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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut
in vitro, Test-Kits zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner
Haut sowie die Verwendung von Enzymen zur Bestimmung des enzymatischen
Status humaner Haut, ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit
von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung
humaner Haut sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von
kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung humaner Haut
und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen
Zubereitung zur Behandlung humaner Haut.
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Der Zusammenhang zwischen Hautphysiologie
und den Enzymen auf der Hautoberfläche (Stratum corneum) ist bekannt.
Man weiss z.B., dass bei der Abschuppung der Haut Proteasen involviert
sind, daß Lipasen
den Fettgehalt der Haut regulieren und daß Sulfatasen mit dem Körpergeruch
zusammenhängen.
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Bisher gibt es keine Möglichkeit
den "Enzymstatus" einer Haut individuell
oder in Typengruppen (fettig, schuppig, Akne) zu bestimmen. Bislang
werden Wirkstoffen für
Skin-care auf Wirkeffekte mit kommerziell erhältlichen Enzymen untersucht,
die meist prokaryotischen Ursprungs sind. Dieses Screening berücksichtigt
nicht die authentischen Enzyme der Haut, nicht die Spezifitäten der
Enzyme, nicht deren Quantität
und nicht die physiologische Beschaffenheit der Haut.
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Wird für ein solches Screening ein
in vivo Hautmodell genutzt, so ist eine höhere Durchsatzrate nicht gegeben,
da die Verfügbarkeit
begrenzt ist.
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Wird ein solches Screening an einem
Probanden durchgeführt,
so ist eine höhere
Durchsatzrate ebenfalls nicht gegeben, darüberhinaus sind derartige Probandenexprimente
ohne toxikologische Absicherung oft nicht zulässig.
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Der vorliegenden Erfindung liegt
daher die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit bereitzustellen, den
Enzymstatus menschlicher Haut unter weitgehender Vermeidung der
oben ausgeführten
Nachteile des Standes der Technik zu bestimmen.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut
in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a)
Ein Enzymgemisch aus dem Stratum corneum menschlicher Haut gewinnt,
- b) das Enzymgemisch in eine Mehrzahl von Kavitäten eines
segmentierten Reaktionsgefäßes gibt,
- c) jede Kavität
mit einer ausreichenden Menge Substrat für das in dieser Kavität zu untersuchende
Enzym versieht,
- d) für
jede Kavität
bestimmt, ob und gegebenenfalls wie intensiv die Reaktion des in
dieser Kavität zu
untersuchenden Enzyms abläuft
und
aus der kombinierten Information aus allen Kavitäten den
Enzymstatus bestimmt.
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Vorteilhafterweise ermöglicht das
erfindungsgemäße Verfahren
die Untersuchung von Enzymen des Stratum corneum aus authentischem
Mileu, sowohl hinsichtlich der Qualität als auch in Bezug auf die
Quantität
der Enzyme. Im Gegensatz zu anderen Methoden ist die Durchführung einfach.
Es ist weder eine spezielle Apparatur zur Durchführung des Tests, noch eine
Extraktion erforderlich. Die verschiedenen Enzymassays können und
sollen parallel in einem Testansatz durchgeführt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet eine
Reihe von Einsatzmöglichkeiten,
beispielsweise die Charakterisierung verschiedener Hauttypen, z.B. die Unterscheidung
fettiger, trockener, empfindlicher Haut bzw. Mischhaut von normaler
Haut. Auch eine Untersuchung pathologischer Hautzustände ist
möglich
(Akne, Neurodermitis). Möglich
ist auch, die Regulierung dieser festgestellten Unterschiede durch Kosmetika
im Verlauf einer "Behandlung" zu verfolgen.
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Vorzugsweise gewinnt man in Schritt
a) das Enzymgemisch mittels „Tape
Stripping", d. h.
durch Aufbringen und Abreißen
eines Klebestreifens auf die Haut bzw. von der Haut (Redoules D.
et al. "Charactersisation
and Assay of five Enzymatic Activities in the Stratum corneum using
Tape Strippings" Skin Pharmacol.
Appl. Skin Physiol. 1999; 12: 182-192.; Beisson F. et al. "Use of Tape Stripping
Technique for Directly Quantifying Esterases Activities in Human Stratum
Corneum" Anal. Biochem.
