Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Verfügung zu
stellen, mit deren Hilfe Stoffe bzw. Substanzen aufgefunden werden
können,
die zur Be handlung von vermehrtem Harndrang bzw. Harninkontinenz
hilfreich sind ebenso wie Stoffe bzw. Substanzen als solche zur
Behandlung der vorgenannten Indikationen, die bei wirksamer Dosierung
bevorzugt gleichzeitig geringere Nebenwirkungen aufweisen als solche aus
dem Stand der Technik. Eine weitere Aufgabe ist es, Zielstrukturen
bzw. Zielsubstanzen („targets") zu identifizieren,
die als Angriffspunkte für
potentielle Arzneimittelwirkstoffe in erfindungsgemäßen Verfahren
zum Einsatz kommen können.
Überraschenderweise
wurde erfindungsgemäß nunmehr
festgestellt, dass die Serin/Threonin-Kinasen der PIM-Subfamilie,
insbesondere die Kinasen PIM-1 und PIM-3, an der Blasenkontrolle
beteiligt sind.
Daraus
folgend war primäre
Aufgabe der Erfindung, ein Screeningverfahren zur Identifizierung
von Substanzen, die zur Kontrolle der Blasenfunktion befähigt sind,
insbesondere Harndrang- bzw. Harninkontinenz-regulierender Substanzen,
zu entwickeln. Die Erfindung betrifft daher insbesondere ein Verfahren
zur Auffindung Harndrang- bzw. Harninkontinenz-regulierender Substanzen
bzw. die Verwendung von PIM-Kinasen, insbesondere PIM-1- und/oder
PIM-3-Kinase, in einem Verfahren zur Auffindung Harndrang- bzw.
Harninkontinenz-regulierender Substanzen bzw. ein Verfahren zur
Auffindung Harndrang- bzw. Harninkontinenzregulierender Substanzen
unter Verwendung von PIM-1- und/oder PIM-3-Kinase, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Inkubation
einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit einer
Zelle und/oder einer Präparation
aus einer solchen Zelle, die das Protein PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase
und/oder ein Protein gemäß einer
der 1b), 1d), 1f), 2b), 2d) oder 2f) und/oder
ein zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches
Protein und/oder ein Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches
Polynukleotid kodiert, und/oder ein Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert
wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
deren Antisense-Polynukleotide binden, oder ein mindestens 10 Aminosäuren langes
Teilprotein eines der vorgenannten Proteine synthetisiert hat,
- (b) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von der Zelle
synthetisierten Protein oder Teilprotein oder Messung mindestens
eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein oder
Teilprotein veränderten
funktionellen Parameter.
Erfindungsgemäß kann in
in vitro Verfahren untersucht werden, inwieweit mit PIM-Kinasen,
insbesondere PIM-1/3-Kinasen, wechselwirkende Substanzen die Blasenkontrolle
beeinflussen. Dies gilt insbesondere bei peripherer Wirkung der
Testsubstanzen. Hierzu werden vorzugsweise Blasenstreifen, bspw.
eines Versuchstieres (bspw. der Maus oder Ratte), präpariert
und in einer Organbadapparatur unter Verwendung einer geeigneten
Nährlösung unter
isometrischen Bedingungen befestigt. Testsubstanzen werden, vorzugsweise
als Lösungen,
der Nährlösung hinzugegeben.
Nach Zugabe der Testsubstanzen wird ein Messparameter bestimmt,
der eine Aussage über
die biologische Wirkung der Testsubstanz auf die Blasenstreifen
zulässt.
Bspw. wird die Kontraktionskraft der Blasenstreifen, ggf. in Abhängigkeit
von der Konzentration der zugegeben Testsubstanz, oder Ableitungen
der Messwerte, bspw. die Kraftanstiegssteilheit, bestimmt.
Dieses
neuartige Screeningverfahren basiert darauf, daß hier eine potentielle Wirksamkeit
einer Substanz über
ihre Wechselwirkung mit einer Harninkontinenzregulierenden Proteinstruktur,
insbesondere PIM-1- oder PIM-3-Kinase oder verwandte Strukturen,
aufgefunden werden kann.
Dabei
bezieht sich der Begriff Harninkontinenz-regulierend auf einen potentiellen
regulierenden Einfluß auf
das physiologische Geschehen im Zusammenhang mit einer Harninkontinenz
bzw. dem Harndrang (vgl. die obigen Ausführungen zur Phänomenologie
der Harninkontinenz und des Harndrangs), insbesondere eine Harninkontinenz-
bzw. Harndrang-hemmende Wirkung. Der Begriff Substanz umfaßt jede
als Arzneimittel-Wirkstoff geeignete Verbindung, insbesondere also
niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch andere wie Nukleinsäuren, Fette,
Zucker, Peptide oder Proteine wie Antikörper.
Die
Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen,
daß die
zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden
Präparation
in einem wässrigen
Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Dabei
kann das wässrige
Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise
bei Raumtemperatur oder bei 37°C.
Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren
Stunden variiert werden, je nach der Wechselwirkung der Substanz
mit dem Teilprotein oder Protein. Bevorzugt sind aber Zeiten zwischen
1 min und 60 min. Das wäßrige Medium
kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so daß bei der
Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise
pH 7,0 – 7,5
im Medium herrscht. Dem Medium können
weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden.
Die geeigneten Bedingungen können
vom Fachmann in Abhängigkeit
von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Teilprotein
oder Protein aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger,
einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren
einen möglichst
deutlichen Meßwert
zu erhalten.
Eine
Zelle, die ein bestimmtes Teilprotein oder Protein synthetisiert
hat, ist eine Zelle, die dieses Teilprotein oder Protein bereits
endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurde,
so daß sie
dieses Teilprotein oder Protein exprimiert und entsprechend vor
Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens
das Teilprotein oder Protein enthält. Die Zellen können Zellen
aus evtl. immortalisierten Zellinien sein oder native aus Geweben
stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zellverband
meist aufgelöst
ist. Die Präparation
aus diesen Zellen umfaßt
insbesondere Homogenate aus den Zellen, das Cytosol, eine Membranfraktion
der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen
etc.
Die
hier aufgezählten
Proteine und Teilproteine wurden im Rahmen dieser Erfindung als
bei der Kontrolle der Blasenfunktion beteiligt identifiziert, in
dem ein PIM-Kinase-defizientes,
insbesondere ein PIM-1- bzw. PIM-3-defizientes Tier hinsichtlich
des Miktionsverhaltens untersucht wurde.
Aus
welcher Spezies diese Proteine stammen, ist für die Funktion des Verfahrens
unerheblich, es ist aber bevorzugt, die humane, Maus- oder Ratten-Variante
zu verwenden. Die PIM-1-Kinase und die PIM-3-Kinase sind in Hinblick
auf die kodierende DNA- und die Aminosäure-Sequenz bekannt und auch
in Ihrer generellen Funktion beschrieben. Keine dieser Kinasen wurde
aber bisher im Stand der Technik in einen Zusammenhang mit Harninkontinenz
oder Harndrang, insbesondere der Regulation der Blasenfunktion,
gebracht. Da hier die Identifizierung der Proteine über eine
Veränderung
des Miktionsverhaltens in einem In-vivo-Modell erfolgte, hat das
daraus abgeleitete erfindungsgemäße Screening-Verfahren
für zukünftige Arzneimittel
unter Verwendung dieser Proteine den erheblichen Vorteil, nicht
nur auf theoretischen Überlegungen
aufzubauen, sondern vermutlich eine starke In-vivo-Relevanz zu besitzen.
Da mit diesem Verfahren die Wechselwirkung von Substanzen mit im
Bereich der Harninkontinenz bzw. dem Harndrang bisher nicht verwendeten
Proteinen und Peptiden als Maßstab
für das
Auffinden harnblasenregulierender Substanzen ermöglicht wird, sind mit dem erfindungsgemäßen erfahren
potentiell zur Behandlung von Harninkontinenz bzw. Harndrang geeignete Substanzen
aufzufinden, die bei den im Stand der Technik bisher bekannten Verfahren
mit anderen Peptiden oder Proteinen nicht aufgefallen wären. Auch
dies ist ein erheblicher Vorteil des neuen erfindungsgemäßen Verfahrens.
