DE102006041335B4

DE102006041335B4 - Zellsensor mit multifunktionellen Reaktionen zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von Materialien

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Publication number: DE102006041335B4
Application number: DE102006041335A
Authority: DE
Inventors: Alexander Dipl.-Ing. 85221 Walter; Udo Dipl.-Ing. 93049 Leuschner
Original assignee: Gerresheimer Regensburg GmbH
Current assignee: Gerresheimer Regensburg GmbH
Priority date: 2006-04-03
Filing date: 2006-09-01
Publication date: 2011-07-21
Anticipated expiration: 2026-09-02
Also published as: EP2004855A2; WO2007113238A3; US20090118138A1; DE102006041335A1; WO2007113238A2; CA2648267A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten Kulturbedingungen als Kontrollgruppe, b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/in/zwischen verschiedenen zu testenden Materialien als Testgruppe, c) Ernten der Zeilen, d) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe, e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe, f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt, g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei diie bestimmte Zellart definiert wird, und h) Bereitstellung dritter Zellen der bestimmten Zellart als Zellsensor sowie des in Schritt g) zusammengestellten Microarray-Standards.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems, ein Zellsensorsystem mit multifunktionellen Reaktionen zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung und Beurteilung von Materialien und die objektive Beurteilung von Zellreaktionen in Verbindung mit 3D-Matrices und anderen Materialien.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Dreidimensionale (3D) Kulturen sind dadurch definiert, dass Zellen in Verbindung mit einer speziellen räumlichen Umgebung Strukturen bilden, wie sie in Geweben und organoiden Gebilden gefunden werden.
Die Reaktionen von kultivierten Zellen sind dabei abhängig vom Zelltyp, vom umgebenden Kulturmedium und von dem Material des verwendeten Kulturraumes. Im einfachsten Fall werden dazu Zellen auf dem Boden einer Kulturschale oder zusammen mit einer natürlichen oder artifiziellen 3D-Matrix (Biomaterial) kultiviert. Die Zellen wachsen dabei je nach Kulturstrategie auf planen Oberflächen oder Materialien mit mehr oder weniger großen Hohlräumen. Je nach verwendetem Material können die Zellen dabei ganz unterschiedliche Reaktionen zeigen.
Zellen in Verbindung mit einer 3D-Matrix zeigen komplexe Reaktionen, die nicht vorhersehbar sind. Beim Kontakt mit einer 3D-Matrix lagern sich die Zellen zuerst locker an (Adhäsion), bilden beim Anhaften spezielle Zellanker aus (Adhärenz) und bleiben im optimalen Fall über längere Zeiträume hinweg in mehr oder weniger enger Interaktion (Affinität) verbunden. Aufgrund der speziellen räumlichen Umgebung können bei den Zellen ganz unterschiedliche zellbiologische Reaktionen beobachtet werden. Das Spektrum reicht von Zellteilung (Mitose), Überwuchern der 3D-Matrix (Spreading) bis hin zur Bildung von typischen (Differenzierung) aber auch von atypischen (Dedifferenzierung) Gewebestrukturen. Die Kulturen lassen sich zudem nicht über beliebig lange Zeiträume halten. Deshalb sind in diesem Zusammenhang auch Vorgänge zur Apoptose, Nekrose und Degeneration wichtige zellbiologische Vorgänge.
Die verschiedenen Stadien der Zell-/Gewebekultur sind folgendermaßen charakterisiert: Adhäsion und Adhärenz: Nach einer Adhäsion, also einem kurzen Primärkontakt von Zellen auf einer 3D-Matrix entscheidet sich, ob daraus ein längerer Kontakt werden soll. Dieses Ausbilden von vorläufigen Ankerstrukturen wird als Adhärenz bezeichnet. Das Verbleiben von Zellen auf einer 3D-Matrix allein ist allerdings noch keine konkrete Aussage darüber, ob, wie lange und wie fest die kultivierten Zellen verankert bleiben und welche gewebespezifischen Eigenschaften dabei ausgebildet werden. Eine gute Adhärenz wird nicht allein von der Zelle und nicht allein von der jeweilig verwendeten 3D-Matrix vermittelt, sondern ist nur in einer engen Kooperation von beiden Beteiligten möglich: Dabei finden folgende Vorgänge statt.
Adhärenz: Zur Kontaktbildung mit einer 3D-Matrix werden von der Zelle zum Beispiel spezifische Integrine als Anker ausgebildet. Damit eine Adhärenz stattfinden kann, müssen deshalb in der 3D-Matrix Rezeptoren für die Anker der Zellen vorhanden sein. Von der natürlichen extrazellulären Matrix (ECM) kennt man in den meisten Fällen die Aminosäuresequenz der Rezeptoren für die Integrine. Bei den verwendeten Polymermaterialien der verschiedenen Kulturartikel ist jedoch unbekannt, wie die Rezeptoren für die jeweiligen Integrinanker der unterschiedlichen Zelltypen aufgebaut sind. Aminosäuresequenzen sind normalerweise in den Polymeren (wie z. B. Kulturschalen aus Polystyrene (Polystyrol)) nicht enthalten. Deshalb müssen ganz andere Molekülkonfigurationen das Vorhandensein eines Rezeptors für Integrine in den Polymeren imitieren.
(Valenick LV et al., Experimental Cell Research 309: 48–55, 2005)
Affinität: Wenn Zellen sich zum definitiven Bleiben auf einem Material entschließen und daraufhin typische Eigenschaften entwickeln, dann wird dieser Vorgang entscheidend durch das verwendete Material und seine Oberflächenbeschaffenheit beeinflusst. Gesteuert wird dieser Vorgang dadurch, dass die Zellen zum Beispiel über Integrinanker interaktiv mit einer 3D-Matrix verbunden sind. Deshalb werden bei 3D-Kulturen möglichst optimierte 3D-Matrices verwendet, um experimentell eine Nachahmung der natürlichen Interaktionsformen anzustreben. Aus eigenem Interesse wird man deshalb 3D-Matrizen mit einer hohen Affinität für die jeweiligen Zellen verwenden. Man kann davon ausgehen, dass nur solche 3D-Matrices auch eine optimale räumliche und funktionelle Entwicklung der reifenden Gewebestrukturen unterstützen.
(Kofidis et al., Medical Engineering & Physics 26: 157–163, 2004)
Mitose: Zellteilungen dienen einerseits zum Erhalt von Zellen, andererseits wird damit sichergestellt, dass sich aus wenigen Zellen eine genügend große Masse an Gewebe bilden kann. Bei der Verwendung von Matrices für die 3D-Kultur muss deshalb entschieden werden, ob die ausgesuchte Matrix auch wirklich die Zellteilungen unterstützt. Mit molekularbiologischen und immunologischen Markern, wie zum Beispiel für zellzyklusspezifische Protein (Cycline oder cyclin-abhängige Kinasen), lässt sich zeigen, wie viele Zellen sich gerade in der Mitosephase und in Kontakt mit einer 3D-Matrix befinden. Das jeweilige Resultat zeigt umgekehrt, in welchem Ausmaß die verwendete 3D-Matrix die Vermehrung von Zellen fördert bzw. hemmt.
Viele Daten zeigen, dass das Mitoseverhalten im Organismus bis zu der Ebene der darin befindlichen Gewebe und Subpopulationen an Zellen spezifisch gesteuert ist. So weisen zum Beispiel im Dünndarm die Epithelzellen der Zotte eine sehr hohe Erneuerungsrate auf, während die enterochromaffinen Zellen und Paneth'schen Körnerzellen in den unmittelbar benachbarten Krypten eine sehr viel niedrigere Mitoseaktivität zeigen. Hier wird an einer einzelnen Zellgrenze entschieden, dass das Epithel der Zotten innerhalb von zwei bis drei Tagen erneuert wird, während in den Krypten über viele Monate keine Teilungen zu beobachten sind. Solche zellbiologischen Unterschiede gibt es auch bei den Bindegewebszellen. Chondroblasten (Knorpel) und Osteoblasten (Knochen) zum Beispiel zeigen erstaunlich hohe Zellteilungsraten, während nach der Ausbildung einer extrazellulären Festsubstanz Chondrozyten und Osteozyten keine (oder über lange Zeiträume keine) Teilung mehr zeigen.
(Gruber et al., Musculoskeletal Disorders 1:1, 2000)
Spreading: Die Erfahrung zeigt, dass sich viele Zellen problemlos vermehren lassen, wenn sie auf dem glatten Boden einer Kulturschale anhaften. Wird den Zellen jedoch eine 3D-Matrix mit einem unterschiedlichen Rauhigkeitsgehalt angeboten, so sind neben der Mitose weitere komplexe Zellreaktionen zu erkennen. Das mögliche Spektrum reicht vom völligen Einwachsen der Zellen in den kleinsten Winkel jeder Rauhigkeit bis zur Abrundung aller Zellen und damit zur völligen Ablehnung der Oberfläche des verwendeten Materials. Verwendet man eine für die Zellen attraktive 3D-Matrix, so ist schon nach relativ kurzer Zeit zu beobachten, dass die gesamte Oberfläche und die zur Verfügung stehenden Binnenräume mit Zellen besiedelt sind. Zudem wachsen die Zellen in unterschiedlichen Schichten aufeinander. Diese massive Ausbreitung von teilungswilligen Zellen wird als Spreading bezeichnet. Die jetzt überall vorkommenden Zellen zeigen jedoch ganz unterschiedliche Funktionszustände. Das Spektrum reicht von unterschiedlichen Stadien der Mitose bis hin zur typischen Interphase mit festen Kontakten der Zellen zueinander und zur angebotenen 3D-Matrix.
