DE69928270T2

DE69928270T2 - Neutraler aminosäurentransporter und korrespondierendes gen

Info

Publication number: DE69928270T2
Application number: DE69928270T
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Sagamihara-shi ENDOU; Yoshikatsu Kanai
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: J Pharma Co Ltd
Priority date: 1998-09-03
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2019-09-04
Also published as: CA2341777A1; US7666999B2; EP1111048A4; US20050019811A1; CA2341777C; US20120083588A1; US20050003490A1; WO2000014228A8; AU5448799A; US7332572B1; US7332293B2; AU766306B2; US20050064475A1; JP4689781B2; JP2000157286A; WO2000014228A1; DE69928270D1; US20050019812A1; US7413895B2; US7335482B2

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Aminosäuretransporterprotein oder einen Teil davon, DNA, die für das Protein oder einen Teil davon codiert, RNA, die für das Protein oder einen Teil davon codiert, DNA, die an die DNA hybridisiert, einen Expressionsvektor, der die DNA enthält, eine transformierte Zelle, die durch die DNA oder durch den Vektor transformiert ist, eine Zelle, in welche die RNA eingeführt ist, einen Antikörper oder einen Teil davon mit einer Reaktivität mit dem Protein oder einem Teil davon, eine Zelle, die den Antikörper produziert, eine markierte DNA, worin ein Teil der DNA radiomarkiert ist, eine markierte RNA, worin ein Teil der RNA radiomarkiert ist, einen markierten Antikörper, wobei der Antikörper oder ein Teil des Antikörpers markiert ist, ein Kit, der die markierte DNA umfasst, ein Kit, der die markierte RNA umfasst, ein Kit, der den markierten Antikörper umfasst, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Teil der DNA enthält, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Teil der RNA enthält, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper oder einen Teil des Antikörpers enthält, ein Verfahren zur Bestimmung, ob das Protein exprimiert ist oder zur Messung der exprimierten Menge davon, ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz mit der Fähigkeit zum Hemmen der biologischen Aktivität des Proteins, ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz mit der Fähigkeit zum Hemmen der Transkription von DNA, die für das Protein codiert, zu mRNA, ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz mit der Fähigkeit zum Hemmen der Expression des Proteins, eine Substanz, die durch das Identifikationsverfahren identifiziert wird, und eine transgene Maus, in die die DNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, eingeführt wird.
Hintergrund der Erfindung
Aminosäuren spielen nicht nur als ein Substrat für die Proteinsynthese eine sehr wichtige Rolle, sondern auch als ein Vorläufer in der Gluconeogenese und in der Biosynthese vieler Biomoleküle, z.B. von Porphyrin, Purin und Pyrimidin.
Die meisten dieser Biosynthesereaktionen erfolgen in Zellen, weshalb die Zellen verschiedene Proteine, die allgemein als Aminosäuretransporter für den Einbau von Aminosäuren in die Zellen von außerhalb der Zelle bezeichnet werden, in ihrer Zellmembran enthalten.
Der Aminosäuretransporter dient nicht nur der Zuführung von Aminosäuren an Zellen, sondern ist auch in Geweben enthalten, die eine Rolle beim Epitheltransport von Aminosäuren in den Dünndarm und Nierenkanal und der Resorption von Neurotransmittern in Nervengewebe spielen, wobei er an einer wichtigen Position für die Expression einer spezifischen Funktion der Gewebe angesiedelt ist.
Bezüglich eines Aminosäure-Transportmechanismus (ein durch einen Aminosäuretransporter vermitteltes Aminosäure-Transportsystem) ist seit etwa 1960 an der Identifikation und Klassifikation unter Verwendung kultivierter Zellen und Zellmembranproben gearbeitet worden und es sind – die Vielfältigkeit der Aminosäuremoleküle widerspiegelnd – Aminosäure-Transportsysteme identifiziert worden, die durch verschiedene Aminosäuretransporter mit unterschiedlicher Substratspezifität vermittelt sind (Physiol. Rev. Vol. 70, S. 43–77, 1990).
Allerdings funktioniert solch ein Transportsystem nicht individuell für jede Aminosäure, sondern trägt jede Aminosäure den intrazellulären Transportweg für mehr als eine Aminosäure in sich, wobei die mehreren Aminosäuren als Substrate eingesetzt werden.
Aminosäuren sind als basische Aminosäuren (Diamino/Monocarbonsäuren) mit positiver Ladung, sauren Aminosäuren (Monoamino/Dicarbonsäuren) mit negativer Ladung und neutralen Aminosäuren (Monoamino/Monocarbonsäuren; bzw. jenen ausschließlich der basischen Aminosäuren und der sauren Aminosäuren) klassifiziert.
Aufgrund der Ladung der Aminosäure ist, wenn eine neutrale Aminosäure oder eine saure Aminosäure mit negativer Ladung zum Beispiel in Zellen mit negativem elektrischen Potenzial gegen den Konzentrationsgradienten transportiert wird, die Durchführung eines aktiven Transports erforderlich, der mit einem gewissen Energieverbrauch verbunden ist.
Unter diesem Gesichtspunkt sind Aminosäuretransporter, die sowohl eine Abhängigkeit von Natrium (Na⁺) als auch eine Unabhängigkeit von Na⁺ aufweisen, wie im Falle eines Zuckertransportsystems vorhanden. Der Na⁺-abhängige Transporter weist eine hohe Konzentrationsfähigkeit auf, da er zum Transport der Aminosäure gegen den Konzentrationsgradienten durch Koppeln des Aminosäuretransports mit dem Na⁺-Transport fähig ist und daher eine wichtige Rolle an der Stelle im lebenden Körper spielt, an der die Bildung eines großen, durch die Zellmembran vermittelten Konzentrationsunterschieds erforderlich ist (Annual Rev. Kidney "Structure and Function of Kidney-Specific Organic Solute Transporters", S. 91–100, veröffentlicht von Chugai Igakusha). Dieser Na⁺-abhängige Transporter kann weiter in zwei Familien klassifiziert werden, d.h. eine Na⁺/Cl^–-abhängige Transporterfamilie und eine Na⁺/K^–-abhängige Transporterfamilie (Annual Rev. Neurosci. Band 16, S. 73–93, 1993 und FASEB J., Band 7, S. 1450–1459, 1993).
Weiterhin können bei einer Kombination dieser Ladungseigenschaften Aminosäuretransporter im Hinblick auf ihre Substratspezifität in Moleküle klassifiziert werden, bei denen basische Aminosäure (Diamino/Monocarbonsäure) ein Substrat ist, Moleküle, bei denen saure Aminosäure (Monoamino/Dicarbonsäure) ein Substrat ist, und Moleküle, bei denen neutrale Aminosäure (Monoamino/Monocarbonsäure, bzw. jene ausschließlich basischer Aminosäure oder saurer Aminosäure) ein Substrat ist.
Es ist bekannt, dass zum Beispiel eine basische Aminosäure mit einer Aminogruppe oder Imidazolgruppe an der Seitenkette, wie etwa Arginin, Lysin und Histidin (basische Aminosäuren, die nahezu neutral sind) zum Großteil durch einen Na⁺-unabhängigen Aminosäuretransporter y⁺ transportiert wird (J. Membrane Biol., Band 66, S. 213–225, 1982). Es ist bekannt, dass eine saure Aminosäure mit einer Carboxylgruppe an der Seitenkette, wie etwa Glutaminsäure und Aspartinsäure, durch einen Na⁺-abhängigen Aminosäuretransporter X_AG transportiert wird (Biochim. Bio phys. Acta, Band 732, S. 24–31, 1983). Im Falle des Transports einer neutralen Aminosäure, zu der viele Aminosäuren gehören, ist bekannt, dass ein Na⁺-unabhängiger Aminosäuretransporter L (Ann. Rev. Physiol. Band 46, S. 417–433, 1984) und Na⁺-abhängigen Aminosäuretransporter A und ASC (Ann. Rev. Physiol. Band 46, S. 417–433, 1984, und J. Membrane Biol., Band 52, S. 83–92, 1980) eine wichtige Rolle spielen (Physiol. Rev., Band 70, S. 43–77, 1990 und Saishin Igaku, Band 50, S. 1997–2004, 1995).
Wie bereits erwähnt, spielen Aminosäuren eine sehr wichtige Rolle als Materialien in der Biosynthese verschiedener Biokomponenten, die in Zellen stattfindet, weshalb angenommen wird, dass ein abnormaler Transport der Aminosäuren in die Zelle an verschiedenen Symptomen beteiligt ist.
Aus den bis heute erfolgten Studien ist bekannt, dass die Symptome, an denen ein abnormaler Transportmechanismus der Aminosäuren in die Zellen beteiligt ist, die Aminoazidurie, bei der eine Störung der Aminosäureresportion aus Nierenkanälen vorliegt, und die Amyotrophe Laterale Sklerose etc. sind, an der eine Störung der Glutaminsäure-Aufnahme und Nervenzelltod beteiligt sind (Annual. Rev. Kidney "Structure and Function of Kidney-Specific Organic Solute Transporters", S. 91–100, 1995, veröffentlicht von Chugai Igakusha; Saishin Igaku, Band 50, S. 1997–2004, 1995; und Saishin Igaku, Band 51, S. 64–70, 1996).
Aminosäuretransporter spielen eine wesentliche und sehr bedeutende Rolle in der Aufnahme von Aminosäuren, die zur Generierung, Differenzierung, Vermehrung und Erhaltung aller Zellen erforderlich sind, weshalb von ihnen angenommen wird, dass sie nicht nur an den oben genannten Symptomen, sondern auch an der Entstehung vieler weiterer Symptome beteiligt sind. Wird außerdem die Unerlässlichkeit von Aminosäuretransportern in lebenden Körpern berücksichtigt, so kann kaum zu dem Schluss gekommen werden, dass die Aufnahme verschiedener Aminosäuren nur durch mehrere bereits identifizierte Transporter vermittelt wird, sondern muss vielmehr angenommen werden, dass viele weitere unbekannte Aminosäuretransporter vorhanden sind.
Die Identifikation solcher unbekannter Aminosäuretransporter, die im Wesentlichen eine Rolle für die Existenz und die Erhaltung von Zellen, Geweben, Organen und lebenden Körpern spielen, erbringt die Möglichkeit der Aufklärung von Ursachen für das Auftreten verschiedener Krankheiten, deren Ursachen bisher nicht geklärt worden sind. Ist außerdem die Beziehung zwischen diesen Aminosäuretransportern und verschiedenen Krankheiten verstanden worden, so wird eine wirksame Behandlung dieser Krankheiten durch eine Regulierung der biologischen Funktion oder die Exprimierung von Aminosäuretransportern möglich. Entsprechend besteht ein dringender Bedarf nach der Identifizierung neuer Aminosäuretransporter und der Klärung der Beziehung zwischen dem Transportermolekül und einem Symptom.
Trotz des medizinischen und sozialen Bedarfs als solchem ist der aktuelle Status der, dass wenig Fortschritt bei der Identifizierung von Aminosäuretransportern und der Klärung des Aminosäure-Transportmechanismus erzielt worden ist.
Um daher ein Aminosäuretransportermolekül zu identifizieren, ist eine Reinigung des Moleküls erforderlich, und um die Aktivität der gereinigten Substanz zu analysieren, ist die Wiederherstellung aus der gereinigten Substanz einer Zellmembran erforderlich, so dass wieder eine Aminosäure-Transportaktivität erzeugt wird. Allerdings erbringt ein Aminosäuretransportermolekül eine relativ geringe Expressionsmenge als ein Membranprotein und weist eine relativ geringe Regnerationsleistung auf, was Schwierigkeiten bei der Technik zur Identifizierung neuer Moleküle bereitet.
Außerdem weist die Identifikation eines Aminosäuretransporters, der spezifisch in abnormalen Zellen exprimiert wird, die direkt am Symptom beteiligt sind, wie etwa Krebszellen (Tumorzellen), und dabei die Rolle des Zuführens einer Aminosäure zu abnormalen Zellen spielt, eine sehr hohe Bedeutung in der Aufklärung des Vorhandenseins und der Vermehrung solcher Symptom-bezogener Zellen, ebenso wie in der Entwicklung von therapeutischen Methoden für Krebs etc., auf. Allerdings ist ein Aminosäuretransporter aus sich selbst heraus ein Molekül, das für die Existenz normaler Zellen wesentlich ist, und von dem angenommen wird, dass es in einem breiten Bereich von Zellspezies vorhanden und dementsprechend als ein Aminosäuretransportermolekül, das spezifisch in solchen abnormalen Zelten exprimiert wird, nicht einfach zu identifizieren ist.
Als einem neutralen Aminosäuretransporter sind ASCT1 und ASCT2 als Natriumabhängige Transporter kloniert worden (Kanal, Curr. Opin. Cell Biol. 9, 565 (1997)). Allerdings sind deren Hauptsubstrate Alanin, Serin, Cystein, Threonin und Glutamin und ihre Substratspezifität von einem neutralen Aminosäure-Transportsystem L verschieden. Außerdem sind Glycin-Transporter und Prolin-Transporter kloniert worden, doch ist deren Substratspezifität vom neutralen Aminosäure-Transportsystem L verschieden (Amara und Kuhar, Annu. Rev. Neurosci. 16, 73 (1993)).
Obschon als solches nicht ein Transporter, sind cDNAs von rBAT und 4F2hc, welches Typ II-Membranglykoproteine mit lediglich einer Transmembranstruktur sind, die für einen Aktivierungsfaktor für Aminosäuretransporter gehalten werden, kloniert worden, und es ist bekannt, dass, wenn sie in Eizellen von Xenopus laevis exprimiert werden, die Aufnahme einer basischen Aminosäure in Verbindung mit einer neutralen Aminosäure aktiviert wird (Palacin, J. Exp. Biol. 196, 123 (1994)).
Demgemäß stellt es einen effektiven Schlüsselansatz zur Bereitstellung einer therapeutischen Methode für ein Symptom und eine Erkrankung dar, ein Aminosäure-Transportermolekül, das bisher noch nicht identifiziert worden ist und das spezifisch in abnormalen Zellen exprimiert wird, die tiefgreifend mit solch einem Symptom assoziiert sind, zu identifizieren und die Beziehung zwischen dem Molekül und dem Vorhandensein/der Vermehrung der abnormalen Zellen aufzuklären.
Wird also die biologische Aktivität des Aminosäuretransportermoleküls oder die Expression des Moleküls kontrolliert, so wird dadurch die Behandlung von Krankheiten möglich.
Die vorliegenden Erfinder haben ihre Aufmerksamkeit auf das bereits bekannte Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2 (CD98) gerichtet, welches für die Vermehrung von Tumorzellen für wesentlich erachtet wird, um einen neuen Aminosäuretransporter zu untersuchen, der spezifisch in solchen Symptom-bezogenen abnormalen Zellen oder insbesondere Tumorzellen exprimiert wird, und waren darin erfolgreich, ein neues Aminosäure-Transportermolekül, bezeichnet als LAT1 (L-artiger Aminosäuretransporter-1) zu identifizieren, das besonders signifikant in Tumorzellen exprimiert wird, relativ zur Expression in normalen Zellen.
Für eine schnelle Zellteilung und ein kontinuierliches Wachstum und Vermehrung müssen die Zellen Nährstoffe wie Aminosäuren und Saccharide in sich aufnehmen, und es wird davon ausgegangen, dass dies durch die Heraufregulierung eines Aminosäuretransporters, der für die Nährstoffe spezifisch ist, erfolgt (Physiol. Rev. Band 70, S. 43–77, 1990). Für das Wachstum, die Vermehrung und die Erhaltung der Tumorzellen muss in den Zellen eine Protein-Biosynthese erfolgen, wozu die Aufnahme essentieller Aminosäuren in die Zellen (Transport aus der Zellumgebung in das Zellinnere) besonders wichtig ist.
Aufgrund der bisherigen Studien wird davon ausgegangen, dass für die Vermehrung von Tumorzellen ein bekanntes Zellmembran-Oberflächenantigen, bezeichnet als 4F2 (CD98), das als ein Typ II-Membranglykoprotein klassifiziert ist, dem eine aktivierende Funktion des Aminosäuretransporters zugeschrieben wird, der bisher noch nicht identifiziert worden ist, eine wichtige Rolle spielen wird (J. Immunol., Band 126, S. 1409–1414, 1981; J. Immunol., Band 129, S. 623–628, 1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 84, S. 6526–6530, 1987; Cancer Res., Band 46, S. 1478–1484, 1986; J. Biol. Chem., Band 267, S. 15285–15288, 1992; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 89, S. 5606–5610, 1992; Biochem. J., Band 324, S. 535–541, 1997; und J. Exp. Biol. Band 196, S. 123–137, 1994).
Unter diesen Gegebenheiten haben die vorliegenden Erfinder eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung eines humanen Tumorzellmembran-Oberflächenmoleküls durchgeführt, das an ein 4F2-Molekül konjugiert oder damit wechselwirkt, und haben ein Gen gefunden, das für den neuen Aminosäuretransporter LAT1 mit den folgenden Charakteristika codiert, wodurch die vorliegende Erfindung vollendet worden ist.
Beschreibung der Erfindung
Der Aminosäuretransporter LAT1, oder insbesondere der Aminosäuretransporter LAT1, der vom Menschen gemäß der vorliegenden Erfindung abgeleitet ist, weist die folgenden Charakteristika auf.

(1) Als Ergebnis eines Northern Blots unter Verwendung von Tumorzellen, die vom Menschen stammen, und von mRNA, die aus gesunden Menschengeweben stammt, wird ihre Expression als eine Bande von etwa 4,8 kb in Tumorzellen festgestellt, die vom Menschen aus einem breiten Bereich von Zellen stammen, einschließlich aus Siegelringzellkarzinom des Magens (KATO III9, malignem Melanom (G-361) und kleinzelligem Lungenkarzinom (RERF-LC-MA). In gesunden menschlichen Geweben wird seine Expression ähnlich als eine Bande von etwa 4,8 kb lediglich in spezifischen und beschränkten Geweben bestätigt, in denen eine Neogenese und Vermehrung der Zellen kräftig ist (Plazenta, Fötusleber, Knochenmark, Hoden, Gehirn und periphere Leukozyten).
(2) Offener Leserahmen (ORF; einschließlich Terminationscodon) weist eine Basensequenz auf, die 1.524 Basen umfasst (eine Basensequenz von der 66. bis zur 1589. Base in der in SEQ ID NR. 1 gezeigten Basensequenz) und der ORF codiert für eine Aminosäuresequenz, die insgesamt 507 Aminosäuren umfasst und ein Molekulargewicht von etwa 55 kDa aufweist (berechneter Wert) (SEQ ID NR. 2).
(3) Als Ergebnis einer hydrophoben Plot-Analyse weist humaner LAT1 12 Transmembran-Regionen auf und ist als ein Membranoberflächenmolekül mit einer phosphorylierten Stelle durch Tyrosinproteinkinase (119. Tyr in einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2) und einer phosphorylierten Stelle durch Proteinkinase C (189. Ser und 346. Ser in einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2) in einer intrazellulären Region identifiziert worden.
(4) In einer Zelle, in der humaner LAT1 und humane 4F2hc (4F2-Schwerkette) coexprimiert werden, wird eine sehr starke Aufnahme von Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Trytophan (Trp) und Valin (Val), die neutrale Aminosäuren sind, und Histidin (His), das eine nahezu neutrale basische Aminosäure ist, bestätigt. Außerdem wird auch eine beträchtliche Aufnahme von Threonin, Cystein, Asparagin und Glutamin, welches weitere neutrale Aminosäuren sind, bestätigt.
(5) In einer Zelle, in der humaner LAT1 und humane 4F2hc coexprimiert werden, wird nicht nur die Aufnahme der oben genannten Aminosäuren bestätigt, sondern auch die bekannte Aufnahme von Pharmazeutika wie L-DOPA, welches ein Arzneimittel für Parkinson-Krankheit ist, und einer physiologisch aktiven Substanz wie Triiodothyronin (Schilddrüsenhormon). Außerdem wird auch die Aufnahme von BCH (2-Amino-2-Norbornan-Carboxylsäure), die als ein Hemmstoff der Aufnahme neutraler Aminosäuren bekannt ist, bestätigt.
(6) In einem kinetischen Michaelis-Menten-Test beträgt der Km-Wert, der die Affinität des humanen Lat1 mit den oben genannten verschiedenen Substraten zeigt, etwa 21 μM.
(7) Die oben genannte Aufnahme der verschiedenen Aminosäuren, Pharmazeutika und physiologisch aktiven Substanzen, wie durch LAT1 vermittelt, in die Zelle hängt nicht von Na⁺-Ionen und Cl^–-Ionen ab.

