EP1356106A2 - Verfahren zur bestimmung des hautstress oder der hautalterung in vitro - Google Patents
Verfahren zur bestimmung des hautstress oder der hautalterung in vitroInfo
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- EP1356106A2 EP1356106A2 EP01986926A EP01986926A EP1356106A2 EP 1356106 A2 EP1356106 A2 EP 1356106A2 EP 01986926 A EP01986926 A EP 01986926A EP 01986926 A EP01986926 A EP 01986926A EP 1356106 A2 EP1356106 A2 EP 1356106A2
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Hautstress und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung des Hautstress und/oder der Hautalterung sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Stress- und/oder Alterungsmarker der Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstress und/oder Hautalterung sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstress und/oder Hautalterung und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstress und/oder Hautalterung. Des weiteren eine kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung gegen Hautstress und/oder Hautalterung.
Description
Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß oder der Hautalterung in vitro
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautaiterung sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Jede lebende Zelle ist in der Lage auf Signale ihrer Umwelt zu reagieren. Die Reaktionen der Zellen werden durch eine geordnete Regulation der Genexpression realisiert, sodaß der Metabolismus von Zellen nicht statisch sondern sehr dynamisch ist. Das menschliche Genom umfasst nach jüngsten Schätzungen ca. 140.000 Gene. Von diesem immensen Informationsangebot verwendet jede Zelle jedoch lediglich einen kleinen, für sie spezifischen Teil für die Synthese von Proteinen, der sich im Genexpressionsmuster wiederspiegelt. Exogene Signale werden von Zellen empfangen und führen, zum Teil über komplexe Signaltransduktionskaskaden, zu Veränderungen im Genexpressionsmuster. Auf diese Weise reagiert jede Zelle auf Signale aus ihrer Umgebung mit der Anpassung ihres Metabolismus.
Z.B. bemerken die Zellen der Haut die energiereiche Strahlung der Sonne und reagieren darauf mit der Umstellung ihrer RNA- und Proteinsyntheseleistungen. Einige Moleküle werden nach einem Stresstimulus (z.B. Sonnenlicht) vermehrt synthetisiert (z.B. MMP-1), andere wiederum werden in einem geringerem Umfang produziert (z.B. Kollagen αι (I)).
Weiterhin wird bei einer Vielzahl der Syntheseprozesse keine signifikante Veränderung erfolgen (z.B. TIMP-1).
Die menschliche Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers. Sie ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, welches aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Diese Tatsache verdeutlicht, dass die Zellen der Haut in besonderem Maße exogenen Signalen der Umwelt, physikalischer und chemischer Natur ausgesetzt sind und daher kontinuierlich ihre Genexpression regulieren. Für das Verständnis von Hautreaktionen auf exogene Stimuli ist daher die Analyse der Genexpression in der Haut von entscheidender Bedeutung.
Die makroskopischen Phänomene alternder Haut beruhen zum einen auf der intrinsischen oder chronologischen Alterung (Hautalterung), zum anderen auf der extrinsischen Alterung durch Umweltstress (Hautstreß). Die Fähigkeit lebender Hautzellen, auf Ihre Umwelt zu reagieren, verändert sich mit der Zeit - es finden Alterungsprozesse statt, die zur Se- neszenz und letztendlich zum Zelltod führen. Die sichtbaren Zeichen gealterter Haut sind als Integral der intrinsischen und der extrinsischen Alterung (z.B. durch Sonnenlicht) zu verstehen, wobei die Ereignisse der extrinsischen Alterung über einen längeren Zeitraum in der Haut akkumulieren.
Ein entscheidendes Merkmal der Haut ist, dass mit zunehmendem Alter die Zellen ihre Fähigkeit verlieren die Homöostase des Organs aufrecht zu erhalten. Welche molekularen Mechanismen dieser Entwicklung zugrunde liegen ist bislang weitgehend unklar.
Effektive Antiage-Produkte zeigen ihre Wirkung auf ein möglichst breites Spektrum molekularer Phänomene der Hautalterung. Bisher sind jedoch nur wenige molekulare Ereignisse der Hautalterung beschrieben worden, die somit als Target kosmetischer Antiage- Produkte dienen können. Die Identifikation neuer Alterungsmarker ermöglicht es, den komplexen Prozesse der intrinsischen und extrinsischen Hautalterung und ihre kausalen Zusammenhänge zu begreifen. Nur mit diesem Wissen können neue Konzepte für kosmetische Antiage-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf das breite Spektrum extrinsischer und intrinsischer Alterungsprozesse in der Haut ausüben.
Jeder Zelltyp der Haut exprimiert ca. 15.000 verschiedene Gene und synthetisiert daraus entsprechend viele Proteine. Welche Gene davon bei der Hautalterung eine Rolle spielen ist bisher jedoch weitgehend unklar.
Die Haut besteht aus mehreren verschiedenen Zelltypen (Fibroblasten, Keratinozyten in verschiedenen Differenzierungszuständen, Melanozyten, Merkelzellen, Langerhanszellen Haarfollikelzellen, Schweisdrüsenzellen etc.), sodass die Komplexität in der Haut expri- mierter Gene sehr groß ist. Es ist bisher nicht möglich gewesen, diese immense Komplexität zu beschreiben. Ebenso wenig war es bisher möglich aus dieser Komplexität die Gene zu identifizieren, die mit der Hautalterung in Zusammenhang stehen und als molekulare Marker der Hautalterung dienen können.
Erschwerend kommt hinzu, dass in der Zelle mRNA-Moleküle in Konzentrationen zwischen einigen wenigen und mehreren hundert Kopien vorkommen. Die schwach expri- mierten Gene sind bisherigen Analysen nicht oder nur sehr schwer zugänglich gewesen, können aber durchaus eine entscheidende Rolle für Alterungsprozesse und für die Home- ostase der Haut spielen.
Die Gesamtheit aller mRNA-Moleküle, die von einer Zelle oder einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt synthetisiert werden, bezeichnet man als "Transkriptom". Bis heute ist es nicht möglich gewesen das komplette Transkriptom, also die Gesamtheit aller transkribierten Gene, der humanen Haut zu beschrieben.
Die Analyse der Genexpression ist zwar mit der Quantifizierung spezifischer mRNA- Moleküle möglich (z.B. Northern-Blot, RNase-Schutzexperimente). Mit diesen Techniken können jedoch nur eine relativ begrenzte Anzahl an Genen gemessen werden.
Die am Markt befindlichen kosmetischen Antiage-Produkte üben ihre Wirkungen auf einen der wenigen bekannten Marker der extrinsischen Hautalterung, wie z.B. die Kollagensynthese, die Kollagenaseaktivität oder Kollagenaseinhibitoren aus.
Ein Verständnis der komplexen Alterungsprozesse in der Haut und die Identifikation geeigneter Markerproteine gestattet die gezielte Suche nach Substanzen oder Kombinationen von Substanzen mit einem breiten Antiage-Wirkspektrum. Produktkonzepte dieser Art
konnten jedoch bis zu dem jetzigen Zeitpunkt nicht entwickelt werden, da eine Vielzahl der Hautalterungsmarker noch nicht bekannt waren.
Bisherige Untersuchungen zur Identifikation von Alterungsmarkern wurden unter Verwendung artifizieller Systeme durchgeführt. Die WO 99/52929 (Lifespan Bioscience Inc.) und die Arbeit von Danit, L. et al., (2000), Science 287, S. 2486-2492, beschreiben die Identifikation von Alterungsmarkern aus isolierten und anschließend in vitro kultivierten Fibroblasten der Haut. Die Zellen sind dabei nicht mehr in ihrer natürlichen Umgebung in der sich nur extrem langsam teilen, sondern teilen sich relativ schnell und stellen dabei ihre Genexpression um. Ein weiterer entscheidender Punkt ist die Tatsache, dass Fibroblasten in der Haut dem Einfluss benachbarter Hautzellen ausgesetzt sind, welches bei isolierten und in vitro kultivierten Zellen nicht mehr der Fall ist.
Es besteht daher ein Bedarf an der Identifikation möglichst vieler, vorzugsweise aller, für die Alterung der Haut wichtigen Gene.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen möglichst großen Teil der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen Gene zu identifizieren. Außerdem sollen mittels der identifizierten Gene Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bereitgestellt werden.
Diese erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (1) zur Identifizierung der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen Gene bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein erstes Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA- Molekülen aus junger menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA- Molekülen aus alter menschlicher oder tierischer Haut gewinnt und
c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in alter und junger Haut unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich ebenso wie die weiteren Gegenstände der Erfindung bevorzugt auf menschliche Haut anwenden, aber auch auf tierische Haut sowie auf Hautmodelle auf der Basis menschlicher oder tierischer Haut übertragen.
Zur Erfassung des Transkriptoms der Haut wurde die Technik der „Seriellen Analyse der Genexpression" (SAGE™) eingesetzt. Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung aller in der Haut exprimierten Gene. Der Vergleich des Transkriptoms junger Haut, mit dem Transkriptom alter Haut lässt die Unterscheidung zwischen relevanten und nicht relevanten Genen der Hautalterung zu.
Für die SAGE™-Analyse wurde humane Haut von gesunden weiblichen Spendern verwendet. Die Durchführung der SAGE™-Analyse erfolgte wie in der EP-A-0 761 822 und bei Velculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484-487, beschrieben. Analysiert wurden zwei SAGE™-Libraries aus humaner Haut verschiedener Altersgruppen. Die erste Library stammt von einer 29-jährigen Probandin (30048 Tags), die andere Library von einer 69- jährigen Probandin (32840 Tags). Zur weiteren Analyse wurden beide SAGE™-Libraries auf die durchschnittliche tag-Anzahl normiert (31594 Tags). Die beiden Libraries wurden miteinander verglichen, um Gene mit einer altersabhängigen Regulation zu identifizieren. Wie für zwei Libraries desselben Gewebetyps erwartet, ist das Tag-Repertoire der beiden Haut-Libraries weitgehend ähnlich.
Zunächst fällt auf, dass die Library aus junger Haut eine deutliche Überexpression von Kollagenen aufweist. Einige Kollagene weisen mehrere alternative poly-Adenylierungen auf, die resultierenden tags zeigen jeweils konsistente Ergebnisse. So ist z.B. Kollagen (I) α1 in der jungen Haut um einen Faktor 4-5 überexprimiert, Kollagen (I) α2 um einen Faktor von 4, und Kollagen (III) α 1 um einen Faktor 8. Weitere Genklassen, die der jungen Haut überexprimiert sind entsprechen Marker- Proteinen z.B. des Cytoskeletts. So sind u. a. Transgelin, Desmin, Actin, Myosin, Calponin und Tropomyosin zwischen 6-fach und 37-fach überrepräsentiert.
Im Gegensatz dazu sind in der Library aus alter Haut einige Keratine und andere Kerati- nocyten-spezische Gene überrepräsentiert. Die in beiden Libraries stark exprimierten epidermalen Keratine 5, 10 und 14 sind z. B. etwa 2-fach stärker in der alten Haut vertreten, während das ebenfalls stark-exprimierte Keratin 1 diese Tendenz nicht zeigt. Stratifin, Desmocollin, MMP2 (Gelatinase) und CLSP (Keratinocyten-spezifisches Calmo- dulin) sind 5- bis 8-fach überrepräsentiert.
Die Tabellen 1 bis 4 enthalten eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelten, in alter und junger Haut differentiell exprimierten Gene unter Angabe einer laufenden Ordnungsnummer in Spalte 1 , der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2, der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in junger Haut in Spalte 3, der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in alter Haut in Spalte 4, des Quotienten der Frequenzen (aus Spalte 3 und Spalte 4) in Spalte 5, der Signifikanz in Spalte 6, der UniGene-Accession-Number in Spalte 7 und einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 8.
Der Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in junger Haut stärker exprimiert wird, als in alter Haut, oder umgekehrt.
Unter ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese
Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen httD.7/www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/quide direkt zugänglich.
In Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 2-fach und weniger als 5-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 2 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 5-fach und weniger als 7-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 3 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 7-fach und weniger als 10-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 4 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 10-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 5 sind Gene aufgelistet, die mindestens 2-fach differentiell exprimiert sind; denen jedoch kein Datenbankeintrag zugeordnet werden konnte und die somit nur durch die Tag-Sequenz in Spalte 2 identifizierbar sind.
In Tabelle 6 sind Gene aufgelistet, die mindestens 2-fach differentiell exprimiert sind und die in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBUGenbank-Nummer definiert werden.
In Tabelle 7 sind Gene aufgelistet, die zwischen 2,89- und 11 , 10-fach differentiell exprimiert sind. Die Zuordnung der Tags zu den Genen, die durch Ihre UniGene-Accession- Number in Spalte 6 definiert werden, erfolgte durch manuelle Annotation.
Zur Annotation wurden folgende Datenbanken verwendet:
1. Unigene - Version vom 30.10.01 mit folgenden Datenbankeinträgen: a. der bekannten Gene aus Genbank (Stand: 12.10.01) b. der EST's aus dbEST (Stand: 19.10.01)
2. mRNA - Version released am 17.10.01
Die Datenbanken wurden vom NCBI heruntergeladen, für eine lokale Version des BLAST- Programmes (ebenfalls NCBI) formatiert und mit den in der SAGE-Analyse detektierten Tags auf identische Hits verglichen.
Die gefundenen Gene/Klone wurden auf Redundanz geprüft und wie nachfolgend aufgeführt nachbearbeitet:
1. Tag-Sequenzen mit mehreren unterschiedlichen Treffern: Bewertung als nicht annotierbar.
2. Tag-Sequenzen mit doppelten oder mehreren identischen Treffern: Eliminierung der Treffer, die am weitesten vom Poly-A-Tail entfernt lagen.
Zunächst wurden die Ergebnisse aus der Unigene-Datenbank ausgewertet und dann mit den Ergebnissen aus der mRNA-Datenbank abgeglichen. Letztere tauchen in der Tabelle 7 nicht auf, da sie auch über die Unigene-Einträge abrufbar sind.
Alle in der Ergebnistabelle aufgeführten Links wurden auf der im folgenden dokumentierten Datenbasis des 30.10.2001 (Unigene-Datenbankrelease: UniGene Build #143) überprüft:
Sequences Included in UniGene
Known genes are from GenBank (Oct 12, 2001) ESTs are from dbEST through 19-Oct-2001
69367 mRNAs + gene CDSs
1147828 EST, 3'reads
1196006 EST, 5'reads
+ 598081 EST, other/unknown
3011282 total sequences in clusters
Final Number of Clusters (sets)
96332 sets total
20516 sets contain at least one known gene 95171 sets contain at least one EST 19355 sets contain both genes and ESTs
Release Notes
Die durch ihre Swissprot- bzw. TREMBL-Nummern definierten Gene oder Genprodukte sind im Internet unter folgenden Adressen offenbart: http://www.ebi.ac.uk/swissprot/ oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die durch ihre EMBUGenbank-Nummern definierten Gene oder Genprodukte sind im
Internet unter folgender Adresse offenbart: http://ncbi.nlm.nih.gov/.
Die zweite der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (2) zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in alter und junger Haut differentiell exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und
d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut stärker exprimiert werden als in alter bzw. gestreßter Haut.
Es kann in Schritt b) des Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ausreichend sein, das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen zu untersuchen, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in alter und junger Haut differentiell exprimiert identifiziert werden, wenn diese ausschließlich in alter oder ausschließlich in junger Haut exprimiert werden. In allen anderen Fällen muß in Schritt b) auch die Menge der differentiell exprimierten Moleküle untersucht werden, d. h., die Expression muß quantifiziert werden.
In Schritt d) des Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung wird das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zugeordnet, wenn es ü- berwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, d. h., daß das Gemisch entweder mehr unterschiedliche typischerweise in alter Haut exprimierte Verbindungen enthält, als solche, die typischerweise in junger Haut exprimiert werden (qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise in alter Haut exprimierten Verbindungen enthält, als typischerweise in junger Haut vorhanden sind (quantitative Differenzierung). Für die Zuordnung zu junger bzw. ungestreßter Haut wird in komplementärer weise verfahren.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Protei-
nen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 1 bis 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 2 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 2 bis 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 3 und 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 3 und 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 7-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 7-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens doppelt, insbesondere 5- fach, vorzugsweise 7-fach, besonders bevorzugt 10-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens doppelt, insbesondere 5-fach, vorzugsweise 7-fach, besonders bevorzugt 10- fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
Man kann den Zustand der Haut auch dadurch beschreiben, daß mehrere Marker (Expressionprodukte der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen Gene) quantifiziert werden, die dann untereinander in einem charakteristischen Verhältnis aktiv sein müssen, um junge Haut zu repräsentieren, bzw. in einem hiervon verschiedenen charakteristischen Verhältnis aktiv sein müssen, um alte Haut zu repräsentieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren (3) zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels Verfahren (1) als für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsam identifiziert werden,
c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in junger bzw. in alter Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den Tabellen 1 bis 5, Spalten 3 bzw. 4 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in alter Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in junger Haut entsprechen.
Vorzugsweise gewinnt man in Schritt a) der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe. Hierbei eröffnet die Vollhautprobe umfassendere Vergleichsmöglichkeiten mit den gleichfalls aus Vollhaut gewonnenen SAGE-Libraries. Die Epidermisprobe ist hingegen leichter zu gewinnen, beispielsweise durch Aufbringen eines Klebebandes auf die Haut und Abreißen desselben, wie in der WO 00/10579 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung gewinnt man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird beispielsweise in „Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161 :12 1735-8; sowie in „Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sei., 1998, 91 , 231-244; und auch im Internet unter http://www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Bei der Anwendung der Mikrodialyse führt man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer geeigneten Trägerlösung die Sonde langsam zu spülen. Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert die Mikrodialyse Proteine,
mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die im extrazellulären Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit, dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist weniger inva- siv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkommender Verbindungen beschränkt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente, mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter
Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese Affinitätschromatographie Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in dem Übersichtsartikel von Akhi- lesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die 2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L.D. Adams, Two-dimensional Gel E- lectrophoresis using the Isodalt System oder in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two- dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; oder in 2-D E- lectrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben:
Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.
Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA- Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter Northern Blots,
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. cDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA) xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere xii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhi- lesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature,
Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. Das TOGA-Verfahren ist in "J. Gregor Sutcliffe et al, TOGA: An automated parsing tech- nology for analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol. 97, No. 5, pp. 1976-1981 (2000)" beschrieben, worauf hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird.
Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte Methoden zur Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen eingesetzt werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, oder die in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden.
Bei einem BioChip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, insbesondere Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden.
Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z. B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Pepti- de, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle).
Im allgemeinen haben BioChips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktioneilen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein. Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Na- ture Genetics, Vol. 21 , Supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301- 306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die bereits genannten Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA- Chiptechnologie liefern die Bücher „DNA Microarrays: A Practical Approach" (Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und „Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA-Chiptechnologie beruht auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren komplementäre Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete technische Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot- und Northern-Blot-Analyse eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei denen lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die DNA-Chiptechnologie einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen.
Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z.B. Glas oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden in hoher Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert werden. Als problematisch wird dabei die Technik der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden-Immobilisierung eingeschätzt. Nach dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden-Immobilisierung realisiert:
E.M. Southern (E.M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 und E.M. Southern et al. ( 1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Synthese an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.
Ein ähnliches Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithographischen Techniken verglichen werden kann (Pease, A.C. et al. (1994), Proc. Natl Acad Sei USA 91 , 5022- 5026).
Neben diesen auf der in s/ft/-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden Techniken können ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von Trägermaterial gebunden werden.
P.O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) beschreibt die Immobilisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen.
Die Veröffentlichung von L.M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22, 5456-5465) legt ein ähnliches Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an eine Glasoberfläche gebunden werden, die mit 3- Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde.
Die Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenannten „Pin- Spotter" erfolgen. Dazu tauchen dünne Metallnadeln mit z.B. einem Durchmesser von 250 μm, in Sondenlösungen ein und überführen anschließend das anhängende Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trägermaterial des DNA-Chips.
Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezogesteuerten Nanodispensers, der ähnlich einem Tintenstrahldrucker, Sondenlösungen mit einem Volumen von 100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche des Trägermaterials aufbringt.
Die Immobilisierung der Sonden erfolgt z.B. wie in der EP-A-0 965 647 beschrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei ein Primer am 5'-Ende modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an einer Glasoberfläche gebunden werden kann, welche mit 3- Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspezifischen PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäu- resequenz in einer Länge von 200-400 bp haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung der PCR-Produkte über den derivatisierten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts durch eine Inkubation bei 96°C für 10 Min entfernt.
In einer für DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu vergleichenden Zellpopulationen isoliert. Die isolierten mRNAs werden mittels reverser Transkription unter Verwendung von z.B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z.B. rot bzw. grün fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschließend die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, bevorzugtermaßen 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden. Die Nukleinsäuresonden weisen bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden auf.
In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens definiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die
ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut bei Menschen oder Tieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Zur Beschleunigung des Testverfahrens ist es auch möglich, verschiedene Wirkstoffe oder Placebos parallel auf verschiedene Hautareale aufzubringen; beispielsweise einen Wirkstoff auf den linken Unterarm und ein Placebo auf den rechten Unterarm, oder umgekehrt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-Verfahren zur I- dentifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test- Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die
ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung, enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt, das geeignet ist, die Aktivität mindestens eines der Proteine zu unterdrücken oder zu verringern, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, oder die Aktivität mindestens eines der Proteine zu induzieren oder zu verstärken, die in junger bzw. ungestreßter Haut stärker exprimiert werden als in alter bzw. gestreßter Haut.
Vorzugsweise sind die Proteine ausgewählt sind unter denen, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt ist bevorzugtermaßen ausgewählt unter DNA, RNA oder PNA. Möglich sind aber auch lineare Kombinationen dieser Nukleinsäuren oder Hybridmoleküle, beispielsweise RNA/DNA-Hybride. Das Nukleinsäurekonstrukt ist außerdem vorzugsweise ausgewählt unter proteinkodierenden Sequenzen, Ribozymen, Antisense-Nukleinsäuren, Triple-Helix-Bildnern und rRNA.
Die erfindungsgemäße Zubereitung kann etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Nukleinsäurekonstrukte enthalten.
Das Nukleinsäurekonstrukt liegt in der erfindungsgemäßen Zubereitung insbesondere in Lipidvesikeln eingeschlossen vor, beispielsweise in Liposomen, Niosomen oder Transfersomen, vorzugsweise in Liposomen.
Als Nukleinsäurekonstrukte im Sinne der Erfindung kommen in Betracht DNA und RNA Sequenzen, die für einen der Altersmarker kodieren und Konstrukte dieser Polynukleotide.
Diese werden nach ihrem Transport in die Zellen der Haut transkribiert und/oder transla- tiert und führen zur verstärkten Expression des von ihnen codierten Proteins.
Die Erfindung umfasst auch Teilsequenzen von Altersgenen sowie Gene deren Sequenz im Vergleich zu den genannten Altersgenen durch gerichtete oder andere Arten der Muta- genese verändert wurde.
Eine Reihe von Techniken zur Veränderung von Monierten Genen sind bekannt und beschrieben z.B. in „Current Protokols in Molecular Biology", Volume 1, Chapter δ, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, Ine (2001). Diese Veränderungen können so ausgeführt werden, daß das nach Transkription und/oder Translation resultierende Protein die identische Aminosäuresequenz besitzt, wie das Protein, das ohne diese Mutation resultieren würde (Redundanz des genetischen Codes). Das veränderte Gen kann aber auch zur Expression eines Proteins mit veränderter Aminosäuresequenz führen, so daß dessen biologische Aktivität verändert, z.B. verstärkt oder verringert ist.
