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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das am Transport von Harnsäure und
deren Analoga oder am Austauschtransport von Harnsäure und
einem anderen Anion teilhat, als auch ein Polypeptid, das durch das
Gen codiert ist.
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Hintergrund
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Bei
der menschlichen Rasse und bei Primaten ist Harnsäure, welche
eine organische Säure
ist, ein Endmetabolit im Purinstoffwechsel in Zellen, die hauptsächlich in
der Niere ausgeschieden wird. Bei anderen Spezies als der menschlichen
Rasse und den Primaten wird sie durch eine Wirkung von Uricase in
der Leber zu Allantoin verstoffwechselt und in der Niere ausgeschieden.
Daher scheint es bei den anderen Säugern so zu sein, dass die
Auswirkungen einer dynamischen Abnormalität von Harnsäure, welche ein Zwischenprodukt in
der Niere darstellt, auf den lebenden Körper gering sind. Der Verlust
der Tätigkeit
der Uricase im evolutionären
Prozess scheint eine Ursache für
die Tatsache zu sein, dass die menschliche Rasse seit Urzeiten aufgrund
von Hyperurikämie
an Gicht gelitten hat.
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Beim
Menschen entsteht, wenn eine verminderte Ausscheidung von Harnsäure in der
Niere zu Hyperurikämie
führt,
mit hoher prozentualer Wahrscheinlichkeit eine Gicht, welche zu
einem Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen
und Bluthochdruck wird. Andererseits ist bekannt, dass ein Anstieg
der Ausscheidung von Harnsäure
in der Niere eine renale Hypourikämie verursacht. Obschon eine
Abnormalität
der Harnsäure-Kinetiken
bei diesen Erkrankungen nicht offensichtlich ist, ist vorgeschlagen
worden, dass Urattransporter in der Niere daran tief greifend beteiligt
sind.
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Die
Harnsäure-Kinetiken
in der Niere sind anhand von experimentellen Systemen unter Anwendung einer
Perfusionsmethode an einem entnommenen Organ und ei nes Systems mit
isolierten Zellmembranvesikeln untersucht worden. Beim Menschen
ist nachgewiesen worden, dass Harnsäure frei durch den Nierenglomerulus
passiert und daraufhin Mechanismen für die Reabsorption und Sekretion
im proximalen Tubulus konvoluta greifen. Mittels der herkömmlichen
Technik ist es jedoch schwierig gewesen, das Urattransportsystem über die
Zellmembran im Detail zu analysieren, weshalb es wünschenswert
geworden ist, den Transporter als solchen zu isolieren und zu analysieren.
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Es
ist bekannt, dass es einen bemerkenswerten Unterschied zwischen
den Spezies hinsichtlich des Urattransports in der Niere gibt, und
es Spezies gibt, bei denen die Sekretion dominant ist, wie etwa
bei Schweinen und Kaninchen, und andere Spezies, bei denen die Reabsorption
dominant ist, wie etwa bei Menschen, Ratten und Hunden. Von den
Spezies mit Sekretionsdominanz scheidet das Schwein 200 bis 300% Harnsäure pro
Einheit Nephron aus, wohingegen von den Spezies mit Harnsäure-Reabsorptionsdominanz
der Mensch lediglich etwa 10% Harnsäure pro Einheit Nephron ausscheidet.
Außerdem
ist bekannt, dass die Reaktionen auf urikosurische (Harnsäureausscheidungs-)Beschleuniger
und urikosurische Hemmer selbst unter den Spezies mit Reabsorptionsdominanz
verschieden sind. Da demgemäß die Kinetiken
der Harnsäure
und die Reaktionen auf Wirkstoffe in der Niere in Abhängigkeit
von den Spezies verschieden sind und die Harnsäure wechselseitig transportiert
wird, ist es nicht einfach gewesen, eine molekulare Entität des Urattransporters zu
isolieren, obschon dessen Existenz vorausgesetzt worden ist.
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Unter
den Urattransportern in der Niere sind die Transporter, die Harnsäure aus
dem renalen tubulären Lumen
reabsorbieren, bereits seit langem mittels eines experimentellen
Systems unter Anwendung des Systems mit isolierten Zellmembranvesikeln
untersucht worden. Für
die Arzneimittel, die derzeit bei Patienten mit Hyperurikämie und
Gicht eingesetzt werden, wird vorausgesetzt, dass der Transporter,
welcher Harnsäure
in der Niere reabsorbiert, gehemmt wird. Außerdem wird vorausgesagt, dass
eine renale Hypourikämie
durch eine genetische Abweichung dieses Transporters verursacht
wird.
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Vor
kurzem ist in mehreren Experimenten gezeigt worden, dass die Transporter,
die an der Reabsorption von Harnsäure beteiligt sind, Austauschtransporter
von Harnsäure
und verschiedenen Anionen sind. Von Pyrazinamid, das derzeit als
der First-Line-Drug
von den antituberkulösen
Wirkstoffen eingesetzt wird, ist gezeigt worden, dass Pyrazincarboxylat,
welches der Metabolit von Pyrazinamid ist, ein Austauschsubstrat
dieses Austauschtransporters ist und die Reabsorption von Harnsäure erleichtert.
Dies wird für
die Ursache einer Hyperurikämie
gehalten, die häufig
bei den Patienten beobachtet wird, die den antituberkulösen Wirkstoff
einnehmen.