Daher beschreibt die vorliegende Erfindung weltweit erstmalig einen Aminosäuretransporter, mit dem eine spezifische Expression in Tumorzellen eines breiten Bereichs im Vergleich zu normalen Zellen festgestellt wird und der für das Vorhandensein und die Vermehrung verschiedener Tumorzellen bei einer breiten Substratspezifität für wesentlich gehalten wird.
Aufgrund der oben genannten Charakteristika des Aminosäuretransportermoleküls der vorliegenden Erfindung ist das Molekül als ein Ziel in der Entwicklung beispielsweise eines Antitumormittels (Antikrebsmittels) recht hoffnungsträchtig. Wird daher ein pharmazeutisches Agens mit einer auf die Unterdrückung der biologischen Aktivität des Moleküls oder der Expression des Moleküls gerichteten Aktivität (wie etwa Antisense-DNA-Medikamente, Antisense-RNA-Medikamente, Antikörper-Medikamente, Antikörperfragment-Medikamente, Peptidantagonist-Medikamente und Nicht-Peptidantagonist-Medikamente einschließlich niedermolekularer Verbindungen) zur Unterdrückung der Aufnahme von Nährstoffen (verschiedene Aminosäuren und physiologisch aktive Substanzen) in durch das Molekül vermittelte Tumorzellen verwendet, so ermöglicht dies nun, die Tumorzellen in einen Hungerzustand zu versetzen und das Vorhandensein oder die Vermehrung der Tumorzellen zu unterdrücken.
Demgemäß sind das Protein der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon, DNA, die für das Protein oder einen Teil davon codiert, RNA, die für das Protein oder einen Teil davon codiert, DNA, die an die DNA hybridisiert, ein Expressionsvektor, der die DNA enthält, eine transformierte Zelle, die durch die DNA oder durch den Vektor transformiert ist, eine Zelle, in welche die RNA eingeführt ist, ein Antikörper oder ein Teil davon mit einer Reaktivität mit dem Protein oder einem Teil davon, eine Zelle, die den Antikörper produziert, eine markierte DNA, worin ein Teil der DNA radiomarkiert ist, eine markierte RNA, worin ein Teil der RNA radiomarkiert ist, ein markierter Antikörper, wobei der Antikörper oder ein Teil des Antikörpers markiert ist, ein Kit, der die markierte DNA umfasst, ein Kit, der die markierte RNA umfasst und ein Kit, der den markierten Antikörper umfasst, als ein pharmazeutisches Agens mit einer Antitumorwirkung und/oder als ein Reagenz in der Entwicklung solcher Medikamente ziemlich nützlich.
Werden außerdem die oben genannte DNA, RNA oder verschiedenen Substanzen der vorliegenden Erfindung, wie z.B. transformierte Zellen, verwendet, so ist auch die Bereitstellung verschiedener Identifikationsmethoden (oder Assaymethoden) für diese verschiedenen Pharmazeutika möglich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Homologie in der Aminosäuresequenz eines humanen Aminosäuretransporters LAT1 mit der eines Ratten-Aminosäuretransporters LAT1.
2 zeigt hydrophile und hydrophobe Regionen eines humanen Aminosäuretransporters LAT1 anhand einer hydrophoben Diagramm-Analyse.
3 zeigt den exprimierten Zustand von mRNA eines humanen Aminosäuretransporters LAT1 in verschiedenen menschlichen Geweben mittels eines Northern Blots.
4 zeigt die Aufnahme-Aktivität von Leucin in die Zellen von Xenopus laevis-Eizellen, worin ein humaner Aminosäuretransporter LAT1 und ein humanes Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2hc coexprimiert werden.
5 zeigt die Menge an in die Zellen aufgenommenem Leucin, wenn Xenopus laevis-Eizellen, worin ein humaner Aminosäuretransporter LAT1 und ein humanes Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2hc coexprimiert sind, in Anwesenheit verschiedener Salze inkubiert werden.
6 zeigt die Affinität eines humanen Aminosäuretransporters LAT1 zum Substrat in einem kinetischen Michaelis-Menten-Test.
7 zeigt die Menge an radiomarkiertem Leucin als einem in die Zellen aufgenommenen Substrat, wenn Xenopus laevis-Eizellen, worin ein humaner Aminosäuretransporter LAT1 und ein humanes Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2hc coexprimiert sind, in Anwesenheit verschiedener Aminosäuren inkubiert werden.
8 zeigt die Menge an radiomarkiertem Phenylalanin als einem in die Zellen aufgenommenen Substrat, wenn Xenopus laevis-Eizellen, worin ein humaner Aminosäuretransporter LAT1 und ein humanes Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2hc coexprimiert sind, in Gegenwart von Aminosäure oder einem pharmazeutischen Agens inkubiert werden.
9 zeigt die Menge an radiomarkiertem Leucin als einem in die Zellen aufgenommenen Substrat, wenn Xenopus laevis-Eizellen, worin ein humaner Aminosäuretransporter LAT1 und ein humanes Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2hc coexprimiert sind, in Gegenwart von Aminosäure oder einer physiologisch aktiven Substanz inkubiert werden.
10 zeigt die Menge verschiedener radiomarkierter Aminosäuren als in die Zellen von Xenopus laevis-Eizellen, worin ein humaner Aminosäuretransporter LAT1 und ein humanes Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2hc coexprimiert sind, aufgenommenen Substraten.
11 zeigt das Ergebnis eines Experiments zur Leucin-Aufnahme durch Eizellen, in die von Ratten-C6-Gliom abgeleitete mRNA und/oder von Ratten-4F2hc-Gen abgeleitete cRNA injiziert ist.
12 zeigt hydrophobe Diagramme eines Ratten-neutrale Aminosäuretransporters LAT1.
13 zeigt eine Fotographie als Ersatz für eine Zeichnung, welche das Ergebnis der Analyse der Expression von LAT1-Gen-mRNA in verschiedenen Organgeweben der Ratte mittels eines Northern Blots zeigt.
14 zeigt eine Fotographie als Ersatz für eine Zeichnung, welche das Ergebnis eines Vergleichs der Expression von LAT1-Gen-mRNA in der jeweiligen Kulturzelllinie der Ratte mit der Expression von LAT1-Gen-mRNA in der Rattenleber mittels eines Northern Blots zeigt.
15 zeigt eine Fotographie als Ersatz für eine Zeichnung, welche das Ergebnis der Analyse der Expression von LAT1-Gen-mRNA in der jeweiligen Kulturzelllinie des Menschen mittels Northern Blot zeigt.
16 zeigt das Ergebnis eines Experiments zur Aufnahme von Leucin unter Verwendung von Eizellen, in die Ratten-LAT1-Gen-cRNA und/oder Ratten-4F2hc-Gen-cRNA injiziert sind, 2 oder 5 Tage nach Injektion der cRNA.
17 zeigt das Ergebnis eines Tests des Einflusses von zugesetztem Salz in einem Experiment zur Aufnahme von Leucin unter Verwendung von Eizellen, in die Ratten-LAT1-Gen-cRNA und Ratten-4F2hc-Gen-cRNA injiziert sind.
18 zeigt das Ergebnis eines Tests des Einflusses der Konzentration des Leucin-substrats in einem Experiment zur Aufnahme von Leucin unter Verwendung von Eizellen, in die Ratten-LAT1-Gen-cRNA und Ratten-4F2hc-Gen-cRNA injiziert sind.
19 zeigt das Ergebnis eines Tests zum Einfluss der Zugabe verschiedener Aminosäuren oder ähnliche Verbindungen auf das System, in einem Experiment zur Aufnahme von Leucin unter Verwendung von Eizellen, in die Ratten-LAT1-Gen-cRNA und Ratten-4F2hc-Gen-cRNA injiziert sind.
20 zeigt das Ergebnis eines Tests zum Einfluss der Zugabe von D-Leucin oder BCH zu einem Medium auf die Zellvermehrung in einer kultivierten Rattenleber-Zelllinie.
21 zeigt eine Fotographie als Ersatz für eine Zeichnung, die das Ergebnis der Analyse der Expression von LAT1-Gen-mRNA und 4F2hc-Gen-mRNA in einer kultivierte humane Tumorzelllinie mittels eines Northern Blots zeigt.
22 zeigt eine Fotographie als Ersatz für eine Zeichnung, die das Ergebnis der Analyse der Expression von LAT1-Gen-mRNA und 4F2hc-Gen-mRNA in einer kultivierten humanen Tumorzelllinie (Leukämiezellen) mittels eines Northern Blots zeigt.
23 zeigt das Ergebnis zur Na⁺-Abhängigkeit der Leucin-Aufnahme von T24-Zellen.
24 Das obere Schaubild zeigt die Konzentrationsabhängigkeit von T24-Zellen für die Leucin-Aufnahme (kinetischer Michaelis-Menten-Test); das untere Schaubild zeigt das Ergebnis der Analyse der Konzentrationsabhängigkeit von T24-Zellen für die Leucin-Aufnahme durch Eadie-Hoffstee-Diagramme.
25 zeigt das Ergebnis des Einflusses einer Zugabe verschiedener Aminosäuren oder ähnlicher Verbindungen zu dem System im Leucin-Aufnahmeexperiment durch T24-Zellen.
26 zeigt das Ergebnis einer Analyse der Wirkung von BCH unter Anwendung von doppelt-reziproken Diagrammen in einem Leucin-Aufnahmeexperiment durch T24-Zellen.
27 zeigt die Wirkung von BCH auf das Wachstum von T24-Zellen (A) und Daudi-Zellen (B).
28 zeigt das Ergebnis einer Untersuchung des Überlebenseffekts durch BCH, D-Leu und D-Ala nach intraperitonealer Transplantation von Maussarkom-180-Zellen in ICR-Mäuse.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Jede der verschiedenen Erfindungen der vorliegenden Anmeldung weist spezifisch den folgenden Nutzen auf.
Die DNA, RNA und transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung sind nicht nur für die Herstellung des Proteins der vorliegenden Erfindung in Form eines unter Anwendung einer Genrekombinationstechnik rekombinierten Proteins nützlich, sondern auch als ein Reagenz (Werkzeug) für das Arzneimittel-Design, Screening und die Identifikation, wie z.B. für ein pharmazeutisches Mittel zur Kontrolle (Aktivierung, Unterdrückung und Hemmung) der biologischen Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung, ein pharmazeutisches Mittel zur Hemmung der Transkription des Proteins der vorliegenden Erfindung in mRNA, ein pharmazeutisches Mittel zur Hemmung der Translation der mRNA in das Protein der vorliegenden Erfindung, ein pharmazeutisches Mittel zur Hemmung der Wechselwirkung des Proteins mit einem anderen Molekül etc.
Spezifischer gesagt kann die DNA der vorliegenden Erfindung nicht nur in einem Assay zur Identifikation eines pharmazeutischen Mittels verwendet werden, dass die biologische Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung kontrolliert, sondern auch in einem Assay zur Identifikation eines pharmazeutischen Mittels, das die Expression des Proteins der vorliegenden Erfindung kontrolliert.
In ersterem Assay werden die Zellen von Säugetieren etc. durch eine DNA transformiert, die für das Aminosäuretransportermolekül der vorliegenden Erfindung codiert, um das Molekül in den Zellen zu exprimieren, wobei die transformierten Zellen bei gleichzeitiger Anwesenheit der Testsubstanz und des Substrats (wie etwa der Aminosäure) für das Molekül inkubiert werden, wobei die Mengen an dabei in die Zellen aufgenommenem Substrat mit der Aufnahme in Kontrollzellen verglichen und die Aktivität der Testsubstanz an der Kontrolle der biologischen Aktivität des Aminosäuretransporters der vorliegenden Erfindung ausgewertet wird.
Letzterer Assay ist durch den sogenannten Reportergen-Assay vertreten, der häufig zum Untersuchen, Screenen und Identifizieren solcher pharmazeutischer Mittel angewendet wird, und durch das sogenannte High-Throughput-Screening, bei dem der Reportergen-Assay das Prinzip verkörpert und das Screening durch eine Maschine (Roboter) vorgenommen wird (Soshiki Baiyo Kogaku, Band 23, Nr. 13, S. 521–524; und US-Patent 5.670.113).
Bei der vorliegenden Erfindung wird DNA, die für das Aminosäuretransportermolekül der vorliegenden Erfindung codiert, DNA, die für die Expressionsregulations-Kontrollregion der DNA codiert, und DNA, die für ein Reporter-Proteinmolekül codiert, das Fluoreszenz, z.B. durch eine Luciferase, ausstrahlt, in solcher Weise inseriert, dass in Abhängigkeit von der Expression des Transportermoleküls das Reporterprotein-Molekül exprimierbar ist, wobei der resultierende Expressionsvektor für die Transformation der Zellen verwendet wird, die häufig zur Erzeugung von genrekombinantem Protein verwendet werden, woraufhin die resultierenden transformierten Zellen mit der Testverbindung zusammengebracht werden und die Menge des Transportermoleküls, die in Abhängigkeit von der Wirkung der Verbindung exprimiert wird, durch Messen der Menge an Fluoreszenz indirekt gemessen wird, die vom Reporterprotein, das gemeinsam mit der Expression des Moleküls exprimiert wird, ausge strahlt wird, woraufhin analysiert wird, ob die Verbindung die Expression des Transportermoleküls beeinflusst (US-Patent Nr. 5.436.128 und US-Patent Nr. 5.401.629).
Darüber hinaus ist die RNA der vorliegenden Erfindung in einem Assay für die Identifikation eines pharmazeutischen Mittels verwendbar, welche die biologische Aktivität des Aminosäuretransporter-Proteinmoleküls der vorliegenden Erfindung kontrolliert.
So besteht der vorliegende Assay darin, dass die RNA, die für das Aminosäuretransportermolekül der vorliegenden Erfindung codiert, zum Beispiel in Eizellen von Xenopus laevis injiziert wird, um das Transportermolekül in den Zellen zu exprimieren, eine Inkubation in gleichzeitiger Anwesenheit der Testsubstanz und des Substrats (Aminosäure etc.) des Moleküls vorgenommen wird und die Menge an in die Zellen aufgenommenem Substrat mit der Aufnahme in Kontrollzellen verglichen wird, woraufhin die Aktivität der Testsubstanz an der Kontrolle der biologischen Aktivität des Aminosäuretransporters der vorliegenden Erfindung ausgewertet wird.
Ein Teil der DNA der vorliegenden Erfindung und ein Teil der RNA davon können als eine Sonde im Falle der Identifikation von DNA oder RNA verwendet werden, die bei einer Koloniehybridisationsmethode oder einer Plaquehybridisationsmethode hybridisiert wird. Außerdem kann ein Teil der DNA der vorliegenden Erfindung als ein Primer für die Amplifikation des Gens, das für die DNA der vorliegenden Erfindung oder das Transportermolekül der vorliegenden Erfindung codiert, unter Anwendung einer PCR (Polymerase-Kettenreaktion) verwendet werden.
Darüber hinaus ist ein Teil der DNA der vorliegenden Erfindung, die DNA, die komplementär zu dieser DNA ist, und ein Teil der RNA der vorliegenden Erfindung nicht nur als ein Reagenz nützlich, wie oben erwähnt, sondern auch als sogenanntes Antisense-DNA-Pharmazeutikum oder Antisense-RNA-Pharmazeutikum.
Ein Antisense-Pharmazeutikum stellt ein Agens mit einem Hemmmechanismus der Transkription von DNA zu mRNA oder der Translation von der mRNA zu Protein unter Ausnutzung der Beschaffenheit der Bindung eines Teils der Basensequenz der DNA, eines Teils der Basensequenz, die zu der Basensequenz der DNA komplementär ist oder eines Teils der Basensequenz von RNA zu DNA oder einer RNA mit einer zu der Basensequenz komplementären Sequenz. Wird ein Teil der Antisense-Sequenz im Antisense-Pharmazeutikum einer chemischen Modifikation unterzogen, so ist eine Modifikation der Eigenschaften, wie etwa eine Erhöhung der Halbwertszeit im Blut, die Permeabilität in Zellen, die Targeting-Effizienz an Zielstellen für Krankheiten etc. möglich.
Beim Protein der vorliegenden Erfindung wird das Stadium, zu welchem das Proteinmolekül auf der Zelloberfläche exprimiert wird, ausgenützt, wobei es wie oben erwähnt möglich ist, das pharmazeutische Agens zu identifizieren, welches die biologische Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung oder die Expression des Proteins kontrolliert. Ausgehend von der Aminosäuresequenz des Proteins ist außerdem das Design eines Peptidantagonisten mit der Fähigkeit zum Hemmen der biologischen Aktivität des Proteins möglich. Der auf solche Weise entworfene Peptidantagonist ist als ein pharmazeutisches Agens nützlich, mit dem die Bindung des Aminosäuretransporters, welcher ein Protein der vorliegenden Erfindung ist, an ein Substrat oder die Bindung eines Proteins der vorliegenden Erfindung an ein anderes Molekül kompetitiv gehemmt wird, so dass die biologische Funktion des Proteins der vorliegenden Erfindung nicht erfüllt wird.
Das Protein der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon und die Zellen, wie etwa das Protein exprimierende transformierte Zellen, sind als ein immunsensibilisiertes Antigen in der Präparierung eines Antikörpers (Antiserum, monoklonaler Antikörper) zum Protein der vorliegenden Erfindung nützlich.
Antiserum (polyklonaler Antikörper) mit einer Reaktivität mit dem Aminosäuretransportermolekül, welches ein Protein der vorliegenden Erfindung ist, und ein monoklonaler Antikörper sind als Antikörper-Pharmazeutika nützlich, indem sie die Erzielung der biologischen Aktivität des Moleküls durch Binden an das Molekül hemmen (neutralisieren).
Außerdem ist der Antikörper als ein Reagenz in der Analyse (immunhistologische Anfärbung, Western Blotting, ELISA, etc.) des exprimierten Zustands des Proteins der vorliegenden Erfindung in verschiedenen biologischen Proben (Zellen, Geweben, Organen oder Körperflüssigkeiten) durch Markieren mit verschiedenen Substanzen, die zur Hervorbringung eines nachweisbaren Signals fähig sind, nützlich.
Wie bei solch einem markierten Antikörper ist auch die markierte DNA, bei der die DNA der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon mit verschiedenen Substanzen markiert ist, die zur Erzielung eines nachweisbaren Signals fähig sind, als ein Reagenz in einem Test (wie z.B. Southern Blotting, FISH, etc.) zur Identifizierung des Gens, das für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, nützlich.
Außerdem ist eine radiomarkierte RNA, bei der die RNA der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon in entsprechender Weise mit Radioisotop markiert ist, als ein Reagenz für die Analyse (wie z.B. Northern Blotting) des exprimierten Zustands der mRNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in Zellen, Geweben oder Organen nützlich.
Bezüglich der DNA der vorliegenden Erfindung wird, wenn die DNA eines Aminosäuretransporters, die von einem Menschen stammt, was eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, in andere Säuger als Menschen eingeführt wird, wie etwa eine Maus, die Präparierung eines transgenen Tiers als einem Modelltier möglich.
Es ist außerdem möglich, ein Gen, das für den Aminosäuretransporter der vorliegenden Erfindung, der von einem Menschen stammt, codiert, als eine Sonde zum Klonieren eines Gens, das für ein homologes Protein codiert, das vom Kaninchen oder der Maus stammt, zu verwenden und, basierend auf der resultierenden genetischen Information, das intrinsische Gen, das für das homologe Protein von der Maus oder dem Kaninchen codiert, zur Präparierung eines Modelltiers (Knockout-Tier) zu zerstören (zu inaktivieren). Sind die physikalischen, biologischen, pathologischen und genetischen Charakteristika dieses Modelltiers analysiert, so können die Funktionen des Aminosäuretransporters gemäß der vorliegenden Erfindung detaillierter aufgeklärt werden.
Wird außerdem das Modelltier, bei dem das intrinsische Gen als solches zerstört wurde, mit dem transgenen Tier gekreuzt, so ist der Erhalt eines Modelltiers möglich, das lediglich das Gen (DNA) enthält, das für den Aminosäuretransporter der vorliegenden Erfindung, der vom Menschen abgeleitet ist, codiert. Wird das oben erwähnte pharmazeutische Agens (Antisense-Pharmazeutikum, Peptidantagonist, niedermolekulare Nicht-Peptidverbindung, Antikörper, etc.), welches die biologische Aktivität des Aminosäuretransportermoleküls der vorliegenden Erfindung oder die Expression des Moleküls kontrolliert, diesem Modelltier verabreicht, so ist die Auswertung der therapeutischen Wirkung des pharmazeutischen Agens möglich.
Daher besteht die vorliegende Erfindung in der Bereitstellung der Substanz, des Arzneistoffs, des Reagenz und des Verfahrens mit einer sehr hohen Nützlichkeit für die Industrie, wie oben erwähnt, die in jedem der folgenden <1> bis <55> beschrieben sind.

<1> Protein, welches ein Zelloberflächenprotein mit der Fähigkeit, den Transport von Aminosäure in eine Zelle zu vermitteln, und mit der Fähigkeit ist, den Einbau mindestens einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Tryptophan (Trp), Valin (Val) oder Histidin (His) in die Zelle in einer Na⁺-unabhängigen Weise zu vermitteln.
<2> Das Protein gemäß <1>, worin, wenn es gleichzeitig mit einem 4F2hc-Protein, klassifiziert als ein Typ II-Membranglykoprotein oder ein Teil davon, die Fähigkeit zum Transportieren von neutraler Aminosäure und dieser ähnlichen Substanzen aufweist.
<3> Das Protein gemäß <2>, worin das 4F2hc-Protein, klassifiziert als ein Typ II-Membranglykoprotein, ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 oder NR. 8 oder eine Aminosäuresequenz ist, worin ein Teil ihrer Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert ist.
<4> Das Protein gemäß einem von <2> bis <3>, welches ein Protein ist, das von einem Menschen oder einer Ratte abgeleitet ist.
<5> Das Protein gemäß einem von <1> bis <4>, welches eine Aminosäuresequenz nach einem der folgenden (1) und (2) aufweist: (1) eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder NR. 4 (2) eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder NR. 4, worin ein oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert sind.
<6> Ein Polypeptid, enthaltend eine partielle Aminosäuresequenz in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder NR. 4, das eine Antigenität aufweist.
<7> DNA, die für eines der Proteine in 1> bis <5> codiert.
<8> Die DNA gemäß <7>, wobei dies eine DNA ist, die von einem Menschen oder einer Ratte abgeleitet ist.
<9> DNA, die für ein Zelloberflächenprotein codiert, welche unter einer stringenten Bedingung an die DNA mit der Basensequenz von Basen 66 bis 1586 der SEQ ID NR. 1 hybridisiert oder eine Basensequenz von Basen 64 bis 1599 der SEQ ID NR. 3 aufweist und die Fähigkeit zum Vermitteln des Einbaus mindestens einer Art von Aminosäure in die Zelle besitzt.
<10> Die DNA gemäß <9>, welche ein Zelloberflächenprotein codiert, wobei der Einbau von Aminosäure in die Zelle durch das gleichzeitige Vorhandensein eines 4F2hc-Protein, klassifiziert als ein Typ II-Membranglykoprotein oder ein Teil davon, vermittelt wird.
<11> Die DNA gemäß 10>, worin das 4F2hc-Protein, klassifiziert als ein Typ II-Membranglykoprotein, die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 oder NR. 8 oder eine Aminosäuresequenz aufweist, worin ein Teil der Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert ist.
<12> RNA, welche von der DNA gemäß <7> bis <11> ableitbar ist.
<13> Die RNA gemäß <12>, wobei dies eine RNA mit der Basensequenz der SEQ ID NR. 26 oder NR. 27 ist.
<14> Ein Expressionsvektor, enthaltend die DNA gemäß einem der obigen <7> bis <11>.
<15> Eine Transformantenzelle, die durch den Expressionsvektor gemäß obigem <14> transformiert ist.
<16> Die Transformantenzelle gemäß <14> oder <15>, wobei die Transformantenzelle außerdem durch eine DNA transformiert ist, die eine Basensequenz enthält, umfassend eine Basensequenz von Basen 110 bis 1696 der Basensequenz der SEQ ID NR. 5 und eine der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch TAG, TGA oder TAA, angrenzend an die 1696ste Base.
<17> Die Transformantenzelle gemäß einem der obigen <14> bis <16>, wobei die Transformantenzelle außerdem durch eine DNA, die für ein Reporterprotein codiert, transformiert ist.
<18> Eine Zelle, die nicht vom Menschen abgeleitet ist, in welche die in obigem <12> oder <13> genannte RNA eingeführt ist.
<19> Die Zelle gemäß <18>, wobei die Zelle eine Eizelle von Xenopus laevis ist.
<20> Ein Antiserum oder ein polyklonaler Antikörper, das über eine Reaktivität mit dem Protein gemäß einem der obigen <1> bis <5> oder mit dem in obigem <6> genannten Polypeptid verfügt.
<21> Ein monoklonaler Antikörper, der über eine Reaktivität mit dem Protein gemäß einem der obigen <1> bis <5> oder mit dem in obigem <6> genannten Polypeptid verfügt, oder ein Teil des monoklonalen Antikörpers.
<22> Der monoklonale Antikörper oder ein Teil davon gemäß <21>, wobei der mo noklonale Antikörper ein rekombinanter chimärer monoklonaler Antikörper ist, umfassend eine variable Region eines Immunglobulins, das von einem Säuger außer einem Menschen stammt, und eine konstante Region eines Immunglobulins, das von einem Menschen stammt.
<23> Der monoklonale Antikörper oder ein Teil des monoklonalen Antikörpers gemäß <21>, wobei der monoklonale Antikörper ein rekombinanter humanartiger monoklonaler Antikörper ist, umfassend die gesamte oder einen Teil einer Komplementaritäts-bestimmenden Region einer hypervariablen Region eines Immunglobulins, das von einem Säuger außer einem Menschen stammt, eine Frame-Region einer hypervariablen Region eines Immunglobulins, das von einem Menschen stammt, und eine konstante Region eines Immunglobulins, das von einem Menschen stammt.
<24> Der monoklonale Antikörper oder ein Teil des monoklonalen Antikörpers gemäß einem der obigen <21> bis <23>, wobei der monoklonale Antikörper ein humaner monoklonaler Antikörper ist.
<25> Zelle, welche den monoklonalen Antikörper gemäß einem der obigen <21> bis <24> produziert.
<26> Die Zelle gemäß obigem <25>, worin die Zelle eine fusionierte Zelle ist, erzeugt durch Fusion einer B-Zelle, die von einem nicht-humanen Säuger stammt, welche zur Produktion des monoklonalen Antikörpers fähig ist, mit einer Myelomzelle, die von einem Säuger stammt.
<27> Die Zelle gemäß obigem <25>, worin die Zelle eine genetisch rekombinierte Zelle ist, transformiert durch Einführung von DNA, die für die schwere Kette des monoklonalen Antikörpers codiert, DNA, die für die leichte Kette davon codiert, oder beide DNAs, in die Zelle.
<28> Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die DNA gemäß einem der obigen <7> bis <11>, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
<29> Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß <28>, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen verwendet wird.
<30> Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die RNA gemäß obigem <12> oder <13> und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
<31> Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß <30>, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen verwendet wird.
<32> Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend das Antiserum oder den polyklonalen Antikörper gemäß obigem <20> und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
<33> Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß <32>, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen verwendet wird.
<34> Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend den monoklonalen Antikörper gemäß einem der obigen <2> bis <24> oder einen Teil des monoklonalen Antikörpers und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
<35> Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß <34>, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen verwendet wird.
<36> Ein markierter monoklonaler Antikörper, worin der monoklonale Antikörper gemäß einem der obigen <21> bis <24> mit einer Markierungssubstanz markiert ist, die zur Abgabe eines nachweisbaren Signals entweder alleine oder durch die Reaktion mit einer anderen Substanz fähig ist.
<37> Der markierte monoklonale Antikörper gemäß obigem <36>, worin die Markier ungssubstanz Enzym, fluoreszierende Substanz, chemilumineszierende Substanz, Biotin, Avidin oder Radioisotop ist.
<38> Ein Kit zum Nachweisen eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder eines Fragments davon aufweist, wobei der Kit einen markierten monoklonalen Antikörper gemäß obigem <36> oder <37> umfasst.
<39> Ein Verfahren zum Untersuchen, ob Protein in einer Probe exprimiert ist, oder zum Untersuchen der exprimierten Menge, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: (1) einen Schritt, bei dem die Probe mit dem markierten monoklonalen Antikörper gemäß obigem <36> und <37> kontaktiert wird, und (2) einen Schritt, bei dem die Menge des markierten monoklonalen Antikörpers, die an die Probe gebunden ist, durch Detektieren der Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Radioaktivität in Abhängigkeit von der Art der Markierungssubstanz, die an den markieren monoklonalen Antikörper gebunden ist, gemessen wird.
<40> Das Verfahren nach obigem <39>, wobei die Probe eine Tumorzelle, ein Tumorgewebe, ein Tumor-tragendes Organ oder ein Teil davon ist.
<41> Eine markierte DNA, wobei die in einem der obigen <7> bis <11> genannte DNA oder ein Fragment davon mit einem Enzym, fluoreszierenden Substanz, chemilumineszierenden Substanz, Biotin, Avidin oder Radioisotop markiert ist.
<42> Eine radiomarkierte RNA, worin die in obigem <12> oder <13> genannte RNA mit einem Radioisotop markiert ist.
<43> Ein Kit zum Nachweisen des Gens, das für das in obigem <1> bis <5> genannte Protein codiert, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit die markierte DNA gemäß obigem <41> oder die radioaktive RNA gemäß obigem <42> umfasst.
Genauer gesagt, ein Kit zum Nachweisen des Gens, das für das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 codiert, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit die markierte DNA gemäß obigem <41> oder die radioaktive RNA gemäß obigem <42> umfasst.
<44> Ein Verfahren zum Nachweisen der Wirkung einer Testsubstanz als einem Substrat auf die Fähigkeit eines Proteins, neutrale Aminosäuren zu transportieren, unter Verwendung des in einem von <1> bis <5> genannten Proteins.
<45> Das Verfahren gemäß obigem <44>, worin die Zelle, die durch die in einem der obigen <7> bis >11> genannte DNA transformiert ist, verwendet wird.
<46> Das Verfahren gemäß obigem <44>, worin eine Eizelle von Xenopus laevis verwendet wird.
<47> Das Verfahren gemäß einem der obigen <44> bis <46>, worin die Testsubstanz eine andere Substanz als eine Aminosäure ist.
<48> Ein Verfahren zum Screening der Testsubstanz auf die unterdrückende Wirkung der Fähigkeit eines Proteins, neutrale Aminosäuren und diesen ähnliche Substanzen zu transportieren, unter Verwendung des in einem von <1> bis <5> genannten Proteins. Genauer gesagt, ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz mit einer Fähigkeit zum Hemmen der Vermittlungsfähigkeit der Aufnahme einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Histidin (His), Trytophan (Trp) und Valin (Val), in Zellen, welches eine biologische Funktion des Proteins mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte (1) und (2) umfasst: (1) einen Schritt, bei dem jegliche der in den folgenden (a) bis (d) genannten Zellen bei gleichzeitigem Vorhandensein der Substanz und einer radiomarkierten Aminosäure, wobei jede der Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Histidin (His), Tryptophan (Trp) und Valin (Val), mit einem Radioisotop markiert wird, oder lediglich in Gegenwart der radiomarkierten Aminosäure, inkubiert werden; (a) eine natürlich vorkommende Zelle, in der ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 und ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 gleichzeitig exprimiert werden; (b) eine rekombinante Zelle, in der ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 und ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 durch eine Cotransformation unter Verwendung einer DNA, enthaltend eine Basensequenz von Basen 66 bis 1586 der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 und eine Basensequenz, die jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch TAG, TGA oder TAA, angrenzend an die 1586. Base umfasst, und eine DNA, enthaltend eine Basensequenz von Basen 110 bis 1696 der Basensequenz der SEQ ID NR. 5 und eine Basensequenz, die jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch TAG, TGA oder TAA, angrenzend an die 1696. Base umfasst, coexprimiert werden; (c) eine nicht vom Menschen abgeleitete rekombinante Zelle, in der ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 und ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 durch gemeinsames Einführen einer RNA, enthaltend eine Basensequenz von Basen 1 bis 1521 der Basensequenz der SEQ ID NR. 26 und eine Basensequenz, die jede der Nonsense-Basensequenzen umfasst, dargestellt durch UAG, UGA oder UAA, angrenzend an die 1521. Base umfasst, und eine RNA, enthaltend eine Basensequenz von Basen 1 bis 1587 der Basensequenz der SEQ ID NR. 27 und eine Basensequenz, die jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt UAG, UGA oder UAA, angrenzend an die 1587. Base umfasst, coexprimiert werden; oder (d) eine Tumorzelle, die von einem Menschen stammt; und (2) einen Schritt, bei dem die Radioaktivität der Zelle, die bei gleichzeitigem Vorhandensein der Substanz und der radiomarkierten Aminosäure inkubiert wird, und die Radioaktivität der Zelle, die lediglich in Gegenwart der radiomarkierten Aminosäure inkubiert wird, gemessen wird und die Differenz zwischen ihnen verglichen wird.
<49> Das Verfahren gemäß <48>, wobei die Zelle, die durch eine DNA gemäß einem der obigen <7> bis <11> transformiert ist, verwendet wird.
<50> Das Verfahren gemäß <48>, worin eine Eizelle von Xenopus laevis verwendet wird.
<51> Ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz, welche die Fähigkeit zum Hemmen der Transkription der DNA gemäß einem der obigen <7> bis <11> zu mRNA oder der Expression des Proteins nach einem der obigen <1> bis <5> aufweist.
<52> Eine Substanz, die detektiert, gescreent oder identifiziert wird mittels eines Verfahrens gemäß einem der obigen <44> bis <51>.
<53> Die Substanz gemäß <52>, wobei die Substanz eine Substanz mit der Fähigkeit zum Hemmen des Wachstums von Tumorzellen ist.
<54> Eine transgene Maus mit einem extrinsischen Gen, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA, die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder NR. 4 codiert, in ein intrinsisches Gen der Maus eingebaut wird, wodurch die Maus eine Zelle aufweist, die das Protein in ihrem Körper exprimiert.
<55> Die transgene Maus gemäß <54> worin die DNA eine DNA ist, die eine Basensequenz enthält, umfassend eine Basensequenz von Basen 66 bis 1586 der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 und jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch TAG, TGA und TAA, angrenzend an die 1586. Base, oder eine Basensequenz enthält, umfassend eine Basensequenz von Basen 64 bis 1599 der Basensequenz der SEQ ID NR. 3 und jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch TAG, TGA oder TAA, angrenzend an die 1599. Base.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlich beschrieben werden, wozu die Bedeutungen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe, ebenso wie das allgemeine Verfahren zur Herstellung der DNA, Proteine, Antikörper, durch die Antikörper produzierten Zellen, Transformanten, markierten DNA, markierten RNA, markierten Antikörper, pharmazeutischen Zusammensetzungen, transgenen Mäuse etc. der vorliegenden Erfindung erklärt werden.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Säuger" meint alle Säuger, z.B. Menschen, Rinder, Pferde, Schweine, Ziegen, Schafe, Hunde, Katzen, Hühner, Kaninchen, Ratten, Hamster, Meerschweinchen und Mäuse; vorzugsweise Menschen, Rinder, Pferde, Schweine, Ziegen, Schafe, Hunde, Katzen, Hühner, Kaninchen, Ratten, Hamster, Meerschweinchen und Mäuse; und besonders bevorzugt Menschen, Ratten, Hamster, Meerschweinchen und Mäuse.
Die Ausdrucksweise "Säuger außer Menschen" und "nicht-humane Säuger", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, weisen dieselbe Bedeutung auf und stehen für alle Säuger außer Menschen in der obigen Definition von Säugern.
"Aminosäure", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, meint alle in der Natur vorkommenden Aminosäuren, und vorzugsweise handelt es sich um die im folgenden gemäß der Dreibuchstaben-Schreibweise oder des Einbuchstabencodes aus dem zur Darstellung von Aminosäuren verwendeten Alphabet dargestellten Aminosäuren:
Glycin (Gly/G), Alanin (Ala/A), Valin (Val/V), Leucin (Leu/L), Isoleucin (Ile/I), Serin (Ser/S), Threonin (Thr/T), Aspartinsäure (Asp/D), Glutaminsure (Glu/E), Asparagin (Asn/N), Glutamin (Gln/Q), Lysin (Lys/K), Arginin (Arg/R), Cystein (Cys/C), Methionin (Met/M), Phenylalanin (Phe/F), Tyrosin (Tyr/Y), Tryptophan (Trp/W), Histidin (His/H) und Prolin (Pro/P).
Aminosäuren sind in saure, basische und neutrale Aminosäuren entsprechend der Polarität und Ladung der Aminosäure klassifiziert. Werden die oben genannten Aminosäuren entsprechend dieser Klassifikation klassifiziert, so sind sie wie folgt kalssifiziert, wobei, wenn der Grad der Polarität und Ladung genauer definiert oder eine Klassifikation unter Zugrundelegung weiterer Parameter vorgenommen wird, es Aminosäuren gibt, die nicht immer für die folgende Klassifikation geeignet sind.

(Saure Aminosäuren)
Aspartinsäure (Asp/D) und Glutaminsäure (Glu/E).
(Basische Aminosäuren)
Lysin (Lys/K), Arginin (Arg/R) und Histidin (His/H).
(Neutrale Aminosäuren)
Leucin (Leu/L), Isoleucin (Ile/I), Phenylalanin (Phe/F), Methionin (Met/M), Tyrosin (Tyr/Y), Tryptophan (Trp/W), Valin (Val/V), Histidin (His/H), Threonin (Thr/T), Cystein (Cys/C), Asparagin (Asn/N), Glutamin (Gln/Q), Glycin (Gly/G), Alanin (Ala/A), Serin (Ser/S) und Prolin (Pro/P).

Der Begriff "Protein", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, meint ein Molekül, das von den oben genannten Säugern abgeleitet ist und eine spezifische Aminosäuresequenz aus den oben genannten Aminosäuren umfasst.
Das "Protein" der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, wie in jedem der oben genannten <1> bis <5> erläutert. Um spezifischer zu sein, handelt es sich um "ein Zelloberflächenprotein mit der Fähigkeit, den Transport einer Aminosäure in eine Zelle zu vermitteln, wobei das Protein die Fähigkeit aufweist, den Einbau jeder der Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Histidin (His), Tryptophan (Trp) und Valin (Val) in die Zelle zu vermitteln, in der das Protein der folgenden (1) oder (2) exprimiert wird:

(1) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 oder NR. 8; oder
(2) ein homologes Protein zu dem Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 oder NR. 8, das durch eine DNA codiert ist, die an eine DNA, enthaltend eine Basensequenz der SEQ ID NR. 5 oder NR. 7, unter einer stringenten Bedingung hybridisiert.

Das oben genannte Protein der vorliegenden Erfindung meint daher ein Protein, welches, wenn das Protein der vorliegenden Erfindung an einer Zellmembran coexprimiert wird, an der ein vom Menschen abgeleitetes Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2hc mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 oder ein homologes Protein dazu, das von einem nicht-humanen Tier stammt, exprimiert wird, die Eigenschaft zeigt, den Einbau einer der oben genannten Aminosäuren in die Zelle zu induzieren.
Hierin bedeutet "homologes Protein" ein Protein, das von einer Tier-Spezies ausschließlich des Menschen abgeleitet ist und eine Sequenzhomologie zur Aminosäuresequenz (SEQ ID NR. 6) des vom Menschen abgeleiteten Zellmembran-Oberflächenmoleküls 4F2hc aufweist, von dem angenommen wird, dass es evolutionär von einem gemeinsamen Vorläuferprotein abstammt und dieselbe physiologische Funktion wie das vom Menschen stammende 4F2hc aufweist.
Vorzugsweise ist das Protein der vorliegenden Erfindung eines der Proteine der folgenden (1) und (2).

(1) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2; oder
(2) ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, worin ein oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 deletiert, substituiert oder addiert sind und das Protein durch seine Fähigkeit gekennzeichnet ist, den Einbau jeder der Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Histidin (His), Tryptophan (Trp) und Valin (Val) in die Zelle zu vermitteln, in der das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 exprimiert wird.

Hierin meint "mehrere Aminosäuren" eine Vielzahl von Aminosäuren. Spezifischer meint dies 1 bis 40 Aminosäuren, vorzugsweise 1–30 Aminosäuren, bevorzugter 1 bis 20 Aminosäuren, und besonders bevorzugt 1 bis 10 Aminosäuren.
Eine partielle Modifikation (Deletion, Substitution, Insertion und Addition) der Aminosäure in der Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung, wie oben genannt, kann durch eine partielle Modifikation der Basensequenz, die für das Protein codiert, eingeführt werden. Diese partielle Modifikation der Basensequenz kann mittels einer herkömmlichen Methode durch eine bekannte ortsspezifische Mutagenese eingeführt werden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 81, S. 5662–5666, 1984).
Die "partielle Aminosäuresequenz" der vorliegenden Erfindung stellt eine Ausführungsform des Proteins der vorliegenden Erfindung, wie oben genannt, dar und bezieht sich auf jegliche partielle Aminosäuresequenz (Proteinfragment) in der Aminosäuresequenz. Vorzugsweise handelt es sich um eine partielle Sequenz, die eine Stelle enthält, die für das Proteins der vorliegenden Erfindung erforderlich ist, um seine biologische Funktion zu erfüllen, oder eine Stelle, an die das Protein der vorliegenden Erfindung an ein anderes Proteinmolekül (Rezeptor oder Ligand) bindet oder damit wechselwirkt.
Darüber hinaus meint "Polypeptid, das eine partielle Aminosäuresequenz enthält und Antigenität aufweist" in der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid, das die oben genannte partielle Aminosäuresequenz enthält und als nicht-eigene Substanz oder Fremdsubstanz aufgrund des Immunantwort-Mechanismus des Säugers erkannt wird, wenn das Polypeptid dem Körper des oben genannten Säugers verabreicht wird, wodurch die Produktion eines Antikörpers zu dem Polypeptid im Körper des Säugers möglich wird.
Das Polypeptid, das das Protein der vorliegenden Erfindung oder die partielle Aminosäuresequenz in der Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung enthält, kann durch geeignete Anwendung einer im Fachgebiet bekannten Methode exprimiert werden, wie etwa einer chemischen Synthese oder einer Zellinkubationsmethode oder einer Modifikation dieser Methoden, zusätzlich zur genetischen Rekombinationstechnik, die später bezeichnet werden wird.
Es ist auch möglich, das Protein der vorliegenden Erfindung durch Injektion der RNA der vorliegenden Erfindung, die später beschrieben werden wird, in verschiedene Zellen, wie etwa Eizellen von Xenopus laevis, zu exprimieren, woraufhin eine direkte Translation der in die Zellen infundierten RNA zum Protein ohne einer Transkription der DNA zu mRNA erfolgt (Spezialausgabe von Jikken Igaku, "Method of Experiments of Biosignals", Band 11, Nr. 3, S. 30–38, 1998).
Eine "DNA" der vorliegenden Erfindung ist eine solche, wie in einem der obigen <7> bis <11> benannt. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die DNA, die für das Protein oder das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert. Auch eine DNA mit einer beliebigen Basensequenz, z.B. cDNA, eine DNA, die komplementär zu der cDNA ist, und genomische DNA ist davon abgedeckt, sofern es sich um eine DNA handelt, die zur Codierung für das Protein der vorliegenden Erfindung fähig ist. Die DNA der vorliegenden Erfindung deckt außerdem jegliche DNA ab, die sich aus einem beliebigen Codon zusammensetzt, solange das Codon für dieselbe Aminosäure codiert. Weiterhin ist eine bevorzugte Ausführungsform der DNA der vorliegenden Erfindung eine DNA, die für das vom Menschen stammende Protein der vorliegenden Erfindung codiert.
Genauer gesagt ist die DNA der vorliegenden Erfindung eine DNA, wie in einem der folgenden (1) bis (3) genannt.

(1) DNA, die für das in einem der obigen <1> bis <5> genannte Protein codiert. Hierbei deckt die DNA eine DNA-Sequenz mit einer beliebigen Basensequenz ab, wie z.B. cDNA, eine DNA, die komplementär zu der cDNA ist, und genomische DNA, solange es sich um eine DNA handelt, die für das Protein codiert, wie etwa ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder NR. 4.
(2) DNA, die eine Basensequenz enthält, umfassend die Basensequenz, welche eine Basensequenz von Basen 66 bis 1586 der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 und jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch TAG, TGA oder TAA, angrenzend an die 1586. Base, oder die Basensequenz von Basen 64 bis 1599 der Basensequenz der SEQ ID NR. 3 und jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch TAG, TGA oder TAA, angrenzend an die 1599. Base. Hierin bezeichnet "Nonsense-Basensequenz" eine der Basensequenzen von TAG, TGA oder TAA, die auch als Terminationscodon, Stoppcodon, Nonsense-Codon, Terminationscodon oder Terminationssignal bezeichnet wird und eine Basensequenz ist, die für den Terminationspunkt der Proteinsynthese codiert.
(3) DNA, die für das Zelloberflächenprotein mit der Fähigkeit codiert, den Einbau mindestens einer Aminosäure in die Zelle zu vermitteln, indem sie unter einer stringenten Bedingung an eine DNA mit einer Basensequenz hybridisiert, die eine Basensequenz von Basen 66 bis 1586 der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 oder eine Basensequenz von Basen 64 bis 1599 der Basensequenz der SEQ ID NR. 3 und mindestens eine Nonsense-Basensequenz, dargestellt durch TAG, TGA oder TAA, angrenzend an die 1599. Base umfasst, wobei der Einbau der Aminosäure in die Zelle unabhängig vom gleichzeitigen Vorhandensein eines der Proteine der folgenden (a) und (b) vermittelt wird: (a) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 oder NR. 8; und (b) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 oder NR. 8, worin ein oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert sind.

Der hier verwendete Begriff "mehrere Aminosäuren" hat dieselbe Bedeutung wie bereits definiert.
Der hierin verwendete Begriff "unter einer stringenten Bedingung" meint eine Bedingung zur Durchführung der Hybridisation, und meint spezifischer gesagt die Temperatur und die Salzkonzentration. Die Temperatur beträgt gewöhnlich etwa 36°C bis etwa 42°C, und kann auch, in Abhängigkeit von der Länge und dem Grad der Komplementarität der verwendeten Sonde, wie folgt eingestellt werden.
Wird beispielsweise eine Sonde von 50 oder mehr Basen verwendet und wird die Hybridisation unter 0,9 % NaCl vorgenommen, so wird die Temperatur (Tm), die eine Dissoziation von 50 % ergibt, anhand der folgenden Formel berechnet und kann die Hybridisationstemperatur wie in der folgenden Formel gezeigt eingestellt werden: Tm = 82,3°C + 0,41 × (G + C)% – 500/n – 0,61 × (Formamid)%(n ist die Basenzahl der Sonde)
Temperatur = Tm – 25°C
Wird eine Sonde mit 100 oder mehr Basen (G + C = 40 bis 50 %) verwendet, so ist das Ziel, dass sich die Tm gemäß der folgenden (1) und (2) verändert:

(1) Die Tm sinkt um 1 °C pro 1 % Fehlpaarung.
(2) Die Tm sinkt mit der Rate von 0,6 bis 0,7°C pro 1 % Formamid.

Entsprechend kann die Temperaturbedingung im Falle einer Kombination von vollständig komplementierten Ketten wie folgt eingestellt werden:

(A) 65 bis 75°C (ohne zugesetztes Formamid)
(B) 35 bis 45°C (in Gegenwart von 50 % Formamid)

Die Temperaturbedingung im Falle der Kombination von unvollständig komplementierten Ketten kann wie folgt eingestellt werden:

(A) 45 bis 55°C (ohne zugesetztes Formamid)
(B) 35 bis 42°C (in Gegenwart von 30 % Formamid)

Die Temperaturbedingung, wenn eine Sonde mit 23 oder weniger Basen erzeugt werden soll, beträgt 37°C, wobei die folgende Formel eine Hilfe sein kann: Temperatur = 2°C × (Anzahl von T + A) + 4°C × (Anzahl von G + C) – 5°C.
Bezüglich der Salzkonzentration können 5 × SSC oder ein Äquivalent dazu üblicherweise eingestellt werden.
Entsprechend kann die Temperatur bei der Hybridisation der vorliegenden Erfindung zum Beispiel auf etwa 37°C eingestellt werden, und kann die Salzkonzentration auf 5 × SSC oder ein Äquivalent dazu eingestellt werden.
Die oben genannte DNA der vorliegenden Erfindung kann mittels einer beliebigen Methode hergestellt werden. Zum Beispiel ist komplementäre DNA (cDNA) die von mRNA erhalten wird, DNA, die von genomischer DNA erhalten wird, DNA, die durch chemische Synthese erhalten wird, DNA, die durch Amplifikation mittels einer PCR unter Verwendung von RNA oder DNA als einer Matrize erhalten wird, und DNA, die durch eine geeignete Kombination dieser Methoden erhalten wird, von der DNA der vorliegenden Erfindung umfasst.
Eine DNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, kann mittels einer Methode, bei der cDNA von der mRNA des Proteins der vorliegenden Erfindung mittels einer herkömmlichen Methode kloniert wird, einer Methode, bei der genomische DNA isoliert und einer Spleißbehandlung unterzogen wird, einer chemischen Synthesemethode etc., hergestellt werden.

(1) Bezüglich einer Methode zum Klonieren von cDNA aus der mRNA des Proteins der vorliegenden Erfindung wird die folgende Methode als Beispiel veranschaulicht: Zunächst wird aus dem oben genannten Gewebe oder der Zelle, aus der das Protein der vorliegenden Erfindung generiert/produziert wird, die mRNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, hergestellt. Die Isolierung der mRNA wird beispielsweise mittels einer Methode vorgenommen, bei der die Gesamt-RNA, die mittels einer bekannten Methode, z.B. der Guanidinthiocyanat-Methode (Chirgwin, et al., Biochemistry, Band 18, S. 5294, 1979), der Heißphenolmethode oder einer AGPC-Methode, erhalten wird, einer Affinitätschromatographie unter Verwendung von Oligo-(dT)-Cellulose oder Poly-U-Sepharose unterzogen wird.

Dann wird die cDNA-Kette beispielsweise mittels einer bekannten Methode wie der unter Verwendung einer reversen Transkriptase, z.B. einer Methode von Okayama (Mol. Cell. Biol., Band 2, S. 161, 1982; und ibid, Band 3, S. 280, 1983), einer Methode von Hoffman, et al. (Gene, Band 25, S. 263, 1983) unter Verwendung der wie oben erhaltenen mRNA als einer Matrize synthetisiert, woraufhin die cDNA zu einer doppelsträngigen cDNA umgewandelt wird. Die resultierende cDNA wird in einen Plasmidvektor oder einen Phagenvektor integriert, und, nachdem Escherichia coli transformiert oder einer in vitro-Verpackung unterzogen wurde, in E. coli transfiziert, woraufhin eine cDNA-Bank angelegt wird.
Bezüglich des hierin verwendeten Plasmidvektors besteht keine spezielle Beschränkung, solange er dupliziert und im Wirt gehalten wird, und bezüglich des verwendeten Phagenvektors kann jeder, der zur Vermehrung im Wirt fähig ist, verwendet werden. Beispiele des Vektors für die Klonierung, die gewöhnlich angewendet wird, sind λZipLox, pUC19, λgt10 und λgt11. Wird er jedoch einem immunologischen Screening unterzogen, was später erläutert werden wird, so ist ein Vektor mit einem Promotor, der zum Exprimieren eines für das Protein der vorliegenden Erfindung codierenden Gens in einem Wirt in der Lage ist, bevorzugt.
Bezüglich einer Methode zum Integrieren der cDNA in das Plasmid besteht ein Beispiel in der Methode von Maniatis, et al., die erläutert ist in Molecular Cloning: A Laboraton Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Nr. 1, S. 53, 1989. Bezüglich einer Methode zum Integrieren von cDNA in den Phagenvektor besteht ein Beispiel in der Methode von Hyunh, et al., DNA Cloning, a Practical Approach, Band 1, S. 49, 1985. Um die Dinge zu vereinfachen kann auch ein handelsüblicher Klonier-Kit (wie etwa das Produkt von Gibco oder Takara Shuzo) verwendet werden. Der rekombinierte Plasmid- oder Phagenvektor, der in solcher Weise präpariert wurde, wird in einen geeigneten Wirt in prokanontischen Zellen eingeführt (wie etwa E. coliHB101, DH5α oder MC1061/P3, etc.).
Bezüglich der Methode zur Einführung des Plasmids in einen Wirt können eine Calciumchloridmethode oder eine Calciumchlorid/Rubidiumchloridmethode, wie erläutert in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Nr. 1, S. 74, 1989), eine Elektroporationsmethode etc. als Beispiele genannt werden. Bezüglich einer Methode zur Einführung eines Phagenvektors in einen Wirt kann eine Methode, bei der Phagen-DNA einer in vitro-Verpackung unterzogen und dann in einen proliferierten Wirt eingeführt wird, als Beispiel genannt werden. Die in vitro-Verpackungsmethode lässt sich unter Verwendung eines handels üblichen in vitro-Verpackungskits (wie z.B. hergestellt von Stratagene, Amersham, etc.) ohne weiteres durchführen.
Eine Methode für die Isolation von cDNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, aus der cDNA-Bank, die mittels der oben genannten Methode hergestellt wurde, wird durch eine Kombination herkömmlicher cDNA-Screeningmethoden ausgeführt.
Zum Beispiel können eine Methode, bei der DNA, die einen Teil oder die gesamte Basensequenz enthält, die für die Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung codiert, oder DNA, die eine Homologie zur Basensequenz aufweist, separat präpariert wird, diese zur Herstellung einer Sonde mit ³²P oder [α-³²P]dCTP markiert wird und dann ein Klon, welcher die gewünschte cDNA enthält, mittels einer bekannten Koloniehybridisationsmethode (Crunstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 72, S. 3961, 1975) oder einer Plaquehybridisationsmethode (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Nr. 2, S. 108, 1989) gescreent werden, als auch eine Methode, bei der ein PCR-Primen hergestellt wird, die spezifische Region des Proteins der vorliegenden Erfindung durch eine PCR amplifiziert wird und ein Klon, der ein für die Region codierendes DNA-Fragment aufweist, ausgewählt wird, etc., als Beispiele genannt werden.
Wird eine cDNA-Bank, die mittels des Vektors hergestellt wurde, der zur Exprimierung der cDNA fähig ist (wie z.B. λZipLox- oder λgt11-Phagenvektor) verwendet, so kann ein erwünschter Klon unter Ausnutzung einer Antigen-Antikörper-Reaktion mittels eines Antikörpers, der eine Reaktivität mit den Protein der vorliegenden Erfindung aufweist, ausgewählt werden. Wird der Klon im großen Maßstab behandelt, so ist die Anwendung einer Screeningmethode unter Ausnutzung der PCR bevorzugt.
Die Basensequenz der derart hergestellten DNA kann mittels einer Methode von Maxam-Gilbert (Maxam, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 74, S. 560, 1977), einer Methode, bei der die Didesoxynukleotid-Synthesekette unter Verwendung des Phagen M13 abgebrochen wird (Sangen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 74, S. 5463–5467, 1977) oder einer Diterminator-Zyklussequenzierungsmethode (herge stellt von Applied Biosystems) bestimmt werden. Das für das Protein der vorliegenden Erfindung codierende Gen kann mittels einer Methode präpariert werden, bei der das gesamte oder ein Teil davon aus dem oben präparierten Klon unter Verwendung eines Restriktionsenzyms herausgeschnitten wird, etc.

(2) Bezüglich einer Präpariermethode durch Isolieren der DANN, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, aus der genomischen DNA, die von der Zelle stammt, die das Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert, wie oben erläutert, kann die folgende Methode als Beispiel veranschaulicht werden. Dabei wird die Zelle vorzugsweise unter Verwendung von SDS oder Protenase K. etc. gelöst und wiederholt mit Phenol extrahiert, wodurch das Protein aus der DNA entfernt wird. Die RNA wird vorzugsweise durch Ribonuklease verdaut. Die resultierende DNA wird mittels eines geeigneten Restriktionsenzyms teilverdaut und das resultierende DNA-Fragment mittels eines geeigneten Phagen oder Cosmids amplifiziert, um eine Bank herzustellen. Ein Klon mit der gewünschten Sequenz wird nachgewiesen, zum Beispiel mittels einer Methode, bei der eine radiomarkierte DNA-Sonde verwendet wird und das gesamte oder ein Teil des Gens, das für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, aus dem Klon mittels eines Restriktionsenzyms oder ähnlichem herausgeschnitten und entnommen wird.
(3) Die Herstellung der cDNA, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 codiert, welche eine Ausführungsform der DNA der vorliegenden Erfindung ist, kann mittels einer herkömmlichen Methode basierend auf der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 vorgenommen werden.

Zum Beispiel wird eine Ratten-C6-Gliomzelle als einer Genquelle verwendet und die mRNA (poly(A)-RNA) daraus präpariert. Diese wird fraktioniert, und jede Fraktion wird in Eizellen von Xenopus laevis zusammen mit der cRNA von 4F2hc eingeführt.
Da über die cDNA des Gens 4F2hc bereits berichtet worden ist [Broer, et al., Biochem. J., Band 312, S. 863, 1995], ist eine einfache Präparierung des Gens von 4F2hc mittels dieser Sequenzinformation unter Anwendung der PCR etc. möglich. Aus der resultierenden cDNA von 4F2hc ist die Synthetisierung einer RNA, die dazu komplementär ist (cRNA) (gekappte RNA) unter Verwendung von T3- oder T7-RNA-Polymerase etc. möglich.
Bezüglich der Eizelle, in die die cRNA von 4F2hc und die mRNA eingeführt werden, wird der Transport (Einbau) des Substrats in die Zelle unter Verwendung von Leucin oder ähnlichem als einem Substrat gemessen und eine mRNA-Fraktion, die eine hohe Einbauaktivität zeigt, ausgewählt, wodurch die mRNA von LATZ konzentriert werden kann. Eine cDNA-Bank wird unter Verwendung dieser konzentrierten mRNA als einer Basis präpariert. Aus der cDNA der Bank wird cRNA (gekappte RNA) präpariert, bei der eine Gruppe aus etwa 500 Klonen besteht, und jede Gruppe wird in Eizellen zusammen mit cRNA von 4F2hc eingeführt, und unter Anlegung der Einbauaktivität des Substrats als einem Index wird eine positive Gruppe ausgewählt. Wird eine positive Gruppe gefunden, so wird sie weiter in Untergruppen klassifiziert, und derselbe Vorgang wird wiederholt, woraufhin Klone, die cDNA des LAT1-Gens enthalten, erhalten werden können.
Bei der resultierenden cDNA wird die Basensequenz mittels einer herkömmlichen Methode bestimmt und eine Translationsregion analysiert, wodurch das dadurch codierte Protein, oder in anderen Worten die Aminosäuresequenz von LAT1, bestimmt werden kann.
Die Tatsache, dass die resultierende cDNA eine cDNA eines neutralen Aminosäure-Transportergens ist oder, in anderen Worten, dass das Genprodukt, das durch die cDNA codiert ist, ein neutraler Aminosäuretransporter ist, kann zum Beispiel wie folgt bestätigt werden. Dabei wird die cRNA, die aus der resultierenden cDNA des LAT1-Gens präpariert ist, durch Einführen in Eizellen zusammen mit der cRNA von 4F2hc exprimiert und die Fähigkeit zum Transport (Einbau) der neutralen Aminosäure in die Eizellen kann in derselben Weise wie oben erwähnt durch Messen des Einbaus des Substrats in die Eizellen gemäß eines herkömmlichen Einbautests (Kanal und Hediger, Nature, 360, 467–471 (1992)) unter Verwendung einer geeigneten neutralen Aminosäure als einem Substrat bestätigt werden.
Dasselbe Einbauexperiment wird auf die exprimierte Zelle angewendet, wobei es möglich ist, die Charakteristik von LAT1 zu untersuchen, wie etwa die Eigenschaft, dass LAT1 einen Austausch von Aminosäuren vornimmt, die Substratspezifität des LAT1, etc.
Wird die resultierende cDNA des LAT1-Gens verwendet und eine geeignete cDNA-Bank oder genomische DNA-Bank, die aus verschiedenen Genquellen präpariert wurde, gescreent, so ist es möglich, das homologe Gen, chromosomale Gen etc., das aus verschiedenen Geweben und verschiedenen Organismen stammt, zu isolieren.
Wird ferner eine herkömmliche PCR (Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung eines synthetischen Primers vorgenommen, der basierend auf der Information der beschriebenen Basensequenz des Gens der vorliegenden Erfindung (eine in SEQ ID NR. 1 gezeigte Basensequenz oder ein Teil davon) designed ist, so ist es möglich, ein Gen aus der cDNA-Bank oder der genomischen DNA-Bank zu isolieren.
SEQ ID NR. 3 der Sequenzliste, die später erläutert werden wird, zeigt eine cDNA-Basensequenz der vollen Länge (etwa 3,5 kbp) des Gens eines neutralen Aminosäuretransporters (Ratten-LAT1), der von einer Ratten-C6-Gliomzelllinie stammt, und eine Aminosäuresequenz (512 Aminosäuren) des Proteins, die für seine Translationsregion codiert. SEQ ID NR. 4 der Sequenzliste zeigt eine Aminosäuresequenz (512 Aminosäuren) eines neutralen Aminosäuretransporters (Ratten-LAT1), der von einer Ratten-C6-Gliomzelllinie stammt.
Eine DNA-Bank, wie etwa eine cDNA-Bank oder eine genomische DNA-Bank, kann mittels einer Methode hergestellt werden, wie erläutert zum Beispiel in Molecular Cloning (von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Press in 1989). Alternativ kann eine handelsübliche Bank verwendet werden, sofern verfügbar.
In der Herstellung einer cDNA, die für das von einem Menschen stammende Protein codiert, kann dies auch auf die folgende Weise vorgenommen werden, bei der eine Cosmid-Bank, in die außerdem humane genomische DNA (chromosomale DNA, genomische DNA) eingeführt ist (Laboratory Manual Human Genome Mapping, herausgegeben von Masaaki Hori und Yusuke Nakamura, veröffentlicht von Maruzen), woraufhin die Cosmid-Bank gescreent wird, um einen positiven Klon zu erhalten, der die DNA der Codierungsregion des gewünschten Proteins enthält, und die codierende DNA, die aus dem positiven Klon herausgeschnitten wird, kann als eine Sonde zur Durchführung eines Screenings der oben genannten cDNA-Bank verwendet werden.
SEQ ID NR. 1 der Sequenzliste, die später erläutert werden wird, zeigt eine cDNA-Basensequenz der vollen Länge (etwa 4,5 kbp) des Gens eines neutralen Aminosäuretransporters (humaner LAT1), der von einem Menschen stammt, und eine Aminosäuresequenz (507 Aminosäuren) des Proteins, die für seine Translationsregion codiert. SEQ ID NR. 2 der Sequenzliste zeigt eine Aminosäuresequenz (507 Aminosäuren) eines neutralen Aminosäuretransporters (humaner LAT1), die vom Menschen stammt.
SEQ ID NR. 5 der Sequenzliste zeigt eine cDNA-Basensequenz der vollen Länge (etwa 1,8 kbp) des Gens vom 4F2hc-Protein, die vom Menschen stammt, und eine Aminosäuresequenz (529 Aminosäuren) des Proteins, die für seine Translationsregion codiert, und SEQ ID NR. 6 der Sequenzliste zeigt eine Aminosäuresequenz (529 Aminosäuren) des 4F2hc-Proteins, das vom Menschen stammt. SEQ ID NR. 7 der Sequenzliste zeigt eine cDNA-Basensequenz der vollen Länge (etwa 1,8 kbp) des Gens von 4F2hc-Protein, das von der Ratte stammt, und eine Aminosäuresequenz (527 Aminosäuren) des Proteins, die für seine Translationsregion codiert, und SEQ ID NR. 8 der Sequenzliste zeigt eine Aminosäuresequenz (527 Aminosäuren) des 4F2hc-Proteins, das von der Ratte stammt.
"Expressionsvektor" der vorliegenden Erfindung meint einen rekombinanten Vektor, der die DNA der vorliegenden Erfindung enthält. Es besteht keine spezielle Beschränkung hinsichtlich des rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung, solange er zur Durchführung einer Selbstmultiplikation in verschiedenen Wirten, wie z.B. prokaryontischen Zellen und/oder eukaryontischen Zellen, einschließlich Plasmidvektor und Phagenvektor, fähig ist.
Der rekombinante Vektor kann in einfacher Weise durch Verknüpfen der DNA der vorliegenden Erfindung mittels einer herkömmlichen Methode mit einem Vektor für die Rekombination, der im Fachgebiet verfügbar ist (Plasmid-DNA und Bakteriophagen-DNA) hergestellt werden. Spezifische Beispiele der verwendbaren Vektoren für die Rekombination im Falle eines von Escherichia coli abgeleiteten Plasmids sind pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 und pUC19; im Falle eines von Hefe abgeleiteten Plasmids pSH19 und pSH15; und im Falle eines von Bacillus subtilis abgeleiteten Plasmids pUB110, pTP5 und pC194. Beispiele der Phagen sind Bakteriophagen wie λ-Phage, und außerdem Tier- und Insektenviren, wie z.B. Retrovirus, Vaccinia-Virus und nukleares Polyhydrose-Virus (pVL 1393, hergestellt von Invitrogen). Ein weiteres Beispiel ist pZL1.
Für das Ziel der Exprimierung des Proteins der vorliegenden Erfindung ist Expressionsvektor nützlich. Bezüglich des Expressionsvektors besteht keine spezielle Beschränkung, solange er die Fähigkeit zum Exprimieren des Proteins der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Wirtszellen wie prokanontischen Zellen und/oder eukaryontischen Zellen aufweist. Als Beispiele können pMAL C2, pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Band 18, S. 5322, 1990; etc.) oder pME18S (Handbook of Genetic Engineering, ergänzende Ausgabe von Jikken Igaku, 1992; etc.) genannt werden.
Werden Bakterien, insbesondere Escherichia coli, als einer Wirtszelle verwendet, so besteht ein Expressionsvektor üblicherweise zumindest aus einer Promotor-Operator-Region, Initiationscodon, DNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, Terminationscodon, Terminatorregion und replizierbarer Einheit.
Wird Hefe, Tierzelle oder Insektenzelle als ein Wirt verwendet, so enthält der Expressionsvektor vorzugsweise zumindest einen Promotor, Initiationscodon, DNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, und Terminationscodon. Er kann außerdem DNA, die für ein Signalpeptid codiert, Enhancer-Sequenz, nicht-translatierte Region an den 5'- und 3'-Enden des Gens, das für das Protein der vorliegen den Erfindung codiert, einen Spleiß-konjugierten Abschnitt, Polyadenylierungsstelle, eine selektive Markenregion oder eine duplizierbare Einheit enthalten. In Abhängigkeit von der Aufgabe kann er auch ein Gen für die Genamplifikation (Marken) enthalten, wie es gewöhnlich verwendet wird.
Die Promotor-Operator-Region zur Exprimierung des Proteins der vorliegenden Erfindung in Bakterien enthält einen Promotor, Operator und eine Shine-Dalgarno-(SD)-Sequenz (wie etwa AAGG). Ist der Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia, so sind geeignete Beispiele solche, die Trp-Promotor, Lac-Promotor, rec A-Promotor, λPL-Promotor, lpp-Promotor und tac-Promotor enthalten. Beispiele des Promotors zur Exprimierung des Proteins der vorliegenden Erfindung in Hefe sind PH05-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor und ADH-Promotor; gehört der Wirt zur Gattung Bacillus, so sind Beispiele der SL01-Promotor, SP02-Promotor und penP-Promotor. Ist der Wirt eine eukaryontische Zelle, wie z.B. eine Säugerzelle, so sind Beispiele von SV40 abgeleiteter Promotor, Promotor für Retrovirus und Hitzeschock-Promotor. Bevorzugte Beispiele sind SV-40 und Retrovirus. Allerdings besteht keine spezielle Beschränkung für die obigen. Auch die Nutzung eines Enhancers stellt eine wirksame Methode für die Expression dar.
Bezüglich des geeigneten Initiationscodons stellt Methionin-Codon (ATG) ein Beispiel dar.
Bezüglich des Terminationscodons stellen herkömmlicherweise verwendete Terminationscodons (wie etwa TAG, TGA und TAA) Beispiele dar.
Bezüglich der Terminatorregion kann herkömmlicherweise verwendeter natürlicher oder synthetischer Terminator verwendet werden.
Duplizierbare Einheit meint eine DNA mit der Fähigkeit zur Duplizierung ihrer gesamten DNA-Sequenz in Wirtszellen, was natürliches Plasmid, künstlich modifiziertes Plasmid (aus natürlichem Plasmid präpariertes DNA-Fragment) und synthetisches Plasmid umfasst. Bezüglich eines geeigneten Plasmids sind Plasmid pBR322 oder ein künstlich modifiziertes Produkt davon (durch Behandlung von pBR322 mit einem geeigneten Restriktionsenzym erhaltenes DNA-Fragment) im Falle von E. coli; 2μ Hefe-Plasmid oder chromosomale Hefe-DNA im Falle von Hefe; und Plasmid pRSVneo (ATCC 37198), Plasmid pSV2dhfr (ATCC 37145), Plasmid pdBPV-MMTneo (ATCC 37224), Plasmid pSV2neo (ATCC 37149), etc. im Falle von Säugerzellen, zu nennen.
Bezüglich der Enhancer-Sequenz, Polyadenylierungsstelle und Spleiß-Kombinationsstelle können die von Fachleuten des Gebiets häufig verwendeten wie die von SV40 abgeleiteten Sequenzen/Stellen verwendet werden.
Bezüglich des selektiven Markers können die häufig verwendeten mittels einer herkömmlichen Methode eingesetzt werden. Ein Beispiel stellt ein Gen dar, das resistent gegenüber Antibiotika wie Tetracyclin, Ampicillin, Neomycin oder Kanamycin ist.
Bezüglich des Gens für die Genamplifikation stellen Dihydrofolsäurereduktase-(DHFR)-Gen, Thymidinkinase-Gen, Neomycin-Resistenzgen, Glutaminsäure-synthetisches Enzymgen, Adenosindeaminase-Gen, Ornithindecarboxylase-Gen, Hygromycin B-Phosphotransferase-Gen, Aspartattranscarbamylase etc. Beispiele dar.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung kann durch kontinuierliches und cyclisches Binden zumindest des oben genannten Promotors, Initiationscodons, der DNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, Terminationscodons und Terminatorregion an eine geeignete duplizierbare Einheit hergestellt werden. Sofern in diesem Fall erforderlich, ist die Verwendung eines geeigneten DNA-Fragments (wie etwa eines Linkers, anderer Restriktionsstellen etc.) mittels einer herkömmlichen Methode wie dem Verdau mit einem Restriktionsenzym oder der Ligation unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase ebenfalls möglich.
Die "transformierte Zelle" der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die durch den oben genannten Expressionsvektor oder die DNA der vorliegenden Erfindung transformiert ist und die durch Einführen der DNA oder des Expressionsvektors in eine prokaryontische Zelle oder eukaryontische Zelle als einer Wirtszelle hergestellt werden kann.
Bezüglich der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Wirtszelle besteht keine spezielle Beschränkung, solange sie auf den oben genannten Expressionsvektor angepasst ist und transformierbar ist, wobei Beispiele dafür verschiedene Zellen sind, wie etwa eine natürliche Zelle oder künstlich hergestellte rekombinante Zelle, wie sie häufig im Fachgebiet der vorliegenden Erfindung verwendet wird, z.B. Bakterien (die zur Gattung Escherichia und Gattung Bacillus gehören), Hefe, die zur Gattung Saccharomyces, Gattung Pichia etc. gehört), Tierzellen und Insektenzellen.
Vorzugsweise sind dies Escherichia coli- oder Tierzellen, und spezifischer können E. coli (DH5α, TB1, HB101, etc.), von Mäusen stammende Zellen (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1 und NIH3T3, etc.), von Ratten stammende Zellen (PC12, PC12h, etc.), von Hamstern stammende Zellen (BHK und CHO, etc.), von Affen stammende Zellen (COS1, COS3, COS7, CV1 und Velo, etc.) und von Menschen stammende Zellen (HeLa, von diploiden Fibroblasten stammende Zellen, HEK293-Zellen, Myelomzellen und Namalwa, etc.), als Beispiele genannt werden.
Die Einführung des Expressionsvektors in Wirtszellen (Transformation (Merkmalübertragung)) kann mittels einer Methode vorgenommen werden, die bereits bekannt ist.
So kann die Transformation beispielsweise mittels einer Methode von Cohen, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 69, S. 2110, 1972), einer Protoplastenmethode (Mol. Gen. Genet., Band 168, S. 111, 1979) und einer Kompetenzmethode (J. Mol. Biol., Band 56, S. 209, 1971) im Falle von Bakterien (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.) vorgenommen werden; zum Beispiel mittels der Methode von Hinnen, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 75, S. 1927, 1978) und einer Lithiummethode (J. Bacteriol., Band 153, S. 163, 1983) im Falle von Saccharomyces cerevisiae, zum Beispiel mittels einer Methode von Graham (Virology, Band 52, S. 456, 1973) im Falle von Tierzellen; und zum Beispiel mittels der Methode von Summers, et al. (Mol. Cell. Biol., Band 3, S. 2156–2165, 1983) im Falle von Insektenzellen.
Das "Protein" der vorliegenden Erfindung kann durch Inkubation der wie oben präparierten Transformantenzelle (im Folgenden wird dies im Sinne der Substanz verwendet werden, in die das Merkmal übertragen wird), die den Expressionsvektor in einem Nährmedium enthält, exprimiert werden.
Es ist bevorzugt, dass das Nährmedium eine Kohlenstoffquelle, anorganische Stickstoffquelle oder organische Stickstoffquelle enthält, wie für das Wachstum der Wirtszelle (Transformant) erforderlich. Bezüglich der Kohlenstoffquelle können Glucose, Dextran, lösliche Stärke, Succrose, etc. genannt werden; und bezüglich der anorganischen Stickstoffquelle oder der organischen Stickstoffquelle können Ammoniumsalze, Nitrate, Aminosäure, Corn Steep Liquor, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen, Kartoffelextrakt, etc. genannt werden. Sofern erwünscht, können weitere Nährstoffe (wie etwa anorganisches Salz [z.B. Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid], Vitamine, antibiotische Substanzen [z.B. Tetracyclin, Neomycin, Ampicillin und Kanamycin] etc.) darin enthalten sein.
Die Inkubation kann mittels einer Methode durchgeführt werden, die im Fachgebiet bekannt ist. Die Inkubationsbedingungen wie Temperatur, pH des Mediums und Inkubationsdauer können geeignet ausgewählt werden, um das Protein der vorliegenden Erfindung reichlich zu exprimieren.
Im Folgenden werden die spezifischen Medien und Inkubationsbedingungen, die in Abhängigkeit von der Wirtszelle verwendet werden, beispielhaft erläutert werden, obschon die vorliegende Erfindung in keinster Weise darauf beschränkt ist.
Ist der Wirt ein Bakterium, Actinomyces, Hefe oder Fadenpilz, ist beispielsweise ein Flüssigmedium, das die oben genannten Nährstoffe enthält, geeignet. Vorzugsweise ist dies ein Medium mit einem pH-Wert von 5–8.
Ist der Wirt E. coli, so sind Beispiele des bevorzugten Mediums LB-Medium, M9-Medium (Millen, et al., Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboraton, S. 431, 1972), etc. In diesem Fall kann die Inkubation gewöhnlich bei 14–43°C für etwa 3–24 Stunden, sofern erforderlich in Verbindung mit Belüftung und Rühren, vorgenommen werden.
Gehört der Wirt zur Gattung Bacillus, so kann die Inkubation üblicherweise bei 30–40°C für etwa 16–96 Stunden, sofern erforderlich unter Belüftung und Rühren, vorgenommen werden.
Ist der Wirt eine Hefe, so ist das Medium vorzugsweise zum Beispiel ein Burkholder-Minimum Medium (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 77, S. 4505, 1980) und beträgt der pH-Wert vorzugsweise 5 –8. Die Inkubation wird gewöhnlich bei 20–35°C für etwa 14–144 Stunden, sofern erforderlich unter Belüftung und Rühren, vorgenommen.
Ist der Wirt eine Tierzelle, so kann MEM-Medium, das etwa 5 bis 20 % fötales Rinderserum enthält (Science, Band 122, S. 501, 1952), DMEM-Medium (Virology, Band 8, S. 396, 1959), RPMI-1640-Medium (J. Am. Med. Assoc., Band 199, S. 519, 1967), 199-Medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Band 73, S. 1, 1950) etc. als ein Medium verwendet werden. Der pH-Wert des Mediums ist vorzugsweise etwa 6–8 und die Inkubation wird üblicherweise bei 30–40°C für etwa 15–72 Stunden vorgenommen. Sofern erforderlich, können auch Belüftung und Rühren erfolgen.
Ist der Wirt eine Insektenzelle, so kann Grace-Medium, das fötales Rinderserum enthält (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 82, S. 8404, 1985) etc. als Beispiel verwendet werden, wobei der pH vorzugsweise etwa 5–8 beträgt. Die Inkubation wird üblicherweise bei etwa 20–40°C für etwa 15–100 Stunden, sofern erforderlich unter Belüftung und Rühren, vorgenommen.
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann in solcher Weise exprimiert werden, dass der Transformant, der wie oben unter Verwendung des Expressionsvektors oder der DNA der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, wie oben erläutert, unter den oben genannten Inkubationsbedingungen inkubiert wird.
Wird das Protein der vorliegenden Erfindung als ein lösliches Protein hergestellt, so werden die Zellen nach der Zellinkubation gesammelt und in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert. Nachdem dann die Zellwände und/oder Zellmembranen der Zelle etc. zum Beispiel mittels Ultraschallwellen, Lysozym, Gefrier-Auftau-Vorgang, zerstört sind, wird eine Methode wie die Zentrifugtion, Filtration etc. vorgenommen, woraufhin die Membranfraktion, die das Protein der vorliegenden Erfindung erhält, erhalten wird. Die Membranfraktion wird unter Verwendung eines grenzflächenaktiven Mittels wie Triton-X 100 zum Erhalt der Rohlösung solubilisiert. Die Rohlösung wird einer herkömmlicherweise angewendeten Reinigungsmethode unterzogen, um das Protein zu reinigen und zu isolieren, woraufhin das Protein der vorliegenden Erfindung als ein lösliches Protein isoliert werden kann.
Bezüglich der Methode zur Isolierung und Reinigung kann eine Methode als Beispiel genannt werden, bei der die Löslichkeit ausgenützt wird, wie die Aussalz- und die Lösungsmittelfällmethode; eine Methode, bei der der Unterschied im Molekulargewicht ausgenützt wird, wie die Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; eine Methode, bei der die Ladung ausgenützt wird, wie die Ionenaustauschchromatographie und Hydroxylapatitchromatographie; eine Methode, bei der die spezifische Affinität ausgenützt wird, wie die Affinitätschromatographie; eine Methode, bei der der Unterschied in der Hydrophobizität ausgenützt wird, wie die Umkehrphasen-Hochleistungschromatographie; und eine Methode, bei der der Unterschied bei den isoelektrischen Punkten ausgenützt wird, wie die isoelektrische Fokussierung.
Die "RNA" der vorliegenden Erfindung ist eine RNA, wie oben unter <5> erwähnt und wie nachstehend erläutert werden wird.
"Eine RNA, die eine Basensequenz von Basen 1 bis 1521 der Basensequenz der SEQ ID NR. 26 enthält, und eine Basensequenz, die jede der Nonsense-Basensequenzen enthält, dargestellt durch UAG, UGA oder UAA, angrenzend an die 1521. Base".
Hierin meint der Begriff "Nonsense-Basensequenz" eine der Basensequenzen von UAG, UGA und UAA, die auch als Terminationscodon, Stoppcodon, Nonsense-Codon, Terminationscodon oder Terminationssignal bezeichnet wird und eine Basensequenz ist, die für den Terminationspunkt der Translation zu dem Protein codiert.
Die RNA der vorliegenden Erfindung kann mittels einer herkömmlichen Methode unter Verwendung einer handelsüblichen RNA-Polymerase (wie etwa T7-RNA-Polymerase) unter Verwendung einer DNA-Sequenz hergestellt werden, die zur oben unter <1> genannten DNA komplementär ist, d.h. "eine DNA, die eine Basensequenz von Basen 66 bis 1586 der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 und jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch TAG, TGA und TAA, angrenzend an die 1586. Base" als einer Matrize enthält.
Die RNA der vorliegenden Erfindung kann zum Exprimieren des Proteins der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Zellen verwendet werden. Wird daher die RNA der vorliegenden Erfindung in Eizellen von Xenopus laevis injiziert, so ist die direkte Expression des Proteins der vorliegenden Erfindung in den Zellen von der injizierten RNA ohne Transkription von DNA zu mRNA möglich (Spezialausgabe von Jikken Igaku, "Method of Experiments of Biosignals", Band 11, Nr.3, S. 30–38, 1993).
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die DNA, die oben unter <4< erläutert wird und im folgenden angegeben ist:
"Eine DNA, die eine partielle Basensequenz der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 enthält oder eine DNA, worin ein Teil der DNA chemisch modifiziert ist, oder eine DNA, die eine Basensequenz enthält, die komplementär zur partiellen Basensequenz ist, oder eine DNA, worin ein Teil der DNA chemisch modifiziert ist und die folgenden Eigenschaften (1) und (2) aufweist.

