DE10304660A1

DE10304660A1 - Identifizierung schmerzregulierter Gene im DRG nach CFA-Arthritis

Info

Publication number: DE10304660A1
Application number: DE2003104660
Authority: DE
Inventors: Eberhard Prof. Dr. Weihe; Annette Dr. Bieller; Martin K.-H. Dr. Schäfer
Original assignee: Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 2003-02-05
Filing date: 2003-02-05
Publication date: 2004-08-26

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auffindung schmerzrelevanter bzw. schmerzregulierender Substanzen, zugehörige Polynukleotide, Peptide, Proteine, Vektoren und Zellen, dadurch identifizierte Verbindungen, entsprechende Arzneimittel und Diagnostika sowie deren Verwendung in der Schmerztherapie.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auffindung schmerzrelevanter Substanzen, zugehörige Polynukleotide, Peptide, Proteine, Vektoren und Zellen, dadurch identifizierte Verbindungen, entsprechende Arzneimittel und Diagnostika sowie deren Verwendung in der Schmerztherapie.
Zur Therapie von Schmerzen stehen unterschiedliche Arzneimittel zur Verfügung wie z.B. Acetylsalicylsäure, Paracetamol, Dipyrone, Tramadol, Morphin und Fentanyl; aber auch Substanzen wie Amitryptilin und Ketamin kommen zur Behandlung von Schmerzpatienten zum Einsatz. Trotz zunehmend verfeinerter Therapieschemata kann jedoch insbesondere bei chronischen Schmerzzuständen oft keine dauerhafte Verbesserung für die Patienten erzielt werden. Hierfür ist unter anderem auch die Tatsache verantwortlich, daß es beim chronischen Schmerz zu dauerhaften Veränderungen beteiligter Nervenzellen kommt.
Die Schmerzforschung der letzten Jahre erbrachte die grundlegende Erkenntnis, daß der Entwicklung gerade chronischer Schmerzzustände plastische Veränderungen des Nervensystems, insbesondere in den nozizeptiven Neuronen der Hinterwurzelganglien und der Neurone im Bereich der Dorsalhörner des Rückenmarks, zugrunde liegen (als Überblick siehe: Coderre et al. 1993; Zimmermann & Herdegen, 1996). Die neuronale Plastizität geht einher mit Veränderungen in der Expression bestimmter Gene und führt zur langanhaltenden Veränderung des Phänotyps der betroffenen Neuronen. Das Konzept der neuronalen Plastizität wurde bisher vor allem auf Entwicklungs-, Lern- und Regenerationsprozesse an gewandt, doch die neueren Befunde aus der Schmerzforschung zeigen, daß dieses Konzept auch bei pathophysiologischen Vorgängen greift (Tölle, 1997).
Die Chronifizierung des Schmerzes ist tierexperimentell auf phänomenologischer Ebene bereits relativ gut charakterisiert. Die Induktion chronischer Schmerzzustände führt zu folgenden Veränderungen:

– Erhöhte Empfindlichkeit und verringerte Reizschwelle peripherer Nozizeptoren
– Aktivierung sogenannter stiller Nozizeptoren
– Reorganisation rezeptiver Felder
– Erregbarkeitszunahme im Rückenmark.

Diese plastischen Veränderungen sind sowohl für die in den Ganglien vorkommenden primären Afferenzen, als auch für die im Rückenmark lokalisierten nachgeschalteten Neurone beschrieben worden und werden auch supraspinal z. B. im Thalamus vermutet. In Analogie zu den für Lern- und Gedächtnisprozesse beschriebenen Mechanismen ist anzunehmen, daß in den beteiligten Zellen ein spezifisches Genprogramm abläuft, das die koordinierte Regulation relevanter Gene beinhaltet, deren Expression dann maßgeblich zur pathophysiologischen Ausprägung chronischer Schmerzen beiträgt.
Ausgangspunkt der Erfindung war daher die Identifizierung derartiger schmerzregulierter Gene, die in ihrer Expression unter Schmerzbedingungen verändert und deshalb wahrscheinlich an der Entstehung und Verarbeitung von insbesondere chronischen Schmerzen beteiligt sind, über ihre Regulationszusammenhänge.
Für eine Reihe bekannter Gene wurde bereits eine Regulation in verschiedenen Schmerzmodellen nachgewiesen (s. Tabelle 1), so zum Beispiel für Neurotransmitter (Substanz P, CGRP), Rezeptoren (Substanz P-Rezeptor, μ, κ, δ-Opiatrezeptoren, NMDA-Rezeptor) und Transkriptionsfaktoren (cJun, Jung, cFos oder Krox24). Die Tatsache, daß die genannten Rezeptoren bereits als molekulare Targets für die Entwicklung neuer Analgetika verwendet werden (Dickenson, 1995), gibt einen deutlichen Hinweis darauf, daß auch die Identifizierung neuer schmerzregulierter Gene für die Entwicklung von Analgetika, insbesondere für entsprechende Screeningverfahren, von großem Interesse ist. Die zentrale Idee ist hierbei, die Entstehung oder Persistenz von Schmerzen, insbesondere chronischer Art, zu unterbrechen, indem solche Proteine in ihrer Funktion beeinflußt werden, die in Schmerz-Zuständen verstärkt oder vermindert gebildet werden.
In WO-A-02/12338 sind ein Screeningverfahren zur Auffindung schmerzrelevanter bzw. schmerzregulierender Substanzen, entsprechende Polynukleotide, Peptide, Proteine, Vektoren und Zellen, durch das Screeningverfahren identifizierte Verbindungen, zugehörige Arzneimittel und Diagnostika sowie deren Verwendung in der Schmerztherapie offenbart. Das Screeningverfahren gemäß WO-A-02/12338 beruht insbesondere auf der schmerzregulierten Expression der Gene für JNK3, PIM-2, LR-11, TFIIFβ, GGT-β, GATA3, CLC-7, Katalase, Tetraspanin (TM4SF/TSPAN-6TTM4-D), Caseinkinase 1a, MAP3K7/TAK-1 (TGF-β activated kinase), BAB14112 bzw. Spermidin-Synthase im dorsalen Teil des Rückenmarks der Ratte in den Segmenten L3-L6 nach Schmerzauslösung durch Injektion von Formalin in die Rattenpfote (sog. Formalinmodell).
Tabelle 1: Regulation bekannter Gene/Genprodukte in Schmerz-Tiermodellen
Daraus folgend war primäre Aufgabe der Erfindung, ein alternatives Screeningverfahren zur Identifizierung schmerzrelevanter, insbesondere schmerzregulierender Substanzen zu entwickeln. Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:

(a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit einer Zelle und/oder einer Präparation aus einer solchen Zelle, die mindestens ein Peptid oder Protein synthetisiert hat, das ausgewählt ist aus folgender Gruppe: – LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens "Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease (insbesondere das Orthologe des entsprechenden Gens von Oryza sativa; vgl. cDNA-Sequenz gemäß 60a) und Aminosäuresequenz gemäß 60b)), Epithelialer Zell wachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69 und/oder – einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c) 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder – einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Peptid oder Protein und/oder – einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c) 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet, und/oder – einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide, und/oder – einem Peptid oder Protein, für das ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid kodiert, dessen Nukleotidsequenz ein Genfragment gemäß einer der in den 1 bis 18 dargestellten Sequenzen umfaßt, oder für das ein zu einem solchen Gen mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, – einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide, und/oder – einem Peptid oder Protein, für das ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid kodiert, dessen Nukleotidsequenz ein Genfragment gemäß einer der in den 1-18 dargestellten Sequenzen umfaßt, oder für das ein zu einem solchen Gen mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert,
(b) Messung der Bindung der Testsubstanz an das/die von der Zelle synthetisierten Peptid(e) oder Proteine) oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das/die Peptid(e) oder Proteine) veränderten funktionellen Parameters.

Die erfindungsgemäß als schmerzrelevant erkannten Proteine bzw. Peptide sind vorzugsweise solche von Wirbeltieren, insbesondere Säugern, wie Mensch, Nagern (z.B. Maus, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen), Schwein, Rind, Ziege usw. Umfasst werden insbesondere auch alle funktionshomologen Fragmente, Derivate und Allele der entsprechenden Proteine bzw. Peptide sowie Polynukleotide, einschließlich aller Fragmente, Derivate und Allele sowie hiermit unter Standardbedingungen hybridierenden Nukleotidsequenzen, die für die genannten Pro teine bzw. Peptide oder deren funktionshomologe Fragmente, Derivate oder Allele codieren.
Das Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung basiert darauf, daß hier eine potentielle Schmerz-Wirksamkeit einer Substanz über ihre Wechselwirkung mit einer schmerzregulierten Peptid- oder Proteinstruktur aufgefunden werden kann.
Dabei bezieht sich der Begriff „schmerzregulierend" auf einen potentiellen regulierenden Einfluß auf das physiologische Schmerzgeschehen, insbesondere auf eine analgetische Wirkung.
Der Begriff „Substanz" umfaßt jede als Arzneimittel-Wirkstoff geeignete chemische Verbindung. Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung ist bspw. eine organisch-chemische Verbindung, insbesondere eine niedermolekulare Spzies, z.B. mit einem Molekulargewicht von < 5000, insbesondere < 3000, vor allem < 1500 und ist typischerweise physiologisch gut verträglich. Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammensetzung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugsweise Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das organische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erfindungsgemäßes Protein mindestens 10⁷ mol^–1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, daß sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra)membranöse Transportproteine. Weitere erfindungsgemäße Substanzen sind biologisch-chemische Verbindungen wie Nukleinsäuren, insbesondere DNA oder RNA und deren jeweilige Bausteine, Fette, und deren Bestandteile, Zucker, seien es Mono-, Oligo- oder Polysaccharide, Peptide, insbesondere Oilgo- oder Polypeptide, oder Proteine wie Enzyme, Antikörper usw. Des weiteren kann eine „Substanz" im Sinne der vorliegenden Erfindung selbstverständlich aus mehreren gleichen oder verschiedenen der vorgenannten Spezies zusammengesetzt sein oder ein Gemisch derselben darstellen.
Die Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen, daß die zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden Präparation in einem wässrigen Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Die „Präparation" aus diesen Zellen umfaßt insbesondere Homogenate aus den Zellen, bspw. entsprechende Zellysate, z.B. das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen etc. Dabei kann das wässrige Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden variiert werden, je nach der Wechselwirkung der Substanz mit dem Peptid oder Protein. Bevorzugt sind aber Zeiten zwischen 1 min und 60 min. Das wäßrige Medium kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so daß bei der Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0 – 7,5 im Medium herrscht. Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Peptid oder Protein aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger, einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren einen möglichst deutlichen Meßwert zu erhalten.
Eine Zelle, die ein bestimmtes Peptid oder Protein synthetisiert hat, ist ein Zelle, die dieses Peptid oder Protein bereits endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurde, so daß sie dieses Peptid oder Protein exprimiert und entsprechend vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens das Peptid oder Protein enthält. Die Zellen können Zellen aus evt. immortalisierten Zellinien sein oder native aus Geweben stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zellverband meist aufgelöst ist.
Die hier aufgezählten Proteine und Peptid wurden im Rahmen dieser Erfindung als durch Schmerz reguliert identifiziert, in dem in einem Tier Schmerz ausgelöst wurde und nach angemessener Zeit das Expressionsmuster in bestimmten Geweben des Tieres mit denen eines Kontroll-Tieres ohne schmerzauslösende Maßnahmen verglichen. Die dabei gefundenen verändert exprimierten Peptide und Proteine umfassen auch bekannte Proteine, wie LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheitbeta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und CGI-69. Aus welcher Spezies diese Proteine stammen, ist für die Funktion des Verfahrens unerheblich, es ist aber bevorzugt, die humane, Maus- oder Ratten-Variante zu verwenden. Die genannten Proteine sind in Hinblick auf die kodierende DNA- und die Aminosäure-Sequenz bekannt und auch in Ihrer generellen Funktion beschrieben. Sie wurden aber bisher im Stand der Technik nicht in einen Zusammenhang mit Schmerz und insbesondere der Schmerzregulation gebracht. Da hier die Identifizierung der Proteine über eine Veränderung der Expression in einem In-vivo-Schmerzmodell erfolgte, hat das daraus abgeleitete erfindungsgemäße Screening-Verfahren für zukünftige Arzneimittel unter Verwendung dieser Proteine den erheblichen Vorteil, nicht nur auf theoretischen Überlegungen aufzubauen, sondern vermutlich eine starke In-vivo-Relevanz zu besitzen. Da mit diesem Verfahren die Wechselwirkung von Substanzen mit im Schmerzbereich bisher nicht verwendeten Proteinen und Peptiden als Maßstab für das Auffinden schmerzregulierender Substanzen ermöglicht wird, sind mit diesem Verfahren jetzt möglicherweise schmerzrelevante Substanzen aufzufinden, die bei den im Stand der Technik bisher bekannten Verfahren mit anderen Peptiden oder Proteinen nicht aufgefallen wären. Auch dies ist ein erheblicher Vorteil des neuen erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausgewählt werden können die verwendeten Proteine oder Peptide auch aus solchen, für die ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c) 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) kodiert. Abgebildet sind die meisten der bekannten kodierenden cDNA-Sequenzen für Maus, Ratte und Mensch von LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens "Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und CGI-69. Für das erfindungsgemäße Verfahren sind auch Peptide und Proteine verwendbar, für die lediglich ein Abschnitt (Teil) des Polnukleotids kodiert, wobei es sich dabei aber mindestens um ein Polypeptid (≥ 10 Aminosäuren) oder ein Protein handeln muß. Schließlich sind für ein Screeningverfahren unter bestimmten Umständen auch nur Teilabschnitte eines der vorgenannten Proteine von mindestens 10 Aminosäuren notwendig.
vorgenannten Proteine von mindestens 10 Aminosäuren notwendig. Verwendbar sind auch Peptide und Proteine, für die eine DNA-Sequenz kodiert, die ein Fragment, ein Derivat oder eine Mutante der für die vorstehend genannten Genprodukte codierenden oder der in den vorstehend genannten Figuren gezeigten Sequenzen darstellt. Eine Mutante bzw. ein Allel oder auch ein Derivat einer erfindungsgemäßen Sequenz geht dabei insbesondere durch Deletion, Addition, Insertion und/oder Substitution eines oder mehrere Nukleotide der jeweiligen Wildtyp-Sequenz aus dieser hervor. Vorzugsweise sind derartige Fragmente, Derivate oder Mutanten einer der abgebildeten zu mindestens 90% ähnlich ist, da so geringe Abweichungen die Wechselwirkung mit Peptid und Protein und damit die Funktion des Verfahrens meist nicht beeinflussen. Dabei versteht man unter 90% Ähnlichkeit eine 90%-ige Übereinstimmung der Basenfolge im kodierenden Bereich des Polynukleotids.
Die Proteine können auch ausgewählt sein aus solchen mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b). Auch dies sind überwiegend aus dem Stand der Technik bekannte Sequenzen, die im Rahmen der Erfindung ermittelt wurden. Verwendbar sind hier auch Peptide und Proteine, deren Aminosäure-Sequenz ein Fragment, Derivat und/oder Mutante der vorstehend genannten Proteine bzw. einer der abgebildeten Sequenzen darstellt. Derartige gegenüber der Wildtyp-Sequenz veränderte Sequenzen gehen durch Addition, Deletion, Insertion und/oder Substitution ein oder mehrerer Aminosäurereste aus der Wildtyp-Sequenz hervor, wobei jedoch die Funktonalität des jeweiligen Wildtyps, insbesondere im vorliegenden Zusammenhang mit der Schmerzregulation, vorzugsweise im wesentlichen erhalten bleibt. Vorzugsweise ist die veränderte Sequenz der Wildtyp-Aminosäuresequenz zu mindestens 90% ähnlich ist, da auch geringe Abweichungen in der Aminosäureabfolge die Wechselwirkung der Substanz mit Peptid und Protein und damit die Funktion des Verfahrens meist nicht beeinflussen. Dabei versteht man unter 90% Ähnlichkeit eine 90%-ige Übereinstimmung in der Aminosäureabfolge.
Die Proteine können auch ausgewählt sein aus solchen, die durch eine Nukleinsäure kodiert werden, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c) 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid binden.
In Hinblick auf die Hybridisierungsbedingungen wird im einzelnen offenbart, dass homologe oder sequenzverwandte DNA-Sequenzen aus allen Säugerspezies, einschließlich Mensch, nach gängigen Verfahren durch Homologie-Screening durch Hybridisierung mit einer Probe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon isoliert werden. Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe der nativen Sequenzen, bspw. der in vorstehenden Sequenzen, beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nicht-codierenden DNA-Sequenz zu verstehen.
Zur Hybrisierung können z.B. kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche, die auf dem Fachmann bekannte Weise ermittelt werden können, verwendet werden. In jedem Fall wird die Verwendung und Funktion von mindestens 15, vorzugsweise mindestens 20 AS langen Nukleotidabschnitten (auch als solche offenbart) der in erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen als Primer für PCR Reaktionen oder als Oligonukleotide auf DNA-Chips, insbesondere in Form von Mikroarrays offenbart. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure-Sequenz (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) bzw. je nachdem, welche Nukleinsäureart (DNA oder RNA) für die Hybridisierung verwendet werden, varieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10 °C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge. Unter Standardbedingungen sind beispielsweise, je nach Nukleinsäure, Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid, wie beispielsweise 42 °C in 5 × SSC, 50% Formamid, zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise bei Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln, beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Ein „Antisense-Polynukleotid" bzw. eine „Antisense-Nukleinsäure" gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein aus mehreren natürlichen oder modifizierten Nukleinsäurebausteinen bestehendes Molekül, dessen Basenabfolge mindestens teil- bzw. bereichsweise komplementär zur Basenabfolge eines Teilbereiches einer in der Natur vorkommenden Spezies, bspw. der in der Natur vorkommenden mRNA, ist. Augrund der Komplementarität ist das erfindungsgemäße Antisense-Polynukleotid bzw. die erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure unter Standardhybridisierungen, wie oben definiert, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen gemäß nachstehender Definition, mit dem Zielmolekül befähigt. Erfindungsgemäß umfasst die Antisense-Nukleinsäure bzw. das Antisense-Polynukleotid DNA- oder RNA-Spezies, die unmodifizierte oder modifizierte Nukleotide enthalten oder auch daraus bestehen können. Insbesondere bei Antisense-RNA ist es außerdem bevorzugt, daß diese zur Stabilisierung gegenüber dem Abbau durch RNAsen mindestens ein Analoges natürlich vorkommender Nukleotide aufweist. Dies beruht auf der Tatsache, daß die in den Zellen vorkommenden RNA-abbauenden Enzyme als Substrat vorzugsweise natürlich vorkommende Nukleotide erkennen. Durch Einfügen von Nukleotidanaloga kann daher der RNA-Abbau erschwert werden, wobei die Auswirkung auf die Translationseffizienz bei Einfügen von diesen Analoga, insbesondere in den codierenden Bereich der mRNA, einen positiven oder negativen Effekt auf die Translationseffizienz haben kann.
Die Modifikation des Analogous gegenüber dem natürlich vorkommenden Nukleotid kann sowohl die Base als auch die Zucker- und/oder Phosphorsäure-Einheit des jeweiligen Nukleinsäurebausteins betreffen. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung können als Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Nukleotidanaloga Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide (d.h. die Antisense-Nukleinsäure ist mindestens teilweise eine Peptidnukleisäure (engl. „peptide nucleic acid" PNA)), Methylphosphonate, 7-Deazaguaonsin, 5-Methylcytosin und Inosin genannt werden.
Grundsätzlich kann es für das erfindungsgemäße Verfahren genügen, wenn ein mindestens 10 Aminosäuren langes Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide verwendet wird, da bereits 10 Aminosäuren, vorzugsweise 15, insbesondere 20 Aminosäuren völlig spezifisch sind oder sein können.
Die Peptide und Proteine können allerdings auch aus solchen Verbindungen ausgewählt werden, für das ein Gen, bestehend aus einem Polynukleotid, kodiert, dessen Nukleotidsequenz ein Genfragment gemäß einer der in den 1-18 dargestellten Sequenzen, bzw. ein Derivat, ein Abschnitt, ein Allel oder eine Mutante davon, umfaßt. Im Rahmen dieser Erfindung wurden durch Schmerz regulierte Genfragmente identifiziert und sequenziert, die im Stand der Technik noch keinem bekannten Peptid oder Protein zugeodnet sind. Eine Nachanalyse der Genfragmente hat allerdings in einigen Fällen noch einen Zusammenhang mit Protein Phosphatase EF-hands-1 (vgl. 1 und 42), Jerky (vgl. 2 und 56), „rRNA intron-encoded homing endonuclease" (vgl. 3 und 60), Epithelialem Zelwachstum Inhibitor (vgl. 5 und 61) bzw. CGI-69 (vgl. 6 und 63) erlaubt. Das jeweils ausreichend umfangreich sequenzierte Genfragment definiert eindeutig das zugehörige Gen, das Polynukleotid, von dessen Sequenz das Genfragment ein Teil ist. Dadurch, daß das entsprechende Genfragment als schmerzreguliert identifiziert wurde, ist auch eine klar physiologische Funktion des Gens umrissen. Zum vollständigen Gen, das das Fragment umfaßt, gelangt der Fachmann über bekannte Methoden. So kann ein Polynukleotid gemäß einer der 1 – 18 als Sonde markiert, eine cDNA-Bank mit der Sonde hybridisiert und unter Standardbedingungen gewaschen werden und der cDNA-Klon, an den die Sonde gebunden hat, isoliert und gegebenenfalls sequenziert werden. Ebenso ist das Gen, bzw. Polynukleotid dadurch erhältlich, daß Abschnitte eines Polynukleotids gemäß einer der 1 – 18 als Gen-spezifische Oligonukleotid-Primer ermittelt und synthetisiert werden, mit denen dann durch PCR, ausgehend von einzel- oder doppelsträngiger DNA, von cDNA-Bibliotheken oder genomischer DANN, als Template das verlängerte Polynukleotid generiert und gegebenenfalls sequenziert wird. Das Vorgehen wird anhand eines Beispiels nachstehend genauer erläutert. Auch für diese Gruppe der Peptide und Proteine gilt der Vorteil gegenüber den bekannten Verfahren, daß bei ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren ein in vivo-Bezug sichergestellt ist und das Verfahren erlaubt, potentiell schmerzregulierende Substanzen zu identifizieren, die in den im Stand der Technik bisher bekannten Screening-Methoden möglicherweise nicht aufgefallen wären.
Der Maßstab über den das Verfahren die Auffindung interessanter Substanzen erlaubt, ist entweder die Bindung an das Protein oder Peptid, die z.B. durch Verdrängung eines bekannten Liganden oder das Ausmaß gebundener Substanz nachgewiesen werden kann, oder die Veränderung eines funktionellen Parameters durch die Wechselwirkung der Substanz mit dem Peptid oder Protein. Diese Wechselwirkung kann insbesondere in einer Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen liegen und veränderte funktionelle Parameter können beispielsweise die Genexpression, das Ionenmilieu, der pH oder das Membranpotential, bzw. die Veränderung der Enrymaktivität oder der Konzentration eines oder mehrerer sog. „2^nd messenger" sein.
Die Wechselwirkung einer Testsubstanz oder die Verdrängung einer mit dem jeweiligen schmerzregulierten Zielmolekül (Peptid oder Protein) wechselwirkenden Substanz durch eine Testsubstanz wird bevorzugt mit Hilfe geeignet makierter Verbindungen (Testsubstanz oder zu verdrängende Substanz) bestimmt. Eine „Markierung" ist jedes Atom oder Gruppe von Atomen, die durch geeignete Nachweis bzs. Messverfahren detektiert werden kann. Eine detektierbare Antikörpermarkierung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann die Substanz an ein nachweisbares Substrat eines Enzyms gebunden werden, wobei das Enzym schließlich in einem Immunoassay (EIA) eingesetzt werden kann. Das Enzym kann dann mit dem entsprechenden Substrat reagieren, so daß eine chemische Verbindung entsteht, die auf eine dem Fachmann geläufige Art und Weise detektiert und ggf. quantifiziert werden kann, z. B. durch Spektrophotometrie, Fluorometrie oder andere optische Verfahren. Bei dem Enzym kann es sich um Malat-Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid Isomerase, Hefealkohol-Dehydrogenase, alpha-Glycerophosphat-dehydrogenase, Triosephos phatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phsophatase, Aspariginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase oder Acetylcholinesterase handeln. Die Detektion wird dann über ein chromogenes Substrat, das spezifisch für das für die Markierung eingesetzte Enzym ist, ermöglicht und kann schließlich z.B. über Sichtvergleich des durch die Enzymreaktion umgesetzten Substrats im Vergleich zu Kontrollstandards erfolgen.
Weiterhin kann die Detektion durch andere Assays sichergestellt werden, z.B. durch radioaktive Markierung der Substanz (bspw. durch einen Radioimmunoassay (RIA; Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T. et al. North Holland Publishing Company, New York (1978). Das radioaktive Isotop kann dabei durch die Verwendung von Szintillationszählern oder durch Autoradigraphie detektiert und quantifiziert werden.
Bevorzugt werden fluoreszierende Verbindungen zur Markierung eingesetzt, beispielsweise Verbindungen wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin sowie GFP (engt. „green fluorescent protein") und dessen Derivate (vgl. auch Biolumineszenz weiter unten). Auch fluoreszensemittierende Metalle, wie z. B. ¹⁵²E oder andere Metalle aus der Lanthanid-Gruppe, können eingesetzt werden. Diese Metalle werden an die Substanz über Chelatgruppen, wie z. B. Diethylentriaminpentaessigsäure (ETPA) oder EDTA angekoppelt. Weiterhin kann an die erfindungsgemäße Substanz über eine mit Hilfe von Chemilumineszenz wirkende Verbindung angekoppelt werden. Die Gegenwart der Chemilumineszenz-markierten Verbindung wird dann über die Lumineszenz, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht, detektiert. Beispiele für derartige Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester. Gleichermaßen können auch biolumineszente Verbindungen zum Einsatz kommen. Biolumineszenz ist eine Unterart der Chemilumineszenz, die bei biologischen Systemen vorgefunden wird, wobei ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion verstärkt. Die Detektion des biolumineszenten Proteins erfolgt wiederum über die Lumineszenz, wobei als biolumineszente Verbindung beispielsweise Luciferin, Luciferase oder Aequorin in Betracht kommen.
Zur Erläuterung der Erfindung werden im folgenden neben den im allgemeinen Text zu Begriffen gegebenen Erklärungen weitere Definitionen angegeben, um klarzustellen, wie bestimmte, insbesondere in den Ansprüchen verwendete Begriffe im Sinne dieser Erfindung zu verstehen und auszulegen sind.