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Entsprechend
wird von dem Transporter, der an der Reabsorption von Harnsäure in der
Niere beteiligt ist, angenommen, dass er eine wichtige Rolle für die internen
Kinetiken der Harnsäure
spielt. Es ist vorausgesetzt worden, dass die Aufklärung seiner
molekularen Entität
zur Erhellung des Wirkmechanismus von urikosurischen Beschleunigern
und der Ursache von renaler Hypourikämie, und somit zur Entwicklung
neuer heilender Medikamente für
Gicht, führt.
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Wir
haben zuvor organische Anionentransporter isoliert und darüber berichtet,
nämlich
OAT1 (organischer Anionentransporter) (Sekine, T. et al., J. Biol.
Chem., 272:18526–18529,
1997), OAT2 (Sekine, T. et al., FEBS Letter, 429:179–182, 1998),
OAT3 (Kusuhara, H. et al., J. Biol. Chem., 274:13675–13680,
1999) und OAT4 (Cha, S. H. et al., J. Biol. Chem., 275:4507–4512, 2000),
die zentrale Rollen im Medikamententransport in der Niere, Leber,
Gehirn, Plazenta und so weiter spielen. Diese Transporter, die zur
OAT-Familie zählen, stellen
jene Transporter dar, die zum Transportieren vieler organischer
Anionen mit unterschiedlichen chemischen Strukturen fähig sind
und die auch den Transport verschiedener anionischer Medikamente
vornehmen.
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WO 01/62923 beschreibt
humane Transporter und Ionenkanäle
(TRICH) und Polynukleotide, die TRICH identifizieren und codieren.
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Roch-Ramel
et al. (1994) American Journal of Physiology 266, F797–F805, beschreibt
den Urattransport in der Brush-Border-Membran der menschlichen Niere.
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Enomoto
et al (2002) Nature 417, 447–52,
beschreibt die molekulare Identifizierung eines renalen Urat-Anionenaustauschers,
der die Uratspiegel im Blut reguliert.
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Lipkowitz
et al. (2001) Journal of Clinical Investigation 107, 1103–15, beschreibt
die funktionelle Rekonstitution, das Membran-Targeting, die genomische
Struktur und die chromosomale Lokalisation eines humanen Urattransporters.
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Es
war nicht offensichtlich, ob der Urattransporter zu der bekannten
Transporterfamilie zählt,
doch da Harnsäure
eine dibasische Säure
sowohl mit Pyrimidinstruktur als auch Imidazolstruktur ist und eines
der organischen Anionen ist, wurde die Möglichkeit, dass der Urattransporter
phylogenetisch zu der OAT-Familie zählt, vorausgesetzt. Innerhalb
der OAT-Familie ist außerdem
vorausgesetzt worden, dass, da OAT4 auf der Seite des renalen tubulären Lumens
in der Niere vorliegt und das Vorhandensein des Transporters, der
an der Reabsorption von Harnsäure
beteiligt ist, ebenfalls auf der Seite des renalen tubulären Lumens
angenommen wird, der Transporter dem OAT4 phylogenetisch ähnlich ist.
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Aus
diesen Tatsachen haben wir angenommen, dass der Urattransporter
in der Niere zu der organischen Ionentransporter-Familie gehört.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung stellt eine Methode zum Nachweisen der Wirkung einer Substanz
eines Subjekts bereit, umfassend das Kontaktieren der Substanz mit
einem Protein und das Bestimmen, ob die Substanz den Transport von
Harnsäure
durch das Protein beeinflusst, wobei das Protein umfasst
- (i) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch
SEQ ID NR. 2 oder
- (ii) eine Aminosäuresequenz,
die davon durch Deletion, Substitution oder Addition von 1 bis 110
Aminosäuren
abgeleitet ist, oder
- (iii) eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 75% Homologie zu SEQ ID Nr. 2, und worin das Protein
zum Transportieren von Harnsäure
fähig ist.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
die Ergebnisse der Analyse der Expression der Messenger-RNA des
URAT1-Gens in verschiedenen organischen Geweben eines erwachsenen
Menschen und eines Embryos mittels Northern Blotting.
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2 zeigt
das Ergebnis der Zeitabhängigkeit
bei Harnsäureaufnahme-Experimenten durch
Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
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3 zeigt
die Ergebnisse der Konzentrationsabhängigkeit bei Harnsäureaufnahme-Experimenten durch
Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
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4 zeigt
die Ergebnisse der Untersuchung der Wirkungen von zugesetzten Salzen
bei Harnsäureaufnahme-Experimenten
anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
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5 zeigt
die Ergebnisse der pH-Abhängigkeit
bei Harnsäureaufnahme-Experimenten anhand
von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
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6 zeigt
die Ergebnisse der Vorinkubation mit verschiedenen organischen Säuren bei
Harnsäureaufnahme-Experimenten
anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
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7 zeigt
das Ergebnis der Untersuchung der Auswirkung von vorab injizierter
unmarkierter Milchsäure
(100 mM, 10 nl) bei Harnsäureaufnahme-Experimenten
anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
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8 zeigt
das Ergebnis der Untersuchung der Auswirkungen der Zugabe von verschiedenen
organischen Säuren
oder analogen Verbindungen davon zu dem System bei Harnsäureaufnahme-Experimenten anhand
von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
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9 zeigt
das Ergebnis der Untersuchung der Auswirkungen der Zugabe von Probenecid
bei verschiedenen Konzentrationen zu dem System bei Harnsäureaufnahme-Experimenten
anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
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10 zeigt
das Ergebnis der Untersuchung der Auswirkungen der Zugabe von Losartan
bei verschiedenen Konzentrationen zu dem System bei Harnsäureaufnahme-Experimenten
anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
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11 zeigt
die Exon-Intron-Struktur des URAT1-Gens im humanen Genom.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Wie
oben beschrieben, isolierten die vorliegenden Erfinder vier organische
Anionentransporter, OAT1, OAT2, OAT3 und OAT4. Sie weisen etwa 40%
Homologie der Aminosäuresequenzen
zueinander auf. Basierend auf diesen Sequenzen wurde die offengelegte
Information des humanen Genomprojekts durchsucht und wurden vielfache
neue Genfragmente mit einer Homologie zu OAT1, 2, 3 und 4 identifiziert.
Aus diesen wurde ein neues Genfragment, das einer Genlocus-Position
von OAT4 extrem nahe kommt, und eine Stelle, die ein Initiationscodon
sein müsste,
identifiziert. Ein Primer, der für
die 5' Stromaufwärts-Region
dieses Initiationscodons spezifisch ist, wurde hergestellt, und
die Isolierung dieses neuen Gens wurde mittels der 3'-RACE-(3-Schnellamplifikation der cDNA-Enden)-Methode
unter Verwendung von Messenger-RNA, die von verschiedenen Geweben
des Menschen stammte, angestrebt. Als ein Ergebnis wurde ein neuer
Klon (URAT1), der nie zuvor berichtet worden ist, mittels der 3'-RACE-Methode unter
Verwendung von Messenger-RNA der menschlichen Niere identifiziert.
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Der
Urattransporter 1, URAT1, der vorliegenden Erfindung weist die Fähigkeit
zum Transportieren von Harnsäure
und ihren Analoga durch die Zellmembran von einer Seite zu der anderen
Seite auf und ist außerdem
ein URAT/Anion-Austauscher, indem er das Anion auf der anderen Seite
der Zellmembran zu einem Austauschsubstrat macht.
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Das
Protein der vorliegenden Erfindung umfasst zum Beispiel solche mit
einer Aminosäuresequenz, in
der ein oder mehrere Aminosäuren
deletiert, substituiert oder addiert sind in der Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, und darüber hinaus eines mit der Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist. Die Aminosäuren könnten bis
zu einem Umfang deletiert, substituiert oder addiert sein, bei dem
die Urattransport-Aktivität
nicht verloren geht, was typischerweise von 1 bis etwa 110 und vorzugsweise von
1 bis etwa 55 Aminosäuren
umfasst. Solche Proteine weisen typischerweise bis zu 75% und vorzugsweise bis
zu 90% homolo ge Aminosäuresequenzen
zu der Aminosäuresequenz
auf, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist.
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Bei
der vorliegenden Erfindung kann die Isolierung des Gens mittels
der 3'-RACE-Methode vorgenommen
werden, indem typischerweise ein Primer aus etwa 30 Basen, die für ein Guanin-
oder Cytosin-reiches Gen spezifisch sind, im 5'-Stromaufwärts des Initiationscodons hergestellt
wird, eine reverse Transkription der von Gewebe stammenden Messenger-RNA
unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers mit einer Adaptorsequenz
vorgenommen wird und anschließend
eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung der Adaptorsequenz
und des Genspezifischen Primers durchgeführt wird. Es ist möglich, die
Akkuratheit der PCR durch die Verwendung einer hitzeresistenten
Polymerase mit höherer
Genauigkeit weiter zu steigern.
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Das
URAT-Transportergen der vorliegenden Erfindung kann isoliert und
erhalten werden durch Screening einer cDNA-Bibliothek, die unter
Verwendung von Nierengeweben oder Zellen in einem geeigneten Säuger als
einer Genquelle präpariert
ist. Zu den Säugern
zählt der
Mensch, und außerdem
nicht-menschliche Tiere wie ein Hund, Rind, Pferd, Ziege, Schaf,
Affe, Schwein, Kaninchen, Ratte und Maus.
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Das
Screening und die Isolierung des Gens kann in geeigneter Weise mittels
eines Homologie-Screenings und der PCR-Methode vorgenommen werden.
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Für die resultierende
cDNA ist es möglich,
die Basensequenz mittels der herkömmlichen Methode zu bestimmen,
die Translationsregion zu analysieren und die Aminosäuresequenz
des Proteins, das dadurch, d. h. URAT1, codiert ist, zu bestimmen.
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Es
kann zum Beispiel anhand der folgenden Methode verifiziert werden,
bei der das erhaltene Gen die cDNA des URAT-Transportergens ist,
d. h. bei der ein Genprodukt, das durch die cDNA codiert ist, der
Urattransporter ist. Die Fähigkeit
zum Transport (Aufnahme) von Harnsäure in Zellen kann durch Einführen von cRNA
(komplementäre
RNA), die aus der erhaltenen URAT1 cDNA präpariert ist, in eine Oozyte
zum Exprimieren und Messen der Aufnahme eines Substrats in die Zellen
mittels des her kömmlichen
Aufnahmeexperiments unter Verwendung von Harnsäure als dem Substrat bestätigt werden
(Sekine, T. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun., 251:586–591, 1998).
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Auch
kann die Transporteigenschaft und Substratspezifität von URAT1
durch Anwenden eines ähnlichen
Aufnahmeexperiments auf exprimierende Zellen untersucht werden.
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Weiterhin
kann die Eigenschaft von URAT1, zum Beispiel die Eigenschaft, dass
URAT1 den Transport bei Zeitabhängigkeit,
Substratselektivität
und pH-Abhängigkeit
des URAT1 vornimmt, untersucht werden, indem ein ähnliches
Aufnahmeexperiment bei den exprimierenden Zellen angewendet wird.
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Homologe
Gene und chromosomale Gene, die von den verschiedenen Geweben oder
verschiedenen Organismen abgeleitet sind, können durch Screening geeigneter
cDNA-Bibliotheken oder genomischer DNA-Bibliotheken isoliert werden,
die aus den verschiedenen Genquellen unter Verwendung der cDNA des erhaltenen
URAT1-Gens hergestellt
wurden.
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Auch
kann das Gen aus der cDNA-Bibliothek mittels der herkömmlichen
PCR-Methode unter
Verwendung synthetischer Primer isoliert werden, die auf der Grundlage
der Information zu der beschriebenen Basensequenz des Gens der vorliegenden
Erfindung entworfen sind (der Basensequenz, dargestellt durch SEQ
ID Nr. 1 oder einem Teil davon).
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Die
DNA-Bibliotheken, wie etwa eine cDNA-Bibliothek und genomische DNA-Bibliothek, können mittels
der Methoden hergestellt werden, die beschrieben sind zum Beispiel
bei "Sambrook, J.,
Fritsch E. F. und Maniatis, T., "Molecular
Cloning" (veröffentlicht
bei Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989)". Alternativ kann, wenn eine kommerziell
verfügbare
Bibliothek existiert, diese verwendet werden.
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Um
die Struktur des URAT1-Gens auf dem humanen Genom zu erhalten, wird
die genomische DNA-Bibliothek unter Verwendung der erhaltenen cDNA
des URAT1- Gens gescreent,
und die erhaltenen Klone werden analysiert. Alternativ kann die
Struktur auf der Grundlage der offengelegten Information zu den
Ergebnissen der humanen Genomanalyse unter Verwendung eines Homologie-Suchprogramms
gesucht werden.
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Der
Urattransporter (URAT1) der vorliegenden Erfindung kann mittels
einer genetischen Rekombinationstechnologie unter Verwendung der
cDNA, die den Urattransporter codiert, produziert werden. Zum Beispiel
ist es möglich,
eine DNA (cDNA etc.), die den Urattransporter codiert, in einen
geeigneten Expressionsvektor zu inkorporieren und die resultierende
rekombinierte DNA in entsprechende Wirtszellen einzuführen. Expressionssysteme
(Wirtsvektorsystem) zur Erzeugung des Polypeptids umfassen die Expressionssysteme von
Bakterien, Hefen, Insektenzellen und Säugerzellen. Um das funktionelle
Protein zu erhalten, ist aus diesen die Verwendung der Insektenzellen
und der Säugerzellen
erwünscht.
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Wird
das Polypeptid zum Beispiel in den Säugerzellen exprimiert, so wird
ein Expressionsvektor durch Einführen
von DNA konstruiert, die den Urattransporter im Stromabwärts eines
entsprechenden Promotors (z. B. SV40 Promotor, LTR Promotor, Elongations-1α-Promotor
und ähnliches)
in einem geeigneten Expressionsvektor (z. B. retroviraler Vektor),
Papillomavirus-Vektor, Vaccinia-Virus-Vektor, SV40-Vektor und ähnliches)
codiert. Als nächstes
wird das Zielpolypeptid durch Transformieren entsprechender Tierzellen
mit dem erhaltenen Expressionsvektor und Kultivieren der Transformanten
in einem entsprechenden Medium erzeugt. Die Säugerzellen als den Wirten umfassen
Zelllinien, wie Affen-COS-7-Zellen, Chinesischer Hamster CHO-Zellen, humane HeLa-Zellen
und Primärkulturzellen,
die von Nierengeweben abgeleitet sind, LLC-PK1-Zellen, die von der
Schweineniere abgeleitet sind, OK-Zellen, die von der Beutelrattenniere
abgeleitet sind, und S1-, S2- und S3-Zellen des proximalem Tubulus
konvoluta, die von der Maus stammen.
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Als
der cDNA, die den Urattransporter URAT1 codiert, ist die Verwendung
der cDNA mit der in Sequenz 1 gezeigten Basensequenz möglich, und
außerdem
ist das Designing einer DNA entsprechend der Aminosäuresequenz
und die Verwendung der DNA, die das Polypeptid codiert, möglich, so
dass keine Beschränkung
auf die obige cDNA besteht. In diesem Falle sind 1 bis 6 Codons,
die eine Aminosäure
codieren, bekannt, und das verwendete Codon kann optional ausgewählt werden,
doch ist das Designing einer Sequenz mit einer hohen Expression
unter Berücksichtigung
der Nutzung der Codonfrequenz in dem für die Expression verwendeten
Wirt möglich.
Die DNA mit der entworfenen Sequenz kann durch chemische Synthese
der DNA, Fragmentierung und Bindung der obigen cDNA, partielle Modifikation
der Basensequenz und ähnliches
erhalten werden. Die künstliche
partielle Modifikation und Mutagenese kann durch ortsspezifische
Mutagenese-Methoden (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 18:5662–5666,
1984) unter Verwendung von Primern, einschließlich synthetischer Oligonukleotide,
die die gewünschte
Modifikation codieren, vorgenommen werden.
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Die
Nukleotide (Oligonukleotide oder Polynukleotide), die mit dem Urattransportergen
der vorliegenden Erfindung unter einer stringenten Bedingung hybridisieren,
können
als Sonden zum Nachweis des Urattransportergens verwendet werden,
und können
außerdem
zum Beispiel als Antisense-Oligonukleotide, Ribozyme und Decoys,
um die Expression des Urattransporters zu modulieren, verwendet
werden. Als solch ein Nukleotid ist zum Beispiel die Verwendung
von Nukleotiden möglich,
die typischerweise eine Teilsequenz von 14 oder mehr aufeinander
folgenden Basen oder die komplementäre Sequenz dazu in der durch
SEQ ID Nr. 1 dargestellten Basensequenz umfassen. Um die Hybridisation
spezifischer zu machen, kann als der partiellen Sequenz eine längere Sequenz,
z. B. eine Sequenz von 20 oder mehr Basen oder 30 oder mehr Basen,
verwendet werden.
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Auch
ist zur Verwendung des Urattransporters der vorliegenden Erfindung
oder des Polypeptids mit immunologischer Äquivalenz dazu der Erhalt von
Antikörpern
dazu möglich,
wobei die Antikörper
für den
Nachweis und die Reinigung des Urattransporters genützt werden
können.
Der Antikörper
kann unter Verwendung des Urattransporters der Erfindung, eines
Fragments davon oder eines synthetischen Peptids mit der Teilsequenz
davon und ähnliches
als einem Antigen produziert werden. Der polyklonale Antikörper kann
mittels der herkömmlichen
Methode produziert werden, bei der das Antigen in das Wirtstier
(z. B. Ratte oder Kaninchen) geimpft wird und das immunisierte Serum
entnommen wird, und der monoklonale Antikörper kann mittels der herkömmlichen
Technologie, wie etwa einer Hybridommethode, produziert werden.
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Außerdem stellt
die vorliegende Erfindung eine Screening-Methode einer Substanz
mit urikosurisch beschleunigender Wirkung bereit. Das Protein der
Erfindung dient zum Transport von Harnsäure in die Zellen und ist an
der Reabsorption der Harnsäure
tiefgreifend beteiligt. Wie in 6, 8, 9 und 10 gezeigt,
ist es auch möglich,
die Beschleunigung oder Hemmung der Wirkung für die Harnsäure-Aufnahme der Screening-Substanz
in dem System zu quantifizieren, wobei das Protein der Erfindung
durch Zugeben von Harnsäure
zu dem System, weiterhin Hinzufügen
der Screening-Substanz dazu und Vergleichen einer Harnsäure-Aufnahmemenge
mit der in dem Falle ohne Zugabe der Screening-Substanz exprimiert
wird. Wie in 6 und 8 gezeigt
ist, haben die klinisch als urikosurische Beschleuniger verwendeten
Substanzen die Aufnahme von Harnsäure in dem obigen experimentellen
System deutlich gehemmt, womit gezeigt ist, dass das Screening der
urikosurisch beschleunigenden Wirkung der Screening-Substanz in
diesem System möglich geworden
ist. Als den in diesem Screening-System verwendeten Zellen sind
diese Zellen nicht auf die in den folgenden Experimenten verwendeten
Oozyten beschränkt,
und die Verwendung verschiedener lebender Zellen ist möglich, solange
die Zellen das Protein der Erfindung exprimieren können.
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Daher
stellt die vorliegende Erfindung die Methode zum Durchmustern von
Substanzen mit urikosurisch regulierender Wirkung unter Verwendung
des Proteins der Erfindung bereit. Die urikosurisch regulierenden
Wirkungen bestehen in der urikosurisch beschleunigenden Wirkung
und der urikosurisch hemmenden Wirkung, wobei jene mit der urikosurisch
beschleunigenden Wirkung für
die Behandlung/Verhütung
von Hyperurikämie
und Gicht bevorzugt sind. Somit umfasst die bevorzugte urikosurisch
regulierende Wirkung die urikosurisch beschleunigende Wirkung. Darüber hinaus
stellt die vorliegende Erfindung urikosurische Regulatoren bereit,
die mittels der obigen Screeningmethode gescreent werden. Der bevorzugte
Harnsäure-Regulator umfasst
einen urikosurischen Beschleuniger. Der mittels der Methode der
Erfindung gescreente urikosurische Regulator kann die Aufnahme von
Harnsäure
durch den Urattransporter regulieren, der an dem Urattransport in
die Niere beteiligt ist, und kann daher als ein aktiver Inhaltsstoff
der Medikament für
die Behandlung/Verhütung
verschiedener Erkrankungen verwendet werden, die mit der Reabsorption
von Harnsäure
in Verbindung stehen, wie etwa Hyperurikämie und Gicht.
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Es
ist möglich,
den erhaltenen aktiven Inhaltsstoff zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung
unter Verwendung eines pharmakologisch akzeptablen Trägers zu
formulieren.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele in
größerer Ausführlichkeit
beschrieben werden, wobei diese Beispiele aber die Erfindung nicht
beschränken.
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In
den folgenden Beispielen wurden, sofern nicht anderweitig spezifiziert,
die jeweiligen Manipulationen mittels der Methoden vorgenommen,
die beschrieben sind bei "Sambrook,
J., Fritsch E: F., und Maniatis, T., "Molecular Cloning" (veröffentlicht von Cold Spring
Harbor Laborstory Press, 1989)",
bzw. wurden, bei Verwendung von handelsüblichen Kits, diese gemäß den Anleitungen
der kommerziell beziehbaren Artikel verwendet.
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Beispiel 1: Isolierung der Nieren-spezifischen
Urattransporter-(URAT1)-cDNA und deren Analyse
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Auf
der Grundlage der Basensequenz-Information von OAT1, OAT2, OAT3
und OAT4, die durch die vorliegenden Erfinder bereits isoliert wurden,
wurden die offengelegten Analyseergebnisse des humanen Genomprojekts
unter Verwendung des Homologie-Suchprogramms durchsucht. Als ein
Ergebnis wurden vielfache neue Genfragmente mit Homologie zu OAT1,
OAT2, OAT3 und OAT4 erhalten. Unter diesen wurde eines der neuen
Genfragmente, das einer Genlocus-Position von OAT4 extrem nahe kommt,
analysiert, und die Stelle, die das Initiationscodon sein müsste, wurde
darin identifiziert. Dieses Initiationscodon wurde durch Vergleichen
der neuen Genfragmente mit den Gensequenzen von OAT1 und OAT4 identifiziert.
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Ein
für die
5' Stromaufwärts-Region
des vorhergesagten Initiationscodons spezifischer Primer wurde unter
Verwendung von 28 Basen hergestellt, und die Isolierung dieses neuen
Gens wurde mittels der 3'-RACE-(3'-Schnellamplifikation
der cDNA-Enden)-Methode
unter Verwendung von Messenger-RNA, die von verschiedenen Geweben
des Menschen stammte, angestrebt. Als ein Ergebnis wurde ein Monoklon
(URAT1) mittels der 3'-RACE-Methode
unter Verwendung von Messenger-RNA der menschlichen Niere erhalten.
Eine mittels der PCR-Methode erhaltene einzelne Bande wurde in den
pCRII-TOPO-Vektor unter Anwendung einer TA-Kloniermethode subkloniert,
und wurde weiter in den pcDNA 3.1(+)-Vektor subkloniert, welcher
der Expressionsvektor war. Als ein Ergebnis wurde eine neue cDNA
(URAT1 cDNA), die eine Urattransport-Aktivität aufweist, erhalten (für die Analyse
der Transportfunktion siehe das Folgende).
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Die
Bestimmung der Basensequenz der cDNA (URAT1 cDNA), die anhand des
obigen erhalten wurde, wurde unter Verwendung spezifischer Primer
mittels eines automatischen Sequenzierers (hergestellt von Applied
Biosystems) durchgeführt
(beschrieben in SEQ ID Nr. 1).
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Die
Expression des URAT1-Gens wurde in verschiedenen Geweben des Menschen
analysiert (Northern Blotting) (1). Volllängen-URAT1-cDNA
wurde mit 32P-dCTP markiert, und unter Verwendung
dieser als einer Sonde wurde die Hybridisation unter Verwendung
von Filtern (hergestellt von Clontech) unter Aufblotten von RNA,
die aus verschiedenen menschlichen Geweben extrahiert war, durchgeführt. Die
Hybridisation wurde über
Nacht in einer Hybridisationslösung
vorgenommen, die die markierte Volllängen-URAT1-cDNA umfasst, und
die Filter wurden mit 0,1 × SSC,
umfassend 0,1% SDS bei 65°C,
gewaschen. Als ein Ergebnis des Northern Blotting wurde eine intensive
Bande in dem Nierengewebe detektiert. In humanen embryonalen Geweben
wurde die Bande in der Niere detektiert.
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Beispiel 2: Analyse der Urattransporter-Funktionen
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Aus
einem Plasmid, umfassend URAT1 cDNA, wurde die cRNA (die zu der
cDNA komplementäre RNA)
in vitro unter Verwendung von T7 RNA Polymerase präpariert
(siehe Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272:18526–18529,
1997).
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Die
resultierende cRNA wurde in Oozyten des Krallenfroschs (Platanna)
injiziert, und Aufnahme-Experimente der radiomarkierten Harnsäure in diese
Oozyten wurden gemäß der bereits
berichteten Methode durchgeführt
(Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272:18526–18529, 1997). Als ein Ergebnis
wurde festgestellt, dass die Oozyten, in denen URAT1 exprimiert
wurde, die Aufnahme von [14C]Harnsäure zeigten,
wie in 2 gezeigt. Die Oozyten, in denen URAT1 exprimiert
wurde, zeigten eine Zeitabhängigkeit
in der Aufnahme der [14C]Harnsäure. Dies
zeigte an, dass URAT1 nicht nur an Harnsäure gebunden wurde, sondern
auch der Transporter war, um diese in die Zellen zu transportieren.
Keine Aufnahme von [14C]PAH (Para-Aminohippursäure) und
[14C]TEA (Tetraethylammonium), die ein repräsentatives
Substrat der organischen Ionentransporter-Familie sind, wurde beobachtet
(nicht gezeigt).
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Ein
dynamisches Michaelis-Menten-Experiment des Urattransports durch
URAT1 wurde durchgeführt. Die
Konzentrationsabhängigkeit
der Harnsäure
in dem Transport durch URAT1 wurde durch Untersuchen der veränderten
Aufnahmemengen an Harnsäure
bei verschiedenen Konzentrationen durch URAT1 untersucht. Das Aufnahme-Experiment
der radiomarkierten Harnsäure
wurde unter Verwendung von Oozyten durchgeführt, die mit URAT1 cRNA gemäß der oben
beschriebenen Methode injiziert waren. Als ein Ergebnis (3) betrug
der Km-Wert (Michaelis-Konstantzahl)
der Harnsäure-Aufnahme
etwa 372 ± 25 μM.
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Die
Wirkung der verschiedenen Elektrolyte auf den Urattransport durch
URAT1 wurde untersucht (4). Wurde extrazelluläres Natrium
durch Lithium, Cholin und N-Methyl-D-glucamin (NMDG) ersetzt, so war
der Urattransport über
URAT1 nicht verändert.
Es wurde gezeigt, dass URAT1 der extrazelluläre Natrium-unabhängige Urattransporter
war. Wurden extrazelluläre
Kaliumionen vollständig
durch Natrium ersetzt (0-K+ in 4) und wurde
Natrium vollständig
durch die Kaliumionen ersetzt (96 mM KCl), so war der Urattransport
nicht ebenfalls verändert,
was nachwies, dass URAT1 Zellmembranpotential-unabhängig war.
Wurden extrazelluläre
Chloridionen durch Gluconsäure
ersetzt, so war die Aufnahme von Harnsäure signifikant erhöht. Aus
dem experimentellen System unter Anwendung des Systems mit isolierten
Zellmembranvesikeln wurde das Vorhandensein des Austauschers von
Harnsäure
und Chlorid auf der Seite des renalen tubulären Lumens in der menschlichen
Niere gezeigt. Somit legt dieses experimentelle Ergebnis nahe, dass
Chlorid das Austauschsubstrat von Harnsäure sein könnte.
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Die
pH-Abhängigkeit
im Urattransport durch URAT1 wurde untersucht. Wie in 5 gezeigt,
war, wenn der extrazelluläre
pH angesäuert
war, der Urattransport in der mit URAT1 cRNA injizierten Oozyte
erhöht, doch
scheint dies durch eine nichtspezifische Absorption von Harnsäure bei
den mit Wasser injizierten Oozyten (Kontrolle) bewirkt zu sein.
Der substantielle Urattransport (URAT1-Kontrolle) war in Abhängigkeit
vom pH-Wert nicht verändert.
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Beispiel 3: Untersuchung zum Austauschsubstrat
von Harnsäure
im Urattransporter
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Ausgehend
von dem experimentellen System unter Anwendung des Systems mit isolierten
Zellmembranvesikeln wurde vorgeschlagen, dass Monocarboxylsäuren wie
Milchsäure
und Nikotinsäure
das Austauschsubstrat von Harnsäure
in dem Harnsäure/Anionenaustausch
in der humanen Niere sein könnten.
Um das Austauschsubstrat von Harnsäure in URAT1 zu untersuchen,
wurden die Oozyten mit diesen Monocarboxylsäuren (1 mM), Para-Aminohippursäure und
Ketoglutarsäure,
vorinkubiert und anschließend
der Transport der Harnsäure
gemessen (6). Wurden die Oozyten mit 1
mM Pyrazincarboxylsäure
und Nikotinsäure (3-Pyridincarboxylsäure) vorinkubiert,
so war die Aufnahme von Harnsäure
in den mit URAT1 cRNA injizierten Oozyten signifikant erhöht. Wurden
die Oozyten dagegen mit Para-Aminohippursäure und Ketoglutarsäure vorinkubiert,
die keine Monocarboxylsäuren
sind, so war die Aufnahme von Harnsäure nicht erleichtert. Die obigen
Ergebnisse zeigen, dass Monocarboxylsäuren wie Pyrazincarboxylsäure und
Nikotinsäure
das Austauschsubstrat von Harnsäure
sind.
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Wie
in 6 war, wenn die Oozyten mit Milchsäure, die
eine Monocarboxylsäure
ist, vorinkubiert waren, die Aufnahme von Harnsäure nicht erleichtert. Es wurde
angenommen, dass dies deshalb eintrat, weil die aufgenommene Milchsäure aus
den Zellen heraus über
einen anderen Weg als über
URAT1 aufgrund der reichlichen Expression von endogenen Laktattransportern
in den Oozyten transportiert wurde. Ebenso wurde angenommen, dass
die geringe Affinität
von Milchsäure
zu URAT1, wie unten gezeigt, ebenfalls eine der Ursachen war. Daher
wurden 100 nl an 100 mM nicht-radiomarkierter L-Milchsäure vorab
in die Oozyten injiziert und daraufhin die Aufnahme der radiomarkierten
Harnsäure
beobachtet (7). Wurde Milchsäure vorab
injiziert, so wurde eine signifikant hohe Aufnahme an Harnsäure im Vergleich
zu dem Falle beobachtet, bei dem Wasser injiziert wurde. Selbst
wenn Para-Aminohippursäure und
Ketoglutarsäure
injiziert wurden, wurde keine Veränderung im Vergleich zu dem
Falle beobachtet, bei dem Wasser injiziert wurde (nicht gezeigt).
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Aus
den Ergebnissen in 6 und 7 ist URAT1
der Austauscher von Harnsäure
und Monocarboxylsäure.
Pyrazinamid, welches ein antituberkulöser Arzneistoff ist, wird zu
Pyrazincarboxylsäure
metabolisiert, welche dann in den Harn ausgeschieden wird, wobei
es behauptetermaßen
die Reabsorption von Harnsäure
erleichtert. Das obige Ergebnis zeigt, dass als einer Folge des
Austauschs von Harnsäure
und Pyrazincarboxylsäure
in URAT1 die Aufnahme von Harnsäure
erleichtert ist. Demgemäß wurde
der Mechanismus in der Verursachung einer Hyperurikämie nachgewiesen,
bei welcher es sich um eine Nebenwirkung von Pyrazinamid handelt,
das ein antituberkulöser
Arzneistoff ist.
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Beispiel 4: Durchmusterung auf die inhibitorische
Substanz für
den Urattransporter
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Um
die Substratselektivität
von URAT1 in dem Aufnahme-Experimentsystem der [14C]Harnsäure durch die
Oozyten, die mit URAT1 cRNA injiziert waren, weiter zu untersuchen,
wurden dem System verschiedene Substanzen zugegeben und wurden ihre
Wirkungen untersucht (inhibitorische Experimente). Das Aufnahme-Experiment
von [14C]Harnsäure wurde unter Verwendung
von Oozyten, die mit URAT1 cRNA injiziert waren, gemäß der oben
beschriebenen Methode durchgeführt
(8, 9 und 10). Die
Aufnahme von 50 μM
[14C]Harnsäure wurde unter der Bedingung
von pH 7,4 in der Gegenwart und Abwesenheit der verschiedenen Verbindungen
(unmarkiert) bei den in 8 gezeigten Konzentrationen
gemessen. Als ein Ergebnis hemmten verschiedene Monocarboxylsäuren (L-Milchsäure, D-Milchsäure, Nikotinsäure, Pyrazincarboxylsäure) den
Transport von [14C]Harnsäure durch URAT1 signifikant
(8). Ketoglutarsäure, welches eine Dicarboxylsäure ist
und welche das Austauschsubstrat von OAT1 sein könnte, hemmte unter der Bedingung
von pH 7,4 nicht. Pyrazindicarboxylsäure, welche eine ähnliche
Struktur zu Pyrazincarboxylsäure
aufweist, zeigte eine etwas schwacher inhibierende Wirkung. Anionische
und kationische Substanzen, wie etwa Para-Aminohippursäure und
Tetraethylammonium, zeigten keinerlei inhibitorische Wirkung (8).
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Für die Behandlung
von Hyperurikämie
verwendete Medikamente, wie etwa Probenecid, Benz-Bromaron, Sulfinpyrazon
und Phenylbutazon, hemmten die Aufnahme von Harnsäure über URAT1
signifikant. Losartan, welches ein Arzneimittel für die Behandlung
von Bluthochdruck ist und welches bekanntermaßen die urikosurisch beschleunigende
Wirkung zeigt, hemmte die Aufnahme von Harnsäure durch URAT1, ebenso wie auch
sein Metabolit, EXP-3174, signifikant. Aus den obigen Ergebnissen
ist URAT1 eine Wirkstelle der repräsentativen urikosurischen Beschleuniger,
die derzeit klinisch verwendet werden.
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Die
inhibitorischen Wirkungen auf die Aufnahme-Tätigkeit der Harnsäure über URAT1
wurden unter Verwendung von Probenecid und Losartan bei verschiedenen
Konzentrationen untersucht (9 und 10).
Ihre IC50-Werte betrugen etwa 50 μM
bzw. 20 μM.
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Beispiel 5: Strukturanalyse des URAT1-Gens
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Die
Struktur des URAT1-Gens in dem humanen Genom wurde analysiert. Die
offengelegte Information der Ergebnisse der humanen Genomanalyse
wurde unter Verwendung des Homologie-Suchprogramms durchsucht, und
die Exon-Intron-Struktur des URAT1-Gens wurde nachgewiesen. Wie
in 11 gezeigt, bestand das URAT1-Gen aus 10 Exons,
wobei sich das Initiationscodon in dem ersten Exon befand.
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Industrielle Anwendbarkeit
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Der
Nieren-spezifische Urattransporter der vorliegenden Erfindung, der
Harnsäure
selektiv transportiert, und sein Gen ermöglichen die in vitro-Untersuchung
des Transports von Harnsäure
und ihrer Analoga an die Stelle, an der der Transporter exprimiert
wird, wobei, basierend auf der Studie, die internen Kinetiken der Verbindung
vorausgesagt werden können.
Harnsäure
ist der Faktor, der an Hyperurikämie
und Gicht tiefgreifend beteiligt ist, und es scheint so zu sein,
dass die Erfindung bezüglich
des Transporters zur Klärung
der Pathogenese von Hyperurikämie
und Gicht in der Zukunft beitragen wird. Der Transporter zeigt die
Wirkung, Harnsäure
in der Niere zu reabsorbieren, und es scheint, dass der Transporter
zur Aufklärung
des verursachenden Gens der renalen Hypourikämie, bei der der Reabsorptionsmechanismus
der Harnsäure
verloren gegangen ist, beitragen wird. Außerdem kann die Aufklärung der
neuen Verbindungen, die die Funktion des Transporters hemmen, und
der Kontrollfaktoren, die die Expression modulieren, zu der Entwicklung
neuer therapeutischer Methoden für
Hyperurikämie
und Gicht beitragen. SEQUENZLISTE
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