2001.; 290: 179-185.) und nachfolgende Eluierung. Das gewonnen Eluat
wird in Enzymassays eingesetzt, die die typischen Hautenzyme (Lipase,
Sulfatase, Glucuroniadase, Phosaphatase, div. Proteasen, etc.) berücksichtigen.
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Das in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Einsatz kommende segmentierte Reaktionsgefäß ist bevorzugtermaßen eine
handelsübliche
Mikrotiterplatte. Besonders bevorzugt verwendet man in Schritt b)
einen Analysechip mit mehreren funktionalen Ebenen für elektrofokussiertes Spotten,
wie in der DE-A-101 02 063.5-52 beschrieben, auf die hiermit in
vollem Umfang Bezug genommen wird. Dieser Analysechip ermöglicht es
vorteilhafterweise, Proben unabhängig
von ihrer Viskosität mit
Hilfe von Elektroden an definierten Punkten des Punktrasters (Arrays)
zu fokussieren und zu immobilisieren.
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Durch die Fokussierfähigkeit
erfolgt gleichzeitig eine Erhöhung
der lokalen Konzentration der Proben und so eine höhere Spezifität. Während der Analyse
selbst besteht die Möglichkeit
das Testgut an die einzelnen Positionen des Arrays zu adressieren. So
kann potentiell jede untersuchte Information mit der höchst möglichen
Sensitivität
aufgespürt
werden.
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Unabhängig von der Viskosität der Lösung, wird
durch einen festgelegten Zeit faktor ein Spannungsfeld angelegt und
dadurch eine definierte Menge an Probenlösung abgezogen. Durch die elektrisch leitfähige Sensorfläche am Boden
der Kavität
wird die gesamte Probenlösung
auf einen Punkt, mit immer der gleichen Größe, elektrisch fokussiert.
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Durch die vorhandene Kavität gibt es
keine Einschränkungen
aufgrund von Kreuzkontaminationen durch benachbarte Spots. Die Proben
können feucht,
durch Abdecken der Kavitäten,
oder trocken gelagert werden.
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Die in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens
einzusetzenden Substrate können
durch den Fachmann in Abhängigkeit
von dem zu untersuchenden Enzym ausgewählt werden. Beispielhaft seien die
im Internet unter http://www.applichem.de/produkte/biotabellen/09Enzymsub.html
(Stand: 17. Dezember 2002) genannt: Besonders bevorzugte Substrate
sind hochsensitive und der optischen Detektion leicht zugängliche
Substrate, beispielsweise 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-galactosaminid; 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosid;
4-Methylumbelliferyl-β-D-glucopyranosid;
4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid;
4-Methylumbelliferyl-phosphat, Methylumbelliferylpalmitat, Methylumbelliferylsulfat oder
2'-(Methylumbelliferyl)-β-D-neuraminsäure.
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Gewünschtenfalls setzt man in Schritt
c) des erfindungsgemäßen Verfahrens
zusätzlich
Inhibitoren der zu untersuchenden Enzyme ein. Geeignete Inhibitoren
sind beispielsweise ausgewählt
unter den im Internet unter http://www.applichem.de/produkte/biotabellen/08Enzyminhi.html
(Stand: 17. Dezember 2002) aufgelisteten Inhibitoren.
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Der Ansatz wird vorzugsweise bei
37°C inkubiert
und kann nach einer gewissen Zeit mit einem weiteren Puffer auf
pH 10,5 umgepuffert werden und die emittierte Fluoreszenz kann mit
einem Fluoreszenzreader aufgenommen werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet,
ein Enzym des Stratum corneum oder mehrere zugleich (Phosphatase,
Lipase, Sulfatase, Glucuronidase, Trypsin, Chymotrypsin, Elastase,
diverse Proteasen, etc.) zu bestimmen und damit den enzymatischen
Status der zu untersuchenden Haut festzustellen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht den
Vergleich des Enzymstatus verschiedener Hautareale eines Individuums
oder verschiedener Individuen miteinander. Das Verfahren erlaubt
vorteilhafterweise durch Screening einer großen Zahl hautgesunder Individuen
Normwerte für
einen gesunden Enzymstatus zu ermitteln und das Verfahren auf diese
Werte zu eichen.