(1) Die partielle Basensequenz ist eine Basensequenz, die nicht völlig identisch zur partiellen Basensequenz der Basensequenz der SEQ ID NR. 3 ist; und
(2) die DNA oder die chemisch modifizierte DNA hybridisiert an das Gen, das für das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 codiert.

Hierin meint „eine partielle Basensequenz der Basensequenz der SEQ ID NR. 1" eine partielle Basensequenz, die optionale Basenzahlen an irgendeiner Stelle enthält, die in der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 enthalten ist".
Die DNA ist als eine Sonde beim Vorgang der DNA-Hybridisierung oder der RNA-Hybridisierung nützlich. Bei einer Aufgabe der Verwendung der DNA als einer Sonde kann als Beispiel eine partielle Basensequenz von 20 oder mehr aufeinander folgenden Basen genannt werden, vorzugsweise eine partielle Basensequenz von 50 oder mehr aufeinander folgenden Basen, bevorzugter eine partielle Basensequenz von 100 oder mehr aufeinander folgenden Basen, noch bevorzugter eine partielle Basensequenz von 200 oder mehr aufeinander folgenden Basen, und besonders bevorzugt eine partielle Basensequenz von 300 oder mehr aufeinander folgenden Basen als der partiellen Basensequenz.
Die oben genannte DNA ist auch als ein Primer in der PCR nützlich. Bei einer Aufgabe der Verwendung der DNA als einem Primer in der PCR kann als Beispiel eine partielle Basensequenz von 5 bis 100 aufeinander folgenden Basen, vorzugsweise eine partielle Basensequenz von 5 bis 70 aufeinander folgenden Basen, bevorzugter eine partielle Basensequenz von 5 bis 50 aufeinander folgenden Basen, und noch bevorzugter eine partielle Basensequenz von 5 bis 30 aufeinander folgenden Basen als der partiellen Basensequenz genannt werden.
Außerdem ist die oben genannte DNA auch als ein Antisense-Pharmazeutikum nützlich. Dabei hybridisiert die DNA an die RNA oder die DNA, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 codiert, wobei auch die Transkription der DNA zu mRNA oder die Translation der mRNA zu Protein gehemmt werden kann.
Bei einer Aufgabe der Verwendung der obigen DNA als einem Antisense-Pharmazeutikum kann beispielsweise eine partielle Basensequenz von 5 bis 100 aufeinander folgenden Basen, vorzugsweise eine partielle Basensequenz von 5 bis 70 aufeinander folgenden Basen, bevorzugter eine partielle Basensequenz von 5 bis 50 aufeinander folgenden Basen, und noch bevorzugter eine partielle Basensequenz von 5 bis 30 aufeinander folgenden Basen als der partiellen Basensequenz genannt werden.
Wird die DNA als ein Antisense-Pharmazeutikum verwendet, so ist es möglich, einen Teil der Basensequenz der DNA einer chemischen Modifikation zu unterziehen, um ihre Halbwertszeit (Stabilität) im Blut zu erhöhen, wenn die DNA dem Körper eines Patienten verabreicht wird, um die Permeabilität in der intrazellulären Membran zu erhöhen, um den Widerstand gegen Zersetzung in oder die Absorption durch die Verdauungsorgane im Falle einer oralen Verabreichung zu erhöhen etc. Bezüglich der chemischen Modifikation kann als Beispiel eine Phosphorsäurebindung in der Oligonukleotidstruktur, Ribose, Nukleinsäure-Base, Saccharidstelle, 3'- und/oder 5'-Endigung(en) etc. genannt werden.
Bezüglich einer Modifikation der Phosphorsäurebindung, kann ein Austausch von ein oder mehreren Bindungen zu einer von Phosphodiesterbindung (D-Oligo), Phosphorthioatbindung, Phosphordithioatbindung (S-Oligo), Methylphosphatbindung (MP-Oligo), Phosphoramidatbindung, Nicht-Phosphorsäurebindung und Methylphosphonothioatbindung oder zu einer Kombination davon zweckmäßig sein. Bezüglich einer Modifikation von Ribose kann ein Austausch zu 2'-Fluororibose, zu 2'-O-Methylribose etc. angezeigt sein. Bezüglich einer Modifikation einer Nukleinsäure-Base kann ein Austausch zu 5-Propynyluracil, zu 2-Aminoadenin etc. angezeigt sein.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die im obigen <6> genannte RNA, die wie folgt definiert ist:
"Eine RNA, die eine partielle Basensequenz in der Basensequenz der RNA enthält, welche Basensequenz komplementär zur Basensequenz der SEQ ID NR. 26 ist, oder eine RNA, in der ein Teil der RNA chemisch modifiziert ist, wobei die RNA oder die chemisch modifizierte RNA dadurch gekennzeichnet ist, dass sie an eine RNA hybridisiert, die für das Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 codiert".
Hierin bedeutet "partielle Basensequenz" eine partielle Basensequenz, die eine beliebige Anzahl von Basen an irgendeiner Stelle umfasst.
Die oben genannte RNA ist auch als ein Antisense-Pharmazeutikum nützlich. Dabei hybridisiert die RNA an die RNA oder die DNA, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 codiert, wobei die Transkription der DNA zu mRNA oder die Translation der mRNA zu Protein gehemmt werden kann.
Bei einer Aufgabe der Verwendung der obigen RNA als einem Antisense-Pharmazeutikum kann als Beispiel eine partielle Basensequenz von 5 bis 100 aufeinander folgenden Basen, vorzugsweise eine partielle Basensequenz von 5 bis 70 aufeinander folgenden Basen, bevorzugter eine partielle Basensequenz von 5 bis 50 aufeinander folgenden Basen, und noch bevorzugter eine partielle Basensequenz von 5 bis 30 aufeinander folgenden Basen als der partiellen Basensequenz genannt werden.
Wird die RNA als einem Antisense-Pharmazeutikum verwendet, so ist es möglich, einen Teil der Basensequenz der RNA einer chemischen Modifikation zu unterziehen, um ihre Halbwertszeit in Blut zu erhöhen, wenn die RNA in den Körper eines Patienten verabreicht wird, die Permeabilität der intrazellulären Membran zu erhöhen, den Widerstand gegen Zersetzung in oder die Absorption durch die Verdauungsorgane im Falle einer oralen Verabreichung etc. zu erhöhen. Bezüglich der chemischen Modifikation kann jene, die an der oben genannten Antisense-DNA vorgenommen wird, als Beispiel aufgeführt werden.
Der "Antikörper" der vorliegenden Erfindung ist ein polyklonaler Antikörper (Antiserum) oder ein monoklonaler Antikörper, und vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper.
Um genauer zu sein, handelt es sich um einen Antikörper, der mit dem Protein der vorliegenden Erfindung oder einem Teil davon reaktiv ist.
Der "Antikörper" der vorliegenden Erfindung deckt einen Antikörper eines natürlichen Typs ab, der durch Immunisieren eines nicht-humanen Säugers, wie einer Maus, Ratte, Hamster, Meerschweinchen, Huhn, Kaninchen, Ziege, Schaf, etc. mittels einer herkömmlichen Methode unter Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung oder eines Teils davon (einschließlich natürlicher Substanzen, rekombinanter und chemisch synthetisierter Substanzen) oder der Zellen, in denen das Protein exprimiert wird (unabhängig von natürlicher Zelle, Transformantenzelle, normaler Zeller, Tumorzelle, etc.) als Immunogen (Antigen) erhalten wird; einen rekombinanten Chimären monoklonalen Antikörper und rekombinanten humanisierten monoklonalen Antikörper (CDR-grafted Antikörper), der durch eine genetische Rekombinationstechnik erhalten werden kann; und einen humanen Antikörper, der unter Verwendung transgener Tiere, die zur Produktion humaner Antikörper fähig sind, etc. erhalten werden kann.
Im Falle eines monoklonalen Antikörpers ist ein monoklonalen Antikörper mit einem Isotyp wie IgG, IgM, IgA, IgD und IgE abgedeckt. Vorzugsweise handelt es sich um IgG oder IgM.
Der polyklonale Antikörper (Antiserum) und der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung können mittels der bereits bekannten allgemeinen Herstellungsmethoden erhalten werden.
So wird beispielsweise das oben genannte Immunogen (Antigen) einem Säuger, vorzugsweise einer Maus, Ratte, Hamster, Meerschweinchen, Kaninchen, Huhn, Katze, Hund, Schwein, Ziege, Pferd oder Rind, oder bevorzugter einer Maus, Ratte, Hamster, Meerschweinchen oder Kaninchen, sofern erforderlich zusammen mit einem Freund-Adjuvans, injiziert.
Der polyklonale Antikörper (Antiserum) kann aus dem Serum, das vom immunologisch sensibilisierten Tier erhalten wird, isoliert werden.
Der monoklonale Antikörper kann in einer Weise hergestellt werden, bei der ein Hybridom aus der Antikörper-produzierenden Zelle (Milz, Lymphknoten, Knochenmark oder Mandeln; vorzugsweise B-Zelle der Milz), erhalten aus dem immunologisch sensibilisierten Tier, mit einer Zelle vom Knochenmark-Typ (Myelomzelle), die keine Fähigkeit zur Autoantikörperproduktion aufweist, präpariert wird, das Hybridom kloniert wird und ein Klon, der einen monoklonalen Antikörper mit einer spezifischen Affinität für das Antigen produziert, das zur Immunisierung des Säugers verwendet wurde, mittels einer immunologischen Messmethode (wie etwa ELISA) ausgewählt wird.
Um genauer zu sein, kann der monoklonale Antikörper wie folgt hergestellt werden: Das Protein der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon (einschließlich natürlicher Substanzen, rekombinanter und chemisch synthetisierter Substanzen) oder eine Zelle, worin das Protein exprimiert wird (unabhängig davon, ob natürliche Zelle, Transformantenzelle, normale Zelle oder Tumorzelle), wird als ein Immunogen verwendet und das Immunogen ein oder mehrmals in Mäuse, Ratten, Hamster, Meerschweinchen, Hühner oder Kaninchen, oder vorzugsweise in Mäuse, Ratten oder Hamster (einschließlich eines transgenen Tiers, welches präpariert wird, um einen Antikörper zu produzieren, der von einem anderen Tier stammt, wie etwa bei transgenen Maus, die einen humanen Antikörper produziert) subkutan, intramuskulär, intravenös in die Fußballen oder intraperitoneal injiziert oder transplantiert, woraufhin eine immunologische Sensibilisierung, sofern erforderlich zusammen mit einem Freund-Adjuvans vorgenommen wird. Gewöhnlich werden ein bis vier Immunisierungen alle 1 bis 14 Tage nach der Anfangsimmunisierung vorgenommen, wobei die Antikörper-produzierenden Zellen von dem Tier, welches immunologisch sensibilisiert wurde, etwa 1 bis 5 Tage nach der Anfangsimmunisierung gewonnen werden können.
Die Herstellung eines Hybridoms, das einen monoklonalen Antikörper sekretiert, kann entsprechend der modifizierten Methode von Köhler und Milstein (Nature, Band 256, S. 495–497, 1975) oder mittels einer dieser ähnlichen Methode vorgenommen werden.
So kann es durch eine Zellfusion von Antikörper-produzierenden Zellen, die in Milz, Lymphknoten, Knochenmark oder Mandeln enthalten sind, oder vorzugsweise in Milz, die aus immunologisch sensibilisierten Tieren wie oben erhalten wurde, mit Myelomzellen erhalten werden, die keine Fähigkeit zur Autoantikörperproduktion aufweisen und von Tieren stammen, wie vorzugsweise Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Hamstern, Kaninchen oder Menschen, oder bevorzugter Mäusen, Ratten oder Menschen.
Bezüglich der für die Zellfusion verwendeten Myelomzellen ist beispielsweise die Verwendung des von Mäusen abgeleiteten Myeloms P3/C63-AG8.653 (653; ATCC Nr. CRL 1580), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), PA1, F0 oder BW5147; von Ratten abgeleiteten Myeloms 210RCY3-Ag.2.3; und vom Menschen abgeleiteten Myeloms U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 oder CEM-T15 möglich.
Das Screening der Hybridomklone, die den monoklonalen Antikörper produzieren, wird durch Inkubieren des Hybridoms in beispielsweise einer Mikrotiterplatte und durch Messen der Reaktivität der inkubierten Überstandsflüssigkeit der Vertiefung, in der das Wachstum festgestellt wird, gegenüber dem bei obiger immunologischer Sensibilisierung von Mäusen verwendeten immunisierten Antigen mittels eines Enzymimmunoassays wie RIA oder ELISA vorgenommen.
Die Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers aus einem Hybridom kann entweder in vitro oder in vivo in der peritonealen Flüssigkeitsansammlung von Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Hamstern oder Kaninchen, vorzugsweise Mäusen oder Ratten, oder noch bevorzugter Mäusen, gefolgt von der Isolierung aus der resultierenden inkubierten Überstandsflüssigkeit oder der peritonealen Flüssigkeitsansammlung des Säugers, erfolgen.
Wird eine Inkubation in vitro durchgeführt, so kann dies in einer Weise erfolgen, bei der das Hybridom vermehrt, haltbar gemacht und gelagert wird in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen wie den Charakteristika der zu inkubierenden Zellspezies, der Aufgabe der Teststudie, der Inkubationsmethode etc., wobei bekannte Nährmedien, die für die Produktion von monoklonalem Antikörper im Überstand der Kulturflüssigkeit eingesetzt werden, oder jede Art von Nährmedium, das in einem bekannten Basalmedium induziert und präpariert wird, Verwendung finden.
Bezüglich des Basalmediums kann ein Low-Calcium-Medium wie Ham F12-Medium, MCDB153-Medium oder Low-Calcium-MEM-Medium; ein High-Calcium-Medium wie MCDB104-Medium, MEM-Medium, D-MEM-Medium, RPMI 1640-Medium, ASF104-Medium oder RD-Medium etc. als Beispiel genannt werden. In Abhängigkeit von der Aufgabe kann das Basalmedium Serum, Hormon, Zytokin und/oder verschiedene anorganische oder organische Substanzen enthalten.
Die Isolierung und Reinigung des monoklonalen Antikörpers kann zum Beispiel durch Unterziehen der oben genannten inkubierten Überstandsflüssigkeit oder peritonealen Flüssigkeitsansammlung einer gesättigten Ammoniumsulfat-Euglobulin-Präzipitationsmethode, Capronsäuremethode, Caprylsäuremethode, Ionenaustauschchromatographie (DEAE, DE52, etc.), Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Antiimmunglobulin-Säule, Protein-A-Säule, etc. und ähnlichem vorgenommen werden.
Es ist auch möglich, das für den monoklonalen Antikörper codierende Gen aus einem Hybridom, transgenen Kuh, Ziege, Schaf oder Schwein, zu klonieren, wobei das Antikörper-codierende Gen in ein intrinsisches Gen mittels einer Technik zur Präparierung eines transgenen Tiers integriert wird und wobei aus der Milch des transgenen Tiers der vom Antikörper-Gen abgeleitete monoklonale Antikörper in großer Menge erhalten wird (Nikkei Science, Ausgabe April 1997, S. 78–84).
Der "rekombinante chimäre monoklonale Antikörper" der vorliegenden Erfindung ist ein monoklonalen Antikörper, der durch eine gentechnische Methode hergestellt wird, und genauer gesagt meint dies einen Chimären monoklonalen Antikörper, wie etwa einen Maus/Mensch-chimären monoklonalen Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, dass zum Beispiel seine variable Region eine solche ist, die von Maus-Immunglobulin abgeleitet ist, wohingegen seine konstante Region eine solche ist, die von Human-Immunglobulin abgeleitet ist.
Die von Human-Immunglobulin abgeleitete konstante Region weist ihre eigene Aminosäuresequenz in Abhängigkeit von den Isotypen von IgG, IgM, IgA, IgD und IgE auf, wobei die konstante Region des rekombinanten chimären monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung eine konstante Region eines Human-Immunglobulins sein kann, das zu irgendeinem der Isotypen zählt. Vorzugsweise ist dies eine konstante Region von humanem IgG.
Der chimäre monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel wie folgt hergestellt werden. Es versteht sich jedoch von selbst, dass die Herstellung nicht auf nur diese Methode beschränkt ist.
Zum Beispiel kann der Maus/Mensch-chimäre monoklonale Antikörper unter Bezugnahme auf Jikken Igaku (Spezialausgabe), Band 16, Nr. 10, 1988 und japanische Patentveröffentlichung Nr. 73280/1991 hergestellt werden.
Dabei wird das C_H-Gen (C-Gen, das für die konstante Region der H-Kette codiert), das von einer DNA erhalten wird, die für Human-Immunglobulin codiert, in einer exprimierbaren Weise stromabwärts des aktiven V_H-Gens (neu angeordnetes VDJ-Gen, das für die variable Region der H-Kette codiert) angeordnet, das aus DNA erhalten ist, die für einen monoklonalen Maus-Antikörper codiert, der aus einem Hybridom isoliert ist, welches den monoklonalen Maus-Antikörper produziert, oder das C_L-Gen (C-Gen, das für die konstante Region der L-Kette codiert), das aus einer DNA erhalten wird, die für Human-Immunglobulin codiert, wird in einer exprimierbaren Weise stromabwärts des aktiven V_L-Gens angeordnet (neu angeordnetes VJ-Gen, das für die variable Region der L-Kette codiert), das aus einer DNA erhalten wird, die für einen monoklonalen Maus-Antikörper codiert, der aus dem Hybridom isoliert ist, wobei es in ein oder mehrere Expressionsvektoren inseriert wird, die Wirtszelle durch den Expressionsvektor transformiert wird und die transformierte Zelle zum Erhalt der angestrebten Zelle inkubiert wird.
Spezifischer gesagt wird DNA aus einem monoklonalen Maus-Antikörperproduzierenden Hybridom mittels einer herkömmlichen Methode extrahiert und die DNA durch ein geeignetes Restriktionsenzym (z.B. EcoRI, Hind III, etc.) verdaut, ei ner Elektrophorese (unter Verwendung zum Beispiel von 0,7 % Agarosegel) und einem Southern Blot unterzogen. Die Gelmigration wird beispielsweise durch Ethidiumbromid angefärbt und fotografiert, die Position des Markers markiert und das Gel zweimal mit Wasser gewaschen und in eine 0,25 M HCL-Lösung für 15 Minuten eingetaucht. Dann wird es in eine 0,4 N NaOH-Lösung für 10 Minuten getaucht und während dieses Zeitraums sanft geschüttelt. Es wird auf ein Filter mittels einer herkömmlichen Methode übertragen und das Filter nach 4 Stunden entnommen und mit 2 × SSC zweimal gewaschen. Nachdem das Filter gut abgetrocknet ist, wird es einer Wärmebehandlung unterzogen (75°C für 3 Stunden). Nach Beendigung der Wärmebehandlung wird das Filter in eine 0,1 × SSC/0,1 % SDS-Lösung platziert und bei 65°C für 30 Minuten behandelt. Dann wird er in eine 3 × SSC/0,1 % SDS-Lösung getaucht. Der resultierende Filter wird in einen Vinylbeutel, zusammen mit einer Vorhybridisierlösung, eingebracht und bei 65°C für 3–4 Stunden behandelt.
Daraufhin wird eine Sonden-DNA, die mit ³²P markiert ist, und eine Hybridisierlösung darein eingebracht und bei 65°C für etwa 12 Stunden umgesetzt. Nach Beendigung der Hybridisation wird das Filter bei einer geeigneten Salzkonzentration, Reaktionstemperatur und Zeitdauer gewaschen (z.B. 2 × SSC – 0,1 % SDS-Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten). Das Filter wird in einen Vinylbeutel eingebracht und dem eine geringe Menge von 2 × SSC zugesetzt, dann der Beutel dicht versiegelt und einer Autoradiographie unterzogen.
Neu angeordnetes VDJ-Gen und VJ-Gen, die für die H-Kette bzw. L-Kette des monoklonalen Maus-Antikörpers codieren, werden durch das zuvor erwähnte Southern Blotting identifiziert. Die Region, die die identifizierten DNA-Fragmente enthält, wird durch eine Sucrose-Dichtegradienten-Zentrifugation fraktioniert, in einen Phagenvektor (wie z.B. Charon 4A, Charon 28, λEMBL3, λEMBL4, etc.) integriert, und Escherichia coli (wie LE392, NM539, etc.) wird durch den Phagenvektor transformiert, um eine Genombank zu erzeugen. Die Genombank wird einer Plaquehybridisation unter Verwendung einer geeigneten Sonde (H-Kette J-Gen, L-Kette (κ), J-Gen, etc.) gemäß beispielsweise der Benton-Davis-Methode unterzogen (Science, Band 196, S. 180–182, 1977), um einen positiven Klon herzustellen, der jedes neu angeordnete VDJ-Gen und VJ-Gen enthält. Eine Restriktionsenzymkarte des resultierenden Klons wird erstellt und die Basensequenz bestimmt, woraufhin bestätigt wird, dass ein Gen, das das angestrebte neu angeordnete V_H (VDI)-Gen oder V_L (VI)-Gen enthält, erhalten wurde.
Inzwischen wird humanes C_H-Gen und humanes C_L-Gen jeweils zur Erzeugung von Chimären separat isoliert. Bei der Erzeugung eines chimären Antikörpers mit humanem IgG1 beispielsweise werden Cγ₁-Gen, welches ein C_H-Gen ist, und C_κ-Gen, welches ein C_L-Gen ist, isoliert. Unter Ausnutzung der hohen Homologie der Basensequenz von Maus-Immunglobulin-Gen zu Human-Immunglobulin-Gen können diese Gene durch Isolieren aus einer Humangenombank unter Verwendung von Maus-Cγ₁-Gen und Maus-C_κ-Gen entsprechend dem humanem Cγ₁-Gen und humanem C_κ-Gen als Sonden erhalten werden.
Genauer gesagt wird ein DNA-Fragment, das humanes C_κ-Gen enthält und eine Enhancer-Region umfasst, aus der Human-Lambda-Charon 4A-HaeIII-AluI-Genombank (Cell, Band 15, S. 1157–1174, 1978) unter Verwendung des HindIII-BamHI-Fragments von 8 kb aus Klon Ig 146 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 75, S. 4709–4713, 1978) und des EcoRI-Fragments von 6,8 kb aus Klon MEP 10 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 78, S. 474–478, 1981) als Sonden isoliert. Außerdem wird beispielsweise humane fötale Leberzell-DNA mittels HindIII gespalten und mittels Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, eine Bande von 5,9 kb in λ788 inseriert und die oben genannte Sonde verwendet, wodurch humanes Cγ-Gen isoliert wird.
Unter Verwendung des Maus-V_H-Gens und des Maus-V_L-Gens, und ebenso des humanen C_H-Gens und des humanen C_L-Gens, wie als solche isoliert, wird das humane C_H-Gen stromabwärts des Maus-V_H-Gens oder das humane C_L-Gen stromabwärts des Maus-V_L-Gens in einen Expressionsvektors wie pSV2gpt oder pSV2neo unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms und DNA-Ligase gemäß einer herkömmlichen Methode integriert, wobei die Promotorregion und die Enhancerregion etc. berücksichtigt werden. Zu diesem Zeitpunkt können chimäre Gene von Maus-V_H-Gen/Human-C_H-Gen und Maus-V_L-Gen/Human-C_L-Gen in einem Expressionsvektor gleichzeitig angeordnet werden oder können jeweils in einem separaten Expressionsvektor angeordnet werden.
Der Expressionsvektor, in den derart präpariertes chimäres Gen eingebaut wird, wird in eine Knochenmarkszelle, die aus sich selbst heraus keinen Antikörper produziert, wie etwa P3X63.Ag8.653-Zelle oder SP210-Zelle, mittels einer Protoplasten-Fusionsmethode, einer DEAE-Dextranmethode, einer Calciumphosphatmethode oder einer Elektroporationsmethode eingeführt. Die transformierte Zelle wird durch Inkubation in einem Medium ausgewählt, das ein pharmazeutisches Agens entsprechend dem pharmazeutischen Resistenzgen enthält, das in den Expressionsvektor eingeführt ist, woraufhin die angestrebte Chimäre monoklonalen Antikörperproduzierende Zelle erhalten wird.
Ein gewünschter chimären monoklonalen Antikörper wird aus der Überstandsflüssigkeit der inkubierten Antikörper-produzierenden Zelle, die als solche dafür ausgewählt ist, erhalten.
Der "humanisierte Antikörper (CDR-grafted Antikörper)" der vorliegenden Erfindung ist ein monoklonalen Antikörper, welcher durch eine gentechnische Methode hergestellt ist, und meint genauer gesagt einen humanisierten monoklonalen Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Teil oder die gesamte Komplementaritätsbestimmende Region seiner hypervariablen Region eine Komplementaritätsbestimmende Region der von monoklonalem Maus-Antikörper abgeleiteten hypervariablen Region ist, dass eine Frame-Region seiner variablen Region eine Frame-Region der von Human-Immunglobulin abgeleiteten variablen Region ist, und dass seine konstante Region eine von Human-Immunglobulin abgeleitete konstante Region ist.
Hierin bedeutet Komplementaritäts-bestimmende Region der hypervariablen Region drei Regionen (Komplementaritäts-bestimmende Reste CDR1, CDR2 und CDR3), die in der hypervariablen Region der variablen Region im Antikörper vorhanden sind und die jene Stellen sind, die direkt an das komplementär binden, wohingegen eine Frame-Region der variablen Region die relativ konservierten vier Regionen meint (Frameworks: FR1, FR2, FR3 und FR4), die dazwischen und dabei vor und nach den drei Komplementaritäts-bestimmenden Regionen liegen.
In anderen Worten meinen alle Regionen, die eine andere als ein Teil oder die Gesamtheit der Komplementaritäts-bestimmenden Region der hypervariablen Region von monoklonalem Maus-Antikörper sind, einen monoklonalen Antikörper, der für die entsprechende Region des Human-Immunglobulins substituiert ist.
Eine konstante Region, die von Human-Immunglobulin abgeleitet ist, weist jeweils eine spezifische Aminosäuresequenz für den Isotyp IgG, IgM, IgA, IgD und IgE auf, wobei die konstante Region des humanisierten monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung eine konstante Region von Human-Immunglobulin sein kann, das zu einem dieser Isotypen zählt. Vorzugsweise ist dies eine konstante Region von humanem IgG. Es besteht keine Beschränkung hinsichtlich der Frame-Region der variablen Region, die von Human-Immunglobulin abgeleitet ist.
Der humanisierte monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel wie folgt hergestellt werden, obschon es selbstverständlich ist, dass dies nicht nur auf diese eine Herstellungsmethode beschränkt ist.
Zum Beispiel kann ein humanisierter rekombinanter monoklonaler Antikörper, der von einem monoklonalen Maus-Antikörper abgeleitet ist, mittels einer gentechnischen Methode unter Bezugnahme auf JP-W-4-506458 und offengelegtes japanisches Patent Nr. 296890/1987 hergestellt werden.
Dabei werden mindestens ein Maus-H-Ketten-CDR-Gen und mindestens ein Maus-L-Ketten-CDR-Gen entsprechend dem Maus-H-Ketten-CDR-Gen aus einem Hybridom isoliert, welches einen monoklonalen Maus-Antikörper produziert, während vom Human-Immunglobulin-Gen ein humanes H-Ketten-Gen, das für ganze Regionen mit Ausnahme der humanen H-Ketten-CDR entsprechend dem obigen Maus-H-Ketten-CDR codiert, und ein humanes L-Ketten-Gen, das für alle Regionen mit Ausnahme des humanen L-Ketten-CDR entsprechend dem obigen Maus-L-Ketten-CDR codiert, isoliert werden.
Das Maus-H-Ketten-CDR-Gen und das humane H-Ketten-Gen, die als solches isoliert wurden, werden in einen geeigneten Expressionsvektor in einer exprimierbaren Weise eingeführt, während in ähnlicher Weise das Maus-L-Ketten-CDR-Gen und das humane L-Ketten-Gen in einen anderen geeigneten Expressionsvektor in einer exprimierbaren Weise eingeführt werden. Alternativ ist es auch möglich, dass das Maus-H-Ketten-CDR-Gen/humane H-Ketten-Gen und das Maus-L-Ketten-CDR-Gen/humane L-Ketten-Gen in denselben Expressionsvektor in einer exprimierbaren Weise eingeführt werden. Wird eine Wirtszelle durch den in dieser Weise präparierten Expressionsvektor transformiert, so wird eine transformierte Zelle, die zum Produzieren eines humanisierten monoklonalen Antikörpers fähig ist, erhalten, und wird die transformierte Zelle dann inkubiert, so wird der angestrebte humanisierte monoklonale Antikörper aus der inkubierten Überstandsflüssigkeit erhalten.
Der "Human-Antikörper" der vorliegenden Erfindung ist ein Immunglobulin, das von dem Gen abgeleitet ist, in dem alle Regionen einschließlich der variablen Region der H-Kette und der konstanten Region der H-Kette und der variablen Region der L-Kette und der konstanten Region der L-Kette, die das Immunglobulin ausmachen, für das Human-Immunglobulin codieren.
Der Human-Antikörper kann in derselben Weise wie bei der oben genannten Methode zur Herstellung des polyklonalen Antikörpers oder monoklonalen Antikörpers mittels einer herkömmlichen Methode hergestellt werden, wobei ein transgenes Tier, das durch Einbau mindestens eines Human-Immunglobulin-Gens in einen Locus eines Säugers mit Ausnahme des Menschen, wie etwa einer Maus, präpariert wird, einer immunologischen Sensibilisierung mit Antigen unterzogen wird.
Zum Beispiel kann eine transgene Maus, die einen Human-Antikörper produziert, mittels einer in Nature Genetics, Band 15, S. 146–156, 1997; Nature Genetics, Band 7, S. 13–21, 1994; JP-W-50465; internationales offengelegtes Patent Nr. WO 94/25585; Nikkei Science, Ausgabe vom Juni, S. 40–50, 1995; Nature, Band 368, S. 856–859, 1994; und JP-W-5-500233 Methode präpariert werden, wie beschrieben.
"Ein Teil des Antikörpers" meint bei der vorliegenden Erfindung einen Teil der Region des oben genannten Antikörpers oder vorzugsweise des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung, und ist genauer gesagt, F(ab')₂, Fab', Fab, Fv (variables Fragment des Antikörpers), sFv, dsFv (Disulfid-stabilisiertes Fv) oder dAb (Einzeldomänen-Antikörper) (Exp. Opin. Ther. Patents, Band 6, Nr. 5, S. 441–456, 1996).
Hierin sind "F(ab')₂" und "Fab" die Antikörper-Fragmente, die durch Behandlung von Immunglobulin (monoklonalen Antikörper) mit einer Protease wie Pepsin oder Papain hergestellt und durch Verdau vor und nach der Disulfid-Bindung, die zwischen den beiden H-Ketten in der Gelenkregion vorliegt, produziert wird. Wird IgG beispielsweise mit Papain behandelt, so wird es stromaufwärts der Disulfid-Bindung gespalten, die zwischen den beiden H-Ketten in der Gelenkregion vorliegt, um zwei homologe Antikörper-Fragmente herzustellen, wobei die L-Kette, die aus V_L (L-Ketten-variable Region) und C_L (L-Ketten-konstante Region) besteht, und ein H-Ketten-Fragment, das aus V_H (H-Ketten-variable Region) und CHγ1 (γ1-Region in der H-Ketten-konstanten Region) besteht, durch eine Disulfid-Bindung an der C-terminalen Region gebunden sind. Jedes dieser beiden homologen Antikörper-Fragmente wird als Fab' bezeichnet.
Wird IgG mit Pepsin behandelt, so wird es stromabwärts der Disulfid-Bindung gespalten, die zwischen den beiden H-Ketten in der Gelenkregion vorliegt, um ein Antikörper-Fragment herzustellen, in welchem die beiden obigen Fab' in der Gelenkregion gebunden sind und die Größe etwas mehr als bei obigem beträgt. Dieses Antikörper-Fragment wird als F(ab')₂ bezeichnet.
Die "monoklonalen Antikörper-produzierende Zelle" der vorliegenden Erfindung meint jegliche Zelle, die den oben genannten monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung produziert. Genauer gesagt handelt es sich um eine Zelle, wie in jedem der folgenden (1) bis (3) bezeichnet.

(1) Die monoklonalen Antikörper-produzierende B-Zelle, die von einem nicht-humanen Säuger abgeleitet ist, welche das Protein der vorliegenden Erfindung wie oben erläutert produziert, d.h. das Protein der vorliegenden Erfindung, das durch Immunisieren eines nicht-humanen Säugers durch einen Teil davon oder durch Zellen etc. erhalten wird, die das Protein oder den monoklonalen Antikörper mit einem Reaktionsvermögen mit einem Teil davon exprimieren.
(2) Das oben genannte Hybridom (fusionierte Zelle), die durch Unterziehen der Antikörperproduzierenden B-Zelle, die als solche erhalten wird, einer Zellfusion mit einer Myelomzelle, die von einem Säuger stammt, erhalten wird.
(3) Die monoklonalen Antikörper-produzierende transformierte Zelle (genetisch rekombinierte Zelle), die durch Transformation einer Zelle mit Ausnahme der monoklonalen Antikörper-produzierenden B-Zelle oder des monoklonalen Antikörperproduzierenden Hybridoms mit einem Gen (einem beliebigen Gen, das für die schwere Kette codiert, und einem Gen, das für die leichte Kette codiert, oder beidem), das für den monoklonalen Antikörper codiert, der aus der monoklonalen Antikörperproduzierenden B-Zelle oder dem monoklonalen Antikörper-produzierenden Hybridom isoliert ist, erhalten wird.

Hierin meint die monoklonalen Antikörper-produzierende transformierte Zelle (genetisch rekombinierte Zelle), wie in obigem (3) genannt, die genetisch rekombinierte Zelle, die eine genetische Rekombinante des monoklonalen Antikörpers produziert, der durch die obige B-Zelle (1) oder das obige Hybridom (2) produziert wird. Diese rekombinierte monoklonalen Antikörper-produzierende Zelle kann mittels derselben Methode hergestellt werden, wie für die Herstellung des oben genannten chimären monoklonalen Antikörpers und humanisierten Antikörpers verwendet.
Die "pharmazeutische Zusammensetzung" der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, bestehend beispielsweise aus einem beliebigen der folgenden (a) bis (c) mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger:

(a) Dem oben definierten Antikörper (vorzugsweise monoklonaler Antikörper; der nicht auf einen aus der Natur stammenden Antikörper oder einen rekombinierten Antikörper beschränkt ist) oder einem Teil des Antikörpers.
(b) DNA-Fragment, das als Antisense-Pharmazeutikum, z.B. der folgenden DNA nützlich ist: "Eine DNA, die eine partielle Basensequenz der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 oder NR. 3 enthält, oder vorzugsweise die partielle Basensequenz mit 14 oder mehr Basen, oder eine DNA, worin ein Teil der DNA chemisch modifiziert ist; oder eine DNA, die eine Basensequenz komplementär zur partiellen Basensequenz oder DNA, worin ein Teil der DNA chemisch modifiziert ist, enthält "
(c) RNA-Fragment, das als ein Antisense-Pharmazeutikum nützlich ist, wie etwa die folgende RNA: "Eine RNA, die eine partielle Basensequenz der Basensequenz einer RNA mit einer Basensequenz, die komplementär zur Basensequenz der SEQ ID NR. 26 oder NR. 27 ist, enthält, oder eine RNA, worin ein Teil der RNA chemisch modifiziert ist, oder eine RNA, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die RNA oder die chemisch modifizierte RNA an eine RNA hybridisiert ist, die für das Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 codiert".

Hierin ist ein "pharmazeutisch akzeptabler Träger" zum Beispiel ein Exzipient, Verdünnungsmittel, Füllmittel, Zerfallmittel, Stabilisator, Konservierungsmittel, Puffer, Emulgator, Aromastoff, Farbstoff, Süßstoff, Verdickungsmittel, Korrigens, Löslichmacher und weitere Zusatzstoffe. Ein oder mehrere dieser Träger werden verwendet, wodurch eine pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten, Pillen, verdünnten Pulvern, Körnchen, Injektionslösungen, Flüssigkeiten, Kapseln, Pastillen, Elixieren, Suspensionen, Emulsionen, Sirupen, etc. hergestellt werden kann.
Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann entweder oral oder parenteral verabreicht werden. Zu weiteren Formen für die parenterale Verabreichung zählen Flüssigagenzien für den externen Gebrauch, Suppositorien für die enterische Verabreichung und Pessare, die ein oder mehrere aktive Substanzen enthalten und gemäß einer herkömmlichen Methode formuliert sind.
Die Dosis kann in Abhängigkeit von Alter, Geschlecht, Körpergewicht und Symptom des Patienten, therapeutischer Wirkung, Verabreichungsmethode, Behandlungsdauer, Typ des aktiven Inhaltsstoffs (das oben genannte Protein oder Antikörper), der in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist etc. variieren, liegt aber üblicherweise innerhalb eines Bereichs von 10 μg bis 1.000 mg (oder von 10 μg bis 500 mg) für die Verabreichung an einen Erwachsenen. Allerdings variiert die Dosis in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen, weshalb in einigen Fällen eine geringere Menge als oben genannt ausreichend oder eine größere Menge als im obigen Bereich genannt manchmal erforderlich sein kann.
Insbesondere im Falle eines Injektionspräparats wird dieses beispielsweise durch Lösen oder Suspendieren des Inhaltsstoffs in einem nicht-toxischen pharmazeutisch akzeptablen Träger, z.B. einer physiologischen Kochsalzlösung oder handelsüblichem destillierten Wasser, zur Injektion zubereitet, um die Konzentration auf 0,1 μg Antikörper/ml Träger bis 10 mg Antikörper/ml Träger einzustellen.
Das als solches hergestellte Injektionspräparat kann einem zu behandelnden menschlichen Patienten ein- bis mehrmals täglich in einer Dosis von 1 μg bis 100 mg, oder vorzugsweise von 50 μg bis 50 mg pro kg Körpergewicht bei jeder Verabreichung verabreicht werden. Beispiele für die Dosierungsform sind medizinisch geeignete Dosierungsformen, wie z.B. die intravenöse Injektion, subkutane Injektion, intrakutane Injektion, intramuskuläre Injektion und intraperitoneale Injektion. Eine intravenöse Injektion ist bevorzugt.
In einigen Fällen kann ein Injektionspräparat als eine Suspension oder Emulsion unter Verwendung eines nicht-wässrigen Verdünnungsmittels (zum Beispiel Propylenglykol, Polyethylenglykol, Speiseöl wie Olivenöl, Alkohol wie Ethanol etc.) zubereitet werden.
Die Aseptisschmachung solch eines Injektionspräparats kann mittels einer Filtersterilisation durch Passieren durch ein Bakterien-rückhaltendes Filter, Compoundieren von Bakterizid oder Bestrahlung vorgenommen werden. Das Injektionspräparat kann in einer vor der Anwendung zu rekonstituierenden Form hergestellt werden. Dabei wird eine aseptische feststoffliche Zusammensetzung mittels Gefriertrocknung oder ähnlichem hergestellt und kann durch Lösen in aseptischem destilliertem Wasser für die Injektion oder einem anderen Lösungsmittel vor der Anwendung verwendet werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist zur Hemmung der biologischen Aktivität des Aminosäure-Transportermoleküls der vorliegenden Erfindung oder der Expression des Moleküls und zur Hemmung des Einbaus der Aminosäure, welche ein essentieller Nährstoff für das Bestehen oder die Vermehrung von Tumorzellen ist, in Zellen fähig und kann zur Therapie von Krebs verwendet werden.
Die "transgene Maus" der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Maus, bei der DNA (cDNA oder genomische DNA), die für das vom Menschen abgeleitete Protein codiert, und im Protein der vorliegenden Erfindung enthalten ist, in einen intrinsischen Locus der Maus integriert und das Protein der vorliegenden Erfindung in deren Körper exprimiert wird.
Genauer gesagt handelt es sich um eine transgene Maus, wie in obigem <52> oder <53> genannt und in den folgenden (1) oder (2) gezeigt.

(1) In einer transgenen Maus mit einem extrinsischen Gen ist die transgene Maus dadurch gekennzeichnet, dass in der Maus eine DNA, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 codiert, auf ihrem intrinsischen Gen eingebaut ist, wodurch das Protein exprimierende Zellen im Körper vorhanden sind.
(2) Die transgene Maus gemäß dem obigen (1), worin die DNA eine DNA ist, die eine Basensequenz enthält, bestehend aus der Basensequenz der Basen 66 bis 1586 der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 und jeder der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch TAG, TGA und TAA, angrenzend an die 1586. Base.

Die transgene Maus kann mittels einer üblichen Methode präpariert werden, die häufig zur Erzeugung von transgenen Tieren angewandt wird (siehe z.B. Newest Manual for Animal Cell Tests, veröffentlicht von LIC, Kapitel 7, S. 361–408, 1990).
Genauer gesagt wird eine embryonale Stammzelle (ES-Zelle), die aus der Blastozyste einer normalen Maus erhalten wird, durch einen Expressionsvektor transformiert, in den Markergen (wie etwa Neomycin-Resistenzgen) und ein Gen, das für das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 der vorliegenden Erfindung codiert, in einer exprimierbaren Weise inseriert sind. Die ES-Zelle, in die das für das Protein codierende Gen auf dem intrinsischen Gen integriert ist, wird mittels einer herkömmlichen Methode in Abhängigkeit von der Tatsache ausgewählt, ob das Markergen exprimiert wird. Dann wird die ES-Zelle, die als solche ausgewählt wurde, in ein fertilisiertes Ei (Blastozyste) mikroinjiziert, das von einer anderen normalen Maus erhalten wurde (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 77, Nr. 12, S. 7380–7384, 1980; US-Patent Nr. 4.873.191). Die Blastozyste wird als Leihmutter-Ei verwendet und in den Uterus einer anderen normalen Maus transplantiert. Auf diese Weise wird die Founder-Maus (Mauskind) von der Leihmutter-Maus geboren. Die Gründermaus wird mit einer normalen Maus gekreuzt, um eine heterogene transgene Maus zu erhalten. Die heterogenen transgenen Mäuse werden gekreuzt, um eine homogene transgene Maus entsprechend den Mendelschen Gesetzen zu erhalten.
Es ist auch möglich, eine sogenannte "Knockout-Maus" ausgehend von der Basensequenz der DNA (genauer gesagt genomischen DNA), die für das Protein codiert, das von der in die vorliegende Erfindung einbezogenen Maus abgeleitet ist, das heißt eine DNA (genauer gesagt genomische DNA), die für ein Maus-Homologon eines vom Menschen abgeleiteten Aminosäuretransporters mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 codiert, zu präparieren.
Bei der Knockout-Maus handelt es sich um eine Maus, bei der das intrinsische Gen, das für das homologe Maus-Protein codiert, angeknockt (inaktiviert) ist, was zum Beispiel mittels einer Positiv-Negativ-Selektionsmethode unter Anwendung einer homologen Rekombination erzeugt werden kann (US-Patente Nrn. 5.464.764, 5.487.992 und 5.627.059; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 86, S. 8932–8935, 1989; Nature, Band 342, S. 435–438, 1989; etc,). Diese Knockout-Maus stellt ebenfalls eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Die "markierte DNA" der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die mit Enzym, fluoreszierender Substenz, chemilumineszierender Substanz, Biotin, Avidin oder Radioisotop (wie etwa ³H, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹³¹I, etc.), wie zur Markierung von "markiertem monoklonalem Antikörper" verwendet, was später beschrieben wird, markiert ist.
Zum Beispiel kann eine radiomarkierte DNA, die mit einem Radioisotop markiert ist, als ein Reagenz bei verschiedenen Testmethoden wie dem Southern Blotting, zur Identifikation eines Gens, das für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet werden (Jikken Igaku, Ergänzungsausgabe, "Handbook of Genetic Engineering, veröffentlicht von Yodosha, S. 133–140, 1992).
Außerdem kann eine markierte DNA, die mit einer radioaktiven Substanz oder einer nicht-radioaktiven Substanz wie Biotin markiert ist, als ein Reagenz bei einer in situ-Hybridisation zur Analyse der Position von genomischer DNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, auf Chromosomen verwendet werden (z.B. FISH (fluorescence in situ hybridization), Jikken Igaku, Ergänzungsausgabe, "Handbook of Genetic Engineering", veröffentlicht von Yodosha, 1992, S. 272–277).
Die "radiomarkierte RNA" der vorliegenden Erfindung ist eine RNA, wobei die RNA der vorliegenden Erfindung mit einem Radioisotop wie ³H,¹³C,¹²⁵I, ¹³¹I etc. markiert ist.
Die radiomarkierte RNA ist als ein Reagenz für die Analyse des exprimierten Stadiums der mRNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in Zellen, Geweben oder Organen nützlich, wie etwa bei einem Northern Blotting (Jikken Igaku, Ergänzungsausgabe, "Handbook of Genetic Engineering", veröffentlicht von Yodosha, S. 133–140, 1992).
Die "markierte Substanz, die aus sich selbst heraus oder durch Reaktion mit einer anderen Substanz ein nachweisbares Signal erzeugen kann" zur Markierung von "markiertem monoklonalem Antikörper" der vorliegenden Erfindung meint eine Substanz, die bei einem Schritt verwendet wird, bei dem sie mit dem oben definierten monoklonalen Antikörper durch eine physiochemische Bindung etc. gebunden wird, so dass das Vorhandensein des monoklonalen Antikörpers nachgewiesen werden kann.
Genauer gesagt ist dies Enzym, fluoreszierende Substanz, chemilumineszierende Substanz, Biotin, Avidin, Radioisotop oder ähnliches.
Um noch genauer zu sein, stellen Beispiele dafür Enzym, wie etwa Peroxidase (z.B. Meerrettichperoxidase), alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucose-6-Phosphatdehydrogenase, alkoholische Dehydrogenase, Apfelsäure-Dehydrogenase, Penicillinase, Katalase, Apoglucoseoxidase, Urease, Luciferase und Acetylcholinesterase; fluoreszierende Substanzen wie Fluoresceinisothiocyanat, Phycobiliprotein, Seltenerdmetallchelat, Dansylchlorid und Tetramethylrhodaminisothiocyanat; Radioisoptope wie ³H, ¹⁴C, ¹²³I und ¹³¹I; Biotin; Avidin; und chemilumineszierende Substanzen dar.
Hierbei ist jedes von einem Radioisotop und einer fluoreszierenden Substanz einzeln zur Abgabe eines nachweisbaren Signals fähig. Dagegen ist jedes von Enzym, chemilumineszierender Substanz, Biotin und Avidin einzeln zur Abgabe eines nachweisbaren Signals unfähig; vielmehr wird ein nachweisbares Signal bei Reaktion mit ein oder mehreren weiteren Substanzen erhalten. Zum Beispiel ist im Falle von Enzym mindestens ein Substrat erforderlich, wobei in Abhängigkeit von dem Messverfahren der enzymatischen Aktivität (z.B. kolorimetrische Methode, Fluoreszenzmethode, Biolumineszenzmethode, Chemilumineszenzmethode, etc.) verschiedene Substrate verwendet werden. Zum Beispiel wird im Falle von Peroxidase Wasserstoffperoxid als ein Substrat verwendet. Im Falle von Biotin ist es üblich, eine Reaktion unter Verwendung zumindest von Avidin oder einem Enzym-modifizierten Avidin (wie etwa Streptavidin-β-Galactosidase) als einem Substrat vorzunehmen, obschon dies keine Beschränkung darstellt. Sofern erforderlich, können verschiedene Färbesubstanzen in Abhängigkeit vom Substrat verwendet werden. Wird beispielsweise Streptavidin-β- Galactosidase als ein Substrat für Biotin verwendet, so ist die Verwendung von 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactosidase als einer Färbesubstanz möglich.
Der "markierte monoklonale Antikörper" der vorliegenden Erfindung und die oben genannte "markierte DNA" meinen einen monoklonalen Antikörper bzw. eine DNA, die mit verschiedenen Markierungssubstanzen markiert sind, wie oben erwähnt.
Der markierte monoklonale Antikörper kann zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung des oben genannten Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Genauer gesagt kann er zum Nachweis der Expression oder zur Messung der exprimierten Menge des Proteins der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Lebendkörperproben wie Zellen (ob nun normale Zellen, abnormale Zellen wie Tumorzellen, die von einem Lebendkörper stammen, der an einer Erkrankung leidet, natürliche Zellen und genetisch rekombinierte Zellen), Geweben (unabhängig von der Quelle, d.h. von einem gesunden Organismus oder einem Organismus, der an einer Erkrankung leidet) oder Organen (unabhängig von der Quelle, d.h. von einem gesunden Organismus oder einem Organismus, der an einer Erkrankung leidet) verwendet werden. Eine derartige Messung kann gemäß einer herkömmlichen Methode unter Anwendung einer üblicherweise angewendeten immunohistologischen Technik vorgenommen werden (Jikken Igaku, Ergänzungsausgabe, "Handbook of Cell Engineering", Yodosha, S. 207–213, 1992).
Weiterhin kann der markierte monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung nicht nur für den oben genannten immunhistologischen Test verwendet werden, sondern auch für eine Western Blotting-Methode, bei der lösliches Membranprotein aus der Zelle, Gewebe, Organ oder einem Teil davon als einer mittels einer herkömmlichen Methode zu testenden Probe präpariert wird und das lösliche Membranprotein mit dem markierten monoklonalen Antikörper zur Reaktion gebracht wird, wodurch das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Proteins der vorliegenden Erfindung im löslichen Membranprotein bestätigt werden kann (Jikken Igaku, Ergänzungsausgabe, "Handbook of Cell Engineering", Yodosha, S.201–206, 1992).
Bei der oben genannten immunhistologischen Messung kann jeglicher markierte monoklonale Antikörper, der mit einer der oben genannten Markierungssubstanzen markiert ist, verwendet werden, doch ist unter Berücksichtigung einer hohen Nachweisempfindlichkeit oder quantitativen Empfindlichkeit und der Bequemlichkeit des Prozesses die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers bevorzugt, der mit einem Enzym wie Peroxidase oder mit Biotin markiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für den Nachweis oder für die quantitative Bestimmung des Proteins der vorliegenden Erfindung mittels einer immunhistologischen Technik unter Verwendung des oben genannten markierten monoklonalen Antikörpers. Genauer gesagt ist dies ein Verfahren, wie oben erläutert, das beispielsweise die folgenden Schritte (1) und (2) umfasst.

(1) Einen Schritt, bei dem die Probe mit dem markierten monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung kontaktiert wird; und
(2) einen Schritt, bei dem die Menge des markierten monoklonalen Antikörpers, die an die Probe gebunden ist, durch Nachweis der Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Radioaktivität in Abhängigkeit von der Art von Markierungssubstanz, die an den markierten monoklonalen Antikörper gebunden ist, gemessen wird.

Hierin deckt "Zelle" eine Primärkulturzelle ab, die von einem menschlichen Organismus erhalten wurde, eine Zelllinie, die zu einer subkultivierbaren und genetisch rekombinierten Zelle (transformierten Zelle) gemacht wurde, wozu ein genetischer Vorgang erfolgt, und welche vorzugsweise eine Primärkulturzelle ist. Die Zelle deckt weiterhin normale Zellen und abnormale Zellen ab, die aus dem Organismus eines Patienten erhalten wurden, der an einer Erkrankung leidet. Beispiele der abnormalen Zellen sind verschiedene Tumorzellen. Der Begriff "Gewebe" meint jegliches Gewebe, das aus dem Organismus eines gesunden Tiers oder eines Patienten, der an einer Erkrankung leidet, stammt, wobei Beispiele der Gewebe, die aus dem Organismus des Patienten stammen, Tumorgewebe sind. Der Ausdruck "Organ oder ein Teil davon" meint jegliches Organ, das aus dem Organismus eines gesunden Tiers oder eines Patienten, der an einer Erkrankung leidet, stammt, oder einen Teil davon.
Beispiele der Organe, die von einem Patienten stammen, sind Tumor-tragende Organe.
Genauer gesagt kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung beispielsweise die folgenden Schritte umfassen, obschon dies keine Beschränkung darstellt.
(Schritt 1) Ein Schritt, bei dem normale Zellen, normale Gewebe oder normale Organe, die zum Beispiel von einer gesunden Person stammen und die bei einem chirurgischen Eingriff ausgeschnitten und weggeworfen wurden, oder ein Teil davon, oder Tumorzellen, Tumorgewebe oder Tumor-tragende Organe, die von einem Patienten stammen, der an Krebs leidet, oder ein Teil davon (das Organ oder der Teil davon kann, sofern erforderlich, zum Erhalt eines Stücks in Scheiben geschnitten werden) mit Paraformaldehyd oder ähnlichem zur Präparierung einer fixierten Probe fixiert wird;
(Schritt 2) ein Schritt, bei dem der markierte monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung, der mit Biotin oder einem Enzym wie Peroxidase markiert ist, der fixierten Probe zur Vornahme einer Antigen-Antikörper-Reaktion zugegeben wird;
(Schritt 3) ein Schritt, bei dem die fixierte Probe gewaschen wird, sofern erforderlich, und dann Substrat in Abhängigkeit vom Typ des verwendeten Enzyms oder Avidins oder Enzym-modifizierten Avidins wie Streptavidin-β-Galactosidase zugegeben wird, woraufhin die markierte Substanz am markierten Antikörper mit dem Substrat, Avidin oder Enzym-modizifizierten Avidin umgesetzt wird (bezüglich des Substrats ist die Zugabe von Wasserstoffperoxid zusammen mit Diaminobenzidin, 4-Chlor-1-naphthol oder Aminoethylcarbazol im Falle der Verwendung eines markierten Antikörpers, der mit einem Enzym wie Peroxidase wie in Schritt 2 markiert ist; Avidin oder Enzym-modifiziertem Avidin, wenn ein markierter Antikörper, der mit Biotin markiert ist, in Schritt 2 verwendet wird, möglich);
(Schritt 4) ein Schritt, bei dem im Falle der Verwendung in Schritt 3 eines Enzym-modifizierten Avidins ein Substrat in Abhängigkeit vom Typ des für die Modifikation verwendeten Enzyms (wie etwa 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactosidase) zugesetzt wird, woraufhin das Substrat mit dem an das Avidin gebundenen Enzym umgesetzt wird;
(Schritt 5) ein Schritt, bei dem die fixierte Probe gewaschen wird, sofern erforderlich, so dass eine enzymatische Reaktion und eine Färbereaktion gestoppt werden; und
(Schritt 6) ein Schritt, bei dem die fixierte Probe unter dem Mikroskop beobachtet wird, um die Farbintensität, Fluoreszenzintensität oder Lumineszenzintensität zu messen.
Da das Aminosäure-Transporterprotein der vorliegenden Erfindung eine spezifische Expression in einem breiten Bereich von Tumorzellen im Vergleich zur Expression in normalen Zellen zeigt, ist es möglich zu beurteilen, ob die zu testende Zelle oder Gewebe normal oder abnormal ist, wie etwa eine Tumorzelle, wenn die Expression des Proteins in verschiedenen Zellen oder Geweben des Organismus unter Anwendung der oben genannten immunhistologischen Methode nachgewiesen wird.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in der Identifikation einer Substanz, die die Fähigkeit zum Hemmen der biologischen Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung aufweist. Spezifischer gesagt stellt dies eine Methode dar, wie sie beispielsweise schon zuvor erwähnt worden ist.
"Ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz mit einer unterdrückenden Wirkung auf die Fähigkeit zum Vermitteln des Einbaus einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Histidin (His), Tryptophan (Trp) und Valin (Val) in Zellen, wobei die Fähigkeit eine biologische Funktion des Proteins mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder NR. 4 ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Schritte der folgenden (1) und (2) umfasst:

(1) Ein Schritt, bei dem jegliche der in den folgenden (a) bis (d) genannten Zellen in gleichzeitiget Anwesenheit der Substanz und einer radiomarkierten Aminosäure, wobei eine der Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Histidin (His), Tryptophan (Trp) und Valin (Val) mit einem Radioisotop markiert wird, oder lediglich in Gegenwart der radiomarkierten Aminosäure inkubiert werden: (a) eine natürlich vorkommende Zelle, in der ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder NR. 4 und ein Protein mit einer Aminosäuresequenz des SEQ ID NR. 6 coexprimiert werden; (b) eine rekombinante Zelle, in der ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 und ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 oder NR. 8 durch eine Cotransformation unter Verwendung einer DNA, die eine Basensequenz der Translationsregion in der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 oder NR. 3 enthält, coexprimiert werden; (c) eine nicht-human-abgeleitete rekombinante Zelle, in der ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 und ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 durch die gleichzeitige Einführung einer RNA, die eine Basensequenz von Basen 1 bis 1521 der Basensequenz der SEQ ID NR. 26 und eine Basensequenz, umfassend jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch UAG, UGA oder UAA, angrenzend an die 1521. Base, und einer RNA, die eine Basensequenz von Basen 1 bis 1587 der Basensequenz der SEQ ID NR. 27 und eine Basensequenz, umfassend jede der Nonsense-Basensequenzen, dargestellt durch UAG, UGA oder UAA, angrenzend an die 1587. Base, enthält, coexprimiert werden; oder (d) eine Tumorzelle, die von einem Menschen stammt; und
(2) ein Schritt, bei dem die Radioaktivität der Zelle, die in gleichzeitiger Anwesenheit der Substanz und der radiomarkierten Aminosäure inkubiert wird, und die Radioaktivität der Zelle, die in Gegenwart lediglich der radiomarkierten Aminosäure inkubiert wird, gemessen und der Unterschied zwischen ihnen verglichen wird.

Folglich ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein dadurch gekennzeichnetes Verfahren, dass die Eigenschaft einer Zelle, in der das Aminosäure-Transporterprotein der vorliegenden Erfindung (mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2) und das vom Menschen abgeleiteten Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2hc (mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6) coexprimiert werden, die Fähigkeit zum Einbau mindestens einer Aminosäure aus Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Histidin (His), Tryptophan (Trp) und Valin (Val) umfasst.
Daher kann die hemmende Aktivität der Testsubstanz gemessen werden, indem ein Vergleich der Menge an markierter Aminosäure, die durch die Zelle bei einer Inkubation der Zelle in Gegenwart einer der oben genannten Aminosäuren, die mit einem Radioisotop (³H,¹⁴C,¹²⁵I oder ¹³¹I, etc.) markiert ist, und der Testsubstanz eingebaut ist, und der Menge an markierter Aminosäure, die durch die Zelle bei der Inkubation der Zelle in Gegenwart lediglich der markierten Aminosäure, die keine Testsubstanz enthält, eingebaut ist, vorgenommen werden.
Bezüglich der Zelle kann jegliche Zelle verwendet werden, sofern es sich um eine Zelle handelt, die die beiden Proteinmoleküle coexprimiert. Zum Beispiel kann jegliches von natürlicher Zellen, die im obigen (a) genannt ist, von transformierter Zelle (genetisch rekombinierter Zelle), die durch die beiden DNAs transformiert ist, die für jedes der beiden Proteinmoleküle codieren, wie in (b) erwähnt, der Zelle, in die RNA, die für jedes der beiden Proteinmoleküle codiert, wie in (c) genannt, eingeführt ist, und der Tumorzelle, die vom Menschen stammt, wie in (d) erwähnt, verwendet werden.
Bezüglich der Wirtszelle, die zur Herstellung der transformierten Zelle verwendet wird, können verschiedene Zellen, die in der Passage erwähnt sind, in der ein Verfahren für die Expression des Proteins der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der DNA der vorliegenden Erfindung ausführlich erläutert ist, verwendet werden.
Zum Beispiel können verschiedene Zellen, wie etwa natürliche Zellen oder künstlich hergestellte rekombinante Zellen, wie sie häufig im Fachgebiet der vorliegenden Erfindung verwendet werden (z.B. Bakterien (z.B. solche, die zur Gattung Escherichia und zur Gattung Bacillus gehören), Hefe (Gattung Saccharomyces, Pichia, etc.), Tierzellen oder Insektenzellen) als Beispiele genannt werden.
Bevorzugt sind Escherichia coli und Tierzellen, und spezifischer können E. coli (DH5α, TB1, HB101, etc.), Zellen die von der Maus stammen (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH3T3, etc.), Zellen die von der Ratte stammen (PC12, PC12h, etc.), Zellen, die vom Hamster stammen (BHK, CHO, etc.), Zellen die vom Affen stammen (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo, etc.) und Zellen, die vom Menschen stammen (HeLa, Zellen, die vom diploiden Fibroblasten abgeleitet sind, HEK293-Zellen, Myelomzellen, Namalwa, etc.), als Beispiele genannt werden.
Bezüglich der Zelle, in die die RNA infundiert wird, können Eizellen von Xenopus laevis als Beispiel genannt werden (Spezialausgabe von Jikken Igaku, "Experimental Methods for Biosginals", Band 11, Nr. 3, S. 30–38, 1993).
Bezüglich der vom Menschen stammenden Tumorzelle kann jegliche Tumorzelle verwendet werden, obschon die Verwendung einer Tumorzelle bevorzugt ist, bei der das Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 und das Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 6 als coexprimiert bestätigt sind.
Hierin meint "Substanz" eine natürliche Substanz, die in der Natur vorkommt, und jegliche Substanz, die künstlich hergestellt ist. Die Substanz lässt sich grob in "Peptid-Substanz" und "Nicht-Peptids-Sbstanz" klassifizieren.
Bezüglich der "Peptid-Substanz" ist der oben umfassend bezeichnete Antikörper der vorliegenden Erfindung (vorzugsweise monoklonaler Antikörper, und besonders bevorzugt rekombinanter humanisierter monoklonaler Antikörper oder humaner monoklonaler Antikörper), Oligopeptid und chemisch modifizierte Substanz von jedem davon zu nennen. Bezüglich des Oligopeptids kann ein Peptid, das 5 bis 30 Aminosäuren, oder vorzugsweise 5 bis 20 Aminosäuren umfasst, als Beispiel genannt wer den. Die chemische Modifikation kann in Abhängigkeit von verschiedenen Zielen gestaltet werden, wie etwa eine Erhöhung der Halbwertszeit im Blut bei Verabreichung an einen Organismus, eine Erhöhung des Widerstands gegenüber Zersetzung oder Absorption in ein Verdauungsorgan bei oraler Verabreichung, etc.
Bezüglich der "Nicht-Peptid-Substanz" kann "eine DNA, die eine partielle Basensequenz enthält, oder eine chemische modifizierte DNA, die durch deren chemische Modifikation hergestellt ist", die als ein Antisense-Pharmazeutikum nützlich ist und in der Definition der Erfindung unter oben genanntem <4> umfassend bezeichnet ist, "eine RNA, die eine partielle Basensequenz enthält, oder eine chemisch modifizierte RNA, die durch deren chemische Modifikation hergestellt ist", die als ein Antisense-Pharmazeutikum nützlich ist und in der Definition der Erfindung unter oben genanntem <6> umfassend bezeichnet ist, und jegliche chemisch synthetisierte "Verbindung" als Beispiel angeführt werden. Hierin kann bezüglich der "Verbindung" eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 1000, vorzugsweise von etwa 100 bis etwa 800, oder bevorzugter von etwa 100 bis etwa 600 außer DNA, RNA und der oben genannten Peptid-Substanz als Beispiel genannt werden.
Bezüglich der Substanz, die mittels des Verfahrens für die Identifizierung der vorliegenden Erfindung identifiziert werden kann, ist eine Substanz mit der Fähigkeit zum Hemmen der Vermehrung jeglicher Tumorzellen, die in irgendwelchen Geweben des menschlichen Körpers entstehen, wünschenswert. Beispiele der Gewebe sind Gehirn, Nacken, Leber, Milz, Niere, Dickdarm, Dünndarm, Zwölffingerdarm, Prostatadrüse, Lunge, Magen, Herz, Haut, Knochenmark, Gebärmutter, Eierstöcke, Hoden, Mund, Zunge, Knochen und Brust.
Noch ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Identifizierung einer Substanz mit der Fähigkeit zum Hemmen der Transkription des Gens, das für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, zu mRNA oder der Expression des Proteins der vorliegenden Erfindung. Spezifischer gesagt ist dies das folgende Verfahren, das bereits beschrieben wurde.
"Ein Verfahren für die Identifizierung einer Substanz mit der Fähigkeit zum Hemmen der Transkription des Gens, das für das Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder NR. 4 codiert, zu mRNA oder der Expression des Proteins mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder 4, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

(1) Einen Schritt, bei dem eine Zelle, die eine durch die DNA der folgenden (a), (b) und (c) cotransformierte Zelle ist, wobei die Zelle in einer Weise transformiert wird, dass in Abhängigkeit von der Expression des Proteins mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2, das durch die DNA von (a) codiert ist, ein Reporterprotein, das durch die DNA von (c) codiert ist, gleichzeitig exprimiert wird, in Anwesenheit oder Abwesenheit der Substanz inkubiert wird: (a) DNA, enthaltend eine Basensequenz der Translationsregion der Basensequenz der SEQ ID NR. 1 oder NR. 3; (b) DNA, enthaltend eine Basensequenz der Translationsregion der Basensequenz der SEQ ID NR. 5 oder NR. 7; (c) DNA, die für ein Reporterprotein codiert; und
(2) einen Schritt, bei dem die exprimierten Mengen an Reporterprotein in jeder der Zellen, die in Gegenwart der Substanz inkubiert werden, und jener, die in Abwesenheit der Substanz inkubiert werden, gemessen und verglichen werden".

Bei dem Verfahren handelt es sich um den sogenannten "Reportergen-Assay", und um genauer zu sein, um ein Verfahren, bei dem DNA, die für das Aminosäure-Transportermolekül der vorliegenden Erfindung codiert, DNA, die für die Expressionsregulations-kontrollierende Region der DNA codiert, und DNA, die für das Fluoreszenz-erzeugende Reporterprotein codiert (Luciferase, abgeleitet von Feuerfliege, Umishiitake [eine Art von Meerespflanze], etc.; GFP (grünes Fluoreszenzprotein), abgeleitet von der Qualle; etc.), in solcher Weise inseriert werden, dass das Reporterprotein-Molekül in Abhängigkeit von der Expression des Transportermoleküls ex primiert werden kann, eine Zelle, die herkömmlicherweise für die Herstellung genetisch rekombinierten Proteins verwendet wird, durch den wie oben präparierten Expressionsvektor transformiert wird, das Resultat mit der Testverbindung kontaktiert und die Menge an Transportermolekül, die in Abhängigkeit von der Wirkung der Verbindung exprimiert ist, durch Messung der Menge an Fluoreszenz indirekt gemessen wird, die durch das Reporterprotein, welches zusammen mit der Expression des Moleküls exprimiert wird, erzeugt wird, woraufhin analysiert wird, ob die Verbindung die Expression des Transportermoleküls beeinflusst (US-Patente Nrn. 5.436.128 und 5.401.629 können zum Beispiel als Referenzen genannt werden).
Übrigens kann die Identifizierung der Verbindung unter Anwendung des vorliegenden Assay mittels eines manuellen Vorgangs schnell und einfach unter Anwendung des sogenannten Hochdurchsatz-Screenings vorgenommen werden kann, bei dem der Assay automatisch unter Verwendung einer Maschine (Roboter) durchgeführt wird (Soshiki Baiyo Kogaku, Band 23, Nr. 13, S. 521–524; US-Patent Nr. 5.670.113).
Die Begriffe "Zelle" und "Substanz", wie beim oben genannten Verfahren verwendet, entsprechen den bereits definierten Begriffen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen ausführlicher veranschaulicht werden, obschon die vorliegende Erfindung selbstverständlich nicht auf die in diesen Beispielen genannten Ausführungsformen alleine beschränkt ist.
Übrigens wurde bei den folgenden Beispielen jeder Vorgang gemäß der Methode vorgenommen, die genannt ist in Molecluar Cloning (von Sambrook, J., Fritsh, E.F. und Maniatis, T.; veröffentlicht von Cold Spring Harbor Press im Jahr 1989), sofern nicht anders erwähnt, bzw. wurde bei Verwendung eines handelsüblichen Reagenz oder Kits es gemäß den zugehörigen Gebrauchsanleitungen verwendet.
Beispiel 1. Isolierung von cDNA aus humanem Zellmembran-Oberflächenmolekül 4F2hc und Präparierung der cRNA.
(1) Präparierung des cDNA-Fragments, das für Ratten-4F2hc codiert, mittels einer RT-PCR.
Entsprechend der herkömmlichen Methode wurde reine poly(A)⁺RNA aus Rattenleber erhalten. 5'-Primer (SEQ ID NR. 9) und 3'-Primen (SEQ ID NR. 10) wurden ebenfalls basierend auf einer cDNA-Sequenz (Biochem. J., Band 312, S. 863, 1995), die für Ratten-4F2hc codiert, synthetisiert.
Eine RT-PCR (reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion; Jikken Igaku, Ergänzungsausgabe, "PCR and Its Applications", Band 8, Nr. 9, 1990; und "Gene Amplification PCR-Its Basis and New Developments" veröffentlicht von Kyoritsu Shuppan, 1992) wurde unter Verwendung der beiden Primer und von Taq-Polymerase (hergestellt von Takara) durchgeführt, wobei die poly(A)⁺RNA als eine Matrize verwendet wurde. Die Reaktion wurde entsprechend dem Protokoll, das der Polymerase beigelegt ist, unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler (hergestellt von Perkin Elmer Cetus) durchgeführt.
Die amplifizierte cDNA wurde einer Agaroseelektrophorese unterzogen und unter Verwendung eines DNA-Extraktions-Kits (hergestellt von Qiagen) zum Erhalt eines Fragments des Ratten-4F2hc-Gens (von Basen 34 bis 479 der Basensequenz der SEQ ID NR. 7) gereinigt.
Übrigens ist die cDNA-Sequenz, die für das Ratten-4F2hc codiert, und die entsprechende Aminosäuresequenz in SEQ ID NR. 7 bzw. NR. 8 dargestellt.
(2) Herstellung der cDNA, die für humanes 4F2hc codiert, und Präparierung der cRNA.
Ein Kit für die Synthese von cDNA (Handelname: Superscript Choice System; hergestellt von Gibco) wurde verwendet, und gemäß der dem Kit beigefügten Versuchs durchführungsmethode wurde humane cDNA aus poly(A)RNA (hergestellt von Clontech), die aus menschlicher Plazenta stammte, präpariert und die cDNA in die mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespaltene Stelle des Phagenvektors λZipLox (hergestellt von Gibco) unter Verwendung einer DNA-Ligase (hergestellt von Gibco) integriert, um eine humane cDNA-Bank anzulegen.
Das Genfragment des wie oben bei (1) präpariertem Ratten-4F2hc wurde mit ³²P-dCTP zur Herstellung einer Sonde markiert, welche Sonde für eine Plaquehybridisierung verwendet wurde.
Die oben erstellte humane cDNA-Bank wurde unter Verwendung der Sonde wie folgt gescreent.
Die cDNA-Bank wurde auf einer Agarplatte ausgesät, und ein Replikon wurde unter Verwendung einer handelsüblichen Filtermembran hergestellt. Die Hybridisation wurde bei 37°C für eine Nacht in einer Hybridisierlösung unter Verwendung der Replikon und der radioaktiven Sonde durchgeführt. Bezüglich der Lösung für die Hybridisation wurde ein Puffer auf pH 6,5, enthaltend 5 × SSC, 3 × Denhard-Lösung, 0,2 % SDS, 10 % Dextransulfat, 50 % Formamid, 0,01 % Antifoam B (ein Antischaummittel, hergestellt von Sigma), 0,2 mg/ml Lachssperma-modifizierte DNA, 2,5 mM Natriumpyrophosphat und 25 mM MES, verwendet. Die Filtermembran wurde mit 0,1 × SSC/0,1 % SDS bei 37°C gewaschen.
Der durch die Hybridisation ausgewählte positive Klon wurde mittels eines einzigen Plaque isoliert, einer in vivo-Exzision unterzogen, mit Plasmid pZL1 (hergestellt von Gibco) rekombiniert und als Plasmid-DNA rückgewonnen. Die Plasmid-DNA wurde in pBlueScriptII SK(–) subkloniert (hergestellt von Stratagene).
Um die Basensequenz der cDNA des humanen 4F2hc, die im resultierenden Klon enthalten ist, zu bestimmen, wurden sieben Arten von Primern synthetisiert (SEQ ID NR. 11 bis SEQ ID NR. 17). Die Basensequenz der cDNA wurde mittels einer Diterminator-Zyklussequenzierungsmethode (von Applied Biosystems) unter Verwendung der sieben Arten von synthetischen Primern und T7-Primern und SP6-Primern, wel ches die handelsüblichen universellen Primer waren (hergestellt von Stratagene), bestimmt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die klonierte cDNA die des Gens des humanen 4F2hc war.
Übrigens waren die cDNA-Sequenz, die für das humane 4F2hc codiert, und die entsprechende Aminosäuresequenz die der SEQ ID NR. 5 bzw. SEQ ID NR. 6.
Aus dem Plasmid, das die wie oben hergestellte cDNA des humanen 4F2hc enthielt, wurde cRNA (eine zu cDNA komplementäre RNA; SEQ ID NR. 27) gemäß einer herkömmlichen Methode unter Verwendung einer T7-RNA-Polymerase präpariert (hergestellt von Stratagene) (Spezialausgabe von Jikken Igaku, "Method of Experiments of Biosignals", Band 11, Nr. 3, S. 33–34, 1993).
Beispiel 2. Isolierung von cDNA aus humanem Aminosäuretransporter LAT1 und Präparierung der cRNA.
Humane cDNA wurde aus poly(A)⁺RNA (bezogen von Clontech), die von der humanen Teratokarzinom-Zelllinie PA-1 abgeleitet war, unter Verwendung eines Kit für die Synthese der cDNA (Handelsname: Superscript Choice System; hergestellt von Gibco) entsprechend einer dem Kit beigelegten Versuchsdurchführungsmethode präpariert und dann die cDNA in eine durch das Restriktionsenzym EcoRI gespaltene Stelle des Phagenvektor λZipLox (hergestellt von Gibco) unter Verwendung einer DNA-Ligase (hergestellt von Gibco) integriert, um eine humane cDNA-Bank anzulegen.
cDNA (DDBJ/EMBL/Genbank-Registriernr. AB015432; ein Segment entsprechend den Basen 1135 bis 1529 der SEQ ID NR. 3), die für einen Ratten-Aminosäuretransporter LAT1 codiert, wurde mittels des Restriktionsenzyms BamHI ausgeschnitten. Übrigens ist eine Aminosäuresequenz des Ratten-Aminosäuretransporters LAT1 in SEQ ID NR. 4 gezeigt.
Dieses DNA-Segment wurde mit ³²P-dCTP markiert, um eine Sonde herzustellen, welche Sonde für eine Plaquehybridisierung verwendet wurde.
Die oben erstellte humane cDNA-Bank wurde unter Verwendung der Sonde wie folgt gescreent.
Die cDNA-Bank wurde auf einer Agarplatte ausgesät und ein Replikon wurde unter Verwendung einer handelsüblichen Filtermembran präpariert. Die Hybridisation wurde für eine Nacht bei 37°C in einer Hybridisierlösung unter Verwendung des Replikon und der radioaktiven Sonde durchgeführt. Bezüglich der Lösung für die Hybridisation wurde ein Puffer auf pH 6,5, enthaltend 5 × SSC, 3 × Denhard-Lösung, 0,2 % SDS, 10 % Dextransulfat, 50 % Formamid, 0,01 % Antifoam B (ein Antischaummittel, hergestellt von Sigma), 0,2 mg/ml Lachssperma-modifizierte DNA, 2,5 mM Natriumpyrophosphat und 25 mM MES verwendet. Die Filtermembran wurde mit 0,1 × SSC/0,1 % SDS bei 37°C gewaschen.
Der mittels der Hybridisation ausgewählte positive Klon wurde mittels eines einzigen Plaque isoliert, einer in vivo-Exzision unterzogen, mit dem Plasmid pZL1 (hergestellt von Stratagene) rekombiniert und als eine Plasmid-DNA rückgewonnen. Die Plasmid-DNA wurde mittels des Restriktionsenzyms PstI ausgeschnitten, um drei cDNA-Fragmente mit den Größen 1,8 kb, 2,5 kb und 4,3 kb zu erhalten. Jedes der Fragmente von 1,8 kb und 2,5 kb wurde in pBlueScriptII SK(–) subkloniert (hergestellt von Stratagene). Das cDNA-Fragment von 4,3 kb wurde einer Selbstligation unterzogen.
Um die Basensequenz der cDNA des humanen Aminosäuretransporters LAT1, der in jedem der Plasmide mit den drei cDNA-Fragmenten enthalten war, zu bestimmen, wurde acht Arten von Primern synthetisiert (SEQ ID NR. 18 bis SEQ ID NR. 25). Die Basensequenz der cDNA wurde mittels einer Diterminator-Zyklussequenzierungsmethode (von Applied Biosystems) unter Verwendung der acht Arten von synthetischen Primern und M13-Forward Primer und M13R Reverse Primer, die die handelsüblichen universellen Primer waren (hergestellt von Stratagene), bestimmt.
Die resultierende Sequenz der Volllängen-cDNA, die für den humanen Aminosäuretransporter LAT1 codiert, und die entsprechende Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NR. 1 bzw. SEQ ID NR. 2 gezeigt.
Weiterhin wurde aus dem resultierenden Plasmid, das die cDNA von humanem 4F2hc, die für den humanen Aminosäuretransporter LAT1 codiert, die cRNA (SEQ ID NR. 26; eine RNA komplementär zu cDNA) unter Verwendung einer T3-RNA-Polymerase (hergestellt von Stratagene) präpariert.
Wurde eine Homologie der Aminosäuresequenzen für einen Ratten-Aminosäuretransporter LAT1 und für einen humanen Aminosäuretransporter LAT1 analysiert, so wies der humane LAT1 eine Aminosäure-Homologie von etwa 91 % zum Ratten-LAT1 auf. Das Ergebnis ist in 1 gezeigt.
Wurde die Aminosäuresequenz des humanen Aminosäuretransporters LAT1 mittels einer hydrophoben Plot-Analyse (Kyte-Doolittle-Hydropathieanalyse) analysiert, so wurde ausgewertet, dass der humane LAT1 ein Zellmembran-Oberflächenmolekül mit 12 Transmembrandomänen (Membran-durchspannenden Domänen) war. Das Ergebnis ist in 2 gezeigt.
Beispiel 3. Analyse der Expression der mRNA von humanem Aminosäuretransporter LAT1 in verschiedenen Geweben des Menschen.
Die cDNA, die für den humanen Aminosäuretransporter LAT1 codiert (cDNA-Fragment entsprechend den Basen 649 bis 1128 der SEQ ID NR.1) wurde mittels des Restriktionsenzyms Smal ausgeschnitten und mit ³²P-dCTP zum Erhalt einer Hybridisationssonde markiert. Ein Northern Blot wurde an verschiedenen menschlichen Geweben unter Verwendung der Sonde wie folgt vorgenommen.
Eine Nylon-Membran, auf die humane poly(A)⁺RNA aufgeblottet war (Handelsname: MTN Blot; hergestellt von Clontech) wurde einer Hybridisation unterzogen und unter Verwendung der ³²P-dCTP-markierten humanen LAT1-Sonde entsprechend dem Protokoll, das dem Kit beigefügt war, gewaschen. Das Ergebnis ist in 3 gezeigt.
Als ein Ergebnis wurde die Expression von mRNA des humanen LAT1 mit einer Größe von etwa 4,8 kb in Plazenta, Gehirn, Hoden, Knochenmark und Fötusleber festgestellt. Eine schwache Expression der mRNA wurde auch in peripheren Leukozyten festgestellt.
Beispiel 4. Analyse der biologischen Aktivität von humanem Aminosäuretransporter LAT 1.
(1) Analyse der Fähigkeit zum Vermitteln des Transports von Aminosäure in die Zelle.
Aus den bisherigen Studien bezüglich der Vermehrung von Tumorzellen ist vorhergesagt worden, dass die bekannte schwere Kette (4F2hc) eines Zellmembran-Oberflächenantigens, welches ein Heterodimer, bestehend aus der schweren Kette, die als ein Glykoprotein des Typs II klassifiziert ist, und der leichten Kette mit der Bezeichnung 4F2 (CD98) ist, eine wichtige Rolle in der Aktivierung eines Aminosäuretransporters spielen kann, der bisher nicht identifiziert worden ist (J. Immunol., Band 126, S. 1409–1414, 1981; J. Immunol., Band 129, S. 623–628, 1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 84, S. 6526–6530, 1987; Cancer Res., Band 46, S. 1478–1484, 1986; J. Biol. Chem., Band 267, S. 15285–18288, 1992; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 89, S. 5606–5610, 1992; Biochem. J., Band 324, S. 535–541, 1997; und J. Expt. Biol., Band 196, S. 123–137, 1994).
In Anbetracht des Obigen wurde die Frage, ob der Aminosäuretransporter LAT1 der vorliegenden Erfindung den Transport der Aminosäure in die Zellen vornimmt, mittels einer Methode analysiert, bei der die Zellen, in denen lediglich humaner LAT1 exprimiert wurde, und andere Zellen, in denen sowohl humaner LAT1 als auch humaner 4F2hc coexprimiert wurden, verwendet und die eingebauten Mengen an Leucin (neutrale Aminosäure) in jede Zelle gemessen wurden.
Übrigens basiert diese Testmethode auf einer Methode, bei der Eizellen von Xenopus laevis, die häufig bei Einbautests verschiedener Substanzen in Zellen eingesetzt werden, Verwendung finden (Spezialausgabe von Jikken Igaku, "Method of Experiments of Biosignals", Band 11, Nr. 3, S. 30–38, 1993).
Eine einzelne cRNA (25 ng), die für den humanen LAT1 codiert, der in obigem Beispiel hergestellt wurde, eine einzelne cRNA (25 ng) die für den humanen 4F2hc codiert, der in obigem Beispiel hergestellt wurde, oder die cRNA (17,5 ng), die für den humanen LAT1 codiert, zusammen mit der cRNA (7,5 ng), die für den humanen 4F2hc codiert, wurden in Eizellen von Xenopus laevis injiziert und für 2 oder 5 Tage inkubiert, woraufhin die lediglich den humanen LAT1 exprimierenden Eizellen, die lediglich den humanen 4F2hc exprimierenden Eizellen und die den humanen LAT1 und den humanen 4F2hc coexprimierenden Eizellen jeweils isoliert wurden.
Ein radiomarkiertes Leucin, das mit ¹⁴C radiomarkiert war, wurde als ein Substrat verwendet, und der Einbau des markierten Leucins in jede Eizelle wurde gemäß der Methode von Kanai, et al. (Kanai und Hediger, Nature, Band 360, S. 467–471, 1992) wie folgt durchgeführt.
Spezifisch wurde jede Eizelle für 30 Minuten in einer Cholinchlorid-Aufnahmelösung (bestehend aus 100 mM Cholinchlorid, 2 mM Kaliumchlorid, 1,8 mM Calciumchlorid, 1mM Magnesiumchlorid und 5 mM HEPES; pH 7,4), enthaltend ¹⁴C-markiertes Leucin (50 μM), inkubiert, woraufhin die Menge an ¹⁴C-markiertem Leucin, die in die Eizellen eingebaut war, durch Messen der Radioaktivität der Eizellen mittels eines Szintillationszählers bestimmt wurde. Übrigens wurde dasselbe Experiment als einer Kontrolle unter Verwendung der Eizellen durchgeführt, in die keine der obigen RNAs injiziert waren, sondern lediglich Wasser infundiert wurde. Das Ergebnis ist in 4 gezeigt.
Das Ergebnis war, dass in den Eizellen, in denen lediglich humaner LAT1 exprimiert war, der Einbau von Leucin selten feststellbar war, genauso wie im Falle der Eizellen, in die lediglich Wasser als einer Kontrolle injiziert war, wohingegen bei den Eizellen, in denen sowohl humaner LAT1 als auch humaner 4F2hc exprimiert war, ein hoher Einbau von Leucin festgestellt wurde. Das Ergebnis wurde auf die Tatsache zurückgeführt, dass humaner 4F2hc erforderlich ist, damit der humane Aminosäuretransporter LAT1 die Funktion der Vermittlung des Einbaus von Aminosäure erfüllt.
(2) Analyse der Salzabhängigkeit des Transports von Aminosäure in die Zellen.
Die Frage, ob eine Salzabhängigkeit des humanen Aminosäuretransporters LAT1 bei der Fähigkeit zum Vermitteln des Transports der Aminosäure in die Zellen eine Rolle spielt, wurde wie folgt analysiert. Spezifisch wurde die Analyse durch Beobachten der Veränderungen in der eingebauten Menge an Leucin in die Zellen durch Wechseln des Typs von Aufnahmelösung, welche die Eizellen im oben genannten Beispiel 4(1) inkubierte, vorgenommen.
Die Eizellen von Xenopus laevis, die den human LAT1 und den humanen 4F2hc, wie in Beispiel 4(1) hergestellt, coexprimieren, wurden für 30 Minuten in der oben genannten Cholinchlorid-Aufnahmelösung, enthaltend ¹⁴C-markiertes Leucin (50 μM), einer Natrium-Aufnahmelösung, enthaltend ¹⁴C-markiertes Leucin (50 μM) (100 mM Cholinchlorid in der obigen Cholin-Aufnahmelösung wurden gegen 100 mM Natriumchlorid ausgetauscht) oder einer Gluconsäure-Aufnahmelösung, enthaltend ¹⁴C-markiertes Leucin (50 μM) (100 mM Natriumchlorid in der obigen Natrium-Aufnahmelösung wurden gegen 100 mM Natriumgluconat ausgetauscht), inkubiert.
Die Menge des in die Eizellen eingebauten ¹⁴C-markierten Leucins wurde durch Messen der Radioaktivität der Eizellen mittels eines Szintillationszählers bestimmt. Das Ergebnis ist in 5 gezeigt.
Das Ergebnis zeigt, dass selbst dann, wenn Cholin außerhalb der Eizellen gegen Natrium ausgetauscht wurde oder dass selbst dann, wenn Chlorionen außerhalb der Eizellen gegen Gluconsäure-Ionen ausgetauscht wurden, dies den Einbau von Leucin in die Eizellen in keinster Weise beeinflusste. Daher wurde festgestellt, dass der humane Aminosäuretransporter LAT1 ein Transportermolekül war, das unabhängig von Natriumion und Chlorion agierte.
(3) Affinität des humanen Aminosäuretransporters LAT1 für das Substrat.
Um die Affinität des humanen Aminosäuretransporters LAT1 für das Substrat zu analysieren, wurde ein kinetischer Michaelis-Menten-Test (Dictionan of Biochemistry, zweite Auflage, S. 1307–1308, 4. Auflage, 1992) durchgeführt.
Dieser kinetische Test wurde durch Überprüfen der Veränderungen in der Einbaurate von Leucin in Abhängigkeit vom Konzentrationsunterschied an Leucin als einem Substrat durchgeführt.
Das Einbau-Experiment mit Leucin wurde gemäß der in obigem Beispiel 4(1) genannten Methode unter Verwendung von Eizellen von Xenopus laevis, in denen humaner LAT1 und humaner 4F2hc coexprimiert waren, durchgeführt. Das Ergebnis ist in 6 gezeigt.
Als Ergebnis betrug die Michaelis-Konstante (Km) etwa 21 μM.
(4) Analyse der Substratspezifität des humanen Aminosäuretransporters LAT1 (Nr. 1).
Die Substratspezifität des humanen Aminosäuretransporters LATZ (Typ des in die Zellen eingebauten Substrats, wie durch LAT1 vermittelt) wurde mittels eines kompetitiven Antagonismustests analysiert.
Spezifisch gesagt wurden Eizellen von Xenopus laevis, die den humanen LAT1 und den humanen 4F2hc coexprimieren, durch Messen der veränderten Einbaumengen an ¹⁴C-markiertem Leucin als einem Substrat in die Eizellen analysiert, wenn in Gegenwart einer Testsubstanz (verschiedene Aminosäuren, Pharmazeutika, physiologisch aktive Substanzen oder andere niedermolekulare synthetische Verbindungen) inkubiert. Nahm die eingebaute Menge an ¹⁴C-markiertem Leucin im Vergleich zur Kontrolle ab, bei der keine Testsubstanz zugesetzt war, so wurde festgestellt, dass die Testsubstanz in die Eizellen, vermittelt durch den humanen Aminosäuretransporter LAT1, eingebaut war.
Die Eizellen von Xenopus laevis, die den humanen LAT1 und den humanen 4F2hc, wie in Beispiel 4(1) präpariert, coexprimierten, wurden für 30 Minuten in einer Cholinchlorid-Aufnahmelösung, enthaltend ¹⁴C-markiertes Leucin (20 μM) und eine der folgenden Testsubstanzen (2 mM), inkubiert.
Übrigens wurde die Inkubation als einer Kontrolle in ähnlicher Weise in einer Cholin-Aufnahmelösung, enthaltend ¹⁴C-markiertes Leucin, jedoch keine der Testsubstanzen, durchgeführt.
[Testsubstanzen]

Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Cystein, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin, Histidin, Tryptophan, Valin, Asparagin, Glutamin, Apartinsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Prolin und BCH (2-Amino-2-Norbornan-Carboxylsäure).

Die Menge an in die Eizellen eingebautem ¹⁴C-markiertem Leucin wurde durch Messen der Radioaktivität der Eizellen mittels eines Szintillationszählers bestimmt. Das Ergebnis ist in 7 gezeigt.
Darüber hinaus wurde auch der Einbau der folgenden Testsubstanzen in Eizellen gemäß der oben genannten Methode unter Verwendung von ¹⁴C-markiertem Phenylalanin anstelle des ¹⁴C-markierten Leucins getestet. Als einer Kontrolle wurde die Inkubation in einer Cholin-Aufnahmelösung, enthaltend ¹⁴C-markiertes Phenylalanin, jedoch keine der Testsubstanzen, in ähnlicher Weise durchgeführt.
[Testsubstanzen]

L-DOPA (ein Therapeutikum für Parkinson-Krankheit) und Triiodothyronin (ein Schilddrüsenhormon).

Das Ergebnis ist in 8 und 9 gezeigt.
Als Ergebnis wurde in verschiedenen Aminosäuren, Pharmazeutika und physiologisch aktiven Substanzen eine cis-hemmende Wirkung für den Einbau von ¹⁴C-markiertem Leucin oder ¹⁴C-markiertem Phenylalanin in die Zellen (Eizellen) beobachtet. Insbesondere hemmten Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin, Histidin, Tryptophan und Valin den Einbau von ¹⁴C-markiertem Leucin, wie durch den humanen LAT1 vermittelt, stark, was in hohem Maße nahe legte, dass jede der Aminosäuren in die Eizellen transportiert wurde, wie durch den humanen LAT1 vermittelt. 2-Amino-2-Norbornan-Carboxylsäure (BCH), die als ein Hemmstoff für den Ein bau neutraler Aminosäuren bekannt ist, hemmte ebenfalls den Einbau von ¹⁴C-markiertem Leucin. Weiterhin wurde der Einbau von ¹⁴C-markiertem Phenylalanin in Eizellen durch das pharmazeutische Agens, wie etwa L-DOPA (ein Therapeutikum für Parkinson-Krankheit) und die physiologisch aktiven Substanzen, wie etwa Triiodothyronin (Schilddrüsenhormon), stark gehemmt. Wurden dagegen saure Aminosäuren (wie etwa Glutaminsäure und Aspartinsäure) oder basische Aminosäuren (wie etwa Lysin und Arginin) als den Testsubstanzen verwendet, so wurde der Einbau von ¹⁴C-markiertem Leucin, wie durch den humanen LAT1 vermittelt, in keinster Weise beeinflusst.
Dieses Ergebnis legt in hohem Maße nahe, dass der humane Aminosäuretransporter LAT1 den Transport verschiedener Aminosäuren (insbesondere neutraler oder nahezu neutraler Aminosäuren), verschiedener Pharmazeutika, verschiedener physiologisch aktiver Substanzen und weiterer niedermolekularer synthetischer Verbindungen in Zellen vermittelt.
(5) Analyse der Subtratspezifität des humanen Aminosäuretransporters LAT1 (Nr. 2).
Basierend auf dem Ergebnis aus Beispiel 4(4) wurde eine Analyse darüber vorgenommen, ob Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin, Histidin, Tryptophan und Valin, vermittelt durch den humanen LAT1, in Eizellen eingebaut wurden.
Der Test wurde in derselben Weise wie in Beispiel 2(1) unter Verwendung jeder der folgenden ¹⁴C-markierten Aminosäuren vorgenommen, die durch Markieren jeder der oben genannten Aminosäuren mit ¹⁴C hergestellt wurden, anstelle der Verwendung von ¹⁴C-markiertem Leucin als einem Substrat.
[¹⁴C-markierte Aminosäuren]

¹⁴C-markiertes Leucin, ¹⁴C-markiertes Isoleucin, ¹⁴C-markiertes Phenylalanin, ¹⁴C-markiertes Methionin, ¹⁴C-markiertes Tyrosin, ¹⁴C-markiertes Histidin, ¹⁴C-markiertes Tryptophan und ¹⁴C-markiertes Valin.

Zu Vergleichszwecken wurde derselbe Test unter Verwendung von ¹⁴C-markiertem Glycin, ¹⁴C-markiertem Serin, ¹⁴C-markiertem D-Leucin und ¹⁴C-markiertem D-Phenylalanin durchgeführt. Das Ergebnis ist in 10 gezeigt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, dass Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin, Histidin, Tryptophan und Valin signifikant in die Eizellen eingebaut wurden. Außerdem wurde auch bei D-Leucin und D-Phenylalanin der Einbau in die Eizellen nachgewiesen.
Beispiel 5. Analyse der Expression von mRNA des humanen Aminosäuretransporters LAT1 in verschiedenen, vom Menschen stammenden Tumorzellen.
Die Gesamt-RNA wurde aus verschiedenen Tumorzellen, die vom Menschen stammten, mittels einer herkömmlichen Methode unter Verwendung von Isogen (Handelsname; hergestellt von Nippon Gene) entnommen und die RNA einer Agaroseelektrophorese mittels einer herkömmlichen Methode unterzogen und auf eine Nitrocellulosemembran aufgeblottet.
Das cDNA-Fragment, das für den in Beispiel 3 präparierten humanen Aminosäuretransporter LAT1 codierte, wurde einem Northern Blotting unter Verwendung einer Hybridisationssonde unterzogen, die durch Markieren mit ³²P-dCTP präpariert war. Der Northern Blot wurde gemäß einem Protokoll durchgeführt, das der handelsüblichen Nylon-Membran für das Nothern Blotting (wie z.B. MTN Blot [Handelsname], hergestellt von Clontech) beigefügt war, wobei verschiedene poly(A)⁺RNAs aufgeblottet wurden.
Als Ergebnis des Northern Blots konnte die Expression der mRNA, die für den humanen LAT1 codierte, in verschiedenen, vom Menschen stammenden Tumorzellen bestätigt werden.
Beispiel 6. Klonierung eines neutralen Aminosäuretransporters der Ratte.
(1) Isolierung der cDNA von Ratten-4F2hc und Erzeugung der cRNA.
Eine cDNA-Bank wurde aus poly(A)⁺RNA angelegt, die aus Rattenleber ausgereinigt war, unter Verwendung eines Kits für die Synthese von cDNA (Handelsname: Superscript Choice System; hergestellt von Gibco) und in die durch das Restriktionsenzym EocRI geschnittene Stelle eines Phagenvektors λZipLox (hergestellt von Gibco) integriert. Ein Segment entsprechend den Basen 135 bis 580 eines Ratten-4F2hc-Gens (Broer et al., Biochem. J., Band 312, S. 863, 1995) wurde mittels einer PCR amplifiziert und mit ³²P-dCTP markiert, und die resultierende Sonde wurde für das Screening einer Rattenleber-cDNA-Bank verwendet. Die Hybridisation wurde für eine Nacht in einer Hybridisierlösung bei 37°C vorgenommen, und die Filtermembran wurde mit 0,1 × SSC/0,1 % SDS bei 37°C gewaschen. Bezüglich der Lösung für die Hybridisation wurde ein Puffer auf pH 6,5, enthaltend 5 × SSC, 3 × Denhard-Lösung, 0,2 % SDS, 10 % Dextransulfat, 50 % Formamid, 0,01 % Antifoam B (ein Antischaummittel, hergestellt von Sigma), 0,2 mg/ml Lachssperma-modifizierte DNA, 2,5 mM Natriumpyrophosphat und 25 mM MES verwendet. Die cDNA-Komponente des λZipLox-Phagen, in den die cDNA eingebaut wurde, wurde in ein Plasmid pZL1 aufgenommen und dann weiter in ein Plasmid pBluescriptII SK (hergestellt von Stratagene) subkloniert.
Bezüglich des resultierenden Klons, d.h. eines Klons, der cDNA von Ratten-4F2hc enthielt, wurde eine Basensequenz von cDNA mittels einer Didesoxymethode unter Verwendung eines synthetischen Primers für die Bestimmung der Basensequenz und eines Kits für die Bestimmung der Basensequenz (Handelsname: Sequenase ver. 2.0; hergestellt von Amersham) bestimmt. In dieser Weise wurde bestätigt, dass die klonierte cDNA die eines Ratten-4F2hc-Gens war. Die Basensequenz des resultierenden 4F2hc ist in der SEQ ID NR.2 in der Sequenzliste dargestellt, die später wiedergegeben ist.
Aus dem oben hergestellten Plasmid, das die cDNA des Ratten-4F2hc enthielt, wurde die cRNA (eine RNA komplementär zur cDNA) unter Verwendung einer T7 RNA-Polymerase erzeugt.
(2) Klonierung eines neutralen Aminosäuretransporters LAT1 der Ratte.
Dies wurde wie folgt mittels einer Expressions-Klonierungsmethode gemäß der Methode von Kanai, et al. (Kanai und Hediger, Nature, Band 360, S. 467–471, 1992) vorgenommen.
Eine Ratten-C6-Gliomzelle poly(A)⁺RNA (400 μg) wurde mittels Gelelektrophorese fraktioniert.
Jede der durch die Fraktionierung erhaltenen Fraktionen wurde in Eizellen, zusammen mit der cRNA von Ratten-4F2hc, wie oben unter (1) erhalten, injiziert, gefolgt von einer Inkubation für zwei Tage.
Bezüglich der Eizellen, in die RNA injiziert war, wurde ein Experiment zum Einbau des Substrats unter Verwendung von Leucin als einem Substrat gemäß einer Methode von Kanai, et al. (Kanai und Hediger, Nature, Band 360, S. 467–471, 1992) wie folgt durchgeführt. Dabei wurden die Eizellen für 30 Minuten in einer Cholinchlorid-Aufnahmelösung, enthaltend 50 μM an ¹⁴C-Leucin als einem Substrat (100 mM Cholinchlorid, 2 mM Kaliumchlorid, 1,8 mM Calciumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid und 5 mM HEPES; pH 7,4) inkubiert, und die Einbaurate des Substrats wurde durch Zählen der Radioaktivität gemessen, die in die Eizellen aufgenommen war. Mit diesem System wurde übrigens bestätigt, dass eine synergistische Erhöhung des Einbaus in den Eizellen, in die sowohl Ratten-C6-Gliomzelle poly(A)⁺RNA (mRNA) als auch cRNA von Ratten-4F2hc injiziert waren, im Vergleich zu Eizellen, in die jedes davon einzeln infundiert war, festgestellt wurde (11).
Unter den mittels der Fraktionierung erhaltenen RNA-Fraktionen wählten die Eizellen, in die RNA infundiert war, eine Fraktion mit der höchsten Einbaurate von Leucin. Eine cDNA-Bank wurde für die poly(A)⁺RNA (2,8–4,0 kb) dieser Fraktion unter Ver wendung eines Kits für die Synthese von cDNA und einer Plasmid-Klonierung (Handelsname: Superscript Plasmid System; hergestellt von Gibco) angelegt. Jene DNAs wurden in die Stellen integriert, die die Restriktionsenzyme Sal1 und Not1 des Plasmids pSPORT1 (hergestellt von Gibco) erkannten, und die resultierende rekombinierte Plasmid-DNA wurde in eine kompetente Zelle von Escherichia coli DH10B-Stamm (Handelsname: Electro Max DH10B Competent Cell; hergestellt von Gibco) eingeführt. Die resultierende Transformante wurde auf einer Nitrocellulose-Membran inkubiert, was etwa 500 Kolonien pro Platte ergab. Eine Plasmid-DNA wurde aus diesen Kolonien präpariert, gefolgt von Ausschneiden mit dem Restriktionsenzym NotI. Die resultierende DNA wurde einer in vitro-Transkription zum Synthetisieren einer gekappten cRNA unterzogen.
Die resultierende cRNA (etwa 45 ng) wurde in Eizellen, zusammen mit der Ratten-4F2hc-cRNA (5 ng), wie oben unter (1) erhalten, infundiert. Bezüglich dieser Eizellen wurde ein Screening auf positive Klone unter Durchführung eines Leucin-Einbauexperiments in derselben Weise wie oben erwähnt vorgenommen. Bei der Durchführung des Screenings wurden Gruppen, in denen aus einer Vielzahl von Klonen extrahierte DNA gepoolt war, geprüft, und wurde der Einbau von Leucin in einigen Gruppen bestätigt, so wurden diese weiter in eine Vielzahl von Gruppen unterteilt und wurde ein weiteres Screening vorgenommen.
Bei dem resultierenden Klon, d.h. dem Klon, der cDNA des neuralen Aminosäuretransporters LAT1 der Ratte enthielt, wurde die Basensequenz mittels einer Didesoxymethode unter Verwendung eines synthetischen Primers für die Bestimmung der Gruppensequenz und eines Kits für die Bestimmung der Basensequenz (Handelsname: Sequenase ver. 2.0; hergestellt von Amersham) bestimmt.
Als Ergebnis wurde eine Basensequenz des neutralen Aminosäuretransporter-LAT1-Gens der Ratte erhalten. Außerdem wurde die Basensequenz der cDNA mittels einer herkömmlichen Methode analysiert, und die Translationsregion der cDNA und die Aminosäuresequenz des darin codierten LAT1 wurden bestimmt. Die Translationsregion erstreckte sich über die Basen 64 bis 1599.
Diese Sequenzen sind in der SEQ ID NR. 4 (Aminosäuresequenz) und NR. 3 (Basensequenz) in der Sequenzliste gezeigt, die später wiedergegeben ist.
Als Ergebnis der Analyse der Aminosäuresequenz von LAT1 mittels einer Kyte-Doolittle-Hydropathieanalyse (hydrophober Plot) wurden 12 Transmembranregionen (Membran-durchspannende Domänen) vorhergesagt, wie in 12 gezeigt. Außerdem befand sich in der zweiten hydrophilen Schleife eine Tyrosin-phosphorylierte Stelle, und in der vierten und achten hydrophilen Schleife lagen zwei Stellen vor, die Proteinkinease-C-abhängige phosphorylierte Stellen sein müssten.
(3) Expression des LAT1-Gens in verschiedenen Geweben der Ratte und in einer kultivierten Rattenzelllinie (Analyse durch Northern Blotting).
Ein cDNA-Fragment entsprechend den Basen 202 bis 1534 des Ratten-LAT1-Gens wurde mit ³²P-dCTP markiert, und unter dessen Verwendung als einer Sonde wurde ein Northern Blot für die RNA, die aus verschiedenen Geweben der Ratte und aus einer von der Ratte abgeleiteten kultivierten Tumorzelllinie extrahiert war, wie folgt durchgeführt. So wurden 3 μg poly(A)⁺RNA einer Elektrophorese unter Verwendung von 1 % Agarose/Formaldehydgel unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen. Das Filter wurde einer Hybridisation über Nacht in einer Hybridisierlösung, enthaltend das LAT1-cDNA-Fragment, markiert mit ³²P-dCTP, bei 42°C unterzogen. Das Filter wurde mit 0,1 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS, bei 65°C gewaschen.
Als Ergebnis des Northern Blots (13) wurden Bande bei etwa 3,8 kb in C6-Gliomzelle, Plazenta, Gehirn, Milz, Dickdarm und Hoden nachgewiesen, und in der Plazenta wurde eine weitere Bande bei etwa 2,6 kb über die zuvor genannte hinaus nachgewiesen, woraufhin eine Expression festgestellt wurde. Obschon die Expression in normaler Leber sehr schwach war, wurde eine starke Bande bei etwa 3,8 kb in Ratten-Hepatomzelllinie und Ratten-Hepatokarzinom-Zelllinie nachgewiesen, woraufhin eine Expression festgestellt wurde (14).
Außerdem wurde nach langer Exposition eine schwache Bande bei etwa 3,8 kb sogar in anderen Geweben festgestellt.
(4) Expression des LAT1-Gens in einer humanen Tumorzelllinie (Analyse mittels eines Northern Blots).
Ein cDNA-Fragment entsprechend den Basen 202 bis 1534 des Ratten-LAT1-Gens wurde mit ³²P-dCTP markiert, und unter dessen Verwendung als einer Sonde wurde RNA, die aus einer vom Menschen stammenden kultivierten Tumorzelllinie extrahiert war, einem Northern Blot wie folgt unterzogen. Poly(A)⁺RNA (3 μg) wurde einer Elektrophorese mit 1 % Agarose/Formaldehydgel unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen. Das Filter wurde einer Hybridisation für eine Nacht in einer Hybridisierlösung, enthaltend das Ratten-LAT1-cDNA-Fragment, markiert mit ³²P-dCTP, bei 37°C unterzogen. Das Filter wurde mit 0,1 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS, bei 37°C gewaschen.
Als Ergebnis des Northern Blots (15) wurden starke Bande bei etwa 4,0 kb bei einer Siegelringzellkarzinom-Zelllinie des Magens, kleinzelligen Lungenkarzinom-Zelllinie und Melanom-Zelllinie nachgewiesen, während eine schwache Bande bei 4,0 kb in einer Neuroblastom-Zelllinie nachgewiesen wurde, woraufhin eine Expression festgestellt wurde.
Beispiel 7. Charakterisierung des neutrale Aminosäuretransporters LAT1
(1) Rolle von 4F2hc in der Transportaktivität von LAT1.
Die Aktivitäten beim Einbau von Leucin in einem Fall, bei dem Ratten-LAT1-Gen-cRNA einzeln in Eizellen exprimiert wurde und in einem Fall, bei dem Ratten-LAT1-Gen-cRNA und 4F2hc-Gen-cRNA gleichzeitig in Eizellen exprimiert wurden, wurden verglichen.
Ratten-LAT1-Gen-cRNA (25 ng), Ratten-4F2hc-Gen-cRNA (25 ng) oder Ratten-LAT1-Gen-cRNA (12,5 g)/Ratten-4F2hc-Gen-cRNA (12,5 ng) wurde durch Injizieren in die Eizellen und Inkubieren für 2 Tage oder 5 Tage exprimiert.
Ein Experiment zum Einbau von Leucin wurde gemäß einer in obigem Beispiel 6(2) genannten Methode wie folgt vorgenommen. Dabei wurden die Eizellen, in die Ratten-LAT1-Gen-cRNA, Ratten-4F2hc-Gen-cRNA oder Ratten-LAT1-Gen-cRNA/-Ratten-4F2hc-Gen-cRNA injiziert war, für 30 Minuten in einer Aufnahmelösung, enthaltend ¹⁴C-Leucin (50 μM) inkubiert und der Einbau der Radioaktivität in die Eizellen gemessen.
Das Ergebnis (16) war, dass in den Eizellen, in denen lediglich LAT1 exprimiert war, der Einbau von Leucin in derselben Höhe erfolgt war, wie in den Eizellen, in die Wasser als einer Kontrolle injiziert war, doch war in den Eizellen, in denen sowohl LAT1 als auch 4F2hc exprimiert waren, ein hoher Einbau des Leucins feststellbar, weshalb 4F2hc als für LAT1 zur Erzielung seiner Funktion erforderlich erachtet wurde.
(2) Salzabhängigkeit der Transportaktivität von LAT1.
Der Einfluss des einem Medium zugegebenen Salzes wurde in einem Test des Einbaus von Leucin in Eizellen getestet, wenn sowohl Ratten-LAT1-Gen-cRNA als auch 4Fh2c-Gen-cRNA verwendet wurden. Salzes wurde in einem Test des Einbaus von Leucin in Eizellen getestet, wenn sowohl Ratten-LAT1-Gen-cRNA als auch 4Fh2c-Gen-cRNA angewendet wurden.
Ein Experiment des Einbaus von Leucin wurde gemäß einer in obigem Beispiel 6(2) genannten Methode unter Verwendung von Eizellen vorgenommen, in die sowohl Ratten-LAT1-Gen-cRNA als auch Ratten-4F2hc-Gen-cRNA injiziert waren. Bezüglich der Aufnahmelösung wurde allerdings eine Natrium-Aufnahmelösung (100 mM Cholinchlorid wurden gegen 100 mM Natriumchlorid ausgetauscht) anstelle einer Cholinchlorid-Aufnahmelösung zur Überprüfung des Einflusses von Natriumionen verwendet. Wurde der Einfluss von Chlorion überprüft, so wurde eine Gluconsäure-Aufnahmelösung (100 mM Natriumchlorid wurden gegen 100 mM Natriumgluconat ausgetauscht) anstelle der Natrium-Aufnahmelösung verwendet.
Das Ergebnis (17) war, dass selbst dann, wenn Cholin außerhalb der Eizellen gegen Natrium ausgetauscht wurde und wenn Chlorion außerhalb der Eizellen gegen Gluconsäureion ausgetauscht wurde, der Einbau des Leucins in keinster Weise beeinflusst wurde. Aus dem Ergebnis war nachweisbar, dass LAT1 ein Transporter war, der unabhängig von Natriumionen und Chlorionen wirkte.
(3) Kinetischer Michaelis-Menten-Test von LAT1.
Ein kinetischer Michaelis-Menten-Test wurde für einen neutralen Aminosäuretransporter durchgeführt. Durch Überprüfen der Veränderlichkeit der Einbaurate von Leucin mit den unterschiedlichen Konzentrationen des Substrats Leucin wurde ein kinetischer Michaelis-Menten-Test des neutralen Aminosäuretransporters durchgeführt.
Ein Experiment des Einbaus von Leucin wurde gemäß einer in obigem Beispiel 6(2) genannten Methode unter Verwendung von Eizellen durchgeführt, in die sowohl Ratten-LAT1-Gen-cRNA als auch Ratten-4F2hc-Gen-cRNA injiziert war. Als Ergebnis dessen (18) betrug der Km-Wert etwa 24 μM.
(4) Substratspezifität von LAT1 (ein Experiment zur Hemmung durch Zugabe von Aminosäure und einer ähnlichen Substanz).
Bei einem Experiment des Einbaus von Leucin durch Eizellen, in die sowohl Ratten-LAT1-Gen-cRNA als auch Ratten-4F2hc-Gen-cRNA injiziert war, wurde der Einfluss der Zugabe verschiedener Aminosäuren und ähnlicher Substanzen zum System getestet.
Ein Experiment des Einbaus von Leucin wurde gemäß einer in obigem Beispiel 6(2) genannten Methode unter Verwendung der Eizellen durchgeführt, in die sowohl Ratten-LAT1-Gen-cRNA als auch Ratten-4F2hc-Gen-cRNA injiziert war. In diesem Falle wurde jedoch eine Cholin-Aufnahmelösung verwendet, und der Einbau von ¹⁴C-Leucin (20 μM) wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 mM verschiedener Verbindungen (unmarkiert) gemessen.
Das Ergebnis (19) war, dass eine cis-hemmende Wirkung bei verschiedenen Arten von neutralen Aminosäuren beobachtet wurde. Insbesondere Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin, Tyrosin, Histidin, Tryptophan und Valin hemmten den Einbau von ¹⁴C-Leucin, wie durch LAT1 vermittelt, stark. Außerdem wurde bei den anderen Substanzen als den standardmäßigen Aminosäuren der Einbau von ¹⁴C-Leucin, wie durch LAT1 vermittelt, auch durch pharmazeutische Agenzien und physiologisch aktive Substanzen wie L-DOPA (ein Therapeutikum für Parkinson-Krankheit), Melphalan (Antitumormittel), Triiodothyronin (Schilddrüsenhormon) Thyroxin (Schilddrüsenhormon), gehemmt. Weiterhin hemmte 2-Amino-2-Norbornan-Carboxylsäure, die als ein Hemmstoff für den Einbau neutraler Aminosäuren bekannt ist, ebenfalls den Einbau von ¹⁴C-Leucin. Saure Aminosäuren und basische Aminosäuren beeinflussten den durch LAT1 vermittelten Einbau von ¹⁴C-Leucin nicht.
(5) Substrat-Selektivität von LAT1 (ein Test des Einbaus unter Verwendung verschiedener Arten von Aminosäuren und ähnlicher Substanzen als Substrate).
Der Einbau von LAT1 wurde unter Verwendung verschiedener Arten von Aminosäuren und ähnlicher Substanzen als einem Substrat getestet.
Ein Test des Einbaus unter Verwendung verschiedener Arten von Aminosäuren und ähnlicher Substanzen wurde gemäß der in obigem Beispiel 6(2) genannten Methode unter Verwendung von Eizellen durchgeführt, in die sowohl Ratten-LAT1-Gen-cRNA als auch Ratten-5F2hc-Gen-cRNA injiziert waren. Als einem Substrat wurden jedoch verschiedene radiomarkierte Verbindungen anstelle von ¹⁴C-Leucin verwendet.
Das Ergebnis war, dass der Einbau in die Eizellen festgestellt wurde, wenn Leucin (eine ¹⁴C-Verbindung), Isoleucin (eine ¹⁴C-Verbindung), Phenylalanin (eine ¹⁴C-Verbindung), Methionin (eine ¹⁴C-Verbindung), Tyrosin (eine ¹⁴C-Verbindung), Histidin (eine ¹⁴C-Verbindung), Tryptophan (eine ¹⁴C-Verbindung) und Valin (eine ¹⁴C-Verbindung) als Substrate verwendet wurden.
Beispiel 8. Kontrolle der Zellvermehrung durch Unterdrückung des neutralen Aminosäuretransporters LAT1.
(1) Hemmung der Unterdrückung der Zellvermehrung durch eine LAT1-Suppression.
Die unterdrückende Wirkung auf die Zellvermehrung einer LAT1-Suppression durch ein LAT1-suppressives Mittel wurde getestet.
Eine Rattenleber-Zelllinie, worin LAT1 hochgradig exprimiert war, wurde auf einem William-Medium inkubiert, wobei 20 mM D-Leucin oder BCH, die den durch LAT1 vermittelten Einbau unterdrückten, dem Medium zugegeben wurden, und nach einer 48-stündigen Inkubation wurden die Zellzahlen unter Verwendung eines Cell Counting Kit-8 (hergestellt von Dojindo Laboratories) untersucht. Die Zellzahlen wurden als eine Absorption bei 450 nm (O.D. 450) gemessen.
Das Ergebnis (20) war, dass in einer Gruppe, worin D-Leucin oder BCH zugegeben waren, eine Reduktion in den Zellzahlen im Vergleich zu einer Kontrollgruppe festgestellt wurde, bei der weder D-Leucin noch BCH zugesetzt war, woraufhin davon ausgegangen wurde, dass die Zellvermehrung durch die Unterdrückung des Einbaus einer neutralen Aminosäure durch eine LAT1-Suppression unterdrückt wurde.
Beispiel 9. Expression von LAT1-Gen und 4F2hc-Gen in verschiedenen Tumorzelllinien des Menschen (eine Analyse mittels Northern Blotting).
Ein cDNA-Fragment entsprechend den Basen 649 bis 1128 des hLAT1-Gens wurde mittels des Restriktionsenzyms Smal ausgeschnitten, eine Sonde wurde durch Markieren mit ³²P-dCTP erzeugt und ein Northern Blotting von humanen Tumorzelllinien wurde wie folgt durchgeführt. Aus verschiedenen humanen Tumorzelllinien wurde poly(A)⁺RNA extrahiert und dann eine Hybridisation und Waschen unter Verwendung einer ³²P-dCTP-markierten LAT1-Sonde vorgenommen.
Das cDNA-Fragment entsprechend den Basen 106 bis 645 des h4F2hc-Gens wurden mittels des Restriktionsenzyms PstI ausgeschnitten, eine Sonde wurde durch Markieren mit ³²P-dCTP erzeugt und ein Northern Blotting von humanen Tumorzelllinien wurde in derselben Weise durchgeführt.
Als ein Ergebnis des Northern Blotting wurde in allen in 21 und 22 untersuchten Tumorzelllinien die Expression von LAT1 nahe 4,8 kb festgestellt. Bezüglich des 4F2hc wurde eine Expression in den meisten der Tumorzelllinien nahe 2,2 kb festgestellt. Die Stärke der Expression variierte jedoch in Abhängigkeit von den Zellen, und insbesondere im Falle der Leukämie-Zelllinien Daudi, CCRF-SB und P30/OHK wurde kein Signal durch Northern Blotting nachgewiesen (22).
Beispiel 10. Signifikanz der von humanem Blasenkrebs abgeleiteten T24-Zellen als einem Auswertungssystem für LAT1-Inhibitoren.
Von humanem Blasenkrebs abgeleitete T24-Zellen wurden inkubiert und in einem Eagles Minimal Essential Medium, das 10 % fötales Rinderserum enthielt, bewahrt. Ein Test auf den Einbau von Aminosäuren in T24-Zellen wurde durch Inkubieren der T24-Zellen auf einer 24-Well-Platte durchgeführt und beendet, als der Zustand konfluent wurde. Der Aminosäure-Einbautest wurde durch Entfernen der Inkubationslösung und Zugeben eines Dulbecco-PBS (hergestellt von Gibco), enthaltend ¹⁴C-Aminosäure, eingeleitet und durch deren Entfernung, Abkühlen mit Eis und Waschen mit Dulbecco-PBS, beendet. Nach dem Waschen wurde das Obige in 0,1 N NaOH gelöst und die Radioaktivität mittels eines Flüssigszintillationszählers gemessen.
(1) Na⁺-Abhängigkeit von T24-Zellen für den Einbau von Leucin.
Der Einfluss von Natriumionen im Medium bei einem Experiment des Leucin-Einbaus durch T24-Zellen wurde untersucht.
Bezüglich der Lösung für den Einbau wurde eine Cholin-Aufnahmelösung (worin Natriumchlorid durch Cholinchlorid ersetzt war) anstelle einer Dulbecco-PBS verwendet, als der Einfluss von Natriumionen im Medium auf den Einbau von Leucin geprüft wurde.
Als ein Ergebnis (23) wurde der Einbau von Leucin selbst dann in keinster Weise beeinflusst, wenn Cholin außerhalb der Zellen gegen Natrium ausgetauscht wurde. Daher wurde festgestellt, dass der Einbau von Leucin durch T24-Zellen auf einem Transportsystem getragen wurde, das nicht von Natriumion abhängig war.
(2) Kinetischer Michealis-Menten-Test auf den Einbau von Leucin durch T24-Zellen.
Ein kinetischer Michaelis-Menten-Test wurde für den Einbau von Leucin durch T24-Zellen durchgeführt. Der kinetische Michealis-Menten-Test wurde durch Untersuchen der Veränderungen in der Einbaurate von Leucin durch unterschiedliche Konzentrationen des Substrats Leucin vorgenommen.
Als ein Ergebnis (24) betrug der Km-Wert 100,3 μM und der Vmax-Wert betrug 23.870 pmol/mg Protein/Minute.
(3) Experiment auf die Hemmung des Einbaus von Leucin durch T24-Zellen durch Zugabe von Aminosäure und ähnlichen Substanzen.
In einem Experiment des Einbaus von Leucin durch T24-Zellen wurde der Einfluss der Zugabe verschiedener Aminosäuren und ähnlicher Substanzen untersucht.
In einem Experiment des Einbaus von Leucin wurde der Einbau von ¹⁴C-Leucin (20 μM) in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 mM von verschiedenen Verbindungen (unmarkiert) gemessen.
Als ein Ergebnis (25) wurde eine starke cis-hemmende Wirkung durch Methionin, Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Histidin und Cystein beobachtet. BCH, welches ein L-spezifischer Hemmstoff des Aminosäure-Transportsystems war, hemmte den Einbau von Leucin stark. Das Ergebnis dieses Experi ments zur Hemmung war mit dem Ergebnis der Expression von LAT1 in Eizellen von Xenopus identisch.
(4) Art und Weise der Hemmung des Leucin-Einbaus durch T24-Zellen mittels BCH, einem Hemmstoff für den Einbau.
Die Abhängigkeit des ¹⁴C-Leucin-Einbaus durch T24-Zellen von der Konzentration wurde in Abwesenheit von BCH, in Gegenwart von 50 μM BCH und in Gegenwart von 100 μM BCH gemessen, und der Art und Weise der Hemmung wurde mittels eines doppelt reziproken Diagramms untersucht.
Als ein Ergebnis (26) wurde geklärt, dass die Hemmung durch BCH eine kompetitive Inhibition war und ihr Ki-Wert 156 μM betrug.
Beispiel 11. Wirkung von BCH, einem Hemmstoff des Aminosäure-Einbaus, auf die Vermehrung einer humanen Tumorzelllinie.
Von humanem Blasenkrebs abgeleitete T24-Zellen wurden inkubiert und in einem Eagle's Minimal Essential Medium, enthaltend 10 % fötales Rinderserum, bewahrt. Humane Daudi-Zellen wurden inkubiert und in einem RPMI-Medium, enthaltend 20 % fötales Rinderserum, bewahrt. Die T24-Zellen oder Daudi-Zellen wurden in einer 24-Well-Platte (800 Zellen/Weil) für 5 Tage in einem Medium mit oder ohne 20 mM BCH inkubiert, und die Zellzahlen wurden ausgezählt.
Als ein Ergebnis (27) wurde geklärt, dass die Zellvermehrung im Falle der T24-Zellen schnell war im Vergleich zu den Daudi-Zellen, und dass, obschon BCH die Vermehrung von T24 in hohem Maße unterdrückte, es selten eine unterdrückende Wirkung auf die Vermehrung der Daudi-Zellen zeigte.
Die T24-Zellen waren, zusammen mit LAT1 und 4F2hc, stark exprimiert (21) und, wie in Beispiel 10 gezeigt, zeigte LAT1 eine starke Funktionsaktivität in T24-Zellen. Im Gegensatz dazu wurde in Daudi-Zellen, obschon LAT1 stark exprimiert war, keine Expression von 4F2hc nachgewiesen, die zur Erzielung der Funktion von LAT1 erforderlich ist (22), weshalb angenommen wird, dass LAT1 in Daudi-Zellen keine Funktion zeigt. Die Tatsachen, dass die Vermehrung von T24-Zellen mit einer starken Funktionsaktivität von LAT1 schnell war, dass BCH eine hohe Suppression der Zellvermehrung zeigte, dass die Vermehrung von Daudi-Zellen, worin LAT1 für nicht funktionsfähig gehalten wird, langsam war und dass BCH keine unterdrückende Wirkung auf die Vermehrung zeigte, stützen die Hypothese, dass der Einbau essentieller Aminosäuren, wie durch LAT1 vermittelt, einen der die Rate bestimmenden Schritte für die Zellvermehrung darstellt und dass eine solche Hemmung die Unterdrückung der Zellvermehrung anzeigt.
In CCRF-SB-Zellen und P30/OHK-Zellen (22), worin die Expression von 4F2hc nicht nachgewiesen wurde wie in Daudi-Zellen, wurde bestätigt, dass, wie bei Daudi-Zellen, die Vermehrung langsam war und die Wirkung von BCH schwach war, und dass, wie bei T24-Zellen, die Vermehrung in den Zellen schnell war, in denen sowohl LAT1 als auch 4F2hc stark exprimiert waren und BCH eine stark unterdrückende Wirkung zeigte.
Beispiel 13. Überlebenseffekt von BCH, einer unterdrückenden Substanz des Aminosäuretransporters, in Tumor-beimpften Mäusen.
Maussarkom-180-Zellen wurden in männliche ICR-Mäuse intraperitoneal transplantiert (1 × 10⁶), und vom nächsten Tag der Transplantation an wurde BCH, welches ein Hemmstoff für den Aminosäuretransporter ist, D-Leu mit einer hemmenden Wirkung auf den Aminosäuretransporter und D-Ala ohne hemmende Wirkung auf denselben bei der Dosis von 300 mg/kg für zehn Tage verabreicht. Nach der Transplantation wurde jeden Tag festgestellt, ob die Maus tot oder lebendig war.
Als Ergebnis der 19-tägigen Beobachtung waren alle Fälle in der unbehandelten Kontrolle am Leben, wohingegen in der mit Sarkom-180-Zellen beimpften Gruppe, der mit Sarkom-180-Zellen beimpften Gruppe und der Gruppe, der ein Vehikel nach Beimpfung mit Sarkom-180-Zellen verabreicht worden war, die Lebensdauern signifikant verkürzt waren im Vergleich zur Kontrolle (28). Im Gegensatz dazu war in der Gruppe, bei der BCH verabreicht wurde oder D-Leu nach Beimpfung mit Sar kom-180-Zellen verabreicht wurde, ein signifikanter Überlebenseffekt durch Behandlung mit solch einem Mittel feststellbar (28). Kein Überlebenseffekt wurde bei D-Ala festgestellt (28).
Industrielle Anwendbarkeit
Das Aminosäure-Transportermolekül der vorliegenden Erfindung weist die wichtige biologische Funktion der Vermittlung des Einbaus verschiedener Aminosäuren, die essentielle Nährstoffe für die Herstellung und die Vermehrung von Zellen sind, auf und zeigt außerdem eine Expression in einem breiten Bereich von Tumorzellen relativ zur Expression in gesunden Zellen, was das Molekül recht hoffnungsträchtig als ein Ziel für die Entwicklung zum Beispiel von Antitumormitteln (Antikrebsmitteln) macht.
Wird daher ein pharmazeutisches Mittel, das eine biologische Aktivität auf dem Molekül oder die Aktivität zur Unterdrückung der Expression des Moleküls (wie etwa Antisense-DNA-Pharmazeutikum, Antisense-RNA-Pharmazeutikum, Antikörper-Pharmazeutikum, Antikörperfragment-Pharmazeutikum, Peptidantagonist-Pharmazeutikum und Nicht-Peptidantagonist-Pharmazeutikum, wie z.B. niedermolekulare Verbindungen) aufweist, verwendet und der Einbau der Nährstoffe (verschiedene Aminosäuren und physiologisch aktive Substanzen), wie durch das Molekül vermittelt, in die Tumorzellen unterdrückt, so ist es nun möglich, die Tumorzellen in einen Zustand des Aminosäurehungers zu versetzen und das Vorhandensein und die Vermehrung von Tumorzellen zu hemmen.
Demgemäß ist das Protein der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon, die DNA, die für das Protein oder einen Teil davon codiert, die RNA, die für das Protein oder einen Teil davon codiert, eine DNA, die an die DNA hybridisiert, der Expressionsvektor, der die DNA enthält, die transformierte Zelle, die durch die DNA oder durch den Vektor transformiert ist, die Zelle, in die die RNA eingeführt ist, der Antikörper oder Teil davon mit einer Reaktivität mit dem Protein oder einen Teil davon, die Zelle, die den Antikörper produziert, die markierte DNA, worin ein Teil der DNA radiomarkiert ist, die markierte RNA, worin ein Teil der RNA radiomarkiert ist, der markierte Anti körper, worin der Antikörper oder ein Teil des Antikörpers markiert ist, ein Kit, umfassend die markierte DNA, ein Kit, umfassend die markierte RNA und ein Kit, umfassend den markierten Antikörper, als pharmazeutische Agenzien mit solch einer Antitumorwirkung und/oder Reagenzien für die Entwicklung solcher pharmazeutischer Agenzien bereitstellbar.
Werden außerdem verschiedene Substanzen wie DNA, RNA oder transformierte Zellen der vorliegenden Erfindung verwendet, so ist nun möglich, ein Arzneimittel-Design, ein Screening (wie etwa einen Reportergen-Assay) und eine Identifizierung von pharmazeutischen Agenzien, die die biologische Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung kontrollieren (aktivieren, unterdrücken oder hemmen), von pharmazeutischen Agenzien, die die Transkription des Proteins der vorliegenden Erfindung zu mRNA hemmen, von pharmazeutischen Agenzien, die die Translation des Proteins der vorliegenden Erfindung von der mRNA hemmen, pharmazeutischen Agenzien, die die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Molekülen hemmen und so weiter, durchzuführen.
Außerdem kann ein Teil der DNA und RNA der vorliegenden Erfindung als eine Sonde für die Identifizierung von DNA oder RNA, die damit hybridisiert, unter Anwendung einer Koloniehybridisationsmethode oder einer Plaquehybridisationsmethode bereitgestellt werden. Außerdem ist ein Teil der DNA der vorliegenden Erfindung als ein Primer für die Amplifikation des Gens, das für die DNA der vorliegenden Erfindung oder das Transportermolekül der vorliegenden Erfindung codiert, mittels einer PCR bereitstellbar.
Darüber hinaus ist ein Teil der DNA der vorliegenden Erfindung, eine DNA, die zu der DNA komplementär ist, oder ein Teil der RNA der vorliegenden Erfindung nicht nur als das oben genannte Reagenz, sondern auch als ein sogenanntes Antisense-DNA-Pharmazeutikum oder Antisense-RNA-Pharmazeutikum bereitstellbar.
Wie oben erwähnt, ist das Protein der vorliegenden Erfindung zum Identifizieren des pharmazeutischen Agens fähig, welches die biologische Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung oder die Expression des Proteins kontrolliert, wenn das Sta dium, zu welchem das Proteinmolekül auf der Zelloberfläche exprimiert wird, ausgenützt wird. Es ist außerdem möglich, basierend auf der Aminosäuresequenz des Proteins, einen Peptidantagonisten mit der Fähigkeit zum Hemmen der biologischen Aktivität des Proteins zu designen. Der Peptidantagonist, welcher als solcher designed wird, hemmt die Bindung des Aminosäuretransporters, welcher das Protein der vorliegenden Erfindung ist, mit verschiedenen Substraten oder die Bindung des Proteins der vorliegenden Erfindung mit anderen Molekülen kompetitiv, wodurch die Bereitstellung eines Pharmazeutikums möglich ist, welches die Erzielung der biologischen Funktion des Proteins der vorliegenden Erfindung verhindert.
Das Protein der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon und Zellen, wie etwa eine transformierte Zelle, die das Protein exprimiert, sind zur Bereitstellung als immunsensibilisierende Antigene in der Erzeugung von Antikörper (Antiserum, monoklonaler Antikörper) zum Protein der vorliegenden Erfindung bereitstellbar.
Antiserum (polyklonaler Antikörper) und monoklonaler Antikörper mit einer Reaktivität mit dem Aminosäure-Transportermolekül, welches das Protein der vorliegenden Erfindung ist, sind als ein Antikörper-Pharmazeutikum bereitstellbar, welches die Erzielung der biologischen Aktivität des Moleküls hemmt (neutralisiert), wenn es an das Molekül bindet.
Wird weiterhin der Antikörper mit verschiedenen Substanzen markiert, die zum Abgeben eines nachweisbaren Signals fähig sind, so ist es als ein Reagenz für die Analyse (immunhistologischen Anfärbung, Western Blotting, ELISA, etc.) des exprimierten Zustands des Proteins der vorliegenden Erfindung in verschiedenen biologischen Materialien (wie etwa Zellen, Geweben, Organen und Körperflüssigkeit) bereitstellbar.
Eben solch ein markierter Antikörper, die markierte DNA, die mit verschiedenen Substanzen markiert und zur Abgabe eines Signals fähig ist, durch die die DNA der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon nachweisbar ist, können als ein Reagenz im Test (wie etwa Southern Blot und ein FISH) zur Identifizierung des Gens, das für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, bereitgestellt werden.
Weiterhin und in ähnlicher Weise kann eine radiomarkierte RNA, wobei die RNA der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon mit einem Radioisotop markiert ist, als ein Reagenz für die Analyse (wie etwa Northern Blot) des exprimierten Zustands der mRNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in Zellen, Geweben oder Organen bereitgestellt werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Protein, welches ein Zelloberflächenprotein mit der Fähigkeit ist, den Transport einer oder mehrerer Aminosäuren in eine Zelle zu vermitteln, welche die Fähigkeit besitzt, den Einbau von Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Phenylalanin (Phe), Methionin (Met), Tyrosin (Tyr), Tryptophan (Trp), Valin (Val) oder Histidin (His) in die Zelle in einer Na⁺-unabhängigen Weise zu vermitteln, welches Protein (i) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 2 oder 4 aufweist, oder (ii) eine Sequenz aufweist, worin 1 bis 40 Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert sind bezüglich SEQ ID Nr. 2 oder 4.
Protein nach Anspruch 1, welches, wenn es gleichzeitig mit einem 4F2hc-Typ II-Membran-Glycoprotein oder einem Teil davon vorhanden ist, die Fähigkeit aufweist, neutrale Aminosäuren und diesen ähnliche Substanzen zu transportieren.
Protein nach Anspruch 2, worin das 4F2hc-Typ II-Membran-Glycoprotein die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 8 oder eine Aminosäuresequenz aufweist, worin ein oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert sind bezüglich SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 8.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches von einem Menschen oder einer Ratte stammt.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches eine antigene partielle Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 4 ist.
DNA-Sequenz, welche ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert, welche unter stringenten Bedingungen an Basen 66 bis 1586 der SEQ ID Nr. 1 hybridisiert oder welche die Sequenz der Basen 64 bis 1599 der SEQ ID Nr. 3 aufweist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 6, welche von einem Menschen oder einer Ratte stammt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 6 oder 7, welche ein Zelloberflächenprotein codiert, wobei der Einbau von Aminosäure in die Zelle durch das gleichzeitige Vorhandensein eines 4F2hc-Typ II-Membran-Glycoproteins oder eines Teils davon vermittelt wird.
DNA-Sequenz nach Anspruch 8, worin das 4F2hc-Typ II-Membran-Glycoprotein die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 8 oder eine Aminosäuresequenz aufweist, worin ein oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert sind bezüglich SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 8.
RNA-Sequenz, welche von einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 ableitbar ist.
RNA-Sequenz nach Anspruch 10, welche die Sequenz der SEQ ID Nr. 26 oder SEQ ID Nr. 27 aufweist.
Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9.
Zelle, welche durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 12 transformiert ist.
Zelle nach Anspruch 13, welche außerdem durch eine DNA-Sequenz transformiert ist, umfassend die Sequenz der Basen 110 bis 1696 der SEQ ID Nr. 5 oder TAG, TGA oder TAA angrenzend an die 1696ste Base, oder durch eine DNA-Sequenz, die für ein Reporterprotein codiert.
Zelle, die von einem Menschen stammt oder eine Eizelle von Xenopus laevis ist, in die eine RNA-Sequenz nach Anspruch 10 oder 11 eingeführt ist.
Antiserum, polyklonaler Antikörper oder monoklonalen Antikörper oder ein Teil davon, das über Reaktivität mit einem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 verfügt.
Monoklonaler Antikörper oder ein Teil davon nach Anspruch 16, welcher ein rekombinanter chimärer monoklonalen Antikörper ist, umfassend eine variable Region eines Immunglobulins, das von einem anderen Säuger als einem Menschen stammt, und eine konstante Region eines Immunglobulins, das von einem Menschen stammt, oder ein rekombinanter humaner monoklonalen Antikörper ist, umfassend die gesamte oder einen Teil einer Komplementaritätsbestimmenden Region einer hypervariablen Region eines Immunglobulins, das von einem anderen Säuger als einem Menschen stammt, eine Frame-Region einer hypervariablen Region eines Immunglobulins, das von einem Menschen stammt, und eine konstante Region eines Immunglobulins, das von einem Menschen stammt.
Monoklonaler Antikörper oder ein Teil davon nach Anspruch 16 oder 17, welcher ein humaner monoklonalen Antikörper ist.
Zelle, welche einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 16 bis 18 produziert.
Zelle nach Anspruch 19, welche eines fusionierte Zelle ist, erzeugt durch Fusion einer B-Zelle, die von einem nicht-humanen Säuger stammt, welche zur Produktion des monoklonalen Antikörpers fähig ist, mit einer Myelomzelle, die von einem Säuger stammt, oder eine genetisch rekombinierte Zelle ist, transformiert durch Einführung von DNA, die für die schwere Kette des monoklonalen Antikörpers codiert, DNA, die für die leichte Kette davon codiert, oder DNA, die für beides codiert, in die Zelle.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9, eine RNA-Sequenz nach Anspruch 10 oder 11, oder ein Antiserum, polyklonalen Antikörper oder monoklonalen Antikörper oder einen Teil davon nach einem der Ansprüche 16 bis 18 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 16 bis 18, welcher mit einer Markierungssubstanz markiert ist, die zur Abgabe eines nachweisbaren Signals entweder alleine oder durch eine Reaktion mit einer anderen Substanz, wahlweise einem Enzym, fluoreszierenden Substanz, chemilumineszierenden Substanz, Biotin, Avidin oder Radioisotop, fähig ist.
Kit zum Nachweisen eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 oder eines Fragments davon aufweist, wobei der Kit einen markierten monoklonalen Antikörper nach Anspruch 22 umfasst.
Verfahren zum Nachweisen oder Messen eines Proteins, das in einer Probe exprimiert ist, welches Verfahren umfasst: (1) Kontaktieren der Probe mit einem markierten monoklonalen Antikörper nach Anspruch 22; und (2) Messen der Menge an markiertem monoklonalen Antikörper, die an die Probe gebunden ist, durch Detektieren der Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Radioaktivität in Abhängigkeit von der Art der Markierungssubstanz, die an den markieren monoklonalen Antikörper gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Probe eine Tumorzelle, Tumorgewebe, Tumor-tragendes Organ oder einen Teil davon umfasst.
DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 9 oder ein Fragment davon, welche mit einem Enzym, fluoreszierenden Substanz, chemilumineszierenden Substanz, Biotin, Avidin oder Radioisotop markiert ist.
RNA nach Anspruch 10 oder 11 oder ein Fragment davon, welche mit einem Radioisotop markiert ist.
Kit zum Nachweisen eines Gens, das für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert, wobei der Kit eine markierte DNA nach Anspruch 26 oder eine radioaktive RNA nach Anspruch 27 umfasst.
Verfahren zum Nachweisen der Wirkung einer Testsubstanz auf die Fähigkeit eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, neutrale Aminosäuren zu transportieren.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die Testsubstanz eine andere Substanz als eine Aminosäure ist.
Verfahren zum Screening einer Testsubstanz auf die unterdrückende Wirkung der Fähigkeit eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, neutrale Aminosäuren und diesen ähnliche Substanzen zu transportieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, worin eine Zelle oder eine Eizelle von Xenopus laevis, die durch eine DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 9 transformiert ist, verwendet wird.
Verfahren zum Identifizieren einer Substanz, welche die Fähigkeit zum Hemmen der Transkription einer DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 9 auf mRNA oder der Expression eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5 aufweist.
Transgene Maus, welche eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 4 codiert, an einem intrinsischen Gen aufgenommen hat, wodurch die Maus eine Zelle aufweist, die das Protein in ihrem Körper exprimiert.
Transgene Maus nach Anspruch 34, worin die DNA-Sequenz die Basen 66 bis 1586 der SEQ ID Nr. 1 und TAG, TGA oder TAA angrenzend an die 1586ste Base oder Basen 64 bis 1599 der SEQ ID Nr. 3 und TAG, TGA oder TAA angrenzend an die 1599ste Base umfasst.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9, RNA-Sequenz nach Anspruch 19 oder 11 oder Antiserum, polyklonaler Antikörper oder monoklonaler Antikörper oder ein Teil davon nach einem der Ansprüche 16 bis 18 zur Verwendung bei einer Methode zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie oder Diagnose.
Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9, einer RNA-Sequenz nach Anspruch 10 oder 11 oder eines Antiserums, polyklonalen Antikörpers oder monoklonalen Antikörpers oder eines Teils davon nach einem der Ansprüche 16 bis 18 in der Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen.