos sistemas de solventes particulares conceden propiedades ventajosas y novedosas al método de la presente invención. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, actividad DGAT mejorada, selectividad DGAT mejorada y la habilidad para usar una extracción de 1 -etapa en el método de la presente invención.

La DGAT tiene actividad significativamente mejorada con etanol como el solvente entre 0.5% a 4.0 % con acetona entre 2.5 % a 10%, con cloroformo entre 0.2 % a 0.4 % y las ,t I A. .A ? .?. «-A— combinaciones de etanol y cloroformo, 0.2% a 2.0 % y 0.1 % a 0.6%, respectivamente y en la combinación de acetona y cloroformo, 1.0% a 5.0% y 0.1% a 0.8%, respectivamente. Cuando se compara a 0.8% de Tween 80 del solvente inicial usado para 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol en la prueba DGAT, la actividad DGAT para 0.8% de etanol, 10% de acetona, 0.4% de cloroformo, 2.1 % de acetonacloroformo (8:2) y 0.8% de etanohcloroformo (1 :1 ) incrementó 5.3-, 484-, 463-, 1057- y 1 ,143-veces, respectivamente. La combinación de acetona cloroformo tiene la ventaja adicional de eliminar las actividades EAT y ACAT así como reducir significantemente la actividad FAAH por 9.4 veces. Usando los solventes acetonacloroformo, el método de extracción de 1 -etapa en la presente invención es capaz de extraer solamente los triglicéridos de la prueba DGAT.

El método de la presente invención también puede modificarse con el fin de determinar si un compuesto es útil para modular la actividad biológica DGAT. Para averiguar la capacidad de un compuesto para modular la actividad biológica DGAT, un compuesto para analizarse por su habilidad para modular la actividad DGAT se combina con los sustratos DGAT y los microsomas. Las etapas restantes del método son idénticas a aquellas descritas anteriormente para la prueba DGAT. La habilidad del compuesto para modular la actividad biológica DGAT puede determinarse mediante un cambio en la actividad biológica, relativa a un control no contactado con el compuesto, que indica que el compuesto modula la actividad biológica DGAT. Esto es, el incremento, disminución o falta de cambio en la producción de triglicéridos a partir de la combinación de DGAT con los sustratos de DGAT, proporciona una medición cuantificable y directa del efecto que un compuesto de prueba que esta en la actividad DGAT biológica.

Los siguientes ejemplos además ilustran la presente invención. Estos ejemplos son solo ilustrativos de la presente invención y no son limitantes. ? -i. > J ¿ .i.?,MAy y ?á EJEMPLOS MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos y Químicos El [14C]Oleoil CoA y el trioleato de [14C]glicerol se obtuvieron de Amersham (Buckinghamshire, England).

La acetona, el cloroformo, el metanol, el isopropanol, el etanol, el éter dietílico, el N-heptano, el isooctano, el ácido glacial acético, el HCl, la sucrosa, el BSA libre de ácidos grasos , la solución de NaOH al 50%, el DMSO, KCl, CaCI2, MgCI2, 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri). 1.0 M de HCl Tris, pH 7.4 se obtuvieron de Digene (Beltsville, Maryland). 0.5 M de EDTA, pH 8.0 se obtuvo de Ambion (Austin, Texas).

Todos los estabilizadores se esterilizaron-filtraron usando un filtro de 0.22-µ antes de usarse. N-(7,10-Dimetil-11 -oxo-10, 11 -dihidro-dibenzo[b,f][1 ,4[-oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida (Química, PGRD, Ann Arbor, Michigan). La prueba de proteínas De se obtuvieron de BioRad (Hercules, California).

Se obtuvieron placas de 20 x 20 cm de Whatman LK6D de Sílica Gel 60 A TLC, placas de polipropileno de 96 pozos Costar 3794 y placas de polipropileno de 96 pozos medios Costar 3956 de VWR (Chicago, Illinois).

Las FLASHPLATES® se obtuvieron en NEN Life Science Products, Inc., (Boston, Massachussets).

N ' *-***-* » m»ttik» . «. „¿ ..a. .,^¡Í. -, . . ... .

Los depósitos de reactivos robóticos se obtuvieron en Tom Tec Instrumentation (Hamden, Connecticut).