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Den Enzymstatus bestimmt man mittels
des erfindungsgemäßen Verfahrens
vorzugsweise, indem man das in Schritt a) gewonnene Enzymgemisch
auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Intensität der untersuchten
enzymatischen Reaktionen untersucht und das Enzymgemisch gesunder Haut
zuordnet, wenn es keine oder nur geringe Abweichungen von den oben
genannten Normwerten aufweist, oder das Enzymgemisch kranker bzw.
in gestörter
Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es erhebliche Abweichungen
von den obengenannten Normwerten aufweist.
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In analoger Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren
auch auf Normwerte eines partiell hautgesunden Individuums geeicht
werden. Die Normwerte werden dann durch Untersuchung der gesunden
Hautareale gewonnen. Hierdurch werden interindividuelle Unterschiede
im Enzymstatus ausgeschlossen.
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Vorzugsweise bestimmt man mit Hilfe
des erfindungsgemäßen Verfahrens
den Enzymstatus anhand von etwa 1 bis 50, insbesondere etwa 4 bis
8 unterschiedlichen Enzymen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Test-Kit zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner
Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren
zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut. Das erfindungsgemäße Test-Kit
kann bei spielsweise einige Klebestreifen, eine Mikrotiterplatte,
Puffer und fluoreszenzmarkierte, vorzugsweise hochsensitive Enzymsubstrate
umfassen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Proteinchip zur Bestimmung zur Bestimmung des enzymatischen
Status humaner Haut in vitro, umfassend
- i.
einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und
- ii. auf diesem immobilisierte Enzyme, die wie oben beschrieben,
mittels Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens aus dem Stratum
corneum gewonnen wurden.
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Bei einem Proteinchip handelt es
sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten
Proteinen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
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Häufig
weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf;
man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von
Proteinen auf einem Chip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit
mikrotechnischen Methoden angefertigt werden.
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Im allgemeinen haben Proteinchips
eine 2D-Basisfläche
für das
Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktionellen Materialien.
Die Basisflächen
können
beispielweise auch von Wänden einer
oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein.
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Zum Stand der Technik kann z. B.
auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Nature Genetics,
Vol. 21, supplement (Gesamt), Jan. 1999 (Biochips); Nature Biotechnology,
Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (Biochips); Trends in Biotechnology,
Vol. 16, S. 301-306, Jul. 1998 (Biochips) sowie die Übersichtsartikel
von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes
and genomes", Nature,
Volume 405, Number 6788, 837 – 846 (2000),
und „Genomics,
gene expression and DNA arrays",
Nature, Volume 405, Number 6788, 827 – 836 (2000), und die dort
angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
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Eine übersichtliche Darstellung der
praktischen Anwendungsverfahren der DNA-Chiptechnologie, die teilweise
auf die Protein-Chiptechnologie übertragen
werden können,
liefern die Bücher „DNA Microarrays:
A Practical Approach" (Editor:
Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und „Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000,
Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen
wird.
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Für
die Herstellung kleiner (bis etwa 500 Sonden umfassender) Proteinchips
sind die in der DE-A-100 28 257.1-52 und in der DE-A-101 02 063.5-52
genannten Analysechips ganz besonders bevorzugt.
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Der erfindungsgemäße Proteinchip umfasst bevorzugt
1 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 100, besonders bevorzugt
etwa 1 bis etwa 50 und ganz besonders bevorzugt etwa 4 bis etwa
8 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander verschiedenen
Sonden können
jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist die Verwendung von Enzymen, die wie oben beschrieben, mittels
Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
aus dem Stratum corneum gewonnen wurden, zur Bestimmung des enzymatischen
Status humaner Haut in vitro.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen
oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Homeostase humaner Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) den enzymatischen Status humaner Haut durch
ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels
eines erfindungsgemäßen Test-Kits
zur Bestim mung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels
eines erfindungsgemäßen Proteinchips
bestimmt,
- b) einen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Homeostase humaner Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) erneut den Hautstatus humaner Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels
eines erfindungsgemäßen Test-Kits
zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels
eines erfindungsgemäßen Proteinchips
bestimmt, und
- d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse
aus a) und c) ermittelt.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder
pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Homeostase humaner Haut, umfassend Mittel zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Testverfahrens.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist die Verwendung von Enzymen, die wie oben beschrieben, mittels
Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
aus dem Stratum corneum gewonnen wurden, zum Nachweis der Wirksamkeit
von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen
oder Beeinträchtigungen
der Homeostase humaner Haut, insbesondere gegen Neurodermitis, Sonnenbrand,
Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne,
Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom,
Hautsarkomin, Vitiligo, Acne, Fettige/trockene Gesichthaut.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Screening-Verfahren
zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen
gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Homeostase humaner Haut in vitro, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man
- a) den enzymatischen Status humaner Haut durch
ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels
eines erfindungsgemäßen Test-Kits
zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels
eines erfindungsgemäßen Proteinchips
bestimmt,
- b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Homeostase humaner Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) den enzymatischen Status humaner Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels
eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur
Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels eines
erfindungsgemäßen Proteinchips
bestimmt, und
- d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus
a) und c) bestimmt.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist die Verwendung von Enzymen, die wie oben beschrieben, mittels
Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
aus dem Stratum corneum gewonnen wurden, zur Identifikation von
kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen
oder Beeinträchtigungen
der Homeostase humaner Haut.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen
Zubereitung gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner
Haut, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a)
wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens, oder
der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen
Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner
Haut bestimmt und
- b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch
geeigneten und verträglichen
Trägern
vermischt.
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Die folgenden Beispiele erläutern die
Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
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Beispiel 1: Gewinnung
der Enzyme aus dem Stratum corneum
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Es werden nacheinander 10 Stripes
von 10 cm Länge
eines transparenten farblosen Tesafilms (Fa. Beiersdorf) auf die
zu untersuchende Hautstelle aufgeklebt, fünfmal mit einer Rolle darüber gerollt und
wieder abgezogen. Die Stripes werden in 0,1 M Kaliumphosphatpufter,
pH 8.0 incl. 0.1% TritonX100 aufgenommen und 4 mal 5 min mit Ultraschall
behandelt. Die Tapes werden anschließend verworfen und das die
Hautenzyme enthaltene Eluat mit einem Miniplus Concentrator (YM10
Membran) um den Faktor 10 aufkonzentriert.
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Beispiel 2: Durchführung des
Lipaseassay
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300 μl des nach der Beschreibung
in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 10
mM Methylumbelliferylpalmitat (Fa. Bachem) Lösung in 500 μl 0.1 M Kaliumphosphatpufter,
pH 8.0 gegeben und bei 37°C
inkubiert. Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem
Ansatz entnommen, zu 190 μl
0.2 M NaHCO3-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader
bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
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Beispiel 3: Durchführung des
Glucuronidaseassay
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300 μl des nach der Beschreibung
in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 10
mM Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid
(Fa. Sigma) Lösung
in 500 μl
0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0 gegeben und bei 37°C inkubiert.
Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem Ansatz entnommen,
zu 190 μl
0.2 M NaHCO3-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader
bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
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Beispiel 4: Durchführung des
Phosphataseassay
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300 μl des nach der Beschreibung
in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 10
mM Methylumbelliferylphosphat (Fa. Sigma) Lösung in 500 μl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer,
pH 8.0 gegeben und bei 37°C
inkubiert. Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem
Ansatz entnommen, zu 190 μl
0.2 M NaHCO3-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader
bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
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Beispiel 5: Durchführung des
Sulfataseassay
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300 μl des nach der Beschreibung
in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 10
mM Methylumbelliferylsulfat (Fa. Sigma) Lösung in 500 μl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer,
pH 8.0 gegeben und bei 37°C
inkubiert. Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem
Ansatz entnommen, zu 190 μl
0.2 M NaHCO3-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader
bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
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Beispiel 6: Durchführung des
Neuraminidaseassay
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300 μl des nach der Beschreibung
in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 1
mM 2'-(Methylumbelliferyl)-⧠-D-neuraminsäure (Fa.
Sigma) Lösung
in 500 μl
0.1 M Kaliumphosphatpufter, pH 8.0 gegeben und bei 37°C inkubiert.
Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem Ansatz entnommen,
zu 190 μl
0.2 M NaHCO3-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader
bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
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Beispiel 7: Durchführung des
Proteaseassays
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55 μl des nach der Beschreibung
in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 45 μl einer Multifluorophor-Casein-Lösung (50 μg/ml) gegeben. Die
Fluoreszenzemission wird über
120 min verfolgt (Ex/Em 485/520 nm).