DE102013015560A1

DE102013015560A1 - Ex vivo Kulturen auf Basis humaner Talgdrüsen und deren Verwendung als Screening Werkzeug

Info

Publication number: DE102013015560A1
Application number: DE201310015560
Authority: DE
Inventors: Paolo Pertile; Michele Massironi
Original assignee: Symrise AG; Cutech SRL
Current assignee: Symrise AG
Priority date: 2013-09-20
Filing date: 2013-09-20
Publication date: 2015-03-26

Abstract

Vorgeschlagen wird die Verwendung menschlicher Talgdrüsen zur Schaffung eines ex-vivo Modells zur Untersuchung des Stoffwechsels der Talgproduktion in der menschlichen Haut und ihren Anhängen.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung von Screening-Verfahren auf der Grundlage des Aufbaus und der Beschreibung organotypischer Kulturen menschlicher Talgdrüsen. Insbesondere werden die Talgdrüsen von der menschlichen Haut und ihren Anhängen mikrodissektiert und danach in Kultur gehalten zur Untersuchung der biologischen Aktivität und/oder der Toxizität von durch das Nährmedium verabreichten Wirkstoffen oder Behandlungen. Die Erfindung umfasst zur Bewertung der Auswirkungen der experimentellen Behandlungen auf die Stoffwechselleistung der Talgdrüsen erstellte Analyseverfahren.
Die Screening-Verfahren werden vorgeschlagen für die Untersuchung der Auswirkungen von therapeutischen, kosmetischen und nutrazeutischen Verbindungen oder Zubereitungen, die für die Behandlung der Haut und ihrer Anhänge bestimmt sind. Das Modell wird ebenfalls vorgeschlagen zur Untersuchung erwünschter oder unerwünschter Auswirkungen, die von Stoffen oder Materialien herrühren, die für die Herstellung von Produkten verwendet werden, die in direktem Kontakt mit der Haut und deren Anhängen verbleiben sollen.
Hintergrund der Erfindung
Die Talgdrüsen sind mikroskopisch kleine Drüsen, die verstreut in der Haut vorliegen und eine ölige Substanz ausscheiden, die Talg genannt wird, um die Haut und das Haar von Säugetieren einzufetten und wasserundurchlässig zu halten. Der Talg trägt dazu bei, den Wasserverlust durch die Haut zu verhindern. Gleichzeitig ernährt und steuert der Talg die auf der Haut lebende Mikroflora. Aus diesen Gründen haben die Talgdrüsen eine erhebliche Auswirkung auf den Stoffwechsel und das Wohlbefinden der Haut. Eine übermäßige Ausscheidung von Talg verleiht der Haut ein glänzendes und unerwünschtes Aussehen (fettige Haut) und kann zur Bildung von Mitessern führen (schwarze Spitzen und weiße Spitzen), d. h. Haarfollikelporen, die von einer Mischung aus Keratin (Hautresten) und Talg verstopft sind. Eine schwerwiegende Überproduktion von Talg kann das Auftreten von Acne vulgaris auslösen, einer Hautkrankheit, die gekennzeichnet ist durch die Entzündung der verstopften Follikelporen, auch aufgrund der Ansiedlung und Vermehrung von Bakterien. Eine Entzündung nahe der Hautoberfläche erzeugt eine Pustel; eine tieferliegende Entzündung ergibt eine Papel (Pickel); wenn die Entzündung noch tiefer liegt, bildet sie eine Zyste.
Im Falle einer unzureichenden Talgproduktion kann die Haut ein trockenes und verletzliches Aussehen haben.
Natürlich hat die Hautkosmetik ein starkes Interesse an der Entwicklung von Zubereitungen, die zur Regulierung der Tätigkeit der Talgdrüsen geeignet sind. Leider liegen bisher keine gültigen Versuchsmodelle vor, die als Versuchsmodell zum Screening von Wirkstoffen und von Behandlungen geeignet sind. Das einzige gegenwärtig angewendete Verfahren zur Untersuchung der Regulierung der Talgproduktion basiert auf isolierten Talgdrüsenzelllinien (Sebozyten), die kultiviert und mit Verbindungen behandelt werden können, die potentiell geeignet sind, ihren Stoffwechsel zu regulieren oder ihre Vitalität zu beeinflussen (vgl. US 2012 225445 A1 ). Jedoch besitzen die isolierten Zellen Lebenszyklen und eine metabolische Reaktionsfreudigkeit, die sich erheblich von denen der ex-vivo-Talgdrüsen unterscheiden. Letztere besitzen eine beerenförmige Form, wobei die undifferenzierten Sebozyten sich in der äußeren Schicht vermehren und dann zunehmend in Richtung der inneren Höhlung migrieren, wobei sie einen Differenzierungsprozess unterlaufen. Am Ende dieser Differenzierung, während der die Sebozyten aktiv Lipide aufbauen und einlagern, platzen sie auf, wobei sie die vorher aufgebaute ölige Substanz in das Drüsenlumen abgeben.
Natürlich beeinflusst die gegenseitige Beziehung der am anatomischen Aufbau der Drüse beteiligten Sebozyten stark ihr biologisches Verhalten. Demzufolge verbessert die Möglichkeit der Erstellung eines technischen für die Kultivierung, Behandlung und Analyse menschlicher Talgdrüsen geeigneten Protokolls erheblich die für das Screening und die Charakterisierung aktiver Wirkstoffe verfügbaren Arbeitsmittel der hautkosmetischen Industrie.
In der wissenschaftlichen Literatur gibt es einige Beispiele für die Technik der Herauslösung und Kultivierung menschlicher Talgdrüsen. Middelton et al. [FEBS Letters, 231: S. 59–61, (1988)] kultivierten über 17–20 Stunden aus Gesichts- und Nackenhaut gewonnene Drüsen. Ridden et al. [J. Cell Sci., 95: S. 125–136, (1900)] kultivierten Talgdrüsen über 7 bis 15 Tage und untersuchten die Auswirkungen von Testosteron und Retinsäure auf den Vorgang der Lipogenese. Downie und Kealey kultivierten aus Brust- und Oberkörperhaut isolierte Drüsen zur Untersuchung der Talgzusammensetzung und die Rolle einiger isotopenmarkierten Vorläufer im Stoffwechsel [J. Invest. Dermatol., 111: S. 199–205 (1998)]
All diese Beispiele der Kultivierung von Talgdrüsen wurden durchgeführt zur Untersuchung und zum besseren Verständnis spezifischer Aspekte der Biologie und Regulierung der Drüsen, jedoch erwiesen sich die beschriebenen Analysetechniken als ungeeignet zur routinemäßigen Anwendung in Screening-Untersuchungen. Andererseits ist keinerlei Stand der Technik hinsichtlich der Aufgabe der vorliegenden Erfindung verfügbar, d. h. ein standardisiertes Versuchsmodell, welches das technische Protokoll zur Kultivierung, Behandlung und schlussendlichen Analyse von ex vivo Talgdrüsen umfasst sowie Kriterien entspricht, die mit dem routinemäßigen Screening von Verbindungen für kosmetische Anwendungen vergleichbar sind.
Gegenstand der Erfindung
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung menschlicher Talgdrüsen zur Schaffung eines ex-vivo Modells zur Untersuchung des Stoffwechsels der Talgproduktion in der menschlichen Haut und ihren Anhängen.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung umfassen die Verwendung des Modells

(a) zur Untersuchung der Wirkungen der Anwendung von entweder topisch oder systemisch angewendeten Substanzen, für pharmakologische, kosmetische oder kosmezeutische Anwendungen;
(b) zur Erstellung eines Toxizitätstests zum Screening von Verbindungen und Behandlungen, die auf dermatologische und kosmetische Anwendungen ausgerichtet sind;
(c) zur Erstellung einer Screening-Methode auf der Grundlage der Bestimmung der Freisetzung von freiem Glycerin in dem Nährmedium mit dem Ziel der Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen für dermatologische und kosmetische Anwendungen;
(d) zur Erstellung einer Screening-Methode auf der Grundlage der Bestimmung des Gesamtlipidgehalts und des Gesamtproteingehalts in den kultivierten Organen mit dem Ziel der Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen für dermatologische und kosmetische Anwendungen;
(e) zur Erstellung einer Screening-Methode auf der Grundlage der Quantifizierung der Enzyme und Rezeptoren der Sebozyten durch da Western Blot-Verfahren mit dem Ziel der Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen für dermatologische und kosmetische Anwendungen;
(f) zur Erstellung einer Screening-Methode auf der Grundlage der Quantifizierung der Enzyme und Rezeptoren der Sebozyten durch das RTqPCR-Verfahren mit dem Ziel der Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen für dermatologische und kosmetische Anwendungen; sowie
(g) zur Untersuchung der Wirksamkeit von Substanzen für Formulierungen mit biologischer Aktivität, wie entzündungsfördernde, entzündungshemmende, antibakterielle, antimykotische, antiprotozoische, antivirale, antitumorale, ätzende Wirkstoffe.

Bearbeitung des Hautgewebes und Herauslösen der Talgdrüsen (TD)
Die in diesem Modell verwendeten Hautproben stammen vorzugsweise von an der Kopfhaut vorgenommenen Eingriffen der plastischen Chirurgie. Tatsächlich ist die Kopfhaut besonders reich an Talgdrüsen und die Einheiten aus Haar, Haarfollikel und Talgdrüse der Kopfhaut großformatig, was ihre Mikrodissektion und Handhabung erleichtert.
Die Hautproben weisen alle Gewebeschichten auf, die in vivo vorhanden sind (d. h. Hornschicht, Epidermis, Dermis, Subcutis sowie Blutgefäße (nicht durchflossen), Hautanhangsgebilde (z. B. Haarfollikel, Talgdrüsen) und alle dazugehörigen Zellarten, wie Epithelzellen, Keratinozyten, Fibroblasten, dendritische Zellen, Melanozyten, Sebozyten usw. Nach dem Ausschneiden der Kopfhautproben werden sie in 50-ml-Röhrchen gegeben, die ca. 40 ml Transportmittel enthalten. Die Röhrchen werden bei 4°C gehalten bis zu ihrer Lieferung an das Labor zur Weiterverarbeitung. Das Transportmittel bietet sowohl einen wirksamen Schutz der Hautproben gegen eine mögliche bakterielle Kontamination während des Transports als auch eine optimale Erhaltung der Hautgewebeeigenschaften. Ein geeignetes Transportmittel ist aus Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit einem Zusatz von Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) zusammengesetzt. Es empfiehlt sich, dass der Transport der Proben von der chirurgischen Klinik in das Labor in vorzugsweise weniger als 4 Stunden vorgenommen wird.
Das Gewebe wird wie im Folgenden beschrieben für die Mikrodissektion der Talgdrüsen (TD) vorbereitet:

• Die Haut wird unter einer Abzugshaube gegen biologische Gefahren aus dem Transportmittel entnommen und in eine Petrischale gegeben.
• Die Haare (Schafte) werden mit einem Skalpell entfernt, wobei darauf geachtet wird, dass die Epidermis nicht beschädigt wird.
• Die Haut wird in kleine Teile geschnitten (ca. 4 × 4 mm).
• Die geschnittenen Teile werden in eine Petrischale gegeben, die mit DMEM gefüllt ist und auf einer Kühlplatte liegt.
• Das Unterhautfett wird vorsichtig entfernt. In diesem Schritt darf die Hautschicht nicht beschädigt werden.
• Der Dermalteil der Hautproben wird mit einem Skalpell in sehr dünne Streifen geschnitten (ca. 1 × 4 mm).
• Im Allgemeinen weisen diese Hautstreifen zwischen 2 und 5 Einheiten aus Haar, Haarfollikel und Talgdrüse auf.
• Die mit dem Haarfollikel verbundenen Talgdrüsen werden mit außerordentlicher Vorsicht mittels Mikroschere und Skalpell entfernt.
• Die entfernten Drüsen werden in eine gekühlte Petrischale gegeben, die ein Nährmedium enthält.

Das verwendete Nährmedium wurde speziell angefertigt, in dem es mit Williams' Medium E versetzt wird. Seine Endzusammensetzung ist original, aber vergleichbar mit dem von Ridden et al. [J. Cell Sci., 95: S. 125–136 (1999)] vorgeschlagenen Medium.
Talgdrüsenkulturen
Die nachfolgend beschriebenen Experimente beruhten auf Talgdrüsen-Kulturen, die in 6-Loch-Platten kultiviert wurden, sofern nichts anderes angegeben ist. In jedes Kulturloch wurden 3,5 ml des Mediums aufgetragen; die Löcher wiesen einen Polycarbonatfilter (Porengröße 60 μm) auf, der mit acht Talgdrüsen beimpft wurde, die willkürlich aus dem Bestand mikrodissektierter Drüsen ausgewählt wurden. Die Verwendung des Filters gewährleistet, dass die Drüsen im Medium eingetaucht bleiben, so dass ein Anhaften an den Kunststoffboden des Loches und somit die Abwanderung von Sebozyten aus der Drüse heraus verhindert wird. Die TD-Kulturen wurden unter folgenden Bedingungen inkubiert: 5% CO₂, 37°C und 100% Luftfeuchtigkeit. Das Nährmedium wurde jeden zweiten Tag erneuert.
Bei der Durchführung der Versuche wurden die Versuchssubstanzen oder -produkte durch Auflösen im Nährmedium verabreicht zur Nachstellung einer potenziellen systemischen Wirkung. Die Versuchsverbindungen wurden, wenn sie wasserlöslich waren, direkt in dem Nährmedium aufgelöst, oder mit einem geeigneten Trägerstoff versetzt, wenn sie lipophil waren (z. B. mittels DMSO).
Beispiele
Beispiele 1 bis 6
Beschreibung der Organkultur: Überlebensergebnisse der menschlichen Talgdrüsen
Nach einer zweckdienlichen Reihe vorbereitender Experimente wurde ein wirksames Kultivierungsprotokoll entwickelt, das geeignet ist, die kultivierten Organe über den für das Screening benötigten Zeitraum unter guten biologischen Bedingungen zu halten. Um die optimale Zeitberechnung für die Kultivierung zu finden, wurde ein Versuch durchgeführt, der zur Bestimmung der Veränderungen in der Vitalität konzipiert war, die an den Drüsen über den Zeitraum der Kultivierung zu erkennen war.
Die Dissektion und Kultivierung der Talgdrüsen wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Vier Gruppen von jeweils 8 Talgdrüsen wurden in verschiedenen Löchern einer 6-Loch-Platte geimpft und über 18 Tage kultiviert. Die kultivierten TD wurden einem Resazurin-Test unterworfen zur Bewertung ihrer Vitalität an den Tagen 1-4-6-8-11-14-18 der Kultivierung. Kurz gesagt wurde jede Talgdrüsen-Gruppe aus dem Kulturloch entfernt und für 2 Stunden auf eine Mikroplatte mit 200 μl eines 10%igen Resazurin-Nährmediums überführt. Während dieser Zeit wird das Resazurin, eine nicht fluoreszierende blaue Farbe, von den lebenden Zellen auf das rosafarbene und tiefrote fluoreszierende Resorufin reduziert. Am Ende der Inkubation wurde das Medium entnommen und auf Resazurin-Fluoreszenz in einem Plattenlesegerät (Emission: 570 nm – Extinktion: 590 nm) analysiert. Das Fluoreszenzsignal korreliert positiv mit der Vitalität der Talgdrüsen. Da der Resazurin-Test nicht toxisch ist, wurden die Talgdrüsen während der Kultivierungszeit wiederholt untersucht, ohne dass sie Anzeichen von Stress zeigten.
Die an Tag 1 der Kultivierung bestimmte Vitalität, d. h. nach 24 Stunden der Gewöhnung an die Kultivierungsbedingungen, wurde als Referenzwert zur Bestimmung der folgenden Veränderungen in der Vitalität betrachtet, die von den kultivierten Talgdrüsen gezeigt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1 Veränderungen in der Vitalität von Talgdrüsen in Kultur – Werte in Prozent ausgedrückt (± Standardabweichung) unter Annahme der an Tag 1 der Kultivierung bestimmten Vitalität als Referenzwert (100%)

Bsp. Tag der Kultivierung Lebensfähigkeit In Prozent ± Standardabweichung

0 1 100 ± 9

1 4 122 ± 9

2 6 141 ± 16

3 8 128 ± 12

4 11 81 ± 7

5 14 69 ± 7

6 18 45 ± 4
Die erhaltenen Daten belegen, dass sich die TD an die Kultur angepasst haben und eine wachsende Lebensfähigkeit bis Tag 6 zeigten. Diese unerwartete Auswirkung ist vermutlich ein Ergebnis der progressiven Vermehrungs- und Differenzierungsrate der Sebozyten, die in Abwesenheit der regulierenden Signale auftritt, die die Drüsen erhalten, wenn sie in das Hautumfeld integriert sind. Nach Tag 6 erliegen die Kulturen einem langsamen Alterungsprozess.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde festgestellt, dass die Tage 6–8 der Kultivierung die optimale Zeit für Screenings darstellen, welche auf die Regulierung der Menge oder der Qualität des Talgs sowie auf die Untersuchung des Aufbaus von an der Lipogenese der Sebozyten beteiligten Enzymen ausgerichtet sind. Derselbe Zeitplan kann für die Bewertung der Toxizität von experimentellen Behandlungen angewendet werden.
Jedoch empfiehlt sich im Fall von Behandlungen, die für das Wohlbefinden und Lebensfähigkeit der TD durchgeführt werden, die Vitalität der Drüsen an den Tagen 1, 6, 10 und 14 zu untersuchen, damit bewertet werden kann, ob die physiologische Alterung der Kultur als eine Folge von günstigen Behandlungen verzögert wird.
Beispiele 7 bis 12
Toxizitätstest auf der Grundlage einer ex-vivo TD-Kultur
Verbindungen, die als Kandidaten zur Verwendung in hautkosmetischen Behandlungen in Frage kommen, müssen vorbereitend auf ihre potenzielle Toxizität untersucht werden. Das beschriebene, auf kultivierten TD basierende Versuchsmodell stellt ein ideales Screening-Werkzeug zur Untersuchung der Toxizität von zur Regulierung der Talgproduktion bestimmten Verbindungen dar.

In dem folgenden Versuch wurde der Toxizitätstest mit zwei als Maßstab dienenden Verbindungen durchgeführt: Niacinamid und Capsaicin. Die angewendete Kultivierungsmethode und Analyse der Lebensfähigkeit wurden bereits in den vorangehenden Beispielen beschrieben. Kurz gesagt wurden Niacinamid und Capsaicin in dem Nährmedium in drei verschiedenen Konzentrationen aufgelöst, und die TD wurden bis zu Tag 6 kultiviert. Die TD wurden Resazurin ausgesetzt und die resultierenden Vitalitätswerte als Prozentzahl der für die Kontrollgruppe bestimmten Lebensfähigkeit (angenommen als Referenzwert = 100%) ausgedrückt. Die Daten sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Toxizitätstest auf der Grundlage der Kultivierung menschlicher TD bis zu Tag 6. Die Lebensfähigkeit der mit Capsaicin und Niacinamid behandelten Gruppen ist als Prozentzahl ausgedrückt (± Standardabweichung) der für die Kontrollgruppe bestimmten Lebensfähigkeit (angenommen 100%).

Bsp.	Behandlung	Menge	Lebensfähigkeit*
0	Kontrollgruppe	0	100 ± 6
7	Capsaicin	0,1 μM	107 ± 12
8	Capsaicin	1 μM	90 ± 12
9	Capsaicin	10 μM	88 ± 10
10	Niacinamid	0,01%	96 ± 9
11	Niacinamid	0,1%	65 ± 8
12	Niacinamid	1%	13 ± 6

*in Prozent gegenüber Kontrollgruppe an Tag 6

Unter der Annahme von 80% Lebensfähigkeit als Grenzwert, bei dem begonnen wird, eine toxische Wirkung festzustellen, bringen uns die Versuchsergebnisse zu der Schlussfolgerung, dass Capsaicin in den drei untersuchten Konzentrationen nicht toxisch ist, wohingegen Niacinamid bereits bei 0,1% eine toxische Wirkung entfaltet.
Das beschriebene Modell erweist sich als geeignet für das Screening der Toxizität von hautkosmetischen Wirkstoffen für die Behandlung von Talgdrüsen.
Beispiele 13 bis 22
Screening von Regulatoren der Talgproduktion auf der Grundlage der Freisetzung von freiem Glycerin
Ein Screening-Protokoll wurde mit der Absicht der Offenbarung geeigneter Wirkstoffe zur Regulierung der Talgproduktion erstellt. Das Protokoll ermöglicht die Kultivierung von TD, gefolgt von dem Ergebnis der Analyse auf freies Glycerin in dem konditionierten Nährmedium. Für dieses spezielle Protokoll wurden die TD in 24-Loch-Platten kultiviert, wobei 8 TD/Loch in 500 μl Medium geimpft wurden.
Glycerin ist ein Nebenprodukt des Triglyceridabbaus, der während der Stoffwechselprozesse auftritt und die Talgproduktion in den Sebozyten steuert. Da die kultivierten TD den Talg in dem Nährmedium freisetzen und das Glycerin hoch wasserlöslich ist, ermöglicht die auf dem Nährmedium durchgeführte Untersuchung auf freies Glycerin eine indirekte Schätzung der Talgproduktion.
In dem folgenden beispielhaften Versuch wurde das von einer Kontrollgruppe unbehandelter Talgdrüsen freigesetzte freie Glycerin mit der Menge verglichen, die von mit Capsaicin in drei verschiedenen Konzentrationen (d. h. 0,1 μM, 1 μM und 10 μM) behandelten TD freigesetzt wurde. Vier Gruppen, die jeweils 8 TD umfassten, wurden für 24 Stunden kultiviert (Tag 1 der Kultivierung) und danach wurde das Nährmedium mit zusätzlichen Medien erneuert (oder mit Standardmedium im Fall der Kontrollgruppe), um die experimentellen Behandlungen zu beginnen. Direkt im Nährmedium gelöstes Capsaicin hemmt generell die Talgproduktion und wurde hier als Maßstab für die Hemmung der Freisetzung von freiem Glycerin verwendet. Die Nährmedien wurden jeden zweiten Tag erneuert (d. h. an Tag 3, 5 und 7 der Kultivierung). Um zu bestimmen, was der optimale Zeitpunkt zur Bewertung der Konzentration von freiem Glycerin ist, wurde die Freisetzung von freiem Glycerin an Tag 3, 5 und 7 der Kultivierungszeit geschätzt (d. h. an Tag 2, 4 und 6 der Behandlung).
Die Bestimmung der Konzentration von freiem Glycerin wurde mittels eines im Handel erhältlichen Kit von Sigma Aldrich (cat# F6428) erhalten. Jedoch wurden in unserem Protokoll die Volumina der untersuchten Proben und Reagenzien neu berechnet, um die Analyse auf die hier vorgeschlagene spezifische Verwendung funktional anzupassen. Kurz gesagt wurden 25 μl des Nährmediums zu 200 μl von „Free Glycerol Reagent” gegeben und bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Minuten inkubiert in Abhängigkeit von der Glycerinkonzentration der Probe. Free Glycerol Reagent misst freies Glycerin mit Hilfe der Reaktion mit einer Quinoniminfarbe, die bei 540 nm ein Absorptionsmaximum zeigt. Nach der Inkubierung wurden die Reaktionsmischungen einer spektrometrischen Analyse bei 540 nm unterzogen und die endgültigen Glycerinkonzentrationen mittels einer geeigneten Normkurve geschätzt.

Das durch die behandelten Drüsen erzeugte freie Glycerin wurde als Prozentsatz des Betrages angegeben, der von der Kontrollgruppe erzeugt wurde (Tabelle 3). Um falsche Reaktionen aufgrund der Mortalität der Kulturen auszuschließen, wurde der Toxizitätstest an allen kultivierten Talgdrüsen durchgeführt, was ihre gute Vitalität bescheinigt. Tabelle 3 Aktivität von Capsaicin auf die Talgproduktion in kultivierten TD, geschätzt durch die Analyse des freien Glycerins an Tag 3, 5 und 7 der Kultivierung – Die Werte sind als Prozentsatz des Ergebnisses der Kontrollgruppe ± Standardabweichung angegeben

Bsp.	Behandlung	Menge	Tage der Kultivierung	Freies Glycerin*
0	Kontrollgruppe	0	Tag 3	100 ± 2
13	Capsaicin	0,1 μM		51 ± 2
14	Capsaicin	1 μM		112 ± 2
15	Capsaicin	10 μM		121 ± 4
16	Kontrollgruppe	0	Tag 5	100 ± 3
17	Capsaicin	0,1 μM		2 ± 2
18	Capsaicin	1 μM		1 ± 1
19	Capsaicin	10 μM		1 ± 1
0	Kontrollgruppe	0	Tag 7	100 ± 7
20	Capsaicin	0,1 μM		12 ± 8
21	Capsaicin	1 μM		1 ± 1
22	Capsaicin	10 μM		5 ± 4

*in Prozent gegenüber der Kontrollgruppe ± Standardabweichung

Die Ergebnisse bescheinigen, dass die Freisetzung von freiem Glycerin durch das Capsaicin in allen Konzentrationen der Behandlung seit Tag 5 der Kultivierung (Tag 4 der Behandlung) wesentlich gehemmt wurde. Dies bestätigt auch, dass das konzipierte Protokoll wirksam die Auswirkungen von experimentellen Behandlungen auf die Talgproduktion darstellen kann, während der optimale Zeitpunkt zur Messung der ausgelesenen Parameter am Tag 5 der Kultivierung ist.
Beispiele 23 bis 25
Screening von Regulatoren der Talgproduktion auf der Grundlage der Schätzung des Gesamtlipidgehalts in den Talgdrüsen
Ein Screening-Protokoll wurde auf der Grundlage der Quantifizierung des Gesamtlipidgehalts in kultivierten TD erstellt, das geeignet ist zur Offenbarung der Auswirkungen potenzieller Regulatoren der Talgproduktion. Das Protokoll gestattet die Kultivierung der TD, gefolgt von der Quantifizierung des Lipid- und Proteingehalts in den Drüsen.
Die Auswirkungen der experimentellen Behandlungen auf die Speicherung von Lipiden in kultivierten TD werden offenbart, in dem der in behandelten Drüsen geschätzte Lipidgehalt mit der Kontrollgruppe unbehandelter Drüsen, die von denselben Spendern entnommen wurden, verglichen wird. Ein spezifisches Lipidextraktionsprotokoll wurde erstellt, um eine Zubereitung zu erhalten, die mittels IR Spektroskopie analysiert werden kann. Jedoch ist das diesem Protokoll inhärente konzeptuelle Problem, dass – um die Gesamtlipidmengen vergleichbar zu machen, die in verschieden großen TD gefunden wurden – es notwendig ist, die Rohdaten aus der spektroskopischen Analyse zu normieren. Versuche, dieses Problem durch eine Schätzung des TD-Gewichts zu überwinden, waren erfolglos. Die gültige Lösung wurde erhalten durch eine Schätzung – nach der Lipidextration – des Gesamtproteingehalts der Drüse und der Division der extrahierten Gesamtlipide durch den Gesamtproteingehalt. Der erhaltene Parameter kann als ”normierter Gesamtlipidgehalt” (Lipide in g/Proteine in g) definiert werden, d. h. die Menge von Lipiden pro Gramm (oder mg) der Proteine in den kultivierten TD. Tatsächlich fördert die Anregung der Lipogenese in den Sebozyten den Aufbau und die Einlagerung von Lipiden, während sie nicht wesentlich den Stoffwechsel der Strukturproteine beeinflusst. Wenn die Lipogenese in den TD angeregt wird, ist als Ergebnis eine Erhöhung des Verhältnisses des Gesamtlipidgehalts/Gesamtproteingehalts zu erwarten. Nach einer konsistenten Reihe von Versuchen wurde das Protokoll entwickelt, das für die Durchführung des nachfolgend berichteten Experiments angewendet wurde, welches die Wirksamkeit der biologischen Aktivität zweier als Maßstab dienender Verbindungen zeigt: Capsaicin zur Hemmung der Lipogenese und Rosiglitazon zu deren Anregung.
Organkulturen mikrodissektierter Talgdrüsen wurden wie oben in der Beschreibung des Modells dargelegt erzeugt. Gruppen von jeweils 8 Drüsen wurden mit zwei verschiedenen Reizstoffen behandelt: mit dem Talgproduktionshemmer Capsaicin zu 1 und 10 μM und dem Talgproduktionsanreger Rosiglitazon zu 10 μM. Die Wirkung der Behandlungen auf die Talgproduktion wurde geschätzt durch Messen des Verhältnisses zwischen dem Gesamtlipidgehalt und Gesamtproteingehalt in den behandelten Drüsen und nachfolgendem Vergleich der Ergebnisse mit denselben ausgelesenen Parametern, die in den unbehandelten Drüsen geschätzt wurden (Kontrollgruppe).
Das zur Analyse der Talgdrüsen angewendete Vorgehen ist in dem nachfolgenden Protokoll beschrieben:

1. Jede TD-Gruppe wird in 100 μl Isopropylalkohol homogenisiert;
2. Die Probe wird bei 14.000 G für 5 Minuten zentrifugiert, und danach wird der Überstand (enthaltend die extrahierten Lipide) gesammelt;
3. Der Lipidextrakt wird mittels eines Direct Detect IR Spectrometer (Millipore) analysiert, wodurch die Gesamtkonzentration an Lipiden des Überstands (mg/ml) ermittelt wird;
4. Der Gesamtlipidgehalt der TD wird quantifiziert, indem die Lipidkonzentration des Überstands (Fraktion 3) mit dem Volumen des für die Lipidextraktion verwendeten Isopropylalkohol (Fraktion 1) multipliziert wird;
5. Der aus Fraktion 2 verbleibende Rückstand wird mit einem Vakuumverdampfer dehydriert und danach erneut homogenisiert in 50 μl eines Proteolysepuffer (20 mM Tris/HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 2 mM DTT, 1% Proteasehemmermischung);
6. Diese Extraktionsmischung wird bei 14.000 G für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand gesammelt und mittels eines Direct Detect IR Spectrometer (Millipore) analysiert;
7. Die erhaltene Gesamtproteinkonzentration wird mit dem extrahierten Volumen (Fraktion 5) multipliziert, um den Gesamtproteingehalt der TD zu quantifizieren.
8. Der Gesamtlipidgehalt (Fraktion 4) wird durch den Gesamtproteingehalt dividiert (Fraktion 7), um die Menge der Lipide pro mg im Verhältnis zu den behandelten TD zu erhalten.

Die Mengen der normierten Lipide, die aus den behandelten Gruppen erhalten wurden, wurden in Prozentzahlen bezüglich des in der Kontrollgruppe erhaltenen Wertes ausgedrückt; die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Analyse des Gesamtlipidgehalts nach 6 Tagen der Behandlung mit Capsaicin und Rosiglitazon – in Prozent gegenüber der Kontrollgruppe ± Standardabweichung

Bsp. Behandlung Menge Gesamtlipidgehalt*

0 Kontrollgruppe 0 100 ± 8

23 Capsaicin 1 μM 88 ± 7

24 Capsaicin 10 μM 63 ± 6

25 Rosiglitazon 10 μM 128 ± 8

*in Prozent gegenüber der Kontrollgruppe
Die Ergebnisse bestätigen die erwartete biologische Aktivität von Capsaicin und Rosiglitazon und bescheinigen die Eignung des vorgeschlagenen Protokolls für die Untersuchung der Regulierung der Lipogenese in Talgdrüsen.
Beispiele 26 bis 27
Screening von Regulatoren der Talgproduktion auf der Grundlage der Kultivierung von Talgdrüsen und nachfolgender Quantifizierung nach dem Western Blot-Verfahren von an der Lipogenese beteiligten Enzymen
Die Regulierung der Lipogenese in kultivierten Talgdrüsen wurde ebenfalls untersucht mittels einer Analyse der Auswirkungen von Verbindungen, die auf an der Talgbildung beteiligte Schlüsselenzyme wirken. In diesem Fall wurde die Enzymquantifizierung nach dem Western Blot-Verfahren erstellt.
Nach dem folgenden Verfahren können an der Talgfettbildung beteiligte Enzyme quantifiziert werden. FADS2 ist ein Bestandteil eines Lipidstoffwechselweges, der die essentiellen Fettsäuren Linoleat und Alpha-linoleat in langkettige polyungesättigte Fettsäuren umsetzt. FADS2 wurde aufgrund seiner Bedeutung als Schlüsselenzym bei der menschlichen Talgbildung gewählt. Jedoch kann dieses Verfahren ebenfalls für die Quantifizierung von anderen an der Talgproduktion beteiligten Enzymen verwendet werden, wie, unter anderem, zum Beispiel Stearoyl-Coenzyme A Desaturase (SCD).
Das Screening-Protokoll gestattet die vorläufige Kultivierung von TD bis zu Tag 6 wie in den vorangehenden Beispielen dargestellt. Um eine verlässliche Quantifizierung des FADS2-Enzyms zu erhalten, wurde das folgende Protokoll verwendet:

1. jede TD-Gruppe wird mit einem Plastikstößel in einem Eppendorf-Röhrchen von 1,5 ml homogenisiert, in Eis, mit 50 μl Lysepuffer (20 mM Tris/HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 2 mM DTT, 1% Proteasehemmermischung);
2. Die extrahierte Mischung wird bei 14.000 G für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
3. Danach wird der Überstand (üblicherweise zwischen 0,8 und 1,5 μg/μl an extrahierten Proteinen enthaltend) gesammelt und mittels einem Direct Detect IR Spektroskop (Millipore) analysiert;
4. Die extrahierten Proteine werden getrennt durch Denaturierung und Reduktion von SDS PAGE in 4–12% Bis-Tris Polyacrylamide und MES als Puffer (Life Technologies-Invitrogen);
5. Die Proteine werden auf eine Nitrozellulosemembran überführt mittels iBlot Dry System (Life Technologies-Invitrogen);
6. Die Western Blot-Analyse wird durchgeführt durch Blockierung der Membran mit 5% BSA in TBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur;
7. Die Membran wird in TBST über Nacht bei 4°C mit Primärantikörper FADS2 hybridisiert (abcam cat# ab-72189) und danach für 45 min bei Raumtemperatur mit IR-dyemarkierten Sekundärantikörpern in TBST;
8. Das Signal wird mittels Infrarot-Scanning-Bildgebung ermittelt (Li-Cor Odyssey);
9. Die Normalisierung der Daten wird auf der Grundlage des Beta-Actin-Gehalts durchgeführt.

Das beschriebene Protokoll wurde angewendet zum Screening der biologischen Aktivität eines bekannten Lipogenese-Stimulators, 10 μM Rosiglitazon, sowie eines bekannten Hemmers, 6 nM Estradiol.
Am Ende der Kultivierung (Tag 7), wurde das FADS2-Enzym in den verschiedenen Versuchsgruppen der TD quantifiziert und die erhaltenen Ergebnisse sind als Prozentwerte der in der Kontrollgruppe nachgewiesenen Menge ausgedrückt, wie in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Quantifizierung von FADS2 nach 6 Tagen der Behandlung mit Rosiglitazon und Estradiol. Die Daten werden in Prozent angegeben gegenüber der Kontrollgruppe ± Standardabweichung

Bsp. Behandlung Menge FADS2-Quantifizierung

0 Kontrollgruppe 0 100 ± 1

26 Rosiglitazon 10 μM 96 ± 1

27 Estradiol 6 nM 108 ± 1

*in Prozent gegenüber der Kontrollgruppe
Die Behandlungen ergaben eine sehr mäßige Regulierung des FADS2-Enzyms, jedoch in der erwarteten Richtung. Das Protokoll gestattete eine Quantifizierung des Zielenzyms mit hoher Effizienz und Genauigkeit.
Beispiele 28 bis 30
Screening von Regulatoren der Talgproduktion auf der Grundlage der Kultivierung von Talgdrüsen und folgender RTqPCR-Analyse der an der Regulierung der Lipogenese beteiligten Kernrezeptoren.
Die Regulierung der Lipogenese in kultivierten Talgdrüsen wurde ebenfalls untersucht, indem die Auswirkungen von Verbindungen untersucht wurden, die aktiv auf die an der Regulierung des Fettstoffwechsels der Sebozyten beteiligten Proteinrezeptoren wirken. Die Expression von Genen, die Rezeptoren kodieren, die die Regulierung der Lipogenese in Sebozyten steuern, wurde durch eine RTqPCR-Analyse bestimmt.
Das folgende beispielhafte Experiment wurde konzipiert, um als Maßstab dienende Verbindungen zu screenen, die auf die Expression von PPAR-alpha und PPAR-gamma Rezeptoren wirken.
PPARs sind Mitglieder der nukleären Hormonrezeptorenfamilie, die Heterodimere mit Retin-X-Rezeptoren bilden und als Transkriptionsregulatoren auf eine Vielfalt von Genen wirken, einschließlich jener, die an dem Fettstoffwechsel in Fettgewebe, Leber und Haut beteiligt sind.
Der PPAR-alpha-Rezeptor ist in einer Vielzahl von menschlichen Geweben exprimiert, und es hat sich erwiesen, dass er eine entscheidende Rolle in der Regulierung der Aufnahme, Aktivierung und Beta-Oxydation von Fettsäuren in der Zelle spielt. PPAR-gamma ist hauptsächlich in Fettgewebe angeordnet. Es gibt klare Hinweise darauf, dass PPAR-gamma ein wichtiger Promotor der Adipozytendifferenzierung ist.
PPARs sind ebenfalls in der immortalisierten menschlichen Sebozytenzelllinie (SZ95) exprimiert. In der Literatur ist offenbart, dass Behandlungen von isolierten menschlichen Talgdrüsen mit bestimmten Liganden von PPAR-alpha und PPAR-gamma die Lipogenese verringern.
Das folgende Experiment ist beispielhaft für das Screening-Protokoll, das auf der RTqPCR Quantifizierung der Genexpression von an der Lipogenese von Sebozyten beteiligten Schlüsselrezeptoren begründet ist. Das beschriebene Verfahren kann ebenfalls für die Quantifizierung von anderen an der Talgproduktion beteiligten Faktoren, wie zum Beispiel, unter anderem, Transient Receptor Potential Vanilloid-1 (TRPV1) verwendet werden.
Die Drüsen wurden wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben kultiviert. 600 pM Estradiol und 10 μM Capsaicin wurden als Hemmer bzw. Stimulans von PPAR Alpha verwendet, wohingegen 10 μM Rosiglitazon als PPAR Gamma-Enhancer verwendet wurde. Am Tag 6 der Kultivierung wurden die Talgdrüsen gesammelt und die PPARs entsprechend dem folgenden Protokoll quantifiziert:

1. Jede TD-Gruppe wird mit einem Plastikstößel in einem Eppendorf-Röhrchen von 1,5 ml, auf Eis, homogenisiert, mit 30 μl Lysepuffer (RNA mini kit Quiagen cat# 74104 Herstellerprotokoll);
2. Die Gesamt-RNA wird spektrophotometrisch quantifiziert mit einem Nanodrop (Thermo Scientific) und ihre Qualität mit Hilfe der Gel-Elektrophorese bewertet.
3. 300 ng der Gesamt-RNA werden retrotranskribiert unter Verwendung von Superscript III Retrotranscriptase und Random Hexamers (Life Technologies);
4. Quantitative PCR-Analyse wird auf einem Rotor-gene 6200 Thermocycler (Qiagen) mit einem qPCR Core Kit No Rox (Eurogentec) durchgeführt. Die folgenden Primer werden zur Erkennung der gewählten Markergene verwendet:
5. Die Datennormalisierung beruht auf der Expression des Referenzgens Ubiquitin C;
6. Die Genexpression und die statistische Analyse werden mit Rotor-gene Software bzw. REST2009 Software durchgeführt.

Entsprechend dem beschriebenen Protokoll wurde die Expression von PPAR-alpha- und PPAR-gamma-Genen in den Versuchsgruppen der Talgdrüsen quantifiziert; die erhaltenen Ergebnisse sind als Prozentwert der in der Kontrollgruppe nachgewiesenen Menge angegeben, wie in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Quantifizierung von PPAR-alpha und PPAR-gamma mRNA nach 6 Tagen der Behandlung mit Capsaicin, Estradiol und Rosiglitazon. Die Daten sind in Prozentwerten gegenüber der Kontrollgruppe angegeben.

Bsp.	Behandlung	Menge	Ausgelesene Parameter	PPARs Quantifizierung
0	Kontrollgruppe	0	PPAR alpha	100
28	Capsaicin	10 μM		160
29	Estradiol	600 pM		81
0	Kontrollgruppe		PPAR gamma	100
30	Rosiglitazon	10 μM	PPAR gamma	138

*in Prozent gegenüber der Kontrollgruppe

Die Ergebnisse bestätigen die erwartete biologische Aktivität von Capsaicin, Estradiol und Rosiglitazon und bescheinigen die Eignung des vorgeschlagenen Protokolls für die Untersuchung der Regulierung der Lipogenese in Talgdrüsen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 2012225445 A1 [0005]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Middelton et al. [FEBS Letters, 231: S. 59–61, (1988)] [0007]
Ridden et al. [J. Cell Sci., 95: S. 125–136, (1900)] [0007]
J. Invest. Dermatol., 111: S. 199–205 (1998) [0007]
Ridden et al. [J. Cell Sci., 95: S. 125–136 (1999)] [0014]

Claims

Verwendung menschlicher Talgdrüsen zur Schaffung eines ex-vivo Modells zur Untersuchung des Stoffwechsels der Talgproduktion in der menschlichen Haut und ihren Anhängen.
Verwendung des Modells nach Anspruch 1 zur Untersuchung der Wirkungen der Anwendung von entweder topisch oder systemisch angewendeten Substanzen, für pharmakologische, kosmetische oder kosmezeutische Anwendungen.
Verwendung des Modells nach Anspruch 1 zur Erstellung eines Toxizitätstests zum Screening von Verbindungen und Behandlungen, die auf dermatologische und kosmetische Anwendungen ausgerichtet sind.
Verwendung des Modells nach Anspruch 1 zur Erstellung einer Screening-Methode auf der Grundlage der Bestimmung der Freisetzung von freiem Glycerin in dem Nährmedium mit dem Ziel der Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen für dermatologische und kosmetische Anwendungen.
Verwendung des Modells nach Anspruch 1 zur Erstellung einer Screening-Methode auf der Grundlage der Bestimmung des Gesamtlipidgehalts und des Gesamtproteingehalts in den kultivierten Organen mit dem Ziel der Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen für dermatologische und kosmetische Anwendungen.
Verwendung des Modells nach Anspruch 1 zur Erstellung einer Screening-Methode auf der Grundlage der Quantifizierung der Enzyme und Rezeptoren der Sebozyten durch da Western Blot-Verfahren mit dem Ziel der Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen für dermatologische und kosmetische Anwendungen.
Verwendung des Modells nach Anspruch 1 zur Erstellung einer Screening-Methode auf der Grundlage der Quantifizierung der Enzyme und Rezeptoren der Sebozyten durch das RTqPCR-Verfahren mit dem Ziel der Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen für dermatologische und kosmetische Anwendungen.
Verwendung des Modells nach Anspruch 1 zur Untersuchung der Wirksamkeit von Substanzen für Formulierungen mit biologischer Aktivität, wie entzündungsfördernde, entzündungshemmende, antibakterielle, antimykotische, antiprotozoische, antivirale, antitumorale, ätzende Wirkstoffe.