Bemerkenswert ist, dass die Zellen beim Spreading während der gesamten Mitosephase, der Zytokinese und der Interphase in stetigem Kontakt mit der jeweiligen 3D-Matrix stehen und sich nicht ablösen. Vermutlich wird dieser Vorgang über die ERK-Kinasen (extracellular signal regulated kinases) und die MAP-Kinasen (mitogen activated Protein kinases) gesteuert.
(Vouret-Craviari V et al., J Cell Science 117: 4559–4569, 2004)
Differenzierung: Aus einzelnen Zellen sollen im Laufe der Kultur kommunizierende Zellverbände und daraus funktionelle Gewebestrukturen entstehen. Dieser Vorgang der Differenzierung verläuft nicht automatisch, sondern wird durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Faktoren gesteuert. Dazu gehören unter anderem Morphogene, Wachstumsfaktoren, Hormone, Ernährungsmilieu und vor allem eine geeignete 3D-Matrix. Mit Ausnahme der 3D-Matrix wirkt jeder dieser Faktoren in einem mehr oder weniger engen Zeitfenster. Treten einzelne Faktoren nicht oder nicht stark genug auf, so kommt es zur Verschiebung im Profil der Differenzierung. Infolge dessen bilden sich nicht typische, sondern unterschiedliche Grade an atypischen Eigenschaften.
(Batorsky et al., Biotechn Bioeng 92: 492–500, 2005)
Die Dimension der molekularen Interaktion von Zellen hängt neben dem Kulturmedium in hohem Maße auch entscheidend vom Material der 3D-Matrix und damit von seiner Oberflächenbeschaffenheit ab. Die Adhäsion, die Adhärenz und die Affinität sind Vorgänge, die durch die Matrix des Zellwachstumsgefäßes enorm beeinflusst werden. Zum Beispiel ist das Wachstum von Zellen auf Glas, Polymethylmethacrylat (pMMA), Polyethylen (PE), Polystyrol (PS) und Polycarbonat (PC) ganz unterschiedlich. Hier kann durch eine Modifikation der Oberflächenladung, wie zum Beispiel einer Plasmabehandlung, oft die Adhäsion und die Affinität für die Zellen verbessert werden. Auch kann das Teilungsverhalten von Zellen, durch zum Beispiel eine 3D-Matrix, beeinflusst werden. Eine zu kleine Porosität kann zum Beispiel eine Mitoseaktivität hemmen, während größere Poren die Teilung von Zellen unterstützen können. Zu große Hohlräume wiederum können bedeuten, dass die Teilung von Zellen nicht weiter gefördert wird. Welche biophysikalischen Einflüsse letztendlich dieses unterschiedliche Verhalten von Zellen beeinflussen, ist unbekannt. Daher sind das Design von Kulturmatrices und die Auswahl der richtigen Materialien sehr schwierig. Voraussagen der Eignung eines Materials sind nicht möglich. Es ist völlig unklar, warum sich Zellen auf 3D Matrices ansiedeln lassen, obwohl diese keinerlei molekulare Ähnlichkeit mit der natürlichen extrazellulären Matrix haben. Wahrscheinlich beeinflussen eine ganze Reihe von verschiedenen physikochemischen Oberflächenparametern die Adhärenz, die Adhäsion, die Affinität, die Mitose, das Spreading und die Differenzierung von Zellen. Experimente zur Besiedlung von Zellen auf 3D-Matrizen zeigen, dass es kein Einheitsmaterial gibt, welches für alle Vorhaben gleich gut geeignet wäre. Vielmehr erweist sich, dass jede Zellart sehr spezifische Anforderungen hat und deshalb eine 3D-Matrix ganz individuell ausgewählt und abgestimmt sein muss. So braucht eine Matrix, die optimal für Leberparenchymzellen geeignet ist, nicht automatisch auch für insulinproduzierende Zellen die erste Wahl zu sein. Für Bindegewebszellen ist eine solche Matrix höchst wahrscheinlich sogar völlig ungeeignet.
Aus dem vorhergesagten wird ersichtlich, wie bedeutend das Material für das Wachstum ist. Bei der Neuentwicklung einer 3D-Matrix kann ihre Eignung nicht vorhergesagt werden. Deshalb müssen bei jeder Neuentwicklung auch immer neue Experimente durchgeführt werden, um die wirkliche Eignung zu erfahren. Objektive Kriterien zur Beurteilung des Materials, insbesondere einer 3D-Matrix, fehlen jedoch. Die Zellen können je nach angebotener 3D-Matrix einerseits mit erwünschter Differenzierung und andererseits mit unerwünschter Dedifferenzierung sehr sensitiv reagieren. Ein großes ungelöstes Problem in diesem Zusammenhang ist, dass Zellen bei Besiedlung einer 3D-Matrix mit guter Affinität nicht automatisch alle funktionellen Eigenschaften eines Gewebes entwickeln, sondern in einem mal mehr oder einem mal weniger unreifen Zwischenzustand der Differenzierung verharren können.
Erfahrungsgemäß weiß man, wie lange eine Zelllinie oder eine Primärkultur benötigt, um einen konfluenten Zellrasen auf der Oberfläche einer Kulturschale aus Polystyrene (Polystyrol) zu bilden. Wird z. B. ein Teil des Schalenbodens mit einem ungeeigneten Polymer, wie zum Beispiel Poly(2-Hydroxyethylmetacrylat) beschichtet, so nimmt die Zahl der anhaftenden Zellen drastisch ab. Ein konfluenter Monolayer von Zellen bildet sich dann nicht mehr aus. Das Beispiel zeigt, wie sensitiv Zellen reagieren können, wenn sie mit einer neuen Oberfläche zusammen treffen.
Die Analysemethoden der Eignung eines zweidimensionalen Materials, wie dem Boden einer Kulturschale, sind vielfältig, jedoch bei 3D-Matrices sehr beschränkt. Zwar ist anhand des Adhäsionsverhaltens von Zellen mit optischen Methoden recht schnell zu erkennen, wie gut oder schlecht die Zellen die Oberfläche einer verwendeten 3D-Biomatrix akzeptieren. Allerdings handelt es sich dabei nur um eine vage Abschätzung, da allein das Wachstumsverhalten und die Zahl der Zellen keine weitere Information zur zellbiologischen Qualität der Verankerung auf einer 3D-Matrix liefert. Zudem können in der Tiefe einer 3D-Matrix keine Aussagen getroffen werden. Die Reaktionen von Zellen in Kontakt mit einer 3D-Matrix wurden bisher immer sehr vage registriert. Dazu gehört zum Beispiel die Bestimmung der Zellzahl, die Vitalität, der Nachweis einzelner Proteine mit einem Antikörper oder die Bildung eines sezernierten Moleküls. Darüber hinaus gibt es kaum eine Aussage, was sonst noch an molekularen Funktionen in der jeweiligen Zellpopulation im dreidimensionalen Raum geschieht.
Während das Funktions- und damit auch das Differenzierungsprofil von zweidimensionalen Kulturen sehr gut mit bisherigen Analysemethoden untersucht werden kann, müssen bei dreidimensionalen Kulturen ganz neue Techniken angewendet werden. Der Grund dafür ist dass die Zellen in einer 3D-Matrix aufgrund der Schicht dicke z. B. morphologisch nicht mehr erkennbar und für physiologische Ableitungen nicht mehr erreichbar sind. Dagegen ist bei zweidimensionalen Kulturen ein direkter Zugang zu den Zellen möglich. Aus diesem Grund müssen für dreidimensionale Kulturen ganz andere Analysemethoden angewendet werden, die die vielfältigen komplexen Reaktionen von Zellen im Binnenraum einer 3D-Matrix exakt wieder spiegeln.
Die Erfassung der Eignung eines Materials als Kulturraum, insbesondere eines 3D-Matrix-Materials, anhand einer Vielzahl objektiver Parameter in einer angemessenen Zeit ist bisher nicht möglich.
Es ist somit die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Sensorsystems bereitzustellen, mit welchem ein großes Spektrum komplexer zellbiologischer Reaktionen in Verbindung mit einem Material erfasst werden kann.
Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Sensorsystem zur Erfassung der komplexen Zellreaktionen bereitzustellen, welches erstmals eine objektive Beurteilung von Zellreaktionen in Verbindung mit 3D-Matrizen und anderen Materialien erlaubt.
Es ist weiterhin eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Beurteilung von Materialien bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden durch das in Patentanspruch 1 definierte Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems, das in Patentanspruch 16 definierte Zellsensorsystem und das im Patentanspruch 22 definierte Verfahren zur Beurteilung von Materialien gelöst.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden in der Beschreibung näher erläutert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems zeichnet sich durch folgende Verfahrensschritte aus:

a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe),
b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/in/zwischen verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe),
c) Ernten der Zellen,
d) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe,
e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe,
f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt,
g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei dieser konfektionierte Microarray als Standard für die bestimmte Zellart definiert wird, und
h) Bereitstellung dritter Zellen der bestimmten Zellart als Zellsensor sowie des in Schritt g) zusammengestellten Microarray-Standards.

Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Beurteilung der Qualität von Materialien, sowie zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von Materialien.
Verwendet werden können sämtliche bekannten Zellen als auch Zelllinien. Die Zellen umfassen die Zellen der Grundgewebe (Epithel, Muskel, Nervengewebe (Neuronen), Bindegewebe) und des hematopoietischen Systems des gesunden und des kranken tierischen und menschlichen Organismus, Stammzellen, embryonal und erwachsene Gewebe, sowie die daraus abgeleiteten Zelllinien, des gesunden und kranken tierischen und menschlichen Organismus. Auch pflanzliche Zellen und Zelllinien können verwendet werden.
Im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden unter ”standardisierten Kulturbedingungen” Kulturbedingungen verstanden, unter denen die jeweiligen Zellarten herkömmlich kultiviert werden. Diese sind dem Fachmann geläufig, siehe zum Beispiel auch W. W. Minuth, R. Strehl, K. Schumacher (2005) Tissue Engineering-Essential for Daily Laborstory Work. WILEY-VCH Verlag, ISBN 3527311866. Unter „standardisierten Bedingungen” können im Zusammenhang der Erfindung aber auch Kulturbedingungen verstanden werden, unter denen die auf einer Standard Kulturoberfläche kultivierten Zellen durch verschiedenste, dem Fachmann bekannten Stimuli zur Differenzierung angeregt werden.
Ferner wird unter ”Ernten der Zellen” das Aufarbeiten der Zellen für die nachfolgende Bestimmung der Genaktivitäten verstanden. Die Aufarbeitung hängt dabei davon ab, auf welcher Ebene die Genaktivitäten bestimmt werden sollen. Vorteilhafterweise werden die Genaktivitäten auf der Nukleinsäureebene und/oder auf der Proteinebene bestimmt. Die entsprechenden Aufarbeiitungsmethoden, d. h. die Isolierung von RNA und/oder Protein sind dem Fachmann bekannt (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, 3. Auflage).
Der Ausdruck ”Bestimmung von Genaktivitäten” bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf Untersuchungen der differenziellen Genexpression, d. h. die Expression verschiedener Gene wird untersucht und die Expressionsmuster bestimmt. Als „Genexpression” wird der gesamte Prozess des Umsetzens der im Gen enthaltenen Information in ein Protein bezeichnet. In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die Genexpressionsmuster durch Verwendung von Microarrays bestimmt. Man unterscheidet zwei Arten von Microarrays, zum einen DNA-Microarrays und zum anderen Protein-Microarrays. Die Wahl des Microarrays hängt davon ab, auf welcher Ebene die Genaktivitäten bestimmt werden sollen. Werden die Genaktivitäten auf Nukleinsäureebene bestimmt, so wird ein DNA-Microarray verwendet. Es gibt zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays, einerseits solche die auf gebundener cDNA beruhen und solche die auf synthetisch hergestellten Oligonukleotiden beruhen. Diese dienen als Sonden, die an definierte Positionen eines Rasters z. B. auf Glasträger aufgebracht werden. Unabhängig von der Art der verwendeten Arrays, wird RNA zunächst aus den zu untersuchenden Zellen extrahiert und diese nach eventuellen Aufreinigungs- und/oder Vermehrungsschritten der mRNA in cDNA oder cRNA umgeschrieben und beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen, chemilumineszenten Markierungen, lumineszenten Markierungen und elektronischen Markierungen markiert. Diese werden dann mit den DNA-Microarrays hybridisiert. Hierbei binden markierte cDNA/cRNA Stücke an ihren komplementären Gegenpart auf dem Array. Nach der Abwaschung der nicht gebundenen cDNA/cRNA Stücke wird das Fluoreszenzsignal jeder Position des Microarrays mittels eines Lasers ausgelesen, bzw. werden bei Verwendung anderer Markierungen entsprechende, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren herangezogen. Diese reine Intensität wird üblicherweise noch normalisiert um Abbaueffekte, verschieden gute Extraktionen und andere Effekte mit einzurechnen. Für Oligomer basierte Microarrays gelangen derzeit zwei weit verbreitete Normalisierungsmethoden zur Anwendung, zum einen RMA (Robust Multiarray Analysis) oder GCOS/MAS der Firma Affymetrix. Anschließend werden die normalisierten Ergebnisse ausgewertet und visualisiert. Auch hierzu steht wieder eine Menge von bioinformatorischen Tools zur Verfügung. So etwa Genesis für die Datenanalyse und Visualisierung. Weiterhin steht mit dem Bioconductor Projekt eine große Bibliothek an Werkzeugen für die Datenanalyse unter GNU_R zur Verfügung. Auch anwendbar ist das System der Firma Applied Biosystems, welches Chemolumineszenz mit Fluoreszenz kombiniert und bei dem keine ESTs gespottet sind, sondern 60er-mer-Oligos.
Soll die Genexpression auf Proteinebene bestimmt werden, so werden Protein-Microarrays verwendet und somit Proteine aus den Zellen isoliert. Proteinproben werden dann auf das Array aufgebracht. Jene Spots, in denen keine Interaktion stattfindet, bleiben nach Durchführung eines Waschschritts leer. Die Detektionsmethode erlaubt anschließend die Unterscheidung zwischen Spots mit und ohne Protein-Protein Interaktion. Es sind auch quantitative Detektionsverfahren möglich, in denen die Menge an haftendem Protein bestimmt werden kann.
Es gibt verschiedene Arten von Protein-Microarrays, welche nach der Art der Interaktion (Antigen-Antikörper, Enzym-Substrat, Rezeptor-Protein oder allgemeine Protein-Protein Interaktion) unterschieden werden. Es kann auch differenziert werden, ob Proteine der Probe am Array fixiert werden und dann mit einer Vielzahl von spezifischen, bekannten Testproteinen geprüft wird – oder ob die Testproteine in den Testflächen fixiert werden und dann die Reaktion mit den Probenproteinen erfolgt.
Die Microarray Western Methode dient zum Nachweis von Antigenen in Zelllysaten verschiedener Gewebe oder in durch isoelektrische Fokussierung gewonnenen Proteinfraktionen. Das Zelllysat oder die Proteinfraktion wird auf dem Trägermaterial des Microarrays gespottet, danach wird der Antikörper aufgebracht. In jedem Testfeld mit Antikörper-Antigen Interaktion bleibt der Antikörper haften. Felder mit Antikörper werden dann wie beim Western Blot detektiert.
Antikörper Microarrays: Die Antikörper werden fixiert (gespottet) und dann die Probe auf das Array aufgebracht.
Antigen Microarrays: Auf jeder Testfläche des Arrays wird ein anderes Antigen fixiert. Enthält die Probe den dazugehörigen, spezifischen Antikörper, bleibt dieser an der Testfläche haften. Damit kann die Reaktion auf eine Vielzahl von Antigenen oder Allergenen gleichzeitig getestet werden.
Bei Proteindomänen Microarrays werden Fusionsproteine auf dem Array fixiert um Protein-Protein Interaktionen nachzuweisen. Das Fusionsprotein ermöglicht die zuverlässige Fixierung auf dem Array mit dem ersten Teil ohne die Interaktionsfähigkeit des anderen Proteinteils zu stören. Das aufgebrachte Protein bleibt nur an jenen Testflächen haften, an denen es zu einer Interaktion kommt.
Ein möglicher Vorteil gegenüber DNA-Microarrays ist die schnellere Vor-Ort-Analyse von Proben, da man auf die oft notwendige Amplifikation genetischen Materials sowie die Hybridisierung verzichten kann.
Vorzugsweise werden Whole Genome Microarrays für den Schritt d) des Verfahrens verwendet. Auch können Microarrays verwendet werden, mit denen in einem weiteren oder engeren Spektrum gezielt nach einzelnen Funktionen oder Funktionsgruppen der Zelle gesucht werden kann. Solche Funktionsgruppen umfassen Funktionen wie zum Beispiel Zellzyklus, Reaktionen am Zellkern, Bindung der Zelle an Oberflächen, Zellstress, Bildung des typischen Zytoskeletts, Signaltransduktion und/oder Apoptose. Je nach verwendetem Microarray können dadurch eine Vielzahl an Gruppen von aktiven oder inaktiven Genen und Proteinen identifiziert werden, deren Funktionen im derzeit untersuchten Zusammenhang bekannt sind. Hinzu kommt jedoch die Analyse mit vielen Gruppen von Genen und Proteinen, die man in diesem Zusammenhang gar nicht vermutet hätte. Je nach Hoch- oder Herunterregulierung der Genaktivität bzw. Proteinsynthese bei einem getesteten Material können sich dabei individuelle Gen- bzw. Proteinaktivitäten als materialspezifisch erweisen.
Auf diese Weise kann erstmals ein großes Spektrum der komplexen zellbiologischen Reaktionen von Zellen in Verbindung mit einem Material objektiv erfasst werden:

1. Im positiven Fall eines Materialtests kann damit das histiotypische Differenzierungsprofil erfasst werden.
2. Im negativen Fall kann damit eine atypische Entwicklung wie eine Dedifferenzierung ermittelt werden.
3. Zwischen diesen beiden Extremen kann ein modifiziertes Material eingeordnet und wenn nötig weiter optimiert werden.

Da die Oberfläche der verwendeten Materialien wie zum Beispiel der Boden einer Kulturschale aus Polysterene (Polystyrol) nicht die Informationssequenzen wie die natürliche ECM besitzt, können mit der Microarray-Technik erstmals Genprofile für einzelne Zellarten unter Kulturbedingungen erarbeitet und mit einer entsprechenden Kontrolle verglichen werden. Dabei kann objektiv festgestellt werden, welche Materialien typische und welche atypische Reaktionen in den Zellen hervorrufen. In diesem Zusammenhang lassen sich nicht nur einzelne Eigenschaften, sondern ein ganzes zellbiologisches Spektrum an Reaktionen ablesen, das von nicht geeignet, weniger geeignet bis suboptimal und optimal reicht.
Im Hinblick auf die verschiedenen Funktionsgruppen werden bevorzugt folgende Microarrays ausgewählt:
Zellzyklus-Microarrays sind derart gestaltet, dass die Expressionsprofile von Genen bestimmt werden können, welche in der Kontrolle von Zellwachstum und Teilung involviert sind und in den gängigen, dem Fachmann bekannten Datenbanken zu finden sind, wie z. B. der Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org, oder in den folgenden Datenbanken: wwwgenecards.org; gdb.org. Bevorzugt werden die Expressionsprofile der Gene bestimmt, welche z. B. Cycline und ihre assoziierten cyklin-abhängigen Kinasen (CDKs), CDK-Inhibitoren, CDK-Phosphatasen und Zellzykluscheckpointmoleküle codieren, die in der Kontrolle von Zellwachstum und Teilung involviert sind.
Signaltransduktions-Microarrays sind dergestalt, dass die Expressionsprofile von Genen bestimmt werden können, welche Zellprozesse durch extrazelluläre Liganden, Ligandenrezeptoren und intrazelluläre Signalmodulatoren kontrollieren. Diese sind in den gängigen Datenbanken zu finden, wie z. B. der Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org, oder in den folgenden Datenbanken: wwwgenecards.org; gdb.org. Bevorzugt können diese ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend: Ca² ⁺/NFAT Signalwege, cAMP/Ca²⁺ Signalwege, DNA-Damage Signalwege, EGF/PDGF Signalwege, Hypoxie Signalwege, G-Proteine und Signalmoleküle, Glukokorticoide Signale, G-Protein gekoppelte Rezeptoren, Wachstumsfaktoren, immunologische Signalwege, Insulin-Signalwege, JAK/STAT-Signalwege, MAP-Kinase-Signalwege, NF_κB-Signalwege, Nitrit Oxid, Notch-Signalwege, Kernrezeptoren und Co-Regulatoren, p53-Signalwege, PI3K-AKT-Signalwege, TGFβ BMP-Signalwege, Toll-Like-Rezeptorsignalwege, Wnt-Signalwege.
Apoptose-Microarrays sind so gestaltet, dass die Expressionsprofile von Genen bestimmt werden können, welche Schlüssel-Liganden, Rezeptoren, intrazelluläre Modulatoren und Transkriptionsfaktoren codieren, die in der Regulation des programmierten Zelltods involviert sind. Diese sind in den gängigen, dem Fachmann bekannten Datenbanken zu finden, wie z. B. der Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org, oder in den folgenden Datenbanken: wwwgenecards.org; gdb.org.
Die Microarrays der anderen Funktionsgruppen – Reaktionen am Zellzyklus, Bindung der Zelle an Oberflächen, Zellstress, Bildung des typischen Zytoskeletts – umfassen entsprechend die Expressionsprofile von Genen, die in der entsprechenden Funktionsgruppe involviert sind. Diese sind in den gängigen, dem Fachmann bekannten Datenbanken zu finden, wie z. B. der Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org, oder in den folgenden Datenbanken: wwwgenecards.org; gdb.org.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nur die Gene identifiziert, bei denen ein Expressionsunterschied von mindestens Faktor zwei vorliegt. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform beträgt der Faktor des Expressionsunterschiedes mindestens drei.
Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht für den Standard-Microarray die folgenden Gene vor, wenn die bestimmten Zellen z. B. 3T3-L1 Fibroblasten sind: Pyruvat Carboxylase, Stearoyl-Coenzym A Desaturase 1, Fatty acid binding Protein 5, Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase 1, Apolipoprotein D, Fatty acid binding Protein 4, Apolipoprotein C-1, Adipsin, Lipin 1, Adinectin, Lipase, Angiotensinogen, Resistin, CD36 Antigen, Fibromodulin, Procollagen-Lysin 2-Oxoglutarat 5-Dioxygenase 1, Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4, Lumican und Clusterin.
Bei den zu testenden Materialien handelt es sich um langkettige organische Moleküle, um Standardkunststoffmaterialien und bioabbaubare Materialien. Vorzugsweise handelt es sich bei den zu testenden Materialien um 3D Matrixmaterialien. Vorzugsweise wird ein getestetes 3D Matrixmaterial in einer weiteren Ausführungsform im Schritt h) des Verfahrens gemäß Anspruch 1 zusammen mit den Zellen der bestimmten Zellart als Zellsensor und dem im Schritt g) zusammengestelltem Microarray-Standard als Teil des Zellsensorsystems bereit gestellt. Bei diesem 3D Matrixmaterial handelt es sich vorzugsweise um ein Material, welches die Differenzierung der Zellen der bestimmten Art unterstützt und somit als „Golden Standard” fungieren kann. Bevorzugt handelt es sich bei dem 3D Matrixmaterial um mit CO₂ aufgeschäumtes Polystyrol. Dieses Material kann z. B. als „Golden Standard” im Zusammenhang mit 3T3-L1 Fibroblasten und den dafür oben definierten Standard-Microarray verwendet werden.
Die obigen Ausführungen und Definitionen zu dem erfindungsgemäßen Verfahren gelten auch im Zusammenhang mit den folgenden weiteren Aspekten der Erfindung, insbesondere dem Zellsensorsystem, dem Verfahren zur Beurteilung von Materialien, der Verwendung von Zellen zur Beurteilung der Qualität von Materialien, der Verwendung von Microarrays zur Herstellung eines Standards zur Verwendung in einem Zellsensorsystem, sowie dem erfindungsgemäßen Kit.
Neben dem zuvor beschriebenen Verfahren betrifft die Erfindung ein Zellsensorsystem mit multifunktionellen Reaktionen zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von Materialien und zur Beurteilung der Qualität von Materialien, welches aus Zellen besteht und dem/den nach dem Verfahren für die bestimmte Zellart erstelltem/erstellten Standard-Microarray(s). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Standard-Microarrays DNA-Arrays und/oder Proteinarrays.
Vorzugsweise umfasst das Zellsensorsystem eine getestete 3D Matrix. Diese 3D-Matrix besteht üblicherweise aus langkettigen organischen Molekülen, Standardkunststoffmaterialien und bioabbaubaren Materialien. Vorzugsweise handelt es sich bei der 3D Matrix, die Teil des Zellsensorsystems ist, um eine 3D Matrix, die die Differenzierung der Zellen der bestimmten Art unterstützt und somit als „Golden Standard” fungieren kann. Bevorzugt handelt es sich bei dem 3D Matrixmaterial um mit CO₂ aufgeschäumtes Polystyrol. Dieses Material kann z. B. als „Golden Standard” im Zusammenhang mit 3T3-L1 Fibroblasten und den dafür oben definierten Standard-Microarray verwendet werden.
Gelangt eine Zelle in Kontakt mit einer 3D-Matrix, so nimmt sie sensitiv Signale aus ihrer Umgebung war. Ausgelöst bzw. unterstützt werden dadurch die Adhäsion, die Adhärenz, die Affinität, die Mitose, das Spreading aber auch die Differenzierung der Zellen. Diese Signale müssen von der Außenseite der Zelle über die Plasmamembranen in das Zellinnere gelangen. Involviert ist dabei unter anderem das ERK-System, welches die vielfältigen Vorgänge zur Nucleotidsynthese, Genexpressionen und Proteinsynthese beeinflusst, die im Folgenden dann von den MAP-Kinasen gesteuert werden. Eines dieser Schlüsselenzyme für die DNA- beziehungsweise RNA-Synthese ist zum Beispiel die Carbamoylphosphatsynthetase II (CPS II). Inkubationen von Kulturen mit epidermalem Wachstumsfaktor haben zum Beispiel gezeigt, dass die ERK-/MAP-Kinasen Phosphatgruppen auf die CPS II übertragen. Diese Phosphorylierung kann durch PRPP (Phosphoribosylpyrophosphat) beschleunigt werden, was zu einer erhöhten Nukleotidsynthese (DNA) und damit zu einer erhöhten Transkriptionsaktivität (Proteinsynthese) führt. Das Signal von den zellulären MAP-Kinasen führt zu einer Erhöhung der Genexpression, indem Rapid Response Gene innerhalb von Minuten aktiviert werden. Dies wiederum geschieht über eine Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und die Phosphorylierung von Histonproteinen. Dadurch bedingt kommt es zu einer Konfigurationsänderung an den Histonmolekülen, wodurch die DNA für die mRNA-Bildung und damit die weitere Proteinbildung aktiviert wird.
Die über ERK-/MAP-Kinasen vermittelte Mitose von Zellen wird über die Familie der CDK (cyclin dependent Protein kinases) gesteuert. Aktiviert werden das Cyclin D1-Protein und sein Partner Cdk4, wodurch sich ein Komplex bildet. Wird dieser Komplex phosphoryliert, so kann es die in der Zelle vorliegende Mitosehemmung aufheben. Dies wiederum setzt den Transkriptionsfaktor E2F frei, wodurch es zum Anstieg der Transkription von Genen kommt, die über die DNA-Replikation Mitose und Spreading unterstützen.
Anhand dieses Beispiels ist ersichtlich, dass extrazelluläre Signale wichtige Einflüsse auf die Mitose und viele andere wichtige zellbiologischen Funktionen im Innern von Zellen haben können. Dazu gehören neben Signalen von Morphogenen beziehungsweise Wachstumsfaktoren, die Osmolarität des Kulturmediums, der Stress, der durch das Fliessen einer Flüssigkeit oder durch hydrostatischen Druck entsteht, und schließlich auch die Oberfläche und der Binnenraum einer 3D-Matrix.
Wenn sich Zellen in Verbindung mit einer 3D-Matrix optimal entwickeln sollen, dann werden sehr spezifische Eigenschaften der Wachstumsoberfläche und des Binnenraumes benötigt, da letztendlich nur sie eine optimale Affinität und Chancen für eine weitere Entwicklung der Zelle bieten. Vermittelt werden diese Vorgänge über Zellanker (z. B. Integrine), die die Information in das Zellinnere weiterleiten.
Neben den Integrinen haben die matrizellulären Proteine, wie zum Beispiel Thrombospondin oder SPARC (Osteonectin) noch eine weitere wichtige Bedeutung für die Entstehung und Aufrechterhaltung der Zellfunktionen. Einerseits können sie die Produktion von Proteinen der extrazellulären Matrix modulieren und andererseits haben sie Einfluss auf die Wirksamkeit von Wachstumsfaktoren durch die Bildung zusätzlicher Rezeptoren. Dieser sehr vielschichtige Regulationsmechanismus kann allerdings nur dann entstehen, wenn die Zelle eine geeignete Verankerung auf der angebotenen 3D-Matrix erkennt. Erst dies ermöglicht die Auslösung weiterer vielfältiger zellbiologischer Funktionen über extrazelluläre und zelluläre Signalkaskaden.
Diese Reaktionen von Zellen können technisch genutzt werden. Zellen können somit als hochsensibler Sensor eingesetzt werden. Die sehr komplexen zellbiologischen Reaktionen können mit Hilfe eines Standard-Microarrays untersucht und dargestellt werden. Mit Hilfe dieses Zellsensorsystems können dann Materialien untersucht werden. Verwendet werden dazu eine Kontrolle und ein zu testendes Material, wie zum Beispiel eine Modifikation von Polystyrene (Polystyrol), das zur Herstellung einer verbesserten Kulturschale verwendet wurde. Zum Testen dieses Materials wird eine definierte Zellpopulation in einem definierten Kulturmedium für einen definierten Zeitraum kultiviert. Die Qualität des zu testenden Materials wird über die zellbiologischen Reaktionen der Zellen festgestellt, die in Verbindung mit dem jeweiligen Material inkubiert werden. Dabei fungieren die Zellen als Sensor auf dem jeweiligen Material und signalisieren ein Bandspektrum zwischen einer positiven und negativen Entwicklung.
Das Signal des Zellsensors ist vielschichtig, deshalb sagen auch einzelne experimentelle Ableitungen der Zelle nichts über ihren wirklichen momentanen Gesamtstatus aus. Aus diesem Grund müssen möglichst alle möglichen Genreaktionen und Proteinexpressionen erfasst werden. Dies ist über die Microarray-Technik möglich. Die verwendeten Chips sind aus einer Vielzahl von Informationskanälen aufgebaut, stellen somit einen Übermittler- und gleichzeitiger Verstärkerfunktion (Transducer und Amplifier) der zellbiologischen Funktionsäußerungen der Zellen dar. Mit Hilfe einer entsprechenden Scannertechnik und Software wird schließlich ermittelt, welche Dimension die Genaktivität und Proteinaktivität zum Zeitpunkt der Messung hat. Von Schritt zu Schritt einer geplanten Materialmodifizierung kann mit dem vorgestellten Zellsensor überprüft werden, ob gleiche oder ganz andere Gengruppen hochreguliert oder herunterreguliert werden. Analog dazu kann mit jeder Materialmodifizierung untersucht werden, welche Gene oder Proteine vermehrt oder vermindert aktiv sind, beziehungsweise gebildet werden. Erstmals können damit die Phasen die Adhäsion, Adhärenz, Affinität, Spreading und Differenzierung objektiv analytisch erfasst werden. Zudem können die Daten erstmals in den entsprechenden Zeitfenstern der oben geschilderten Abläufe erhoben werden. Dies bedeutet, dass ein mit Zellen bewachsenes Material am Anfang, in der Mitte und am Ende eines Versuches ganz andere Eigenschaften haben kann. Der Grund dafür ist, dass die Zellen in Abhängigkeit vom verwendeten Material extrazelluläre Matrix produzieren und dadurch die Oberfläche des Materials im positiven oder negativen Sinn verändern. Auf diese Weise kann mit Hilfe eines Proteinchips zum Beispiel nach Materialeigenschaften gesucht werden, welche die Zellen zur Bildung von extrazellulären Matrixproteinen stimulieren.
Die Chiptechnologie bildet die Möglichkeit, dass mit einer einzigen Zellprobe gleichzeitig eine Vielzahl von Tausenden von Genen und Hunderten an Proteinen getestet werden. Dadurch werden Gene und Proteine sichtbar, an die in diesem Zusammenhang nicht gedacht oder als nicht relevant erachtet wurden. Somit muss für jede Zellart ein spezifischer Standard nach dem erfindungsgemäßen Verfahren definiert werden. Entsprechend dieses Standards können verbesserte oder schlechtere Materialien sicher erkannt und ohne subjektive Einflüsse evaluiert werden. Zudem können Risiken von beliebigen Biomaterialien zum ersten Mal objektiv mit der Microarray-Technik erfasst werden. Erstmals wird es dadurch möglich sein, die Dimension der Interaktion von Zellen im Zusammenhang mit einem Biomaterial molekularbiologisch zu definieren. Mit dem vorgestellten Zellsensorsystem wird es möglich sein, die Kultur von Zellen auf beliebigen Materialien objektiv zu beurteilen. Dies kann von den Herstellern von Kulturartikeln als entscheidender Vorteil genutzt werden:

1. Dies gilt für die Modifizierung von bisher verwendeten Materialien.
2. Dies gilt für die Neuentwicklung von Materialien.
3. Dies gilt für die Qualitätssicherung einzelner Chargen.
4. Dies gilt für die Zertifizierung von Produkten anhand von Microarray-Daten.
5. Dies gilt für die Identifizierung nachgeahmter Produkte.

Folgende Zellen und Zelllinien finden bevorzugt als Zellsensoren in dem erfindungsgemäßen Zellsensorsystem Anwendung: Die Zellen der Grundgewebe (Epithel, Muskel, Nervengewebe (Neuronen), Bindegewebe) und des hematopoietischen Systems des gesunden und des kranken tierischen und menschlichen Organismus, Stammzellen, embryonal und erwachsene Gewebe, sowie die daraus abgeleiteten Zelllinien, des gesunden und kranken tierischen und menschlichen Organismus. Auch pflanzliche Zellen und Zelllinien können verwendet werden. Die genannten Zellen und Zelllinien finden auch Anwendung in den anderen Aspekten der Erfindung, wie z. B. dem Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems, dem Verfahren zur Beurteilung von Materialien, der Verwendung von Zellen, sowie dem Kit.
Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht als Zellsensor 3T3-L1 Fibroblasten vor.
Verwendet man beim Testen von 3D-Matrices Zelllinien, so muss man zudem berücksichtigen, dass mit jedem Experiment eine Selektion der Zellen mit den besten Affinitätseigenschaften erreicht werden kann. Werden für die Subkultivierung immer nur diejenigen Zellen verwendet, die eine starke Affinität zur jeweiligen 3D-Matrix zeigen, so werden durch den Selektionsdruck besser haftende Zellen erzeugt. Dabei werden allerdings alle Zellen aus dieser Population verloren, die keine so guten Adhäsionseigenschaften haben. Man kann damit zum Beispiel Zellklone erhalten, die eine immer bessere Affinität für eine 3D-Matrix zeigen. Dieser Effekt ist jedoch für das objektive Testen von Materialien nicht erwünscht. Deshalb müssen die Versuche immer mit Zellen der gleichen Uridentität durchgeführt werden.
In einer noch spezielleren Ausführungsform enthält das Microarray des erfindungsgemäßen Zellsensorsystems folgendes Genprofil: Pyruvat Carboxylase, Stearoyl-Coenzym A Desatu rase 1, Fatty acid binding Protein 5, Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase 1, Apolipoprotein D, Fatty acid binding Protein 4, Apolipoprotein C-1, Adipsin, Lipin 1, Adinectin, Lipase, Angiotensinogen, Resistin, CD36 Antigen, Fibromodulin, Procollagen-Lysin 2-Oxoglutarat 5-Dioxygenase 1, Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4, Lumican und Clusterin.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung von Materialien bereit, welches durch die folgenden Verfahrensschritte gekennzeichnet ist:

a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe),
b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/in/zwischen verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe),
c) Ernten der Zellen,
d) Bestimmung von der Genaktivitäten,
e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe,
f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt,
g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei dieser konfektionierte Microarray als Standard für die bestimmte Zellart definiert wird, und
h) Kultivierung dritter Zellen der bestimmten Zellart unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe),
i) Kultivierung von vierten Zellen der bestimmten Art auf verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe),
j) Ernten der Zellen,
k) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe unter Verwendung des Standard-Microarrays.

Erfindungsgemäß ist das Verfahren derart weitergebildet worden, dass nur noch die Schritte h–k durchgeführt werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform findet die Kultivierung von Zellen als Kontrollgruppe im Schritt h) des erfindungsgemäßen Verfahrens auf einem bereits getestetem 3D Material statt. Vorzugsweise unterstützt diese 3D Matrix die Differenzierung der Zellen der bestimmten Art und kann somit als „Golden Standard” definiert werden.
Erfindungsgemäß wird in die Verfahren zur Beurteilung von Materialien das erfindungsgemäße Zellsensorsystem eingesetzt.
In einem noch weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung von Zellen zur Beurteilung der Qualität von Materialien anhand der zellbiologischen Reaktionen der Zellen vor. Bevorzugt werden die oben bereits genannten Zellen und Zelllinien verwendet.
In anderer Hinsicht betrifft die Erfindung die Verwendung von Microarrays zur Herstellung eines Standards zur Verwendung in einem Zellsensorsystem.
In einem noch weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Kit vor, das das erfindungsgemäße Zellsensorsystem, Medium und eine oder mehrere 3D-Matrices umfasst.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens näher erläutert.
Beispiel
3T3-L1 Zellsensorsystem – 3T3-L1 Zellsensor mit multifunktionellen Reaktionen zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von Materialien und zur Beurteilung der Qualität von Materialien.
Die Eignung einer 3D Matrix zur Züchtung von qualitativ hochwertigen Zellen mit natürlichem Genexpressionsmuster kann mit Hilfe von Microarrays analysiert werden. Je nach Zelltyp und verwendeten Kulturbedingungen können unterschiedliche Genexpressionsmuster beobachtet werden. In diesem Ausführungsbeispiel wird die Erstellung eines Zellsensorsystems anhand von 3T3-L1 Fibroblasten dargestellt. Diese Zellen wurden zur Validierung einer offenporigen Schaumstruktur aus Polystyrol verwendet. Diese Zelllinie stellt eine Vorstufe zu Fettzellen dar. Die Zellen können sich durch Zugabe von geeigneten Differenzierungsmedien zu Fettzellen entwickeln. Die Zellen wurden in der 3D Struktur und als Kontrollgruppe in Standard Zellkulturschalen kultiviert. Nach einer Kulturdauer von 1, 3 und 5 Wochen wurden die Zellen lysiert und die in den Zellen enthaltene RNA isoliert. Ausgehend von dieser RNA wurden Microarrays angefertigt um den Differenzierungsgrad und damit die Qualität der Zellen auf dem zu testenden Substrat zu validieren. Insgesamt konnten so 22690 Gene untersucht werden. Zur Auswertung der Microarrays wurden 2 verschiedene Programme angewandt: RMA (Robust Multiarray Analysis) und ein Programm vom Hersteller Affymetrix (GCOS 1.2 software). Ausschließlich die Gene, für die beide Programme positive oder negative Expressionsunterschiede ergaben, wurden weiter untersucht. Von Interesse waren nur Gene, bei denen eine Veränderung um mindestens den Faktor 3 auftrat und zwar sowohl beim Vergleich mit der Affymetrix- sowie mit der RMA-Software.
Material und Methoden:
Gesamt RNA wurde für die weitere Microarrayanalyse mit einem Oligonukleotid GeneChip^® Mouse Genome 430A 2.0 Array (Affymetrix) gemäß der Herstellerangaben isoliert. In Kürze, 5 μg Gesamt RNA wurde verwendet, um Biotin-markierte cRNA zu synthetisieren und 10 μg fragmentierter cRNA wurden mit den GeneChips für 16 Stunden bei 45°C hybridisiert. Die GeneChips wurden gewaschen, wie empfohlen markiert und mit dem GeneArray Scanner, gesteuert durch die Affymetrix GCOS 1.2 Software, gescannt. Die unbearbeiteten Gen-Expressions-Daten wurden mit a) dem Affymetrix GCOS 1.2 Software Modul gemäß der Hersteller-Empfehlungen und b) durch die Robust Multiarray Analysis (RMA) (Irizarry, 2003#3) bearbeitet und normalisiert.
Gene, die reproduzierbar eine größer als 1,3-fache Regulation zeigten, wurden für die weitere Analyse verwendet.
Ergebnisse:

Die Gene des Fett-Stoffwechsels, die Expressionsunterschiede aufwiesen sind in der Tabelle 1 zusammengefasst, die Gene der extrazellulären Matrix (ECM) in der Tabelle 2.

Gen	Abkürzung	Funktion
Pyruvate carboxylase	Pcx	Fettsäuresynthese
Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1	Scd1	Tritt bei späterer Differenzierungsphase auf, Funktion bei Triglycerid-Metabolismus
Fatty acid binding Protein 5	Fabp5	Transport
Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1	Gpd1	Tritt bei späterer Differenzierungsphase auf, Funktion bei Triglycerid-Metabolismus
Apolipoprotein D	Apod	Transport
Fatty acid binding protein 4	Fabp4	Transport
Apolipoprotein C-I	Apoc1	Lipid-Transport
Adipsin	Adn	Von Adipozyten sezerniertes Protein
Lipin1	Lpin1	Lipid-Metabolismus
Adiponectin	Adipoq	Ausschließlich von Adipozyten sezerniertes Signalmolekül, Funktion beim Lipidstoffwechsel
Lipase	Lipe	Lipid-Metabolismus
Angiotensinogen	Agt	Von Adipozyten sezerniertes Protein
Resistin	Retn	Von Adipozyten sezerniertes Signalmolekül mit kontroverser Funktion
CD36 Antigen	Cd36	Tritt bei späterer Differenzierungsphase auf, Fettsäuretransporter

Tabelle 1: Wichtigste Faktoren des Fett-Stoffwechsels, die Expressionsunterschiede aufweisen

Gen	Abkürzung	Funktion
Fibromodulin	Fmod	Proteoglykan, Bestandteil der ECM, bindet Kollagenfibrillen
Procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1	Plod1	Einfluss auf CollagenStabilität
Tissue inhibitor of metalloproteinase 4	Timp4	Inhibitor des Collagenabbaus
Lumican	Lum	Proteoglykan, Bestandteil der ECM
Clusterin	Clu	Glykoprotein, Bestandteil der ECM

Tabelle 2: Wichtigste Faktoren der ECM, die Expressionsunterschiede aufweisen

Ausgehend von dieser ersten Filterung kann ein speziell auf diesen Zelltyp konfektionierter Microarray angefertigt werden, der nur die relevanten Gene enthält. Nachfolgend sind exemplarisch einige Vergleichsgruppen wiedergegeben:

1. Es wurde das Genexpressionsmuster von nicht induzierten Zellen nach 5 Wochen Kulturdauer auf Standard Kulturoberflächen (2D) und in einer 3D Matrix (3D) verglichen. Die in der 3D Matrix kultivierten Zellen zeigen erhöhte Expressionsniveaus bei fetttypischen Genen wie Adipsin oder Lipin 1, was auf eine verstärkte Differenzierung in der 3D Struktur schließen lässt.

induziert	Oberfläche	Zeitpunkt
nein	2D ⇔ 3D	5 Wo

Gensymbol	Genname	Fold Change RMA
Fmod	fibromodulin	7,41880099
Scd1	stearoyl-Coenzyme A desaturase 1	6,75264622
Scd1	stearoyl-Coenzyme A desaturase 1	6,73976255
Pcx	pyruvate carboxylase	3,7015062
Fabp4	fatty acid binding protein 4, adipocyte	7,1741056
Apoc1	apolipoprotein C-I	4,32503396
Adn	adipsin	20,2100308
Lpin1	lipin 1	4,73274873
Fabp4	fatty acid binding protein 4, adipocyte	5,9418088
Fabp4	Fatty acid binding protein 4, adipocyte	5,49877767
Fmod	fibromodulin	4,71459538
Fmod	fibromodulin	3,65339497
Retn	resistin	11,1491854
Cd36	CD36 antigen	33,8000785
Cd36	CD36 antigen	4,01193924
Fabp4	fatty acid binding protein 4, adipocyte	7,09433811
Fmod	fibromodulin	17,4081919

2. Zur Verifizierung der Ergebnisse aus 1. wurden die auf der Standard Kulturoberfläche (2D) kultivierten Zellen durch einen hormonellen Stimulus zur Differenzierung zu Fettzellen angeregt. Die bei den differenzierten Zellen exprimierten Gene decken sich größtenteils mit den exprimierten Genen der in der 3D Kultur gezüchteten Zellen.

induziert	Oberfläche	Zeitpunkt
ja ⇔ nein	2D	3 Wo

Gensymbol	Genname	Fold Change RMA
Pcx	pyruvate carboxylase	3,60800586
Scd1	stearoyl-Coenzyme A desaturase 1	26,6933954
Scd1	stearoyl-Coenzyme A desaturase 1	36,9262059
Fabp5	fatty acid binding protein 5, epidermal	3,22117879
Gpd1	glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 (soluble)	7,91468237
Apod	apolipoprotein D	–13,1097152
Pcx	pyruvate carboxylase	4,33910033
Fabp4	fatty acid binding protein 4, adipocyte	29,2428857
Apoc1	apolipoprotein C-I	3,77502085
Adn	adipsin	55,5907207
Adipoq	adiponectin, C1Q and collagen domain containing	98,9725419
Lipe	lipase, hormone sensitive	6,80543408
Lum	lumican	–3,94698561
Fabp4	fatty acid binding protein 4, adipocyte	9,38585906
Fabp4	fatty acid binding protein 4, adipocyte	5,48498243
Clu	clusterin	–3,51558536
Gpd1	glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 (soluble)	12,443891
Retn	resistin	17,0625426
Fabp4	fatty acid binding protein 4, adipocyte	24,1939835

Damit konnte gezeigt werden, dass alleine die Kultivierung von 3T3-L1 Fibroblasten in der zu testenden 3D Matrix ohne weitere äußere Stimuli zu einem verbesserten Differenzierungsverhalten führt. Ohne den Einsatz der Arraytechnologie wäre dieser Nachweis nicht möglich oder mit ungemein mehr Aufwand verbunden gewesen. Will man nun weitere Materialien auf diese Eigenschaft hin testen, reicht es aus einen speziell auf den verwendeten Zelltyp und die relevanten Gene hin ausgerichteten Array zu verwenden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten Kulturbedingungen als Kontrollgruppe, b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/in/zwischen verschiedenen zu testenden Materialien als Testgruppe, c) Ernten der Zeilen, d) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe, e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe, f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt, g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei dieser konfektionierte Microarray als Standard für die bestimmte Zellart definiert wird, und h) Bereitstellung dritter Zellen der bestimmten Zellart als Zellsensor sowie des in Schritt g) zusammengestellten Microarray-Standards.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zu testenden Materialien 3D-Matrixmaterialien sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der im Schritt g) zusammengestellte Microarray als Standard für die bestimmte Zellart und das verwendete 3D Matrixmaterial definiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei ein 3D Material zusammen mit den Zellen der bestimmten Zellart und dem Microarray als Zellsensorsystem im Schritt h) bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2–4, wobei das 3D Material mit CO₂ aufgeschäumtes Polystyrol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die Genaktivitäten von Genen aus dem zellspezifischen Genom bestimmt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, wobei für den Schritt d) whole Genome Microarrays verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, wobei die Genaktivitäten von Funktionsgruppen von Genen bestimmt werden, ausgewählt aus Gruppen von Genen der Funktionen Zellzyklus, Reaktionen am Zellkern, Bindung der Zelle an Oberflächen, Zellstress, Bildung des typischen Zytoskeletts, Signaltransduktion, Apoptose.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, wobei die Genaktivitäten auf Nukleinsäureebene und/oder auf Proteinebene bestimmt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–9, wobei die Genaktivitäten durch Verwendung der Microarray-Technik bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei ein DNA-Chip und/oder Protein-Chip verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–11, wobei der Faktor des Expressionsunterschiedes mindestens 2 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–11, wobei der Faktor des Expressionsunterschiedes mindestens 3 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–13, wobei die bestimmte Zellart 3T3-L1 Fibroblasten sind.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei für den Standard-Microarray für 3T3-L1 Fibroblasten folgende Gene verwendet werden: Pyruvat Carboxylase, Stearoyl-Coenzym A Desaturase 1, Fatty acid binding Protein 5, Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase 1, Apolipoprotein D, Fatty acid binding Protein 4, Apolipoprotein C-1, Adipsin, Lipin 1, Adinectin, Lipase, Angiotensinogen, Resistin, CD36 Antigen, Fibromodulin, Procollagen-Lysin 2-Oxoglutarat 5-Dioxygenase 1, Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4, Lumican und Clusterin.
Zellsensorsystem mit multifunktionellen Reaktionen, bestehend aus: – Zellen einer bestimmten Zellart – Microarray(s) mit den nach dem Verfahren 1 speziell für die verwendete Zellart erstellten Genprofilen.
Zellsensorsystem nach Anspruch 16, wobei das Zellsensorsystem eine 3D Matrix umfasst.
Zellsensorsystem nach Anspruch 17, wobei die 3D Matrix aus mit CO₂ aufgeschäumtem Polystyrol besteht.
Zellsensorsystem nach einem der Ansprüche 16–18, wobei das/die Microarray(s) ein DNA-Array und/oder ein Proteinarray ist/sind.
Zellsensorsystem nach einem der Ansprüche 16–19, wobei die Zellen 3T3-L1 Fibroblasten sind.
Zellsensorsystem nach Anspruch 20, wobei das Microarray folgendes Genprofil enthält: Pyruvat Carboxylase, Stearoyl-Coenzym A Desaturase 1, Fatty acid binding Protein 5, Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase 1, Apolipoprotein D, Fatty acid binding Protein 4, Apolipoprotein C-1, Adipsin, Lipin 1, Adinectin, Lipase, Angiotensinogen, Resistin, CD36 Antigen, Fibromodulin, Procollagen-Lysin 2-Oxoglutarat 5-Dioxygenase 1, Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4, Lumican und Clusterin.
Verfahren zur Beurteilung von Materialien, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe), b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/in/zwischen verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe), c) Ernten der Zellen, d) Bestimmung der Genaktivitäten, e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe, f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt, g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei dieser konfektionierte Microarray als Standard für die bestimmte Zellart definiert wird, und h) Kultivierung dritter Zellen der bestimmten Zellart unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe), i) Kultivierung von vierten Zellen der bestimmten Art auf verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe), j) Ernten der Zellen, k) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe unter Verwendung des Standard-Microarrays.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die zu testenden Materialien 3D-Matrixmaterialien sind.
Verfahren nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, wobei im Schritt h) die Kultivierung der Kontrollgruppe auf einem 3D Matrixmaterial erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23–24, wobei das 3D Material mit CO₂ aufgeschäumtes Polystyrol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22–25, wobei nur noch die Schritte h–k durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22–26, wobei das Zellsensorsystem gemäß einem der Ansprüche 16–21 verwendet wird.
Verwendung von Zellen im Zellsensorsystem nach Anspruch 16 zur Beurteilung der Qualität von Materialien anhand der zellbiologischen Reaktionen der Zellen.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Zellen 3T3-L1 Fibroblasten sind.
Verwendung von Microarrays zur Herstellung eines Standards zur Verwendung in einem Zellsensorsystem gemäß Anspruch 16.
Kit, umfassend das Zellsensorsystem einer der Ansprüche 16–21, Medium und eine 3D-Matrix.