Animales Se obtuvieron ratas macho Sprague-Dawley (Rattus rattus), 350 a 400 g, en Charles River (Willmington, Maryland). Las ratas se alojaron en una Asociación para la Valoración y Acreditación de la instalación acreditada del Laboratorio de Cuidado Animal Internacional y se alimentaron con una dieta de comida por 2 semanas antes de la recolección.

Instrumentación Homogenizadores: Politrón PT 3100; Gerald K. Séller Co., GT-21 Mezclador/Homogenizar Centrífuga: Beckman/Contador Avanti J-301 Ultracentrífugo: Beckman L8-80 M Espectrofotómetro de Microplacas: Dispositivos Moleculares Espectra Max Plus Incubación: Termociclizador Perkin Elmer 9600 Horno de Convección de Gravedad, 1310, VWR Formador de imágenes de fósforo: Formador de imágenes de fósforo de 860 Storm Molecular Dynamics Multimek 96 Robotic Pipetar, Beckman/Coulter Saigen Carousels, Beckman/Coulter Brazo Robótico Orea, Beckman/Coulter Sellador de Placas Saigen Modelo 041-03-00043, Beckman/Coulter Topcount NXT, Contador de Luminiscencia y Centelleo de Microplacas, Packard Instrument Company Programa Beckman/Sagian Core Systems, Beckman/Coulter Aislamiento de Microsomas Método de Gradiente de Sucrosa Se les aplicó la eutanasia a las ratas usando una fijación de C02, sus hígados fueron inmediatamente removidos y colocados en un estabilizador de microsomas en hielo (estabilizador MC) que consiste de 125 mM de sucrosa, 3.0 mM de imidazola, pH 7.4. Los hígados se cortaron en 5 aproximadamente 10 piezas, se colocaron en 20 ml de estabilizador MC frío en hielo por hígado y se homogeneizaron en hielo en un homogeneizador de polvo Dounce de vidrio usando 10 líneas arriba y abajo. Los homogenatos se centrifugaron a 1700 rpm en un rotor Beckman JA-14 durante 10 minutos a 4° C. El sobrenadante se removió y se colocó en hielo El granulo se resuspendió en 4.0 ml de estabilizador MC por hígado, se rehomogeneizaron como se describió anteriormente y se 10 centrífugo a 1700 rpm en un rotor Beckman JA-14 durante 10 minutos a 4° C. Este supernadante se combinó con el supernadante previo y se centrífugo a 13,000 rpm en un rotor Beckman JA-14 por 20 minutos a 4° C. El supernadante se transfirió a nuevos tubos en hielo y el granulo se desechó. El supernadante se centrífugo a 35,000 rpm en un rotor Beckman Ti-70 durante 60 minutos a 4° C y el granulo resultante, que contiene membranas microsomales se resuspendió en 15 estabilizador MC en hielo usando 17 líneas de un homogeneizador para polvo Dounce de vidrio. Las concentraciones de proteína Microsomal se determinaron mediante la Prueba de Proteínas De y la BSA se usó para generar la curva estándar. Los microsomas se diluyeron a la concentración final de 10 a 20 mg/ml. Las microsomas se colocaron en alícuotas dentro de tubos de 1-0 ml y se almacenaron en un crio-congelador de líquidos N2. 20 Prueba de Enzima DGAT Reactivos Estabilizador de Prueba DGAT (DAB): 0.25 M de sucrosa, 1.0 mM de EDTA, pH 8.0, 150 mM de HCl Tris, pH 7.4 y 1.25 mg/ml de BSA libre de ácido graso. 25 Mezclas del Sustrato de Prueba DGAT El [14C]Oleoil CoA y 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol se disolvió en solventes (Tween 80, etanol no desnaturalizado 100%, acetona, cloroformo, acetona loroformo, etanolcloroformo) se diluyeron i^fypiffl dentro de DBA en las concentraciones indicadas, la solución se revolvió y se conservo en hielo hasta que se realizó la prueba.

Los compuestos se disolvieron en DMSO y se diluyeron para hacer 10x con DAB (compuesto 10x) y se conservó a temperatura ambiente hasta que se realizó la prueba.

Las alícuotas de los microsomas (10-20 mg/ml de la proteína total) se descongelaron sobre hielo y se diluyeron para hacer una existencia de trabajo en las concentraciones indicadas con el estabilizador MC y se almacenaron en hielo hasta usarse.

Soluciones de la Extracción de 1 -Etapa Solución de Termino: 78.4 % de isopropanol, 19.6% de n-heptano y 2.0% de DI H20 se realizó por adelantado y se almacenó en contenedores sellados herméticamente a temperatura ambiente por más de 1 mes.

La Mezcla de Solución de Termino de Etanol Alcalino (AESSM): 12.5% de etanol desnaturalizado al 100%, 10.0 % de DI H20, 2.5% de 1.0N de NaOH, 75.0% de la Solución de Término, se realizó previamente antes de la prueba y se almacenó a temperatura ambiente.

Procedimiento de Reacción La prueba de reacción DGAT se realizó como sigue: 5 µl del compuesto 10x se agregó a los tubos de reacción de pared delgada Perkin seguido por 35 µl de la mezcla del sustrato DGAT y se revolvieron. La reacción se inició mediante la adición de 10 µl de los microsomas 5x diluidos, se revolvieron y se incubaron en un termociclizador Perkin Elmer 9600 por los tiempos y temperaturas indicados.

Separación de Triqlicéridos -. .». . *»..« A . ...-. . . . ---""» * •* Método TLC Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 µl de 0.75 N de HCl. Las muestras posteriormente se observaron dentro de placas TLC y se secaron en un horno de convección de gravedad a 70° C durante 30 minutos. Las placas se desarrollaron en una cámara TLC de 27 x 7.5 x 26 cm durante 60 minutos a temperatura ambiente en 102 ml de isooctano:éter etílico:ácido acético (75:25:2) para la determinación de triglicéridos. Las placas TLC se removieron de la cámara, se secaron en un horno de convección de gravedad a 70° C durante 30 minutos, se envolvieron en celofán y se expusieron a las placas para imágenes de fósforo durante la noche. Las placas de las imágenes de fósforo se analizaron en un aparato para imágenes de fósforo y las imágenes se analizaron usando el programa ImageQuant. Un trioleato de[ 4C]glicerol estándar se trituró en placas TLC para determinaciones de masa. Todas las estadísticas se realizaron usando el programa de análisis de Microsoft Excel usando una prueba T de dos opciones para la media.

Método de Extracción de 1 -Etapa Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 150 µl de AESSM seguido por la adición de 300 µl de n-heptano. La mezcla se entubó de 5x para mezclar y permitir separar por 5 minutos a temperatura ambiente. La fase superior total, la fase n-heptano se removió a tubos nuevos y se colocaron en placas de TLC sílica y se procesaron como se describió anteriormente (ver el método TLC) o se colocaron dentro de ampolletas de destello de 5 ml que contenían el cóctel de destello y se contaron.

Prueba de Análisis en Masa DGAT de 96 Pozos Reactivos La mezcla del sustrato DGAT consiste de [14C]oleoil CoA 50 µCi/ml diluido a 278 nCi/ml y 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol dísuelta en acetonacloroformo (8:2) 19.5 mM, se diluyó a 672 nM dentro de DAB, se revolvieron y se almacenaron en hielo hasta que la prueba se realizó.

Las alícuotas congeladas de los microsomas (10-20 mg/ml de la proteína total) se descongelaron en hielo y se diluyeron para hacer una existencia de trabajo de 0.0625 mg/ml con DAB y se almacenaron en hielo hasta que se realizó la prueba.

Protocolo de Reacción Los compuestos se ordenaron en Compound Management, PGRD, Ann Arbor, se disolvieron en DMSO a 10 mM con 1.0 µl, se colocaron dentro de placas de polipropileno inferiores de 96 pozos redondas. Las placas se cargaron dentro del carrusel robótico. El brazo robótico transfirió las placas a un multidrop 1 para la adición de 30 µl de la mezcla del sustrato y se agitó por 1.0 minutos a temperatura ambiente. El brazo robótico transfiere la placa al multidrop 2 para la adición de 20 µl de los microsomas diluidos y se agitó por 1.0 minutos a temperatura ambiente. El brazo robótico transfiere al reverso de la placa al carrusel en donde se incuba por 1.0 horas a temperatura ambiente.

Protocolo de Extracción El brazo robótico transfiere la placa al multidrop 3 para la adición de 150 µl de AESSM. EL brazo robótico transfiere la placa al multimek para iniciar la extracción. El volumen de reacción se transfiere a una placa de extracción de polipropileno de 96 pozos medios en el multimek. Las puntas se lavaron con 3 x 100 µl de DI H20 en un depósito de reactivos con un flujo continuo de Di H20. El multimek posteriormente lava la placa de reacción de 96 pozos con 3 x 100 µl de n-heptano y transfiere el volumen a la placa de extracción. El multimek mezcla el volumen en la placa de extracción 6 x 100 µl y las placas se asientan por 10 segundos. Las puntas se lavaron 3 x 100 µl de DI H20 en un depósito de reactivos a flujo constante. Un ciento de microlitos de la fase superior de n-heptano se transfirió a una placa de destello. El brazo robótico transfiere la placa de destello a un carrusel entubado a un gancho humeante, que permite que el n-heptano se evapore por un mínimo de 6 horas. Las placas se transfirieron un sellador de placas para sellarse, se transfirieron al contador de destello para la cuenta superior y se contó por 1.0 minutos. Los datos se colectaron y se reportaron al Trillium basado en el sistema de manejo de compuestos. i l l l EJEMPLO 1 Solventes DAG La actividad DGAT se midió usando las cantidades de incremento de estos solventes DAG: etanol, acetona, cloroformo y las combinaciones de etanolcloroformo o acetonacloroformo, en donde las concentraciones de etanol y acetona se mantuvieron constantes mientras que las concentraciones de cloroformo se incrementaron. La actividad DGAT se incrementa con las concentraciones incrementadas de etanol, R2 = 0.9626, con un incremento significante de 121 % del control anterior a 0.5% de etanol, p = 0.013 a un nivel de 180% de los controles anteriores a 4.0% de etanol, p = 0.005 (Figura 1A). La actividad DGAT también se incrementa con las concentraciones de incremento de acetona, R2 = 0.9901 a un nivel de 394% de los controles anteriores a 10.0% de acetona, p = 0.0006 (Figura 1 B). La actividad DGAT se incrementa con las concentraciones de incremento de cloroformo, R2 = 0.9763 a un nivel de 955% de control a 0.35% de cloroformo, p = 0.0004 (Figura 1C). Cuando se usa la combinación de etanoicloroformo, mantener la actividad de DGAT a 1.5% se incrementa con las concentraciones de incremento de cloroformo, R2 = 0.9866 y logra un nivel de 1436% del control anterior a 6.0% del cloroformo, p = 0.0012 (Figura 1D). Cuando se usa la combinación de la acetonacloroformo, la actividad DGAT, con 1.67 % de acetona, se incrementa con las concentraciones de incremento del cloroformo, R2 = 1.000 y se logra un nivel de 581% del control anterior a 0.8% de cloroformo, p = 0.003, a pesar de que el incremento cesa para ser lineal pasando el 0.4 % de cloroformo. El beneficio del cloroformo se disminuye a medida que la concentración de acetona se incrementa arriba de 1.67% (Figura 1 E).

Las cantidades conocidas de un [14C]triacilglicerol (TAG), también conocidas como triglicéridos estándares se colocaron en placas TLC junto con la reacción DGAT, para determinar la proporción de la producción de [14C]TAG usando los varios solventes DAG. La producción del [14C]TAG oscilado de 20 ± 0.02 pmoles, 104 ± 0.4 pmoles, 9.5 ± 0.06 nmoles, 20.9 ± 0.025 nmoles y 22.5 + 0.58 nmoles [14C]TAG/mg proteína del microsoma/minuto por 0.8 % de Tween 80, 0.8% de etanol, 10% de acetona, 2.1% de acetonacloroformo (8:2) y 0.8% de etanolcloroformo 1 :1 , . . .¿ .rt ? J.: .i .íst?. respectivamente (Tabla 1 ). Todos los valores estuvieron significativamente arriba o abajo del control de etanol, p < 0.001.

Con relación al Tween 80, todos los otros solventes incrementaron la actividad de DGAT con lo más dramático siendo observado por la combinación de acetona/cloroformo o 95% de etanol/cloroformo, 1057 y 1142-veces, respectivamente. Sin embargo, la acetonacloroformo (8:2) tiene una mayor ventaja de eliminación de la actividad ACAT y EAT y reducir la actividad FAH 9.4 veces (Figura 3A) y (Figura 3C). Estos beneficios permiten que la concentración microsomal se reduzca 32 veces y la concentración del sustrato [14C]oleoil CoA podrá disminuirse 12 veces de las condiciones iniciales usadas para probarse con DGAT.

A pesar de que la actividad DGAT varió dramáticamente con los diferentes solventes, el IC50 del compuesto de referencia, N-(7,10-dimetil-11-oxo-10,11-dihidro-dibenzo[b,f][1 ,4]oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida, fue relativamente constante en el rango de entre 2.0 y 2.6 µM (Tabla 2).

EJEMPLO 2 Comparación de los Solventes DAG de Etanol y Acetona:Cloroformo (8:2) Usando TLC y los Métodos de Extracción de 1 -Etapa ACAT, EAT, FAH y DGAT son activos en la presencia del 0.8% de etanol (Figura 3A). Cuando se usa el protocolo de extracción de 1 -etapa, los productos de ACAT, esteres de colesterol y los esteres de etil acilo junto con los triglicéridos de DGAT se extrajeron (Figura 3C). Usando 2.1% de acetonacloroformo (8:2) elimina los productos de ACAT y EAT y reduce grandemente la actividad de FAH, por lo tanto incrementando la disponibilidad del sustrato para DGAT (Figura 3C). Usando 2.1% de acetonacloroformo (8:2) en combinación con el método de extracción de 1-etapa permite la producción específica y la extracción de los triglicéridos [1 C] marcados por DGAT (Figura 3D). El IC50 del compuesto de referencia para la inhibición DGAT, N-(7,10-dimetil-11-oxo-10,11-dihidro-dibenzo[b,f][1 ,4]oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida, oscila de 2.6 µM para la prueba DGAT que corre con 0.8% de etanol y TLC, 2.4 µM para 0.8 % de etanol extraído y corrido en TLC, *••*- * * • «-**«»"--» — 2.0 µM para 2.1% de acetonacloroformo (8:2) y TLC para 2.5 µM para 2.1% de acetonacloroformo (8í2) extraído y corrido en TLC (Figura 3).

EJEMPLO 3 Efecto de N-(7,10-Dimet¡l-11-oxo-10,11-dihidro-dibenzo[b,f][1,4]oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida en la Actividad DGAT a partir de Cuatro Preparaciones de Microsoma de Hígado de Rata Separados Comparando los Métodos de Destello/Extracción de 1 -Etapa, TLC/Extracción de 1 -Etapa y TLC Cuatro preparaciones de microsoma de hígado de rata separadas se usaron en una prueba para comparar el TLC y los métodos de extracción de 1 etapa, así como comparar el aparato de imágenes de fósforo y los métodos de destello para detectar el [14C]triglicérido mientras que se usa la N-(7,10-dimetil-11-oxo-10,11-díhidro-dibenzo[b,f][1 ,4]oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida. El IC50 para los Grupos 1 ,2,3 y 4 cambiados solo marginalmente entre el método TLC solo, los métodos de extracción de 1 etapa/TLC y el método de destello/extracción de 1 -etapa (Figura 4 y Tabla 2).

EJEMPLO 4 Tiempo y Temperatura en la Prueba DGAT Cuando se corre la prueba DGAT a 22° C por 2 horas, la producción de [14C]triglicérido incrementa en una manera lineal arriba de los 70 minutos, R2 = 0.9760 y procede al nivel fuera de los 70 minutos a los 120 minutos finales. Cuando se corre la prueba DGAT a 37° C por 2 horas, la producción de [14C]triglicéridos se incrementa en una manera lineal por más de 25 minutos, R2 = 0.9758 y procede al nivel pasando los 25 minutos hasta 120 minutos (Figura 5).

EJEMPLO 5 Efecto de DMSO en la Actividad DGAT El DMSO disminuye la actividad DGAT en una manera lineal cuando DGAT se prueba en aproximadamente 37° C, R2 = 0.8566 y 22° c, R2 = 0.7907. Para tanto 37° C y 22° C, la prueba DGAT mostró solo cambios significantes cuando la concentración DMSO alcanzó el 45%, p < 0.05 (Figura 6).

EJEMPLO 6 Efecto de la Mezcla de la Solución para la Detención del Etanol Alcalino (AAESS) en la Estabilidad de [14C]Triglicérido Producido en la Prueba DGAT Durante la corrida del método de Análisis de Masa DGAT de 96 pozos, la reacción DGAT se terminó mediante la adición de AAESS, que contiene 1.ON de NaOH y posteriormente se incuba por un período de tiempo, menos de 5 minutos, mientras que el robot transporta la placa para extracción. Los triglicéridos son susceptibles a la hidrólisis en un ambiente básico, así podría encontrarse en AAESS. Cuando los productos de reacción DGAT se incubaron a 22° C en la presencia del AAESS, antes de la extracción, el [14C] triglicérido producido en la prueba mostró disminución no significante para las incubaciones arriba de los 20 minutos, R2 = 0.1225, p > 0.05 (Figura 7).

EJEMPLO 7 Efecto de N-(7,10-Dimetil-11-oxo-10,11-dihidro-dibenzo[b,f][1,4]oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida en la Actividad DGAT usando el Método de Análisis en Masa DGAT de 96 pozos Comparado a la Extracción Manual El protocolo de extracción del análisis en masa se corrió en dos placas separadas de 96 pozos, 6 columnas de la primera placa, 8 columnas de la segunda placa y 2 columnas de la primera placa se extrajeron manualmente, usando el inhibidor DGAT N-(7,10-dimetil-11-oxo-10,11-d¡hidro-dibenzo[b,f][1 ,4]oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida. El IC50 para la placa 1 , placa 2 y las muestras se extrajeron manualmente son 1.50, 1.27 y 1.70 µM, respectivamente (Figura 8).

Los solicitantes han probado una variedad de parámetros de la prueba DGAT para desarrollar un método que podría permitir el análisis en masa de los inhibidores DGAT sin usar el ^¿ÉUtÁ^MMMÉt TLC, un método lento y laborioso. Mediante usar un solvente de acetonacloroformo para disolver el sustrato, 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol, la actividad DGAT se incremento sobre unas 1000 veces, las actividades ACAT y EAT se eliminaron y la actividad FAH se redujo sobre 96 veces. Usando acetonacloroformo permitió una muy alta producción de [14C]triglicérido, que facilitó su extracción mediante el método de extracción de 1 -etapa. Mediante ajustar los volúmenes del reactivo de prueba DGAT y el método de extracción de 1 -etapa, la prueba llego a ser amigable a un formato de 96 pozos. La última modificación permitió un completo y alto análisis de masa de los inhibidores DGAT. Se establecieron el tiempo, la temperatura y las concentraciones de DMSO más convenientes para el método de Análisis de Masa DGAT de 96 pozos. El inhibidor DGAT, N-(7,10-dimetil-11-oxo-10,11-dih¡dro-dibenzo[b,f][1 ,4]oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida, demostró la validez de la prueba en formato de 96 pozos para el análisis de los inhibidores DGAT. • • .-1- .. - i.. *--- Tabla 1. Efecto de los Solventes en la Actividad DGAT Actividad Reacción en (pmol TAG Veces Solvente % formada/ mg de Incrementadas proteína / min) Tween 80 0.8 20 ± 0.2 1.0 95% de EtOH 0.8 104 ±0.4 5.3a Acetona 10 9,537 ± 62 483.5a Cloroformo 0.4 9,256 ± 21 462.8 Acetona:Cloroformo (8:2) 2.1 20,851 ± 248 1,057.0' 95% de EtOH Cloroformo (1 :1 ) 0.8 22,539 ± 581 1,142.5' Las pruebas se realizaron a 37° C por 5 minutos usando 40 µg de proteína mícrosomal, 20 nCi [14C]oleoil CoA y 403 µM 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol para etanol y 1.25 µg de proteína mícrosomal, 8.3 nCí [14C]oleoil CoA y 403 µM de 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol para acetonacloroformo. Los valores representan los promedios, n = 3 ± SEM. a p < 0.001 vs Tween 80 Tabla 2. Efecto de N-(7,10-Dimeetil-11-oxo-10,11-dihidro- dibenzo[b,f][1 ,4]oxazepin-2-il)-4-hidroxi-benzamida en la Actividad DGAT de Cuatro Preparaciones de Microsoma de Hígado de Rata Separadas Comparadas con el Método TLD, Método de Destello/Extracción de 1 -Etapa, TLC/Extracción de 1 -Etapa Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 IC50 [µM] ICso [µM] ICso [µM] IC50 [µM] TLC 1.07 1.52 1.74 0.91 TLC/Etapa-1 0.95 1.14 2.30 0.73 Método de Destello/Etapa-1 1.66 1.12 2.05 1.10 Las pruebas se realizaron a 37° C por 5 minutos usando 1.25 µg de proteína microsomal, 8.3 nCi r [1 , C]oleoil CoA y 403 µM 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol por reacción.

Los ejemplos demostraron claramente la utilidad del método de la presente invención para medir la actividad DGAT y para el análisis de alto rendimiento de los compuestos como moduladores de la actividad DGAT.

En vista de lo anterior, se entenderá y apreciará que numerosas modificaciones y variaciones de la invención anterior pueden implementarse. La descripción y los ejemplos son ilustrativos de las modalidades particulares de la presente invención pero no son limitantes para la práctica de la misma. Las siguientes reivindicaciones y todos sus equivalentes definen el alcance de la invención. -- --- » ' ' • -*" - - . • á» * ** *

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para medir la actividad acetiltransferasa del diacilglicerol (DGAT), dicho método comprende las etapas de: (a) proporcionar al menos un sustrato DGAT; (b) combinar microsomas que tienen DGAT asociada en las mismas con el sustrato DGAT para formar una mezcla de reacción; (c) incubar la mezcla de los microsomas y el sustrato DGAT por un intervalo de tiempo predeterminado; (d) terminar la reacción de DGAT con el sustrato DGAT y (e) detectar la producción de triglicéridos como un indicador de la actividad biológica DGAT.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el sustrato DGAT comprende oleoil CoA, 1 ,2-dioleoil-sn-glicerol y los radio-isótopos del mismo.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde al menos un sustrato DGAT se disuelve en un solvente de acetonacloroformo.

4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la proporción de la acetona para el cloroformo es 8:2.

5. Un método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la concentración de la acetona oscila desde aproximadamente 1.0% a aproximadamente 5.0% en volumen.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la concentración del cloroformo oscila desde aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 0.8 % en volumen.

7. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los sustratos DGAT se disuelven en el solvente etanolcloroformo.

8. Un método de conformidad con la reivindicación 7, en donde la proporción del etanol para el cloroformo es 1 :1.

9. Un método de conformidad con la reivindicación 7, en donde la concentración de etanol oscila de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 2.0 % en volumen.

10. Un método de conformidad con la reivindicación 7, en donde la concentración del cloroformo oscila de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 0.6 % en volumen.

11. Un método para determinar si un compuesto es útil para modular la actividad biológica de aciltransferasa de diacilglicerol (DGAT), dicho método comprende las etapas de: (a) proporcionar sustratos DGAT; (b) proporcionar microsomas que tienen DGAT asociadas en las mismas; (c) contactar un compuesto para analizarse por su habilidad para modular la actividad biológica DGAT con los sustituyentes establecidos en (a) y (b) para una mezcla de reacción; (d) incubar la mezcla de reacción por un predeterminado intervalo de tiempo; (e) terminar cualquier reacción de DGAT con al menos un sustrato DGAT en le mezcla de reacción y (f) medir la actividad biológica DGAT, en donde un cambio en la actividad biológica DGAT, relativa a un control no contactado con el compuesto indica que el compuesto modula la actividad biológica DGAT. •& & * *-i i masa de los compuestos como moduladores de la actividad biológica de DGAT. fiátefc . , ,, A.A.y..? . » - ^L^^^^jjjj