Der
Maßstab, über den
das Verfahren die Auffindung interessanter Substanzen erlaubt, ist
entweder die Bindung an das Protein oder Teilprotein, die z.B. durch
Verdrängung
eines bekannten Liganden oder das Ausmaß gebundener Substanz nachgewiesen
werden kann, oder die Veränderung
eines funktionellen Parameters durch die Wechselwirkung der Substanz
mit dem Teilprotein oder Protein.
Diese
Wechselwirkung kann insbesondere in einer Regulation, Hemmung und/oder
Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen liegen
und veränderte
funktionelle Parameter können
beispielsweise die Genexpression, das Ionenmilieus, der pH oder
das Membranpotentials, bzw. die Veränderung der Enzymaktivität oder der
Konzentration der 2nd messenger sein.
Zur
Erläuterung
der Erfindung werden im folgenden neben den im allgemeinen Text
zu Begriffen gegebenen Erklärungen
weitere Definitionen angegeben, um klarzustellen, wie bestimmte,
insbesondere in den Ansprüchen
verwendete Begriffe im Sinne dieser Erfindung zu verstehen und auszulegen
sind.
- – Substanz:
Damit ist eine chemische Verbindung gemeint. Hier handelt es sich
im engeren Sinne um Verbindungen, die potentiell eine Wirkung im
Körper
entfalten können,
niedermolekulare Wirkstoffe, Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide
oder Proteine, insbesondere hier niedermolekulare Wirkstoffe.
- – Harninkontinenz-
bzw. Harndrang-regulierend: Im Sinne der Erfindung heißt Harninkontinenz-regulierend, daß die Substanz
die Funktion der Harnblase direkt oder indirekt beeinflußt, insbesondere
natürlich
einer Harninkontinenz bzw. einem Harndrang entgegenwirkt.
- – Inkubation:
Unter Inkubation ist das Einbringen und Belassen eines biologischen
Untersuchungsobjektes, beispielsweise einer Zelle oder eines Proteins,
in einem temperierten Medium wie in einem Brutschrank oder auf einem
Wasserbad zu verstehen. Dabei bedeutet hier unter geeigneten Bedingungen
eine Inkubation unter physiologischen Bedingungen (z.B. 37°C, pH 7,2)
oder bei den Bedingungen, bei denen eine optimale Messung im Verfahren
möglich
wird.
- – Zelle:
Die Zelle ist ein sich selbst regulierendes, offenes, mit seiner
Umgebung durch permanenten Stoffaustausch in einem Fließgleichgewicht
stehendes System mit eigenem Stoffwechsel, und Vermehrungsfähigkeit.
Die Zelle kann separat kultiviert oder Teil eines Gewebes, insbesondere
aus einem Organ, sein, und dort vereinzelt oder noch im Zellverband
vorliegen.
- – Präparation
aus einer Zelle: Darunter versteht man Präparate, die mittels chemischer,
biologischer, mechanischer oder physikalischer Methoden unter Änderung
der Zellstruktur hergestellt werden, beispielsweise Membranfragmente,
isolierte Zellkompartimente, isoliertes Cytosol, oder aus Gewebe
gewonnenes Homogenat.
- – Peptid:
Verbindung aus über
peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften Aminosäuren. Ein
Oligopeptid besteht aus zwischen 2 und 9 Aminosäuren, ein Polypeptid aus zwischen
10 und 100 Aminosäuren.
- – Protein:
Verbindung aus über
peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften mehr als 100 Aminosäuren u.U.
mit einer definierten Raumstruktur.
- – Teilprotein:
Verbindung aus über
peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften mehr als 10 Aminosäuren u.U.
mit einer definierten Raumstruktur aber ausgeschnitten bzw. ausgewählt aus
einem definierten Priotein. Ein Teilprotein kann ein Peptid sein.
- – PIM-Kinase:
ein Mitglied der PIM-Kinase-Subfamilie. Bei den PIM-Kinasen handelt
es sich um Serin-Threonin-Proteinkinasen. Sie weisen eine ATP-Bindungsstelle auf.
Zu dieser Subfamilie gehören
bspw. die PIM-1-, PIM-2- oder
PIM-3-Kinase.
- – Polynukleotid:
Das zugrundeliegende Nukleotid ist ein grundsätzlich aus Nukleinbase, Pentose
und Phosphorsäure
bestehender Grundbaustein der Nukleinsäuren. Diese entspricht einem
hochmolekularen Polynucleotid aus mehreren Nukleotiden, die über Phosphorsäure-Pentose-Veresterung
miteinander verknüpft sind.
Unter diesem Begriff fallen erfindungsgemäß aber auch modifi zierte Polynukleotide,
die zwar die Basenabfolge beibehalten, aber über ein modifiziertes Rückrat statt
der Phosphorsäure-Pentose
verfügen.
- – zu
mindestens 90 (95, 97)% ähnlich:
Darunter ist zu verstehen, daß die
hiermit erfaßten
Polynucleotide in ihrem kodierenden Bereich bezüglich der Basenabfolge zu mindestens
90% (95%, 97%) identisch mit der Referenz (Abbildung etc.) sind
und die mit diesem Ausdruck erfaßten Peptide und Proteine in
ihrer Primärstruktur,
der Abfolge der Aminosäuren
zu mindestens 90% (95%, 97%) mit der Referenz identisch sind.
- – Gen:
Mit dem Begriff Gen wird ein Genomabschnitt mit einer definierten
Nukleotidsequenz bezeichnet, der die Information zur Synthese einer
m- oder prä-mRNA
oder einer sonstigen RNA (z.B. tRNA, rRNA, snRNA etc.) enthält. Es besteht
aus kodierenden und nicht kodierenden Abschnitten.
- – Genfragment:
Nukleinsäureabschnitt,
der in seiner Basenabfolge einen Teilbereich eines Gens beinhaltet.
- – Bindung
an das Peptid, Teilprotein oder Protein: Wechselwirkung zwischen
Substanz und Peptid, Teilprotein oder Protein, die zu Fixierung
führt.
- – funktionelle
Parameter: Meßgrößen eines
Experimentes, die mit der Funktion eines Proteins (Ionenkanal, Rezeptor,
Enzym) korrelieren.
- – gentechnisch
manipuliert: Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart,
daß hier
genetisches Material eingebracht bzw. verändert wird
- – endogen
exprimiert: Expression eines Proteins, die eine Zelllinie unter
geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne daß dieses entsprechende Protein
durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde.
- – G-Protein:
International übliche
Abkürzung
für ein
Gunaosintriphosphat (GTP)-bindendes
Protein, das als Signalprotein durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren
aktiviert wird.
- – Reportergen:
Generelle Bezeichnung für
Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer Methoden
oder histochemischer Methoden einfach nachweisen lassen, wie z.B.
Luziferase, alkalische Phosphatase oder Green Fluorescent Protein
(GFP).
- – (rekombinantes)
DNA-Konstrukt: Generelle Bezeichnung für jede Art von DNA-Molekülen, die
durch die in vitro-Verknüpfung
von DNA-Molekülen
entstanden sind.
- – Klonierungsvektor:
Generelle Bezeichnung für
Nukleinsäure-Moleküle, die
beim Klonieren als Träger
von Fremdgenen oder Teilen dieser Gene dienen.
- – Expressionsvektor:
Bezeichnung für
speziell konstruierte Klonierungsvektoren, die nach Einbringen in eine
geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in den
Vektor einklonierten Fremdgens erlauben.
- – LTR-Sequenz:
Abkürzung
für Long
Terminal Repeat. Generelle Bezeichnung für längere Sequenzbereiche, die
an beiden Enden eines linearen Genoms zu finden sind. Derartige
Sequenzbereiche kommen z.B. in den Genomen von Retroviren und an
den Enden eukaryontischer Transposons vor.
- – Poly-A-Schwanz:
Am 3'-Ende von messenger-RNAs
durch Polyadenylierung angehefteten Adenyl-Reste (ca. 20-250).
- – Promotor-Sequenz:
Bezeichnung für
einen DNA-Sequenzbereich, von dem aus die Transkription eines Gens,
d.h. die Synthese der mRNA, gesteuert wird.
- – ORI-Sequenz:
Abkürzung
für Origin
of Replication. Die ORI-Sequenz erlaubt einem DNA-Molekül, sich als
autonome Einheit in der Zelle zu vermehren.
- – Enhancer-Sequenz:
Bezeichung für
relativ kurze, zum Teil als Repetitionen auftretende, genetische
Elemente, die in der Regel die Expression mancher Gene in unterschiedlichem
Maße verstärken.
- – Transkriptionsfaktor:
Bezeichnung für
ein Protein, das über
eine Bindung an spezifische DNA-Sequenzen die Transkription eines
Gens beeinflußt.
- – kultivieren:
Zellen oder Gewebe unter geeigneten Kulturbedingungen halten
- – Bedingungen,
die eine Expression erlauben: Darunter versteht man die Auswahl
und Anwendung von Kulturbedingungen, die eine Expression des interessierenden
Proteins erlauben. Dazu gehören
Temperaturänderung,
Mediumwechsel, Zusatz von induzierenden Substanzen, Weglassen hemmender
Substanzen.
- – Inkubationszeit:
Zeitdauer, für
die Zellen oder Gewebe inkubiert, d.h. einer definierten Temperatur
ausgesetzt werden.
- – Selektionsdruck:
Anwendungen von Kulturbedingungen, die Zellen mit einem bestimmtem
Genprodukt, dem sog. Selektionsmarker, einen Wachstumsvorteil verschaffen.
- – Amphibienzelle:
Zelle aus einem Tier der Klasse der Amphibia.
- – Bakterienzelle:
Zelle, die dem Überreich
der Eubacteria oder Archaebacteria zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
- – Hefezelle:
Zelle, die der Ordnung der Endomycetalse zuzuordnen ist, oder von
ihr abstammt.
- – Insektenzelle:
Zelle, die der Ordnung der Hexapoda zuzuordnen ist, oder von ihr
abstammt.
- – native
Säugetierzelle:
Aus einem Säugetier
stammende Zelle, die in ihren relevanten Merkmalen der im Organismus
befindlichen Zelle entspricht.
- – immortalisierte
Säugetierzelle:
Zelle, die durch die angewendeten Kulturbedingungen oder gentechnische Manipulation
die Eigenschaft erlangt hat, sich über die normalerweise übliche Teilungshäufigkeit
hinaus (ca.100) in der Kultur zu teilen.
- – markiert:
Durch entsprechende Modifizierung oder Derivatisierung für eine Nachweisreaktion
zugänglich gemacht.
Beispielsweise radioaktiv, fluoreszierend oder lumineszierend.
- – Ligand:
Substanz, die an ein im Körper
oder einer Zelle befindliches Molekül, im speziellen einen Rezeptor,
bindet.
- – Verdrängung: Vollständiges oder
partielles Entfernen eines Liganden von seiner Bindungsstelle.
- – gebundene
Aktivität:
Biochemisch oder physikalisch erfaßter Meßwert, der mit der an einen
Rezptor gebundenen Ligandenmenge korreliert.
- – Regulation:
Die als Teil eines Regelprozesses erfolgte Hemmung oder Aktivierung
eines Vorgangs.
- – Hemmung:
Als Sonderfall der Regulation die Verhinderung/Minderung eines Vorgangs.
- – Aktivierung:
Als Sonderfall der Regulation die Verstärkung eines Vorgangs.
- – Rezeptoren:
Im weitesten Sinne alle im pro- oder eukaryoten Organismus vorhandenen
Moleküle,
an die ein Wirkstoff binden kann. Im engeren Sinne membrangebundene
Proteine oder Komplexe mehrerer Proteine, die durch Bindung eines
Wirkstoffes eine Änderung
in der Zelle hervorrufen.
- – Ionenkanäle: Membrangebundene
Proteine oder Komplexe mehrerer Proteine, durch die Kationen oder Anionen
durch die Membran hindurchgelangen können.
- – Enzyme:
Bezeichnung für
Proteine oder Komplexe aus einer aktivierenden Nichteiweißkomponente
mit einem Protein, die katalytische Eigenschaften besitzen.
- – Genexpression
(exprimieren/exprimierbar): Das Übersetzen
der genetischen Information eines Genes in RNA (RNA-Expression)
oder in Protein (Proteinexpression).
- – Ionenmilieu:
Ionenkonzentration eines oder mehrerer Ionen in einem bestimmten
Kompartiment.
- – Membranpotential:
Spannungsdifferenz über
einer Membran aufgrund eines Überschusses
an Kationen auf der einen Seite und Anionen auf der anderen Seite
der Membran.
- – Veränderung
der Enzymaktivität:
Hemmung oder Induktion der katalytischen Aktivität eines Enzyms.
- – 2nd messenger: Kleines Molekül, das als
Antwort auf ein extrazelluläres
Signal entweder im Cytosol gebildet wird oder in das Cytosol hineinwandert
und dabei hilft, die Information an das Zelliniere weiterzugeben, wie
zum Beispiel CAMP, IP3.
- – (Gen-)Sonde:
Bezeichnung für
jede Art von Nukleinsäuren,
mit deren Hilfe man ein gesuchtes Gen oder eine bestimmte DNA-Sequenz
nachweisen kann. Durch Derivatisierung der Gensonde (z.B. Biotin,
magnetische Beads, Digoxinin) können
zudem DNA-Moleküle
aus einem Gemisch herausgezogen werden. Als Sonden werden klonierte
Gene, Genfragmente, chemisch synthetisierte Oligonukleotide und
auch RNA verwendet, die meist radioaktiv markiert ist.
- – DNA:
Internationale Bezeichnung für
Desoxyribonukleinsäure.
- – genomische
DNA: Generelle Bezeichnung für
die bei eukaryontischen Organismen aus dem Zellkern einer Zelle
stammenden DNA.
- – cDNA:
Abkürzung
für complementary
DNA. Bezeichnung für
die einzel- bzw. doppelsträngige
DNA-Kopie eines RNA-Moleküls.
- – cDNA-Bank/Bibliothek:
Bezeichung für
eine Sammlung von willkürlich
klonierten cDNA-Fragmenten, die zusammengenommen die Gesamtheit
aller von einer Zelle oder einem Gewebe synthetisierten RNA repäsentieren.
- – cDNA-Klon:
Bezeichnung für
eine Population genetisch einheitlicher Zellen, die sich von einer
einzigen Zelle ableiten, derart, daß diese Zelle eine künstlich
eingebrachtes cDNA-Fragment enthält.
- – Hybridisierung:
Durch Basenpaarung bewirkte Ausbildung eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls aus zwei
getrennten Einzelsträngen.
- – stringente
Bedingungen: Bedingungen, unter denen nur perfekt basengepaarte
Nukleinsäure-Stränge gebildet
werden und stabil bleiben.
- – isolieren:
Ein gesuchtes Molekül
aus einem Gemisch herausfinden und abtrennen.
- – DNA-Seauenzierung:
Bestimmung der Abfolge der Basen in einem DNA-Molekül.
- – Nukleinsäuresequenz:
Bezeichnung für
die Primärstruktur
eines DNA-Moleküls, d.h.
die Abfolge der einzelnen Basen, aus denen sich eine DNA zusammensetzt.
- – Genspezifische
Oligonukleotid-Primer: Oligonukleinsäuren, also 10-40 Basen lange
Nukleinsäurefragmente,
die in ihrer Basenzusammensetzung eine stringente Hybridisierung
an das gesuchte Gen oder die gesuchte cDNA erlauben.
- – Ermitteln
von Oligonukleotid-Primern: Die manuelle oder Computerunterstützte Suche
von Oligonukleotiden zu einer vorgegebenen DNA-Sequenz, die für eine Hybridisierung
und/oder eine Polymerase-Kettenreaktion optimal geeignet sind.
- – PCR:
Abkürzung
für Polymerase-Kettenreaktion.
In vitro-Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen
definierter Länge
und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen.
- – DNA-Template:
Nukleinsäuremolekül oder ein
Gemisch von Nukleinsäuremolekülen, aus
denen ein DNA-Abschnitt mit Hilfe der PCR (s.o.) vervielfältigt wird.
- – RNA:
International gebräuchliche
Abkürzung
für Ribonukleinsäuren.
- – mRNA:
International gebräuchliche
Abkürzung
für messenger-Ribonukleinsäuren, die
am Transfer der genetischen Information aus dem Kern in die Zelle
beteiligt sind und die Information für die Synthese eines Polypetids
oder eines Proteins beinhalten.
- – Antisense-Polynukleotid:
Eine aus mehreren natürlichen
oder modifizierten Nukleinsäuren
bestehendes Molekül,
deren Basenabfolge komplementär
zur Basenabfolge eines Teilbereiches einer in der Natur vorkommenden
RNA ist.
- – PNA:
International gebräuchliche
Abkürzung
für Peptide
Nucleic Acids. Hierbei bilden peptidisch verknüpfte Aminosäuren eine Kette, wobei die
Aminosäuren
als Seitenkette eine zur Hybridisierung mit DNA oder RNA befähigten Base
trägt.
- – Sequenz:
Abfolge von Nukleotiden oder Aminosäuren. Im spezifischen Sinne
dieser Erfindung ist damit die Nukleinsäuresequenz gemeint.
- – Ribozym:
Bezeichnung für
eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure (z.B. Ligase, Endonuklease,
Polymerase, Exonuklease).
- – DNA-Enzym:
Bezeichnung für
ein DNA-Molekül,
das katalytische Aktivität
beinhaltet (z.B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease).
- – katalytische
RNA/DNA: generelle Bezeichnung für
Ribozyme bzw. DNA-Enzyme
(s.o.).
- – Adenovirus:
Bei Vertebraten vorkommender cytopathogener Virus.
- – Adenoassoziiertes
Virus (AAV): Gehört
zur Familie der Parvoviren. Für
eine effektive Vermehrung des AAV ist eine Coinfektion der Wirtszellen
mit Helferviren (z.B. Herpes-, Vaccinia- oder Adenoviren) erforderlich.
Die Eigenschaft von AAV, stabil in das Wirtsgenom zu integrieren,
macht es als Transduktionsvektor für Säugetierzellen besonders interessant.
- – Herpesvirus:
Viraler Erreger der Herpes-Infektion.
- – posttranslationale
Modifikation: Veränderung
an Proteinen oder Polypetiden, die nach der Translation durchgeführt wird.
Hierzu zählen
z.B. Phosphorylierung, Glykosylierung, Amidierung, Acetylierung
oder Proteolyse.
- – glykosilieren:
Bezeichnung für
das Anhängen
von einzelnen Zuckermolekülen
oder ganzen Zuckerketten an Proteine.
- – phosphorylieren:
Bezeichnung für
das Anhängen
von einem oder mehreren Phosphatresten an ein Protein, bevorzugt
an die OH-Gruppen der Aminosäuren
Serin, Threonin oder Tyrosin.
- – amidieren:
Die Bezeichnung für
das Umwandeln einer Carboxylfunktion in eine Amidfunktion, z.B.
an den carboxyterminalen Aminosäurerest
eines Peptides oder Proteins.
- – mit
Membrananker versehen: Posttranslationelle Modifikation eines Proteins
oder eines anderen organischen Moleküls, derart daß es durch
Anhängen
eines hydrophoben Moleküls,
geeigneterweise eine Fettsäure
oder ein Derivat derselben, an die Lipiddoppelschicht-Membran von
Zellen verankert wird.
- – spalten:
In diesem spezifischen Fall die Spaltung eines Peptids oder Proteins
in mehrere Untersequenzen.
- – verkürzen: Ein
aus mehreren Einzelteilen bestehendes Molekül um eine oder mehrere Teile
zu verkürzen.
- – Antikörper: Lösliche,
oder an Zellmembranen gebundene, als Immunglobuline bezeichnete
Proteine mit einer spezifischen Bindungsstelle für Antigene.
- – monoklonaler
Antikörper:
Gegen eine einzige antigene Determinante eines Antigens gerichtete
Antikörper mit
extrem hoher Selektivität.
- – polyklonaler
Antikörper:
Gemisch aus Antikörpern,
die gegen mehrere Determinanten eines Antigens gerichtet sind.
- – transgen:
Genetisch verändert.
- – nichthumanes
Säugetier:
Die Gesamtheit der Säugetiere
(Klasse der Mammalia) mit Ausnahme der Spezies Mensch.
- – Keim-Zelle:
Zelle mit haploidem Genom, die durch Verschmelzung mit einer zweiten
Keimzelle die Bildung eines neuen Organismus ermöglicht.
- – somatische
Zelle: Diploide Zelle als Bestandteil eines Organismus
- – chromosomale
Einbringung: Eingriff in die Nukleotidsequenz auf chromosomaler
Ebene.
- – Genom:
Allgemeine Beschreibung für
die Gesamtheit aller Gene in einem Organismus
- – Vorfahr
des Tieres: Ein Tier (der Vorfahr), das auf natürliche oder künstliche
Weise durch Weitergabe an seinem genetischen Material in direkter
Linie mit einem anderen Tier (dem Nachfahren) verwandt ist.
- – exprimierbar:
Ein Nukleinsäuremolekül ist dann
exprimierbar, wenn es die Information zur Synthese eines Proteins
oder Polypetids beinhaltet und mit ensprechenden regulatorischen
Sequenzen versehen ist, die eine Synthese dieses Proteins oder Polypeptids
in vitro oder in vivo erlauben. Wenn diese Voraussetzungen nicht
mehr gegeben sind, beispielsweise durch Eingriff in der kodierenden
Sequenz, ist das Nukleinsäuremolekül nicht
mehr exprimierbar.
- – Nagetier:
Tier aus der Ordnung der Rodentia, z.B. Ratte oder Maus.
- – als
Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifizierbar:
Substanz, die bei Einbringung in einen lebenden Organismus eine
Verhaltensänderung
bewirkt, die der Fachmann als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-hemmend
bezeichnet. Im Falle des Screeningverfahrens bezieht sich das darauf, daß die Substanz
beim Screening durch stärkere
Bindung oder Auslösung
einer Änderung
eines funktionellen Parameters deutlich, beispielsweise 100 %, die
Bindung oder Wechselwirkung des Durchschnitts der getesteten Substanzen übertrifft.
- – Verbindung:
Ein anderer Name für
Molekül,
als aus mehreren Atomen bestehend, hier ein durch das erfindungsgemäße Verfahren
identifiziertes Molekül.
- – Wirkstoff:
Eine Verbindung, die bei Anwendung an einem Organismus eine Veränderung
in diesem Organismus hervorruft. Im Besonderen werden darunter organisch-chemisch
synthetisierte Moleküle
verstanden, die auf den Organismus eine heilende Wirkung ausüben. Hier
insbesondere Moleküle,
die an die erfindungsgemäßen Proteine
und Peptide binden.
- – niedermolekular:
Molekül
mit einem Molekulargewicht < 2kDa.
- – Arzneimittel:
Ein Stoff entsprechend der Definition im Artikel 1 § 2 des Gesetzes über den
Verkehr mit Arzneimitteln.
- – Diagnostikum:
Verbindung oder Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Krankheit
zu diagnostizieren.
- – Behandlung
von Harninkontinenz bzw. Harndrang: Verfahren, mit dem Ziel Harninkontinenz
bzw. Harndrang zu lindern oder aufzuheben, oder das zu erwartende
Auftreten von Harninkontinenz bzw. Harndrang zu hemmen.
- – chronische
Harninkontinenz bzw. chronischer Harndrang: Länger anhaltende Harninkontinenz
bzw. länger
anhaltender Harndrang.
- – Gentherapie:
Unter Gentherapie versteht man alle Verfahren, die das Ziel haben,
genetische Erkrankungen durch geeignete Veränderungen des Genoms kausal
zu behandeln.
- – In-vivo-Gentherapie:
Einbringen von genetischem Material in den lebenden Organismus mit
dem Ziel der Gentherapie. Man kann zwischen somatischem und Keimbahn-Eingriff
unterscheiden, der einmal an diploiden Zellen und einmal an haploiden
Zellen stattfindet.
- – In-vitro-Gentherapie:
Einbringen von genetischem Material in Zellen außerhalb des menschlichen Körpers mit
dem Ziel, diese nachher wieder durch Einbringen in den menschlichen
Körper
zur Gentherapie zur verwenden.
- – Diagnostik:
Verfahren, um eine Krankheit zu identifizieren.
- – Wirksamkeitsuntersuchung:
Untersuchung mit dem Ziel, die Wirksamkeit einer Verbindung nach
Einwirkung auf einen lebenden Organismus zu untersuchen.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens wird die Zelle vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert.
Dabei wird genetisches Material in die Zelle eingebracht, insbesondere
eine oder mehrere Polynukleotidsequenzen. In einer weiter bevorzugten
Variante dieser Ausführungsform
erlaubt die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines
der durch die Testsubstanz veränderten
funktionellen Parameter. In dieser Ausführungsform werden durch gentechnische
Manipulation Voraussetzungen geschaffen, unter denen die Verände rung
eines funktionellen Parameters überhaupt
oder verbessert gemessen werden kann. Dabei ist es insbesondere
bevorzugt, daß durch
die gentechnische Manipulation eine in der Zelle nicht endogen exprimierte
Form eines G-Proteins exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.
Darunter ist insbesondere die gentechnische Einführung eines endogen nicht vorhandenen
oder physiologisch nicht exprimierten G-Proteins (GTP-bindenden
Proteins) in die Zelle zu verstehen, beispielsweise die Einführung eines
chimären G-Proteins,
das eine Veränderung
des Signalweges erlaubt oder eines promiskuitiven G-Proteins, das
sehr bindungsfreudig ist. Die Einführung eines Reportergens wiederum
erlaubt die Messung einer (extrazellulär ausgelösten) induzierten Expression
des Genproduktes.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird die Zelle gentechnisch so manipuliert, daß die Zelle mindestens ein
Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2a) oder 2e) oder
ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches
Polynukleotid enthält.
Damit kann beispielsweise erreicht werden, daß ein Teilprotein oder Protein,
das in der im Verfahren verwendeten Zelle oder Präparation
nicht endogen exprimiert wird, von der Zelle synthetisiert wird.
Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn das Polynukleotid in einem
rekombinanten DNA-Konstrukt
enthalten ist. Unter einem (rekombinanten) DNA-Konstrukt versteht
man ein in vitro hergestelltes DNA-Molekül.
Wenn
beim Verfahren vor dem Schritt a) die Zelle gentechnisch manipuliert
wird, ist es bevorzugt, daß die
Zelle nach der gentechnischen Manipulation und vor dem Schritt (a)
unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird,
gegebenenfalls unter Selektionsdruck. Unter kultivieren versteht
man, Zellen oder Gewebe bei Bedingungen, die ein Überleben
der Zellen, bzw. deren Nachfolgegeneration sichern, zu halten. Dabei
sollten die Bedingungen hier so gewählt werden, daß eine Expression
des durch die gentechnische Manipulation eingefügten Materials ermöglicht wird.
Dazu sollten pH, Sauerstoffgehalt, und Temperatur physiologisch
gehalten sein und ausreichend Nährstoffe
und notwendige Cofaktoren beigefügt
sein. Der Selektionsdruck erlaubt, nur die Zellen weiter zu kultivieren,
bei denen die gentechnische Manipulation zumindest teilweise erfolgreich war.
Dazu gehört
beispielsweise die Einführung
einer Antibiotikaresistenz über
das DNA-Konstrukt.
Es
ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
besonders bevorzugt, wenn die verwendete Zelle eine Amphibienzelle,
Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte
oder native Säugetierzelle ist.
Beispiele für
Amphibienzellen sind Xenopus Oocyten, für Bakterienzellen E-coli-Zellen,
für Hefezellen
solche von Saccharomyces cerevisiae, für Insektenzellen Sf9-Zellen,
für immortalisierte
Säugetierzelle
HeLa-Zellen und für
native Säugetierzellen
die CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zelle.
Bei
einer bevorzugten Meßmethode
zur Feststellung der Bindung der Substanz an ein Teilprotein oder Protein
im erfindungsgemäßen Verfahren
erfolgt die Messung der Bindung über
die Verdrängung
eines bekannten markierten Liganden vom Teilprotein oder Protein
und/oder über
die daran gebundene Aktivität
einer markierten Testsubstanz. Dabei ist ein Ligand ein mit hoher
Spezifität
an das Protein oder Teilprotein bindendes Molekül, das durch eine ebenfalls
bindende, zu testende Substanz aus der Bindungsstelle verdrängt wird. Unter
Markierung ist eine den Nachweis erleichternde künstliche Modifikation am Molekül zu verstehen.
Beispiele sind radioaktive, fluoreszierende oder lumineszierende
Markierung.
Bei
einer anderen bevorzugten Meßmethode
zur Feststellung der durch die Bindung der Substanz an das Teilprotein
oder Protein im erfindungsgemäßen Verfahren
ausgelösten
Veränderung
der funktionellen Parameter, erfolgt die Messung mindestens eines
der durch die Testsubstanz veränderten
funktionellen Parameter über
Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren,
Ionenkanälen
und/oder Enzymen, insbesondere über
Messung der Veränderung
der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, über Veränderung
der Enzymaktivität
oder der Konzentration der 2nd messenger.
Damit ist auf der einen Seite direkt die Messung der Wirkung der
Substanz über
die Beeinflußung
von Rezeptoren, Ionenkanälen
und/oder Enzymen erfaßt,
auf der anderen Seite als bevorzugt zu messende Beispiele sich än dernder
Parameter wie Genexpression, Ionenmilieu, pH, Membranpotential,
Enzymaktivität
oder Konzentration der 2nd messenger. Dabei
versteht man unter Ionenmilieu insbesondere die Konzentration eines
oder mehrer Ionen in einem Zellkompartiment, insbesondere dem Cytosol,
unter Membranpotential die Ladungsdiffferenz zwischen zwei Seiten
einer Biomembran und unter 2nd messenger
Botenstoffe des intrazellulären
Signalwegs wie z.B. zyklisches AMP (cAMP), Inosotoltriphosphat (IP3)
oder Diacylglycerol (DAG).
In
einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird das Teilprotein oder
Protein in den Schritten (a) und (b) ausgewählt aus:
- – der PIM-1-Kinase,
- – einem
Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c) oder 1e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise
95%, insbesondere 97%, ähnliches
Polynukleotid kodiert,
- – einem
Protein mit einer Aminosäuresequenz
gemäß einer
der 1b), 1d) oder 1f), oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise
95%, insbesondere 97%, ähnlichem
Protein und/oder
- – einem
Protein, das durch eine Nukleinsäure
kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid
gemäß einer
der 1a), 1c) oder 1e) oder deren Antiisense Polynukleotide bindet,
- – oder
einem mindestens 10 Aminosäuren
langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine.
Darunter
erfaßt
ist die Verwendung von Teilproteinen und insbesondere Proteinen
mit bekannter Sequenz und Funktion, ohne daß für diese im Stand der Technik
eine Funktion im Zusammenhang mit Harninkontinenz oder Harndrang
bekannt war.
Es
ist weiter bevorzugt, daß es
sich im erfindungsgemäßen Verfahren
bei dem Polynukleotid um RNA bzw. ein- oder doppelstängige DNA,
insbesondere mRNA oder cDNA handelt.
Ebenso
ist es bevorzugt, daß es
sich im erfindungsgemäßen Verfahren
bei dem Polynukleotid um ein Antisense-Polynukleotid oder PNA handelt,
das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
zu binden. Dabei versteht man unter PNA „peptidic nucleic acid" (peptidische Nukleinsäure), die
zwar die Basenpaare trägt,
aber dessen Rückrat
peptidisch gebunden ist. Ein Antisense-Polynukleotid zeigt die komplementäre Basenabfolge
zu mindestens einem Teil einer Basis-Nukleinsäure. Ebenfalls bevorzugt ist
es, daß das
Polynukleotid Teil eines Ribozym oder sonstigen DNA-Enzyms oder
einer katalytischen RNA bzw. DNA ist. Unter Ribozym ist eine katalytisch
aktive Ribonukleinsäure
zu verstehen, unter DNA-Enzym ein entsprechende Desoxyribonukleinsäure, also
katalytische RNA beziehungsweise DNA.
Im
erfindungsgemäßen Verfahren
ist ein Vektor bevorzugt, enthaltend eines dieser vorangehend beschriebenen
erfindungsgemäßen Polynukleotide.
Unter einem Vektor versteht man ein Nukleinsäuremolekül, das bei gentechnischer Manipulation
dazu dient, Fremdgene zu enthalten bzw. zu übertragen. Besonders bevorzugt
ist dabei, daß es
sich um einen Expressionsvektor handelt. Er dient damit der Expression
des enthaltenen Fremdgens, des Polynukleotids.
Weiter
bevorzugt ist ein derartiger Vektor, der abgeleitet ist von einem
Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder
Herpesvirus und/oder er mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder
ORI-Sequenz enthält.
Ein LTR ist ein „Long-TerminalRepeat", ein am Ende befindlicher
Abschnitt beispielsweise bei Viren. Poly-A-Sequenz ist ein mehr
als 20 Adenosinreste langer Schwanz. Eine Promotorsequenz ist der
Steuerungsbereich für
die Transkription.
Es
ist auch Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn das Protein
bzw. ein daraus abgeleitetes Teilprotein posttranslational modifiziert
wurde, es insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert,
acetyliert, ADP-ribosyliert,
hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde.
Posttranslationale Modifikationen sind beispielsweise dem Voet/Voet,
Biochemistry, 1st Edition, 1990, S. 935-938
zu entnehmen.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Verbindung identifizierbar
als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz durch
ein erfindungsgemäßes Verfahren.
Hierbei bezieht sich Verbindung insbesondere auf niedermolekulare
Wirkstoffe, aber auch auf Peptide, Proteine und Nukleinsäuren. Dabei
bedeutet identifizierbar, daß die
Verbindung das Merkmal aufweist, daß es beim erfindungsgemäßen Screeningverfahren
bezüglich
der Bindung deutlich stärker,
vorzugsweise doppelt so stark bindet wie der Durchschnitt der zu
testenden Substanzen oder bezüglich
der Änderung
der funktionellen Parameter deutlich vom Durchschnitt der zu testenden
Substanzen abweicht.
Eine
besonders ausgewählte
Form der erfindungsgemäßen Verbindung
ist durch ein Verfahren unter Verwendung eines Proteins oder Teilproteins
in den Schritten (a) und (b) als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende
Substanz identifizierbar, wobei das Protein oder Teilprotein ausgewählt ist
aus:
- – der
PIM-1-Kinase,
- – einem
Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c) oder 1e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise
95%, insbesondere 97%, ähnliches
Polynukleotid kodiert,
- – einem
Protein mit einer Aminosäuresequenz
gemäß einer
der 1b), 1d), 1f), oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise
95%, insbesondere 97%, ähnlichem
Protein und/oder
- – einem
Protein, das durch eine Nukleinsäure
kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid
gemäß einer
der 1a), 1c) oder 1e) oder deren Antisense-Polynukleotide bindet,
- – oder
einem mindestens 10 Aminosäuren
langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel zur Behandlung
von Harninkontinenz- oder Harndrang, enthaltend
- a.
ein Polynukleotid kodierend für
eine PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder
ein Polynukleotid, welches einer der in einer der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten
Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere
zu wenigstens 97% entspricht,
- b. ein Polynukleotid, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder
PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch
an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. einen Vektor, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b)
- d. eine PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder
ein Protein gemäß einer der 1b), 1d), 1f), 2b), 2d) oder 2f) und/oder
ein zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches
Protein und/oder ein Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches
Polynukleotid kodiert, und/oder ein Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert
wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
deren Antisense-Polynukleotide binden oder ein mindestens 10 Aminosäuren langes Teilprotein
eines der vorgenannten Proteine,
- e. einen Antikörper
gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. eine Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder
Teilprotein gemäß Punkt
d) oder einen Antikörper
gemäß Punkt
e),
- g. eine Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
als Harninkontinenz bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifiziert
wurde, und/oder
- h. einen Wirkstoff, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt
a) bindet,
sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder
Zusatzstoffe. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel
können
als flüssige
Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte, als
halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets,
Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und
enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemäßen Gegenstand
je nach galenischer Form gegebenenfalls Trägermaterialien, Füllstoffe,
Lösungsmittel,
Verdünnungsmittel,
Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie
die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel
oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal,
intramuskulär,
intranasal, buccal, rectal oder örtlich,
zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und
an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen
sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten,
Tropfen, Säften und
Sirupen, für
die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen,
Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie
Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem
Depot in gelöster Form
oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration
fördernden
Mitteln, sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral
oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen.
Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in
Abhängigkeit
vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation
und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblichweise werden 2 bis 500
mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert.
Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden
soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe beispielsweise
eine physiologische Kochsalzlösung,
Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-Inhibitoren etc.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere
die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches
einer der in einer der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens
90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
- b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid
oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch
an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b)
- d. einer PIM-Kinase, insbesondere der PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase,
und/oder ein Protein gemäß einer der 1b), 1d), 1f), 2b), 2d) oder 2f) und/oder
eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnlichen
Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches
Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert
wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
deren Antisense-Polynukleotide binden oder ein mindestens 10 Aminosäuren langes
Teilprotein eines der vorgenannten Proteine,
- e. eines Antikörpers
gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder
Teilprotein gemäß Punkt
d) oder einen Antikörper
gemäß Punkt
e)
- g. einer Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifiziert
wurde, und/oder
- h. eines Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt
a) bindet,
sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe
zur Diagnose von Harninkontinenz bzw. Harndrang bzw. die Verwendung
der genannten Gegenstände
zur Herstellung eines entsprechenden Diagnostikums.
Bevorzugt
ist auch eine Form des Diagnostikums, das ein Polynukleotid enthält, bei
dem es sich um ein Antisense-Polynukleotid oder eine PNA handelt.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere
die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches
einer der in einer der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens
90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
- b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid
oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch
an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b)
- d. einer PIM-Kinase, insbesondere der PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder
eines Proteins gemäß einer
der 1b), 1d), 1f), 2b), 2d) oder 2f) und/oder
eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches
Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
ein dazu zu mindestens 90 ähnliches
Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird,
die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
deren Antisense-Polynukleotide binden oder eines mindestens 10 Aminosäuren langen
Teilproteins eines der vorgenannten Proteine,
- e. eines Antikörpers
gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder
Teilprotein gemäß Punkt
d) oder einen Antikörper
gemäß Punkt
e)
- g. einer Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifiziert
wurde, und/oder
- h. eines Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt
a) bindet,
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung
von Harninkontinenz bzw. Harndrang.
Besonders
bevorzugt ist die Verwendung zur Behandlung der chronischen Harninkontinenz
bzw. des chronischen Harndrangs.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere
die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches
einer der in einer der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens
90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
- b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid
oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch
an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b)
- d. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b) oder einen Vektor gemäß Punkt c)
für die Gentherapie
von Harninkontinenz bzw. Harndrang. Dabei ist es besonders bevorzugt,
wenn es sich um In-vivo- oder In-vitro-Gentherapie handelt. Unter
Gentherapie versteht man eine Therapieform, bei der durch die Einführung von
Nukleinsäuren
in Zellen ein Effektorgen, meist ein Protein, exprimiert wird. Man
unterscheidet prinzipiell In-vivo- und In-vitro-Verfahren. In In-vitro-Verfahren
werden Zellen aus dem Organismus entfernt und ex-vivo mit Vektoren
transfiziert, um anschließend
wieder in denselben oder in einen anderen Organismus eingebracht
zu werden. Bei der In-vivo-Gentherapie werden Vektoren systemisch
(z.B. über
die Blutbahn) oder direkt in das Zielgewebe (z.B. in einen Bereich
des Urogenitalsystems) appliziert.
Bevorzugt
beim Einsatz in der Gentherapie ist auch die Verwendung eines Polynukleotids,
beim dem es sich um ein Antisense-Polynukleotid oder eine PNA handelt,
oder das Teil eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer
katalytischen RNA oder DNA ist.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase,
insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids,
welches einer der in einer der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens
90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
- b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid
oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch
an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b)
- d. einer PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder
eines Proteins gemäß einer
der 1b), 1d), 1f), 2b), 2d) oder 2f) und/oder
eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches
Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
ein dazu zu mindestens 90 ähnliches
Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird,
die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
deren Antisense-Polynukleotide binden oder eines mindestens 10 (vorzugsweise
20) Aminosäuren
langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine,
- e. eines Antikörpers
gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder
Teilprotein gemäß Punkt
d) oder einen Antikörper
gemäß Punkt
e)
- g. einer Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifiziert
wurde, und/oder
- h. eines Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt
a) bindet,
für
die Diagnostik und/oder für
Wirksamkeitsuntersuchungen im Zusammenhang mit Harninkontinenz bzw. Harndrang.
Dabei versteht man unter Diagnostik die Analyse von dem gennanten
Krankheitsbild zugeordneten Symptomen und unter Wirksamkeitsuntersuchungen
Untersuchungen über
die Wirksamkeit zu testender Substanzen, insbesondere ihrer medizinischen
Wirksamkeit im Zusammenhang mit Harninkontinenz bzw. Harndrang.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere
die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches
einer der in einer der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens
90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
- b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid
oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch
an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b)
- d. einer PIM-Kinase, insbesondere der PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder
eines Proteins gemäß einer
der 1b), 1d), 1f), 2b), 2d) oder 2f) und/oder
eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches
Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches
Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird,
die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) oder
deren Antisense-Polynukleotide binden oder eines mindestens 10 (vorzugsweise
20) Aminosäuren
langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine,
- e. eines Antikörpers
gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem
der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder
Teilprotein gemäß Punkt
d) oder einen Antikörper
gemäß Punkt
e),
in einem Verfahren zur Auffindung Harninkontinenz-
bzw. Harndrangregulierender, insbesondere Harninkontinenz- bzw.
Harndrang-hemmender Substanzen.
Dabei
ist es für
ein erfindungsgemäßes Arzneimittel,
ein erfindungsgemäßes Diagnostikum
und/oder eine erfindungsgemäße Verwendung
besonders bevorzugt, wenn das Polynukleotid gemäß Punkt a) ein Polynukleotid,
kodierend für
PIM-1-Kinase, oder
ein Polynukleotid, welches einer der in einer der 1a), 1c) oder 1e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens
90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
ist
und/oder
das Protein gemäß Punkt d) eine PIM-Kinase,
insbesondere die PIM-1-Kinase, und/oder ein Protein gemäß einer
der 1b), 1d) oder 1f) und/oder ein zu einem dieser vorgenannten
Proteine zu mindestens 90 % ähnliches
Protein und/oder ein Proteins, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c) oder 1e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches
Polynukleotid kodiert, und/oder ein Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert
wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c) oder 1e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden
oder ein mindestens 10 Aminosäuren
langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine ist.
Dabei
ist es für
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Verwendungen sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders
bevorzugt, wenn das Polynukleotid (gegebenfalls gemäß Punkt
a) und/oder Punkt b)) eine RNA oder eine ein- oder doppelstängige DNA,
insbesondere mRNA oder cDNA ist.
Dabei
ist es für
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Verwendungen sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders
bevorzugt, wenn das Polynukleotid (gegebenfalls gemäß Punkt
b)) Teil eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen
RNA oder DNA ist.
Dabei
ist es für
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Verwendungen sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders
bevorzugt, wenn der Vektor (gegebenfalls gemäß Punkt c)) ein Expressionsvektor
ist.
Dabei
ist es für
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Verwendungen sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders
bevorzugt, wenn der Vektor (gegebenfalls gemäß Punkt c)) abgeleitet ist
von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem
Virus oder Herpesvirus und/oder er mindestens eine LTR-, Poly-A-,
Promotor- und/oder ORI-Sequenz enthält.
Dabei
ist es für
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Verwendungen (nicht Gentherapie) sowie Arzneimittel und/oder
Diagnostika besonders bevorzugt, wenn das Protein oder Teilprotein
(gegebenfalls gemäß Punkt
d)) posttranslational modifiziert wurde, es insbesondere glykosiliert,
phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert,
hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde.
Dabei
ist es für
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Verwendungen (nicht Gentherapie) sowie Arzneimittel und/oder
Diagnostika besonders bevorzugt, wenn der Antikörper (gegebenenfalls gemäß Punkt
e)) ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
Dabei
ist es für
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Verwendungen (nicht Gentherapie) sowie Arzneimittel und/oder
Diagnostika besonders bevorzugt, wenn es sich bei der Zelle (gegebenenfalls
gemäß Punkt f))
um eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle
oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle handelt.
Dabei
ist es für
eine erfindungsgemäße Verbindung
(auch Anti-Sense etc.), ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, ein erfindungsgemäßes Diagnostikum
und/oder eine erfindungsgemäße Verwendung
besonders bevorzugt, wenn es sich bei der Verbindung (gegebenenfalls
gemäß Punkt
g)) um eine niedermolekulare Verbindung handelt.
Dabei
ist es für
ein erfindungsgemäßes Arzneimittel,
ein erfindungsgemäßes Diagnostikum
und/oder eine erfindungsgemäße Verwendung
besonders bevorzugt, wenn der genannte Wirkstoff gemäß Punkt
h) ein niedermolekularer Wirkstoff ist.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist in einem Teilverfahren das Protein oder Teilprotein in den Schritten
(a) und (b) ausgewählt
aus:
- – der
PIM-1-Kinase,
- – einem
Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der 1a), 1c) oder 1e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise
95%, insbesondere 97%, ähnliches
Polynukleotid kodiert,
- – einem
Protein mit einer Aminosäuresequenz
gemäß einer
der 1b), 1d), 1f), oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise
95%, insbesondere 97%, ähnlichem
Protein und/oder
- – einem
Protein, das durch eine Nukleinsäure
kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid
gemäß einer
der 1a), 1c) oder 1e) oder deren Antisense-Polynukleotide bindet,
- – oder
einem mindestens 10 Aminosäuren
fangen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine
und
in einem anderen Teilverfahren das Protein oder Teilprotein in den
Schritten (a) und (b) ausgewählt
aus: - – der
PIM-2-Kinase, oder
- – der
PIM-3-Kinase,
- – einem
Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der 2a), 2c) oder 2e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise
95%, insbesondere 97%, ähnliches
Polynukleotid kodiert,
- – einem
Protein mit einer Aminosäuresequenz
gemäß einer
der 2b), 2d), 2f), oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise
95%, insbesondere 97%, ähnlichem
Protein und/oder
- – einem
Protein, das durch eine Nukleinsäure
kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid
gemäß einer
der 2a), 2c) oder 2e) oder deren Antisense-Polynukleotide bindet,
- – oder
einem mindestens 10 Aminosäuren
langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine,
wobei – meist
anschließend – die Ergebnisse
aus Schritt b) der Teilverfahren differentiell verglichen werden.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung
von Harninkontinenz oder Harndrang, insbesondere chronischer Harninkontinenz
bzw. chronischem Harndrang, bei einem nichthumanen Säugetier
oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Harninkontinenz
(Streßinkontinenz
oder Dranginkontinenz) oder Harndrang, insbesondere chronischer
Harninkontinenz bzw. chronischem Harndrang, benötigt, durch Verabreichung eines
erfindungsgemäßen Arzneimittels,
insbesondere solche, enthaltend eine erfindungsgemäße Substanz
und/oder einen erfindungsgemäßen Wirkstoff.
Die
Verabreichung kann beispielsweise in Form eines Arzneimittels, wie
oben beschrieben, erfolgen.
Insgesamt
ist eine wichtige Grundlage der Erfindung die Identifizierung Harninkontinenz-
bzw. Harndrang-regulierter Gene und Genfragmente. Darauf basiert
das Screeningverfahren. Aber auch die Verwendung zur Diagnose oder
Therapie bietet sich, wie bereits ausgeführt, an. Im folgenden werden
entsprechende Anwendungsmöglichkeiten
und weitere Ausführungsbeispiele
erläutert.
1. Therapie chronischer
Harninkontinenz bzw. chronischem Harndrang
1.1 Antisense-Strategien
Hierbei
werden, abgeleitet von der Nukleinsäuresequenz der vollständigen cDNA
oder von Teilbereichen Konstrukte erstellt, die die mRNA oder Proteinkonzentration
herabsetzen können.
Dies können
z.B. Antisense-Oligonukleotide (DNA oder RNA) sein, die eventuell
unter Verwendung modifizierter Nukleotidbausteine (z.B. O-Allyl-Ribose)
eine erhöhte
Stabilität
gegenüber
Nukleasen aufweisen. Zudem ist die Verwendung von Ribozymen denkbar,
die als enzymatisch aktive RNA-Moleküle eine
spezifische Spaltung der RNA katalysieren. Daneben könnten auch
Vektoren eingesetzt werden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen
oder Teilbereiche dieser Nukleotidsequenzen unter Kontrolle eines
geeigneten Promotors exprimieren und somit für eine In-vivo- oder Ex-vivo-Therapie
geeignet sind. Zusätzlich
sind auch Antisense-Konstrukte möglich,
die unter Austausch des Phosphatrückgrats von Nukleotidsequenzen
(z.B. PNAs, d.h. Peptide Nucleic Acids) oder Verwendung nichttraditioneller
Basen wie Inosine, Queosine oder Wybutosine sowohl wie Acetyl-,
Methyl-, Thio- und ähnlich
modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanosin u, Thymidin und
Uridin nicht oder in geringerem Masse durch endogene Nukleasen abgebaut
werden können.
1.2. Antagonisten/Agonisten
bzw. Inhibitoren/Aktivatoren der im Screeningverfahren verwendeten
erfindungsgemäßen Genprodukte.
Dies
umfaßt
Substanzen, die durch eine Bindung an das Genprodukt dessen Funktion
verändern.
Dies können
sein:
- 1.2.1. Organisch-chemische Moleküle, die
im Rahmen eines Wirkstoffscreenings unter Verwendung der Genprodukte
der erfindungsgemäßen cDNA
als Bindungspartner gefunden werden.
- 1.2.2. Antikörper,
seien es polyklonale, chimäre,
single-chain, Fab-Fragmente oder Fragmente
aus Phagen-Banken, die bevorzugt als neutralisierende Antikörper über eine
Bindung an die Genprodukte spezifisch die Funktion beeinflußen.
- 1.2.3. Aptamere, d.h. Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate
mit Proteinbindenden Eigenschaften. Dazu gehören auch sog. Spiegelmere,
die durch Spiegelevolution gewonnene spiegelbildliche und damit
stabile Oligonukleotide darstellen, die hochaffin und hochspezifisch
ein Zielmolekül
binden können
(Klußmann
et al., 1996: Nature Biotechnology 14: 1112-1115).
1.3. Gentherapie
Die
beschriebenen Sequenzen können
zur Therapie von Harninkontinenz oder Harndrang, insbesondere chronischer
Formen, eingesetzt werden, indem sie nach Klonierung in geeignete
Vektoren (z. B. Adenovirus-Vektoren oder adenoassozierter-Virus-Vektoren)
zur In-vivo oder Ex-vivo-Therapie verwendet werden, um dort z.B.
einer Überexpression
oder Unterexpression des endogenen Genproduktes entgegenzusteuern, die
Sequenz des defekten Genproduktes zu korrigieren (z. B. durch Transsplicing
mit dem exogenen Konstrukt) oder ein funktionelles Genprodukt zur
Verfügung
zu stellen.
2. Diagnose
Polynukleotidsequenzen
(Oligonukleotide, Antisense-DNA & RNA-Moleküle, PNAs),
die von den im Screeningverfahren etc. verwendeten Nukleotidsequenzen
abgeleitet sind, könnten
zur Diagnose bzw. Untersuchung der Grundlage für Harninkontinenzen oder Harndrangzuständen werden.
Beispiele derartiger Grunderkrankungen beinhalten neurologische
Erkrankungen oder neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer,
Parkinson, Chorea Huntington, Jacob-Creutzfeld, amyotrophe Lateralsklerose
und Demenzen. Die Nukleotidsequenzen können auf vielfältige Weise
(Northernblot, Southernblot, FISH-Analyse, PRINS-Analyse, PCR) entweder zur Identifizierung
der Genproduktes oder abweichender diagnostisch relevanter Genprodukte oder
zur Quantifizierung des Genproduktes dienen. Neben der Nukleinsäurediagnostik
können
auch Antikörper
oder Aptame re gegen das von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierte
Protein zur Diagnostik eingesetzt werden (z. B. mittels ELISA, RIA,
immuncytochemische oder immunhistochemische Verfahren), um das Protein
oder abweichende Formen zu identifizieren und das Protein zu quantifizieren.
Im
Hinblick auf eine Gendiagnostik könnten Nukleinsäure-Sonden
abgeleitet von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
zur Bestimmung des Gen-Lokus eingesetzt werden (z.B. durch FISH,
FACS, artifizielle Chromosomen. wie YACs, BACs oder P1-Konstrukte).
Die
folgenden Beispiele und Abbildungen sollen die Erfindung erläutern, ohne
sie darauf zu beschränken.
Abbildungen
und Beispiele
Abbildungen:
1a) cDNA-Sequenz von PIM-1-Kinase, human; AN:
NM_002648
1b) Aminosäure-Sequenz
von PIM-1-Kinase, human; AN: NP_002639
1c) cDNA-Sequenz von PIM-1-Kinase, Ratte; AN:
NM_017034
1d) Aminosäure-Sequenz
von PIM-1-Kinase, Ratte; AN: NP_058730
1e) cDNA-Sequenz von PIM-1-Kinase, Maus; AN: NM_008842
1f) Aminosäure-Sequenz
von PIM-1-Kinase, Maus; AN: NP_032868
2a) enthält
zwei Sequenzen, nämlich
(i) mRNA-Sequenz ähnlich
zu PIM-3-Kinase,
human; AN: BC017083 und (ii) cDNA-Sequenz von PIM-3-Kinase, human; AN
(EMBL): BC052239
2b) Aminosäure-Sequenz
von PIM-3-Kinase, human; AN: Q86V86 (Datenbank: Swiss Prot)
2c) cDNA-Sequenz von PIM-3-Kinase, Ratte; AN:
NM_022602
2d) Aminosäure-Sequenz
von PIM-3-Kinase, Ratte; AN: NM_072124
2e) cDNA-Sequenz von PIM-3-Kinase, Maus; AN: BC017621
2f) Aminosäure-Sequenz
von PIM-3-Kinase, Maus; AN: BC017621
3 zeigt
in einer graphischen Darstellung die Ergebnisse von Untersuchungen
des Miktionsverhaltens von PIM-1-defizienten (knock-out) Mäusen (PIM –/–) im Vergleich
zum Wildtyp (FVB +/+). Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen
der Messungen bei 20 (FVB +/+) bzw. 22 (PIM –/–) Tieren.
Die
vorliegende Anmeldung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele
näher beschrieben.
