JP2013063978A - 抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット - Google Patents
抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013063978A JP2013063978A JP2012234768A JP2012234768A JP2013063978A JP 2013063978 A JP2013063978 A JP 2013063978A JP 2012234768 A JP2012234768 A JP 2012234768A JP 2012234768 A JP2012234768 A JP 2012234768A JP 2013063978 A JP2013063978 A JP 2013063978A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lat1
- score
- prostate cancer
- staining
- malignancy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Abstract
【解決手段】手術前の早期段階において生検材料を用いてGleasons分類と組み合わせることによって、手術時に摘出した材料でなく細胞針検査で採取した材料を用いた場合でも、前立腺がんの悪性度がより高精度かつ容易に判定可能な手段を提供することを目的とする、前立腺がんの悪性度を判定(診断)して患者の予後を予測するための判定キット及び判定法を提供する。
【選択図】なし
Description
(2)内因性のペルオキシダーゼを阻害する過酸化物(ペルオキシド)
(3)酸化により発色する酸化還元色素
(4)抗原タンパク(LAT1)と抗体が結合しやすくするための賦活化試薬
(5)組織中のLAT1以外のタンパクと抗体との非特異的な結合を阻害するブロッキング試薬
(6)各ステップにおいて標本に付着した試薬を取り除くための洗浄剤
・検体組織に過酸化物を適用する工程
・賦活化試薬に検体組織を浸漬し、マイクロウエーブ処理を施す工程
・ブロッキング試薬を検体組織に適用する工程
・抗ヒトLAT1モノクローナル抗体に対する標識化抗体を適用する工程
・酸化により発色する酸化還元色素を適用する工程
・場合により、一次抗体陰性コントロールを検体組織に適用する工程
一次抗体には、抗ヒトL-タイプアミノ酸トランスポーター1(hLAT1)マウスモノクローナル抗体をタンパク量として2μg/mL含有する。当該抗体は、in vitro translation法によりhLAT1クローニングベクターより合成したhLAT1の1-52位のタンパクを抗原としてBALB/cマウスに免疫し、その脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞を融合させて得たハイブリドーマをマウス腹腔内に接種、得られた腹水より、硫安分画法及びProtein Gカップリングカラムクロマトグラフィーにより精製し、1%ウシ血清アルブミンを含む10mM PBS(pH7.4)に溶解したものである。なお、LAT1のアミノ酸配列及び当該タンパク質をコードする塩基配列は、特開2000−157286号公報に記載されている。
本製造例に係る判定キットは、以下の6種類の試薬から構成される。
・ブロッキング試薬
正常ブタ血清を2%に希釈して調製する。
・一次抗体
抗LAT1マウスモノクローナル抗体(製造例1)を緩衝液(1%BSA、0.25% Casein sodium、15mM sodium Azide、0.1% Tween 20)で2μg/mLに希釈して調製する。
・ポリマー試薬
ニチレイ
ヒストファイン シンプルステイン MAX-PO(M)(商標)を用いる。尚、当該試薬は、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGヤギポリクローナル抗体(Fab’)を4 μg/mL含有している。
・一次抗体陰性コントロール
マウスIgG(Vector Laboratories)を上記緩衝液で溶解し、2μg/mLとする。
・基質緩衝液
Tris[hydroxyl methyl]amino methane及びTris[hydroxyl methyl]amino methane chlorideを精製水で希釈し、調製する。
・発色基質
DAB(3-3’Diaminobendine tetrahydrochloride)を緩衝液(上記の基質緩衝液)で溶解し、0.2mg/mLとする。
過酸化水素水をメタノールで希釈し、1%とする。
・賦活化試薬:0.01Mクエン酸緩衝液(pH6.0)
クエン酸一水和物(0.36g)、クエン酸三ナトリウム二水和物(2.44g)を精製水に溶解し、1Lに調製する。
・洗浄液:PBS
リン酸水素二ナトリウム12水和物(2.90g)、リン酸二水素ナトリウム二水和物(0.296g)、塩化ナトリウム(8.5g)を精製水に溶解し、1Lに調整する。
1.操作方法
表2に操作手法の概要に示す。
検体組織スライドを脱パラフィン後、染色バット中で内因性ペルオキシダーゼブロッキング試薬に浸漬し、室温で30分間処理後、水洗する。標本の余分な水分を取り除き、賦活化試薬に浸漬し、5分間マイクロウェーブ処理する。処理後室温まで十分に冷却した後、水洗し、さらに洗浄液で洗浄する。標本の余分な水分を取り除き、ブロッキング試薬を組織切片に満遍なくいきわたる十分量滴下し、湿潤箱中で、室温30分間反応させる。標本の余分な水分を取り除き、一次抗体を十分量滴下し、湿潤箱中で室温1時間反応させた後、洗浄液で洗浄する(5分間、3回)。陰性コントロール用検体組織スライドには、一次抗体の代わりに一次抗体陰性コントロールを十分量滴下し、同様に処理する。標本の余分な水分を取り除き、ポリマー試薬を十分量滴下し、湿潤箱中で室温30分間反応させ、洗浄液で洗浄する(5分間3回)。標本の余分な水分を取り除き、検体に基質溶液を所定量滴下もしくは浸漬し、湿潤箱中、もしくは染色つぼ中で室温15分間反応させた後、洗浄液で洗浄する。標本を対比染色液(例:マイヤーのヘマトキシリン液)で染色した後、水洗する。アルコール系列で脱水して、キシレンで置換後、封入して鏡検に用いる。
検体組織スライド、ブロッキング試薬、一次抗体、一次抗体陰性コントロール、ポリマー試薬、基質溶液、精製水、洗浄液、対比染色液を機器の所定の位置に設置し、それぞれの試薬を所定時間、室温、湿潤状態で反応させる。検体の水分をアルコール、次いでキシレンで置換後、封入して鏡検に用いる。
観察は低倍率(対物4倍)で全体の染色状態を確認した後、検体組織中の腫瘍組織の中で、もっとも染色強度の高い部分について高倍率(対物10倍〜40倍)で行い、以下の基準に従ってスコア化する(図2)。
LAT1過剰発現:なし
染色パターン:腫瘍組織中の細胞膜にLAT1陽性を呈している細胞が認められない(図2a)。
b) スコア1
LAT1過剰発現:なし
染色パターン:腫瘍組織中の細胞膜にLAT1陽性を呈している細胞が複数個存在するが、染色強度が弱い(図2b)。
c) スコア2
LAT1過剰発現:なし
染色パターン:腫瘍組織中の細胞膜に中程度のLAT1陽性を呈している細胞が複数個存在する。染色強度はスコア1とスコア3の中間(図2c)。
d) スコア3
LAT1過剰発現:あり
染色パターン:腫瘍組織中の細胞膜に強度のLAT1陽性を呈している細胞が複数個存在し、それぞれの腫瘍細胞の細胞膜全体に鮮明なワイヤーループ状な染色が認められる(図2d)。
判定キットの品質を確認するためコントロールスライド(LAT1タンパク過剰発現を示す前立腺がん由来培養細胞、PC3株)について、以下の方法に基づいてa)特異性試験、b)感度試験及びc)同時再現性試験を行った。尚、本試験例を含む以後の試験例においては、基本的には、上述した《製造例2》及び《判定法》に記載の条件で実施したが、これらと異なる条件で実施した点に関しては別途特記した。
製造例2に係る判定キットを用いて、コントロールスライド(前立腺がん由来培養細胞PC3のパラフィン切片標本)を上記「操作方法」に従い染色し、判定キット中の一次抗体と一次抗体陰性コントロールの染色結果を比較・検討した。染色結果は、上記「判定法」の基準に基づき、スコア0〜スコア3でスコア化した(表3)。いずれの試験検体キットにおいても、コントロールスライドの結果にスコア3が得られた(図3)。
製造例2に係る判定キットを用いて、判定キット中の一次抗体を比較対照として、試験検体キット中の一次抗体溶液を抗体希釈液で8倍希釈したものを用いて、管理検体スライド及びコントロールスライドを上記「操作方法」に従い染色し、試験検体キット中の一次抗体と一次抗体を8倍希釈したものを用いて染色し、結果を比較・検討した。染色結果は、上記「判定法」の基準に基づき、スコア0〜スコア3でスコア化した(表4、表5)。所定濃度の一次抗体溶液を使用した場合、コントロールスライドの細胞膜にはスコア3の染色強度が認められたが、所定濃度の一次抗体を抗体希釈液で8倍希釈したものを使用した場合、コントロールスライドの細胞膜の染色強度はスコア1に減退した(図4)。
製造例2に係る判定キットを用いて、管理用検体組織スライドとコントロールスライドそれぞれ3枚ずつを上記「操作方法」に従い同時に染色し、染色結果を比較・検討した。染色結果は、「判定法」の基準に基づき、スコア0〜スコア3でスコア化した(表6)。3枚のコントロールスライドはいずれも同様な染色態度を示し、同様のスコアであった(図5)。
製造例2に係る判定キットを用いて、今回の標的臓器である前立腺がん由来の培養細胞PC3株及び前立腺がんの生検材料標本(いずれもホルマリン固定、パラフィン包埋の切片標本)での染色性の確認試験を行った。尚、参考までに、LAT1が高発現していることが知られている大腸がんの手術摘出材料についても確認試験を行った。なお、本試験例は、基本的には、上述した《製造例2》及び《判定法》に記載の条件で実施したが、一次抗体の濃度のみ以下の表7に示す条件で試験を行った。
次に、臨床医学的見地からの証明が必要と考え、本テストの開発を試みた。前立腺がんの手術を受けた症例について、手術前に採取した生検標本を用いてLAT1の免疫組織化学染色を行った。
実施施設は実施機関Aと実施機関Bの二施設であり、その症例数の内訳は下表のとおりである。それぞれの施設より、別個に症例を抽出し、試験に供した。
細胞針検査により採取された前立腺がん生検材料のホルマリン固定・パラフィン包埋標本
試験実施施設2施設において、前立腺がんと診断されて1982年〜2000年の間に細胞針検査により採取され、保存されているホルマリン固定・パラフィン包埋病理組織標本のうち、病理組織学的診断によってstageII〜stageIVとされた症例を無作為に抽出し、本キットを用いて、上記「操作方法」により、免疫組織化学染色を実施した。染色結果は上記「判定法」に従って観察、スコア化し、染色結果(LAT1スコア)と5年生存率の関連性についてKaplan-Meierの方法を用いて解析した。
1)症例数と染色結果の内訳
前立腺がんと診断された症例について、製造例2に係る判定キットを用いて、腫瘍細胞におけるLAT1タンパクの発現を免疫組織化学染色により調査したところ、症例により、スコア0〜3までの染色が認められた。両施設におけるLAT1スコアの内訳を以下の表に示す。尚、全症例の結果を、スコア別に分類すると、実施機関A及びBともに、スコア0の症例が最も多く、スコア3症例は少ない傾向にあった。また、その染色態度もほぼ同様であり、製造例2に係る判定キットによる染色に施設間誤差はないと判断した。
1)の症例について、両施設の結果を統合し、腫瘍細胞におけるLAT1タンパクの発現度合い(LAT1スコア)と症例患者の生存期間との関係をKaplan-Meierの方法(ノンパラメトリック法)を用いて生存分析を行った結果、LAT1高発現(LAT1スコア3)と低発現群(LAT1スコア0〜2)の間に有意な差が認められた。具体的には、スコア3とスコア0の間でP<0.001の結果を得た。これらの結果から、LAT1スコア3においては、約半数例が5年以内に死亡に転帰しており、スコア0の症例群との間に有意差が認められた(図7)。
1)の全症例について、染色の強さに加え、染色範囲を3段階に分けて観察し、focal(10%以下)、partial(10〜30%)、diffuse(30%以上)と分類した。それぞれの観察結果について、スニークロープの方法に基づいてLAT1スコアに染色範囲に応じた係数(focalは1、partialは2、diffuseは3)を乗じ、LAT1スコアを変換した(図8)。それらの変換したLAT1スコアについて、2)と同様にKaplan-Meierの方法を用いて生存分析を行った結果、LAT1スコアと生存期間の間により明確な差が認められた。この結果から、スコア4以上において、スコア0との間に有意な差が認められ、特にスコア6以上の症例では、90%が5年以内に死亡に転帰した。このように、LAT1スコアの強度に発現範囲係数(focal=1、partial=2、diffuse=3)を乗じて変換したLAT1スコア(0〜9)を用いた生存分析を行うことにより、さらに精度の高い診断が可能になることが示唆された。
同様の症例について、前立腺がんの特異マーカーとして知られているPSAとの比較を行った。今回用いた171症例のうち、手術直前のPSA値が記録されていた127症例について、PSA値4ng/mLと10ng/mLをカットオフ値として、Kaplan-Meireの方法を用いて生存解析を行って、LAT1スコアによる結果と比較した。いずれのカットオフ値においても、PSA値では、低発現群と高発現群の間に有差は認められなかった。同様の症例を用いて行ったLAT1スコアの解析では、スコア0群とスコア3群の間に有意差が認められた(図9)。
症例群の中で、手術時の情報から、病理学的TMN分類及び手術時の転移の有無に関する情報を基にstage分類を行い、Kaplan-Meireの生存分析を行った。Stage分類では、5年生存率との間に有意差が認められなかったのに対し、LAT1分類では、いずれのStageにおいても、スコア0群とスコア3群の間で、有意差が認められた(図10)。
本試験で使用した生検材料の病理診断結果報告書より、診断時のGleasonsスコアを調査し、情報が得られた154症例について、Kaplan-Meire法により生存解析を行い、LAT1スコアによる結果と比較したところ、両者においては、ほぼ同等の結果を得た(図11)。このように、前立腺がん診断において最も重要視されているGleasonsスコア分類の結果(P=0.0008)と同等の有用性を示した。
本臨床試験結果より、LAT1の発現は前立腺がん患者の生存期間と有意に逆相関しており、その有用性は、Gleasons スコアに匹敵することが示唆された。また、現在前立腺がんのマーカーとして用いられているPSA及びがんの進行度を示すとされているStage分類と比較して、がんの悪性度診断においては、優れた結果を得た。
Claims (2)
- hLAT1の1〜52位のタンパクを抗原として得られた抗ヒトLAT1モノクローナル抗体。
- 請求項1記載の抗ヒトLAT1モノクローナル抗体を含む、免疫組織化学染色による前立腺がんの悪性度判定用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012234768A JP2013063978A (ja) | 2012-10-24 | 2012-10-24 | 抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012234768A JP2013063978A (ja) | 2012-10-24 | 2012-10-24 | 抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008556938A Division JPWO2008096416A1 (ja) | 2007-02-06 | 2007-02-06 | 前立腺がんの悪性度判定キット及びその方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015022687A Division JP2015134778A (ja) | 2015-02-06 | 2015-02-06 | 抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013063978A true JP2013063978A (ja) | 2013-04-11 |
Family
ID=48187831
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012234768A Withdrawn JP2013063978A (ja) | 2012-10-24 | 2012-10-24 | 抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2013063978A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015134778A (ja) * | 2015-02-06 | 2015-07-27 | ジェイファーマ株式会社 | 抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット |
WO2018181483A1 (ja) * | 2017-03-31 | 2018-10-04 | 松浪硝子工業株式会社 | スライドグラス及びスライドグラスの製造のための溶液 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000157286A (ja) * | 1998-09-03 | 2000-06-13 | Japan Science & Technology Corp | アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子 |
JP2001523454A (ja) * | 1997-11-19 | 2001-11-27 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | ヒト2−19タンパク質分子類似体z219c |
JP2003033192A (ja) * | 2002-05-13 | 2003-02-04 | Human Genome Sciences Inc | Gタンパク質副甲状腺ホルモンレセプターhltdg74 |
JP2005265531A (ja) * | 2004-03-17 | 2005-09-29 | Tama Tlo Kk | 中性アミノ酸トランスポーターによる癌の検出法、及びそのためのキット |
-
2012
- 2012-10-24 JP JP2012234768A patent/JP2013063978A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001523454A (ja) * | 1997-11-19 | 2001-11-27 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | ヒト2−19タンパク質分子類似体z219c |
JP2000157286A (ja) * | 1998-09-03 | 2000-06-13 | Japan Science & Technology Corp | アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子 |
JP2003033192A (ja) * | 2002-05-13 | 2003-02-04 | Human Genome Sciences Inc | Gタンパク質副甲状腺ホルモンレセプターhltdg74 |
JP2005265531A (ja) * | 2004-03-17 | 2005-09-29 | Tama Tlo Kk | 中性アミノ酸トランスポーターによる癌の検出法、及びそのためのキット |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015134778A (ja) * | 2015-02-06 | 2015-07-27 | ジェイファーマ株式会社 | 抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット |
WO2018181483A1 (ja) * | 2017-03-31 | 2018-10-04 | 松浪硝子工業株式会社 | スライドグラス及びスライドグラスの製造のための溶液 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101976219B1 (ko) | 유방암의 바이오마커 | |
AU2007256391B2 (en) | Use of protein SATB2 as a marker for colorectal cancer | |
AU2009339802B2 (en) | RBM3 as a marker for malignant melanoma prognosis | |
JP5893037B2 (ja) | Brafv600eに特異的に結合する抗体を使用する癌の診断のための手段及び方法 | |
JPWO2008096416A1 (ja) | 前立腺がんの悪性度判定キット及びその方法 | |
EP2318841B1 (en) | Anln protein as an endocrine treatment predictive factor | |
JP2013063978A (ja) | 抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット | |
EP2107375A1 (en) | Uses of WARS protein in cancer prognostics | |
JP4560314B2 (ja) | 中性アミノ酸トランスポーターによる癌の検出法、及びそのためのキット | |
US20110003854A1 (en) | Breast cancer treatment and treatment prediction | |
JP2015134778A (ja) | 抗ヒトlat1モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット | |
WO2016143356A1 (en) | Kit and method for determining prostate cancer malignancy | |
WO2018222069A1 (ru) | Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата | |
EP2055717A1 (en) | Prognostic method | |
JP2022076410A (ja) | 悪性末梢神経鞘腫瘍の診断マーカー | |
EP2293070A1 (en) | Means and methods for ovarian cancer prognosis | |
JP2022032795A (ja) | 子宮内膜癌の発症の予測方法 | |
CN105372425A (zh) | 前列腺癌的恶性程度判定试剂盒和其方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140430 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140627 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140702 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20141007 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20150217 |