Darüberhinaus kommen als Polynukleotide zur Einschleussung in die Haut DNA und RNA Sequenzen in Betracht, die einen Teil der Sequenz eines oder mehrerer der genannten Gene umfassen und selbst eine gewünschte biologische Aktivität besitzen (z.B. anti-sense RNA, rRNA oder kurze doppelsträngige DNA-Moleküle).
Jedes erfindungsgemäß verwendbare Gen, bevorzugt aber solche, die in der Altershaut als schwach exprimiert gefunden wurden, kann mit dem Ziel seiner verstärkten Expression in die Zellen der Haut eingeschleusst werden.
Jedes Konstrukt aus einem der erfindungsgemäß verwendbaren Gen, funktioneil verknüpft mit einem eukaryotischen Promotor, kann verwendet werden.
Die Konstrukte mit einem der Altersgene können beliebige eukaryotische Expression- konstrukte sein. Beispielsweise können bakterielle Plasmide, virale Konstrukte oder andere DNA-Konstrukte genetisch modifiziert werden, so daß ein rekombinantes DNA- (oder RNA-) Molekül entsteht, welches eine Sequenz enthält, die für eines der Altersgene codiert und das gewünschte Genprodukt in Zellen der Haut exprimiert.
Bevorzugt sind Konstrukte, die die Fähigkeit zur Replikation sowohl in eukaryotischen als auch in prokaryotischen Wirtszellen besitzen. Solche Konstrukte sind Stand der Technik und kommerziell erhältlich.
Die erfindungsgemäße Zubereitung wird vorzugsweise auf die Haut appliziert. Die in ihr enthaltene DNA kann entweder linear oder zirkulär sein, vorzugsweise handelt es sich um zirkuläre DNA-Moleküle. Das Polynukleotid oder das Polynukleotid-enthaltende Konstrukt kann nach bekannten Methoden vervielfältigt und gereinigt werden und wird als pures Molekül oder in einer der u.g. Formulierungen verwendet.
Bevorzugt sind Konstrukte, die einen Promotor tragen, welcher eine Expression der interessierenden DNA ermöglicht. In Abhängigkeit von der Art des Gens und dem Zweck seiner Anwendung können verschiedene Promotoren verwendet werden. Starke, konstitu- tive Promotoren können verwendet werden, wie z.B. der Promotor des „immediate early
gene" von Cytomegalovirus (CMV) oder der Promotor des „long terminal repeat" des Rous Sarcoma Virus (RSV).
Alternativ können gewebespezifische Promotoren oder zelltypspezifische Promotoren eingesetzt werden. Beispielsweise kann der Promotor so gewählt sein, daß er die spezifische Expression in Hautzellen oder bestimmten Hautzell-Typen bewirkt. Beispiele für gewebespezifische oder zelltypspezifische Promotoren sind u.a. die Keratin-Promotoren (z.B. humanes Keratin 14 Promotor (Wang et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sei US 94:219-226)) oder Tyrosinase Promotoren (spezifisch für Melanocyten). Alternativ können induzierbare Promotoren verwendet werden.
Die Konstrukte können neben den Promotoren noch andere Elemente enthalten, die die transkriptionale oder translationale Expression des Genprodukts verstärken. Beispielsweise kann das Konstrukt eine „intemal ribosomal entry site" (IRES) beinhalten, um die Translation der stromabwärts liegenden Sequenz zu verstärken (siehe Murakami et al. 1997, Gene 202:23-29). Weitere Komponenten, die auf dem Konstrukt vorhanden sein können umfassen Marker (z.B. Antibiotikaresistenz-Gene wie das Ampicillin-Resistenz Gen) zur Selektion von Zellen die das Konstrukt enthalten, einen Replikationsursprung der die stabile Replikation des Konstrukts in prokaryotischen Zellen bewirkt, ein Kern- Lokalisierungs Signal oder andere Elemente, die die Produktion des DNA-Konstrukts und/oder des codierten Proteins unterstützen.
Die Konstrukte können auch ein Polyadenylierungs-Signal enthalten. Die Sequenz eines solchen Signals kann ausgewählt werden aus verschiedenen bekannten Polyadenylie- rungs-Signalen. Ein bevorzugtes Beispiel ist das SV40 early Polyadenylierungs-Signal.
Die Konstrukte können auch ein oder mehrere Introns beinhalten, welche die Expression der DNA verstärken kann.
Die Erfindung umfasst auch Konstrukte, die für Fusionsproteine eines der Altersmarker mit einem zweiten Protein oder für ein Fusionsprotein aus zwei Altersmarkern codieren.
Bevorzugte Nukleinsäurekonstrukte sind solche mit mehreren Expressionskasetten, auf denen zwei oder mehr Altersmarker codiert sind, oder die eines der Altersgene und ein Gen für ein weiteres Protein kodieren.
Auch die Co-Transfektion mit einem oder mehreren weiteren Vektoren, die die Expression des interessierenden Gens unterstützen können ist möglich.
Vektoren, die eines oder mehrere der genannten Merkmale tragen und darüber hinaus auch noch weitere funktionelle Einheiten beinhalten können sind vielfach in der Literatur beschrieben und kommerziell erhältlich. Solche Vektoren sind z.B. pCI und pSI (Promega GmbH) oder pDEST (Gibco BRL).
Die Sequenzen der erfindungsgemäß bestimmbaren und insbesondere die, der in den Tabellen 1 bis 9 aufgeführten Altersgene und Teilsequenzen der Gene können zur selektiven Inhibierung der Expression einzelner Gene genutzt werden.
Bevorzugte Targets für die Inhibierung der Expression sind solche, die in der Altershaut als verstärkt exprimiert gefunden wurden. Oligo- und Polynukleotide, die für diesen Zweck geeignet sind umfassen Antisense-Nukleotide, Ribozym-Nukleotide und doppelsträngige RNAs.
Antisense-Nukleotide sind wohlbekannt in ihrer Eigenschaft mit sense-Strängen der mRNA zu hybridisieren und dadurch mit der Expression der mRNA zu interferieren (siehe z,B. Wingers et al., Laboratory Investigation 79, 1415-1424 (1999). Einen Überblick über die Anwendung von Antisense-Nukleotiden in der Haut gibt Wraight et al., Pharmacol & Ther 90, 89-104 (2001).
Ribozym-Nukleinsäuren sind ebenfalls bekannt als einzelsträngige RNA-Moleküle, die die Fähigkeit besitzen, ssRNA und ssDNA selektiv zu spalten, und dadurch die Expression der Targetmoleküle selektiv zu inhibieren.
Post-transkriptionale Gen-Repression kann ebenfalls durch doppelsträngige RNAs hervorgerufen werden. Diese dsRNAs interferieren mit der Ziel-RNA nach Spaltung in kürze-
re Segmente durch Ribonuklease III. Ebenso können zur Gen-Repression Duplexe aus kurzen RNA-Sequenzen verwendet werden (S.M. Elbashir et al., Nature 411 ,494-498 (2001). Auch diese doppelsträngigen RNA-Moleküle können im Sinne der Erfindung zur Repression der gefundenen Altersgene verwendet werden.
Unmodifizierte DNA oder RNA-Moleküle unterliegen in Gewebe oder Zellen einem schnellen Abbau. Um die Resistenz von Oligo-oder Polynukleotiden gegenüber Abbau durch Nukleasen zu erhöhen, wurden Modifizierungen entwickelt, die entweder das Rückgrat oder die Pyridin- bzw Pyrimidinbasen eines Oligonukleotids betreffen. Solche modofi- zierten DNA- oder RNA-Sequenzen können ebenfalls im Sinne der Erfindung verwendet werden. Geeignete Modifizierungen sind z.B. Phosphorthioate, Methylphosphonate oder Peptid-Verknüpfungen (PNAs) für das Zucker-Rückgrat sowie C5-propynyl-dU, dC für die Nukleosid-Basen.
Die DNA oder RNA-Moleküle der Erfindung können z.B. topisch appliziert werden. Die Moleküle können dabei entweder ohne weitere die Penetration beeinflussende Substanzen angewendet werden, oder im Gemisch bzw. assoziiert mit Molekülen, welche die Penetration durch das stratum corneum und die Transfektion der Zellen der Haut beeinflussen.
Eine bevorzugte Ausführung der topischen Applikation der Altersgene ist die in einer Formulierung mit Lipiden, wahlweise in Gemisch mit Surfactants, bevorzugt in Form von Liposomen.
Dabei enthält die Formulierung etwa 0,1 μg - 5 mg DNA oder RNA pro mg Liposom. Die Bestandteile der Liposomen können neutral oder geladen sein und in Form von z.B. mul- tilamellaren Vesikeln oder unilamelaren Vesikeln vorliegen.
Geeignete Lipide für die Herstellung von Liposomen sind z.B. natürliches Phosphatidyl- cholin, welches beispielsweise aus Ei, Sojabohne, Oliven, Kokosnuß, Walfett, Safran, Leinsamen, Nachtkerze oder Primel gewonnen werden kann. Weitere geeignete Lipide sind z.B. natürliches oder synthetisches Phosphatidylethanolamin, synthetisches Phosphatidylcholin, Phosphatidsäuren oder ihre Ester, Phosphatidylserin und Phosphati-
dyl(poly)alkohole, wie z.B. Phosphatidylinisitol oder Phosphatidylglycerol. Beispiele für die genannten Lipide sind DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholin), DOPE (Dioleylphospha- tidylethanolamin), DOTMA (N[1-(2,3,dioleoyloxy)propyl]-N,N,N trimethyl- ammoniumchlorid), DOTAB (N-1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl N,N,N-trimethylammo- niumchlorid) , DPPA (Dipalmitoylphosphatidsäure), DPPG (Dipalmitoylphos- phatidylglycerol).
Auch einzelne oberflächeaktive Verbindungen, welche z,B, als Detergenzien oder Emul- gatoren verwendet werden, können zur Bildung von Liposomen eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind DODAC (Dioctadecylammoniumchlorid) und CTAC (Cetyltrimethylam- moniumchlorid). Geeignete Bestandteile von Liposomen und Herstellungsverfahren sind in der Literatur beschrieben (siehe z.B. „Liposome Drug Delivery Systems", G. Betageri (Hrsg.), Lancaster Techonomic Publishing Company (1993) oder „Liposome Technology", Gregoriadis (Hrsg.), CRC Press). Neben Liposomen können auch andere Lipidvesikel wie beispielsweise Niosomen und Transfersomen (siehe Z.B.WO9817255) eingesetzt werden.
Die Penetrationsfähigkeit der DNA- und RNA-Moleküle kann durch die vorherige oder gleichzeitige Applikation von Penetrationsenhancem verbessert werden. Chemische pe- netrationsenhancer sind in der Literatur zahlreich beschrieben (siehe z.B. M. Foldvari, PSTT 3, 417-425 (2000) oder N. Kanikkannan, Curr Med. Chem. 7, 593-608 (2000)). Geeignete Penetrationsenhancer sind u.a. organische Lösungsmittel (z.B. Ethanol), Pyr- rolidone, Sulfoxide (z.B. DMSO), Fettsäuren (gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder unverzweigte mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8-18), Terpene (z.B. L-Menthol oder 1,8-Cineol) Surfactants (z.B. Polysorbate (Tween), Polyethylenalkylphenole (Brij), Alkylethersulfate sowie Betaine und amphotere Glycinate).
Weiterhin kommen zur Verbesserung der Penetration von Oligo- oder Polynukleotiden im Sinne der Erfindung auch invasive oder minimal-invasive Methoden in Betracht. Zu den gängigen minimal-invasiven Methoden gehören die Elektroporation und die lontophorese. Bei beiden Methoden wird mit Hilfe von Elektroden eine Spannung an der Oberfläche der Haut angelegt. Die Elektroporation nutzt einen kurzen Puls hoher Spannung zur Permea- bilisierung der Haut. Bei der lontophorese kommt zu diesem Zweck eine kleine Spannung mit konstantem Strom zum Einsatz.
Ultraschall von geringer Frequenz kann ebenfalls verwendet werden, um die Permeabilität der Haut für DNA oder RNA zu erhöhen.
Die folgenden Ausführungsbeispiele verdeutlichen die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
Beispiel 1
Herstellung von Liposomen-DNA-Komplexen
18,6 μl (25 μmol) DOPE und 0,0175 g DOTAP (25 μmol) werden zusammen in 1 ml Etha- nol gelöst. Die Lösung wird über Nacht in Eksikkator eingetrocknet und die Lipidmischung anschließend in 3 ml PBS (58 mM NaHPO4, 17 mM NaH2PO4, 69 mM NaCI, pH 7,4) unter Lichtausschluss für 3-4 h unter gelegentlichem Mischen rehydratisiert. Die so entstandene Lipiddispersion wird 2 mal für je 5 min im Ultraschallbad beschallt mit einer zwischenzeitlichen 2-stündigen Pause. 6,1 μl der entstandenen Liposomen-Dispersion werden mit 1 ,5 ml PBS verdünnt und mit 20 μg Plasmid gelöst in 1 ,5 ml HBS (150 mM NaCI, 20 mM Hepes, pH 7,4) gemischt. Die bei Zugabe der Plasmid-Lösung zu der Liposomen- Dispersion entstehende stärkere Trübung gibt einen Hinweis auf das Entstehen der DNA- Liposomen-Komplexe.
Beispiel 2
Herstellung von Liposomen-DNA-Komplexen
18,6 μl (25 μmol) DOPE und 0,0175 g DOTAP (25 μmol) werden zusammen in 1 ml Etha- nol gelöst. Die Lösung wird über Nacht in Eksikkator eingetrocknet und die Lipidmischung anschließend in 3 ml PBS (58 mM NaHPO4, 17 mM NaH2PO4, 69 mM NaCI, pH 7,4) unter Lichtausschluss für 3-4 h unter gelegentlichem Mischen rehydratisiert. Die so entstandene Lipiddispersion wird 2 mal für je 5 min im Ultraschallbad beschallt mit einer zwischenzeitlichen 2-stündigen Pause. 50 μl der entstandenen Liposomen-Dispersion werden mit 50 μg Plasmid gelöst in 50 μl HBS (150 mM NaCI, 20 mM Hepes, pH 7,4) gemischt. Der Nachweis der Liposomen erfolgt durch TEM-Aufnahmen der Liposomen-DNA-Komplexe (Figur 1)-
Beispiel 3
Herstellung von Liposomen mit kationischen Detergenz und Komplexbildung mit DNA
29,8 μl (40 μmol) DOPE und 4 mg CTAC (Cetyltrimethylammoniumchlorid) (10 μmol) werden zusammen in 1 ml Ethanol gelöst. Das Lösungsmittel Ethanol wird im Rotationsverdampfer abgezogen und die Mischung anschließend in 3 ml PBS (58 mM NaHPO4, 17 mM NaH2PO4, 69 mM NaCI, pH 7,4) unter Lichtausschluss für 3-4 h unter gelegentlichem Mischen rehydratisiert. Die so entstandene Lipiddispersion wird 2 mal für je 5 min im Ultraschallbad beschallt mit einer zwischenzeitlichen 2-stündigen Pause. 6,7 μl der entstandenen Liposomen-Dispersion werden mit 1 ,5 ml PBS verdünnt und mit 20 μg Plasmid gelöst in 1 ,5 ml HBS (150 mM NaCI, 20 mM Hepes, pH 7,4) gemischt.
Verzeichnis der Figuren:
Figur 1 : TEM-Aufnahme der Liposomen-DNA-Komplexe aus Beispiel 2 im Cryomode. Vergrößerung: 10000-fach
Figur 1:
Tabellen:
Tabelle 4:
Tabelle 3:
Tabelle 2:
Tabelle 1:
Tabelle 5:
Tabelle 7:
Tabelle 6:
Tabelle 8:
TRANSPORTER 1. (4F2 LC) 4F2 LIGHT CHAIN. (SLC7A5).
144 Hs.73965 Q01130 MRF1: (SFRS2) SPLICING FACTOR, ARGININE/SERINE- RICH 2 (SPLICING FACTOR SC35) (SC-35) (SPLICING COMPONENT, 35 KDA) (PR264 PROTEIN).
145 Hs.25313 014742 MSP58: (MSP58) NUCLEOLAR PROTEIN CELL CYCLE- REGULATED FACTOR P78.
146 Hs.76941 P54709 NA-K-ATPASE-B3: (ATP1 B3) SODIUM/POTASSIUM- TRANSPORTING ATPASE BETA-3 CHAIN (SODIUM/POTASSIUM-DEPENDENT ATPASE BETA-3 SUBUNIT) (ATPB-3).
147 Hs.15977 Q9Y6M9 NDUFB9: (NDUFB9 OR UQOR22) NADH-UBIQUINONE OXIDOREDUCTASE B22 SUBUNIT (EC 1.6.5.3) (EC 1.6.99.3) (COMPLEX 1-B22) (CI-B22).
148 Hs.172674 Q99842 NFATX4: (NFATC3 OR NFAT4) NUCLEAR FACTOR OF ACTIVATED T-CELLS, CYTOPLASMIC 3 (T CELL TRANSCRIPTION FACTOR NFAT4) (NF-ATC3) (NF-AT4) (NFATX).
149 Hs.62041 P14543 NIDOGEN: (NID) NIDOGEN PRECURSOR (ENTACTIN).
150 Hs.111039 P30419 NMT1: (NMT1 OR NMT) GLYCYLPEPTIDE N- TETRADECANOYLTRANSFERASE 1 (EC 2.3.1.97) (PEPTIDE N-MYRISTOYLTRANSFERASE 1) (MYRISTOYL-COA.PROTEIN N- MYRISTOYLTRANSFERASE 1) (NMT 1).
151 Hs.724 P20393 NR1D1: (NR1D1 OR THRAL OR EAR1 OR HREV) ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR1D1 (V-ERBA RELATED PROTEIN EAR-1) (REV-ERBA-ALPHA).
152 Hs.1119 P22736 NR4A1 : (NR4A1 OR HMR OR NAK1 OR GFRP1) ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR HMR (EARLY RESPONSE PROTEIN NAK1) (TR3 ORPHAN RECEPTOR)
153 Hs.82120 P43354 NR4A2: (NR4A2 OR NURR1 OR TINUR OR NOT) ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NURR1
154 Hs.83469 Q14494 NRF1: (NFE2L1 OR NRF1 OR TCF11 OR HBZ17) NUCLEAR FACTOR ERYTHROID 2 RELATED FACTOR 1 (NF-E2 RELATED FACTOR 1) (NFE2-RELATED FACTOR 1) (NUCLEAR FACTOR, ERYTHROID DERIVED 2, LIKE 1) (TRANSCRIPTION FACTOR 11) (TRANSCRIPTION FACTOR HBZ17)
155 Hs.75212 P11926 ODC1: (ODC1) ORNITHINE DECARBOXYLASE (EC 4.1.1.17) (ODC).
156 Hs.88474 P23219 PGH1: (PTGS1 OR COX1) PROSTAGLANDIN G/H SYNTHASE 1 PRECURSOR (EC 1.14.99.1) (CYCLOOXYGENASE-1) (COX-1) (PROSTAGLANDIN- ENDOPEROXIDE SYNTHASE 1) (PROSTAGLANDIN H2SYNTHASE 1) (PGH SYNTHASE 1) (PGHS-1) (PHS 1).
157 Hs.76152 P07585 PGS2: (DCN) BONE PROTEOGLYCAN II PRECURSOR (PG-S2) (DECORIN) (PG40).
158 Hs.9589 Q9UMX0 PLIC-1: (UBQLN1) PLIC-1 UBIQUILIN. (DA41)
159 Hs.173902 P30153 PPP2R1A: (PPP2R1A) SERINE/THREONINE PROTEIN PHOSPHATASE 2A, 65 KDA REGULATORY SUBUNIT A, ALPHA ISOFORM (PP2A, SUBUNIT A, PR65-ALPHA ISOFORM) (PP2A, SUBUNIT A, R1-ALPHA ISOFORM) (MEDIUM TUMOR ANTIGEN-ASSOCIATED 61 KDA PROTEIN)
160 P34062 PSMA6: (PSMA6 OR PROS27) PROTEASOME IOTA CHAIN (EC 3.4.99.46) (MACROPAIN IOTA CHAIN) (MULTICATALYTIC ENDOPEPTIDASE COMPLEX IOTA CHAIN) (27 KDA PROSOMAL PROTEIN) (PROS-27) (P27K).
Tabelle 9:
Claims
1. Verfahren zur Identifizierung der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen Gene bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein erstes Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus junger menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus alter menschlicher oder tierischer Haut gewinnt und c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in alter und junger Haut unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.
2. Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in alter und junger Haut differentiell exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es ü- berwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut stärker exprimiert werden als in alter bzw. gestreßter Haut.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 1 bis 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 2 bis 4 in
Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 2 bis 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in
Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 3 und 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 3 und 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 7-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 7-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 oder 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 oder 7 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens doppelt, insbesondere 5-fach, vorzugsweise 7-fach, besonders bevorzugt 10-fach, ganz besonders bevorzugt 11 -fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens doppelt, insbesondere 5-fach, vorzugsweise 7-fach, besonders bevorzugt 10-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
8. Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet , daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA-Moleküle o- der Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 als für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsam identifiziert werden, c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in junger bzw. in alter Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den Tabellen 1 bis 5 und 7, Spalten 3 bzw. 4 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in alter Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in junger Haut entsprechen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe o- der aus einer Epidermisprobe gewinnt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse gewinnt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter i. Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese ii. Affinitätschromatographie iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter
Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese Affinitätschromatographie Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter i. Northern Blots, ii. Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), iii. RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. CDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA) xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere xii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter Northern Blots,
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. CDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA) xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere xii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, 9, 10, 11 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, 12 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden.
17. Test-Kit zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16.
18. Biochip zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend i. einen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, oder die in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden.
19. Biochip nach Anspruch 18, umfassend 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden.
20. Biochip nach Anspruch 18 oder 19, umfassend Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden.
21. Biochip nach Anspruch 20, umfassend Sonden mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden.
22. Biochip nach Anspruch 18 oder 19, umfassend Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
23. Biochip nach einem der Ansprüche 18 bis 22, umfassend Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens definiert werden,
24. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut bei Menschen oder Tieren.
25. Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 23 bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 23 bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
26. Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 25.
27. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
28. Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 23 bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 23 bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
29. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
30. Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 28, oder der Verwendung nach Anspruch 29 bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
31. Kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung, enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt, das geeignet ist, die Aktivität mindestens eines der Proteine zu unterdrücken oder zu verringern, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, oder die Aktivität mindestens eines der Proteine zu induzieren oder zu verstärken, die in junger bzw. ungestreßter Haut stärker exprimiert werden als in alter bzw. gestreßter Haut.
32. Zubereitung nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ausgewählt ist, bzw. die Proteine ausgewählt sind unter denen, die a) in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die b) in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die c) in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden.
33. Zubereitung nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurekonstrukt ausgewählt ist unter DNA, RNA oder PNA.
34. Zubereitung nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Nukleinsäurekonstrukte enthält.
35. Zubereitung nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurekonstrukt ausgewählt ist unter proteinkodierenden Sequenzen, Ribozy- men, Antisense-Nukleinsäuren, Triple-Helix-Bildnern und rRNA.
36. Zubereitung nach einem der Ansprüche 31 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurekonstrukt in Lipidvesikeln eingeschlossen ist, beispielsweise in Liposomen, Niosomen oder Transfersomen, vorzugsweise in Liposomen.
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Effective date: 20080514 |