DE10043702A1 - Antisense Oligonukleotide - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Antisense Oligodesoxynucleotide gegen VR1, entsprechende Nukleotid-Konstrukte, diese enthaltende Zellen, Arzneimittel und Diagnostika, deren Verwendung in der Schmerztherapie und Verfahren zur Diagnose mit VR1 verbundener Symptome und zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen.

Description

Die Erfindung betrifft Antisense Oligodesoxynucleotide gegen VR1, entsprechende Nukleotid-Konstrukte, diese enthaltende Zellen, Arzneimittel und Diagnostika, deren Verwendung in der Schmerztherapie und Verfahren zur Diagnose mit VR1 verbundener Symptome und zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen.

Die effektive Behandlung von Schmerz ist eine große Herausforderung für die molekulare Medizin. Akuter und transitorischer Schmerz ist ein wichtiges Signal des Körpers, um den Menschen vor schwerem Schaden durch die Umgebung oder Überbelastung des Körpers zu bewahren. Im Gegensatz dazu hat der chronische Schmerz, der länger anhält als die Ursache des Schmerzes und der erwartungsgemäße Zeitrahmen der Heilung keine bekannte biologische Funktion und betrifft Hunderte von Millionen Menschen weltweit. Rund 7,5 Mio. Menschen leiden allein in der Bundesrepublik Deutschland an chronischen Schmerzen. Unglücklicherweise ist die pharmakologische Behandlung des chronischen Schmerzes noch unbefriedigend und bleibt daher eine Herausforderung für die aktuelle medizinische Forschung. Die derzeit existierenden Analgetika sind häufig nicht ausreichend wirksam und haben z. T. schwere Nebenwirkungen.

Daher werden vielfach neue Targets, körpereigene Strukturen, über die eine schmerzmodulierende Einwirkung, beispielsweise niedermolekularer Wirkstoffe oder anderer Verbindungen wie Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN), möglich erscheint, für die Behandlung insbesondere chronischer Schmerzen gesucht. Der von Caterina et al., (1997) klonierte Vanilloid Rezeptor Subtyp 1 (VR1, auch als Capsaicin Rezeptor bezeichnet) ist ein vielversprechender Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Schmerzmedikamente. Es handelt sich dabei um einen Kationenkanal, der vorwiegend durch primäre sensorische Neuronen expremiert wird (Catarina et al., 1997). VR1 wird durch Capsaicin, die scharfe Komponente der Chilischoten, Hitze (<43°C) und einen niedrigen pH (Protonen) infolge von Gewebeverletzungen aktiviert und bewirkt einen Calicium-Einstrom in primäre Afferenten. VR1 Knockout Mäuse entwickelten keine thermische Hyperalgesie nach Gewebeschäden bzw. Entzündungen (Caterina et al., 2000; Davis et al., 2000).

Antisense Oligodesoxynukleotiden (ODN), Ribozymen und andere katalytische Nukleinsäuren können zur Behandlung, insbesondere des chronischen, Schmerzes durch das Schneiden oder Spalten der mRNA ausgewählter Targets - im Falle dieser Erfindung der vorangehend beschriebenen Vanniloid-Rezeptors Subtypes 1 (VR1) (Catarina et al., 1997) - eingesetzt werden, deren Expression herunterregulieren und damit die Anzahl der Rezeptoren pro Zelle verringern. Die ODN lagern sich an die mRNA an und blockieren so zum einen die Translation und initiieren zum anderen den Abbau der mRNA durch RNase H, die RNA in einer DNA/RNA Duplex spaltet. Porreca et al., (1999) konnten zeigen, dass intrathekal applizierte ODNs gegen den PN3/SNS-Kanal bei Ratten die Entwicklung von Hyperalgesie und Allodynie durch chronische Nerven- oder Gewebeschädigung verhindern.

Auch wenn die Sequenz des VR1 bekannt ist, so kommt es doch für eine effektive Blockierung und Spaltung der mRNA insbesondere auf die Auswahl der richtigen Antisense-Oligodesoxynukleotide, Ribozyme und anderen katalytische Nukleinsäuren an. Die mRNA des Targets ist meist gefaltet und nur an wenigen Stellen für eine Anlagerung und nachfolgende Spaltung zugänglich. Über die richtige Auswahl der ODN ist aber im SdT nichts bekannt.

Aufgabe der vorliegenden Schrift war entsprechend die Entwicklung von Antisense Oligodesoxynukleotiden sowie entsprechender Ribozyme und katalytischer Nukleinsäuren gegen die mRNA des Vanilloid Rezeptors. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (a) in einer der Abb. 1 bis 16. Damit sind insbesondere Oligonukleotide erfaßt, die die die im Unterpunkt (a) der Abbildungen gezeigte Sequenz enthalten, d. h. 3'-wärts und 5'-wärts der GUC-Site jeweils diese spezifischen 3 Nukleotide. Dabei bedeutet Oligonukleotid im Sinne dieser Erfindung ein Molekül mit zwischen 2 und 2 und 30 Nukleotiden.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß einem der Unterpunkte (b) bis (j) in einer der Abb. 1 bis 16 oder eine(r) sich im nicht im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich in maximal einer abweichenden Base davon unterscheidende(n) Sequenz.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (k) in einer der Abb. 1 bis 16 oder eine(r) sich im nicht im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich in maximal zwei abweichenden Basen, vorzugsweise einer, davon unterscheidende(n) Sequenz.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, wobei das Oligonukleotid ein Länge von 7 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25, Nukleotiden aufweist.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes besonders bevorzugtes Oligonukleotid, wobei die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende Basensequenz einer der Abb. 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 15 oder 16 zu entnehmen ist. Damit sind insbesondere Oligonukleotide gemeint, die als besonders effektiv erkannt wurden bzw. entsprechende Sequenzen gegebenenfalls leicht abweichend enthalten, mit hoher Bindung an die mRNA des VR1 zu binden (s. Oligos V15, V30, V2, V16 und V4 bzw. die entsprechenden humanen Sequenzen).

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes besonders bevorzugtes Oligonukleotid, wobei die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende Basensequenz einer der Abb. 1 bis 4, 11 oder 12, vorzugsweise 1, 3 oder 11, insbesondere 1 oder 3, zu entnehmen ist.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid. Hier ist Polynukleotidkonstrukt in einem sehr weiten Sinne zu verstehen. Es umfaßt RNA und DNA und Nukleotide ab einer Länge von mindestens 20 Nukleotiden. Dabei ist (rekombinantes) Polynukleotid-Konstrukt: Generelle Bezeichnung für jede Art von DNA- bzw. RNA-Molekülen, die durch die in vitro-Verknüpfung von DNA-, RNA-Molekülen entstanden sind. Unter Polynukleotid versteht man folgendes: Das zugrundeliegende Nukleotid ist ein grundsätzlich aus Nucleinbase, Pentose und Phosphorsäure bestehender Grundbaustein der Nucleinsäuren. Diese entspricht einem hochmolekularen Polynukleotid aus mehreren Nukleotiden, die über Phosphorsäure-Pentose-Veresterung miteinander verknüpft sind. Unter die Erfindung fallen aber auch modifizierte Polynukleotide, die zwar die Basenabfolge beibehalten, aber über ein modifiziertes Rückrat statt der Phosphorsäure-Pentose verfügen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt enthaltend in zwei voneinander getrennten Bereichen die beiden Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. II gemäß einem der Unterpunkte (I)-(n) oder die beiden Nukleotidteilsequenzen Helix I und Helix III gemäß einem der Unterpunkte (o)-(q) in einer der Abb. 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 oder 15 oder von diesen Nukleotidteilsequenzen jeweils maximal in einer Base abweichende Nukleotidteilsequenzen. Genaueres über die Aufteilung der beiden Bereiche kann man der Fig. 24) (Helix I/Ribozym) und bei Santoro et al., (1997) Fig. 2, S. 4264 (Abschnitt I/DNA-Enzym) entnehmen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt kodierend für mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, wobei es sich um ein Ribozym, ein DNA-Enzym, einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor, oder eine PNA handelt.

Dabei heißt generell im Sinne dieser Erfindung:

• - (Klonierungs)vektor: Generelle Bezeichnung für Nukleinsäure- Moleküle, die beim Klonieren als Träger von Fremdgenen oder Teilen dieser Gene dienen.
• - Expressionsvektor: Bezeichnung für speziell konstruierte Klonierungsvektoren, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in den Vektor einklonierten Fremdgens erlauben.
• - PNA: International gebräuchliche Abkürzung für peptidic Nucleic Acids. Hierbei bilden peptidisch verknüpfte Aminosäuren eine Kette, wobei die Aminosäuren als Seitenkette eine für die Hybridisierung mit DNA oder RNA fähigen Base trägt.
• - Sequenz: Abfolge von Nukleotiden oder Aminosäuren. Im spezifischen Sinne dieser Erfindung ist damit die Nukleinsäuresequenz gemeint.
• - Ribozym: Bezeichnung für eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure (z. B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease)
• - DNA-Enzym: Bezeichnung für ein DNA-Molekül, das katalytische Aktivität beinhaltet (z. B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease)
• - katalytische RNA/DNA: generelle Bezeichnung für Ribozyme bzw. DNA-Enzyme (s. o.).

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt enthaltend in zwei voneinander getrennten Bereichen die beiden Nukleotidteilsequenzen wie oben beschrieben, wobei es sich um ein Ribozym, vorzugsweise ein "hammerhead" Ribozym, oder ein DNA-Enzym, vorzugsweise ein DNA-Enzym vom Typ 10-23 oder 12-32, handelt. Hier ist es besonders bevorzugt und ausgewählt, wenn es sich um ein DNA-Enzym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. II gemäß einem der Unterpunkte (I) bis (n), vorzugsweise (n), in einer der Abb. 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 oder 13,

• - vorzugsweise 1, 3, 7 oder 11, insbesondere 1 oder 3, oder
• - vorzugsweise 4, 6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12

handelt. Ebenso ist es besonders bevorzugt und ausgewählt, wenn es sich bei dem Polynukleotid-Konstrukt um ein Ribozym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Helix I und Helix III gemäß einem der Unterpunkte (o) bis (q), vorzugsweise (o), in einer der

Abb.

1, 3, 4, 5, 6, 8, 11 oder 12;

• - vorzugsweise 1, 3 oder 11, insbesondere 11; oder
• - vorzugsweise 4, 6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12

handelt.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, wobei dieses mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweist. Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, wobei dieses an einen Träger; insbesondere Protein, vorzugsweise tet-, Transportin oder Ferritin; gebunden und/oder in einem Liposom verpackt ist.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch eine Zelle enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid und/oder ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemäßen Gegenstand je nach galenischer Form gegebenenfalls Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen. Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblichweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-Inhibitoren etc.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Diagnostikum enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe.

Dabei bedeuten

• - Arzneimittel: ein Stoff entsprechend der Definition im Artikel 1 §2 des Gesetzes über den Verkehr mit Arzneimitteln
• - Diacinostikum: Verbindung oder Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Krankheit zu diagnostizieren.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotid, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukt und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz, insbesondere von chronischem Schmerz, taktiler Allodynie, thermisch ausgelöstem Schmerz, und/oder Entzündungsschmerz.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harninkontinenz; auch von neurogenen Blasensymptomen; Pruritus, Tumoren, Entzündungen; insbesondere von VR1-Rezeptorassoziierten Entzündungen mit Symptomen wie Asthma; sowie von allen mit VR1 zusammenhängenden Krankheitssymptomen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle für die Gentherapie, vorzugsweise In-vivo oder In-vitro Gentherapie. Unter Gentherapie versteht man eine Therapieform, bei der durch die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen ein Effektorgen, meist ein Protein, aber auch ein Antisense Oligodesoxynukleotid, exprimiert wird. Man unterscheidet prinzipiell In-vivo- und in-vitro-Verfahren. In In-vitro-Verfahren werden Zellen aus dem Organismus entfernt und ex-vivo mit Vektoren transfiziert, um anschließend wieder in denselben oder in einen anderen Organismus eingebracht zu werden. Bei der In-vivo-Gentherapie werden Vektoren, beispielsweise zur Bekämpfung von Tumoren, systemisch (z. B. über die Blutbahn) oder direkt in den Tumor appliziert.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung über eine Quantifizierung der Bindung mindestens eines, vorzugsweise markierten, erfindungsgemäßen Oligonukleotids oder mindestens eines erfindungsgemäßen Polynukleotid- Konstrukts an eine RNA erfolgt.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:

• a) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einem erfindungsgemäßen Oligonukleotid und/oder einem erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukt,
• b) parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identischen Zelle (Kontrollzelle) entweder
  • - unterbleibend,
  • - unter Durchführung der Manipulation parallel ohne Oligonukleotid oder Polynukleotid-Konstrukt oder
  • - mit einem veränderten, nicht mehr erfindungsgemäßen Oligonukleotids oder Polynukleotidkonstrukts,
• c) parallele Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit mindestens einer Test-Zelle und mindestens einer Konrollzelle und/oder einer Präparation aus solchen Zelle, die mindestens ein Rezeptorprotein, ausgewählt aus der Vanilloid-Rezeptor- Familie, vorzugsweise den VR-1-Rezeptor, synthetisiert hat
• d) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von den Zellen synthetisierten Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Rezeptorprotein veränderten funktionellen Parameter,
• e) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Meßwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.

Dabei bezieht sich der Begriff schmerzmodulierend auf einen potentiellen regulierenden Einfluß auf das physiologische Schmerzgeschehen, insbesondere auf eine analgetische Wirkung. Der Begriff Substanz umfaßt jede als Arzneimittel-Wirkstoff geeignete Verbindung, insbesondere also niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch andere wie Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine wie Antikörper. Die Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen, daß die zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden Präparation in einem wässrigen Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Dabei kann das wässrige Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden variiert werden, je nach der Wechselwirkung der Substanz mit dem Rezeptor. Bevorzugt sind aber Zeiten zwischen 1 min und 60 min. Das wäßrige Medium kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so daß bei der Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0-7,5 im Medium herrscht. Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Rezeptor aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger, einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren einen möglichst deutlichen Meßwert zu erhalten. Eine Zelle, die einen Rezeptor synthetisiert hat, ist ein Zelle, die diesen Rezeptor bereits endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurden, so daß sie diesen Rezeptor exprimiert und entsprechend vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens den Rezeptor enthält. Die Zellen können Zellen aus evt. immortalisierten Zellinien sein oder native aus Geweben stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zellverband meist aufgelöst ist. Die Präparation aus diesen Zellen umfaßt insbesondere Homogenate aus den Zeilen, das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen etc.

Der Maßstab über den das Verfahren die Auffindung interessanter Substanzen erlaubt, ist entweder die Bindung an den Rezeptor, die z. B. durch Verdrängung eines bekannten Liganden oder das Ausmaß gebundener Substanz nachgewiesen werden kann, oder die Veränderung eines funktionellen Parameters durch die Wechselwirkung der Substanz mit dem Rezeptor. Diese Wechselwirkung kann insbesondere in einer Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen liegen und veränderte funktionelle Parameter können beispielsweise die Genexpression, das Ionenmilieus, der pH oder das Membranpotentials, bzw. die Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2^nd messenger sein. Dabei heißt:

• - gentechnisch manipuliert: Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart, daß hier genetisches Material eingebracht wird
• - endogen exprimiert: Expression eines Proteins, die eine Zellinie unter geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne das dieses entsprechende Protein durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die Zelle bereits vor den Verfahrensschritten (a) und (a') gentechnisch manipuliert wird.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines Mitglieds der Vanilloid-Rezeptor-Familie, vorzugsweise der VR-1-Rezeptor, exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden eines Mitglieds der Vanilloid-Rezeptor-Familie, vorzugsweise des VR-1-Rezeptors, erfolgt.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß zwischen den parallelen Verfahrensschritten (a) und (a') und dem Verfahrensschritt (b) ≧ 8 h, vorzugsweise ≧ 12 h, insbesondere ≧ 24 h, vergehen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Diagnose von Krankheitsbildern, die mit veränderter Expression von Genen der Vanilloid-Rezeptor-Familie verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Diagnose über eine Quantifizierung der Bindung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids und/oder mindestens eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts an eine RNA erfolgt.

Die Oligonukleotide und auch Polynukleotidkonstrukte werden nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt. Dabei werden Nukleotide, insbesondere auch Oligonukleotide, beispielsweise nach Art der Merryfield-Synthese, an einem unlöslichen Träger (H.G. Gassen et al., Chemical and Enzymatic Synthesis of Genefragments (Verlag Chemie, Weinheim 1982)) oder auf andere Art synthetisiert (Beyer/Walter; Lehrbuch der Organischen Chemie, 20. Auflage, (S. Hirzel Verlag, Stuttgart 1984), S. 816 ff.).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere Schmerzbehandlung, eines nichthumanen Säugetieres oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, benötigt, durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, insbesondere solche enthaltend eine erfindungsgemäßes Oligonukleotid und/oder ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt. Ein weiterer Gegenstand sind auch entsprechende Verfahren zur Behandlung von Pruritus und/oder Harninkontinenz.

Die folgenden Beispiele und Abbildungen sollen die Erfindung erläutern, ohne daß der Gegenstand der Erfindung darauf beschränkt wäre.

Abbildungen und Beispiele Abbildungen

Abbildungen, Abbildung, Figur und Figur sind als synonym zu betrachten. Ebenso synonym sind im Zusammenhang mit den Abbildungen Subtyp und Unterpunkt. Ein "X" in den abgebildeten Sequenzen steht für ein beliebiges zur entsprechenden Base auf der mRNA von VR1 komplementäres Nukleotid. Die Abbildungen zeigen:

Fig. 1 Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V15, Oligonukleotid Nr. 15 oder V15 bezeichnet. Unterpunkte (a)-(j) zeigen verkürzte Ausschnitte aus dieser Antisense- Oligodesoxynukleotidsequenz, Unterpunkt (k) zeigt die volle Antisense- Oligodesoxynukleotidsequenz, mit der das "messenger walk screening" durchgeführt wurde, Unterpunkte (I)-(n) zeigen jeweils zwei (Abschn. I und Abschn. II) von der vollen Antisense-Oligodesoxynukleotidsequenz ausgehende Nukleotidteilsequenzen, die jeweils nicht überlappende Teilbereiche dieser Segenz umfassen oder diesen entsprechen, meist an oder in der GAC-Region getrennt sind und in bestimmten Polynukleotidkonstrukten, insbesondere DNA-Enzymen, in zwei voneinander getrennten Bereichen, den "erkennenden Armen" auftreten, Unterpunkte (o)-(q) zeigen jeweils zwei (Helix I und Helix III) von der vollen Antisense-Oligodesoxynukleotidsequenz ausgehende Nukleotidteilsequenzen (hier allerdings als RNA), die jeweils nicht überlappende Teilbereiche dieser Segenz umfassen oder diesen entsprechen, meist an oder in der GAC-Region getrennt sind und in bestimmten Polynukleotidkonstrukten, insbesondere Ribozymen, in zwei voneinander getrennten Bereichen, den "erkennenden Armen" auftreten.

Fig. 2 die dem Oligo V15 in Fig. 1 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a)-(k) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 3 Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V30, Oligonukleotid Nr. 30 oder V30 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 4 die dem Oligo V30 in Fig. 3 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VRI. Die Untertypen (a)-(q) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 5 generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V32, Oligonukleotid Nr. 32 oder V32 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 6 die dem Oligo V32 in Fig. 5 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a)-(q) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 7 generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V26, Oligonukleotid Nr. 26 oder V26 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 8 die dem Oligo V26 in Fig. 7 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a)-(q) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 9 generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V2, Oligonukleotid Nr. 2 oder V2 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 10 die dem Oligo V2 in Fig. 9 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a)-(k) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 11 generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V16, Oligonukleotid Nr. 16 oder V16 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 12 die dem Oligo V16 in Fig. 11 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a)-(q) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 13 generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V28, Oligonukleotid Nr. 28 oder V28 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 14 die dem Oligo V28 in Fig. 13 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a)-(k) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 15 generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V4, Oligonukleotid Nr. 4 oder V4 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 16 die dem Oligo V4 in Fig. 15 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a)-(k) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Fig. 1 beschriebenen.

Fig. 17 zeigt das Ergebnis des Messenger Walk Screenings. Zu sehen sind in jeder Spur neben der oberen Bande des ungeschnittenen Substrates die zwei Produktbanden der geschnittenen mRNA sowie einige unspezifische Banden. Zu sehen ist die VR1 mRNA nach dem Abbau durch RNase H in der Gegenwart von jeweils einem von 33 Antisense- Oligonukleotiden (Oligo V1 bis Oligo V33). Zu sehen sind in jeder Spur neben der oberen Bande des ungeschnittenen Substrates die zwei Produktbanden der geschnittenen mRNA sowie einige unspezifische Banden.
Spur 1: VR1 mRNA, Spur 2-34: RNase H Assay mit Antisense Oligodesoxynukleotiden gegen die 33 GUC-Sites der VR1 mRNA (Oligo V1 bis Oligo V33).

Fig. 18 quantitative Auswertung des Messenger Walk Screenings. In Fig. 18 ist der prozentuale Anteil der ungeschnittenen mRNA nach dem RNase H Assay mit den einzelnen ODNs aufgetragen. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert aus mindestens drei Experimenten, so daß die Standardabweichung in keinem Fall 10% übersteigt. Die Antisense Oligodesoxynukleotide gegen die 15. und 30. GUC-Site binden am effizientesten an die VR1 mRNA, sodass diese zu 88 ± 4 bzw. 97 ± 1% durch die RNase H abgebaut wird (Oligo V15 und Oligo V30).

Fig. 19 Bild von einem Gel nach dem RNase H Assay mit den Oligonukleotiden V15, V15Ktr. (Mismatch), V30 und V30 Ktr. (Mismatch). Gezeigt sind VR1 mRNA (Spur 1) sowie RNase H Assay mit den Oligodesoxynukleotiden V15, V15Ktr., V30 und V30Ktr (Spur 2-5).

Fig. 20 quantitative Beurteilung des Schneidens der mRNA durch Ribozyme und DNA-Enzyme unter Bedingungen unter "Single turnover"-Bedingungen.

Fig. 21 Kinetik des VR1 mRNA-Schneidens durch Ribozyme und DNA-Enzyme unter "Single turnover"-Bedingungen.

Fig. 22 Kinetik der VR1 mRNA-Schneidens durch Ribozyme und DNA-Enzyme unter "Multiple turnover"-Bedingungen.

Fig. 23 Abschätzung der taktilen Allodynie während der Behandlung durch VR1- Antisense(AS)- und Mismatch(MS)-Oligodesoxynukleotide (V15 und V15Ktr.).

Fig. 24 allgemeine Darstellung eines "Hammerhead"-Ribozyms mit den "erkennenden Armen" Helix I und Helix III.

Fig. 25 Übersichtsdarstellung der gemachten Experimente.

Beispiele Identifizierung der generell geeigneten Schnittstellen

Der erste Schritt in der Antisens- und Ribozym-Strategie ist die Identifizierung zugänglicher Stellen der mRNA für die Bindung von Oligonukleotiden, insbesondere aber auch von Ribozymen. Dazu mußte die mRNA des VR1 auf diese Schnittstellen hin untersucht werden. Eine Analyse der VR1-mRNA ergab im kodierenden Bereich folgende potentielle Erkennungsstellen für Ribozyme:
33 × GT(U)C-Sequenzen
28 × GT(U)T-Sequenzen
12 × GT(U)A-Sequenzen.

Um die zugänglichen Stellen der VR1mRNA zu ermitteln, wurden in einem ersten Schritt drei unabhängige Nukleotidgemische folgender Sequenz synthetisiert:
Gemisch 1: NNNAACNNN sog. GUU-Library
Gemisch 2: NNNCACNNN sog. GUA-Library
Gemisch 3: NNNGACNNN sog. GUC-Library.

Diese wurden konsekutiv in einem Rnase H-Experiment verwendet und es zeigte sich, daß nur mit der GUC-Library ein nennenswerter Abbau der VR1-mRNA zu beobachten war. Somit sind von den potentiellen Zielsequenzen für Ribozyme die 33 GUC-Sites in der VR1 mRNA am besten zugänglich und wurden zur weiteren Analyse eingesetzt.

Beispiel 2 Identifizierung der effektivsten Antisense Oligodesoxynukleotide Messenger Walk Screening

Zur Identifikation von Bereichen der mRNA, die für Antisense Oligodesoxynukleotide zugänglich sind, wurde diese systematisch mit ODNs im RNase H Assay gescreent (Messenger Walk Screening). Die ODNs waren 18 Nukleotide lang und enthielten in der Mitte eine GAC- Sequenz, die revers-komplementär zu GUC-Sequenzen in der mRNA ist.

Dieses Triplet wurde als Target gewählt, da es gute Ergebnisse zeigte und in einem zweiten Schritt zur Entwicklung von Hammerhead Ribozymen und DNA Enzymen verwendet werden kann. Insgesamt wurden 33 ODNs, die als V1 bis V33 bezeichnet wurden, gegen sämtliche GUC-Sites der VR1 mRNA getestet. Die ODNs wurden systematisch durch die Zugabe von jeweils einem ODN und RNase H zur mRNA auf ihre Eignung hin gescreent. Die RNase H schneidet gebildete DNA/RNA-Duplexe wo immer ein Oligonukleotide an die mRNA binden kann (Fig. 17).

In vitro Transkription der VR1 mRNA

Zunächst wurde die cDNA des Vanilloid Rezeptors in den Vektor pcDNA3.1 (+) der Firma Invitrogen kloniert. Anschließend erfolgte die in vitro Transkription der mRNA mit dem RiboMAX Large Scale RNA Production System - T7 der Firma Promega nach Angaben des Herstellers.

RNase H Assay

Zum Test, ob ein Antisense Oligodesoxynukleotid an die mRNA gebunden hat, wurde ein RNase H Assay durchgeführt. Dazu wurde die VR1 mRNA (100 mM) mit einem fünffachen Überschuss des ODNs in einem Gesamtvolumen von 10 µl in 40 mM Tris/HCl pH 7,2; 4 mM MgCl₂; 1 mM DTT und 150 mM NaCl für 7,5 min bei 37°C in Gegenwart von 0,4 u RNase H (von Promega) inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA (65 mM Endkonzentration) gestoppt. Die Proben wurden über ein 1,5%iges Agarose-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid (1 µg/ml) 20 min angefärbt. Die Gele wurden mit dem Gel Doc 2000 Gel Documentation System der Firma Biorad photographiert und mit dem Programm Quantity One ausgewertet.

Fig. 17 zeigt das Ergebnis des Messenger Walk Screenings. Zu sehen sind in jeder Spur neben der oberen Bande des ungeschnittenen Substrates die zwei Produktbanden der geschnittenen mRNA sowie einige unspezifische Banden.

Eine Quantifizierung des RNA-Abbaus zeigte, daß durch das effektivste Antisense Oligonukleotid (Oligo Nr. 30 (V30)) mehr als 90% der VR1 mRNA spezifisch geschnitten/gespalten werden konnte, wenn es im 5- fachem Überschuß gegenüber der Ziel-mRNA eingesetzt wird (Fig. 18).

Die Intensitäten der einzelnen Banden wurden ausgewertet. In Fig. 18 ist für die einzelnen ODNs der Anteil der ungeschnittenen mRNA für den RNase H Assay aufgetragen. Die Antisense Oligodesoxynukleotide gegen die 15. und 30. GUC-Site (Oligo V15 und Oligo V30) binden am effizientesten an die VR1 mRNA, so daß diese zu 88 ± 4 bzw. 97 ± 1% durch die RNase H abgebaut wird.

Die Sequenzen der in diesem Test effektivsten Antisense- Oligodesoxynukleotide finden sich in Abb. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 und 15, wobei u. a. die als Oligo V15 (Abb. 1) und Oligo V30 (Abb. 3) bezeichneten bevorzugt erscheinen in Betracht gezogen wurden.

Als Mismatch-Kontrollen für diese Antisense Oligodesoxynukleotide wurden für die folgenden Experimente Oligodesoxynukleotide synthetisiert und verwendet, bei denen jede fünfte und sechste Base (bzw. - falls diese identisch sind - zwei benachbarte Basen) vertauscht sind. Die Sequenzen der Kontroll Oligodesoxynukleotide (Mismatch) lauten:
Oligo V15Ktr.: CAT GCT ATG AGC GTT GAG
Oligo V30Ktr.: ATC TGT TTG AGC GTC TAC.

Zur Kontrolle wurde der RNase H Assay mit den Oligonukleotiden V15, V15Ktr., V30 und V30 Ktr. durchgeführt (s. Abb. 19). Erwartungsgemäß wird die RNA nur mit den Antisense ODNs, nicht aber mit den Mismatch- Kontrollen abgebaut, da diese nicht an die mRNA binden.

Zusammenfassung

Im RNase H Assay mit Antisense Oligodesoxynukleotiden gegen sämtliche GUC-Triplets der VR1 mRNA konnten Oligodesoxynukleotide gegen die GUC-Triplets (2, 4, 15, 16, 26, 28, 30 und 32), insbesondere das 15. und 30. als die am besten bindenden ODNs identifiziert werden. Diese Oligodesoxynukleotide sowie zwei Mismatch-Kontrollen stehen somit für Versuche im Tiermodell und andere Verwendungen zur Verfügung.

Entsprechend interessant sind auch die humanen Sequenzen gem. Abb. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, die von der Position den in der Ratte gefundenen entsprechen. Die mRNA der Ratte und des Menschen sind stark homolog (wahrscheinlich auch in der Faltung) und es ist daher klar, daß günstig erreichbare identifizierte Schnittstellen auf der Ratten mRNA auch human interessant sind. Dabei sind die Sequenzen besonders bevorzugt, die auch das GUC-Triplett zeigen, die Abb. 4, 6, 8 und 12, und aufgrund der der Ratte ähnlichen Lokalisation auch die V15 und V30 entsprechenden gemäß Abb. 2 und 4.

Beispiel 3 Ribozyme und DNA-Enzyme

Weiter wurden aufgrund der gefundenen effektivsten Bindungsstellen entsprechende Ribozyme und DNA-Enzyme untersucht.

"Hammerhead"-Ribozyme und DNA-Enzyme des Typs '10-23' (Santoro et al., 1997) wurden gegen die Stellen die mRNA konstruiert, welche für ODNs zugänglich waren. Die Länge der "erkennenden Arme" war 7 oder 9 Nukleotide auf jeder Seite. Quantitative Auswertung der mRNA- Spaltung/Schneidung unter "Single turnover"-Bedingungen (10-facher Überschuß an Ribozymen und DNA-Enzymen) zeigte nach 20 min bei 37°C, daß Ribozyme mit kürzeren "erkennenden Armen" (Helix I und Helix III) aktiver sind, während widerum bei DNA-Enzyme solche mit längeren "Armen" (Abschn. I und Abschn. II) aktiver sind (Fig. 20). Eine schematische Abbildung eines Ribozyms mit den Helices I und II zeigt Fig. 24). Für ein DNA-Enzym 10-23 kann man dies (5'-wärts (Abschnitt I) und 3'-wärts (Abschnitt II) vom katalytischen Motiv) bei Santoro et al., (1997; S. 4264, Fig. 2) entnehmen.

Experimente mit Ribozymen und DNA-Enzymen wurden in 50 mM Tris/HCl pH 7.5 und 10 mM MgCl₂ bei 37°C durchgeführt. Für "Single turnover"- Experimente wurden Ribozyme und DNA-Enzyme im 10-fachen Überschuß verwendet. Bei "Multiple turnover"-Experimente wurde das Substrat mRNA im 10-fachen Überschuß verwendet.

"Single turnover"-Kinetik

Es wurde eine kinetische Analyse unter "Single turnover"-Bedingungen für die zwei effektivsten Ribozyme und DNA-Enzyme durchgeführt (Fig. 21). Die Daten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. DNA-Enzym V15 (9/9), das die mRNA mit einer biphasischen Kinetik schneidet, hat die höchste Rate (Geschwindigkeitskonstante), gefolgt von Ribozym V16 (7/7), DNA-Enzym V30 (9/9) und dem langsamsten Ribozym V15 (7/7). Dabei heißt z. B. DNA- Enzym V15, daß das Enzym gegen die GUC-Site des Oligos V15 gerichtet ist und in den "erkennenden Armen" jeweils 7 Nukleotide (Abschnitt I und II) enthält, z. B. gemäß Abschnitt I und Abschnitt II von Subtyp (I) in Fig. 1).

Tabelle 1

Kinetische Daten der Ribozyme und DNA-Enzyme gegen VR1 mRNA unter "Single turnover"- Bedingungen

"Multiple turnover"-Kinetik

Die Spaltung der mRNA unter "Multiple turnover"-Bedingungen (10-facher Substrat Überschuß) wird in Fig. 22 gezeigt. Wieder hat das DNA-Enzym V15 (9/9) eine höhere anscheinende (apparente) Rate ((Geschwindigkeitskonstante) (Faktor 3.4) als das Ribozyme V16 (7/7) (Tab. 2).

Tabelle 2

Kinetische Daten der Ribozyme und DNA-Enzyme gegen VR1 mRNA unter "Multiple turnover"- Bedingungen

Beispiel 4 In vivo Experimente

In 20 männlichen Sprague-Dawley-Ratten wurden an den linken L5/L6 Spinal-Nerven Spinal-Nerven-Ligaturen gemäß Kim und Chung (1992) angelegt. Zur selben Zeit wurden Spinal-Katheter gemäß Pogatzki et al.⁶ (2000) implantiert. 4 bis 6 Tage nach der Operation wurde die taktile Schwellen-Basislinie (Rückzugs-Schwellen/withdrawal threshholds) an der ipsi- und contralateralen Hinterpfote durch ein elektronisches von Frey- Anethesiometer (IITC Life Science, USA) gemessen. Der korrekte Sitz der Spinal-Katheter wurde durch Lidocain-Gabe (10 µl, 2%) bestätigt, die in einer kurzfristigen Lähmung des bilateralen Hinterglieds resultierte. Nach dem Test und Messung der Basislinie wurden je 45 µg VR-1 Antisense- (AS, n = 10) oder Mismatch (MS, n = 10)-Oligonukleotide in 0.9% NaCl einmal am ersten Tag und b.i.d. an den folgende 4 Tagen gegeben. Die taktilen Rückzugs-Schwellen (withdrawal threshholds) wurden 30 Minuten nach der ersten täglichen Oligo-Gabe gemessen. Die Ergebnisse sind als % maximal possible effect (%MPE; % des maximal möglichen Effekts) auf der ipsilateralen Seite angegeben, in dem man die Basisline als 0% und die Rückzugs-Schwelle einer Kontroll-Gruppe als 100%MPE annimmt. Verwendet wurden als Antisense Oligo V15 (Fig. 1, Subtyp k) und als Mismatch Oligo V15Ktr. wie oben bereits beschrieben.

Die Behandlung von mononeuropathischen Ratten mit Antisense- aber nicht mit Mismatch-Oligodesoxynukleotiden induzierte eine Verringerung der taktilen Allodynie beginnend am dritten Tag der Behandlung und ein Plateau an den Tagen 4 und 5 der Behandlung erreichend. Es gab keinen Effekt auf die Rückzugs-Schwellen der contralateralen Hinterpfoten.

Literatur

Caterina, M.J.; Schumacher, M.A.; Tominaga, T.A.; Rosen, T.A.;
Levine, J.D.; Julius, D. (1997) The capsaicin receptor: a heat­ activated ion channel in the pain pathway. Nature 389, 816-824.
Caterina, M.J.; Leffler, A.; Malmberg, A.B.; Martin, W.J.; Trafton, J.; Petersen-Zeitz, K.R.; Koltzenburg, M; Basbaum, A.I.; Julius, D.
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Rogers, D.C.; Bingham, S.; Randall, A.; Sheardown, S.A. (2000) Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature 405, 183-187.
Kim, S.H.; Chung, J.M. (1992) An experimental model for peripheral mononeuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain 50, 355-363.
Pogatzki, E.M.; Zahn, P.K.; Brennan, T.J. (2000) Lumbar catheterization of the subarachnoid space with a 32-gauge polyurethane catheter in the rat. Eur. J. Pain 4, 111-113.
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Hunter, J.C. (1999) A comparison of the potential role of the tetrodotoxin-insensitive sodium chanels, PN3/SNS and NaN/SNS2, in rat models of chronic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7640-7644.
Santoro, S.W.; Joyce, G.F. (1997) A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4262-4266.

Claims (30)

1. Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (a) in einer der Abb. 1 bis 16.

2. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß einem der Unterpunkte (b) bis 0) in einer der Abb. 1 bis 16 oder eine(r) sich im nicht im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich in maximal einer abweichenden Base davon unterscheidende(n) Sequenz.

3. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (k) in einer der Abb. 1 bis 16 oder eine(r) sich im nicht im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich in maximal zwei abweichenden Basen, vorzugsweise einer, davon unterscheidende(n) Sequenz.

4. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid ein Länge von 7 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25, Nukleotiden aufweist.

5. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende Basensequenz einer der Abb. 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 15 oder 16 zu entnehmen ist.

6. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende Basensequenz einer der Abb. 1 bis 4, 11 oder 12, vorzugsweise 1, 3 oder 11, insbesondere 1 oder 3, zu entnehmen ist.

7. Polynukleotid-Konstrukt enthaltend mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Polynukleotid-Konstrukt enthaltend in zwei voneinander getrennten Bereichen die beiden Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. II gemäß einem der Unterpunkte (I)-(n) oder die beiden Nukleotidteilsequenzen Helix I und Helix III gemäß einem der Unterpunkte (o)-(q) in einer der Abb. 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 oder 15 oder von diesen Nukleotidteilsequenzen jeweils maximal in einer Base abweichende Nukleotidteilsequenzen.

9. Polynukleotid-Konstrukt kodierend für mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.

10. Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Ribozym, ein DNA- Enzym, einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor, oder eine PNA handelt.

11. Polynukleotid-Konstrukt gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Ribozym, vorzugsweise ein "hammerhead" Ribozym, oder ein DNA-Enzym, vorzugsweise ein DNA-Enzym vom Typ 10-23 oder 12-32, handelt.

12. Polynukleotid-Konstrukt gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein DNA-Enzym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. II gemäß einem der Unterpunkte (l) bis (n), vorzugsweise (n), in einer der Abb. 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 oder 13,
vorzugsweise 1, 3, 7 oder 11, insbesondere 1 oder 3, oder
vorzugsweise 4, 6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12 handelt.

13. Polynukleotid-Konstrukt gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Ribozym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Helix I und Helix III gemäß einem der Unterpunkte (o) bis (q), vorzugsweise (o), in einer der Abb. 1, 3, 4, 5, 6, 8, 11 oder 12;
vorzugsweise 1, 3 oder 11, insbesondere 11; oder
vorzugsweise 4, 6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12 handelt.

14. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweisen.

15. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 14 oder Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß dieses an einen Träger; insbesondere Protein, vorzugsweise tet-, Transportin oder Ferritin; gebunden und/oder in einem Liposom verpackt ist.

16. Zelle enthaltend mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 oder 15 und/oder ein Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15.

17. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 oder 15, ein Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15 und/oder eine Zelle gemäß Anspruch 16 sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.

18. Arzneimittel gemäß Anspruch 17 enthaltend mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, einen Vektor enthaltend ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, und/oder ein Ribozym gemäß Anspruch 13 oder DNA-Enzym gemäß Anspruch 12.

19. Diagnostikum enthaltend mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 oder 15, ein Polynukleotid- Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15 und/oder eine Zelle gemäß Anspruch 16 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe.

20. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 oder 15, eines Polynukleotid-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz, insbesondere von chronischem Schmerz, taktiler Allodynie, thermisch ausgelöstem Schmerz, und/oder Entzündungsschmerz.

21. Verwendung eines Oligo- oder Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 oder 15, eines Polynukleotid-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harnirikontinenz; auch von neurogenen Blasensymptomen; Pruritus, Tumoren, Entzündungen; insbesondere von VR1-Rezeptor­ assoziierten Entzündungen mit Symptomen wie Asthma; sowie von allen mit VR1 zusammenhängenden Krankheitssymptomen.

22. Verwendung eines Oligo- oder Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 oder 15, eines Polynukleotid-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15 oder einer Zelle gemäß Anspruch 16 für die Gentherapie, vorzugsweise In-vivo oder In-vitro Gentherapie.

23. Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung über eine Quantifizierung der Bindung mindestens eines, vorzugsweise markierten, Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 oder 15 oder mindestens eines Polynukleotid-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15 an eine RNA erfolgt.

24. Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:

• a) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einem Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 oder 15 und/oder einem Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15,
• b) (a') parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identischen Zelle (Kontrollzelle) entweder
  unterbleibend,
  unter Durchführung der Manipulation parallel ohne Oligonukleotid oder Polynukleotid-Konstrukt oder
  mit einem veränderten, nicht mehr den Ansprüchen 1 oder 7 bis 9 entsprechenden Oligonukleotid oder Polynukleotidkonstrukt,
• c) parallele Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit mindestens einer Test-Zelle und mindestens einer Konrollzelle und/oder einer Präparation aus solchen Zelle, die mindestens ein Rezeptorprotein, ausgewählt aus der Vanilloid-Rezeptor- Familie, vorzugsweise den VR-1-Rezeptor, synthetisiert hat
• d) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von den Zellen synthetisierten Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein veränderten funktionellen Parameter,
• e) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Meßwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle bereits vor den Verfahrensschritten (a) und (a') gentechnisch manipuliert wird.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines Mitglieds der Vanilloid-Rezeptor-Familie, vorzugsweise der VR-1-Rezeptor, exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden eines Mitglieds der Vanilloid-Rezeptor-Familie, vorzugsweise des VR-1-Rezeptors, erfolgt.

29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den parallelen Verfahrensschritten (a) und (a') und dem Verfahrensschritt (b) ≧ 8 h, vorzugsweise ≧ 12 h, insbesondere ≧ 24 h, vergehen.

30. Verfahren zur Diagnose von Krankheitsbildern, die mit veränderter Expression von Genen der Vanilloid-Rezeptor-Familie verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Diagnose über eine Quantifizierung der Bindung eines Oligo- oder Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 oder 15 und/oder mindestens einem Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 15 an eine RNA erfolgt.