– Substanz: Damit ist eine chemische Verbindung gemeint (vgl. auch die vorstehenden Erläuterungen hierzu). Hier handelt es sich im engeren Sinne um Verbindungen, die potentiell eine Wirkung im Körper entfalten können, niedermolekulare Wirkstoffe, Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine, insbesondere hier niedermolekulare Wirkstoffe.
– schmerzregulierend: Im Sinne der Erfindung heißt schmerzregulierend, daß die Substanz die Wahrnehmung von Schmerz direkt oder indirekt beeinflußt, insbesondere analgetisch wirkt.
– Inkubation: Unter Inkubation ist das Einbringen und Belassen eines biologischen Untersuchungsobjektes, beispielsweise einer Zelle oder eines Proteins, in einem temperierten Medium wie in einem Brutschrank oder auf einem Wasserbad zu verstehen. Dabei heißt hier unter geeigneten Bedingungen eine Inkubation unter physiologischen Bedingungen (z.B. 37°C, pH 7,2) oder bei den Bedingungen, bei denen eine optimale Messung im Verfahren möglich wird.
– Zelle: Die Zelle ist ein sich selbst regulierendes, offenes, mit seiner Umgebung durch permanenten Stoffaustausch in einem Fließgleichgewicht stehendes System mit eigenem Stoffwechsel, und Vermehrungsfähigkeit. Die Zelle kann separat kultiviert oder Teil eines Gewebes, insbesondere aus einem Organ, sein, und dort vereinzelt oder noch im Zellverband vorliegen.
– Präparation aus einer Zelle: Darunter versteht man Präparate, die mittels chemischer, biologischer, mechanischer oder physikalischer Methoden unter Änderung der Zellstruktur hergestellt werden, beispielsweise Zellysate, Membranfragmente, isolierte Zellkompartimente, isoliertes Cytosol, oder aus Gewebe gewonnenes Homogenat.
– Peptid: Verbindung aus über peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften Aminosäuren. Ein Oligopeptid besteht aus zwischen 2 und 9 Aminosäuren, ein Polypeptid aus zwischen 10 und 100 Aminosäuren.
– Protein: Verbindung aus über peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften mehr als 100 Aminosäuren u.U. mit einer definierten Raumstruktur.
– Polynukleotid bzw. Nukleinsäure: Das zugrundeliegende Nukleotid ist ein grundsätzlich aus Nukleobase, Pentose und Phosphorsäure bestehender Grundbaustein der Nukleinsäuren. Diese entspricht einem hochmolekularen Polynukleotid aus mehreren Nukleotiden, die über Phosphorsäure-Pentose-Veresterung miteinander verknüpft sind. Unter diesen Begriff fallen erfindungsgemäß aber auch modifizierte Polynukleotide, die zwar die Basenabfolge beibehalten, aber über ein modifiziertes Rückrat statt der Phosphorsäure-Pentose verfügen (vgl. hierzu auch die vorstehenden Ausführungen hinsichtlich Antisense-Polynukleotid bzw. Antisense-Nukleinsäure, die hinsichtlich der Analoga usw. entsprechend gelten).
– zu mindestens 90 (95, 97)% ähnlich: Darunter ist zu verstehen, daß die mit erfaßten Polynukleotide in ihrem kodierenden Bereich bezüglich der Basenabfolge zu mindestens 90% (95%, 97%) identisch mit der Referenz (Figur etc.) sind und die mit erfaßten Peptide und Proteine in ihrer Primärstruktur, der Abfolge der Aminosäuren zu mindestens 90% (95%, 97%) mit der Referenz identisch sind.
– Gen: Mit dem Begriff Gen wird ein Genomabschnitt mit einer definierten Nukleotidsequenz bezeichnet, der die Information zur Synthese einer m- oder prä-mRNA oder einer sonstigen RNA (z.B. tRNA, rRNA, snRNA etc.) enthält. Es besteht aus kodierenden und nicht kodierenden Abschnitten.
– Genfragment: Nukleinsäureabschnitt, der in seiner Basenabfolge einen Teilbereich eines Gens beinhaltet.
– physiologisch verlängertes Genfragment: Genfragment, das durch molekularbiologische Verfahren, wie z.B. das Durchmustern einer cDNA-Bibliothek, das Herausziehen komplementärer DNA-Stränge aus einem Nukleinsäuregemisch oder PCR-vermittelten Verfahren (sog. RACE-Protokolle) so verlängert wird, daß es in seiner Sequenz der in dem entsprechenden Zielorgan (Gehirn, Rückenmark, Hinterwurzelganglion) exprimierten mRNA entspricht.
– Bindung an das Peptid oder Protein: Wechselwirkung zwischen Substanz und Peptid oder Protein, die zu Fixierung führt.
– funktionelle Parameter: Darunter versteht man Meßgrößen eines Experimentes, die mit der Funktion eines Proteins (z.B. Ionenkanal, Rezeptor, Enzym) korrelieren.
– gentechnisch manipuliert: Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart, daß hier genetisches Material eingebracht wird.
– endogen exprimiert: Expression eines Proteins, die eine Zelllinie unter geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne das dieses entsprechende Protein durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde.
– G-Protein: International übliche Abkürzung für ein Gunaosintriphosphat (GTP)bindendes Protein, das als Signalprotein durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktiviert wird.
– Reportergen: Generelle Bezeichnung für Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer Methoden oder histochemischer Methoden einfach nachweisen lassen, wie z.B. Luziferase, alkalische Phosphatase oder Green Fluorescent Protein (GFP).
– (rekombinantes) DNA-Konstrukt: Generelle Bezeichnung für jede Art von DNA-Molekülen, die durch die in vitro-Verknüpfung von DNA-Molekülen entstanden sind.
– Klonierungsvektor: Generelle Bezeichnung für Nukleinsäure-Moleküle, die beim Klonieren als Träger von Fremdgenen oder Teilen dieser Gene dienen.
– Expressionsvektor: Bezeichnung für speziell konstruierte Klonierungsvektoren, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transkription und Translation des in den Vektor einklonierten Fremdgens erlauben.
– LTR-Sequenz: Abkürzung für engl. „Long Terminal Repeat". Generelle Bezeichnung für längere Sequenzbereiche, die an beiden Enden eines linearen Genoms zu finden sind. Derartige Sequenzbereiche kommen z.B. in den Genomen von Retroviren und an den Enden eukaryontischer Transposons vor.
– Poly-A-Schwanz: die am 3'-Ende von mRNAs durch Polyadenylierung angeheftenen Adenyl-Reste (ca. 20-250).
– Promotor-Sequenz: Bezeichnung für einen DNA-Sequenzbereich, von dem aus die Transkription eines Gens, d.h. die Synthese der mRNA, gesteuert wird.
– ORI-Sequenz: Abkürzung für engt. „Origin of Replication". Die ORI-Sequenz erlaubt einem DNA-Molekül, sich als autonome Einheit in der Zelle zu vermehren.
– Enhancer-Sequenz: Bezeichung für im allgemeinen relativ kurze, zum Teil als Repetitionen auftretende, genetische Elemente, die in der Regel die Expression mancher Gene in unterschiedlichem Maße verstärken.
– Transkriptionsfaktor: Bezeichnung für ein Protein, das über eine Bindung an spezifische DNA-Sequenzen, die Transkription eines Gens beeinflußt.
– kultivieren: Zellen oder Gewebe unter geeigneten Kulturbedingungen halten.
– Bedingungen, die eine Expression erlauben: Darunter versteht man die Auswahl und Anwendung von Kulturbedingungen die eine Expression des interessierenden Proteins erlauben, darunter gehören Temperaturänderung, Mediumwechsel, Zusatz von induzierenden Substanzen, Weglassen hemmender Substanzen.
– Inkubationszeit: Zeitdauer, während der ein Untersuchungsobjekt, bspw. Zellen, Gewebe oder einzelne Moleküle oder Molekülgemische, inkubiert, d.h. definierten Bedingungen, wie Temperatur, Druck, Salzgehalt, pH-Wert usw., ausgesetzt werden.
– Selektionsdruck: Anwendungen von Kulturbedingungen die Zellen mit einem bestimmtem Phänotyp, insbesondere durch Expression eines bestimmten Genprodukts, dem sog. Selektionsmarker, einen Wachstumsvorteil verschaffen.
– Amphibienzelle: Zelle aus einem Tier der Klasse der Amphibia.
– Bakterienzelle: Zelle, die dem Überreich der Eubacteria oder Archaebacteria zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
– Hefezelle: Zelle, die der Ordnung der Endomycetalse zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
– Insektenzelle: Zelle, die der Ordnung der Hexapoda zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
– native Säugetierzelle: Aus einem Säugetier stammende Zelle, die in ihren relevanten Merkmalen der im Organismus befindlichen Zelle entspricht.
– immortalisierte Säugetierzelle: Zelle, die durch die angewendeten Kulturbedingungen oder gentechnische Manipulation die Eigenschaft erlangt hat, sich über die normalerweise übliche Teilungshäufigkeit hinaus (ca.100), in der Kultur zu teilen.
– markiert: Durch entsprechende Modifizierung oder Derivatisierung für einen Nachweisn zugänglich gemacht. Beispielsweise radioaktiv oder lumineszierend, insbesondere fluoreszierend (vgl. auch obige Ausführungen bzgl. geeigneter Markierungen).
– Ligand: Substanz, die an ein im Körper oder einer Zelle befindliches Molekül, bspw. einen Rezeptor, bindet.
– Verdrängung: Vollständiges oder partielles Entfernen eines Liganden von seiner Bindungsstelle.
– gebundene Aktivität: Biochemisch oder physikalisch erfaßter Meßwert, der mit der an einem Rezptor gebundenen Ligandenmenge korreliert.
– Regulation: Die als Teil eines Regelprozesses erfolgte Hemmung oder Aktivierung eines Vorgangs.
– Hemmung: Als Sonderfall der Regulation die Verhinderung/Minderung eines Vorgangs.
– Aktivierung: Als Sonderfall der Regulation die Auslösung/Verstärkung eines Vorgangs.
– Rezeptoren: Im weitesten Sinne alle im pro- oder eukaryoten Organismus vorhandenen Moleküle, an die ein Ligand, bspw. ein Wirkstoff, binden kann. Im engeren Sinne membrangebundene Proteine oder Komplexe mehrerer Proteine, die durch Bindung eines Liganden eine Änderung in der Zelle hervorrufen.
– Ionenkanäle: Membrangebundene Proteine oder Komplexe mehrerer Proteine, durch die Kationen oder Anionen durch die Membran hindurchgelangen können.
– Enzyme: Bezeichnung für Proteine oder Komplexe aus einer aktivierenden Nichteiweißkomponente mit einem Protein, die katalytische Eigenschaften besitzen.
– Genexpression (exprimieren/exprimierbar): das Übersetzen der genetischen Information eines Genes in RNA (RNA-Expression) oder in Protein (Proteinexpression).
– Ionenmilieu: Konzentration eines oder mehrerer Ionen in einem bestimmten Kompartiment.
– Membranpotential: Spannungsdifferenz über eine Membran aufgrund eines Überschusses an Kationen auf der einen Seite und Anionen auf der anderen Seite der Membran.
– Veränderung der Enzymaktivität: Hemmung oder Induktion der katalytischen Aktivität eines Enzyms.
– 2^nd messenger: Kleines Molekül, das als Antwort auf ein extrazelluläres Signal entweder im Cytosol gebildet wird oder in das Cytosol hineinwandert und dabei hilft die Information an das Zellinnere weiterzugeben, wie zum Beispiel cAMP, IP₃.
– (Gen-)Sonde: Bezeichnung für jede Art von Nukleinsäuren, mit deren Hilfe man ein gesuchtes Gen oder eine bestimmte DNA-Sequenz nachweisen kann. Durch Derivatisierung der Gensonde (z.B. Biotin, magnetische Beads, Digoxinin) können zudem DNA-Moleküle aus einem Gemisch herausgezogen werden. Als Sonden werden klonierte Gene, Genfragmente, chemisch synthetisierte Oligonukleotide und auch RNA verwendet, die meist radioaktiv markiert ist.
– DNA: Internationale Bezeichnung für Desoxyribonukleinsäure.
– genomische DNA: Generelle Bezeichnung für die bei eukaryontischen Organismen aus dem Zellkern einer Zelle stammenden DNA.
– cDNA: Abkürzung für "complementary DNA". Bezeichnung für die einzel- bzw. doppelsträngige DNA-Kopie eines RNA-Moleküls.
– cDNA-Bank/Bibliothek: Bezeichung für eine Sammlung von willkürlich klonierten cDNA-Fragmenten, die zusammengenommen die Gesamtheit aller von einer Zelle oder einem Gewebe synthetisierten RNA repäsentieren.
– cDNA-Klon: Bezeichnung für eine Population genetisch einheitlicher Zellen, die sich von einer einzigen Zelle ableiten, derart, daß diese Zelle eine künstlich eingebrachtes cDNA-Fragment enthält.
– Hybridisierung: Durch Basenpaarung bewirkte Ausbildung eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls aus zwei getrennten Einzelsträngen.
– stringente Bedingungen: Bedingungen, unter denen nur perfekt basengepaarte Nukleinsäure-Stränge gebildet werden und stabil bleiben.
– isolieren: ein gesuchtes Molekül aus einem Gemisch herausfinden und abtrennen.
– DNA-Sequenzierung: Bestimmung der Abfolge der von Basen in einem DNA-Molekül.
– Nukleinsäuresequenz: Bezeichnung für die Primärstruktur eines Nukleinsäure-Moleküls, d.h. die Abfolge der einzelnen Basen, aus denen sich eine Nukleinsäure zusammensetzt.
– Genspezifische Oligonukleotid-Primer: Oligonukleotide, also etwa 10-40 Basen lange Nukleinsäurefragmente, die in ihrer Basenzusammensetzung eine vorzugsweise stringente Hybridisierung an das gesuchte Gen oder die gesuchte cDNA erlauben.
– Ermitteln von Oligonukleotid-Primern: Die manuelle oder computerunterstützte Suche von Oligonukleotiden zu einer vorgegebenen DNA-Sequenz, die für eine Hybridisierung und/oder eine Polymerase-Kettenreaktion möglichst optimal geeignet sind.
– PCR: Abkürzung für „Polymerase-Kettenreaktion". In vitro-Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen.
– DNA-Template: Nukleinsäuremolekül oder ein Gemisch von Nukleinsäuremolekülen, aus denen ein DNA-Abschnitt mit Hilfe der PCR (s.o.) vervielfältigt wird.
– RNA: International gebräuchliche Abkürzung für Ribonukleinsäure.
– mRNA: International gebräuchliche Abkürzung für messenger-Ribonukleinsäuren, die am Transfer der genetischen Information aus dem Kern in die Zelle beteiligt sind und die Information für die Synthese eines Polypetids oder eines Proteins beinhalten.
– Antisense-Polynukleotid bzw. Antisense-Nukleinsäure: Ein aus mehreren natürlichen oder modifizierten Nukleinsäurebausteinen bestehendes Molekül, deren Basenabfolge mindestens teilweise komplementär zur Basenabfolge eines Teilbereiches einer in der Natur vorkommenden RNA ist.
– PNA: International gebräuchliche Abkürzung für „Peptidic Nucleic Acid" (Peptidnukleinsäure). Hierbei bilden peptidisch verknüpfte Aminosäuren eine Kette, wobei die Aminosäuren als Seitenkette eine für die Hybridisierung mit DNA oder RNA befähigte Base trägt.
– Sequenz: Abfolge von Nukleotiden oder Aminosäuren. Im spezifischen Sinne dieser Erfindung ist damit die Nukleinsäuresequenz gemeint.
– Ribozym: Bezeichnung für eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure (z.B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease)
– DNA-Enzym: Bezeichnung für ein DNA-Molekül, das katalytische Aktivität beinhaltet (z.B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease)
– katalytische RNA/DNA: Generelle Bezeichnung für Ribozyme bzw. DNA-Enzyme (s.o.).
– Adenovirus: Bei Vertebraten vorkommendes cytopathogenes Virus.
– Adenoassoziiertes Virus (AAV): Gehört zur Familie der Parvoviren. Für eine effektive Vermehrung des AAV ist eine Coinfektion der Wirtszellen mit Helferviren (z.B. Herpes-, Vaccinia- oder Adenoviren) erforderlich. Die Eigenschaft von AAV, stabil in das Wirtsgenom zu integrieren, macht es als Transduktionsvektor für Säugetierzellen besonders interessant.
– Hergesvirus: Viraler Erreger der Herpes-Infektion.
– posttranslationale Modifikation: Veränderung an Proteinen oder Polypetiden, die nach der Translation durchgeführt wird, hierzu zählen z.B. Phosphorylierung, Glykosylierung, Amidierung, Acetylierung oder Proteolyse.
– glykosylieren: Bezeichnung für das Anhängen von einzelnen Zuckermolekülen oder ganzen Zuckerketten an Proteine.
– phosphorylieren: Bezeichnung für das Anhängen von einem oder mehreren Phosphatresten an ein Protein, bevorzugt an die OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin oder Tyrosin.
– amidieren. Die Bezeichnung für das Umwandeln einer Carboxylfunktion in eine Amidfunktion, z.B. an den carboxyterminalen Aminosäurerest eines Peptides oder Proteins.
– mit Membrananker versehen: Posttranslationelle Modifikation eines Proteins, oder eines anderen organischen Moleküls derart, daß es durch Anhängen eines hydrophoben Moleküls, geeigneterweise einer Fettsäure oder eines Derivats derselben, in der Lipiddoppelschicht-Membran von Zellen verankert wird.
– spalten: In diesem spezifischen Fall die Spaltung eines Peptids oder Proteins in mehrere Untersequenzen.
– verkürzen: Ein aus mehreren Einzelteilen bestehendes Molekül um eine oder mehrere Teile verkürzen.
– Antikörper: Lösliches, oder an Zellmembranen gebundenes, als Immunglobulins bezeichnetes Protein mit einer spezifischen Bindungsstelle für ein Antigen.
– monoklonaler Antikörper: Sind gegen eine einzige antigene Determinante eines Antigens gerichtete Antikörper mit extrem hoher Selektivität.
– polyklonaler Antikörper: Gemisch aus Antikörpern, die gegen mehrere Determinanten eines Antigens gerichtet sind.
– transgen: Genetisch verändert.
– nichthumanes Säugetier: Die Gesamtheit der Säugetiere (Klasse der Mammalia) mit Ausnahme der Spezies Mensch.
– Keimzelle: Zelle mit haploidem Genom, die durch Verschmelzung mit einer zweiten Keimzelle die Bildung eines neuen Organismus ermöglicht.
– somatische Zelle: Diploide Zelle als Bestandteil eines Organismus.
– chromosomale Einbringung: Eingriff in die Nukleotidsequenz auf chromosomaler Ebene.
– Genom: Allgemeine Beschreibung für die Gesamtheit aller Gene in einem Organismus.
– Vorfahr des Tieres: Ein Tier (der Vorfahr), das auf natürliche oder künstliche Weise durch Weitergabe an seinem genetischen Material in direkter Linie mit einem anderen Tier (dem Nachfahren) verwandt ist.
– exprimierbar: Ein Nukleinsäuremolekül ist dann exprimierbar, wenn es die Information zur Synthese eine Proteins oder Polypetids beinhaltet und mit ensprechenden regulatorischen Sequenzen versehen ist, die eine Synthese dieses Proteins oder Polypeptids in vitro oder in vivo erlauben. Wenn diese Voraussetzungen nicht mehr gegeben sind, beispielsweise durch Eingriff in der kodierenden Sequenz, ist das Nukleinsäuremolekül nicht mehr exprimierbar.
– Nagetier: Tier aus der Ordnung der Rodentia, z.B. Ratte oder Maus.
– als schmerzregulierende Substanz identifizierbar: Substanz, die bei Einbringung in einen lebenden Organismus eine Verhaltensänderung bewirkt, die der Fachmann als schmerzhemmend bezeichnet (antinozizeptiv, antihyperalgetisch oder antiallodynisch). Im Falle des Screeningverfahrens bezieht sich dieser Ausdruck darauf, daß die Substanz beim Screening durch stärkere Bindung oder Auslösung einer Änderung eines funktionellen Parameters deutlich, beispielsweise zu 100 %, die Bindung oder Wechselwirkung des Durchschnitts der getesteten Substanzen übertrifft.
– Verbindung: Anderer Name für Molekül, als aus mehreren Atomen bestehend, hier ein durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziertes Molekül.
– Wirkstoff: Eine Verbindung, die bei Anwendung an einem Organismus eine Veränderung in diesem Organismus hervorruft. Im Besonderen werden darunter organisch-chemisch synthetisierte Moleküle verstanden, die auf den Organismus eine heilende Wirkung ausüben. Hier insbesondere Moleküle, die an die erfindungsgemäßen Proteine und Peptide binden.
– niedermolekular: Molekül mit einem Molekulargewicht < 2kDa.
– Arzneimittel: ein Stoff entsprechend der Definition im Artikel 1 § 2 des Gesetzes über den Verkehr mit Arzneimitteln.
– Diagnostikum: Verbindung oder Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Krankheit zu diagnostizieren.
– Behandlung von Schmerz: Verfahren, mit dem Ziel Schmerzen zu lindern oder aufzuheben, oder das zu erwartende Auftreten von Schmerzen zu hemmen (präemptive Analgesie).
– chronischer Schmerz: eine Schmerzempfindung von länger anhaltender Dauer, oft dadurch gekennzeichnet, daß sie über Zeitpunkt und Ort des initialen Stimulus hinausreicht, die Schmerzempfindlichkeit des Körpers steigert.
– Gentherapie: Unter Gentherapie versteht man alle Verfahren, die das Ziel haben, genetische Erkrankungen durch geeignete Veränderungen des Genoms kausal zu behandeln.
– In-vivo-Gentherapie: Einbringen von genetischem Material in den lebenden Organismus mit dem Ziel der Gentherapie. Man kann zwischen somatischem und Keimbahn-Eingriff unterscheiden, der einmal an diploiden Zellen und einmal an haploiden Zellen stattfindet.
– In-vitro-Gentherapie: Einbringen von genetischem Material in Zellen außerhalb des Organismus, bspw. des menschlichen Körpers, mit dem Ziel, diese nachher wieder durch Einbringen in den Organismus, bspw. den menschlichen Körper, zur Gentherapie zu verwenden.
– Diagnostik: Verfahren, um eine Krankheit zu identifizieren.
– Wirksamkeitsuntersuchung: Untersuchung mit dem Ziel, die Wirksamkeit einer Verbindung nach Einwirkung auf einen lebenden Organismus zu untersuchen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Zelle vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert. Dabei wird genetisches Material in die Zelle eingebracht, insbesondere eine oder mehrere Polynukleotidsequenzen. In einer weiter bevorzugten Variante dieser Ausführungsform erlaubt die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter. In dieser Ausführungsform wenden durch gentechnische Manipulation Voraussetzungen geschaffen, unter denen die Veränderung eines funktionellen Parameters überhaupt oder verbessert gemessen werden kann. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines G-Proteins exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird. Darunter ist insbesondere die gentechnische Einführung eines endogen nicht vorhandenen oder physiologisch nicht exprimierten G-Proteins (GTP-bindenden Proteins) in die Zelle zu verstehen, beispielsweise die Einführung eines chimären G-Proteins, das eine Veränderung des Signalweges erlaubt oder eines promiskuitiven G-Proteins, das sehr bindungsfreudig ist. Die Einführung eines Reportergens wiederum erlaubt die Messung einer (extrazellulär ausgelösten) induzierten Expression des Genproduktes.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zelle gentechnisch so manipuliert, daß die Zelle mindestens ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c) 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90% ähnliches Polynukleotid oder ein Polynukleotid aus der kodierenden Sequenz eines Genes, das ein Genfragment gemäß einer der in den 1-18 dargestellten Sequenzen umfaßt, oder ein dazu zu mindestens 90% ähnliches Polynukleotid enthält. Damit kann beispielsweise erreicht werden, daß ein Peptid oder Protein, das in der im Verfahren verwendeten Zelle oder Präparation nicht endogen exprimiert wird, von der Zelle synthetisiert wird. Dabei ist es insbesondere der Zelle synthetisiert wird. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn das Polynukleotid in einem rekombinanten DNA-Konstrukt enthalten ist. Unter einem (rekombinanten) DNA-Konstrukt versteht man ein in-vitro hergestelltes DNA-Molekül.
Wenn beim Verfahren vor dem Schritt (a) die Zelle gentechnisch manipuliert wird, ist es bevorzugt, daß die Zelle nach der gentechnischen Manipulation und vor dem Schritt (a) unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, gegebenenfalls unter Selektionsdruck. Unter „kultivieren" versteht man, Zellen oder Gewebe bei Bedingungen, die ein Überleben der Zellen, bzw. deren Nachfolgegeneration sichern, zu halten. Dabei sollten die Bedingungen hier so gewählt werden, daß eine Expression des durch die gentechnische Manipulation eingefügten Materials ermöglicht wird. Dazu sollten pH, Sauerstoffgehalt und Temperatur physiologisch gehalten sein und ausreichend Nährstoffe und notendige Cofaktoren beigefügt sein. Der Selektionsdruck erlaubt, nur die Zellen weiter zu kultivieren, bei denen die gentechnische Manipulation zumindest teilweise erfolgreich war. Dazu gehört beispielsweise die Einführung einer Antibiotikaresistenz über das DNA-Konstrukt.
Es ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt, wenn die verwendete Zelle eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle ist. Beispiele für Amphibienzellen sind Xenopus Oocyten, für Bakterienzellen E-coli-Zellen, für Hefezellen solche von Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris usw., für Insektenzellen Sf9-Zellen, für immortalisierte Säugetierzelle He-La-Zellen und für native Säugetierzellen die CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zelle.
Bei einer bevorzugten Meßmethode zur Feststellung der Bindung der Substanz an ein Peptid oder Protein im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden vom Peptid oder Protein und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsubstanz. Dabei ist ein Ligand ein mit hoher Spezifität an das Protein oder Peptid bindendes Molekül, das durch eine ebenfalls bindende, zu testende Sub stanz aus der Bindungsstelle verdrängt wird. Unter Markierung ist eine den Nachweis erleichternde künstliche Modifikation am Molekül zu verstehen. Beispiele sind radioaktive oder lumineszierende, insbesondere fluoreszierende Markierungen.
Bei einer anderen bevorzugten Meßmethode zur Feststellung der durch die Bindung der Substanz an ein Peptid oder Protein im erfindungsgemäßen Verfahren ausgelösten Veränderung der funktionellen Parameter, erfolgt die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter über Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen, insbesondere über Messung der Veränderung der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, über Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2^nd messenger. Damit ist auf der einen Seite direkt die Messung der Wirkung der Substanz über die Beeinflußung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen erfaßt, auf der anderen Seite als bevorzugt zu messende Beispiele sich ändernder Parameter wie Genexpression, Ionenmilieu, pH, Membranpotential, Enzymaktivität oder Konzentration der 2^nd messenger. Dabei versteht man unter Ionenmilieu insbesondere die Konzentration eines oder mehrer Ionen in einem Zellkompartiment, insbesondere dem Cytosol, unter Membranpotential die Ladungsdiffferenz zwischen zwei Seiten einer Biomembran und unter 2^nd messenger Botenstoffe des intrazellulären Signalwegs wie z.B. zyklisches AMP (cAMP), Inositoltriphosphat (IP3) oder Diacylglycerol (DAG).
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird das Peptid oder Protein in den Schritten (a) und (b) aus folgenden Gruppen ausgewählt:

– LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69,
– ein Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c) 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, oder
– ein Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein
– und/oder einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c) 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 36a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet, und/oder
– einem mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide.

Darunter erfaßt ist die Verwendung von Peptiden und insbesondere Proteinen mit bekannter Sequenz und Funktion, ohne daß für diese im Stand der Technik eine Funktion im Schmerz bekannt war.
In einer anderen bevorzugten Variante des Verfahrens kodiert für das Peptid oder Protein in den Schritten (a) und (b) ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid, das ein Genfragment gemäß einer der in den 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, dargestellten Sequenzen umfaßt, oder es kodiert für das Peptid oder Protein ein zu dem Gen zu mindestens 90%, insbesondere 95%, vorzugsweise 97%, ähnliches Polynukleotid.
In einer anderen bevorzugten Variante des Verfahrens kodiert für das Peptid oder Protein in den Schritten (a) und (b) ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid, das ein Genfragment gemäß einer der in den 1 – 6, 17 oder 18 dargestellten Sequenzen umfaßt, oder es kodiert für das Peptid oder Protein ein zu dem Gen zu mindestens 90%, insbesondere 95 %, vorzugsweise 97%, ähnliches Polynukleotid.
Ein werterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist auch ein Polynukleotid, welches einer der in einer der 1 – 18, dargestellten Nukleotidsequenzen oder einem Polynukleotid aus der kodierenden Sequenz eines Genes, das ein Genfragment gemäß einer der 1 – 18 umfaßt, zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht. Hiervon sind die dargestellten Genfragmente selbst umfaßt, wie auch ein Polynukleotid, das entweder vollständig oder zumindest Teilen der kodierenden Sequenz des dem Fragment entsprechenden Gens entspricht. Damit sind auch Polynukleotide gemeint, die mindests 90%-ige, vorzugsweise 95%-ige, insbesondere wenigstens 97%-ige Übereinstimmung in der Basenabfolge mit der kodierenden Sequenz der abgebildeten Polynukleotide oder der kodierenden Sequenz der Gens aufweisen.
Die erste besonders ausgewählte Form des Polynukleotids ist ein Polynukleotid, das einer der in einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, dargestellten Nukleotidsequenzen oder Teilen davon oder einem Polynukleotid aus der kodierenden Sequenz eines Genes, das ein Genfragment gemäß einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, umfaßt, zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist ein erstes durch das Herstellungsverfahren definiertes Polynukleotid, nämlich ein Polynukleotid, das zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% einer definierten Nuklein säuresequenz entspricht, das man dadurch erhält, daß ein Polynukleotid gemäß einer der 1 – 18 als Sonde markiert, eine cDNA-Bank mit der Sonde hybridisiert und unter Standardbedingungen gewaschen wird und der cDNA-Klon, an den die Sonde gebunden hat, isoliert und gegebenenfalls sequenziert wird. Hier wird ein Polynukleotid, oder Gen, über einen Herstellungsprozeß definiert, mit dem ein bestimmtes Produkt, das Gen, das ein bestimmtes, bekanntes Genfragment enthält, isoliert, beziehungsweise sequenziert werden kann. Eine Sonde ist eine Nukleinsäure, die zur Identifizierung komplementärer oder entsprechender Nukleotidsequenzen verwenden kann und dazu meist zur Identifizierung markiert wird. Eine cDNA-Bank sind klonierte cDNA-Fragmente einer Zelle oder eines Gewebes, die möglichst vollständig die mRNA des ausgewählten Gewebes wiedergeben sollen. Hybridisierung bedeutet die Bindung zweier einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle, wobei das Waschen unter Standardbedingungen gewährleisten soll, daß nur über exakt gepaarte Basen hybridisierte Nukleinsäuremoleküle gebunden bleiben. Ein cDNA-Klon ist eine genetisch einheitliche Nachkommengruppe, hier mit einheitlicher cDNA.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist ein zweites durch das Herstellungsverfahren definiertes Polynukleotid, nämlich ein Polynukleotid, das zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% einer definierten Nukleinsäuresequenz entspricht, das man dadurch erhält, daß Abschnitte eines Polynukleotids gemäß einer der 1 – 18 als Gen-spezifische Oligonukleotid-Primer ermittelt und synthetisiert werden, mit denen dann durch PCR ausgehend von einzel- oder doppelsträngiger DNA, von cDNA-Bibliotheken oder genomischer DNA als Template das verlängerte Polynukleotid generiert und gegebenenfalls sequenziert wird. Auch hier wird ein Polynukleotid, bzw. Gen, über einen weiteren Herstellungsprozeß definiert, mit dem ein bestimmtes Produkt, das Gen, das ein bestimmtes, bekanntes Genfragment enthält, isoliert, beziehungsweise sequenziert werden kann. Ein Primer ist ein Oligonukleotid, das mit der Ziel-DNA (als sog. Template) hybridisiert und Startpunkt der Synthese ist. PCR ist die Abkürzung für Polymerasekettenreaktion, bei der die Wärmebeständigkeit einer bestimmten Polymerase zur selektiven Vervielfältigung genutzt wird. Dabei dient das Template als Ausgangsamterial, an der die Vervielfältigung selektiv mit den Primern hybridisierender passender DNA stattfindet.
Die zweite besonders ausgewählte Form des Polynukleotids sind die durch die Herstellungsverfahren definierten Polynukleotide insbesondere dann, wenn als Ausgangspunkt ihrer Herstellung/Isolierung/Sequenzierung ein Polynukleotid (Genfragment) gemäß einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, verwendet wird.
Es ist weiter bevorzugt, daß es sich bei dem Polynukleotid um RNA bzw. einzel- oder doppelsträngige DNA, insbesondere mRNA oder cDNA, handelt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antisense-Polynukleotid bzw. eine Antisense-Nukleinsäure, wobei es sich auch um eine PNA handeln kann, das/die eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polynukleotid zu binden (vgl. auch die unter diesem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ebenfalls geltenden vorstehenden Ausführungen zum Begriff „Antisense-Polynukleotid" bzw. Antisense-Nukleinsäure"). Dabei versteht man unter PNA (engl. „peptidic nucleic acid") eine peptidische Nukleinsäure, die zwar die Basenpaare trägt, aber dessen Rückrat peptidisch gebunden ist. Eine Antisense-Nukleinsäure zeigt die komplementäre Basenabfolge zu mindestens einem Teil einer Basis-Nukleinsäure. Die erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure ist vorzugsweise Teil eines Ribozyms oder eines DNA-Enzyms oder einer sonstigen katalytischen RNA bzw. DNA. Unter Ribozym ist eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure zu verstehen, unter DNA-Enzym ein entsprechende Desoxyribonukleinsäure, also katalytische RNA bzw. DNA. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildet eine siRNA, die gegen eine der erfindungsgemäßen Gene gerichtet ist. Der Begriff „siRNA" ist erfindungsgemäß ein doppelsträngiges RNA-Molekül (dsRNA), das 19 bis 29 Bp, insbesondere 21 bis 23 Bp, umfasst und eine der mRNA der erfindungsgemäßen Gene komplementäre Sequenz aufweist. siRNA-Moleküle können bei verschiedenen Anbietern, bspw. IBA GmbH (Göttingen, Deutschland), bezogen werden.
Die siRNA der vorliegenden Erfindung liegt gemäß bevorzugten Ausführungsformen chemisch modifiziert vor, insbesondere um einen vorzeitigen Abbau durch Nukleasen zu umgehen. Diesbezüglich gelten die vorstehenden Ausführungen im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäure bzw. dem Antisense-Polynukleotid entsprechend.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, enthaltend eines der bereits beschriebenen Polynukleotide. Unter einem Vektor versteht man ein Nukleinsäuremolekül, das bei gentechnischer Manipulation dazu dient Fremdgene zu enthalten bzw. zu übertragen. Besonders bevorzugt ist dabei, daß es sich um einen Expressionsvektor handelt. Er dient damit der Expression des enthaltenen Fremdgens, des Polynukleotids.
Werter bevorzugt ist ein Vektor, der abgeleitet von einem Virus ist, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und der vorzugsweise mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI-Sequenz enthält. Ein LTR ist ein Long Terminal Repeat", ein am Ende befindlicher Abschnitt, der sich beispielsweise bei Viren findet. Poly-A-Sequenz ist ein mehr als 20 Adenosinreste langer Schwanz am 5'-Ende. Eine Promotorsequenz ist der Steuerungsbereich für die Transkription.
Eine besonders ausgewählte Form des erfindungsgemäßen Vektors ist ein Vektor der ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid gemäß 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, oder ein Polynukleotid oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid, das die Sequenz gemäß den 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, enthält oder ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid, das durch ein Herstellungsverfahren ausgehend von einem Genfragment gemäß einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, erhalten wird, enthält.
Ein weiterer Gegenstand ist ein Peptid, insbesondere Oligopeptid oder Polypeptid, oder Protein, das durch eines der bereits als Gegenstände der Erfindung beschriebenen Polynukleotide kodiert wird.
Ein weiter Gegenstand der Erfindung ist auch ein Peptid, insbesondere Oligopeptid oder Polypeptid, oder Protein, für das ein Polynukleotid kodiert, daß unter Standardbedingungen mit einem der Polynukleotide gemäß 1 – 18 oder dessen Antisense-Polynukleotid hybridisiert.
Es ist auch Gegenstand dieser Erfindung, wenn das Peptid oder Protein posttranslational modifiziert wurde, es insbesondere glykosyliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde. Posttranslationale Modifikationen sind beispielsweise Voet & Voet, Biochemistry, 1. Aufl., 1990, S. 935-938, zu entnehmen.
Eine besonders ausgewählte Form des Peptid oder Proteins wird durch ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid gemäß 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, oder ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid , das die Sequenz gemäß den 7- 16, insbesondere 15 oder 16, enthält oder ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid, das durch ein Herstellungsverfahren, ausgehend von einem Genfragment gemäß einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, erhalten wird, kodiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Antikörper gegen ein bereits als Gegenstand der Erfindung beschriebenes Peptid oder Protein.
Der Begriff "Antikörper" umfaßt i.S. der vorliegenden Erfindung sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfindungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auftreten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionsproteinen werden typischerweise durch die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt. Als Antikörper werden nach der vorliegenden Erfindung also sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper, bspw. scFv-Konstrukte, oder auch synthetische Antikörper bezeichnet.
Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heterogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehören aber auch polyklonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung der Antikörper (bspw. über eine Säule, die mit Peptiden eines spezifischen Epitops beladen sind) erhalten werden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); US-Patent 4,376,110; Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988); Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Die in den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen.
Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druckschriften beschrieben herstellen. Kurz gesagt, werden dazu Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthio cyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren insertiert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe-Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.
Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehören: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.
Bei den efindungsgemäßen chimären Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse-monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen). Chimäre Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z.B. ergeben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, so daß human/murine chimäre Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden. Noch mehr bevorzugt ist ein monoklonaler Antikörper, der die hypervariablen, Komplementari täts-bestimmenden Regionen (CDR, engl. "complementarity defining region") eines murinen monoklonalen Antikörpers mit den übrigen Bereichen eines humanen Antikörpers in sich vereinigt. Ein derartiger Antikörper wird humanisierter Antikörper genannt. Chimäre Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312 643-646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023 ; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171496 ; Morrion et al., EP-A-173494 ; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187 ; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) und Harlow und Lane, Antibodies: A Laboraton Manual, supra. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezogen.
Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Fab und F(ab')₂-Fragmente entbehren eines Fc-Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, so daß sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht-spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufweisen. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')₂, Fragmenten) verwendet werden, oder durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden.
Es ist die besonders ausgewählte Form des Antikörpers, wenn er gegen ein Peptid oder Protein gerichtet ist, für das ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid gemäß 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, oder ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid, das die Sequenz gemäß den 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, enthält oder ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid, das durch ein Herstellungsverfahren ausgehend von einem Genfragment gemäß einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, erhalten wird, kodiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, enthaltend ein bereits als Gegenstand der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid oder eine wie vorstehend definierte Antisense-Nukleinsäure, ein bereits als Gegenstand der Anmeldung beschriebenes Peptid oder Protein und/oder einen bereits als Gegenstand der Anmeldung beschriebenen Vektor. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn es sich um um eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle handelt. Beispiele für Amphibienzellen sind Xenopus Oocyten, für Bakterienzellen E-coli-Zellen, für Hefezellen solche von Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Pichia pastoris, für Insektenzellen Sf9-Zellen, für immortalisierte Säugetierzelle HeLa-Zellen und für native Säugetierzellen die CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zelle.
Die besonders ausgewählte Form der Zelle enthält die besonders ausgewählte Form des Polynukleotids, die besonders ausgewählte Form des Peptids oder Proteins und/oder die besonders ausgewählte Form des Vektors.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein transgenes nichthumanes Säugetier, dessen Keim- und somatische Zellen eine der bereits als Gegenstand der Erfindung beschriebenen Polynukleotide als Resultat einer chromosomalen Einbringung in das Genom des Tieres oder das Genom eines der Vorfahren des genannten Tieres enthalten. Dabei versteht man unter chromosomaler Einbringung, dass sich der gentechnische manipulative Eingriff im Chromosom des Tieres auswirkt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein transgenes nichthumanes Säugetier, dessen Keim- und somatische Zellen als Resultat einer chromosomalen Manipulation im Genom des Tieres oder im Genom eines der Vorfahren des genannten Tieres eine der vorstehend definierten Nukleotidsequenzen nicht mehr in exprimierbarer Form enthalten. Die chromosomale Manipulation betraf das Gen des Tieres oder seiner Vorfahren. Unter nicht mehr exprimierbar versteht man, wenn die Information zur Synthese eines Polypeptids oder Proteins, obwohl in nativer Form vorhanden, nicht mehr die vollständige Synthese erlauben. Beispiele sind Veränderung der regulatorischen Sequenzen oder Herausschneiden eines Teils des nativen Nukleinsäuremoleküls im kodierenden Bereich.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn das transgene nichthumane Säugetier ein Nagetier ist.
Die besonders ausgewählte Form des transgenen nichthumanen Säugetiers liegt vor, wenn die Nukleotidsequenz der besonders ausgewählten Form des Polynukleotids entspricht.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Verbindung, die als schmerzregulierende Substanz durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifizierbar ist. Hierbei bezieht sich der Begriff „Verbindung" insbesondere auf niedermolekulare Wirkstoffe wie vorstehend erläutert, aber auch auf biologisch-chemische Moleküle, wie Peptide, Proteine, Saccharide, Fette und Nukleinsäuren. Dabei bedeutet identifizierbar, daß die Verbindung das Merkmal aufweist, daß es beim erfindungsgemäßen Screeningvertahren bezüglich der Bindung deutlich stärker, vorzugsweise doppelt so stark bindet wie der Durchschnitt der zu testenden Substanzen oder bezüglich der Änderung der funktionellen Parameter deutlich vom Durchschnitt der zu testenden Substanzen abweicht.
Eine besonders ausgewählte Form der efindungsgemäßen Verbindung ist eine solche, die durch ein Verfahren unter Verwendung der bekannten Proteine, LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, oder einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, oder einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein und/oder einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet, und/oder einem mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide, als schmerzregulierende Substanz identifizierbar ist.
Eine ebenfalls besonders ausgewählte Form der erfindungsgemäßen Verbindung ist eine solche, die durch ein Verfahren identifizierbar ist, in dem für das Peptid oder Protein in den Schritten (a) und (b) ein Gen, bestehend aus einem Polynukleotid, das ein Genfragments gemäß einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, umfaßt, kodiert, oder ein zu dem Gen zu mindestens 90%, insbesondere 95%, vorzugsweise 97%, ähnliches Polynukleotid.
Ebenfalls bevorzugt ist eine Verbindung, die durch ein Verfahren identifizierbar ist, in dem für das Peptid oder Protein in den Schritten (a) und (b) ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid, das ein Genfragments gemäß einer der 1 – 6, 17 oder 18 umfaßt, kodiert, oder ein zu dem Gen zu mindestens 90%, insbesondere 95 %, vorzugsweise 97%, ähnliches Polynukleotid als schmerzregulierende Substanz.
Ein weiterer Gegenstand ist auch ein Wirkstoff, der an ein erfindungsgemäßes . Peptid oder Protein bindet, wobei besonders bevorzugt ist, wenn der Wirkstoff ein niedermolekularer Wirkstoff ist.
Eine besonders ausgewählte Form des Wirkstoffes ist es, wenn der Wirkstoff an die besonders ausgewählte Form des Peptids oder Proteins bindet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein, einen erfindungsgemäßen Vektor, einen erfindungsgemäßen Antikörper, eine erfindungsgemäße Zelle, eine erfindungsgemäße Verbindung und/oder einen erfindungsgemäßen Wirkstoff sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
Entsprechende Wege zur geeigneten Formulierung und Herstellung derartiger Formulierungen sind bspw. bei "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das vollinhaltlich Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist. Für die parenterale Verabreichung kommen als Hilfs- bzw. Zusatzstoffe bspw. steriles Wasser, sterile Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole, hydrierte Naphthalene und insbesondere biokompatible Lactidpolymere, Lactid/Glykolidcopolymere oder Polyoxyethylen-/Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Laktose, Manitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol an erfindungsgemäße Nukleinsäuren, Proteine oder Antikörper, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluß von Materialien in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindungen, wie z.B. Polylaktat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamerare oder multilamelare Vesikel, Erythrozyten-Fragmente oder Spheroblasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der phannazeutischen Zusammensetzungen werden abhängig vom physikalischen Verhalten, bspw. in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bioverfügbarkeit oder Abbaubarkeit gewählt. Kontrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffkomponenten schließt die Formulierung auf Basis lipophiler Depots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer pharma zeutischer Zusammensetzungen bzw. Arzneimittel, enthaltend die therapeutisch wirksamen Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z.B. Polyoxamere oder Polyoxamine). Weiterhin können erfindungsgemäße therapeutisch wirksame Substanzen oder Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z.B. Proteaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren oder Permeabilitätsverstärker, aufweisen. Bevorzugte Träger sind typischerweise wässrige Trägermaterialien, wobei Wasser zur Injektion (WFI) oder Wasser, gepuffert mit Phosphat, Zitrat, HEPES oder Acetat usw. verwendet wird und der pH typischerweise auf 5,0 bis 8,0 (vorzugsweise 6,5 bis 7,5) eingestellt wird. Der Träger bzw. das Vehikel wird zusätzlich vorzugsweise Salzbestandteile enthalten, z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder andere Komponenten, welche die Lösung bspw. isotonisch machen. Weiterhin kann der Träger bzw. das Vehikel neben den vorstehend genannten Bestandteilen zusätzliche Komponenten, wie humanes Serumalbumin (HSA), Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren usw., enthalten.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemäßen Gegenstand je nach galenischer Form gegebenenfalls vorstehend genannte Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen. Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblichweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-Inhibitoren, RNAse-Inhibitoren etc.
Besonders bevorzugt ist weiterhin ein Arzneimittel, das bevorzugte Formen oder die besonders ausgewählte Formen) des/der Polynukleotids(e), der Antisense-Nukleinsäure(n), Peptids oder Proteins, Vektors, Antikörpers, Zelle, Verbindung und/oder Wirkstoffes enthält.
Dabei kann es besonders bevorzugt sein, wenn das Arzneimittel eine bevorzugte erfindungsgemäße Verbindung enthält, die durch ein Verfahren unter Verwendung der bekannten Proteine, LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Poly nukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, oder einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein und/oder einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet, und/oder einem mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide, als schmerzregulierende Substanz identifizierbar ist.
Bevorzugt ist es auch, wenn das Arzneimittel eine Verbindung, die durch ein Verfahren identifizierbar ist, in dem für das Peptid oder Protein in den Schritten (a) und (b) ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid, das ein Genfragments gemäß einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, umfaßt, kodiert, oder ein zu dem Gen zu mindestens 90%, insbesondere 95%, vorzugsweise 97%, ähnliches Polynukleotid, oder einen Wirkstoff enthält, der an die besonders ausgewählte Form des Peptids oder Proteins bindet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostikum enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein, einen erfindungsgemäßen Vektor, Antikörper oder Teile davon und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Hilf- und/oder Zusatzstoffe. Dabei versteht man unter Diagnostikum ein Hilfsmittel zur Diagnose beispielsweise eines Krankheitsgeschehens.
Besonders bevorzugt ist ein Diagnostikum, das die vorstehend als besonders bevorzugte Form des/der Polynukleotids, Antisense-Nukleinsäure(n), Peptids oder Proteins oder eines Teiles davon, Vektors, Antikörpers und/oder der Zelle enthält.
Besonders bevorzugt ist eine Form des Diagnostikums, das eine Antisense-Nukleinsäure enthält, die eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polynukleotid zu binden.
Ferner werden erfindungsgemäß diagnostische in-vitro Verfahren offenbart, die es erlauben, in einem Organismus, insbesondere beim Menschen, auf molekularer Grundlage der Ursache für auftretende krankhafte Schmerzzustände nachzugehen bzw. mit Schmerzen einhergehende Erkrankungen nachzuweisen (vgl. auch die nachstehenden Ausführungen hierzu unter dem Punkt 2. Diagnose). Für derartige Verwendungszwecke eignen sich insbesondere PCR-Methoden, bspw. RT-PCR-Verfahren, also die Diagnose auf der Basis von mRNA, die in vitro entsprechend in cDNA übersetzt wird und dann mit Hilfe von herkömmlichen PCR-Verfahren vervielfältigt wird. Auch entsprechende Array-Techniken, die erfindungsgemäße Oligonukleotide auf einem Chip positionieren, erlauben die Dia gnostik mit Hilfe von Hybridisierungsreaktionen. Hierbei wird die Patientenprobe gegen einen Array mit erfindungsgemäßen Oligonukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen repräsentieren, getestet. Entsprechend gegenüber einem Vergleichsexperiment mit einer Probe eines gesunden Organ ismus abweichende Signale auf dem Array bei Oligonukleotiden lassen daher eine entsprechende Diagnose zu. Selbstverständlich können derartige Diagnosen auf Nukleinsäure-Ebene auch mit klassischen Blot-Verfahren (Northern- und/oder Southern-Blot) durchgeführt werden.
In ähnlicher Weise eignen sich auch Tests mit (erfindungsgemäßen) Antikörpern gegen die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, um eine veränderte Expression der erfindungsgemäß mit der Schmerzregulation zusammenhängenden Proteine oder Peptide in einem kranken, d.h. mit akuten, vorzugsweise chronischen Schmerzen belasteten Organismus, insbesondere einem humanen Patienten, gegenüber einem gesunden Vergleichsorganismus nachzuweisen. Hierzu stehen einem Fachmann entsprechende Testformate, bspw. Radioimmunoassays, ELISA-Tests usw. zur Verfügung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Gegenstands, bspw. eines Polynukleotids, einer Antisense-Nukleinsäure, eines Peptids oder Proteins, Vektors, Antikörpers, einer Zelle, Verbindung, und/oder eines Wirkstoffes, der an ein Peptid oder Protein ausgewählt aus der folgenden Gruppe:

– LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder
– einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder
– einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein, und/oder
– einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet, und/oder
– einem mindestens 10, vorzugsweise 15, insbesondere 20, Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide,

Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Behandlung des chronischen Schmerzes.
Bevorzugt ist auch eine Verwendung der besonders ausgewählten Form des Polynukleotids, der Antisense-Nukleinsäure, des Peptids oder Proteins, Vektors, Antikörpers, der Zelle, Verbindung, und/oder eines Wirkstoffes, der an ein Peptid oder Protein ausgewählt aus der folgenden Gruppe:

– LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptonantereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE; Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder
– einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, oder
– einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein

Eine weitere stark bevorzugte Verwendung zur Behandlung von Schmerz bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz betrifft die erste besonders ausgewählte Form der Verbindung und/oder einen Wirkstoff der an ein Peptid oder Protein ausgewählt aus der folgenden Gruppe:

– LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophi la-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonudease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder
– einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, oder
– einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein;

Eine weitere stark bevorzugte Verwendung zur Behandlung von Schmerz bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz betrifft die zweite besonders ausgewählte Form der Verbindung und/oder die besonders ausgewählte Form des Wirkstoffes.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids, Peptids oder Proteins, Vektors, Antikörpers und/oder Zelle für die Gentherapie bzw. die Verwendung zur Herstellung eines entsprechenden gentherapeutischen Mittels. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn es sich um In-vivo oder In-vitro Gentherapie handelt. Unter Gentherapie versteht man eine Therapieform, bei der durch die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen ein Effektorgen, meist ein Protein, exprimiert wird. Man unterscheidet prinzipiell In-vivo- und In-vitro-Verfahren. In In-vitro-Verfahren werden Zellen aus dem Organismus entfernt und ex-vivo mit Vektoren transfiziert, um anschließend wieder in denselben oder in einen anderen Organismus eingebracht zu werden. Bei der In-vivo-Gentherapie werden Vektoren, beispielsweise zur Bekämpfung von Tumoren, systemisch (z.B. über die Blutbahn) oder direkt in den Tumor appliziert.
Besonders bevorzugt ist diese Verwendung, wenn das durch das Herstellungsverfahren definierte Polynukleotid, insbesondere dessen besonders ausgewählte Form, die zweite besonders ausgewählte Form der Polynukleotids, verwendet wird.
Ebenfalls bevorzugt beim Einsatz in der Gentherapie ist die Verwendung der ersten besonders ausgewählten Form des Polynukleotids.
Bevorzugt beim Einsatz in der Gentherapie ist auch die Verwendung eines Antisense-Polynukleotids bzw. einer Antisense-Nukleinsäure, wie vorstehend definiert, das/die eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polynukleotid zu binden, oder das/die Teil eines Ribozyms oder DNA-Enzyms oder einer sonstigen katalytischen RNA oder DNA ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids, einer Antisense-Nukleinsäure, eines Peptids oder Proteins, eines Vektors, eines Antikörpers, einer Zelle, einer Verbindung und/oder eines Wirkstoffes für die Diagnostik und/oder für Wirksamkeitsuntersuchungen. Dabei versteht man unter Diagnostik die Analyse von einem Krankheitsbild zugeordneten Symptomen und unter Wirksamkeitsuntersuchungen Untersuchungen über die Wirksamkeit zu testender Substanzen, insbesondere ihrer medizinischen Wirksamkeit.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein anderes Screening-Verfahren, nämlich ein Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:

(a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit einer Zelle und/oder einer Präparation aus einer solchen Zelle, die ein Peptid oder Protein synthetisiert hat, für das ein durch das Herstellungsverfahren definiertes Polynukleotid vorzugsweise die zweite besonders ausgewählte Form des Polnukleotids, oder ein dazu zu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert,
(b) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von der Zelle synthetisierten Peptid oder Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Peptid oder Protein veränderten funktionellen Parameter.

Es ist bevorzugt, daß die Zelle vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert wird. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die gentechnische Manipulion die Mes sung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt. Ebenso besonders bevorzugt ist es, wenn die Zelle gentechnisch so manipuliert wird, daß die Zelle mindestens ein durch das Herstellungsverfahren definiertes Polynukleotid, vorzugsweise die zweite besonders bevorzugte Form des Polynukleotids, oder ein dazu zu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid enthält.
Es ist weiter eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens, wenn die Zelle nach der gentechnischen Manipulation und vor dem Schritt (a) unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, gegebenenfalls unter Selektionsdruck, kultiviert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Peptids oder Proteins, bei dem eine erfindungsgemäße Zelle, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält, kultiviert und gegebenfalls das Peptid oder Protein isoliert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Peptids oder Proteins ausgewählt aus einer der folgenden Gruppen:

– LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophi la-Gens "Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder
– einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder
– einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Peptid oder Protein
– und/oder einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet,
– einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide, und/oder
– einem Peptid oder Protein, für das ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid kodiert, dessen Nukleotidsequenz ein Genfragment gemäß einer der in den 1 – 18 dargestellten Sequenzenumfaßt, oder für das ein zu einem solchen Gen mindestens 90% ähnliches Polynukleotid kodiert,

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere Schmerzbehandlung, eines nichthumanen Säugetieres oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, benötigt, durch Verabreichung einer Substanz, die an ein Protein oder Peptid bindet, das ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:

– LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder
– einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert,
– einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Peptid oder Protein
- und/oder einem Protein, das durch eine Nukieinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet,
– einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide, und/oder
– einem Peptid oder Protein, für das ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid kodiert, dessen Nukleotidsequenz ein Genfragment gemäß einer der in den 1 – 18 dargestellten Sequenzenumfaßt, oder für das ein zu einem solchen Gen mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert.

Die Verabreichung kann beispielsweise in Form eines Arzneimittels, wie oben . beschrieben, erfolgen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere Schmerzbehandlung, eines nichthumanen Säugetieres oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, benötigt, durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, insbesondere solche enthaltend eine erfindungsgemäße Substanz und/oder einen erfindungsgemäßen Wirkstoff.
Insgesamt ist eine wichtige Grundlage der Erfindung die Identifizierung schmerzregulierter Gene und Genfragmente. Darauf basiert das Screeningverfahren. Aber auch die Verwendung zur Diagnose oder Therapie bietet sich, wie bereits ausgeführt, an. Im folgenden werden entsprechende Anwendungsmöglichkeiten und weitere Ausführungsbeispiele erläutert.
1. Therapie chronischer Schmerzen
Die Sequenzen wurden aus Rückenmarksgewebe isoliert. Im Rückenmark projizieren die primären sensorischen Neurone auf nachgeschaltete zentralnervöse Neurone, es handelt sich hierbei neben supraspinalen Vorgängen um die zentrale Umschaltstelle für nozizeptive Information. Zahlreiche Experimente konnten zeigen, daß der Entwicklung chronischer Schmerzzustände plastische Veränderungen des Nervensystems zugrundeliegen (als Überblick siehe Corderre et al., 1993; Zimmermann und Herdegen, 1996). Insbesondere in den Neuronen der dorsalen Wurzelganglien und des Rückenmarks sind plastische Veränderungen beschrieben worden, die mit der Regulation schmerzrelevanter Gene einhergeht. So ist für eine Reihe von Neurotransmitter-Rezeptoren, die für die Schmerztherapie von Bedeutung sind, eine Gen-Regulation im Rückenmark beschrieben worden (siehe Tabelle 1). Auf dieser Grundlage könnten die gefundenenen, unter Schmerz regulierten cDNA-Sequenzen zur Therapie (Gentherapie, Antisense, Ribozyme) und Diagnose chronischer Schmerzzustände verwendet werden.
1.1 Antisense-Strategien
Hierbei werden, abgeleitet von der Nukleinsäuresequenz der vollständigen cDNA oder von Teilbereichen, Konstrukte erstellt, die die mRNA oder Proteinkonzentration herabsetzen können. Dies können z.B. Antisense-Oligonukleotide (DNA oder RNA) sein, die eventuell unter Verwendung modifizierter Nukleotidbausteine (z.B. O-Allyl-Ribose) eine erhöhte Stabilität gegenüber Nukleasen aufweisen. Zudem ist die Verwendung von Ribozymen denkbar, die als enzymatisch aktive RNA-Moleküle eine spezifische Spaltung der RNA katalysieren. Daneben können auch Vektoren eingesetzt werden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen oder Teilbereiche dieser Nukleotidsequenzen unter Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimieren und somit für eine in-vivo oder ex-vivo Therapie geeignet sind. Zusätzlich sind auch Antisense-Konstrukte möglich, die unter Austausch bzw. Modifikation des Phosphatrückgrats von Nukleotidsequenzen (z.B. PNAs, d.h. Peptide Nucleic Acids) oder Verwendung von nichttraditionellen Basen wie Inosin, Queosin oder Wybutosin als auch von Acetyl-, Methyl-, Thio- und ähnlichen modifizierten Formen von Adenin, Cytidin, Guanosin u, Thymidin und Uridin nicht oder in geringerem Masse durch endogene Nukleasen abgebaut werden können.
1.2. Antagonisten/Agonisten bzw. Inhibitoren/Aktivatoren der von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen kodierten Genprodukte.
Dieser Gesichtspunkt umfaßt Substanzen, die durch eine Bindung an das Genprodukt dessen Funktion verändern. Dies können sein:

1.2.1. Organisch-chemische Moleküle, die im Rahmen eines Wirkstoffscreenings unter Verwendung der Genprodukte der erfindungsgemäßen cDNA als Bindungspartner gefunden werden.
1.2.2. Antikörper, seien es polyklonale, chimäre, single-chain, F_ab-Fragmente oder Fragmente aus Phagen-Banken, die bevorzugt als neutralisierende Antikörper über eine Bindung an die Genprodukte spezifisch die Funktion beeinflußen.
1.2.3. Aptamere, d.h. Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate mit Proteinbindenden Eigenschaften. Dazu gehören auch sog. Spiegelmere, die durch Spiegelevolution gewonnene spiegelbildliche und damit stabile Oligonukleotide darstellen, die hochaffin und hochspezifisch ein Zielmolekül binden können (Klußmann et al., 1996).

1.3. Gentherapie
Die beschriebenen Sequenzen können zur Therapie neurologischer Erkrankungen insbesondere chronischer Schmerzustände eingesetzt werden, indem sie nach Klonierung in geeignete Vektoren (z.B. Adenovirus-Vektoren oder adenoassozierter-Virus-Vektoren) zur in vivo oder ex-vivo Therapie verwendet werden, um dort z.B. einer Überexpression oder Unterexpression des endogenen Genproduktes entgegenzusteuern, die Sequenz des defekten Genproduktes zu korrigieren (z.B. durch Transsplicing mit dem exogenen Konstrukt) oder ein funktionelles Genprodukt zur Verfügung zu stellen.
2. Diagnose
Polynukleotidsequenzen (bspw. Oligonukleotide, Antisense -DNA & RNA-Moleküle, PNAs), die von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen abgeleitet sind, können zur Diagnose von Zuständen oder Erkrankungen eingesetzt werden, die mit einer Expression dieser Gensequenzen assoziiert sind. Beispiele dieser Zustände oder Erkrankungen beinhalten neurologische Erkrankungen inklusive chronischer Schmerzen oder neuropathischer Schmerzen (hervorgerufen z.B. durch Diabetes, Krebs oder AIDS) oder neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington, Jacob-Creutzfeld, amyotrophe Lateralsklerose und Demenzen. Die Nukleotidsequenzen können auf vielfältige Weise (Northernblot, Southernblot, FISH-Analyse, PRINS-Analyse, PCR, Microarrays) enweder zur Identifizierung der Genproduktes oder abweichender diagnostisch relevanter Genprodukte oder zur Quantifizierung des Genproduktes dienen. Neben der Nukleinsäurediagnostik können auch Antikörper oder Aptamere gegen das von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierte Protein zur Diagnostik eingesetzt werden (z. B. mittels ELISA, RIA, immuncytochemische oder immunhistochemische Verfahren), um das Protein oder abweichende Formen zu identifizieren und das Protein zu quantifizieren.
Im Hinblick auf eine Gendiagnostik könnten Nukleinsäure-Sonden, abgeleitet von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen zur Bestimmung des Gen-Lokus eingesetzt werden (z.B. durch FISH, FACS, artifizielle Chromosomen wie YACs, BACs oder P1-Konstrukte).
Die folgenden Beispiele und Figuren sollen die Erfindung erläutern, ohne sie darauf zu beschränken.
Figuren und Beispiele
Figuren:
1 Genfragment ab13-78-B (Verbindung zur „Protein Phosphatase, EFhands-1 "/Fig. 42).
2 Genfragment 18-15 (Verbindung zu „jerky"/56).
3 Genfragment N21-4 (Verbindung zur „rRNA intron-encoded homing endonuclease"/60).
4 Genfragment abN-22-5-B.
5 Genfragment ab50-51-B (Verbindung zum „Epithelialen Zellwachstum Inhibitor"/61).
6 Genfragment ab5 (Verbindung zum „CGI-69"/63).
7 zeigt die verlängerte Sequenz des Genfragments 6-2. Die Sequenz des Genfragments 6-2 wurde mit Hilfe von EST/cDNA-Sequenzen auf insgesamt 1140bp erweitert. Der 1. Teil der Sequenz (Pos. 1-625) entspricht dem EST BE110520 (Pos. 1-625). Der 2. Teil (Pos. 626-1140) entspricht dem EST BE107354 (Pos. 526-1). Die analysierte Sequenz des ursprünglichen Fragments 6-2 ist einfach unterstrichen. Mittels der RT-PCR-Methode wurde ein 850bp goßes Fragment aus Spinalganglien-cDNA der Ratte isoliert und in den Vektor pGEM-T (Fa. Clontech) in antisense-Richtung ligiert. Die Primer, die für die RT-PCR verwendet wurden, sind doppelt unterstrichen (5'-TGTGTAAARTAAAAGTGTTCGG-3', 5'-AACTATTCTTTATTATCCCAGCAA-3'). Die Antisense-RNA-Sonde kann durch in vitro Transkription vom T7-Promotor aus synthetisiert werden.
8 zeigt die verlängerte Sequenz des Genfragments 38-13. Die Sequenz des Genfragments 38-13 wurde mit Hilfe von EST/cDNA-Sequenzen auf insgesamt 950bp erweitert. Der 1. Teil (Pos. 1- 310) entspricht dem EST Aw142547 (Pos. 1-312). Der 2. Teil der Sequenz (Pos. 311-950) entspricht dem EST BG378585 (Pos. 640-1). Die analysierte Sequenz des ursprünglichen Fragments 38-13 ist einfach unterstrichen. Mittels der RT-PCR-Methode wurde ein 659bp goßes Fragment aus Spinalganglien-cDNA der Ratte isoliert und in den Vektor pGEM-T (Fa. Clontech) in reverser Richtung ligiert. Die Primer, die für die RT-PCR verwendet wurden, sind doppelt unterstrichen (5'– ATGTAGTGGTGAACGGCAGAC-3', 5'-AGTATCCATTTCTCAGTAAGGGGA-3'). Die as-RNA-Sonde kann vom Promotor T7 aus synthetisiert werden. Die Sequenz enthält ein Polyadenylierungssignal an Pos. 918 und einen Teil der angehängten Poly-A-Sequenz (beide Sequenzen sind kursiv dargestellt).
9 zeigt die verlängerte Sequenz des Genfragments 24-21. Die Sequenz des Genfragments 24-21 wurde mit Hilfe von EST/cDNA-Sequenzen auf insgesamt 1088bp erweitert. Der 1. Teil der Sequenz (Pos. 1-385) entspricht dem EST BI295776 (Pos. 716-334). Der 2. Teil (Pos. 386-1088) entspricht der cDNA-Sequenz BG667993 (Pos. 1-703). Die analysierte Sequenz des ursprünglichen Fragments 24-21 ist einfach unterstrichen. Mittels der RT-PCR-Methode wurde ein 675bp goßes Fragment aus Spinalganglien-cDNA der Ratte isoliert und in den Vektor pGEM-T (Fa. Clontech) in reverser Richtung ligiert. Die Primer, die für die RT-PCR verwendet wurden, sind doppelt unterstrichen (5'-AGTTCAGAGTCACCCTAAGCAC-3', 5'-CAGACTAAAGATGGGTGGGTAT-3') . Die Antisense-RNA-Sonde kann durch in vitro Transkription vom T7-Promotor aus synthetisiert werden.
10 zeigt die verlängerte Sequenz des Genfragments ab54-36-A. Die Sequenz des Genfragments ab54-36-A wurde mit Hilfe von EST/cDNA-Sequenzen auf insgesamt 674bp erweitert. Der 1. Teil der Sequenz (Pos. 1-666) entspricht dem EST AA849729 (Pos. 666-1). Der 2. Teil (Pos. 667-674) entspricht dem EST AI599426 (Pos. 8-1). Die analysierte Sequenz des ursprünglichen Fragments ab54-36-A ist einfach unterstrichen. Mittels der RT-PCR-Methode wurde ein 541 by goßes Fragment aus Spinalganglien-cDNA der Ratte isoliert und in den Vektor pGEM-T (Fa. Clontech) in sense-Richtung ligiert. Die Primer, die für die RT-PCR verwendet wurden, sind doppelt unterstrichen (5'-GCACTTTGGAGCACAGGTTC-3', 5'-AACAGCAAACAGAGCCAAGACT-3') . Die Antisense-RNA-Sonde kann durch in vitro Transkription vom Sp6-Promotor aus synthetisiert werden.
11 zeigt die verlängerte Sequenz des Genfragments ab40-41-B. Die Sequenz des Genfragments ab40-41-B wurde mit Hilfe von EST/cDNA-Sequenzen auf insgesamt 600bp erweitert. Der 1. Teil (Pos. 1-3) entspricht dem EST BF546896 (Pos. 429-397). Der 2. Teil der Sequenz (Pos. 4-600) entspricht dem EST AI412988 (Pos. 1-567). Des weiteren wurde der EST AW141812 identifiziert. Allerdings enthält der EST AI412988 205 bp, die nicht im EST AW141812 vorhanden sind. (Dieser Sequenzabschnitt ist kursiv dargestellt.) Daher wurden zwei RT-PCR-Ansätze mit Spinalganglien-cDNA durchgeführt. Einmal mit dem Primer ab4041 bfW (5'-CGCCGCCATCTGCTCCTA-3') und einem Primer (5'-TGCCGATGTTCAGAGATGGGTAG-3') , der in dem „205bp"-Bereich liegt und zum anderen mit dem Primer ab4041 bfw und einem Primer der außerhalb (5'-TCGTCATAGCCGCCAGCC-3') dieses Bereiches lokalisiert ist. Beide Ansätze ergaben PCR-Produkte entsprechend der dargestellten Sequenz. Die analysierte Sequenz des ursprünglichen Genfragments ist einfach unterstrichen. Die Primer, die für die RT-PCR verwendet wurden, sind doppelt unterstrichen. Das 562bp große RT-PCR-Fragment wurde in den Vektor pGEM-T (Fa. Promega) in sense-Richtung ligiert. Die Antisense-RNA-Sonde kann durch in vitro Transkription vom Sp6-Promotor aus synthetisiert werden.
12 Genfragment 22-19.
13 Genfragment 6-3.
14 Genfragment ab7.
15 Genfragment ab-N-23-6-B.
16 Genfragment ab3.
17 Genfragment ab07-72-B.
18 Genfragment 39-9.
19 LuzP:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
20 PEP-19:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
21 Phosphatidylinositol Synthase:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz (AV225403).
22 Valosin containing Protein (VCP):
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
23 Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-Beta:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
24 Aspartat-Aminotransferase:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
25 Neuronal Immediate Early Gene: Ratte; cDNA-Sequenz.
26 Heat Shock Protein 27 (HSP27):
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
27 Hsc 70 (Chaperon):
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz.
28 Calmodulin:
a) Ratte; cDNA-Sequenz,
b) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
c) Maus; cDNA-Sequenz,
d) Maus; Aminosäure-Sequenz.
29 Syntaxin Binding Protein 1:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
30 Spliceosomales Protein SAP155:
a) Ratte; cDNA-Sequenz,
b) Ratte; Aminosäure-Sequenz.
31 Neurodap 1:
a) Ratte; cDNA-Sequenz,
b) Ratte; Aminosäure-Sequenz.
32 Bamacan:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
33 Leukotrien A4 Hydrolase:
a) Ratte; cDNA-Sequenz,
b) Ratte; Aminosäure-Sequenz.
34 Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphate 5 kinase:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
35 Chondromodulin-1:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
36 26S Proteasome, UE p112:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz.
37 Proteasome, UE Z:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
38 Ingensin:
a) Ratte; cDNA-Sequenz,
b) Ratte; Aminosäure-Sequenz.
39 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A-Synthase:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz.
40 Phosphoglyceratkinase:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
41 RNA Polymerase II TF SIII p18 UE:
a) Ratte; cDNA-Sequenz,
b) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
c) Maus; cDNA-Sequenz,
d) Maus; Aminosäure-Sequenz.
42 Protein Phosphatase, EF hands-1:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz.
43 RAB21:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz.
44 TNF-receptor-associated factor 6-binding protein:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz.
45 Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti":
a) Maus; cDNA-Sequenz,
b) Maus; Aminosäure-Sequenz.
46 Protein mit 4 Transmembrandomänen, Member 3:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
47 VPS28; Vacuolar Protein Sorting Protein:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
48 HSKM-B:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
49 Calnexin-t:
a) Ratte; cDNA-Sequenz,
b) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
c) Maus; cDNA-Sequenz,
d) Maus; Aminosäure-Sequenz.
50 Sorting Nexin 3:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Maus; cDNA-Sequenz,
d) Maus; Aminosäure-Sequenz.
51 Glia-derived Nexin precursor PN-1:
a) human; Aminosäure-Sequenz,
b) Ratte; cDNA-Sequenz,
c) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
d) Maus; cDNA-Sequenz,
e) Maus; Aminosäure-Sequenz.
52 Microtubuli-assoziiertes Protein 4:
a) Maus; cDNA-Sequenz,
b) Maus; Aminosäure-Sequenz.
53 CDC10:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Maus; cDNA-Sequenz,
d) Maus; Aminosäure-Sequenz.
54 26S Proteasome, UE p44.5:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
55 Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Maus; cDNA-Sequenz,
d) Maus; Aminosäure-Sequenz.
56 jerky:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz.
57 Neurotransmitter assoziiertes Protein:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz.
58 TF SOX-10:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz,
c) Ratte; cDNA-Sequenz,
d) Ratte; Aminosäure-Sequenz,
e) Maus; cDNA-Sequenz,
f) Maus; Aminosäure-Sequenz.
59 SOUL Protein:
a) Maus; cDNA-Sequenz,
b) Maus; Aminosäure-Sequenz.
60 rRNA intron-encoded homing endonuclease:
a) Oryza sativa; cDNA-Sequenz,
b) Oryza sativa; Aminosäure-Sequenz.
61 Epithelialer Zellwachstum Inhibitor: human; Aminosäure-Sequenz.
62 Glutathiontransferase A4: human; cDNA-Sequenz.
63 CGI-69:
a) human; cDNA-Sequenz,
b) human; Aminosäure-Sequenz.
64 zeigt einen schematischen Überblick über die angewandte generelle Klonierungsstrategie.
65 ist ein Überblick über die identifizierten schmerzregulierten Gene bzw. Genfragmente. In der ersten Spalte ist die Zugehörgikeit des jeweiligen Klons zu einer der erfindungsgemäß definierten Gruppen (1 bis 8; vgl. nachstehende Ausführungen) angegeben. Die Spalten 2 bis 5 enthalten Angaben über das jeweilige RFDD-Fragment. In der zweiten Spalte ist die Nr. des Datenblatts angegenben, welches die Sequenz- und Expressionsdaten des jeweiligen Klons zusammenfasst. In der dritten Spalte ist angegeben, ob der Klon durch CFA hoch- (+) oder herrunterreguliert (–) wurde. In der vierten Spalte ist jedem Klon eine Arbeitsbezeichnung zugeordnet. In der fünften Spalte ist die Länge des Klons in Basenpaaren angegeben. Die Spalten 6 bis 10 enthalten Angaben über ggf. mit dem RFDD-Fragment homologe Sequenzen. In der sechsten Spalte sind Bezeichnungen der homologen Sequenzen angeführt. In der siebenten Spalte ist die Zugriffsnummer (AC-Nr.) der homologen Sequenz in GenBank bzw. Swiss-Prot angegeben. In der achten Spalte sind die Nukleotide bzw. Aminosäuren des identifizierten RFDD-Fragments in der homologen Sequenz angegeben. In der neunten Spalte ist die Größe (Länge) des homologen Bereichs angeführt. In der zehnten Spalte ist der Grad der Homologie (in %) des RFDD-Fragments mit der homologen Sequenz angegeben.
66 zeigt in tabellarischen Aufsttellungen die Ergebnisse von Microarray-Experimenten zur schmerzinduzierten Veränderung der Genexpression (66A-C) sowie eine Zusammenfassung der Resultate bezüglich der Henunter- bzw. Hochregulation erfindungsgemäßer schmerzrelevanter Gene (66D). Die Veränderung der Genexpression wurde mittels der Micoarray-Hybridisierung analysiert (A-C). Die Versuchsbedingungen, Material und Methoden sind im Zwischenbericht vom 31.07.2002 der Fa. Memorec beschrieben (s. Anhang). Es wurde das Tiermodelle Completet Freund Adjunvans (CFA) sowie zwei Modelle neurophatischen Schmerzes als Folge von Ligaturen nach Bennett (Ben) bzw. Chung (Ch) untersucht. Bei jedem Experiment ist in der ersten Spalte der Signalquotient behandelte Tiere/Kontrolltiere und in der zweiten Spalte der Variationskoeffizient (CV) der Vierfachspots (%) angegeben. Falls kein CV angegeben ist, war nur ein Spot lesbar. Bei reprimierten Genen wurde der Kehrwert des Originalquotienten mit –1 multipliziert. Damit ist +1-fach identisch zu –1-facher Regulation (entsprechend nicht differentieller Expression). Für die gleichen Gene wurde auch mit Hilfe der RFDD-Methode nach 6 Tagen CFA-Behandlung eine Regulation beobachtet (D). Die Behandlungsdauer ist in Tagen (d) bzw. Wochen (w) angegeben.
67 zeigt die zelluläre Lokalisation des Transkriptes des Gens PEP-19. Die in-situ-Hybridisierung mit einer genspezifischen antisense-RNA-Sonde (as) ist einmal im Dunkelfeld (obere Abbildung, A.) und einmal im Hellfeld (untere Abbildung, B.) dargestellt. Das Gen wird ausschließlich in Neuronen (N) exprimiert.
68 zeigt die zelluläre Lokalisation des Transkriptes des Gens Phosphatidylinositol Synthase (PPI). Die in-situ-Hybridisierung mit einer genspezifischen antisense-RNA-Sonde (as) ist einmal im Dunkelfeld (obere Abbildung, A.) und einmal im Hellfeld (untere Abbildung, B.) dargestellt. Das Gen wird ausschließlich in Neuronen (N) exprimiert.
69 zeigt die zelluläre Lokalisation des Transkriptes des Gens Interleukin 6 signal transducer (IL-6R-Beta). Die in-situ-Hybridisierung mit einer genspezifischen antisense-RNA-Sonde (as) ist einmal im Dunkelfeld (obere Abbildung, A.) und einmal im Hellfeld (untere Abbildung, B.) dargestellt. Das Gen wird in Neuronen (N) und in nicht-neuronalen Zellen exprimiert.
70 zeigt die zelluläre Lokalisation des Transkriptes des Gens Valosin Containing Protein (VCP). Die in-situ-Hybridisierung mit einer genspezifischen antisense-RNA-Sonde (as) ist einmal im Dunkelfeld (obere Abbildung, A.) und einmal im Hellfeld (untere Abbildung, B.) dargestellt. Das Gen wird ausschließlich in Neuronen (N) exprimiert.
71 zeigt die zelluläre Lokalisation des Transkriptes des Gens LUZP. Die in-situ-Hybridisierung mit einer genspezifischen antisense-RNA-Sonden (as) ist einmal im Dunkelfeld (obere Abbildung, A.) und einmal im Hellfeld (untere Abbildung, B.) dargestellt. Das Gen wird ausschließlich in Neuronen (N) exprimiert.
Beispiele:
Beispiel 1
Identifizierung, Isolierung und Sequenzierung schmerzregulierter Gene
1.) Vorgehen
Es wurde folgendes Vorgehen gewählt (zur Erläuterung s. 64):
Als Ausgangspunkt für die Isolierung schmerzregulierter Gene wurde das sogenannte CFA-Arthritis-Modell an der Ratte gewählt (vgl. D. Dubuisson, S.G. Dennis, Pain 4, 161 – 174 (1977)), bei dem CFA (engt. „complete Freud's adjuvans", komplettes Freudsches Adjuvanz) jeweils an 6 aufeinanderfolgenden Tagen in die recht und linke Rattenpfote injiziert wird. Das Zielgewebe, in dem die schmerzregulierte Expression der erfindungsgemäßen Gene nachgewiesen wurde, waren Spinalganglien im Lendenbereich (Segmente L2, L4 und L5). Zur Isolierung differentiell regulierter Gene stehen vier Methoden zur Verfügung:

– cDNA-RDA (cDNA-representational difference analysis; Hubank & Schatz, 1994)
– DDRT-PCR (Differential Display RT-PCR; Liang & Pardee 1992, Bauer et al., 1994),
– RFDD-PCR (Restriction Fragment Differential Display PCR; vgl. Habu, Fukuda-Tanaka et al. 1997)
– Subtraktive Hybridisierung (Watson & Margulies, 1993)
– SAGE (Serial Analysis of Gene expression, Velculescu et al., 1995).

Eine vergleichende Bewertung der genannten Methoden führte zur Auswahl der RFDD-PCR, da diese Methode im Gegensatz zur subtraktiven Hybridisierung und der SAGE in der Lage ist, sowohl hoch- und herunterregulierte Gene als auch seltene Transkripte zu erfassen und darüberhinaus innerhalb kurzer Zeitspannen eine Fülle von Ergebnissen liefert. Gegenüber der unter den vorstehend genannten Gesichtspunkten ähnlich effizienten DDRT-PCR bietet die RFDD-PCR bspw. den Vorteil, dass hierbei ausschließlich codierende Bereiche amplifiziert werden, während die DDRT-PCR, bei der OligodT-Rückwärtsprimer verwendet werden, oft wenig interessante Amplifikate mit 3'-nichttranslatierter Sequenzinformation liefert. Des weiteren werden bei der RFDD-PCR hochspezifische Primer verwendet, welche die Einhaltung hochstringenter PCR-Bedingungen erlaubt, was zur Erzeugung sehr gut auflösbarer und isolierbarer PCR-Fragmente führt.
2.) MATERIAL UND METHODEN
Isolierung und Charakterisierung schmerzregulierter cDNA-Sequenzen
Methode: RFDD Kit displayPROFILE^® von Qbiogen [korrekt?] und nachfolgender Auftrennung der Fragmente mittels TAE-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Tiermodell: Es wurden an 6 aufeinanderfolgenden Tagen 100 μl CFA-Lösung (1 mg/ml) bilateral in die Hinterpfoten adulter Spargue Dawley Ratten injiziert und die Tiere 6 Tage nach der ersten Injektion zur Gewebeentnahme getötet. Parallel wurden bei den Kontrolltieren isotonische Kochsalzlösung in beide Hinterpfoten injiziert.
Gewebeentnahme: Die Tiere wurden dekapitiert und das Rückenmark durch Präparation entfernt. Danach wurden die Spinalganglien des Bereiches L2, L4 und L5 herauspräpariert und sofort in Reaktionsgefäße überführt, die in Trockeneis gekühlt wurden. Anschließend wurden die Ganglien bis zur RNA-Extraktion bei –80°C gelagert.
RNA-Isolierung: Aus den Gewebeproben wurde die Gesamt-RNA mit dem Trizol-Kit (Fa. Invitrogen) nach Angaben des Herstellers isoliert. Die RNA wurde UV-spektrometrisch quantifiziert (Extinktion bei 260 nm) und durch Gelelektrophorese in einem Agarosegel (Sambrook et al., 1989) auf ihre Integrität überprüft.
DNasel-Behandlung: Vor Einsatz in die DDRT-PCR wurden eventuelle Spuren an genomischer DNA durch DNasel-Behandlung entfernt. Hierbei wurden 25 μl RNA-Lösung (ca. 20 μg) in einem Gesamtvolumen von 100 μl in 1 × Transkriptionspuffer (Fa. Boehringer-Mannheim) und 20 U RNAse-freie DNAse I (Fa. Boehringer-Mannheim) für 30 min bei 37°C inkubiert. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion wurde die RNA durch Zugabe an 1110 Vol. Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Vol. Ethanol präzipitiert, in DEPC-Wasser gelöst, UV-spektrometrisch quantifiziert und durch erneute Agarose-Gelelektrophorese charakterisiert.
Reverse Transkription: Je 2,5 μg mit DNAse I behandelte Gesamt-RNA wurden mit oligo-dT-Primer durch Inkubation für 5 min bei 70°C denaturiert, auf Eis abgeschreckt und dann in einem Gesamtvolumen von 10 μl Reaktionsgemisch für 60 min bei 37°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch enthielt 1 × Transkriptionspuffer (Fa. Boehringer-Mannheim), 20 mM DTT, je 1 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Fa. Boehringer-Mannheim), 40 U RNAseInhibitor (Fa. MBI) und 200 U Superscript II RnaseH– Reverse Transkriptase (Fa. Invitrogen). Anschließend wurde das Enzym durch Erhitzen bei 99°C für 5 min inaktiviert und der cDNA-Ansatz bei –20°C gelagert.
RFDD-PCR: Es wurde eine modifizierte Methode der DD-RT-PCR, die sogenannte Restriction Fragment Differential Display (RFDD-PCR) Technik, verwendet. (Habu, Fukada-Tanaka et al. 1997). Das gebrauchsfertige Reaktionssystem wurde von der Fa. Qbiogen bezogen.
Die cDNA-Synthese und RFDD-PCR wurde nach den Angaben des Herstellers durch geführt. Für die PCR-Reaktion wurde [³³P]-dATP (3000 Cilmmol) verwendet. Die Auftrennung der radioaktiv markierten PCR-Fragmente erfolgte in einem denaturierenden 6% Polyacrylamid-Gel und wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht (Sambrook et al., 1989). Differentiell regulierte PCR-Banden wurden mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und durch 10 minütiges Kochen in 100 ml bidest. Wasser aus dem Gelstück eluiert. Das Eluat wurde mit S-200 HR Säulen der Fa. Amersham aufgereinigt. Für die Reamplifikation wurden 5 μl des aufgereinigten Eluats eingesetzt. Die Reamplifikation erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
Klonierung in TA-Klonierungsvektor: PCR-Fragmente wurden in den pGEM-T Vektor mittels dem pGEM-T Kit (Fa. Promega) nach Angaben des Herstellers ligiert und in XL-blue-E. coli -Zellen transformiert. Der Transformationsansatz wurde auf LB-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin, X-Gal (1 mM) und Isopropylthiogalactosid (40 μg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die weißen Bakterien-Klone wurden mit Hilfe der PCR Methode hinsichtlich der Größe des Plasmid-Inserts überprüft. Hierfür wurde ein Teil der Bakterien-Kolonien in ein Reaktionsgefäß mit 20 μl Wasser überführt und für 10 min gekocht. Anschließend wurden 5 μl dieser Suspension für einen 25 μl PCR-Ansatz verwendet. Für die PCR wurde die AmpliTAQ-DNA-Polymerase der Fa. Perkin-Elmer und die Primer T7 und Sp6 verwendet. Das Reaktionsgemisch wurde nach Angaben des Herstellers zusammengesetzt. Für die Amplifikation der Plasmid-Inserts wurde folgendes PCR-Temperaturprofil verwendet: 10 min bei 95°C; 25 Zyklen mit 45 s bei 94°C, 45 s bei 54°C, x min bei 72°C (die Elongationszeit x wurde der Länge des amplifizierten Fragmentes angepasst: 1 min/1000 Nukleotide); 6 min bei 72 °C. Anschließend wurde die Größe der PCR-Produkte durch Gelelektrophorese ermittelt. Bakterien-Klone, die ein Plasmid-Insert mit der erwarteten Größe enthielten, wurden in 5 ml LB-Flüssigmedium mit 100 μg/ml Amplicillin überführt und über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Aus diesen Kulturen wurde Plasmid-DNA unter Verwendung des Qiagen-Spin-Miniprep-Kits (Fa. Qiagen) nach Angaben des Herstellers isoliert.
Sequenzanalyse: Die Sequenzierung wurde von der Fa. SeqLab in Göttingen nach der DYE Terminator Cycle Sequencing Methode durchgeführt. Die DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung der bioSCOUT-Software (Fa. LION, Heidelberg) mit den Datenbanken abgeglichen.
3.1 Ergebnisse
Unter Anwendung dieser Methode (s. 64) wurden 63 schmerzregulierte cDNA-Klone (siehe die tabellarische Zusammenfassung der Daten in 65) zunächst als Partialsequenz, im weiteren Verlauf des Arbeitsprozesses zum Teil als verlängerte Sequenz kloniert.
Ausgehend vom ausgewählten Tiermodell wurden mit der angewandten Klonierungsstrategie cDNA-Sequenzen aus der Ratte kloniert.
Die als schmerzreguliert aufgrund der Auslösung einer CFA-Arthritis nachgewiesenen cDNA-Sequenzen bzw. Genfragmente aus Spinalganglien von Ratten können gemäß nachfolgenden Kriterein in 8 Gruppen eingeteilt werden:

1. RFDD-Fragmente mit einer Sequenzübereinstimmung von mindestens 97% zu einem bekannten Gen der Ratte.
2. RFDD-Fragmente mit einer Sequenzübereinstimmung von mindestens 98% zu einem oder mehreren cDNA-Klonen der Ratte und einer signifikanten Homologie zu einem bekannten Gen der Maus oder des Menschen.
3. RFDD-Fragmente mit einer signifikanten Homologie zu einem bekannten Gen der Maus oder des Menschen, aber ohne deutliche Sequenzübereinstimmung zu einem bekannten Gen, einem cDNA-Klon oder genomischer DNA der Ratte.
4. RFDD-Fragmente mit einer Sequenzübereinstimmung von mindestens 96% zu einem cDNA- oder genomischen Klon der Ratte, aber ohne signifikante Homologie zu einem bekannten Gen.
5. RFDD-Fragmente mit einer Sequenzübereinstimmung von mindestens 82% zu einem cDNA- oder genomischen Klon der Ratte, aber ohne signifikante Homologie zu einem bekannten Gen.
6. RFDD-Fragmente, bei denen mindestens zwei Drittel der identifizierten Sequenz eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 90% mit einem cDNA-Klon der Ratte aufweist.
7. RFDD-Fragmente, die eine signifikante Homologie zu mehreren Genen aufweisen.
8. RFDD-Fragmente, die keine signifikante Homologie zu einem Gen, einem cDNA- oder genomischen Klon aufweisen.

Die Zugehörgigkeit der erfindungsgemäß identifizierten cDNA-Klone zu den obigen Gruppen ist in der Tabelle gemäß 65 angegeben.
Besonders interessant sind die Genfragmente der vorstehenden Gruppe 8. Darunter fallen die Genfragmente ab-N-23-6-B (15) und ab3 (16).
Die in der 15 gezeigte Sequenz des Genfragments ab-N-23-6-B hat in der Analyse ergeben, das hier ein neues Gen vorliegt, das keine signifikante Homologie zu Datenbanksequenzen zeigt. Es wurde lediglich in einem EST-Klon der Maus (AC-Nr. BB190235) ein nur 18 Basenpaare umfassender Bereich mit 100%iger Homologie identifiziert. Es handelt sich bei diesem Genfragment somit um einen Teil eines bisher unbekannten Gens.
Das weitere unter der Gruppe 8 (bisher unbekannte Gene) eingeordnete Genfragment ab3 (16) zeigt auf Aminosäureebene zu ASTH1J (aus Mensch oder Maus) eine geringe Homologie von 52% und zu dem HIV-Protein TAT (HIVgroup0) eine geringe Homologie von 36%.
Beispiel 2a)
In-situ-Hybridisierung verschiedener aufgefundener Genfragmente oder bekannter Gene.
Ratten werden verschiedenen Schmerzmodellen unterworfen, einige Zeit nach Auslösung des Schmerzes Rückenmarks- und Spinalganglienschnitte gewonnen und durch in-situ-Hybridisierung mit DNA-Sonden oder mit spezifischen Antikörpern die Expression des jeweiligen Gens oder Genfragments untersucht und mit Kontrolltieren verglichen.
Als Modelle können CFA induzierte Arthritis (CFA), Collagen induzierte Arthritis (CIA) und der Formalin-Test (Formalin) (vgl. D. Dubuisson, S.G. Dennis, Pain 4, 161 – 174 (1977)) verwendet werden.
Beispiel 2b)
Expressionsniveau-Bestimmung über RT-PCR verschiedener bekannter Gene nach verschiedenen Schmerzmodellen.
Der Umfang der Expression nach verschiedenen Schmwerzmodellen im Vergleich zu Kontrollen in Ratten wird durch RT-PCR (s.o.) untersucht.
Beispiel 2c)
Klonierung der vollständigen humanen bzw. Ratten-Sequenzen, bzw. des entsprechenden vollständigen Gens zu den in Beispiel 1 gefundenen Genfragmenten gem. Abildungen 1-18
1.) Klonierung der full-length-Ratten-cDNA-Sequenzen
Die Klonierung der vollständigen Ratten-cDNA-Sequenzen erfolgt entweder mittels Durchscreenen von cDNA-Banken oder PCR-vermittelten Methoden.
a) Durchscreenen
Die cDNA-Banken werden mit RNA eines Gewebes erstellt, das die mRNA des gesuchten Genes exprimiert. Als Sonden finden einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA-Moleküle Verwendung, die entweder radioaktiv (z.B. mit [α³²P]dCTP) oder nicht radioaktiv markiert sind (z.B. mit Digoxigenin markiertes UTP). Die in Bakterien oder Phagen vorhandene cDNA-Bank wird auf Agar-Platten aufgebracht, nach Übertragen auf geeigneten Filtermembranen mit den Nukleinsäuresonden hybridisiert und nach stringenter Waschprozedur detektiert. Die durch diese Verfahren identifizierten cDNA-Klone werden weiter vereinzelt und durch Sequenzierung analysiert (siehe hierzu Sambrooks et al., 1989; Ausubel et al., 1990).
b) PCR-vermittelte Methode
Bei den PCR-vermittelten Methoden werden ausgehend von den regulierten cDNA-Sequenzen Oligonukleotid-Primer in sense oder antisense- Orienterung ermittelt und synthetisiert. Bei dem herkömmlichen 5'-RACE Verfahren (Rapid amplification of 5'-cDNA Ends) wird der antisense-orientierte Primer zur cDNA-Synthese verwendet, danach die entstandene einzelsträngige cDNA durch Ligation eines Oligonukleotides mit RNA-Ligase oder Tailing-Reaktion mit terminaler Transferase verlängert und dann einer PCR-Reaktion mit einem weiter innen gelegenen (sog. nested) Primer und einem Tail-spezifischen Primer unterzogen. Die PCR-Amplifikate werden kloniert und durch Sequenzierung analysiert. Eine Abwandlung dieser Methode nutzt den Effekt der sogenannten Supression-PCR, um ausgehend von einem cDNA-Template sowohl in 5' als auch in 3'-Richtung die cDNA-Sequenz zu verlängern (Marathon cDNA Amplification Kit, Fa. Clontech). Hierbei wird eine doppelsträngige cDNA ausgehend von RNA aus Ratten-Rückenmark erstellt, und mit speziell modifizierten Linkern ligiert. Diese cDNA wird dann mit einem Gen-spezifischen Primer und einem Linker-spezifischen Primer mittels PCR amplifiziert, die Amplifikationsprodukte kloniert und sequenziert.
2.) Klonierung der homologen humanen cDNA-Sequenzen
Die homologen humanen cDNA-Sequenzen werden durch Modifikation der oben erwähnten Methoden isoliert. Beim herkömmlichen Screenen von cDNA-Banken werden Banken humanen Ursprungs verwendet und die Hybridisierung unter weniger Standardbedingungen durchgeführt, um auch cDNA-Klone geringerer Homologie zu erfassen.
Bei den PCR-vermittelten Strategien versucht man zunächst mit einer Vielzahl verschiedener Primer, die bevorzugt aus der kodierenden Region stammen, eine humane cDNA zu amplifizieren. Gelingt dies nicht, so kann man degenerierte PCR-Primer verwenden oder man wählt weniger stringente PCR-Bedingungen.
Beispiel 3
Verifizierung der schmerzinduzierten Veränderung der Genexpression mit Hilfe der Microarray-Analyse
Mittels der Hybridisierung von Microarrays wurden die Veränderung der Genexpression in Spinalganglien aus verschiedenen Ratten-Schmerzmodellen untersucht (Microarray-Analyse). Die Untersuchungen wurden mittels PIQOR^® cDNA Array-Hybridisierungen der Fa. Memorec (Köln, Deutschland) nach deren Protokollen und Materialien durchgeführt. Im Rahmen dieser Analyse wurde die Expression von Genen analysiert, die mit Hilfe der RFDD-Methode als schmerzregulierte Gene isoliert wurden. Die untersuchten Gene sind im Folgenden aufgelistet, wobei die Bezeichnung des ursprünglich isolierten Genfragmentes in der Klammer angegeben ist: Bamacan (ab-11-76-B), Calmodulin (ab-22-23-C), Aspartataminotransferase (07-3), SH3-Domäne Protein 5 (24-21), Ratten Ortholog eines uncharakterisierten humanen Gens mit der Zugriffsnummer BC015480 (38-13), Ratten Ortholog eines Gens der Maus mit der Zugriffsnummer NM_019998 (ab40-41-B), Ratten Ortholog des Gens 1110033009 der Maus (ab-54-36-A ), Transmembrane 4 Superfamily, Member3 (ab-54-55-B), HSKM-B (ab34-16-A), Neurodap1 (ab-24-89-B), Vacuolar Sorting Protein (VPS28; ab18-83), 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A Synthase (44-15), Heat Shock Protein 70 (HSP70.1; abN45-46-B), Microtubuli-assoziiertes Protein 4 (MAP4; 25-25), RAS-realated protein 21 (RAB21; ab-21-51-B), Splicesomales Protein 155 (SAP155; 19-16).
Für die Microarray-Analyse wurde das CFA-Modell mit einer Behandlungsdauer von 2 Tagen und 1 bzw. 3 Wochen verwendet, während beim ursprünglichen RFDD-Experiment die Dauer der Behandlung 6 Tage umfasste. Mit Ausnahme der Gene HSKM-B und Neurodap1 wurden die Ergebnisse des RFDD- Experiments durch die Microarray-Analyse, die nach einer Woche CFA-Behandlung erfolgte, bestätigt (vgl. 66A und 66D), d.h. in beiden Ansätzen war eine Hoch- bzw. Herunterregulation dieser Gene zu beobachten. Die Gene HSKM-B und Neurodap1 zeigten im RFDD-Experiment nach 6 Tagen CFA-Behandlung jeweils eine Hochregulation, während die Microarray-Hybridisierung nach einer Behandlungsdauer von einer Woche eine Herunterregulation zeigte. Allerdings war bei der Micoraray-Analyse nach einer zweitägigen CFA-Behandlung ebenfalls eine Hochregulation dieser Gene zu beobachten, so dass möglicherweise erst eine längere Behandlungsdauer die Herunterregulation bewirkt. Die Ergebnisse der Microarray-Analyse zur differenziellen Expression erfindungsgemäß schmerzrelevanter Gene sind in 66A-C zusammengefasst. 66D zeigt in einer zusammenfassenden Darstellung die Ergebnisse hinsichtlich Herrunter- bzw. Hochregulation der erfindungsgemäß schmerzrelevanten Gene.
Beispiel 4
Zelluläre Lokalisation der Transkripte von identifizierten schmerzregulierten Genen in Spinalganglien
Die Transkripte der Gene PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase (PPI), Interleukin 6 signal transducer (IL-6R-Beta), Valosin Containing Protein (VCP) und LuzP wurden in Gewebedünnschnitte von L2-Spinalganlien der Ratte detektiert. Hierfür wurde die in-situ-Hybridisierung wie beschrieben angewandt (Schafer, Varoqui et al. 2002). Als Matrize für die RNA-Sonde wurde für PEP-19 das ca. 400 by große Genfragment 54-22 verwendet. Die Matrizen für PPI (AB022890; Position 616-1056, 5'-AATTTCTCCGAGGGACCACT-3', 5'-CAGTCTTCAGACAGGCCTCC-3'), IL-6R-Beta (M92340; Position 216-1478, 5' -AGGTGTACTCCGTGAATGCC-3', 5'-TCACAGTGCCATCTTCTTGC-3'), VCP (U11760; Position 904-1825, 5'-AGCTGCCACTGAGACATCCT-3', 5'-GCCAGTAAGGTTTTCCCACA-3') und LuzP (AF181259; Position 2505-2848, 5'-GGCTGAGATCGAGGTGCTAC-3', 5'-GCTCAGTCTTTTCCAGTCGG-3') wurden mittels der RT-PCR Methode hergestellt (s. o.).
Für alle fünf Gene wurden Transkripte in Spinalganglien nachgewiesen. Es zeigte sich, dass die Gene Pep-19 (67), PPI (68), VCP (70) und LuzP ( 71) ausschließlich in Neuronen exprimiert werden, während die IL-6R-Beta-mRNA auch in nicht-neuronalen Zellen detektiert wurde (69).
Beispiel 5:
Beispiel für ein Arzneimittel enthaltend einen erfindungsgemäßen Wirkstoff – Tablettenformulierung
Tabletten können durch direktes Verpressen von Mischungen des erfindungsgemäßen Wirkstoffes mit entprechenden Hilfsstoffen oder durch Verpressen von wirkstoffhaltigen Granulaten (mit gegebenenfalls weiteren Hilfsstoffen) hergestellt werden. Die Granulate können dabei entweder durch Feuchtgranulation mit z.B. wäßrigen Granulierflüssigkeiten und anschließender Trocknung dieser Granulate oder durch Trockengranulation z.B. über Kompaktierung hergestellt werden.
Direktverpressung
Homogene Mischung des Wirkstoffes mit den Hilfsstoffen herstellen und diese auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem ⌀ von 10 mm verpressen.
Trockengranulation
Homogene Mischung des Wirkstoffes mit der Mikrokristallinen Cellulose und der I-HPC herstellen und diese Kopaktieren. Nach dem Sieben der Komprimate wird das entstandene Granulat mit Magnesiumstearat und Siliziumdioxid gemischt und auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem ⌀ von 9 mm verpreßt.
Feuchtgranulation
Homogene Mischung des Wirkstoffes mit der Mikrokristallinen Cellulose und dem Crospovidon herstellen und diese in einem Granulator mit einer wäßrigen Lösung des Povidons granulieren. Das feuchte Granulat wird anschließend nachgranuliert und nach der Trocknung im Trockenschrank (50°C) 10 h getrocknet. Das trockene Granulat wird mit dem Magnesi umstearat zusammen gesiebt, endgemischt und auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem ⌀ von 8 mm verpreßt.
Beispiel 5
Beispiel für ein Arzneimittel enthaltend einen erfindungsgemäßen Wirkstoff – parenterale Lösung
1 g eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes wird in 1 l Wasser für Injektionszwecke bei Raumtemperatur gelöst und anschließend durch Zugabe von NaCl (Natriumchlorid) auf isotone Bedingungen eingestellt.
Literatur

Akopian AN, Sivilotti L & Wood JN (1995) Nature 379: 257-262
Ausubel FM, Brent R, Kingdton RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA & Struhl K eds. (1190) Current protocols in molecular biology. John Wiley &Sons, Inc. New York, NY.
Baba N, Doubell TP, Woolf CJ 1999: Peripheral inflammation facilitates Aβ fibermediated synaptic input to the substantia gelatinosa of the adult rat spinal cord. J Neurosci 19: 859-867
Bauer D, Müller N, Reich J, Riedel N, Ahrenkiel V, Warthoe P & Strauss M (1993): Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique (DDRT-PCR) Nucl Acids Res 21: 4272-4280.
Bonini A, Anderson SM, Steiner DF (1997) Molecular cloning and tissue expression of a novel orphan G Protein-coupled receptor from rat lung. Biochem Biophys Res Comm 234: 190-193.
Chih-Cheng et al., (1995): A P2X prinoceptor expressed by a subset of sensory neurons. Nature 377: 428-432
Corderre TJ, Katz J, Vaccarino AL, Melzack R (1993): Contribution of central plas ticity to pathological pain: review of clinical and experimental evidence. Pain 52: 259-285.
Dickenson (1995) Novel pharmacological targets in the treatment of pain. Pain Rev., 2, 1-12.
Dubuisson et al., 1997 Pain, 4:161-174.
Feng Y & Gregor P (1997) Cloning of a novel member of the G Protein-coupled receptor family related to peptide receptors. Biochem Biophys Res Comm 231: 651-654.
Furukawa T, Yang Y, Nakamoto B, Stamatoyannopoulos G, Papayannopoulou T (1996): Identification of new genes expressed in a human erythroleukemia cell line. Bloods Cell Mol & Dis 22:11-22.
Gunasekar PG, Kanthasamy, AG, Borowitz JL, Isom GE 1995: NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J Neurochem 65: 2016-2021.
Habu, Y., S. Fukada-Tanaka, et al. (1997). "Amplified restriction fragment length polymorphism-based mRNA fingerprinting using a single restriction enzyme that recognizes a 4-bp sequence." Biochem Biophys Res Commun 234(2): 16-21.
Hawes BE, Fried S, Yao X, Weig B, Graziano MP 1998: Nociceptin (ORL1) and μ-Opioid receptors mediate mitogen-activated protein kinase activation in CHO cells through a Gi-coupled signaling pathway: evidence for distinct mechanisms of agonist-mediated desensitization. J Neurochem 71: 1024-1033.
Hubank M & Schatz DG (1994): Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA. Nucl Acids Res 22: 5640-5648.
Klußmann S et al., 1996: Nature Biotechnology 14: 1112-1115.
Li L-Y & Chang K-J 1996: The stimulatory effect of opioids on mitogen-activated protein kinase in Chinese hamster ovan cells transfected to express μ-opioid receptors. Mol Pharm 50:599-602.
Liang P & Pardee AB 1992: Differential Display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257:967-971.
Methner A, Henney G, Schinke B, Hennanns-Borgmeyer I (1997): A novel G Protein-coupled receptor with homology to neuropeptide and chemoattractant receptors expressed during bone development. Biochem Biophys Res Comm 233: 336-342.
Mohit AA, Martin JH & Miller CA 1995: p493F12 Kinase: a novel MAP kinase expressed in a subset of neurons in the human nervous system. Neuron 14: 67-78.
Poirier GM-C, Pyati J, Wan JS, Erlander MG 1997: Screening differentially expressed cDNA clones obtained by differential display using amplified RNA. Nucleic Acids Research 25: 913-914.
Sambrook J, Fritsch EF & Maniatis T 1989: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
Sompayrac L, Jane S, Burn TC, Tenen DG & Danna KJ 1995: Overcoming limitations of the mRNA differential display technique. Nucleic Acids Research 23: 4738739.
Schafer, M. K., N. Varoqui, et al. (2002). "Molecular cloning and functional identification of mouse vesicular glutamate transporter 3 and its expression in subsets of novel excitatory neurons." J Biol Chem 277(52): 50734-48.
Tal M 1996: A novel antioxidant alleviates heat hyperalgesia in rats with an experimental painful neuropathy. Neurreport 7: 1382-1384.
Tölle TR (1997): Chronischer Schmerz. In: Klinische Neurobiologie, Herdergen T, Tölle TR, Bähr M (Hrsg.): S. 307-336; Spektrum Verlag, Heidelberg.
U.S.Patent 5.262.311
Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW (1995): Serial analysis of gene expression. Science 270: 484-487.
Wan JS, Sharp JS et al. (1996): Cloning differentially expressed mRNAs Nature Biotech 14:1685-1691.
Watson JB & Margulies JE (1993) Differential cDNA screening strategies to identify novel stage-specific proteins in the developing mammalian brain. Dev Neurosci 15: 77-86.
Wilks AF (1989) Two putative protein-tyrosine kinases identified by application of the polymerase chain reaction. Poc Natl Acad Sci USA 86: 1603-1607.
Woolf CJ, Shortland P, Coggeshall RE 1992: Peripheral nerve injury triggers central sprouting of myelinated afterents. Nature 355:75-78.
Zimmermann, M & Herdegen, T (1996): Plasticity of the nervous system at the systemic, cellular and molecular levels: a mechanism of chronic pain and hyperalgesia. Progr Brain Res 110: 233-259

Claims

Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten: (a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit einer Zelle und/oder einer Präparation aus einer solchen Zelle, die mindestens ein Peptid oder Protein synthetisiert hat, das ausgewählt ist aus folgender Gruppe: – LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder – einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder – einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Peptid oder Protein, und/oder – einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet, und/oder – einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide, und/oder – einem Peptid oder Protein, für das ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid kodiert, dessen Nukleotidsequenz ein Genfragment gemäß einer der in den 1 bis 18 dargestellten Sequenzen umfaßt, oder für das ein zu einem solchen Gen mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, (b) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem/die von der Zelle synthetisierten Peptid(e) oder Proteine) oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das/die Peptid(e) oder Proteine) veränderten funktionellen Parameters.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines G-Proteins exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle gentechnisch so manipuliert wird, daß die Zelle mindestens ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid oder ein Polynukleotid aus der kodierenden Sequenz eines Genes, das ein Genfragment gemäß einer der in den 1-18 dargestellten Sequenzen umfaßt, oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid enthält.
Verfahren gemäß Ansprach 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid in einem rekombinanten DNA-Konstrukt enthalten ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle nach der gentechnischen Manipulation gemäß Anspruch 2 und vor dem Schritt (a) gemäß Anspruch 1 unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, gegebenenfalls unter Selektionsdruck.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden des Peptids/der Peptide oder des Proteins/der Proteine gemäß Anspruch 1 und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsubstanz erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter über Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen erfolgt, ins besondere über Messung der Veränderung der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, über Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2^nd messenger.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß das/die Peptide) oder Proteine) in den Schritten (a) und (b) aus folgenden Gruppen ausgewählt ist/sind: – LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10; 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder – ein Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder – ein Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein, und/oder – einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet, und/oder – einem mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 – 10, dadurch gekennzeichnet, daß für das/die Peptid(e) oder Proteine) in den Schritten (a) und (b) ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid, das ein Genfragment gemäß einer der in den 7-16 dargestellten Sequenzen umfaßt, kodiert, oder ein zu dem Gen zu mindestens 90%, insbesondere 95 %, vorzugsweise 97%, ähnliches Polynukleotid.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 – 10, dadurch gekennzeichnet, daß für das/die Peptid(e) oder Proteine) in den Schritten (a) und (b) ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid, das ein Genfragment gemäß einer der in den 1 – 4, 17 oder 18 dargestellten Sequenzen umfaßt, kodiert, oder ein zu dem Gen zu mindestens 90%, insbesondere 95%, vorzugsweise 97%, ähnliches Polynukleotid.
Polynukleotid, welches einer der in einer der 1-18 dargestellten Nukleotidsequenzen oder einem Polynukleotid aus der kodierenden Sequenz eines Genes, das ein Genfragment gemäß einer der 1 – 18 umfaßt, zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht.
Polynukleotid gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es einer der in einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, dargestellten Nukleotidsequenzen oder Teilen davon oder einem Polynukleotid aus der kodierenden Sequenz eines Genes, das ein Genfragment gemäß einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, umfaßt, zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht.
Polynukleotid, das zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% einer definierten Nukleinsäuresequenz entspricht, dadurch erhältlich, daß ein Polynukleotid gemäß einer der 1 – 18 als Sonde markiert, eine cDNA-Bank mit der Sonde hybridisiert und unter Standardbedingungen gewaschen wird und der cDNA-Klon, an den die Sonde gebunden hat, isoliert und gegebenenfalls sequenziert wird.
Polynukleotid, das zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% einer definierten Nukleinsäuresequenz entspricht, dadurch erhältlich, daß Abschnitte eines Polynukleotids gemäß einer der 1 – 18 als Gen-spezifische Oligonukleotid-Primer ermittelt und synthetisiert werden, mit denen dann durch PCR ausgehend von einzel- oder doppelsträngiger DNA, von cDNA-Bibliotheken oder genomischer DNA als Template das verlängerte Polynukleotid generiert und gegebenenfalls sequenziert wird.
Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polynukleotid gemäß einer der 7 – 16, insbesondere 15 oder 16, verwendet wird.
Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 14 – 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um RNA oder ein- oder doppelstängige DNA, insbesondere mRNA oder cDNA handelt.
Antisense-Polynukleotid oder PNA, das/die eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 14 - 19 zu binden.
Antisense-Polynukleotid oder PNA gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es/sie Teil eines Ribozyms oder DNA-Enzyms oder einer sonstigen katalytischen RNA oder DNA ist.
Vektor, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 14 – 19 und/oder ein Antisense-Polynukleotid nach einem der Ansprüche 20 oder 21.
Vektor gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Expressionsvektor ist.
Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor abgeleitet ist von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder er mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI-Sequenz enthält.
Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 – 24, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 15 oder 18 enthält.
Peptid, insbesondere Oligopeptid oder Polypeptid, oder Protein kodiert durch ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 14 -19.
Peptid, insbesondere Oligopeptid oder Polypeptid, oder Protein, für das ein Polynukleotid kodiert, daß unter Standardbedingungen mit einem der Polynukleotide gemäß einer der 1 – 18 oder dessen Antisense-Polynukleotid hybridisiert.
Peptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß es posttranslational modifiziert wurde, es insbesondere glykosyliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde.
Peptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß es durch ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 15 oder 18 kodiert wird.
Antikörper gegen ein Peptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 26 – 29.
Antikörper gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein Peptid oder Protein gemäß Anspruch 29 gerichtet ist.
Zelle, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 14 – 21, ein Peptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 26 – 29 und/oder einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 – 25.
Zelle gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle handelt.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 15 oder 18, ein Peptid oder Protein gemäß Anspruch 29 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 25 enthält.
Transgenes nichthumanes Säugetier, dessen Keim- und somatische Zellen eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14 – 21 als Resultat einer chromosomalen Einbringung in das Genom des Tieres oder das Genom eines der Vorfahren des genannten Tieres enthalten.
Transgenes nichthumanes Säugetier, dessen Keim- und somatische Zellen als Resultat einer chromosomalen Manipulation im Genom des Tieres oder im Genom eines der Vorfahren des genannten Tieres eine der Nukleotidsequenzen gemäß einem der Ansprüche 14 – 21 nicht mehr in exprimierbarer Form enthalten.
Transgenes nichthumanes Säugetier gemäß einem der Ansprüche 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Nagetier ist.
Transgenes nichthumanes Säugetier gemäß einem der Ansprüche 36 – 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz Anspruch 15 oder 18 entspricht.
Verbindung, identifizierbar als schmerzregulierende Substanz durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 – 13.
Verbindung gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung durch ein Verfahren gemäß Anspruch 11 als schmerzregulierende Substanz identifizierbar ist.
Verbindung gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung durch ein Verfahren gemäß Anspruch 12 als schmerzregulierende Substanz identifizierbar ist.
Verbindung gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung durch ein Verfahren gemäß Anspruch 13 als schmerzregulierende Substanz identifizierbar ist.
Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er an ein Peptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 26 – 29 bindet.
Wirkstoff gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß er ein niedermolekularer Wirkstoff ist.
Wirkstoff gemäß einem der Ansprüche 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, daß er an ein Peptid oder Protein gemäß Anspruch 29 bindet.
Arzneimittel, enthaltend mindestens ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 14 – 19, ein Antisense-Polynukleotid nach einem der Ansprüche 20 oder 21, ein Peptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 26 – 29, einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 – 25, einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 30 – 32, eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 33 – 35, eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 40 – 43 und/oder einen Wirkstoff gemäß einem der Ansprüche 44 – 46 sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
Arzneimittel gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 15 oder 18, ein Peptid oder Protein gemäß Anspruch 29, einen Vektor gemäß Anspruch 25, einen Antikörper gemäß Anspruch 32, eine Zelle gemäß Anspruch 35, eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 41 oder 42 und/oder einen Wirkstoff gemäß Anspruch 46 enthält.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 47 oder 48, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung gemäß Anspruch 41 enthält.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 47 oder 48, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung gemäß Anspruch 42 und/oder einen Wirkstoff gemäß Anspruch 46 enthält.
Diagnostikum enthaltend mindestens ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 14 – 19 oder Teile davon, ein Antisense-Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21 oder Teile davon, ein Peptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 26 – 29 oder Teile davon, einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 – 25, einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 30 – 32 oder Teile davon und/oder eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 33 – 35 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe.
Diagnostikum gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 15 oder 18 oder Teile davon, ein Peptid oder Protein gemäß Anspruch 29 oder Teile davon, einen Vektor gemäß Anspruch 25, einen Antikörper gemäß Anspruch 32 und/oder eine Zelle gemäß Anspruch 35 enthält.
Diagnostikum gemäß einem der Ansprüche 51 oder 52, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polynukleotid gemäß Anspruch 20 enthält.
Verwendung eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 14 – 19, eines Antisense-Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21, eines Peptids oder Proteins gemäß einem der Ansprüche 26 – 29, eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 22 – 25, eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 30 – 32, einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 33 – 35, einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 40 – 43, eines Wirkstoffes gemäß einem der Ansprüche 44 – 46 und/oder eines Wirkstoffes, der an mindestens ein Peptid oder Protein ausgewählt aus der folgenden Gruppe: – LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Orthotog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder – ein Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder – ein Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein, und/oder – einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet, und/oder – einem mindestens 10, vorzugsweise 15, insbesondere 20, Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide, bindet, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz.
Verwendung gemäß Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung chronischen Schmerz betrifft.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 54 oder 55, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 15 oder 18, ein Peptid oder Protein gemäß Anspruch 29, ein Vektor gemäß Anspruch 25, ein Antikörper gemäß Anspruch 32, eine Zelle gemäß Anspruch 35, eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 41 oder 42, ein Wirkstoff gemäß Anspruch 46 und/oder ein Wirkstoff, der an mindestens ein Peptid oder Protein, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: – LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder – ein Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder – ein Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein bindet, verwendet werden.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 54 – 56, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung gemäß Anspruch 41 und/oder ein Wirkstoff, der an mindestens ein Peptid oder Protein, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: – LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epithelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, und/oder – ein Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder – ein Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) der ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Peptid oder Protein; bindet, verwendet werden.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 54 – 56, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung gemäß Anspruch 42 und/oder ein Wirkstoff gemäß Anspruch 46 verwendet werden/wird.
Verwendung eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 14 – 19, eines Antisense-Polynukleotids nach einem der Ansprüche 20 oder 21, eines Peptids oder Proteins gemäß einem der Ansprüche 26 – 29, eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 22 – 25, eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 30 – 32 und/oder einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 33 – 35 für die Gentherapie.
Verwendung gemäß Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um In-vivo- oder In-vitro-Gentherapie handelt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 59 oder 60, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 16 – 18, vorzugsweise 18, verwendet wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 59 oder 60, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polynukleotid gemäß Anspruch 15 verwendet wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 59 oder 60, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antisense-Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21 verwendet wird.
Verwendung eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 14 – 19, eines Antisense-Polynukleotids nach einem der Ansprüche 20 oder 21, eines Peptids oder Proteins gemäß einem der Ansprüche 26 – 29, eines Vek tors gemäß einem der Ansprüche 22 – 25, eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 30 – 32, einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 33 – 35, einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 40 – 43 und/oder eines Wirkstoffes gemäß einem der Ansprüche 44 – 46 für die Diagnostik und/oder für Wirksamkeitsuntersuchungen.
Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten: (a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit einer Zelle und/oder einer Präparation aus einer solchen Zelle, die ein Peptid oder Protein synthetisiert hat, für das ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 16 – 18, vorzugsweise 18, oder ein dazu zu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, (b) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von der Zelle synthetisierten Peptid oder Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Peptid oder Protein veränderten funktionellen Parameter.
Verfahren gemäß Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 66, dadurch gekennzeichnet, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 66 oder 67, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle gentechnisch so manipuliert wird, daß die Zelle mindestens ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 15 – 18, vorzugsweise 18, oder ein dazu zu mindestens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 97% ähnliches Polynukleotid enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 66 bis 68, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle nach der gentechnischen Manipulation gemäß Anspruch 66 und vor dem Schritt (a) gemäß Anspruch 65 unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, gegebenenfalls unter Selektionsdruck.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins gemäß einem der Ansprüche 26 – 29, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 33 – 35 kultiviert und gegebenfalls das Peptid oder Protein isoliert wird.
Verwendung eines Peptids oder Proteins ausgewählt aus einer der folgenden Gruppen: – LuzP, PEP-19, Phosphatidylinositol Synthase; Valosin Containing Protein, Interleukin-6 Rezeptoruntereinheit-beta, Aspartat-Aminotransferase, Neuronal Immediate Early Gene, Heat Shock Protein 27, HSC70, Calmodulin, Syntaxin Binding Protein 1, Spliceosomales Protein SAP155, Neurodap 1, Bamacan, Leukotrien A4 Hydrolase, Mss4/Phosphatidylinositol-4-phosphat 5 Kinase, Chondromodulin-1, 26S Proteasom UE p112, Proteasom UE Z, Ingensin, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co-A Synthase, Phosphoglyceratkinase, RNA Polymerase II TF SIII p18 UE, Protein Phosphatase EF hands-1, RAB21, TNF-Receptor-Associated-Factor 6-Binding Protein, Ortholog des Drosophila-Gens „Spaghetti", Protein mit 4 Transmembrandomänen Member 3, Vacuolar Protein Sorting Protein, HSKM-B, Calnexin-t, Sorting Nexin 3, Glia Derived Nexin Precursor, Microtubuli-assoziiertes Protein 4, CDC10, 26S Proteasom UE p44.5, Transkriptions Ko-Aktivator CRSP150, JERKY, Protein mit der Zugriffsnummer XM_209528, TF SOX-10, SOUL Protein, rRNA Intron-Encoded Homing Endonuclease, Epi thelialer Zellwachstumsinhibitor, Glutathiontransferase A4 und/oder CGI-69, – einem Peptid oder Protein, für das oder für einen Teil dessen ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, – einem Peptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der 19b), 19d), 19f), 20b), 20d), 20f), 21b), 21d), 21f), 22b), 22d), 22f), 23b), 23d), 23f), 24b), 24d), 24f), 26b), 26d), 26f), 27b), 28b), 28d) 29b), 29d), 29f), 30b), 31b), 32b), 32d), 32f), 33b), 34b), 34d), 34f), 35b), 35d), 35f), 36b), 36d), 37b), 37d), 37f), 38b), 39b), 39d), 40b), 40d), 40f), 41b), 41d), 42b), 43b), 44b), 45b), 46b), 46d), 46f), 47b), 47d), 47f), 48b), 48d), 48f), 49b), 49d), 50b), 50d), 51a), 51c), 51e), 52b), 53b), 53d), 54b), 54d), 54f), 55b), 55d), 56b), 57b), 58b), 58d), 58f), 59b), 61 oder 63b) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Peptid oder Protein – und/oder einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der 19a), 19c), 19e), 20a), 20c), 20e), 21a), 21c), 21e), 22a), 22c), 22e), 23a), 23c), 23e), 24a), 24c), 24e), 25, 26a), 26c), 26e), 27a), 28a), 28c), 29a), 29c), 29e), 30a), 31a), 32a), 32c), 32e), 33a), 34a), 34c), 34e), 35a), 35c), 35e), 36a), 36c), 37a), 37c), 37e), 38a), 39a), 39c), 40a), 40c), 40e), 41a), 41c), 42a), 43a), 44a), 45a), 46a), 46c), 46e), 47a), 47c), 47e), 48a), 48c), 48e), 49a), 49c), 50a), 50c), 51b), 51d), 52a), 53a), 53c), 54a), 54c), 54e), 55a), 55c), 56a), 57a), 58a), 58c), 58e), 59a), 62 oder 63a) oder deren Antisense-Polynukleotid bindet, – einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide, und/oder – einem Peptid oder Protein, für das ein Gen bestehend aus einem Polynukleotid kodiert, dessen Nukleotidsequenz ein Genfragment gemäß einer der in den 1-18 dargestellten Sequenzenumfaßt, oder für das ein zu einem solchen Gen mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, in einem Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen.