DE69637155T2

DE69637155T2 - Addressine der schleimhaut und der blutgefässe und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69637155T2
Application number: DE69637155T
Authority: DE
Inventors: Michael J. Lexington BRISKIN; Douglas J. Revere RINGLER; Dominic Sudbury PICARELLA; Walter Boston NEWMAN
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-12
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2016-02-13
Also published as: EP0808367B1; PT808367E; CA2212702A1; EP0808367A1; ATE366809T1; CA2212702C; WO1996024673A1; DE69637155D1; MX9706049A; JPH10513365A; DK0808367T3; ES2290955T3; NZ303523A; JP4205162B2; AU4986296A

Description

Hintergrund der Erfindung
Das Homing von Lymphozyten aus der Zirkulation zu den lymphoiden Geweben und Migration zu Entzündungsstellen wird durch Interaktion mit in postkapillaren Venolen exprimierten Rezeptoren, einschließlich hochendondothelialer Venolen (HEV, high endothelial venules), die sich in sekundären lymphoiden Geweben finden, reguliert (z. B. mesenteriale Lymphknoten, Peyer-Plaques (PP) (Bevilacqua, M.P., Annu. Rev. Immunol., 11: 767–804 (1993); Butcher, E.C., Cell, 67: 1033–1036 (1991); Picker, L.J., et. al., Annu. Rev. Immunol.,10: 561–591 (1992), und Springer, T.A., Cell, 76: 301–314 (1994)). In der Natur sind diese Interaktionen gewebespezifisch.
Eine Entzündung (z. B. chronische Entzündung) ist gekennzeichnet durch Infiltrieren des betroffenen Gewebes durch Leukozyten, wie etwa Lymphozyten, Lymphoblasten und mononukleare Phagozyten. Die beachtenswerte Selektivität, mit welcher Leukozyten bevorzugt zu zahlreichen Geweben sowohl bei normaler Zirkulation als auch bei Entzündung migrieren, resultiert aus einer Reihe von adhäsiven und aktivierenden Ereignissen, die mehrere Rezeptor-Ligand-Interaktionen involvieren, wie dies von Butcher und weiteren vorgeschlagen wird (Butcher, E.C., Cell, 67: 1033–1036 (1991); von Adrian, U.H., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7538 (1991); Mayadas, T.N., et. al., Cell, 74: 541 (1993); Springer, T.A., Cell, 76: 301 (1994)). Als ein erster Schritt findet eine transiente Rolling-Interaktion zwischen Leukozyten und Endothel statt, die aus der Interaktion von Selektinen (und in einigen Fällen durch α4-Integrine) mit deren Kohlenhydrat-Liganden resultiert. Diese Interaktion, die sich durch das Rolling in der Flussrichtung kennzeichnet, kann durch bekannte Verfahren untersucht werden (Lawrence, M.B. und T.A. Springer, Cell, 65: 859 (1991); WO 92/21746 , Springer et. al. (10. Dezember 1992)). Daraufhin folgen Aktivierungsereignisse, die durch Chemoattraktoren wie etwa Chemokine und deren Rezeptoren, die Aktivierung von Integrin-Haftfähigkeit verursachen und die Richtung der Migration von Leukozyten mittels Gefäßwänden beeinflussen, vermittelt werden. Solche sekundären Signale wiederum lösen die feste Adhäsion von Leukozyten am Endothel mittels Leukozyt-Integrinen und deren endothelialen Liganden (Ig-ähnliche Rezeptoren und die EZM) und anschließende transendotheliale Migration von der Zirkulation durch das vaskuläre Endothel aus.
Bei sekundären lymphoiden Geweben, wie etwa Peyer-Plaques (PPs) und Lymphknoten (z. B. periphere Lymphknoten (PLK), werden Trafficking und Homing von Leukozyten durch Interaktionen von Homing-Rezeptoren an der Oberfläche von Leukozyten mit endothelialen Zellen, welche die post-kapillaren Venolen, genauer gesagt hochendotheliale Venolen (HEV) liniieren (Gowans, J.L. und E.J. Knight, Proc. R. Soc. Lond., 159: 257 (1964)) reguliert. Als vaskuläre Addressine bezeichnete Rezeptoren, die an der Oberfläche von Endothelzellen vorhanden sind, regulieren die Migration und anschließende Extravasation von Lymphozyten-Teilmengen. Die vaskulären Addressine zeigen eingeschränkte Expressionsmuster und diese gewebespezifische Expression stellt einen wichtigen Beitrag zu der Spezifität von Leukozyten-Trafficking dar (Picker, L.J. und E.C. Butcher, Annu. Rev. Immunol., 10: 561–591 (1992); Berg, E.L., et. al., Cellular and molecular mechanisms of inflammation, 2: 111 (1991); Butcher, E.C., Cell, 67: 1033–1036 (1991)).
Bei dem mukosalen, vaskulären Addressin MAdCAM-1 (Mukosales Addressin-Zelladhäsionsmokelül-1, Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1) handelt es sich um einen Adhäsionsrezeptoren für Lymphozyten der Immunglobulin-Superfamilie, der sich von VCAM-1 und ICAM-1 unterscheidet. MAdCAM-1 wurde bei der Maus als ein ~60 kD-Glykoprotein identifiziert, das an Stellen der Extravasation von Lymphozyten selektiv exprimiert wird. Insbesondere wurde von Expression von MAdCAM-1 in vaskulären Endothelzellen von mukosalen Geweben, einschließlich mit Darm assoziierten Geweben oder lymphoiden Organen wie etwa Peyer-Plaques und Venolen der Lamina propria von Dünn- und Dickdarm und der Milch produzierenden Brustdrüse berichtet, jedoch nicht in peripheren Lymphknoten. MAdCAM-1 spielt bei der Bindung von Lymphozyten an Peyer-Plaques eine wichtige Rolle. (Streeter, P.R., et. al., Nature, 331: 41–46 (1988); Nakache, M., et. al., Nature, 337: 179–181 (1989); Picker, L.J., et. al., Annu. Rev. Immunol., 10: 561–591 (1992); Briskin, M.J., et. al., Nature, 363: 461 (1993); Berg, E.L., et. al., Nature, 366: 695–698 (1993); Berlin, C., et. al., Cell, 74: 185–195 (1993)). MAdCAM-1 kann durch entzündungsfördernde Stimuli in vitro induziert werden (Sikorski, E.E., et. al., J. Immunol., 151: 5239–5250 (1993)).
MAdCAM-1 bindet spezifisch das Lymphozyten-Integrin α4β7 (ebenfalls als LPAM-1 (Maus), α4β7p (Maus) bezeichnet), bei dem es sich um einen Rezeptor für das Homing von Lymphozyten handelt, der bei Homing zu Peyer-Plaques eine Rolle spielt (Berlin, C., et. al., Cell, 80: 413–422 (1994); Berlin, C., et. al., Cell, 74: 185–195 (1993), und Erle, D.J., et. al., J. Immunol., 153: 517–528 (1994)). Im Gegensatz zu VCAM-1 und Fibronektin, die sowohl mit α4β1 als auch mit α4β7 interagieren (Berlin, C., et. al., Cell, 74: 185–195 (1993); Strauch, U.S., et. al., Int. Immunol., 6: 263 (1994)), handelt es sich bei MAdCAM-1 um einen selektiven Rezeptor für α4β7.
Bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) wie etwa zum Beispiel Colitis ulcerosa und Morbus Crohn kann es sich um eine schwächende und progressive Erkrankung handeln, die eine Entzündung des Magen-Darm-Trakts implizieren. Die Symptome dieser allein in den Vereinten Staaten geschätzte zwei Millionen Personen betreffenden Erkrankung schließen abdominalen Schmerz, Krämpfe, Diarrhö und rektale Blutung ein. Behandlungen von CED schließen entzündungshemmende Medikamente (wie etwa Corticosteroide und Sulfasalazin), immunosuppressive Medikamente (wie etwa 6-Mercaptopurin, Cyclosporin und Azathioprin) und chirurgische Behandlung (wie etwa Kolektomie) ein. Podolsky; New Engl. J. Med., 325: 928–937 (1991) und Podolsky, New Engl. J. Med., 325: 1008–1016 (1991).
In einigen Studien wurde angenommen, dass das Zelladhäsionsmolekül ICAM-1 das Rekrutieren von Leukozyten an entzündlichen Stellen mittels Adhäsion an Liganden auf Leukozytenoberflächen, d. h. Mac-1 oder LFA-1, vermittelt (Springer, Nature, 346: 425–434 (1990)). Darüber hinaus wurde von dem vaskulären Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1), welches das α4β1-Integrin (VLA-4) erkennt, berichtet, dass es bei dem in vivo Rekrutieren von Leukozyten eine Rolle spielt (Silber et. al., J. Clin. Invest. 93: 1554–1563 (1994)). Es wurde vorgeschlagen, dass CED durch das Blockieren der Interaktion von ICAM-1 mit LFA-1 oder Mac-1 oder jener von VCAM-1 mit α4β1 behandelt werden können (z. B. WO 93/15764 ). Allerdings ist wahrscheinlich, dass diese therapeutischen Ziele bei entzündlichen Prozessen in mehreren Organen eine Rolle spielen und eine funktionelle Blockade könnte systemische Immunstörungen verursachen.
Im Gegensatz zu VCAM-1 und ICAM-1 wird MAdCAM bevorzugt in dem Magen-Darm-Trakt exprimiert, bindet das α4β7-Integrin, das sich auf Lymphozyten findet, und nimmt an dem Homing dieser Zellen zu mukosalen Stellen, wie etwa Peyer-Plaques in der Darmwand, teil (Hamann et. al., Journal of Immunology, 152: 3282–3293 (1994)). Die Verwendung von Inhibitoren der Bindung von MAdCAM an den Rezeptor, nämlich α4β7, bei der Behandlung von Erkrankungen wie etwa CED wurde nicht vorgeschlagen. Darüber hinaus wurde MAdCAM-1 des Menschen oder von Primaten weder kloniert noch charakterisiert, obwohl humane α4- und β7-Gene und -Proteine identifiziert wurden (Yuan et. al., Int. Immunol., 2: 1097–1108 (1990); Erle et. al., J. Biol. Chem., 266: 11009–11016 (1991); Bevilacqua, M.P., Annu. Rev. Immunol., 11: 767–804 (1993); Springer, T.A., Cell, 76: 301–314 (1994)).
WO 94/13312 bezieht sich auf das Bereitstellen von gereinigten Nucleinsäuren und Proteinen von Säugern, die für mukosale Addressine codieren. Die Proteine, Nucleinsäuren und Fragmente derselben dienen einer Vielzahl von Zielsetzungen bei dem Modulieren von Homing-Interaktionen von Leukozyten und mukosalem Gewebe. Zusätzlich können die Proteinfragmente als Antigene für das Produzieren von Antikörpern, die für bestimmte Domänen des mukosalen Addressins spezifisch sind, dienen, während die Nucleinsäuren als Sonden für Antisense-Herstellung zwecks Einbringens in Wirte, die zu der DNA-Quelle allogen oder xenogen sein können, für die Expression des Proteins und dergleichen verwendet werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine isolierte Nucleinsäure, die für folgendes codiert:

(a) ein natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten, oder
(b) eine funktionelle Variante, welche α4β7-Integrin bindet; oder
(c) ein funktionelles Fragment eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, welche α4β7-Integrin bindet und zumindest eine Immunglobulin-ähnliche Domäne umfasst,

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Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein isoliertes Protein, das die Aminosäuresequenz von folgendem aufweist:

(a) einem natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, oder
(b) einer funktionellen Variante derselben, welche α4β7-Integrin bindet; oder
(c) eines funktionellen Fragments eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, welches α4β7-Integrin bindet und mindestens eine Immunglobulin-ähnliche Domäne umfasst,

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Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein isoliertes, natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten, das eine oder mehr als eine Funktion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Bindung an α4β7-Integrin und der Vermittlung von Zelladhäsion aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Produktion eines Proteins der Erfindung, wobei das Verfahren das Halten einer Wirtszelle, welche eine für das Protein codierende rekombinante Nucleinsäure enthält, unter für die Expression die Nucleinsäure geeigneten Bedingungen, wodurch das Protein produziert wird, umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment desselben, welches ein natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten bindet.
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment der Erfindung für die Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments.
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Detektion eines ausgewählten MAdCAM in einer Probe, das folgendes umfasst:

(a) Kontaktieren einer Probe mit einem Antikörper oder einem Antigenbindenden Fragment desselben, welches ein natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten bindet, unter Bedingungen, die für spezifische Bindung des Antikörpers oder des Fragments daran geeignet sind; und
(b) Detektieren der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper oder dem Fragment und MAdCAM.

Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Detektion oder zur Identifizierung eines Liganden von MAdCAM oder eines an ein MAdCAM von Primaten bindenden Stoffes, welches das Zusammenbringen eines zu untersuchenden Stoffes mit einem isolierten Protein der Erfindung unter Bedingungen, die für die Bindung des Liganden daran geeignet sind, und Detektieren oder Messen der Bildung eines Komplexes zwischen dem Stoff und dem Protein umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Detektion eines Inhibitors der Bindung eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten an einen Liganden desselben, das folgendes umfasst:

(a) Zusammenbringen eines zu untersuchenden Stoffes mit einem Liganden des MAdCAM von Primaten und einer Zusammensetzung, die isoliertes und/oder rekombinantes MAdCAM von Primaten der Erfindung umfasst, unter Bedingungen, die für die Bindung des Liganden daran geeignet sind; und
(b) Detektieren oder Messen der Bindung zwischen dem MAdCAM von Primaten und dem Liganden, wobei ein im Vergleich mit einer geeigneten Kontrolle geringere Bindung anzeigt, dass der Stoff ein Inhibitor ist.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Proteine oder Polypeptide, die hierin ebenfalls als isolierte und/oder rekombinante (z. B. im Wesentliche reine) MAdCAMs von Primaten bezeichnet werden. Bei einer Ausführungsform kann MAdCAM von Primaten selektiv an Zellen, die α4β7-Integrin exprimieren, insbesondere Lymphozyten, binden. Die rekombinanten Proteine der vorliegenden Erfindung, einschließlich Varianten, können in Wirtszellen, wie hierin beschrieben, produziert werden. Zusätzlich können mit den Proteinen der vorliegenden Erfindung reaktionsfähige Antikörper unter Verwendung eines MAdCAM von Primaten oder einer Variante desselben als Immunogen produziert werden. Solche Antikörper oder Fragmente derselben sind bei Therapie-, Diagnose- und Forschungsanwendungen zweckmäßig. Zum Beispiel können die Antikörper bei der Reinigung und der Studie von MAdCAMs, der Identifizierung von Zellen, die MAdCAM exprimieren, und der Detektion oder Quantifizierung von MAdCAM in einer Probe verwendet werden.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf isolierte und/oder rekombinante (z. B. im Wesentlichen reine) Nucleinsäuren, die für ein MAdCAM von Primaten wie etwa MAdCAMs des Menschen, codieren. Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf rekombinante Nucleinsäure-Konstrukte, wie etwa Plasmide oder retrovirale Vektoren, die eine Nucleinsäure enthalten, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung oder einen Teil desselben codiert. Die Nucleinsäuren und Konstrukte können für die Produktion von rekombinanten MAdCAMs von Primaten verwendet werden. Bei einer weiteren Ausführungsform codiert die Nucleinsäure für eine Antisense-Nucleinsäure, die mit einer zweiten, für ein MAdCAM von Primaten codierenden Nucleinsäure hybridisieren kann und welche die Expression des Proteins hemmen kann (z. B. bei Einbringen in Zellen).
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung abgedeckt sind Verfahren zur Identifizierung von Liganden und/oder Inhibitoren (z. B. Antagonisten) von MAdCAM-Funktion. Zum Beispiel kann MAdCAM von Primaten, einschließlich Varianten, in Assays, die dergestalt sind, dass Antagonisten, welche die Bindung von MAdCAM an den Liganden, nämlich α4β7-Integrin, blockieren, identifiziert werden, verwendet werden.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf Verfahren für Therapie, einschließlich einem Verfahren zur Behandlung eines Lebewesens, das an einer Erkrankung leidet, die mit Rekrutieren von Leukozyten im Magen-Darm-Trakt oder weiteren Geweben als ein Ergebnis von Bindung von Leukozyten an mit Darm assoziiertem Endothel, welches das Molekül MAdCAM exprimiert, assoziiert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Stoffes oder einer Verbindung wie etwa einem Antikörper, welche/r die Bindung von Leukozyten an endotheliales MAdCAM hemmt, an ein Lebewesen (z. B. einen Säuger, wie etwa einen Primaten) umfasst. Bei dem Antikörper handelt es sich bevorzugt um einen monoklonalen, chimären und/oder humanisierten Antikörper oder um ein Antigen-bindendes Fragment desselben und er hemmt die Adhäsion an das MAdCAM exprimierende Endothel von Leukozyten, die ein die β7-Kette enthaltendes Integrin (wie etwa α4β7) exprimieren. Bei einer Ausführungsform weist der monoklonale Antikörper oder das Antigenbindende Fragment desselben die antigene Spezifität für einen monoklonalen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FIB 21, FIB 30, FIB 504 und ACT-1 auf. Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen wie etwa, nicht jedoch darauf beschränkt, Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Pouchitis, Zöliakie, mikroskopische oder Kollagencolitis und eosinophile Gastroenteritis können gemäß dem beanspruchten Verfahren behandelt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Illustration der Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1), die aus Subklonen von cDNA Klon 4, der für MAdCAM-1 des Menschen codiert, bestimmt wird und der Sequenz des vorhergesagten Proteins, das durch das offene Leseraster codiert ist (MadCAM-1; SEQ ID NO: 2). Das vorhergesagte Signalpeptid und die vorhergesagte transmembrane Region sind fett unterstrichen. Cysteinreste der beiden Ig-ähnlichen Domänen sind eingerahmt, da es sich um potentielle N-gebundene Glykosilierungsstellen handelt. Die Muzin-Domäne, welche die PPDTTS (Q/P) E Repetition bestehend aus 71 Aminosäuren enthält, ist durch eine dünne, fett gedruckte Linie eingefasst.
2 ist eine Illustration der Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 3), die aus Subklonen von cDNA Klon 20, der für MAdCAM-1 des Menschen codiert, bestimmt wird und der Sequenz des vorhergesagten Proteins, das durch das offene Leseraster codiert ist (MAdCAM-1; SEQ ID NO: 4). Das vorhergesagte Signalpeptid und die vorhergesagte transmembrane Region sind fett unterstrichen. Cysteinreste der beiden Ig-ähnlichen Domänen sind eingerahmt, das es sich um potentielle N-gebundene Glykosilierungsstellen handelt. Die Muzin-Domäne, welche die PPDTTS (Q/P) E Repetition bestehend aus 47 Aminosäuren enthält, ist durch eine dünne, fett gedruckte Linie eingefasst.
3 ist eine Illustration der Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 5), die aus Subklonen von cDNA Klon 31D, der für MAdCAM-1 des Menschen codiert, bestimmt wird, und der Sequenz des vorhergesagten Proteins, das durch den offenen Leseraster codiert ist (MAd-CAM-1; SEQ ID NO: 6). Das vorhergesagte Signalpeptid und die vorhergesagte transmembrane Region sind fett unterstrichen. Cysteinreste der beiden Ig-ähnlichen Domänen sind eingerahmt. Die Muzin-Domäne, die eine einzige PPDTTS (Q/P) E Repetition enthält, wird durch eine dünne, fett gedruckte Linie eingefasst.
Die 4A–4B sind Histogramme, welche die selektive Bindung von mit MAdCAM-1 des Menschen transfizierten Zellen an Lymphozyten, die α4β7 exprimieren, illustrieren. 4A illustriert die Ergebnisse eines Versuchs, bei dem RPMI 8866-Zellen (0,5 × 10⁶/Well), die α4β7-Bindung (und nicht α4β1) exprimieren, an CHO/P-Zellen, die murines MAdCAM-1 oder MAdCAM-1 des Menschen exprimieren, banden, jedoch nicht an mit VCAM-1 des Menschen transfizierte CHO/P-Zellen oder an mit pcDNA-3 transfizierte CHO/P-Zellen. 4B illustriert die Ergebnisse eines Versuchs, bei dem mit VCAM-1 des Menschen transfizierte CHO/P-Zellen an Jurkat-Zellen (die hohe Niveaus von α4β1 exprimieren) banden, jedoch bei der Bindung an mit murinem MAdCAM-1 oder MAdCAM-1 des Menschen transfizierte CHO/P-Zellen oder an mit pcDNA-3 transfizierte CHO/P-Zellen als Kontrolle scheiterten. Die Bindung wird als die Anzahl an gebundenen RPMI 8866-Zellen pro CHO/P-Zelle (4A) oder gebundenen Jurkat-Zellen pro CHO/P-Zelle (4B) als Durchschnitt von zumindest vier Feldern (10 × Objektiv) ± Standardfehler gezeigt. Bindungsreaktionen schlossen Kontroll-IgG, anti-α4β7 (monoklonaler Antikörper ACT-1) oder anti-murines MAdCAM-1 (monoklonaler Antikörper MECA-367) wie angezeigt ein.
5 ist ein Histogramm, das illustriert, dass von den Klonen 4 und 20 codiertes MAdCAM-1 des Menschen RPMI 8866-Zellen bindet und dass die Bindung durch den ACT-1 Antikörper gehemmt wird. Wie ersichtlich, repräsentieren die Balken einen Durchschnitt von vier Feldern aus einem einzigen Versuch plus Standardabweichungen.
6 ist eine Illustration der abgeleiteten Domänen-Strukturen von murinem MAdCAM-1 und MAdCAM-1 des Menschen. Die zwei N-terminalen, durch Disulfidbindungen (angezeigt durch Schleifen) gebundenen Immunglobulin-Domänen, die in Zelladhäsion impliziert sind, transmembrane Regionen und ein cytoplasmatischer Schwanz sind in murinen Proteinen und Proteinen von Makaken und des Menschen vorhanden. MAdCAM-1 des Menschen weist einen längeren cytoplasmatischen Schwanz auf. Eine Repetition von 8 Aminosäuren, die sich in der Muzin-Domäne findet, ist in 4 bis 8 Kopien in humanen Isoformen vorhanden, tritt jedoch nur einmal in der murinen Isoform und jener von Makaken auf.
7A und 7B sind graphische Illustrationen von histologischen Werten von entzündlicher Aktivität und Epithelverletzung des linken (Colon descendens) und des rechten (Colon ascendens) Colons von Mäusen, denen 10 Tage lang in ihrem Trinkwasser DSS gegeben wurde. Es werden drei Gruppen von Mäusen gezeigt, bestehend aus Gruppen, die jeweils einen irrelevanten Ratte IgG2a-Antikörper, FIB 21- oder FIB 30-Antikörper erhielten.
8 ist ein Graph der γ Impulse pro Minute (cpm) (± 1 SEM) als eine Prozentzahl der gesamten eingegeben Impulse von Mäusen, denen 10 Tage lang DSS im Trinkwasser gegeben wurde. Die sechs Gruppen bestanden aus Negativkontrollen mit Gabe von Wasser allein, Positivkontrollen mit Gabe von DSS allein, Testgruppen mit Gabe von irrelevantem Ratte IgG2a-Antikörper, FIB 21, MECA-367 oder FIB 21 mit MECA-367.
9 ist ein Graph, der die histologischen Werte (± 1 SEM) der Zottenfusion, die aus Jejunum-Biopsie-Proben von Weißbüschelaffen erhalten werden, vor und an dem 14. Tag der Behandlung mit 2 mg/kg/Tag monoklonalem Antikörper ACT-1 darstellt.
10 ist ein Graph, der die histologischen Werte (± 1 SEM) der Zottenatrophie, die aus Jejunum-Biopsie-Proben von Weißbüschelaffen erhalten werden, vor und an dem 14. Tag der Behandlung mit 2 mg/kg/Tag monoklonalem Antikörper ACT-1 darstellt.
11 ist eine Illustration der Stuhlkonsistenz von Tieren (Lisztaffen), die an Colitis leiden und mit Antikörper ACT-1 behandelt wurden.
12 ist eine Illustration der histologisch untersuchten entzündlichen Aktivität von Tieren (Lisztaffen), die an Colitis leiden und mit Antikörper ACT-1 behandelt wurden.
13 ist ein Diagramm, welches das Versuchsprotokoll der Behandlung mit Antikörper ACT-1 von Lisztaffen, die an chronischer Colitis leiden, illustriert.
14 ist ein Graph, der die therapeutische Wirkung auf die Stuhlkonsistenz der Verabreichung von Antikörper ACT-1 (-⦁-) oder eines irrelevanten, Isotyp-spezifischen Antikörpers (-O-) an Lisztaffen, die an chronischer Colitis leiden, illustriert.
15 ist ein Histogramm, das die therapeutische Wirkung von Immuntherapie mit ACT-1 auf die entzündliche Aktivität des Colons bei Lisztaffen, die an chronischer Colitis leiden und mit Antikörper ACT-1 oder einem irrelevanten, monoklonalen Kontroll-Antikörper behandelt werden, illustriert. Jeder Balken repräsentiert das Mittel der absoluten Änderung des Werts entzündlicher Aktivität ± 1 SEM innerhalb einer Behandlungsgruppe, der für jedes Tier durch Vergleichen des Werts zu einem bestimmten Zeitpunkt mit Wert desselben Tieres an Tag 0 berechnet wird.
16 ist ein Histogramm, das die absoluten Anzahlen von α4β7+ Lymphozyten in dem peripheren zirkulatorischen Pool bei Lisztaffen, die an Colitis leiden und mit Antikörper ACt-1 behandelt werden, illustriert. Jeder Balken repräsentiert das Mittel (± 1 SEM) der Konzentration an α4β7⁺ Zellen im Blut, wie durch ACT-1 detektiert.
17A–17E sind Graphen, welche die Ergebnisse einer FACS-Analyse, welche die spezifische Färbung von HuT 78-Zellen mit MAdCAM-Ig Chimären zeigt, illustriert. Überstände von COS-Zellen, die transient mit einem Konstrukt aus MAdCAM des Menschen und Ig-Chimäre transfiziert wurden (aufgrund vier unabhängiger Transfektionen), wurden mit HuT 78-Zellen in Gegenwart von 2 mM Mn⁺⁺ inkubiert und gebundenes Chimär wurde unter Verwendung eines für humanes IgG1 spezifischen, Phycoerythrin-konjugierten Antikörpers detektiert. 17A, Medien Kontrolle; 17B–17C, Überstände von mit Klon 21 transfizierten Zellen (die gesamte extrazelluläre Domäne von MAdCAM des Menschen umfassend); 17D–17E, Überstände von mit Klon 38 transfizierten Zellen (die zwei N-terminalen Ig-Domänen von MAdCAM des Menschen umfassend). Die Bindung nach Vorinkubation von Zellen mit Medium allein (rechts). Die Bindung wurde durch Vorinkubation von Zellen mit anti-β7 MAb FIB 504 gehemmt (links).
18 ist ein Graph, der den Unterschied bezüglich Körpergewicht von SCID-Mäusen, die mit 1 × 10⁶ CD45RB^hi T-Zellen (∎) rekonstituiert wurden, relativ zu Kontroll-SCID-Mäusen, die mit einer gleichen Anzahl an CD45RB^lo T-Zellen
abgeleitet von BALG/c-Milz, rekonstituiert wurden, zeigt. Mäuse als Rezipienten wurden in wöchentlichen Intervallen gewogen, um das Fortschreiten der Erkrankung zu messen.
19 ist ein Histogramm, welches das stärkere Akkumulieren in dem Colon von intravenös injizierten ¹¹¹In-markierten Zellen des mesenterialen Lymphknotens bei SCID-Mäusen, die mit CD45RB^hi T-Zellen rekonstituiert wurden, verglichen mit dem Akkumulieren in Colon von SCID-Mäusen, die mit einer gleichen Anzahl von CD45RB^lo T-Zellen rekonstituiert wurden, und die Hemmung des Akkumulierens durch 2-wöchige Behandlung mit einer Kombination von anti-β7 (FIB 504) und monoklonalen Antikörpern anti-MAdCAM (MECA-367) illustriert. Die Ergebnisse wurden als Impulse pro Minute (CPM) in % im Colon, normalisiert auf CPM in der Milz und für den Hintergrund korrigiert, ausgedrückt.
20 ist ein Histogramm, das die vollständige Hemmung des Akkumulierens von ¹¹¹In-markierten Zellen (intravenös injiziert) in dem Colon von SCID-Mäusen durch 4-monatige Behandlung (ab dem Zeitpunkt der Rekonstitution) mit FIB 504, MECA-367 oder mit FIB 504 plus MECA-367 illustriert. Von links nach rechts: die mit CD45Rb^lo T-Zellen rekonstituierten SCID-Mäuse, die irrelevantes Isotyp-spezifisches Kontroll-Ratte IgG2a erhielten; die mit CD45RB^hi T-Zellen rekonstituierten SCID-Mäuse, die entweder irrelevantes Isotyp-spefzisches Kontroll-Ratte IgG2a, FIB 504, MECA-367 oder FIB 504 + MECA 376 erhielten.
21 ist ein Histogramm, das die Reduktion der Anzahl von CD4⁺ T-Zellen in dem Colon ascendens (rechts) oder dem Colon descendens (links) in SCID-Mäusen, die 14 Tage lang mit einer Kombination aus FIB 504 plus MECA-367 behandelt wurden, verglichen mit Mäusen, die mit einem Isotyp-spezifischen Kontroll-Ratte IgG2a Antikörper durch das Färbung von gefrorenen Bereichen des linken und rechten Colons mit einem für Maus CD4 spezifischen Ratte-Antikörper bestimmt behandelt wurden, illustriert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Proteine und Peptide
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf isolierte und/oder rekombinante (einschließlich z. B. im Wesentlichen reine) Proteine oder Polypeptide, die als MAdCAMs von Primaten (Mukosal Addressin Zelladhäsionsmoleküle, Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecules) und Varianten von MAdCAMs von Primaten bezeichnet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform weisen die isolierten und/oder rekombinanten Proteine der vorliegenden Erfindung zumindest eine Eigenschaft, Aktivität oder Funktion auf, die für MAdCAM von Primaten (wie hierin definiert) kennzeichnend ist/sind, wie etwa Bindungsfunktion (z. B. die Fähigkeit, an α4β7-Integrin zu binden) und/oder zelluläre Adhäsionsmolekül-Funktion (z. B. die Fähigkeit, zelluläre Adhäsion wie etwa α4β7-abhängige Adhäsion in vitro und/oder in vivo zu vermitteln) und/oder eine immunologische Eigenschaft wie hierin definiert. Zum Beispiel können manche Proteine der vorliegenden Erfindung selektiv an ein α4β7-Integrin binden und dadurch α4β7-abhängige, zelluläre Adhäsion an Zellen, die α4β7-Integrin tragen, wie etwa Leukozyten (insbesondere Lymphozyten wie etwa T- oder B-Zellen) in vitro und/oder in vivo vermitteln. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können Proteine der vorliegenden Erfindung heterotypische Zelladhäsion (z. B. von Endothelzellen an Leukozyten wie etwa Lymphozyten) vermitteln.
Bei einer weiteren Ausführungsform können Proteine der vorliegenden Erfindung ein α4β7-Integrin von Primaten derselben oder einer unterschiedlichen Primatenspezies binden und/oder zelluläre Adhäsionsmolekül-Funktion aufweisen (z. B. die Fähigkeit, zelluläre Adhäsion wie etwa α4β7-abhängige Adhäsion in vitro und/oder in vivo zu vermitteln). Zum Beispiel können wie hierin gezeigt MAdCAM-1 Proteine des Menschen und von Makaken, die in Säugetierzellen durch Expression von cDNA-Klonen produziert werden, selektiv an in Lymphozyten des Menschen vorhandenes α4β7-Integrin binden und als zelluläre Adhäsionsmoleküle, die in der Lage sind, selektive Adhäsion an Zellen, die das α4β7-Integrin tragen, zu vermitteln, wirken.
Bei auf hierin als „isoliert" Bezug genommenen Proteinen oder Polypeptiden handelt es sich um Proteine oder Polypeptide, die gereinigt wurden bis zu einem Zustand, unterhalb dessen sie in Säugetier-Zellen vorkommen. „Isolierte" Proteine oder Polypeptide schließen Proteine oder Polypeptide, die mittels hierin beschriebenen Verfahren, ähnlichen Verfahren oder weiteren geeigneten Verfahren erhalten wurden, einschließlich im Wesentlichen reiner Proteine oder Polypeptide, Proteine oder Polypeptide, die mittels chemischer Synthese (z. B. synthetische Peptide) oder durch Kombinationen von biologischen und chemischen Verfahren produziert wurden, und isolierte rekombinante. Proteine oder Polypeptide, ein. Die Proteine können in einem isolierten Zustand mit zumindest ungefähr 50 Gew.-%, bevorzugt zumindest ungefähr 75 Gew.-% und bevorzugter in im Wesentlichen reiner Form erhalten werden. Bei Proteinen oder Polypeptiden, auf die hierin als „rekombinant" Bezug genommen wird, handelt es sich um Proteine oder Polypeptide, die durch Expression rekombinanter Nucleinsäuren produziert werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „MAdCAM von Primaten" auf natürlich vorkommende oder endogene MAdCAM-Proteine von Primaten, auf Proteine, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mit derjenigen eines natürlich vorkommenden oder entsprechenden endogenen MAdCAMs von Primaten identisch ist (z. B. rekombinante Proteine) und auf funktionelle Varianten jedes der vorstehenden Proteine (z. B. funktionelle Fragmente und/oder Mutanten, die via Mutagenese und/oder rekombinante Techniken produziert werden). Wie hierin definiert schließt der Begriff dementsprechend reifes MAdCAM von Primaten, glykolisierte oder nicht glykolisierte MAdCAM-Proteine, polymorphe oder allele Varianten und weitere Isoformen von MAdCAM von Primaten (z. B. durch alternatives Spleißen oder weitere zelluläre Prozesse produziert) und funktionelle Fragmente ein.
Natürlich vorkommende oder endogene MAdCAM-Proteine von Primaten schließen Wildtyp-Proteine wie etwa reifes MAdCAM, polymorphe oder allele Varianten und weitere Isoformen, die bei Primaten natürlich auftreten (z. B. humane oder weitere, nicht-humane Primaten wie etwa Makaken, Lisztaffen), ein. Solche Proteine können aus einer Quelle, die natürlich MAdCAM von Primaten produziert, gewonnen werden. Diese Proteine und MAdCAM-Proteine von Primaten weisen dieselbe Aminosäuresequenz wie ein entsprechendes natürlich vorkommendes oder endogenes MAdCAM von Primaten auf, auf das durch den Namen des entsprechenden Primaten Bezug genommen wird. Handelt es sich bei dem entsprechenden Primaten zum Beispiel um einen Menschen, wird das Protein als ein MAdCAM-Protein des Menschen bezeichnet (z. B. ein rekombinantes humanes MAdCAM, das in einer geeigneten Wirtszelle produziert wird).
„Funktionelle Varianten" von MAdCAMs von Primaten schließen funktionelle Fragmente, funktionelle mutante Proteine und/oder funktionelle Fusionsproteine ein. Im Allgemeinen schließen Fragmente oder Teile von MAdCAM von Primaten, die von der vorliegenden Erfindung abgedeckt werden, jene ein, die eine Deletion (d. h. eine oder mehr als eine Deletion) einer Aminosäure (d. h. einer oder mehr als einer Aminosäure) verglichen mit dem reifen MAdCAM von Primaten (wie etwa N-terminale, C-terminale oder interne Deletion) aufweisen. Ebenfalls vorgesehen sind Fragmente oder Teile, in denen lediglich benachbarte Aminosäuren deletiert wurden oder in denen nicht benachbarte Aminosäuren verglichen mit reifem MAdCAM von Primaten deletiert wurden.
Im Allgemeinen schließen Mutanten oder Derivate von MAdCAMs von Primaten, die von der vorliegenden Erfindung abgedeckt werden, natürliche oder künstliche Varianten, die sich durch Addition, Deletion und/oder Substitution von einem oder mehr als einem benachbarten oder nicht benachbarten Aminosäurerest unterscheiden, oder modifizierte Polypeptide, in denen ein oder mehr als ein Rest modifiziert ist, und Mutanten, die einen oder mehr als einen modifizierten Rest umfassen, ein. Bei bevorzugten Mutanten handelt es sich um natürliche oder künstliche Varianten von MAdCAM von Primaten, die sich durch Addition, Deletion und/oder Substitution von einem oder mehr als einem benachbarten oder nicht benachbarten Aminosäurerest unterscheiden.
Ein „funktionelles Fragment oder funktioneller Teil", ein „funktioneller Mutant" und/oder ein „funktionelles Fusionsprotein" eines MAdCAMs von Primaten nimmt Bezug auf ein isoliertes und/oder rekombinantes Protein oder Polypeptid, das zumindest eine Eigenschaft, Aktivität und/oder Funktion, die für ein MAdCAM von Primaten kennzeichnend ist/sind, aufweist, wie etwa Bindungsfunktion (z. B. die Fähigkeit, an α4β7-Integrin zu binden) und/oder zelluläre Adhäsionsmolekül-Funktion (z. B. die Fähigkeit, zelluläre Adhäsion wie etwa α4β7-abhängige Adhäsion in vitro und/oder in vivo zu vermitteln) und/oder zumindest eine immunologische Eigenschaft eines MAdCAMs von Primaten aufrecht erhält.
Wie hierin verwendet, handelt es sich bei einem Protein, Polypeptid oder Oligopeptid, das „zumindest eine immunologische Eigenschaft" eines MAdCAM von Primaten aufweist, um ein Protein, Polypeptid oder Oligopeptid, das (a) durch zumindest einen Antikörper mit einer ausgewählten Epitopspezifität, der an ein natürlich vorkommendes oder endogenes MAdCAM von Primaten oder ein Protein, das dieselbe Aminosäuresequenz wie das natürlich vorkommende oder endogene MAdCAM von Primaten (z. B. humanes MAdCAM-1) aufweist, bindet, gebunden ist, und/oder (b) bei dem es sich um ein Immunogen handelt, das in der Lage ist, bei einem geeigneten Tier die Bildung eines Antikörpers mit einer ausgewählten Epitopspezifität, der an ein natürlich vorkommendes oder endogenes MAdCAM von Primaten oder an ein Protein, das dieselbe Aminosäuresequenz wie das natürlich vorkommende oder endogene MAdCAM von Primaten aufweist, bindet, zu induzieren. Zum Beispiel kann ein geeignetes Fragment mit einem Antikörper, der gegen isoliertes MAdCAM von Primaten erzeugt wurde und/oder mit demselben reaktionsfähig ist, kreuzreagieren.
Geeignete Fragmente oder Mutanten können durch Screenen identifiziert werden. Zum Beispiel können die N-terminalen, C-terminalen oder internen Regionen des Proteins schrittweise deletiert werden und das resultierende Protein oder Polypeptid kann unter Verwendung eines geeigneten Bindungs- oder Adhäsions-Assays, wie etwa einem hierin beschriebenen Assay, gescreent werden. Dort, wo das resultierende Protein in dem Assay Aktivität anzeigt, handelt es sich bei dem resultierenden Protein („Fragment") um ein funktionelles Protein. Informationen bezüglich der Struktur und Funktion von murinem MAdCAM und weiteren Adhäsionsmolekülen und von wie hierin gezeigt MAdCAMs von Primaten liefern eine Grundlage für das Unterteilen von MAdCAM von Primaten in funktionelle Domänen (siehe unten).
Der Begriff deckt ebenfalls Fusionsproteine, die ein MAdCAM von Primaten (z. B. reifes MAdCAM-1 des Menschen) als einen ersten Anteil, gebunden an einen zweiten Anteil, der nicht in dem in der Natur gefundenen MAdCAM von Primaten vorkommt, umfassen. Somit kann es sich bei dem zweiten Anteil um eine Aminosäure, ein Oligopeptid oder ein Polypeptid handeln. Der erste Anteil kann sich an einer N-terminalen Position, einer C-terminalen Position oder im Inneren des Fusionsproteins befinden. Bei einer Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein ein MAdCAM des Menschen oder einen Teil desselben als den ersten Anteil und einen zweiten Anteil, der eine Linkersequenz und einen Affinitäts-Liganden umfasst (z. B. ein Enzym, ein Antigen, ein Epitop-Tag).
Bei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Fusionsprotein um ein Hybrid-Immunglobulin, wie etwa ein Hybrid, das einen MAdCAM-Anteil von Primaten, der an seinem C-Ende mit dem N-Ende eines Immunglobulin-Anteils fusioniert ist (z. B. eine oder mehr als eine konstante Region von Immunglobulin, bevorzugt von Primatenursprung), wie etwa jene, die gemäß Capon et. al., US Patente Nr. 5,428,130 und 5,225,538 , deren Lehren hierin durch Bezugnahme in ihrer Vollständigkeit inkorporiert sind, hergestellt wurden. Das Hybrid-Immunglobulin umfasst ein Fusionsprotein oder ein Polypeptid, das zumindest einen Teil einer Immunglobulinkette und bevorzugt zumindest eine vollständige Immunglobulin-Domäne (z. B. CH1, Gelenkregion) enthält. Es wurden weitere Beispiele für „Immunadhäsine" berichtet (Watson, S.R., et. al., Nature, 349: 164–167 (1991); Martin, S., et. al., J. Virol., 67: 3561–3568 (1993); Staunton, D.E., et. al., J. Exp. Med., 176: 1471–1476. (1992); Capon, D.J., et. al., Nature, 337: 525–531 (1989); Jakubowski et. al., J. Immunol., 155: 938–946 (1995)). Zum Beispiel können ein Fusionsprotein, das ein MAdCAM von Primaten (z. B. eines Menschen) vollständig oder teilweise umfasst, und eine konstante Region einer schweren oder einer leichten Immunglobulinkette oder einen Teil derselben hergestellt werden (z. B. durch Herstellung einer Nucleinsäure, die für das Fusionsprotein codiert). Typischerweise wird die Fusion so konstruiert, dass das C-terminale Ende des MAdCAM an das N-terminale Ende der konstanten Region des Immunglobulins gebunden ist. Allerdings können Fusionsproteine, bei denen das N-terminale Ende des MAdCAM an das C-terminale Ende der konstanten Region des Immunglobulins gebunden ist, hergestellt werden. Bevorzugt wird ein Teil von MAdCAM von Primaten verwendet, der für die Bindung an einen Liganden (z. B. α4β7–Integrin) ausreichend ist, wie etwa die vollständige extrazelluläre Domäne oder ein Teil, der die zwei N-terminalen Immunglobulin-Domänen umfasst, in denen die transmembrane Region deletiert ist (siehe z. B. Beispiel 3).
Es kann eine Vielzahl von Hybrid-Immunglobulinmolekülen produziert werden (z. B. monomere, homodimere, heterodimere, homotetramere, heterotetramere), abhängig von der Art der ausgewählten konstanten Region und dem in dem Fusionspolypeptid verwendeten Teil (z. B. die konstante Region einer leichten Kette, die konstante Region einer schweren Kette (wie etwa die aus IgG, IgA, IgD, IgE oder IgM erhaltenen konstanten Regionen γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, δ, ε und μ) oder Teile derselben) und abhängig davon, ob sie untereinander in multimerer Form angeordnet sind und/oder ob sie mit weiteren Hybrid-Immunglobulinen oder Immunglobulinketten angeordnet sind (siehe Capon et. al., US Patente Nr. 5,428,130 und 5,225,538 ). Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein eine vollständige konstante Region einer schweren Kette oder zumindest eine funktionell aktive Gelenkregion, CH2- und CH3-Domäne. Eine besondere konstante Region (z. B. IgG1), Variante oder Teile derselben können für maßgeschneiderte Effektor-Funktion ausgewählt werden. Zum Beispiel kann eine mutierte konstante Region (Variante) in ein Fusionsprotein inkorporiert sein, um die Bindung an Fc-Rezeptoren zu minimieren (Beispiel 3: Winter et. al., GB 2,209,757 B ; und Morrison et. al., WO 89/07142 ), und/oder um ein Komplement zu fixieren ( WO 94/29351, 22. Dezember 1994), etc.
Beispiele für „MAdCAM-Proteine von Primaten" schließen Proteine ein, die durch eine MAdCAM-1 Nucleinsäure des Menschen oder von Makaken der vorliegenden Erfindung codiert sind, wie etwa ein Protein, das eine dargelegte oder im Wesentlichen in 1 (SEQ ID NO: 2), in 2 (SEQ ID NO: 4) oder in 3 (SEQ ID NO: 6) dargelegte Aminosäuresequenz und funktionelle Teile derselben aufweist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist ein MAdCAM von Primaten oder eine Variante eine Aminosäuresequenz auf, die zu einem in 1 (SEQ ID NO: 2), in 2 (SEQ ID NO: 4) oder in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Protein zumindest ungefähr 55 % Ähnlichkeit, bevorzugter zumindest ungefähr 75 % Ähnlichkeit und noch bevorzugter zumindest ungefähr 90 % Ähnlichkeit aufweist.
Struktur von MAdCAM
Bei murinem MAdCAM-1, einem Element der Immunglobulin-Supergen-Familie, handelt es sich um ein Multi-Domänen-Molekül, das sowohl Immunglobulinassoziierte als auch Muzin-ähnliche Sequenzen umfasst (Briskin, M.J., et. al., Nature, 363: 461 (1993)). Wie in 6 angezeigt, enthält die murine Form zwei Aminoterminale, Immunglobulin-ähnliche Domänen, die zu den Domänen der Ig-ähnlichen Adhäsionsrezeptoren, nämlich ICAM-1 und VCAM-1, homolog sind und bei der Integrinbindung eine Rolle spielen. Die dritte (membranproximale) Immunglobulin ähnliche Domäne teilt die Homologie mit einem weiteren Element der mit der Mucosa in Zusammenhang stehenden Immunglobulin-Superfamilie, nämlich IgA, obgleich sie mit Adhäsionsrezeptoren dieser Klasse nicht in Zusammenhang steht. Zusätzlich zu den drei Immunglobulin-ähnlichen Domänen weist murines MAdCAM-1 zwischen der ersten und der dritten Ig-ähnlichen Domäne eine Muzin-ähnliche Domäne, die reich an Serin/Threonin ist, auf. Diese strukturellen Elemente lassen den Schluss zu, dass MAdCAM-1 mehr als eine Funktion in den Zelladhäsionskaskaden ermöglicht und kürzlich durchgeführte Studien mit murinem MAdCAM-1 untermauern, dass MAdCAM-1 sowohl bei Selektin- als auch bei Integrinbindung eine Rolle spielt (Moore, K.L., et. al., J. Cell. Biol., 118: 445 (1992); Bargatze, R.F., et. al., Immunity, 3: 99–108 (1995)). Ebenfalls unter diesem Blickpunkt wurde berichtet, dass murines MAdCAM-1 bei Expression in mesenterialen Lymphknoten L-Selektin bindende Kohlenhydrate, die mit dem Addressin-Epitop von peripheren Knoten, nämlich MECA-79, assoziiert sind, aufweisen können (Berg, E.L., et. al., Nature, 366: 695 (1993)).
Wie hierin beschrieben, weisen MAdCAM-1 des Menschen und von Makaken zwei Immunglobulin-ähnliche (Ig-ähnliche) Domänen auf, die zu den zwei Aminoterminalen, Immunglobulin-ähnlichen, Integrin bindenden Domänen von murinem MAdCAM-1 (1–3 und 6) homolog sind. Allerdings ist die Ähnlichkeit von Sequenzen innerhalb der Region, die zu der Muzin/IgA-Domäne von murinem MAdCAM-1 homolog ist, weniger offensichtlich. Die membranproximalen Regionen der Rezeptoren des Menschen und von Makaken zeigen (im Vergleich miteinander oder mit murinem MAdCAM-1) bezüglich der Länge der Muzin-ähnlichen Sequenz und dem Mangel an membranproximaler Ig-(IgA-ähnlichen) Domäne außergewöhnliche Variation.
Es wurden zwei Isoformen von MAdCAM-1 des Menschen identifiziert, die Polymorphismus von einzelnen Aminosäuren und Variation bei der Anzahl von Kopien in einer Repetition in der Muzin-Region, die reich an Serin/Threonin/Prolin ist, aufzeigen. Diese zwei Isoformen scheinen in Genom-DNA codiert zu sein, was allele Variation und/oder alternatives Verarbeiten dieser Sequenz nahelegt. Diese zwei Isoformen können als alternativer Mechanismus für die Regulation von α4β7 Bindungsaffinität und/oder das Vorhandensein von Kohlenhydraten für die Bindung von Selektin dienen. Das Vorhandensein dieser Ig-ähnlichen Domänen und Muzin-Domänen in hierin beschriebenen MAdCAMs von Primaten stimmt ebenfalls damit überein, dass dieselben sowohl bei Bindung von Selektin- als auch bei Bindung von Integrin eine Rolle spielen.
Kürzlich durchgeführte Domain-Swapping-Versuche bei murinem MAdCAM-1 haben gezeigt, dass, obwohl Domäne Eins von MAdCAM-1 α4β7 schwach binden kann, die Adhäsion bei Fehlen von starker Integrin-Aktivierung gering ist. Die zwei Aminoterminalen, Ig-ähnlichen Domänen (die zu den Domänen von ICAM-1 und VCAM-1 ähnlich sind) sind ausreichend für α4β7 Bindungsaktivität in einer von der Aktivierung abhängigen Art und Weise, vergleichbar mit der vom Wildtyp murines MAdCAM-1.
Ein kurzes Motiv (GLDTSL), das in Domäne Eins von murinem MAdCAM-1 vorhanden ist, wird aufrecht erhalten und ist für Bindung von Integrin in weiteren, Ig-ähnlichen Rezeptoren, einschließlich Domäne Eins von ICAM-1, ICAM-2 und ICAM-3 und Domänen 1 und 4 von VCAM-1, erforderlich (Staunton, D.E., Cell, 52: 925–33 (1988); Staunton, D.E., et. al., Nature, 339: 61 (1989); Osborn, L., et. al., Cell, 59: 1203 (1989); Fawcett, J., et. al., Nature, 360: 481 (1992)). Diese Sequenz, nämlich G-(I/L)-(D/E)-(T/S)-(P/S)-L, befindet sich zwischen β-Faltblättern c und d dieser Integrin bindenden Domänen. Das Motiv GLDTSL fand sich in dem hier gekennzeichneten MAdCAM von Primaten.
Die Mutagenese von E34 (Glu³⁴) in diesem Motiv von Domäne 1 von ICAM-1 (oben unterstrichen) und von D40 (Asp⁴⁰) in VCAM-1 (oben fett gedruckt) hat jeweils tiefgreifende Wirkung auf die Bindung von LFA-1 und α4β1 (Osborn, L., et. al., J. Cell. Biol, 124: 601–608 (1994); Renz, M.E., et. al., J. Cell. Biol., 125: 1395–1406 (1994); Staunton, D.E. et. al., Cell, 61: 243–254 (1990); Vonderheide, R.H., et. al., J. Cell. Biol., 125: 215–222 (1994)). Zu einem noch kürzer zurück gelegenen Zeitpunkt wurde ein Fragment von VCAM-1, das die zwei N-terminalen Domänen umfasst, Kristallstrukturbestimmung unterzogen (Jones, E.Y., et. al., Nature, 373: 539–544 (1995); Wang, J-H, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92: 5714–5718 (1995)). Das aufrecht erhaltene Motiv in VCAM-1 (QIDSPL) scheint dem N-terminalen Bereich der CD-Schleife der ersten Ig-Domäne in einer Position, die als leicht zugänglich für Integrine gilt, stark ausgesetzt zu sein.
In diesem Motiv von murinem MAdCAM-1 beseitigt eine Substitution von Nukleotid, was bei Aminosäure 61 zu einer Änderung von Leucin zu Arginin (L61-R61) führt, Interaktionen von MAdCAM-1 mit verbleibenden Lymphozyten, die α4β7 exprimieren. Daher macht murines MAdCAM-1 ebenfalls dieses aufrecht erhaltene Aminosäuremotiv, nämlich GLDTSL, in der vom berechneten vorausgesagten CD-Schleife seiner N-terminalen Domäne für Bindung seines Integrin-Liganden, nämlich α4β7, erforderlich.
Vergleiche der cDNA Klone 4 und 20 von MAdCAM des Menschen (1 und 2) offenbarten, dass die Amino-terminalen 225 Aminosäuren in den Klonen 4 und 20 identisch sind. Diese Region umfasst eine vorhergesagte hydrophile Leader-Sequenz oder Signalsequenz von 18 Aminosäuren und zwei Immunglobulin-ähnliche Domänen. Diese Region kann mit murinem MAdCAM-1 und MAdCAM-1 von Primaten eingestellt werden und zeigt die folgenden, aufrecht erhaltenden Merkmale: (1) ein vorhergesagtes Signalpeptid (in den humanen Proteinen identisch und zu den murinen Signalpeptiden und den Signalpeptiden von Makaken ähnlich); (2) zwei Paare von Cysteinresten in der ersten Ig-ähnlichen Domäne, wobei die Cysteine jedes Paares durch 3 Aminosäuren getrennt sind; (3) eine Sequenz von neun Aminosäuren (die das Motiv „LDTSL" enthält) in der vorhergesagten C-D-Schleife der Ig-ähnlichen Domäne 1 und die als eine allgemeine Integrin-Erkennungsstelle (identisch in jedem Klon von Primaten) impliziert ist und (4) eine uncharakteristisch große, zweite Immunglobulin-ähnliche Domäne. Die Größe der zweiten Ig-ähnlichen Domäne mit ungefähr 70 Aminosäuren zwischen Cysteinresten könnte dieselbe als eine Domäne von Typ „V" (variabel) klassifizieren, im Gegensatz zu den Domänen von Typ 02 (konstant), die sich typischerweise in den Ig-ähnlichen Adhäsionsrezeptoren finden (Hunkapiller, T., et. al., Adv. in Immunol., 44: 1–62 (1989); Williams, A.F., et. al., Annu. Rev. Inununol., 6: 381–405 (1988)). Innerhalb dieser Domäne findet sich eine verlängerte C'-E-Schleife, die negativ geladene Reste im Überschuss enthält, was jedem Klon von MAdCAM-1 von Primaten, von murinem MAdCAM-1 und von MAdCAM-1 des Menschen gemein ist, was bei damit in Zusammenhang stehenden Adhäsionsrezeptoren jedoch nicht zu sehen ist.
Die nächste, in den Klonen 4 und 20 gefundene Region ist aufgrund der Prävalenz von Serin-, Threonin- und Prolinresten (69 % bei Klon 4 und 76 % bei Klon 20) (in 1 und 2 eingerahmt) zu der Muzin-Domäne von murinem MAdCAM-1 analog. Diese Region, obgleich sie in Aminosäurezusammensetzung zu murinem MAdCAM-1 ähnlich ist, unterscheidet sich stark von murinem MAdCAM-1. Daher erscheint es wichtiger, das Aufrechterhalten der Integrin bindenden, Ig-ähnlichen Domänen auszuwählen als das Aufrechterhalten der Muzin-Sequenzen auszuwählen. Die MAdCAM-1 Domäne des Menschen weist bei Klon 4 eine Länge von 71 Aminosäuren und bei Klon 20 eine Länge von 47 Aminosäuren auf. Diese Region enthält ebenfalls zwei Polymorphismen: (1) einen Polymorphismus bei Aminosäure 240, bei dem es sich bei Klon 4 um Prolin (P) und bei Klon 20 um Serin (S) handelt; und (2) einen Polymorphismus bei Aminosäure 242, bei dem es sich bei Klon 4 um Asparagin (N) und bei Klon 20 um Aspartat (D) handelt. Zusätzlich enthalten Muzin-Domänen des Menschen eine Repetition aus 8 Aminosäuren, die aus der Sequenz PPDTTS(Q/P)E besteht, die bei Klon 4 acht Mal und bei Klon 20 fünf Mal auftritt.
Da die humane Muzin-Domäne stark repetitiv ist, kann die Verkürzung von drei Repetitionen in Klon 20 bezüglich Klon 4 das Ergebnis von Prozessen wie etwa alternativem Spleißen oder Mutation (z. B. ein aberrierendes Rekombinationsereignis) sein, welche das Leseraster beibehalten, wobei ein Rezeptor erhalten wird, der bezüglich der Integrinbindung funktionell ist und angenommen wird, dass manche oder alle Muzin-Sequenzen für Integrinbindung unabkömmlich sind. Dementsprechend wurde gezeigt, dass die Ig-ähnlichen Domänen 1 und 2 von murinem MAdCAM-1 für die von Aktivierung abhängige Adhäsion an α4β7 ausreichend sind, wodurch angezeigt wird, dass murine Muzin-Sequenzen für Integrinbindung unabkömmlich sind. Ebenfalls von Interesse in diesem Zusammenhang ist, dass der isolierte Klon von Makaken den Großteil dieser isolierten Region nicht aufweist.
Die verbleibenden C-terminalen 110 Aminosäuren sind bei Klon 4 und 20 identisch: 47 Aminosäuren gehen einem vorhergesagten hydrophoben transmembranen Segment von 20 Aminosäuren voraus, gefolgt von einem cytoplasmatischen Schwanz von 43 Aminosäuren. Die 47 Aminosäuren, die unmittelbar C-terminal zu der Muzin-Region sind, befinden sich in einer entsprechenden Region zu der IgA-ähnlichen Ig-Domäne von murinem MAdCAM-1. Obwohl die Proteine des Menschen und von Makaken in dieser Region ähnlich sind, unterscheiden sie sich von murinem MAdCAM-1. Im Vergleich zu murinem MAdCAM-1 sind die Proteine des Menschen in dieser Region um 59 Aminosäuren kürzer und es mangelt ihnen an jedwedem Kennzeichen einer Ig-ähnlichen Domäne. Die transmembranen Domänen aller Rezeptoren sind ähnlich, doch der cytoplasmatische Schwanz ist bei MAdCAM-1 des Menschen (26 bei Primaten und 20 bei der Maus) wesentlich länger (43 Aminosäuren).
Verfahren zur Produktion rekombinanter Proteine
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Produktion eines MAdCAMs von Primaten oder einer Variante desselben (z. B. einen Teil). Rekombinante Proteinen können zum Beispiel durch die Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls, das für ein MAdCAM von Primaten oder eine Variante desselben zum Beispiel in einer geeigneten Wirtszelle codiert, erhalten werden.
Geeignete Konstrukte für die Expression eines MAdCAMs von Primaten oder einer Variante desselben sind ebenfalls vorgesehen. Die Konstrukte können in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden, und Zellen, die ein rekombinantes MAdCAM von Primaten oder eine Variante desselben exprimieren, können produziert und in Kultur gehalten werden. Solche Zellen sind für eine Vielzahl von Zielsetzungen zweckmäßig und können zum Beispiel in Adhäsionsassays (z. B. in einem Assay für das Screenen von Liganden und/oder möglichen Inhibitoren von MAdCAM-vermittelter Adhäsion), bei der Produktion von Protein für das Charakterisieren, Isolieren und/oder Reinigen (z. B. Affinitätsreinigung) und als Immunogene verwendet werden. Geeignete Wirtszellen können prokaryotisch sein, einschließlich bakterieller Zellen wie etwa E. coli, B. subtilis und/oder weiterer geeigneter Bakterien, oder dieselben können eukaryotisch sein, wie etwa Pilz- oder Hefezellen (z. B. Pichia pastoris, Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) oder es kann sich um weitere niedrigere eukaryotische Zellen und Zellen höherer Eukaryoten wie etwa jene von Insekten (z. B. Sf9 Zellen von Insekten) oder Säugern (z. B. Zellen aus Ovarien chinesischer Hamster (CHO), COS-Zellen, HuT 78-Zellen, 293-Zellen) handeln. (Siehe z. B. Ausubel, F.M. et. al., Hrsg. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und John Wiley & Sons Inc., (1993)). Bei einer Ausführungsform werden Wirtszellen verwendet, die in der Lage sind, membrangebundenes reifes Protein zu exprimieren. Bei einer weiteren Ausführungsform sind die Wirtszellen in der Lage, lösliches MAdCAM zu sekretieren (z. B. lösliches MAdCAM wie etwa MAdCAM, dem es an der C-terminalen transmembranen Region und dem cytosplasmatischen Schwanz mangelt).
Wirtszellen, die ein rekombinantes MAdCAM von Primaten oder Varianten desselben produzieren, können wie folgt produziert werden. Zum Beispiel kann eine Nucleinsäure, die für alle oder einen Teil der codierenden Sequenzen des erwünschten Proteins codiert, in einen Nucleinsäurevektor, z. B. einen DNA-Vektor, inseriert werden, wie etwa einem Plasmid, einem Virus oder einem weiteren geeigneten Replikon für Expression. Es ist eine Vielzahl von Vektoren erhältlich, einschließlich Vektoren, die als einzelne Kopie oder vielfache Kopie aufrecht erhalten werden, oder Vektoren, die in das Chromosom der Wirtszelle inkorporiert werden.
Die transkriptionalen und/oder translationalen Signale eines MAdCAM-1 Gens können verwendet werden, um die Expression zu lenken. Alternativ sind geeignete Expressionsvektoren für die Expression einer Nucleinsäure, die für alle oder einen Teil der codierenden Sequenz des erwünschten Proteins codiert, erhältlich. Geeignete Expressionsvektoren können eine Anzahl von Komponenten, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, einer oder mehr als einer der folgenden Komponenten enthalten: einen Replikationsursprung; ein auswählbares Markergen; ein oder mehr als ein Element zur Kontrolle der Expression, wie etwa ein Element zur Kontrolle der Translation (z. B. ein Promoter, ein Enhancer, ein Terminator) und ein oder mehr als ein Translationssignal, eine Signalsequenz oder eine Leader-Sequenz für Membran-Targeting oder Sekretieren (von Primaten oder von einer heterologen Primaten oder nicht-Primaten Spezies stammend). In einem Konstrukt kann eine Signalsequenz von dem Vektor, von der für das MAdCAM von Primaten codierenden Sequenz oder von einer weiteren Quelle bereitgestellt werden.
Für Expression in einer geeigneten Wirtszelle ist ein Promoter vorgesehen. Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein. In den Vektoren ist der Promotor funktionsfähig an eine Nucleinsäure, die für das MAdCAM von Primaten oder eine Variante desselben codiert, gebunden und in der Lage, die Expression des codierten Polypeptids zu lenken. Eine Vielzahl von geeigneten Promotoren für prokaryotische (z. B. lac-, tac-, T3-, T7-Promotoren für E. coli) und eukaryotische (z. B. Hefe-Alkohol-Dehydrogenase (ADH1), SV40, CMV) Wirte sind erhältlich.
Zusätzlich umfassen die Expressionsvektoren typischerweise einen auswählbaren Marker für das Auswählen von Wirtszellen, die den Vektor tragen, in dem Fall eines replizierbaren Expressionsvektors einen Replikationsursprung. Bei für Gene codierenden Produkten, die Resistenz gegenüber Antiobiotika oder Medikamenten verleihen, handelt es sich um auswählbare Marker und dieselben können in prokaryotischen (z. B. β-Lactamase-Gen (Resistenz gegenüber Ampillicin), Tet-Gen für Resistenz gegenüber Tetracyclin) und eukaryotischen Zellen (z. B. Resistenzgene gegenüber Neomycin (G418 oder Geneticin), gpt (Mycophenolsäure), Ampillicin oder Hygromycin) verwendet werden. Markergene von Dihydrofolatreduktase erlauben das Auswählen mit Methotrexat in einer Vielzahl von Wirten. Gene, die für das Genprodukt auxotropher Marker des Wirts (z. B. LEU2, URA3, HIS3) codieren, werden bei Hefe oftmals als auswählbare Marker verwendet. Verwendung von viralen Vektoren (z. B. Baculovirus) oder Phagen-Vektoren und Vektoren, die in der Lage sind, in das Genom der Wirtszelle zu integrieren wie etwa retrovirale Vektoren wurden ebenfalls beobachtet. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Zellen, die diese Expressionsvektoren tragen.
Zum Beispiel kann eine Nucleinsäure, die für ein MAdCAM von Primaten oder eine Variante desselben codiert, in den Vektor inkorporiert sein, funktionsfähig an ein oder mehr als ein Element zur Kontrolle von Expression gebunden sein und das Konstrukt kann in Wirtszellen eingebracht werden, die unter für Expression geeigneten Bedingungen gehalten werden, wobei das codierte Polypeptid produziert wird. Das Konstrukt kann durch ein geeignetes Verfahren in die ausgewählte Wirtszelle eingebracht werden (z. B. Transformation, Transfektion, Elektroporation, Infektion). Zur Produktion eines Proteins werden das Konstrukt umfassende Wirtszellen unter für Expression geeigneten Bedingungen gehalten (z. B. in Gegenwart von Inducer, geeigneten Medien, die mit angemessenen Salzen supplementiert sind, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Nahrungszusätzen, etc.). Das codierte Protein (z. B. MAdCAM-1 des Menschen) kann aus der Wirtszelle oder dem Medium isoliert werden.
Fusionsproteine können ebenfalls auf diese Art und Weise produziert werden. Zum Beispiel können manche Ausführungsformen produziert werden, indem eine cDNA von MAdCAM von Primaten oder ein Teil derselben in einen geeigneten Expressionsvektoren eingebracht wird, wie etwa Bluescript^®II SK+/(Stratagene), pGEX-4T-2 (Pharmacia), pcDNA-3 (Invitrogen) und pET-15b (Novagen). Das resultierende Konstrukt wird dann in eine geeignete Wirtszelle für Expression eingebracht. Nach der Expression kann das Fusionsprotein mittels einer geeigneten Affinitätsmatrix aus einem Zelllysat isoliert oder gereinigt werden (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et. al., Hrsg., Bd. 2, Beil. 26, S. 16.4.1–16.7.8 (1991)). Zusätzlich stellen Affinitätsmarkierungen ein Mittel für das Detektieren eines Fusionsproteins bereit. Zum Beispiel kann die Zelloberflächenexpression oder das Vorhandensein eines Fusionsproteins, das eine Antigen- oder Epitop-Affinitätsmarkierung umfasst, in einer bestimmten Zellfraktion mittels eines geeigneten Antikörpers detektiert werden.
Nucleinsäuren, Konstrukte und Vektoren
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf isolierte und/oder rekombinante Nucleinsäuren (einschließlich z. B. im Wesentlichen reine Nucleinsäuren), die Sequenzen aufweisen, welche wie hierin beschrieben für ein MAdCAM von Primaten oder für eine Variante desselben codieren.
Bei Nucleinsäuren, auf die hierin als „isoliert" Bezug genommen wird, handelt es sich um Nucleinsäuren, die von den Nucleinsäuren der Genom-DNA oder der zellulären RNA von deren Usprungsquelle abgetrennt sind (z. B. wie dies in Zellen oder in einer Mischung von Nucleinsäuren wie etwa einer Bibliothek zu finden ist) und dieselben können weiter verarbeitet worden sein. „Isolierte" Nucleinsäuren schließen Nucleinsäuren ein, die mittels hierin beschriebenen Verfahren, ähnlichen Verfahren oder weiteren geeigneten Verfahren gewonnen werden, einschließlich im Wesentlichen reiner Nucleinsäuren, durch chemische Synthese, Kombinationen von biologischen und chemischen Verfahren produzierten Nucleinsäuren und rekombinanten isolierten Nucleinsäuren (siehe z. B. Daugherty, B.L. et. al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. und J.S. Crowe, Gene, 101: 297–302 (1991)). Bei Nucleinsäuren, auf die hierin als „rekombinant" Bezug genommen wird, handelt es sich um Nucleinsäuren, die mittels rekombinanter DNA-Verfahren produziert wurden, einschließlich jener Nucleinsäuren, die durch Vorgänge erzeugt werden, die auf einem Verfahren der künstlichen Rekombination wie etwa der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und/oder Klonieren in einen Vektor unter Verwendung von Restriktionsenzymen beruhen. Bei „rekombinanten" Nucleinsäuren handelt es sich ebenfalls um diejenigen, die aus über die natürlichen Mechanismen von Zellen ablaufenden Rekombinationsereignissen resultieren, jedoch nach dem Einführen von Nucleinsäuren, die derart ausgestaltet sind, dass ein derartiges Rekombinationsereignis möglich und wahrscheinlich wird, ausgewählt werden.
Bei einer Ausführungsform weisen die Nucleinsäure oder ein Teil derselben, die/der für ein Protein oder ein Polypeptid codiert, zumindest eine Eigenschaft, Aktivität oder Funktion auf, die für ein MAdCAM von Primaten (wie hierin definiert) kennzeichnend ist/sind, wie etwa Bindungsfunktion (z. B. die Fähigkeit, an α4β7-Integrin zu binden) und/oder zelluläre Adhäsionsmolekül-Funktion (z. B. die Fähigkeit, zelluläre Adhäsion wie etwa α4β7-abhängige Adhäsion in vitro und/oder in vivo zu vermitteln) und/oder eine immunologische Eigenschaft wie hierin definiert.
Die vorliegenden Erfindung bezieht sich im Besonderen ebenfalls auf isolierte und/oder rekombinante Nucleinsäuren oder einen Teil derselben, die/der Sequenzen aufweisen/aufweist, die für MAdCAM-1 des Menschen oder von Makaken oder Varianten desselben codiert.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf isolierte und/oder rekombinante Nucleinsäuren, die durch folgendes gekennzeichnet sind:

(1) ihre Fähigkeit, (a) an eine Nucleinsäure, die für ein MAdCAM von Primaten codiert, wie etwa eine Nucleinsäure mit einer Nukleotidsequenz wie in 1 (SEQ ID NO: 1), in 2 (SEQ ID NO: 3) oder in 3 (SEQ ID NO: 5) dargelegt oder im Wesentlichen dargelegt; (b) an das Komplement einer Nucleinsäure gemäß (a); oder (c) an Teile von einer der vorstehenden (z. B. einen Teil, der das offene Leseraster umfasst) zu hybridisieren; oder
(2) ihre Fähigkeit, für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz eines MAdCAM von Primaten (z. B. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6) zu codieren; oder
(3) beide Kennzeichen.

Bei einer Ausführungsform teilt die Nucleinsäure zu jeder beliebigen der Nukleotidsequenzen, die in 1, in 2 oder in 3 gezeigt werden (jeweils SEQ ID NO: 1, 3 oder 5) oder zu einer der für MAdCAM codierenden Regionen derselben zumindest ungefähr 50 % Nukleotid-Ähnlichkeit. Bevorzugter teilt die Nucleinsäure zumindest ungefähr 75 % Nukleotidsequenz-Ähnlichkeit und noch bevorzugter zumindest ungefähr 90 % Nukleotidsequenz-Ähnlichkeit zu einer beliebigen der in 1, in 2 oder in 3 gezeigten Sequenzen (jeweils SEQ ID NO: 1, 3 oder 5) oder zu einer beliebigen der für MAdCAM codierenden Regionen derselben.
Isolierte und/oder rekombinante Nucleinsäuren, die diese Kriterien erfüllen, umfassen Nucleinsäuren mit Sequenzen, die mit Sequenzen von natürlich vorkommenden MAdCAMs von Primaten oder Varianten der natürlich vorkommenden Sequenzen identisch sind. Solche Varianten schließen Mutanten, die sich durch Addition, Deletion oder Substitution von einem oder mehr als einem Rest unterscheiden, modifizierte Nucleinsäuren, bei denen ein oder mehr als ein Rest modifiziert ist/sind (z. B. DNA- oder RNA-Analoga) und Mutanten, die einen oder mehr als einen modifizierten Rest umfassen, ein.
Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, einschließlich jener, die an eine ausgewählte Nucleinsäure wie oben beschrieben hybridisieren, können zum Beispiel unter hoch stringenten Bedingungen oder moderat stringenten Bedingungen detektiert oder isoliert werden. „Hoch stringente Bedingungen" und „moderat stringente Bedingungen" für das Hybridisieren von Nucleinsäuren werden auf den Seiten 2.10.1–2.10.16 (siehe im Besonderen 2.10.8–11) und den Seiten 6.3.1–6 in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et. al., Hrsg., Bd. 1, Beil. 26, 1991), deren Lehren hierin vollständig durch Bezugnahme inkorporiert sind, erläutert. Faktoren wie etwa Sondenlänge, Basenzusammensetzung, Mismatch zwischen den hybridisierenden Sequenzen in Prozent, Temperatur und Ionenstärke beeinflussen die Stabilität von Nucleinsäurehybriden. Somit können hoch oder moderat stringente Bedingungen empirisch bestimmt werden und hängen teilweise von den Kennzeichen der bekannten Nucleinsäure (z. B. DNA) und den weiteren Nucleinsäuren, die zwecks Hybridisieren an dieselben untersucht werden sollen, ab.
Isolierte und/oder rekombinante Nucleinsäuren, die sich durch ihre Fähigkeit (z. B. unter hoch oder moderat stringenten Bedingungen), (a) an eine Nucleinsäure, die für ein MAdCAM von Primaten (z. B. jene Nucleinsäuren, die in 1 (SEQ ID NO: 1), in 2 (SEQ ID NO: 3) und in 3 (SEQ ID NO: 5) dargestellt sind) codieren, (b) an das Komplement solcher Nucleinsäuren, oder (c) an einen Teil derselben zu hybridisieren, kennzeichnen, können ebenfalls für ein Protein oder ein Polypeptid, das zumindest eine Eigenschaft, Aktivität oder Funktion, die für ein MAdCAM von Primaten (wie hierin definiert) kennzeichnend ist/sind, wie etwa Bindungsfunktion (z. B. die Fähigkeit, an α4β7-Integrin zu binden) und/oder zelluläre Adhäsionsmolekül-Funktion (z. B. die Fähigkeit, zelluläre Adhäsion wie etwa α4β7 abhängige Adhäsion in vitro und/oder in vivo zu vermitteln) und/oder eine immunologische Eigenschaft wie hierin definiert, aufweist. Bevorzugte Nucleinsäuren weisen Längen von zumindest ungefähr 40 Nukleotiden, bevorzugter von zumindest ungefähr 50 und noch bevorzugter von zumindest ungefähr 75 Nukleotiden auf.
Die Bindungsfunktion eines MAdCAM von Primaten oder einer Variante desselben, das/die durch eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung codiert ist, kann mittels standardmäßiger Assays für Ligandenbindung (z. B. Assays, welche die Bildung eines Komplexes zwischen isoliertem und/oder rekombinantem MAdCAM und einem α4β7-Integrin kontrollieren) oder standardmäßiger Adhäsionsassays (z. B. Assays, bei denen die Adhäsion zwischen einer ersten, ein rekombinantes MAdCAM von Primaten exprimierenden Zelle und einer zweiten, ein α4β7-Integrin tragenden Zelle kontrolliert wird) oder weiteren geeigneten Verfahren detektiert werden. Bindungs- und/oder Adhäsionsassays oder weitere geeignete Verfahren können ebenfalls bei Vorgängen für das Identifizieren und/oder Isolieren von Nucleinsäuren, die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung (siehe z. B. Beispiel 1) codieren, verwendet werden. Die Antigen-Eigenschaften von Proteinen oder Polypeptiden, die durch Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung codiert sind, können mittels immunologischer Verfahren unter Einsatz von Antikörpern, die an ein MAdCAM von Primaten binden, wie etwa Immunoblot, Immunopräzipitation und Immunoassay (z. B. Radioimmunoassay, ELISA), bestimmt werden.
Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können bei der Produktion von Proteinen oder Polypeptiden verwendet werden. Zum Beispiel kann eine für ein MAdCAM von Primaten codierende Nucleinsäure (z. B. DNA) in zahlreiche Konstrukte und Vektoren, die für weiteres Manipulieren von Sequenzen oder für Produzieren des codierten Polypeptids in geeigneten Wirtszellen wie oben beschrieben geschaffen wurden, inkorporiert sein.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um eine Antisense-Nucleinsäure, die vollständig oder teilweise zu einem Zielmolekül, das einen Sense-Strang umfasst, komplementär ist und kann mit dem Zielmolekül hybridisieren. Bei dem Ziel kann es sich um DNA oder ihr RNA-Gegenstück handeln (d. h. bei T-Resten der DNA handelt es sich um U-Reste in dem RNA-Gegenstück). Bei Einbringen in eine Zelle kann die Antisense-Nucleinsäure die Expression des durch den Sense-Strang codierten Gens hemmen. Antisense-Nucleinsäuren können durch standardmäßige Techniken produziert werden.
Bei einer bestimmten Ausführungsform ist die Antisense-Nucleinsäure vollständig oder teilweise zu einer Ziel-Nucleinsäure komplementär und kann mit derselben hybridisieren, wobei die Ziel-Nucleinsäure an eine Nucleinsäure mit der Sequenz des Komplements des obersten Strangs, der in 1 (SEQ ID NO: 1), in 2 (SEQ ID NO: 3) oder in 3 (SEQ ID NO: 5) gezeigt wird, hybridisieren kann. Zum Beispiel kann die Antisense-Nucleinsäure zu einer Ziel-Nucleinsäure mit der in 1 (SEQ ID NO: 1), in 2 (SEQ ID NO: 3) oder in 3 (SEQ ID NO: 5) als der oberste Strang des offenen Leserasters gezeigten Sequenz oder zu einem Teil derselben komplementär sein, der ausreichend ist, um das Hybridisieren zu ermöglichen. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Antisense-Nucleinsäure vollständig oder teilweise zu einer Ziel-Nucleinsäure, die für ein MAdCAM von Primaten codiert, komplementär und kann mit derselben hybridisieren.
Die Nucleinsäuren können ebenfalls als Sonden (z. B. für Hybridisieren in situ) verwendet werden, um Zusammenhänge zwischen chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) (oder weiteren Zuständen) und stärkerer Expression von MAdCAM von Primaten in erkrankten Geweben zu untersuchen. Die Nucleinsäuren können ebenfalls als Sonden verwendet werden, um polymorphe oder allele Varianten, zum Beispiel in einer von einem Primaten gewonnenen Probe (z. B. entzündetes Gewebe), zu detektieren und/oder zu isolieren (z. B. durch Hybridisieren mit RNA oder DNA). Darüber hinaus kann das Vorhandensein oder die Häufigkeit einer bestimmten Variante in einer Probe/in Proben, die von einem oder mehr als einem erkrankten Primaten gewonnen wurde/n, verglichen mit einer Probe/Proben von normalem/n Primaten, anzeigen, dass ein Zusammenhang besteht zwischen chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) (oder weiteren Zuständen) und einer bestimmten Vatiante, was wiederum bei der Diagnose des Zustandes verwendet werden kann.
Wie in den Beispielen beschrieben, wurde ein für MAdCAM-1 von Makaken codierender cDNA-Klon durch Expressionsklonieren isoliert und die cDNA wurde als eine Sonde für das Screenen einer Bibliothek von humaner cDNA verwendet. Zwei unterschiedliche, für MAdCAM-1 des Menschen codierende Nucleinsäuren wurden isoliert und charakterisiert. Zusätzliche Gene oder cDNAs des Menschen, von Makaken oder weiteren Primaten können erhalten werden. Gemäß den hierin beschriebenen oder weiteren geeigneten Verfahren (z. B. Hybridisieren, PCR, Expressionsklonieren oder weitere geeignete Techniken) können zum Beispiel die hier beschriebenen Gene oder ausreichende Teile derselben, die entweder isoliert und/oder rekombinant oder synthetisch sind, als Sonden oder Primer für das Detektieren und/oder Gewinnen zusätzlicher Nucleinsäuren, die für MAdCAMs von Primaten oder Varianten derselben aus einer geeigneten Quelle wie etwa einer Bibliothek von Genom oder cDNA von Primaten codieren, verwendet werden.
Bei einer Ausführungsform können die für MAdCAM von Primaten codierenden Nucleinsäuren durch Verfahren wie etwa PCR-Amplifikation produziert werden. Zum Beispiel können geeignete Primer (z. B. ein Primer-Paar oder verschachtelte Primer) konzipiert werden, die eine Sequenz enthalten, die zu einem Teil einer cDNA von MAdCAM von Primaten wie hierin beschrieben komplementär oder im Wesentlichen komplementär ist. Zum Beispiel können Primer konzipiert werden, die zu dem 5'- oder 3'-Ende der codierenden Sequenz komplementär sind und/oder die codierende Sequenz flankieren. Solche Primer können in einer Polymerase-Kettenreaktion mit einer geeigneten Template-Nucleinsäure verwendet werden, um zum Beispiel für MAdCAM von Primaten codierende Nucleinsäure zu erhalten. Geeignete Templates schließen z. B. hierin beschriebene Konstrukte (wie etwa pcD3PMAd, pcD3HuMAd-4 oder pcD3HuMAd-20), eine cDNA-Bibliothek oder weitere geeignete Quellen von Primaten (z. B. des Menschen) für cDNA oder Genom-RNA ein. Primer können Teile enthalten, die zu den flankierenden Sequenzen des ausgewählten Templates, soweit erforderlich, komplementär sind.
Zusätzliche Gene oder cDNAs können verwendet werden, um MAdCAM von Primaten zu exprimieren, mit gemäß den hierin beschriebenen Zweckmäßigkeiten und dieselben können bei der Produktion von Konstrukten, Wirtszellen und Antikörpern unter Verwendung von hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden. Die hierin beschriebenen Lösungsansätze können bei weiteren Primaten angewandt werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Lösungsansätze, die für das Isolieren und Manipulieren von MAdCAM-1 von Makaken und des Menschen verwendet werden, um Vektoren und Wirtsstränge zu konstruieren und die für das Produzieren der Proteine und das Verwenden derselben, um Antikörper zu produzieren, etc. verwendet werden.
Therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls Antikörper vor, die (1) ein „MAdCAM von Primaten" in vitro und/oder in vivo binden können; und/oder die (2) eine Aktivität oder Funktion, die für ein „MAdCAM von Primaten" kennzeichnend ist, wie etwa Bindungsfunktion (z. B. die Fähigkeit, an α4β7-Integrin zu binden) und/oder zelluläre Adhäsionsmolekül-Funktion (z. B. die Fähigkeit, zelluläre Adhäsion wie etwa α4β7 abhängige Adhäsion in vitro und/oder in vivo zu vermitteln), hemmen können. Solche Antikörper schließen Antikörper ein, die ein MAdCAM des Menschen oder von Makaken, das durch cDNA Klon 4, cDNA Klon 20 oder cDNA Klon 31D codiert ist, binden können. Ebenfalls abgedeckt sind Antikörper, die ein natürlich vorkommendes oder ein endogenes MAdCAM von Primaten (z. B. MAdCAM des Menschen) binden können. Bevorzugt sind die Antikörper in der Lage, MAdCAM von Primaten in vitro und/oder in vivo selektiv zu binden (z. B. selektive Bindung an in mukosalem Gewebe und/oder Milz exprimiertem MAdCAM von Primaten (z. B. wie immunohistologisch untersucht)).
Bei einer Ausführungsform können die Antikörper MAdCAM von Primaten binden und Bindung von „MAdCAM von Primaten" an ein α4β7-Integrin (z. B. humanes) hemmen, wobei zelluläre Adhäsion, die von MAdCAM, bevorzugt selektiv, vermittelt wird, gehemmt wird. Ein solcher Antikörper kann α4β7 abhängige zelluläre Adhäsion an Zellen, die ein α4β7 Integrin tragen, wie etwa Leukozyten (insbesondere Lymphozyten wie etwa T- oder B-Zellen) in vitro und/oder in vivo hemmen. Zum Beispiel wurden elf Hybridome identifiziert, die Antikörper produzierten, welche im Spezifischen die Adhäsion von RPMI 8866-Zellen an MAdCAM-1 hemmen (Beispiel 2, als 10G4, 8C1, 10G3, 9G12, 9E4, 7H12, 10F2, 10A6, 1E5, 2F5, 7G11 bezeichnete Hybridome). Somit decken die Antikörper der vorliegenden Erfindung Antikörper, die zelluläre Adhäsion von Zellen, die ein α4β7-Integrin tragen, an vaskuläre Endothelzellen in mukosalen Geweben, einschließlich mit dem Darm assoziierten Geweben oder lymphoiden Organen, hemmen können, ab.
Bevorzugt können die Antikörper ein MAdCAM von Primaten mit hoher Affinität binden (zum Beispiel eine K_a in dem Bereich von ungefähr 1–10 nM oder eine K_d in dem Bereich von ungefähr 1 × 10^–8 bis 1 × 10^–10 Mol^–1).
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind bei einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Prozessen, Forschungs-, Diagnose- und Therapieanwendungen, zweckmäßig. Zum Beispiel können sie für das Isolieren und/oder Reinigen von MAdCAM von Primaten oder Varianten desselben (z. B. durch Affinitätsreinigung oder weitere geeignete Verfahren) und für die Studie der Struktur von MAdCAM (z. B. Konformation) und Funktion desselben verwendet werden.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können ebenfalls für das Modulieren der Funktion von MAdCAM bei Diagnose- oder Therapieanwendungen (z. B. in vitro) verwendet werden. Zum Beispiel können Antikörper als Inhibitoren wirken, um Bindungsfunktion und/oder zelluläre Adhäsionsmolekül-Funktion eines MAdCAMs von Primaten wie hierin beschrieben zu hemmen (zu reduzieren oder zu verhindern).
Zusätzlich können Antikörper der vorliegenden Erfindung für das Detektieren und/oder Messen des Niveaus eines MAdCAM von Primaten in einer Probe (z. B. Gewebe oder Körperflüssigkeiten, wie etwa ein entzündliches Exsudat, Blut, Serum, Darmflüssigkeit, oder auf mit einer Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung transfizierten Zellen) verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Probe (z. B. Gewebe und/oder Flüssigkeit) aus einem Primaten erhalten werden und ein geeignetes immunologisches Verfahren kann für das Detektieren und/oder Messen von Niveaus an MAdCAM von Primaten verwendet werden, einschließlich Verfahren wie etwa Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA), einschließlich Chemilumineszenz-Assays, Radioimmunoassay und Immunohistologie. Bei einer Ausführungsform ist ein Verfahren für das Detektieren eines ausgewählten MAdCAM von Primaten in einer Probe vorgesehen, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Probe mit einem Antikörper, der unter für spezifische Bindung des Antikörpers an das ausgewählte MAdCAM von Primaten an isoliertes MAdCAM von Primaten bindet und das Detektieren der Komplexe aus Antikörper und MAdCAM, die gebildet werden, umfasst.
Bei einer Anwendung des Verfahrens können reaktionsfähige Antikörper mit einem MAdCAM-1 von Primaten für die Analyse von normalem Gewebe versus entzündetem Gewebe bei humanen und nicht-humanen Primaten auf Reaktivität und/oder Expression (z. B. immunohistologisch) von MAdCAM von Primaten hin verwendet werden. Somit ermöglichen die Antikörper der vorliegenden Erfindung immunologische Verfahren für das Untersuchen von Expression von Primaten (z. B. MAdCAM-1 des Menschen) in normalem Gewebe versus entzündetem Gewebe, mithilfe dessen das Vorhandensein einer Erkrankung, das Fortschreiten der Erkrankung und/oder die Wirksamkeit von Therapie mit anti-Primaten MAdCAM-1 bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen untersucht werden kann.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls wie hierin definiertes „MAdCAM von Primaten" vor, einschließlich funktioneller Varianten, wie etwa lösliches MAdCAM von Primaten (z. B. dem es vollständig oder teilweise an der transmembranen Region und dem cytosplasmatischen Schwanz fehlt, sodass das Protein sekretierte) und funktionelle Fusionsproteine (z. B. Hybrid-Immunglobuline, die einen Anteil MAdCAM von Primaten umfassen, der bei seinem C-Terminus mit dem N-Terminus eines Immunglobulin-Anteils fusioniert ist). Diese Moleküle sind bei einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Prozessen, Forschungs-, Diagnose- und Therapieanwendungen, zweckmäßig.
Zum Beispiel können MAdCAM von Primaten, MAdCAM-Ig Fusionsproteine oder weitere rekombinante lösliche MAdCAM-Moleküle von Primaten in Assays für das Identifizieren von Liganden oder Inhibitoren (z. B. einem blockierenden Antikörper) der Interaktion zwischen MAdCAM von Primaten und α4β7 verwendet werden. Wie hierin verwendet handelt es sich bei einem Inhibitoren um eine Verbindung, welche die Bindung von MAdCAM-1 von Primaten an einen Liganden, einschließlich α4β7-Integrin, hemmt und/oder die das Auslösen einer von Liganden vermittelten zellulären Antwort hemmt. Bei einer wirksamen Menge handelt es sich um eine Menge, die ausreichend ist, um das Hemmen von Bindung oder Adhäsion an MAdCAM-1 von Primaten und/oder Signalisieren (z. B. eine Menge, die ausreichend ist, um Adhäsion einer Zelle, die einen Liganden von MAdCAM-1 von Primaten trägt (einschließlich α4β7-Integrinen, wie etwa α4β7-Integrin des Menschen und seine Homologe von Primaten)) an das isolierte und/oder rekombinante MAdCAM von Primaten zu erzielen.
Gemäß einem Aspekt wird ein Verfahren zur Detektion oder zur Identifizierung eines Liganden von MAdCAM von Primaten oder eines Stoffs, der ein MAdCAM von Primaten bindet, vorgesehen, wobei ein (d. h. ein oder mehr als ein) zu untersuchender Stoff (oder ein möglicher Ligand) mit einem isolierten und/oder rekombinanten „MAdCAM von Primaten", einschließlich „funktioneller Varianten" wie hierin definiert, unter für die Bindung des Liganden daran geeigneten Bedingungen, kontaktiert wird, und die Bildung eines Komplexes zwischen dem Stoff und dem MAdCAM von Primaten detektiert wird. Bei einer Ausführungsform wird ein zu untersuchender Stoff mit einer Wirtszelle, die rekombinantes MAdCAM von Primaten oder eine funktionelle Variante unter für Bindung von Ligand daran geeigneten Bedingungen exprimiert, zusammengebracht. Bei einer Ausführungsform ist das MAdCAM von Primaten oder die funktionelle Variante mit einer geeigneten Markierung markiert (z. B. Fluoreszenz-Markierung, Isotopen-Markierung) und die Bindung wird durch Detektieren der Markierung bestimmt. Die Spezifität von Bindung kann durch Kompetition oder Verschiebung, zum Beispiel unter Verwendung eines nicht markierten Stoffes, eines unmarkierten, isolierten und/oder rekombinanten MAdCAMs von Primaten oder einer funktionellen Variante desselben, oder durch einen zweiten Liganden von MAdCAM von Primaten als einem Kompetitoren untersucht werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist ein Verfahren zur Detektion eines Inhibitors von durch MAdCAM von Primaten vermittelter zellulärer Adhäsion vorgesehen. Bei einer Ausführungsform wird ein zu untersuchender Stoff mit einem Liganden von MAdCAM von Primaten und einem isolierten und/oder rekombinanten MAdCAM von Primaten oder einer funktionellen Variante (z. B. Fusionsprotein) unter für Bindung von Ligand daran geeigneten Bedingungen zusammengebracht. Die Bildung eines Komplexes zwischen dem Liganden und dem MAdCAM von Primaten oder der funktionellen Variante wird kontrolliert. Eine Abnahme der Bindung von Ligand in Gegenwart des Stoffs verglichen mit einer geeigneten Kontrolle (z. B. Bindung bei Fehlen von Stoff) zeigt an, dass der Stoff ein Inhibitor ist. Zum Beispiel können die in Beispiel 3 beschriebenen Fusionsproteine und Assays für das Detektieren von Inhibitoren verwendet werden. Ein zu untersuchender Stoff kann ebenfalls mit einer ersten, ein rekombinantes MAdCAM von Primaten exprimierenden Zelle und einer zweiten, ein α4β7-Integrin tragenden Zelle unter Bedingungen, die für Adhäsion der ersten Zelle auf der zweiten Zelle geeignet sind, zusammengebracht werden. Die Adhäsion zwischen der ersten und der zweiten Zelle kann kontrolliert werden und im Vergleich mit einer geeigneten Kontrolle geringere Adhäsion (reduziert oder eliminiert) zeigt an, dass der Stoff ein Inhibitor ist. Eine Zelle oder Zellen, die einen Liganden von MAdCAM-1 wie etwa ein Leukozyt (z. B. eine α4β7⁺ B-Lymphozyte, T-Lymphozyte) natürlich exprimiert/exprimieren, oder weitere Zellen, die einen Liganden von MAdCAM-1 (z. B. eine rekombinante Zelle) exprimieren, können verwendet werden.
Assays wie jene, die in Beispiel 3 beschrieben werden, können für das Identifizieren von Verbindungen, die Bindung in vitro hemmen, verwendet werden. Wie hierin gezeigt, können Fusionsproteine, die einen Anteil MAdCAM von Primaten (zwei chimäre MAdCAM-Ig Fusionen) umfassen, an α4β7 positive Lymphozyten in Lösung binden. Somit stellen MAdCAMs von Primaten, einschließlich funktioneller Varianten, insbesondere löslicher MAdCAM-Moleküle von Primaten und Fusionsproteine wie etwa die in Beispiel 3 beschriebenen chimären MAdCAM-Ig Fusionen, mögliche Inhibitoren der Interaktion zwischen α4β7 und MAdCAM und der in vivo Rekrutierung von Lymphozyten bei entzündlichen Stellen bereit, was wie nachfolgend beschrieben bei Therapie zweckmäßig sein kann. Die in vivo Wirksamkeit dieser Moleküle kann unter Verwendung von hierin beschriebenen Verfahren (siehe z. B. Beispiel 4 und 5) oder weiterer geeigneter Verfahren untersucht werden. Zum Beispiel können Primatenmodelle wie jene, die in Beispiel 5 beschrieben werden, verwendet werden. Das Modell CD45RB^Hi/SCID stellt ein Mausmodell mit Ähnlichkeit sowohl zu Morbus Crohn als auch zu Colitis ulcerosa bereit (Beispiel 4, Powrie, F. et. al., Immunity, 1: 553–562 (1994)). Die Wirksamkeit in diesem Modell kann unter Verwendung eines Versuchsprotokolls, das zu dem für monoklonale Antikörper verwendeten ähnlich ist (Beispiel 4), untersucht werden. Parameter wie etwa Hemmung von Rekrutierung von ¹¹¹In-markierten Zellen bei dem Colon und Reduktion der Anzahl der CD4⁺ T-Lymphozyten in der Lamina propria des Dickdarms nach Verabreichung (z. B. intravenös (i.v.), interperitoneal (i.p.) oder per oral (p.o.)) können untersucht werden. Ebenfalls beschrieben wurden Knockout-Mäuse, die Darmverletzungen ähnlich jenen bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen des Menschen entwickeln (Strober, W. und Ehrhardt, R.O., Cell, 75: 203–205 (1993)) und NOD-Mäuse liefern ein Tiermodell für insulinabhängigen Diabetes mellitus.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Entdeckung, dass Erkrankungen, die mit der Rekrutierung von Leukozyten im Magen-Darm-Trakt, wie etwa CED, oder weiteren mukosalen Geweben assoziiert sind, durch das Hemmen von MAdCAM-Bindung an α4β7-Integrin und/oder Auslösen von α4β7 vermittelten zellulären Antworten behandelt werden kann. Verbindungen oder Stoffe, die Bindung hemmen, schließen „MAdCAM von Primaten" wie hierin definiert ein, einschließlich löslicher MAdCAM-Moleküle von Primaten und Fusionsproteine sowie Antikörpern oder Antigenbindenden Fragmenten derselben, die MAdCAM und/oder das α4β7-Integrin binden. Antikörper, die in dem Verfahren verwendet werden können, schließen rekombinante oder nicht rekombinante polyklonale, monoklonale, chimäre, humanisierte und/oder anti-idiotypische Antikörper ein.
Monoklonale Antikörper, die MAdCAM oder α4β7 binden, wurden beschrieben. Zum Beispiel handelt es sich bei MECA-367 um einen anti-MAdCAM-Antikörper des IgG2a Subtyps und es wird in Gallatin et. al., Nature, 304: 30 (1983) und Michie et. al., Am. J. Pathol., 143: 1688–1698 (1993) beschrieben. Bei ACT-1 handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper, der das α4β7 Integrin bindet (Lazarovits et. al., J. Immunol., 133: 1857 (1984); Schweighoffer et. al., J. Immunol., 151: 717–729 (1993)). FIB 21 bindet die β7-Kette und wird in Berlin et. al., Cell, 74: 184–195 (1993), Andrew, D.P. et. al., J. Immunol., 153: 3847–3861 (1994)) beschrieben und charakterisiert.
Weitere polyklonale oder monoklonale Antikörper, wie etwa Antikörper, die an dieselben oder ähnliche Epitope wie die oben beschriebenen Antikörper binden, können gemäß den hierin beschriebenen Verfahren, im Stand der Technik bekannten Verfahren oder weiteren geeigneten Verfahren hergestellt werden (wie etwa Kohler et. al., Nature, 256: 495–497 (1975), Harlow et. al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, NY) oder Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2 (Beilage 27, Sommer '94), Ausubel et. al., Hrsg. (John Wiley & Sons: New York, NY), Kapitel 11 (1991)). Ebenfalls produziert werden können Antikörper, die mit jedem beliebigen der durch die als 10G4, 8C1, 10G3, 9G12, 9E4, 7H12, 10F2, 10A6, 1E5, 2F5 oder 7G11 bezeichneten Hybridom-Zelllinien für die Bindung an eine Zelle, die ein α4β7-Integrin, bevorzugt α4β7-Integrin des Menschen, trägt, produzierten Antikörper konkurrieren.
Zum Beispiel können Antikörper gegen ein angemessenes Immunogen in einem geeigneten Säugetier (z. B. eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchenn oder ein Schaf) erzeugt werden. Immunogene schließen zum Beispiel MAdCAM, α4β7 oder immunogene Fragmente derselben ein. Zum Beispiel kann ein MAdCAM von Primaten oder eine Variante desselben produziert und als ein Immunogen für das Erzeugen von Antikörpern in einem geeigneten Immunisierungsprotokoll verwendet werden.
Antikörper produzierende Zellen (z. B. eine Lymphozyte) können zum Beispiel aus den Lymphknoten oder der Milz eines immunisierten Tieres isoliert werden. Die Zellen können dann mit einer geeigneten immortalisierten Zelle fusioniert werden (z. B. eine Myelom-Zelllinie), wodurch ein Hybridom gebildet wird. Fusionierte Zellen können unter Einsatz selektiver Kulturtechniken isoliert werden. Zellen, die Antikörper mit der erwünschten Spezifität produzieren, können mittels eines geeigneten Assays ausgewählt werden (z. B. ELISA) (siehe z. B. Beispiel 2).
Bei einer Ausführungsform kann es sich bei dem Immunogen um einen Antikörper handeln, der zum Beispiel MAdCAM, α4β7 oder immunogene Fragmente derselben bindet. Bei dem dadurch erzeugten Antikörper kann es sich um einen antiidiotypischen Antikörper handeln, der ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann ( US Patent Nr. 4,699,880 ).
Ebenfalls in der Erfindung verwendet werden können einzelkettige Antikörper und chimäre, humanisierte oder primatisierte Antikörper (CDR-transplantiert oder mit neuer Oberfläche wie etwa gemäß EP 0,592,406 , Padlan et. al, 13. April 1994) sowie chimäre oder CDR-transplantierte einzelkettige Antikörper, die von unterschiedlichen Spezies abgeleitete Teile umfassen. Die zahlreichen Teile dieser Antikörper können chemisch durch herkömmliche Techniken aneinander gebunden werden oder sie können als ein nebeneinanderliegende Proteine unter Verwendung von Techniken der Genmanipulation hergestellt werden. Zum Beispiel können für eine chimäre oder humanisierte Kette codierende Nucleinsäuren für das Produzieren von benachbarten Proteinen verwendet werden. Siehe z. B. Cabilly et. al., US Patent Nr. 4,816,567 ; Cabilly et. al., Europäisches Patent Nr. 0,125,023 B1 ; Boss et. al., US Patent Nr. 4,816,397 ; Boss et. al., Europäisches Patent Nr. 0,120,694 B1 ; Neuberger, M.S. et. al., WO 86/01533 ; Neuberger, M.S. et. al., Europäisches Patent Nr. 0,194,276 B1 ; Winter, US Patent Nr. 5,225,539 und Winter, Europäisches Patent Nr. 0,239,400 B1 . Siehe ebenfalls Newman, R. et. al., BioTechnology, 10: 1455–1460 (1992), bezüglich primatisierter Antikörper und Ladner et. al., US Patent Nr. 4,946,778 und Bird, R.E. et. al., Science, 242: 423–426 (1988)) bezüglich einkettiger Antikörper.
Zusätzlich können ebenfalls funktionelle Fragmente von Antikörpern, einschließlich Fragmente von chimären, humanisierten, primatisierten oder einzelkettigen Antikörpern, produziert werden. Funktionelle Fragmente der vorangehenden Antikörper halten zumindest eine Bindungsfunktion des Antikörper in seiner vollen Länge, von denen sie abgeleitet sind, aufrecht und bevorzugt halten sie die Fähigkeit, Interaktion zu hemmen, aufrecht. Zum Beispiel schließen Antikörperfragmente, die in der Lage sind, an das α4β7-Integrin, MAdCAM oder einen Teil desselben zu binden, Fv-, Fab-, Fab'- und F(ab')₂-Fragmente ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Solche Fragmente können durch enzymatisches Spalten oder durch rekombinante Techniken produziert werden. Zum Beispiel kann das Spalten von Papain oder Pepsin jeweils Fab- oder F(ab')₂-Fragmente erzeugen. Alternativ können in einer Vielzahl von verkürzten Formen unter Verwendung von Antikörpergenen, in denen ein oder mehr als ein Stopp-Codon stromaufwärts auf der natürlichen Stoppstelle eingebracht wurde/n, Antikörper produziert werden. Zum Beispiel kann ein chimäres Gen, das für einen F(ab')₂-Teil einer schwerer Kette codiert, konzipiert werden, um DNA-Sequenzen, die für die CH₁-Domäne und Gelenkregion der schweren Kette codieren, einzuschließen.
Antikörper und Antigen-bindende Fragmente derselben, die in dem beanspruchten Verfahren verwendet werden, können, schließen Antikörper ein, die an MAdCAM und/oder an α4β7 wie etwa anti-β7-Ketten Antikörper binden. Zum Beispiel können Antikörper aus der Gruppe einschließlich FIB 21, FIB 30, FIB 504 und ACT-1 und Mischungen derselben verabreicht werden. Alternativ oder zusätzlich können Antigen-Fragmente dieser Antikörper verabreicht werden.
Verbindungen oder Stoffe, welche die Bindung von MAdCAM und dem α4β7-Integrin hemmen, können gemäß dem beanspruchten Verfahren bei der Behandlung von Erkrankungen, die mit Infiltration von Leukozyten (z. B. Lymphozyten, Monozyten) bei Geweben, die das Molekül MAdCAM-1 exprimieren (einschließlich Rekrutieren und/oder Akkumulieren von Leukozyten in Geweben) assoziiert sind, verabreicht werden. Zwecks Behandelns einer solchen Erkrankung wird eine wirksame Menge einer Verbindung oder eines Stoffs (d. h. einer oder mehr als einer Verbindung oder ein oder mehr als ein Stoff) einem Lebewesen (z. B. ein Säuger, wie etwa ein Menschen oder weitere Primaten) verabreicht. Gemäß dem vorliegenden Verfahren können zum Beispiel chronisch-entzündliche Erkrankungen, einschließlich Erkrankungen, die mit Infiltration von Leukozyten des Magen-Darm-Trakts (einschließlich mit dem Darm assoziiertes Endothel), weiterer mukosaler Gewebe oder Gewebe, die das Molekül MAdCAM-1 exprimieren (z. B. mit dem Darm assoziierte Gewebe, wie etwa Venolen der Lamina propria des Dünn- und Dickdarms und Brustdrüse (z. B. Milch produzierende Brustdrüse)) behandelt werden. Gleichermaßen kann ein Lebewesen behandelt werden, das an einer Erkrankung leidet, die mit der Infiltration von Leukozyten von Geweben als ein Ergebnis von Bindung von Leukozyten an Zellen (z. B. Endothelzellen), die das Molekül MAdCAM-1 exprimieren, assoziiert ist.
Erkrankungen, die dementsprechend behandelt werden können, schließen chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED) wie etwa Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Ileitis, Zöliakie, nicht tropische Sprue, mit seronegativen Gelenkerkrankungen assoziierte Enteropathie, mikroskopische oder Kollagencolitis, eosinophile Gastroenteritis oder Pouchitis als Ergebnis nach Proktokolektomie und ileoanale Anastomose ein.
Bei Pankreatitis und Insulinbedingtem Diabetes mellitus handelt es sich um weitere Erkrankungen, die unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens behandelt werden können. Es wurde berichtet, dass manche Gefäße in der exokrinen Pankreas sowohl von NOD-Mäusen (nicht übergewichtig, diabetisch) als auch von BALG/c und SJL-Mäusen MAdCAM-1 exprimieren. Die Expression von MAdCAM-1 wurde angeblich auf dem Endothel in entzündeten Langerhans'schen Inseln der Pankreas der NOD-Maus induziert und MAdCAM-1 war das predominante Addressin, das durch das Inselendothel bei NOD-Mäusen bei frühen Stadien von Insulitis exprimiert wurde (Hanninen, A., et. al., J. Clin. Invest., 92: 2509–2515 (1993)). Des Weiteren wurde das Akkumulieren von α4β7 exprimierenden Lymphozyten innerhalb der Inseln beobachtet und MAdCAM-1 spielte bei der Bindung von Lymphom-Zellen via α4β7 an Gefäße der entzündeten Inseln eine Rolle (Hanninen, A., et. al., J. Clin. Invest., 92: 2509–2515 (1993)).
Beispiele für chronisch-entzündliche, mit mukosalen Geweben assoziierte Erkrankungen, die gemäß dem vorliegenden Verfahren behandelt werden können, schließen Mastitis (Brustdrüse), Cholezystitis, Cholangitis oder Pericholangitis (Gallengang und umliegendes Gewebe der Leber), chronische Bronchitis, chronische Sinusitis, Asthma und Graft-Versus-Host-Disease (z. B. in dem Magen-Darm-Trakt) ein. Wie bei Morbus Crohn ersichtlich, dehnt sich die Entzündung oftmals bis hinter die mukosale Oberfläche aus, dementsprechend können chronisch-entzündliche Erkrankungen der Lunge, die in einer interstitiellen Fibrose resultieren, wie etwa exogene allergische Alveolitis, Kollagenosen, Sarkoidose und weitere idiopathische Zustände, behandelt werden.
Die Verbindung wird in einer wirksamen Menge, die Bindung von MAdCAM an das α4β7-Integrin hemmt, verabreicht. Zwecks Therapie wird eine wirksame Menge ausreichend sein, um die erwünschte therapeutische und/oder prophylaktische Wirkung zu erzielen (wie etwa eine Menge, die ausreichend ist, um von MAdCAM vermittelte Bindung und/oder Signalisieren zu reduzieren oder zu verhindern, wodurch Adhäsion und Infiltration von Leukozyten und/oder assoziierte zelluläre Antworten gehemmt werden). Die Verbindungen können als eine Einzeldosis oder als Mehrfach-Dosis verabreicht werden. Die Dosierung kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren bestimmt werden und hängt zum Beispiel vom Alter, der Sensitivität, der Toleranz und dem allgemeinen Wohlbefinden des Lebewesens ab. Geeignete Dosierungen für Antikörper können von 0,1–1,0 mg/kg Körpergewicht pro Behandlung reichen.
Gemäß dem Verfahren kann eine Verbindung oder ein Stoff an ein Lebewesen (z. B. einem Menschen) allein oder in Verbindung mit einem weiteren Stoff verabreicht werden. Eine Verbindung oder ein Stoff können vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung des zusätzlichen Stoffes verabreicht werden. Bei einer Ausführungsform wird mehr als ein monoklonaler Antikörper, der die Bindung von Leukozyten an endotheliales MAdCAM hemmt/hemmen, verabreicht. Alternativ wird ein monoklonaler Antikörper, der die Bindung von Leukozyten an endotheliale Liganden hemmt, zusätzlich zu einem anti-MAcDAM oder anti-β7 Antikörper verabreicht. Ebenfalls verabreicht werden kann zum Beispiel ein Antikörper, der die Bindung von Leukozyten an einen endothelialen Liganden hemmt, wobei es sich bei dem Liganden um einen anderen als MAdCAM wie etwa einen anti-ICAM-1 oder einen anti-VCAM-1 Antikörper handelt. Bei einer weiteren Ausführungsform kann ein zusätzlicher pharmakologisch aktiver Bestandteil (z. B. Sulfasalazin, eine entzündungshemmende Verbindung oder eine steroidale oder eine weitere nicht steroidale entzündungshemmende Verbindung) in Verbindung mit der Verbindung oder dem Stoff (z. B. dem Antikörper der vorliegenden Erfindung) verabreicht werden.
Abhängig von der Erkrankung oder dem Zustand, die/der behandelt werden soll, sind eine Vielzahl von Applikationsformen möglich, einschließlich, aber nicht zwingend darauf beschränkt, parenterale (z. B. intravenös, intraarteriell, intramuskulär, subkutane Injektion), orale (z. B. Diät), topische oder rektale Applikationsformen oder Inhalation (z. B. intrabronchiale, intranasale oder orale Inhalation, Nasentropfen). Parenterale Verabreichung ist eine bevorzugte Applikationsform.
Formulierungen einer zu verabreichenden Verbindung werden gemäß der ausgewählten Applikationsform (z. B. Lösung, Emulsion, Kapsel) variieren. Eine angemessene Zusammensetzung, welche die zu verabreichende Verbindung umfasst, kann in einem physiologisch annehmbaren Vehikel oder Träger hergestellt werden. Für Lösungen oder Emulsionen schließen geeignete Träger zum Beispiel wässrige oder alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen ein, einschließlich salzhaltiger und gepufferter Medien. Parenterale Vehikel können Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat oder fette Öle einschließen. Intravenöse Vehikel können zahlreiche Zusatzstoffe, Konservierungsstoffe oder Flüssigkeits-, Nährstoff- oder Elektrolytfüllstoffe einschließen (siehe im Allgemeinen Remington's Pharmaceutical Science, 16. Auflage, Mack, Aufl. 1980). Zwecks Inhalation kann die Verbindung löslich gemacht werden oder für Verabreichung in einen geeigneten Dispenser gefüllt werden (z. B. ein Atomiseur, ein Zerstäuber oder eine Aerosolsprühdose).
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Beispiele, die in keinster Weise einschränkend zu verstehen sind, illustriert.
Einführung
Studien bezüglich Hybridisierung unter Verwendung von Zoo-Blots mit murinen MAdCAM DNA-Sonden unter wenig stringenten Bedingungen zeigten an, dass das Aufrechterhalten von Nukleotid zwischen murinem MAdCAM-1 und höheren Spezien gering war. Ein Lösungsansatz bezüglich funktioneller Expression wurde verwendet, um Homologe von Primaten und des Menschen zu klonieren, wobei mit cDNAs transfizierte Zellen, welche die Fähigkeit der Adhäsion an eine Ziel-Lymphozyten-Zelllinie, die hohe Niveaus des MAdCAM-1 Liganden (α4β7) exprimiert, verleiht, identifiziert und die cDNAs wiedergewonnen wurden. Angesichts der Knappheit an humanen Gewebequellen wurde zunächst ein Homolog von MAdCAM-1 von Primaten identifiziert.
Für das Expressionsklonieren wurde in einem eukaryotischen Expressionvektor pRSVsport (von Gibco/BRL) eine Bibliothek von cDNA-Expression von Primaten, abgeleitet von mesenterialen Lymphknoten eines Makaken, hergestellt. Ein hochwirksames Transfektionssystem, das die CHO/P Zelllinie verwendete, wurde verwendet (Heffernan, M. und J.D. Dennis, Nucleic Acids Res., 19: 85–92 (1991)). Die Bibliothek wurde getrennt und einzelne Pools (ungefähr 1 500 Klone darstellend) wurden in Wells von 24-Well-Gewebekulturplatten transfiziert. Zelladhäsions-Assays wurden durchgeführt, um cDNAs, die einen adhäsiven Phänotypen auf T- und B-Zelllinien, die das α4β7-Integrin, einen bekannten Liganden von MAdCAM-1, exprimieren, verleiht, zu identifizieren. Die Adhäsion wurde mikroskopisch durch Rossetting der T- und B-Zelllinien auf den transfizierten Zellen identifiziert. Ein Pool, der den erwünschten Phänotyp verleiht, wurde subfraktioniert, bis ein einziger cDNA Klon in voller Länge, der als Klon 31D bezeichnet wurde, identifiziert wurde. Die DNA-Sequenzierung des Amino-terminalen Teils der cDNAs offenbarte Homologie des Makaken-Klons zu murinem MAdCAM-1 (Briskin, M.J., et al, Nature (Lond.), 363: 461–464 (1993)) sowohl bezüglich des Proteins als auch der Nukleinsäure.
Bei Einbringen in CHO/P-Zellen durch transiente Transfektion lenkte der aus Klon 31D gewonnene cDNA-Insert die Expression eines Proteins, das die Bindung an die folgenden zwei Zelllinien, die α4β7 exprimieren, vermitteln konnte: (1) TK1, ein murines T-Zellen Lymphom (Butcher, E.C., et. al., Eur. J. of Immunol., 10: 556–561 (1980)) und (2) RPMI 8866, ein humanes B-Zellen Lymphom (Erle, D.J., et. al., J. Immunol., 153: 517–528 (1994)). Die Bindung von TK1-Zellen an mit der cDNA von Makaken transfizierten Zellen konnte durch Antikörper, entweder an das α4β7 (Mab PS/2) oder das β7 (Mab FIB 504) Integrin, blockiert werden und die Bindung von RPMI 8866 an CHO/P-Zellen, die transient mit cDNA von Makaken transfiziert waren (Klon 31D in pSV-SPORT), wurde durch das anti-α4β7 MAb, nämlich ACT-1, blockiert. In Kontrollversuchen scheiterte ein für cDNA codierendes VCAM-1 des Menschen bei der Bindung von RPMI 8866 B-Zelllinie des Menschen. Jurkat-Zellen, eine T-Zelllinie, die α4β1 und nicht α4β7 exprimiert, band nachweislich VCAM-1, scheiterte jedoch an der Bindung von cDNA von Makaken exprimierenden transfizierten Zellen.
Die cDNA, die für ein Homolog von Primaten (Makaken) von murinem MAdCAM-1 codiert, wurde als eine Sonde verwendet, um einen Klon, der durch Hybridisieren für ein humanes Homolog codiert, zu erhalten. Um einen Klon von MAdCAM-1 des Menschen zu erhalten, wurden in den Phagenvektor λZiplox von Gibco/BRL zwei cDNA-Bibliotheken konstruiert, eine abgeleitet vom normalen humanen mesenterialen Lymphknoten (MLN) und die andere abgeleitet von einem entzündeten MLN Lymphknoten eines Morbus Crohn-Patienten. Für das Screenen dieser Bibliotheken wurde cDNA des Klons von Makaken verwendet. Es wurden zwei unterschiedliche, ähnlich große Klone humaner cDNA isoliert. Jeder dieser Klone schien durch vorherige Sequenzanalyse in voller Länge vorhanden zu sein. Die Analyse von cDNAs des MAdCAM-1 sowohl von Makaken als auch des Menschen zeigt an, dass jedes der codierten Proteine eine vorhergesagte hydrophobe Leader-Sequenz (unterstrichen in 1–3) aufweist, während die verbleibenden Teile der Proteine jeweils dem vorhergesagten reifen MAdCAM-1 des Menschen oder von Makaken entsprechen.
Um die Funktion zu untersuchen, wurden humane cDNA-Inserts in den Expressionsvektor pCDNA3 (Invitrogen) subkloniert und transiente Expressions-Assays wurden verwendet, um die Funktion zu veranschaulichen. Die humanen cDNAs können als funktionelle Proteine exprimiert werden und sind in der Lage, spezifische Bindung an Zellen, die α4β7 exprimieren, zu vermitteln. Dementsprechend werden diese beiden Klone humaner cDNA als cDNAs von MAdCAM-1 des Menschen bezeichnet.
Stabile transfizierte Zellen, sowohl der cDNA von Primaten als auch der cDNA des Menschen, wurden in einer Maus Pre-B-Zelllinie, L1-2 und CHO-Zellen erzeugt. Transfizierte L1-2 Zellen wurden verwendet, um Mäuse zu immunisieren und monoklonale Antikörper gegenüber MAdCAM-1 des Menschen zu erzeugen. Es wurden Antikörper identifiziert, die in der Lage sind, die Interaktion zwischen MAdCAM-1 und α4β7 zu hemmen. Die Produktion von blockierenden Antikörpern, die gegen humanes MAdCAM-1 gerichtet sind, stellt einen signifikanten Fortschritt dar, da frühere Versuche, solche blockierenden Antikörper, die Kreuz-Reaktivität mit dem humanen Homolog aufwiesen, unter Verwendung von murinem MAdCAM-1 zu produzieren, scheiterten.
Beispiel 1. Klonen der cDNAs von MAdCAM-1 von Makaken und des Menschen
Isolierung der RNA und Selektion der Botschaft
Die gesamte RNA wurde unter Verwendung des Reagens CsTFA^TM (Caesiumtrifluoracetat) (Pharmacia; Kat. Nr. 17-087-02) aus (a) mesenterialen Lymphknoten (MLN, mesenteric lymph nodes) von Primaten (Makaken); (b) histologisch normalen humanen mesenterialen Lymphknoten; (c) humanen mesenterialen Lymphknoten (entzündete ileale Knoten) von einem Patienten mit Morbus Crohn, und (d) Gewebekulturzellen isoliert. Die gesamte RNA aus dem mesenterialen Lymphknoten wurde aus zwei Spezies der Makakenaffen (Macaca fascicularis und Macaca mulatta) gewonnen und wurde vor der Isolierung der poly-(A)-RNA vereinigt. Das Gewebe wurde zunächst in flüssigem Stickstoff schockgefroren und einer Dounce-Homogenisierung in einer Lösung, bestehend aus 5,5 M Guanidiniumisothiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, 0,5 % Natrium-Laurylsarcosin und 0,2 M 2-Mercaptoethanol, unterzogen, während Gewebekulturzellen (1,5 × 108) einmal in Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS, phosphate buffered Saline) gewaschen und durch Pipettieren homogenisiert wurden. Ein gereinigtes Lysat wurde dann in Schichten auf ein CsTFA-Polster aufgetragen, und die gesamte RNA wurde durch 20-stündige Zentrifugation bei 30 000 min^–1 pelletiert.
Die mRNA wurde durch das polyATract-mRNA-Isolierungssystem von Promega selektiert. Das System verwendet einen biotinylierten Oligo-(dT)-Primer, um (in Lösung) an poly-A Schwänze von eukaryotischen Botschaften zu hybridisieren. Die Hybride wurden aufgefangen und mit hoher Stringenz unter Verwendung von an paramagnetische Partikel gekoppeltem Streptavidin sowie einer Vorrichtung für die magnetische Trennung gewaschen. mRNA wurde durch eine einzige Reinigung in diesem System ausgewählt, und die Ausbeute lag im Bereich von 1–2 % der Gesamtausbeute an RNA. Die Integrität sowohl der Gesamtmenge als auch der mRNA wurden mit Hilfe von Gelelektrophorese und Färben mit Ethidiumbromid analysiert.
cDNA-Synthese
Die cDNA wurde unter Verwendung des Superscript^TM-Lambda-Systems (Kat. Nr. 18256-016) entweder in Verbindung mit dem λZiplos^TM-Vektor (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD, Kat. Nr. 19643-014) in dem Fall der humanen Bibliotheken oder dem pSVSPORT-1-Vektor (Gibco/BRL, Kat. Nr. 15388-010) in dem Fall der Makaken-Bibliothek synthetisiert. An dem Standard-Protokoll wurden die folgenden Modifikationen vorgenommen: cDNA wurde nur entweder am ersten oder am zweiten Strang (jedoch nicht an beiden Strängen) mit einem α³²P-dCTP markiert und quantitative Schätzungen wurden mit Hilfe einer Untersuchung der Ethidiumbromidfärbung von Aliquoten von cDNA-Fraktionen vorgenommen.
DNA-Sequenzierung
Die vollständigen cDNAs von MadCAM-1 von Makaken und des Menschen wurden zunächst jeweils in den Bibliotheksvektoren pSV-SPORT-1 und pZL1 (aus λZiplox^TM) isoliert. Auf Grundlage der Restriktionskartierung wurden Fragmente in Bluescript^®-Vektoren subkloniert (Stratagene), um das Sequenzieren anhand interner Bereiche der cDNAs zu ermöglichen. Nach einer Sequenzanalyse dieser Klone wurden Oligonukleotidprimer dazu verwendet, die Sequenz abzuschließen. Es wurde eine überlappende Sequenz beider Stränge erhalten. Für die Sequenzanalyse wurde die DNA-Polymerase des Sequenase^TM-7-Deaza-dGTP-DNA-Sequencing-Kit mit Sequenase Version 2.0 T7 (sequenase^TM 7-deaza-dGTP DNA sequencing kit with sequenase version 2.0 T7 DNA polymerase) (United States Biochemical) und ³⁵S-dCTP (Amersham Life Science und New England Nuclear) verwendet. Der Delta-TAQ-Sequencing-Kit (USB) und die G-C-reiche Sequenz Gamma ³²P-ATP (Amersham) wurden ebenfalls als G-C-reiche Sequenzen verwendet.
Sequenzen wurden unter Verwendung des Lasergene-Systems eingetragen und analysiert (DNASTAR, Inc.). Anordnungen von Nukleotidsequenzen wurden mittels der „Clustal method with Weighted residue weight table" unter Verwendung einer Gap Penalty von 10 und einer Gap length penalty von 10 sowie von Standardparametern („pairwise alignment parameter” waren: ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, und diagonals saved = 4) ermittelt.
Anordnungen von Nukleotidsequenzen wurden mittels der „Clustal method with the PAM250 residue weight table" unter Verwendung einer Gap Penalty von 10 und einer Gap length penalty von 10 und Standardparametern („pairwise alignment parameter” waren: ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 4, und diagonals saved = 4) ermittelt.
Herstellung der Makaken-Expressionbibliothek
Das Verfahren zur Größenfraktionierung wurde für die Konstruktion der Makaken-Expressionsbibliothek ebenfalls geringfügig modifiziert, um große Inserts (> 1,5 kb) zu ermöglichen. Nach einem Durchgang des Fraktionierens wurde nur die erste (größte) cDNA-Fraktion isoliert, und die übrigen Fraktionen wurden vereinigt und einem weiteren anschließenden Durchgang der Fraktionierung unterzogen. Die größte Fraktion aus dem nächsten Durchgang wurde mit der größten Fraktion aus dem vorangehenden Durchgang vereinigt, und die zweite Fraktion aus diesem Durchgang wurde ebenfalls verwendet. Diese beiden Fraktionen wurden gefällt und in Ligationen mit dem pSV-SPORT-1-Vektor eingebracht, und eine Fraktion jeder Ligation wurde in elektrokompetente DH 10B-Bakterien (Gibco) transformiert, um sowohl den Titer der Bibliothek als auch die durchschnittliche Größe des Inserts zu schätzen. Schätzungen, die lediglich anhand der Ligation der längsten cDNA-Fraktion vorgenommen worden waren, zeigten das Potential, 2,4 Millionen unabhängiger Klone mit einer durchschnittlichen Größe des Inserts von 1,9 kb und einer mittleren Größe von 2 kb herzustellen.
Die eigentliche gescreente Bibliothek bestand aus 150 000 unabhängigen Klonen, die mit einer Dichte von 1 500 Klonen/Platte mit Ampicilin bei 50 μg/ml auf 100 LB-Agarplatten ausgestrichen worden waren (um 100 Pools von jeweils 1 500 Klonen/Pool zu erzeugen) und über Nacht bei 37 °C gezüchtet wurden. Für die Reinigung von einzelnen Pools wurde jede Platte mit ungefähr 2 ml Luria-Brühe (LB) überschichtet, und die Kolonien wurden von jeder Platte mit einem herkömmlichen Schaber für Gewebekulturzellen (tissue culture cell scraper) abgeschabt, und Bakteriensuspensionen wurden auf Mikrofuge-Röhrchen übertragen. Vor der Reinigung wurde aus jedem Pool ein Glycerinstamm erzeugt. Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung von QIAprep-Spinsäulen (QIAGEN) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.
Transfektionen
CHO/P-Zellen (Heffernan, M. und J.D. Dennis, Nucleic Acids Res., 19: 85–92 (1991)) wurden ungefähr 24 Stunden vor der Transfektion mit einer Dichte von 40 000 Zellen/Well in 24-Well-Platten ausgesät. DNAs wurden unter Verwendung des LipofectAMINE^TM-Reagens (GIBCO; Kat. Nr. 18324-012) transient transfiziert, wobei im Wesentlichen nach dem empfohlenen Protokoll, das zusätzlich für 24-Well-Platten optimiert worden war, wie folgt vorgegangen wurde: 200 ng DNA (die entweder einen Plasmid-Pool oder gereinigte Kontroll-DNAs darstellen) wurde in 20 μl mit reduziertem Serummedium Opti-MEM (GIBCO) sowie in 20 μl einer Mischung gelöst, die aus 18 μl Opti-MEM 1 und 2 μl LipofectAMINE^TM-Reagens bestand. Die Liposommischung wurde dann ungefähr 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert, anschließend wurden 200 μl of Opti-MEM 1 hinzugefügt, und die Gesamtmischung wurde dann als Schicht auf einem Well von CHO/P aufgebracht und wieder in den Inkubator gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2,5 Stunden bei 37 °C wurden 240 ml MEM-α (Gibco) Medium mit 20 % fötalem Kälberserum (FCS, fetal calf serum) zu jedem Well hinzugegeben, und die Zellen wurden zusätzlich 18–24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Das Medium wurde dann durch standardmäßiges MEM-α mit 10 % FCS ersetzt, und der Adhäsionsassay wurde ungefähr 20–24 Stunden später durchgeführt.
Adhäsionsassay für Expressionsklonierung
Für die Adhäsionsassays in dem Expressionsklonierungsscreen wurde das murine T-Zelllymphom TK1, das hohe Niveaus von α4β7 exprimiert (Butcher, E.C., et al., Eur. J. Immunol., 10: 556–561 (1980)), verwendet, um mit für das Bereitstellen eines adhäsiven Phänotyps geeigneten cDNAs transfizierte CHO/P-Zellen zu detektieren. TK1-Zellen wurden erneut bei einer Dichte von 2 × 10⁶/ml in einem Assaypuffer, der aus HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺), angereichert mit 2% bovinem Kälberserum, 20 mM HEPES, pH 7,3, 2 mM Mg²⁺ und 2 mM Ca²⁺, bestand, suspendiert. Jedes mit einem DNA-Pool transfizierte Well wurde mit 0,25 ml eines kombinierten, monoklonale Antikörper enthaltenden Überstands sowohl zu humanem VCAM-1 (MAb 2G7; Graber, N.T., et al., J. Immunol., 145: 819–830 (1990)) als auch zu murinem MAdCAM-1 (MAb MECA-367; American Type Culture Collection (Rockville, MD), Accession Nr. HB9478; Streeter, P.R., et al., Nature, 331: 41 (1988)) präinkubiert; siehe auch US-Patent-Nr. 5,403,919 von Butcher), um die durch VCAM-1 (das in hohen Niveaus in den Lymphknoten von Primaten exprimiert ist) vermittelte Adhäsion oder jegliche potentiell verunreinigende murine MadCAM-1 Expressionsplasmide zu beseitigen. Nach 15-minütiger Inkubation bei 4 °C wurden 0,25 ml der TK1-Zellsuspension (5 × 10⁵ TK1-Zellen) zu jedem Well gegeben, und die Inkubation auf einem Einsatz für Schüttelkolben wurde zusätzliche 30 Minuten lang bei 4 °C fortgesetzt. Die Platten wurden mindestens 1 Stunde lang durch vorsichtiges Invertieren in einem großen Becherglas mit Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) gefolgt von Inversion in einem Becherglas mit PBS mit 1,5 % Gluteraldehyd für die Fixierung gewaschen. Die Wells wurden dann mikroskopisch (10fach-Objektiv) auf das Rosetting von TK1-Zellen hin untersucht.
Reinigung der Makakenklone
Pools mit einer oder mehr TK1-Rosetten wurden mit dem folgenden Protokoll weiter subfraktioniert: Ein DNA-Vertreter eines positiven Pools wurde erneut in DH10B transformiert und mit einer Dichte von ungefähr 200 Kolonien/Platte auf sechsundneunzig Petrischalen von 100 mm ausgestrichen. Zellulosenitratfilter wurden verwendet, um Replikaplatten zu erzeugen, und ein Satz von jeder Platte wurde dann DNA-Reinigung und darauf folgenden Adhäsionsassays unterzogen, wie oben beschrieben. Ein Replikaplatten-Vetreter eines positiven Pools wurde dann weiter in Pools von 5 Kolonien subfraktioniert, die auf einer Replikaplatte ausgestrichen und über Nacht in Ampicillin enthaltenden LB-Medium gezüchtet wurden. Nach einem weiteren Durchlauf der DNA-Reinigung und der Adhäsionsassays konnten dann einzelne Klone gezüchtet werden, und die Klone, welche die Adhäsion der TK1-Zellen bereitstellen, wurden identifiziert.
Ein Klon mit voller Länge, von dem gezeigt wurde, dass er für MAdCAM-1 codiert, wurde erhalten und als Klon 31D bezeichnet. Klon 31D, in pSV-SPORT-1 (P25) konstruiert, enthält ein cDNA-Insert von 5'-SalI bis NotI-3'. Transformanten des den 31D-Klon enthaltenden E. coli-Stammes DH10B wurden erhalten. Für die Expression in stabilen Zelllinien wurde diese cDNA in Expressionsvektor pcDNA-3 (Invitrogen) subkloniert, welcher ein für die G418-Selektion geeignetes Neoresistenzgen trägt. Insbesondere wurde das Insert von Klon 31D durch Verdau mit EcoRI(5') und NotI freigegeben und in mit EcoRI und NotI gespaltene pcDNA-3 eingesetzt, um pcD3pMAd zu erhalten.
Ergebnisse
Eine cDNa-Expressionsbibiliothek, welche in Pools von 1 500 unabhängigen Klonen unterteilt ist, wurde mit Hilfe von aus den mesenterialen Lymphknoten von Makaken (MLNs) gereinigter mRNA konstruiert. Jeder Pool wurde transient in die CHO/P-Zelllinie transfiziert, und 48 Stunden nach der Transfektion wurde ein Zelladhäsionsassay unter Verwendung des murinen T-Zell-Lymphoms TK1 durchgeführt. Da VCAM-1 in MLNs exprimiert ist, wurden Assays in Gegenwart von anti-VCAM-1-MAb-2G7 durchgeführt (Graber, N.T., et al., J. Immunol., 145: 819–830 (1990)). Zusätzlich wurden Assays bei 4 °C durchgeführt, um eine durch cDNAs von ICAM vermittelte Adhäsion zu eliminieren (TK-1-Zellen exprimieren hohe Niveaus von LFA-1, und LFA-1 ist bei 4 °C nicht funktionsfähig). Eine mikroskopische Untersuchung der Assays zeigte mehrere Wells mit deutlichen Rosetting von TK1-Zellen. Zwei Wells wurden durch Wiederholung der Transfektion sowie dadurch, dass bestimmt wurde, ob das durch die Pools vermittelte Binden durch anti-β7- oder anti-α4-MAbs blockiert werden kann, für die weitere Analyse ausgewählt. TK1-Bindung an einen der Pools wurde durch eine Vorinkubation von TK1-Zellen entweder mit anti-α4 MAb PS/2 oder anti-β7 MAb FIB 504 vollständig inhibiert. Dieser Pool wurde drei Durchgängen von Subfraktionierung unterzogen, bis ein einzelner Klon, genannt 31D, isoliert war. Der gereinigte Klon 31D vermittelte eine Bindung an TK-1-Zellen, die durch anti-α4- oder anti-β7-Antikörper inhibiert werden konnte.
Die Größe des Inserts von Klon 31D betrug ungefähr 1,8 kb. Die Sequenzierung des Aminoterminus offenbarte mehrere Merkmale, die einem Primaten-Homolog von murinem MAdCAM-1 entsprachen. Die Länge beider Signalpeptide betrug 21 Aminosäuren. Obwohl gefunden wurde, dass die Ähnlichkeit der Aminosäuren nur 48 % betrug, waren sie zu 71 % identisch, wenn nicht-konservative Substitutionen berücksichtigt wurden. Zusätzlich wies das von Klon 31D codierte Protein ein Merkmal auf, das einzigartig für die Adhäsionsrezeptoren der Ig-Familie ist: zwei Paare von Cysteinen, die in der ersten Immunglobulindomäne durch 3–4 (in diesem Fall 3) Aminosäuren getrennt sind. Schließlich stellen die 8 Aminosäuren am C-terminalen Ende der ersten Doppelcysteine ein Segment aus 9 Aminosäuren, das identisch mit einer Sequenz in murinem MAdCAM-1 ist, dar. Innerhalb dieses Bereichs befand sich die Sequenz LDTSL, die einem Konsensusmotiv für Interaktionen zwischen Familienmitgliedern der Integrin/Ig-Familie entspricht. Auch wenn dieses Motiv im Allgemeinen in Bezug auf andere Ig-Adhäsionsrezeptoren wie etwa ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 und VCAM-1 (Osborn, L., et al., J. Cell. Biol, 124: 601–608 (1994); Renz, M.E., et al., J. Cell. Biol., 125: 1395–1406 (1994)) erhalten bleibt, wurde genau diese Sequenz vorher ausschließlich in murinem MAdCAM-1 gefunden. Die funktionale Bedeutung dieses Motivs liegt aufgrund der Tatsache nahe, dass eine Punktmutation, die das erste L (Leucin) des Motivs bei Aminosäure 61 in ein R (Arginin) in murinem MAdCAM-1 umwandelt, eine dramatische Auswirkung auf die Bindung zwischen MAdCAM-1 und α4β7 (nicht gezeigt) hat. Die Ergebnisse der funktionalen Studien zusammen mit diesen Sequenzmerkmalen zeigen an, dass Klon 31D ein Primatenhomolog zu murinem MAdCAM-1 codiert.
Screenen einer humanen Phagen-Bibliothek und Reinigung humaner Klone
Humane Phagen-cDNA-Bibliotheken wurden in dem λZiplox^TM-Vektor (Gibco/BRL) konstruiert. Humane cDNA wurde entweder aus aus normalen oder entzündeten mesenterialen Lymphknoten (MLN) isolierter DNA wie oben beschrieben hergestellt. cDNA wurde wie oben beschrieben synthetisiert, in den Phagenvektor ligiert und auf den Bakterienstamm Y1090 (ZL) („ZL” = Ziplox) titriert. Duplikatfilter von ungefähr 500 000 unabhängigen Klonen (50 000 Klone/Filter) sowohl der normalen als auch der MLN-Phagen-Bibliothek für Morbus Crohn wurden mit ³²P-markierter MAdCAM-1-cDNA voller Länge von Makaken markiert.
Für das Herstellen der Sonde wurde ein ~1,7 kb langes EcoRI-NotI-Fragment aus Klon 31D ausgeschnitten und unter Verwendung von GeneClean (BIO 101) isoliert. Dieses Fragment wurde mit α³²P-dCTP markiert, indem es mit Zufallshexamer-Primern versehen wurde (Maniatis et al., In: Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1990)).
Die Bedingungen des Screenings waren wie folgt: 50 000 Phagenklone wurden auf 150 mm Petrischalen enthaltend NZYCM-Agar (Gibco/BRL) ausgestrichen. Nach 7– 16-stündigen Inkubation wurden die Platten 2 Minuten lang und anschließend 5 Minuten lang mit 132 mm Zellulosenitratfiltern (Schleicher und Schuell, Keene, NH) überschichtet, um jeweils erste und zweite (Duplikat)-Lifts von Phagenklonen zu übertragen. Die Filter wurden dann 5 Minuten lang in Denaturierungslösung (1,5 M Natriumchlorid, 0,5 N Natriumhydroxid) mit anschließender Neutralisierung in 1,5 M Natriumchlorid, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 eingeweicht. Die Filter wurden 15 Minuten lang an der Luft getrocknet und dann unter Vakuum 2 Stunden lang bei 80 °C gebacken.
Die Filter wurden 2 Stunden lang bei 55 °C in 2 M Na₂HPO₄, 0,5 % SDS, 5 × Denhardt-Lösung (1 × Denhardt-Lösung ist 0,02 % bovines Serumalbumin, 0,02 % Ficoll und 0,02 % Polyvinyl-Pyrolidon), 1 mM EDTA und 50 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA prähybridisiert und anschließend über Nacht bei 55 °C in demselben Puffer hybridisiert. Filter wurden einmal bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,1 % SDS (1 × SSC ist 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat) gewaschen, drei bis vier Wäschen bei 65 °C in 0,1 × SSC und 0,1 % SDS folgten im Anschluss. Die Filter wurden mit einem Geigerzähler überwacht, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren.
Positive Klone wurden von Belag gereinigt, und das die cDNA-Inserts enthaltende Plasmid pZL1 wurde unter Verwendung des CRE-LOX-Rekombinationssystems (GIBCO) isoliert (Plasmid pZL1 ist in dem Körper des Lambda-Ziplox-Vektors enthalten). Insbesondere wurde eine gereinigte Phagenplatte in 200 μl Phagenpuffer (20 mM TrisHCl, pH 7,5, 145 mM NaCl, 8 mM MgSO₄ 7 H₂O, 0,01 % Gelatine) 5 Minuten lang bei Raumtemperatur suspendiert. 20 μl der Phagensuspension wurden dann zu 100 μl einer Über-Nacht-Kultur von DH10B (ZL) gegeben und für weitere 5 Minuten inkubiert. Verdünnte Lösungen der Mischung wurden dann auf mit Ampicillin angereicherten LB-Platten bei 50 μg/ml und 10 mM MgCl₂ ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Einzelne Kolonien, die nun die in den pZL1-Vektor eingefügte cDNA enthielten, wurden als standardmäßige Über-Nacht-Kulturen gezüchtet, und Plasmide wurden dann unter Verwendung von Reagenzien für die Reinigen von Plasmiden von Qiagen gereinigt.
Identifikation verschiedener funktionaler cDNA-Klone von MAdCAM-1 des Menschen
Zwei humane cDNA-Bibliotheken von histologisch normalen humanen mesenterialen Lymphknoten und entzündeten mesenterialen Lymphknoten eines Patienten mit Morbus Crohn wurden unter Verwendung der gesamten cDNA von MAdCAM-1 von Makaken als Sonde gescreent. Ein kreuz-hybridisierender Klon wurde aus der normalen Bibliothek isoliert und zwei kreuz-hybridisierende Klone wurden aus der Bibliothek für Morbus Crohn isoliert. Einer der zwei aus der Bibliothek für Morbus Crohn isolierten Klone war ungefähr 1,3 kb lang, schien an dem 5'-Ende unvollständig zu sein; und war nicht sequenziert. Der Klon aus der normalen Bibliothek (Klon 4) war etwas größer (1624 bp) als der längere, aus der Bibliothek für Morbus Crohn isolierte Klon (1558 bp) (Klon 20). Obwohl diese beiden cDNAs sich in Bezug auf Größe um ungefähr 100 bp unterscheiden, war die Länge ihrer nicht translatierten 5' und 3'-Sequenzen nahezu identisch. Jeder Klon schien die volle Länge zu haben, da sie beide eine Signalsequenz am aminoterminalen Ende enthielten, die fast identisch mit der Makakensequenz war.
Zusätzlich zeigte ein im Vorfeld durchgeführtes Sequenzieren dieselben Unterscheidungsmerkmale der aminoterminalen, Ig-ähnlichen Domäne wie bei der Primaten-DNA. Da die Größenunterschiede bei diesen Klonen nicht auf die Länge der nichttranslatierten Sequenzen zurückgeführt werde konnten, schien es wahrscheinlich, dass die Veränderung auf den codierenden Bereich zurückzuführen war.
Um zu bestimmen, ob jeder Klon für funktionales MAdCAM-1 des Menschen codiert, wurden die Inserts jedes Klons in den pCDNA-3-Expressionsvektor subkloniert (Invitrogen, San Diego, CA), der ein für die G418-Selektion geeignetes Neoresistenzgen trägt. Die humanen cDNAs (die unter Verwendung von NotI-oligo-dT-Primern an dem 3'-Ende und SalI-Adaptern an dem 5'-Ende) wurde auf den λZiplox-Vektor ligiert, der das Plasmid pZL1 enthält. pZL1-Vektoren mit cDNA-Inserts wurden wie oben beschrieben isoliert. Für das Subklonieren wurden die Klone 4 und 20 jeweils durch Verdau mit EcoRI und NotI aus dem pZL1-Backbone gelöst. Die EcoRI-NotI (5' → 3')-Fragmente wurde durch Geneclean (Bio 101) mit anschließender Elektrophorese auf einem 1 %-igen Agarosegel isoliert, und die Fragmente wurden in pcDNA-3 ligiert, die mit EcoRI und NotI gespalten worden waren. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um einen Strang mit der Wirksamkeit von DH10B E.coli Max (GIBCO) zu transformieren, und nach der Selektion auf mit 50 μg/ml Ampicillin (Amp) angereichertem LB-Agar wurden die Transformanten erhalten. Es wurden als pcD3huMAd4 (Insert von Klon 4) und pcD3huMAd20 (Insert von Klon 20) bezeichnete Plasmide erhalten und mit Hilfe eines Restriktionsverdaus analysiert.
Klon pcD3huMAd4 (Insert von Klon 4) oder pcD3huMAd20 (Insert von Klon 20) wurden transient in CHO/P-Zellen transfiziert. Jeder Klon richtete die Expression eines funktionalen Proteins, das Bindung und Adhäsion vermitteln konnte, wie durch die Adhäsion von CHO/P-Transfektanten an das humane B-Zell-Lymphom RPMI 8866 (5) oder an TK1-Zellen untersucht wurde (nicht gezeigt).
Adhäsion der CHO/P-Transfektanten an RPMI-8866-Zellen wurde durch Vorinkubation mit anti-α4β7 MAb-ACT-1, jedoch nicht durch Kontroll-IgG blockiert. Adhäsion von Transfektanten an die TK1-Zellen wurde durch anti-β7-MAb-FIB 504 blockiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass Klon 4 (aus einer Bibliothek von normalen mesenterialen Lymphknoten) und Klon 20 (aus einer Bibliothek von Morbus Crohn) jeweils für funktionale MAdCAM-1-Proteine codieren. Um diese unterschiedlichen cDNAs weiter zu charakterisieren, wurden beide Klone vollständig sequenziert.
Ergebnisse
Die cDNAs der Klone 4 und 20 codieren für MAdCAM-1 des Menschen und haben jeweils eine Länge von 1628 bp und 1543 bp. cDNA von Klon 4 (1, SEQ ID NO: 1) enthält ein offenes Leseraster von 1218 bp, der für ein vorhergesagtes Protein von 406 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2) und einen nicht-translatierten 3'-Bereich von 410 bp codiert, enthält jedoch keinen nicht-translatierten 5'-Bereich. cDNA von Klon 20 (2; SEQ ID NO: 3) enthält 4 bp der nicht-translatierten 5'-Sequenz, einen offenen Leseraster von 1146 bp, der für ein vorhergesagtes Protein von 382 Aminosäuren (SEQ ID NO: 4) und einen nicht translatierten 3'-Bereich von 393 bp codiert. Die vorhergesagten molekularen Massen der codierten Proteine nach der Spaltung einer vorhergesagten Signalsequenz aus 18 Aminosäuren sind 40,910 (Klon 4) und 38,375 (Klon 20) Dalton.
Mehrere Ausrichtungen wurden durchgeführt, um den Grad der Ähnlichkeit zwischen den verschiedenen geklonten Spezies von MAdCAM-1 zu analysieren. Nukleotidausrichtungen zeigten eine 81,9 %-ige Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen der cDNAs von MAdCAM-1 von Maus und Ratte, 41,8 % Ähnlichkeit zwischen den cDNAs von Maus und Makake und 42,1 %-ige Ähnlichkeit zwischen cDNAs von murinem und humanem (Klon 4) MAdCAM-1 und 41,8 %-ige Ähnlichkeit zwischen cDNAs von murinem und humanem (Klon 20) MAdCAM-1. Ausrichtung der Nukleotidsequenzen von MAdCAM-1 von Makaken mit cDNAs von humanem Klon 4 und Klon 20 zeigte Ähnlichkeiten zwischen den Sequenzen von jeweils 70,7 % und 75,0 %.
Die Ähnlichkeiten zwischen den Aminosäuresequenzen wurden auf 78,5 % zwischen MAdCAM-1 von Maus und Ratte, 44,3 % zwischen Maus und Makake und 39 % zwischen murinem MAdCAM-1 und dem durch den humanen Klon 4 codierten MAdCAM-1 festgelegt.
Vergleiche der cDNA-Klone 4 und 20 zeigten einen Bereich, der aufgrund einer Prävalenz von Serin-, Threonin- und Prolin-Resten (69 % für Klon 4 und 76 % für Klon 20) (in 1 und 2 umrahmt gezeigt) homolog zu dem Muzinbereich von murinem MAdCAM-1 ist. Dieser Bereich, obgleich in der Aminosäure-Zusammensetzung ähnlich dem murinen MAdCAM-1, ist in höchstem Maße verschieden von murinem MAdCAM-1. Der Bereich hat eine Länge von 71 Aminosäuren in Klon 4 und 47 Aminosäuren in Klon 20. Dieser Bereich enthält auch zwei Polymorphismen: (1) einen Polymorphismus bei Aminosäure 240, bei der es sich bei Klon 4 um Prolin (P) und bei Klon 20 um Serin (S) handelt; und (2) einen Polymorphismus bei Aminosäure 242, bei der es sich bei Klon 4 um Asparagin (N) und bei Klon 20 um Aspartat (D) handelt. Zusätzlich enthalten die humanen Muzin-Domänen eine sich wiederholende Sequenz aus 8 Aminosäuren, die aus der Sequenz PPDTTS(Q/P)E besteht, die bei Klon 4 acht Mal und bei Klon 20 fünf Mal auftritt.
Um die Herkunft der Klone 4 und 20 zu untersuchen, wurden die Wiederholungssequenz flankierende PCR-Primer verwendet, um die humane genomische DNA zu amplifizieren. Die folgenden Primer wurden verwendet:
5'-CTC TAC TGC CAG GCC ACG-3' (Primer Nr. 1, SEQ ID NO: 7)
5'-AGC CTG GGA GAT CTC AGG G-3' (Primer Nr. 2, SEQ ID NO: 8)
5'-GCC ACG ATG AGG CTG CCT GG-3' (Primer Nr. 3, SEQ ID NO: 9)
5'-GTG GAG CCT GGG CTC CTG GG-3' (Primer Nr. 4, SEQ ID NO: 10).
Die Primer waren aneinander gereihte Primer. In der ersten Reaktion wurden Primer 1 und 2 verwendet. Für die zweite Amplifikationsreaktion wurde eine 1:1000 verdünnte Lösung der ersten Reaktion hergestellt, und 1 μl wurde mit Primern 3 und 4 verwendet. Amplifikationsreaktionen enthielten entweder 0,5 μl genomischer DNA, 10 Picogramm Kontrollplasmide (pcD3HuMAd4 oder pcD3HuMAd20) oder ungefähr 1 ng doppelsträngige cDNA, die vorher für die ZipLox-Bibliotheken hergestellt worden war. Genomische DNA wurde von drei Quellen erhalten (Promega; ClonTech und durch Reinigung aus Jurkat-Zellen). Die Bedingungen der Amplifikation waren die folgenden: ein 5 Minuten langer Zyklus bei 94 °C; 25 45 Sekunden lange Zyklen bei 94 °C; 45 Sekunden lang bei 60 °C und eine Minute lang bei 72 °C mit einem anschließenden, 5-minütigen Zyklus bei 72 °C.
Durch die Amplifikationsreaktionen aus genomischer DNA erhielt man zwei Banden, die mit den einzelnen Produkten der PCR-Reaktionen unter Verwendung von cDNA von Klon 4 oder Klon 20 als Templat komigrierten. Diese Daten legen nahe, dass die zwei cDNA-Klone durch genomische DNA codierte Isoformen sind und wahrscheinlich durch alternatives Spleißen oder durch die Transkription von zwei verschiedenen Allelen erzeugt werden. Eine erhebliche Polymorphismus- und Sequenzdivergenz wurden in anderen Muzinsequenzen (z. B. Hilkens, J. et al., Trends, Biochem. Sci, 17: 359–363 (1992)) dokumentiert. Zum Beispiel sind repetitive Abschnitte von intestinalen Muzinen bei Nagetieren und Menschen nicht hinreichend erhalten geblieben (Gum, J.G. et al., J. Biol. Chem., 266: 22733–22738 (1991)). Ein Widerspruch liegt darin, dass auf Grundlage einer Analyse von muriner Genomstruktur die humane genomische DNA ein Intron in diesem Bereich enthalten könnte. Wenn dem so ist, würden die in diesem Versuch verwendeten PCR-Primer das Intron überstreichen, und es würde nicht erwartet werden, dass eine Amplifikation von humaner genomischer DNA Banden derselben Größe erzeugen, wie sie durch die Amplifikation der cDNA-Kontrollen hergestellt werden. Isolierung und Analyse von genomischen Klonen von MAdCAM-1 des Menschen können demzufolge die Möglichkeit eines Klonierungsartefakts ausschließen. Eine weitere Untersuchung von normalem und/oder entzündetem Gewebe von normalen Individuen und von Patienten mit IBD, Morbus Crohn oder anderen Entzündungskrankheiten könnte durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob eine Korrelation zwischen der Isoform von Klon 20 und einer Entzündungskrankheit oder Entzündungsaktivität vorliegt.
Der Vergleich von MAdCAM-1 von Mäusen, Makaken und zwei humanen Isoformen zeigt, dass die aminoterminalen Abschnitte dieser Rezeptoren Domänenstrukturen aufweisen, die wahrscheinlich mit der Erkennung von α4β7 in Verbindung stehen. Im Gegensatz dazu weisen die Bereiche dieser Rezeptoren an einem dem Ort der Muzin-/IgA-Domäne von murinem MAdCAM-1 entsprechenden Ort ähnliche Aminosäure-Zusammensetzungen (Serin-, Threonin-, Prolinreiche Muzinbereiche) auf, unterscheiden sich jedoch stärker voneinander.
Expression von RNA von MAdCAM-1 des Menschen
Eine Analyse mittels Northern Blot wurde unter Verwendung von mehreren Analysen Northern I und II für unterschiedliches Gewebe (im Handel erhältlich von Clontech, Palo Alto, CA) oder 2 μg von polyA+-RNA von Zelllinien und Geweben, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, durchgeführt. RNA wurde denaturiert und es wurde eine Elektrophorese durch ein 1 %-iges Agarose-Formaldehydgel durchgeführt und auf eine PVDF-Membran (Immobilion, Millipore) durch standardmäßige Kapillar-Blot-Verfahren übertragen. RNA-Proben wurden mit Ethidiumbromid gefärbt, um von Anfang an sicherzustellen, dass die Qualität und Quantität jeder Zell- oder Gewebe-RNA gleich war. Nach der Übertragung wurde die RNA durch UV-Crosslinking (Stratalinker, Stratagene) auf Membranen fixiert, und dieser Blot sowie die kommerziell hergestellten Blots wurden bei 68 °C eine Stunde lang in ExpressHyb (Clontech) prähybridisiert. Das cDNA-Insert von Klon 4 wurde mit α³²P-dCTP durch Versehen mit Zufallshexamer-Primern markiert (Maniatis et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (199)). Die Hybridisierung wurde 1 Stunde lang bei 68 °C in ExpressHyb bei einer Konzentration von 2 × 10⁶ cpm/ml mit einer denaturierten Sonde durchgeführt.
Die Blots wurden dann bei 65 °C 60 Minuten lang in 0,1 × SSC, 0,1 % SDS mit einer Veränderung der Wäsche nach 30 Minuten gewaschen. Die Expositionszeit betrug mit einem Verstärkungsscreen 48 Stunden. Nach dieser Exposition wurde der Blot durch 10-minütiges Waschen in 0,5 % SDS abgestreift und unter denselben Bedingungen mit einer β-Aktin-cDNA erneut hybridisiert. Die Expositionszeit betrug 2 Stunden.
Ergebnisse
Für die MAdCAM-1-Expression wurden Northern Blots untersucht, die das gesamte cDNA-Insert von Klon 4 als eine Sonde verwenden. Eine einzelne RNA-Spezies von ungefähr 1,6 kb wurde in großem Maße in dem Dünndarm und in geringerem Maße im Colon und der Milz exprimiert. In anderen, unter diesen Bedingungen untersuchten Geweben, einschließlich Thymusdrüse, Prostata, Eierstöcke, Hoden sowie Leukozyten des peripheren Blutes (PBL, peripheral blond leukocytes), wurde keine signifikante Expression beobachtet. Dieses gewebespezifische Expressionsmuster entspricht Studien an der Maus, welche eine eingeschränkte Expression von MAdCAM-1 in Peyer Plaques, MLN (mesenterialer Lymphknoten), Lamina propria des Dünndarms und einer gewissen Expression in dem marginalen Sinus um die Knoten der weißen Milzpulpa in der Milz herum (Hemler, M.E., Annu. Rev. Immunol., 8: 365 (1990); Berg, E.L., et al., Cellular and molecular mechanisms of inflammation, 2: 111 (1991); Briskin, M.J., et al., Nature, 363: 461 (1993)) zeigt. Keine signifikante Expression wurde in anderen untersuchten Geweben, einschließlich Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel oder Niere beobachtet, allerdings wurden niedrige Expressionsniveaus in der Bauchspeicheldrüse detektiert. Diese Daten zeigen an, dass die Expression von MAdCAM-1 des Menschen gewebespezifisch ist, mit einer Expression in Mucosalgeweben und der Milz; eine ausführliche immunhistochemische Analyse der Gewebeverteilung kann unter der Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen MAdCAM-1 des Menschen (siehe unten) durchgeführt werden.
Beispiel 2. Charakterisierung von MAdCAM-1-Klonen
Funktionale Adhäsionsassays
Plasmide:
Die folgenden Plasmide wurden in den funktionalen Adhäsionsassays verwendet: (1) pSV-SPORT-1 (Gibco/BRL) oder pcDNA-3 (Invitrogen) wurden als Kontrollen verwendet; (2) murines MAdCAM-1 in pCDM8 (pCDMAD-7; Briskin, M.J., et al., Nature, 363: 461 (1993)); (3) humanes VCAM-1 mit sieben Domänen (Polte, T., et al., Nucleic Acids Res., 18: 5901 (1990)) in pcDNA3 (pCD3VCAM); und (4) MAdCAM-1 des Menschen in pcDNA-3 (pCDhuMAd4) (siehe oben).
Monoklonale Antikörper:
Die folgenden monoklonalen Antikörper (MAb, monoclonal antibodies) wurden in den funktionalen Adhäsionsassays verwendet: (1) anti-muriner MAd-CAM-1 MAb MECA-367 (American Type Culture Collection (Rockville, MD), Accession-Nr. HB9478; Streeter, P.R., et al., Nature, 331: 41 (1988); und US-Patent Nr. 5,403,919 von Butcher); (2) anti-humaner VCAM-1 MAb 2G7 (American Type Culture Collection (Rockville, MD); Graber, N.T., et al., J. Immunolog. 145: 819–830 (1990)); (3) antimuriner α4β7 MAb DATK 32 (Andrew, D.P., et al., J. Immunol., 153: 3847–3861 (1994)); (4) anti-muriner β7 MAb FIB 504 (Andrew, D.P., et al., J. Immunol., 153: 3847 (1994)); (5) anti-humaner α4β7 MAb ACT-1 (Lazarovits, A.I., et al., J. Immunol., 133: 1857 (1984)); (6) anti-humanes Integrin β1 (CD29) (Becton Dickinson; San Jose, CA, Kat. Nr. 550034); und (7) murines IgG1 und IgG2A der Ratte als irrelevante Kontrollen.
Zelllinien:
Die folgenden Zelllinien wurden in den funktionalen Adhäsionsassays verwendet:
(1) murine TK1 aus T-Zell-Lymphom (Butcher, E.C., et al., Eur. J. Immunol., 10: 556–561 (1980); E. Butcher (Stanford, CA); (2) RPMI 8866, eine humane Linie des B-Zell-Lymphoms, die α4β7 (und nicht α4β1) exprimiert (American Type Culture Collection (Rockville, MD); Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153: 517 (1994); eine Spende von D. Erle); (3) JURKAT, eine humane T-Zelllinie, die α4β1 (und nicht α4β7) exprimiert (American Type Culture Collection (Rockville, MD)); und (4) Ramos, eine humane (B-lymphozytische) Burkitt-Lymphom-Zelllinie, die α4β1 (und nicht α4β7) exprimiert (American Type Culture Collection (Rockville, MA), Accession Nr. ATCC CRL 1596).
Funktionale Adhäsionsassays:
Für funktionale Adhäsionsassays wurden verschiedene Spezies von MAdCAM-1, humanem VCAM-1 codierende Plasmide und Kontrollplasmide durch transiente Transfektion in CHO/P-Zellen wie oben beschrieben (Beispiel 1) eingebracht, und zwar mit den folgenden Modifikationen. Da mehrere Wells für die Studien zur Hemmung von Antikörpern transfiziert werden mussten, wurde zunächst eine Master-Liposomenmischung mit Vielfachen der zu transfizierenden Wells für jedes Plasmid hergestellt. Dies stellte sicher, dass dieselbe Liposommischung in jedes Well transfiziert wurde.
48 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium entfernt. Ein Antikörper-Überstand (0,25 ml) (enthaltend entweder humanes VCAM-1 MAb 2G7 oder anti-murines MADCAM-1 MAb MECA-367), oder 0,25 ml eines Adhäsionsassaypuffers als eine Kontrolle wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 4 °C 15 Minuten lang vorinkubiert.
Gleichzeitig wurden Lymphozyten-Zelllinien (RPMI 8866 oder Jurkat) geschleudert und erneut bei einer Dichte von 2 × 10⁶/ml in Assaypuffer bestehend aus mit 2% bovinem Kälberserum, 20 mM HEPES pH 7,3, 2 mM Mg²⁺ und 2 mM Ca²⁺ angereichertem HBSS (ohne CA²⁺ oder Mg²⁺) suspendiert. Aliquote von 0,25 ml (5 × 10⁵ Zellen) dieser RPMI 8866- oder JURKAT-Zellsuspensionen wurden mit einem geringen Volumen von verschiedenen gereinigten Antikörpern oder mit einem gleichen Volumen eines Überstands von DATK 32 15 Minuten lang bei 4 °C vorinkubiert. Bei Verwendung von DATK 32 in einer Vorinkubation mit einer Zelllinie wurde der in den Wells vorhandene Überstand oder Puffer (der die Transfektanten enthielt) vor dem Beginn des Assays aufgesaugt, um ein Gesamtvolumen von 0,5 ml für den Adhäsionsassay zu erhalten.
Für die Vorinkubationen wurden gereinigte Antikörper (ACT 1, FIB 504 anti-β1) und Kontroll-IgG-Antikörper mit Konzentrationen von 20 μg/ml verwendet. 0,25 ml Antikörper-Überstand (unverdünnt verwendet) enthaltend anti-humanes VCAM-1 (MAb 2G7) oder anti-murines MAdCAM-1 (MAb MECA-367) wurden in den Vorinkubationen verwendet. 0,25 ml Antikörper-Überstand von DATK 32 wurden in der Vorinkubation verwendet.
Nach den Vorinkubationen wurden Zelllinien (Jurkat oder RPMI 8866) mit den Transfektanten in den Wells vereinigt, und die Inkubation mit einem Einsatz für Schüttelkolben wurde zusätzliche 30 Minuten lang bei 4 °C fortgesetzt.
Die Assays wurden wie oben beschrieben fixiert. Platten wurden mindestens 1 Stunde lang durch vorsichtiges Invertieren in einem großen Becherglas mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gefolgt von Inversion in einem Becherglas mit PBS mit 1,5 Gluteraldehyd für die Fixierung gewaschen. Die Adhäsion wurde untersucht, indem sowohl Lymphozyten als auch CHO-Zellen in einem Feld mit 20-facher Vergrößerung gezählt wurden. Für jeden Assay wurde die Anzahl der pro CHO/P-Zelle gebundenen Lymphozyten im Durchschnitt als ein Minimum von vier Feldern mit Standardfehler berechnet. Die jeweiligen Ergebnisse stammen aus einem von drei Experimenten, die mit ähnlichem Ergebnis durchgeführt wurden.
Ergebnisse
Murines MAdCAM-1 bindet spezifisch an α4β7 (und nicht α4β1) exprimierende Lymphozyten. Um die Spezifität von humanen MAdCAM-1-Lymphozyten-Interaktionen zu bestimmen, wurden Adhäsionsassays durchgeführt, um die Fähigkeit von transient transfizierten, MAdCAM-1 des Menschen exprimierenden CHO/P-Zellen, an die ausschließlich α4β7 exprimierende RPMI 8866-Zelllinie (Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153: 517 (1994)) oder an die ausschließlich α4β1 exprimierende T-Zelllinie Jurkat zu binden, zu untersuchen. Die Bindung dieser Zelllinien wurde mit transient transfizierten CHO/P-Zellen, die murines MAdCAM-1 und humanes VCAM-1 exprimieren, verglichen. Die Ergebnisse werden in den 4A–4B dargestellt.
RPMI 8866-Zellen banden nicht an Kontrolltransfektanten, zeigten aber eine große Bindungsbereitschaft an humanes oder murines MAdCAM-1 exprimierende Transfektanten. Diese Bindung wurde vollständig durch die Vorinkubation mit anti-α4β7 MAb ACT-1 (4A) inhibiert. VCAM-1-Transfektanten konnten nicht an RPMI 8866 binden, was der vorangehend gezeigten Tatsache entspricht, dass α4β7/VCAM-1-Interaktionen aktivierungsabhängig sind (Postigo, A.A., et al., J. Immunol., 151: 2471–2483 (1993); Ruegg, C., et al., J. Cell. Biol., 117: 179–189 (1992)). Das Unvermögen von RPMI 8866-Zellen, an VCAM-1-Transfektanten zu binden, wurde nicht durch fehlende Expression verursacht, da die FACS-Analyse unter Verwendung von anti-VCAM-1 MAb 2G7 eine Wirksamkeit der Transfektion von ~60 % anzeigte. Des Weiteren waren dieselben VCAM-1-Transfektanten in der Lage, an Jurkat-Zellen zu binden, und die Bindung wurde durch Vorinkubation mit anti-VCAM-1 oder anti-β1-MAbs (4B) vollständig inhibiert. Murine und humane MAdCAM-1-Transfektanten banden keine Jurkat-Zellen (eine α4β1-positive Linie). Diese Daten beweisen, dass MAdCAM-1 des Menschen selektiv an humane Leukozyten-Lymphozyten, die α4β1-Integrine exprimieren, binden kann.
L1-2 und CHO-Zelltransfektanten
Die Maus-L1-2-Zelllinie ist aus einem Pre-B-Lymphom abgeleitet und wurde von Dr. Eugene Butcher (Stanford University, Stanford, CA) erhalten. Die für die cDNAs von MAdCAM-1 von Makaken oder des Menschen codierenden Gene wurden in den pcDNA-3-Vektor (Invitrogen) wie oben beschrieben subkloniert. Die resultierenden Plasmide (pcD3HuMAd4, pcD3HuMAd20 oder pCD3Pmad (Makaken)) wurden durch Transfektion in L1-2-Zellen wie folgt eingebracht: L1-2-Zellen wurden bis zu einer Dichte von ungefähr 10⁶/ml gezüchtet. Entweder 50, 25 oder 12,5 Millionen Zellen wurden in HBSS gewaschen und dann in 0,8 ml eines Puffers, der aus einer mit 20 mM HEPES, pH 7,05, angereicherten, balancierten Hanks-Salzlösung bestand, erneut suspendiert. Eine Lösung, die aus 20 μg linearisiertem Plasmid, 500 μg tRNA und HBSS, um das Endvolumen auf 200 μl zu erhalten, bestand, wurde der Zellsuspension hinzugefügt, um das Gesamtvolumen auf 1 ml zu erhalten. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Zell-/DNA-Mischung auf eine Elektroporationsküvette (BioRad, Richmond, CA) übertragen, und bei 250 Volt, 960 mF in einem BioRad Gene Pulser elektroporiert. Nach weiteren 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen auf 25 ml in einem standardmäßigen L1-2-Wachstumsmedium (RMPI 1640, 10 % fötales bovines Serum Hyclone, 50 U/ml Penicillin/Styreptomycin (Gibco) und 0,29 mg/ml L Glutamin (Gibco) gelöst und bei 37 °C zurück in den Inkubator gegeben. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren pelletiert und erneut in 50 ml eines mit G418 angereicherten L1-2-Mediums (Geneticin; Gibco) mit 0,8 mg/ml suspendiert. Verdünnte Lösungen der Zellsuspension wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten ausgestrichen und einzelne Kolonien zwecks Analyse der Expression von MAdCAM-1 wurden gezüchtet.
MAdCAM-1 exprimierende L1-2-Zellklone konnten durch die Anheftung an TK1-Zellen detektiert werden. Sowohl L1-2 (nicht transfizierte Zellen) als auch TK1-Zellen werden als einzelne Zellsuspensionen gezüchtet. Die Expression von MAdCAM-1 auf der Oberfläche kann durch dessen Fähigkeit, die Adhäsion durch eine Interaktion mit dem auf den TK1-Zellen exprimierten α4β7 zu vermitteln, detektiert werden. Die Spezifität dieser Interaktion wurde weiterhin durch die Inhibition durch Vorbehandlung von TK1-Zellen mit anti-β7 MAb FIB 504 bewiesen.
CHO-Zellen (Zellen aus Ovarien von chinesischen Hamstern; American Type Culture Collection (Rockville, MD)), die mit Klonen von MAdCAM-1 von Makaken oder des Menschen stabil transfiziert worden waren, wurden durch Elektroporation wie oben für die L1-2-Zellen beschrieben, hergestellt, jedoch mit den folgenden Ausnahmen:
Ein Medium für das CHO-Zellwachstum war α-MEM mit Desoxyribonukleosiden (Gibco) und 10 % fötalem Kälberserum (Gibco) und 50 U/ml Penicillin/Streptomycin (Gibco) und 0,29 mg/ml L-Glutamin (Gibco). Das Selektionsmedium bestand aus demselben Medium mit 0,55 mg/ml G418 (Gibco). Einzelne Klone wurden gezüchtet und im Hinblick auf ihre Fähigkeit, α4β7-abhängiges Binden von RPMI 8866-Zellen unter Verwendung des oben beschriebenen funktionalen Adhäsionsassays (für transiente) aufzuweisen analysiert, mit der Ausnahme, dass, dass Zellen am Tag vor dem Assay mit 50 000 Zellen pro Well auf einer 24-Well-Platte ausgestrichen wurden. Unter Anwendung dieses Kriteriums wurde eine CHO-HuMAd 4 genannte Linie etabliert.
Für das Inhibieren der Adhäsion geeignete monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper gegen MAdCAM-1 des Menschen wurden durch Immunisieren von C57BL/6-Mäusen mit L1-2 MAdCAM-1-Transfektanten erzeugt. Mäuse wurden drei Mal im Abstand von zwei Wochen intraperitoneal mit 10 Milionen in HBSS resuspendierten Zellen immunisiert, und eine abschließende vierte Immunisierung (von 10 Millionen in HBSS resuspendierten Zellen) wurde intravenös injiziert. Die ersten Immunisierung wurde mit einer Mischung von zwei Klonen (L1-2-Zellklon 23 und -Klon 19) durchgeführt, die MAdCAM-1 von Makaken exprimieren. Die verbleibenden Anstiege wurden mit einem einzelnen, MAdCAM-1 des Menschen exprimierenden L1-2-Klon durchgeführt (L1-2-Klon HuMAD4/17).
Eine erfolgreiche Fusion wurde durchgeführt, die ungefähr 5 000 Hybridome erzeugte. Vier Tage nach der letzten intravenösen Injektion wurde die Milz entfernt und eine einzelne Zellsuspension wurde in serumfreien DMEM-Medium hergestellt. Diese Zellen wurden gemäß dem Verfahren von Galfre et al. (Galfre, G., et al., Nature 299: 550–552 (1977)) mit dem Fusionspartner SP2/0 fusioniert. 20 ml Milzzellen und 20 ml SP2/0-Zellen wurden vereinigt, bei 800 g 5 Minuten lang geschleudert, und das Medium wurde durch Absaugen entfernt. Eine Lösung von 50 % Polyethylenglycol 1500 (PEG 1500) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), die auf 37 °C vorgewärmt wurde, wurde 2 Minuten lang zu dem Zellpellet hinzugefügt, anschließend wurden 3 Minuten lang 10 ml DMEM-Medium hinzugegeben. Die Zellsuspension wurde bei 600 g 3 Minuten lang geschleudert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde vorsichtig in DMEM-Medium mit 20 %-igem fötalen Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycinsulfat und HAT-Selektionsmedium (Sigma, St. Louis, MO) resuspendiert. Die Zellen wurden mit 200 μl/Well in zehn 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden ausgestrichen.
Zehn Tage nach der Fusion wurden Überstände aus den Wells im Hinblick auf ihre Reaktivität gegenüber CHO-Transfektanten von Mad-CAM-1 des Menschen (CHO HuMAd4-Zellen) mit Hilfe von Fluoreszenzfärbung gescreent. Das Färben von 500 000 Zellen pro Probe wurde im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt, unter Verwendung von 50 μl jedes Überstandes und 50 μl Zellen (E. Harlow und D. Lane, 1989, in: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Der sekundäre Antikörper war ein FITC-markiertes anti-murines IgG (H+L) (Jackson Labs), das im Verhältnis 1:200 verdünnt war. Eine hohe Reaktivität wurde als eine Erhöhung der Fluoreszenz um 2–3 log im Vergleich zu nicht transfizierten CHO-Zellen bezeichnet.
48 Antikörper-Überstände wurden aufgrund starker Reaktivität gegen CHO HuMAd4-Zellen ausgewählt. Diese Antikörper-Überstände wurden dann auf ihre Fähigkeit, die Adhäsion von CHO-HuMAd4-Zellen an RPMI 8866-Zellen zu blockieren, untersucht. Als Kontrolle wurde die Fähigkeit von Überständen, die Bindung von Ramos-Zellen an VCAM-1-Transfektanten zu inhibieren, untersucht, da diese nicht durch ein spezifisches anti-humanes MAdCAM-1-MAb beeinflusst wurde. Um das Blockieren von anti-humanen monoklonalen Antikörpern von MAdCAM-1 zu identifizieren, wurde der folgende Assay durchgeführt. Um Kontroll-Transfektanten bereitzustellen, wurden CHO/P-Zellen wie oben beschrieben mit pCD3VCAM transfiziert und 48 Stunden nach der Transfektion mit Hilfe eines Assays untersucht. 48 Stunden vor dem Assay bezüglich der Inhibition der Adhäsion wurden 40 000 Zellen pro Well von transienten VCAM-1-Transfektanten auf 24 Well-Platten ausgestrichen. 24 Stunden vor dem Assay wurden 50 000 Zellen pro Well von CHOHuMAd4-Transfektanten auf 24 Well-Platten ausgestrichen. An dem Tag des Assays wurde jeder antihumane MAdCAM-1-Überstand (0,25 ml) zu einem Well hinzugegeben, das entweder CHOHuMAD4-Transfektanten oder VCAM-1-Transfektanten enthielt, und die Mischung wurde bei 4 °C 15 Minuten lang vorinkubiert. Adhäsionsassays wurden unter Verwendung von Folgendem durchgeführt: (1) RPMI 8866-Zellen für die MAdCAM-1-Transfektanten oder (2) Ramos-Zellen (eine humane B-Zelllinie, die α4β1 exprimiert) für die VCAM-1-Transfektanten.
Gleichzeitig wurden Zellen (RPMI 8866 oder Ramos) bei einer Dichte von 2 × 10⁶ ml in einem Assaypuffer bestehend aus HBSS (ohne CA²⁺ oder Mg²⁺) angereichert mit 2% bovinem Kälberserum, 20 mM HEPES pH 7,3; 2 mM Mg²⁺ und 2 mM Ca²⁺ resuspendiert. Nach der Vorinkubation der Transfektanten mit dem Antikörper wurden 0,25 ml der Zellsuspensionen von RPMI 8866 oder Ramos (5 × 10⁵ Wells) zu jedem Well hinzugefügt, und die Inkubation mit einem Einsatz für Schüttelkolben wurde zusätzliche 30 Minuten lang bei 4 °C fortgesetzt. Die Wells wurden gewaschen, fixiert und wie oben beschrieben untersucht, um die Inhibition der Bindung zu untersuchen.
Elf der 48 untersuchten Hybridom-Überstände zeigten eine wesentliche Blockierungsaktivität, welche die Adhäsion von RPMI 8866-Zellen an MAdCAM-1 exprimierende Transfektanten hemmte. Adhäsion von Ramos-Zellen an VCAM-1 exprimierende Transfektanten wurde nicht beeinflusst, was auf eine selektive Inhibition von α4β7-vermittelten Interaktionen schließen lässt. Ausgewählte blockierende Hybridome wurden durch serielle Verdünnung subkloniert.
Ergebnisse
Stabile Zelllinien, die MAdCAM-1 von Makaken oder des Menschen exprimieren, wurden in dem murinen Pre-B-Lymphom L1-2 hergestellt. Diese Zellen wurden verwendet, um C57BL/6-Mäuse zu immunisieren und um Hybridome herzustellen. Die resultierende Fusion wurde mittels Immunfluoreszenzfärben von MAdCAM-1 des Menschen exprimierenden CHO-HuMAd4-Transfektanten gescreent. Das Screenen von ungefähr 1 000 Wells erzeugte 48 Überstände mit starker Reaktivität gegen die CHO-HuMAd4-Transfektanten, während nicht transfizierte CHO-Zellen negativ waren. Diese Überstände wurden anschließend auf ihre Fähigkeit, die Adhäsion von RPMI 8866-Zellen an humane MAdCAM-1-Transfektanten spezifisch zu blockieren, getestet.
11 der 48 untersuchten Hybridome konnten die Adhäsion von RPMI 8866-Zellen an MAdCAM-1 spezifisch inhibieren, während die Adhäsion der Ramos-Zellen (die α4β1 exprimieren) an VCAM-Transfektanten durch dieselben Überstände nicht beeinflusst wurde. Diese Hybridome wurden als 10G4, 8C1, 10G3, 9G12, 9E4, 7H12, 10F2, 10A6, 1E5, 2F5, 7G11 bezeichnet.
Beispiel 3. Ausgestaltung und funktionale Analyse einer humanen MAdCAM-1-IgG-Chimäre
Konstruktion der MAdCAM-IgG-Chimäre
Die cDNA des humanen MAdCAM-1-Klons 4 in pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), genannt pcD3huMAD4) (Beispiel 1) wurde als ein Templat für die PCR-Amplifikation von extrazellulären Bereichen von MAdCAM-1 des Menschen, das mit dem konstanten Bereich des humanen IgG1 fusioniert werden sollte, verwendet. Der Primer HUMADIG4/2 (SEQ ID NO: 11), der das 5'-Ende der Codierungssequenz von MAdCAM-1 des Menschen (ATG-Codon, fettgedruckt) enthält, wurde synthetisiert:
Dieser 5'-Primer wurde im Zusammenhang mit einem als HUMADIG2 bezeichneten 3'-Primer (SEQ ID NO: 12) verwendet, um Bereiche zu amplifizieren, welche für die zwei aminoterminalen Immunglobulinähnlichen Domänen (Ig-Domänen) von MAdCAM-1 des Menschen codieren. Der Primer HUMADIG2 (SEQ ID NO: 12), der einen zu Nukleotiden 667–683 von SEQ ID NO: 1 des Codierungstranges komplementären Abschnitt enthält, weist die folgende Sequenz auf:
Alternativ wurde der 5'-Primer in Verbindung mit 3'-Primer HUMADIG3 verwendet, um einen Bereich zu amplifizeren, derfür die gesamte extrazelluläre Domäne von MAdCAM-1 des Menschen codiert (Klon 4). Der 3'-Primer HUMADIG2 (SEQ ID NO: 12), der einen zu den Nukleotiden 992–1010 von SEQ ID NO: 1 des codierenden Stranges komplementären Abschnitt aufweist, weist die folgende Sequenz auf:
Die Primer wurden mit einer 5'-HindIII-Stelle oder 3'-SpeI-Stellen wie gezeigt ausgestaltet. Diese Primer wurden verwendet, um zwei verschiedene MAdCAM-Fragmente mittels PCR unter Verwendung eines PCR-Optimizer-Kits von Invitrogen (San Diego, CA) zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden mit den Enzymen HindIII und SpeI verdaut, um Enden für das Klonieren zu erzeugen. Die Produkte wurden anschließend mittels Gelelektrophorese unter Verwendung eines Glassmax-DNA-Isolierungssystems (Gibco, Bethesda, MD) gereinigt.
Ein ~1 kb langes Fragment, das die CH1-, H-(Gelenkregion), CH2- und CH3-Bereiche umfasst, wurde durch Verdau mit SpeI und EcoRI aus einem Konstrukt, das für eine schwere Kette des humanen Immunglobulins 71 codiert mit einem Fc-mutierten konstanten humanen Bereich ausgeschnitten. Der durch dieses Konstrukt codierte Antikörper wurde als eine Isotyp-spezifische irrelevante Kontrolle verwendet. Der humane konstante Bereich in diesem Konstrukt wurde ursprünglich durch PCR-Amplifikation der schweren Kette CAMPATH-1H (Reichmann, L. et al., Nature, 322: 323–327 (1988)) wie von Sims M.J. et al. (J. Immunol., 151: 2296–2308 (1993)) und Waldmann et al. ( WO 93/02191 , 4. Februar 1993 (Seite 23)) beschrieben, deren Lehren hierin durch die Bezugnahme darauf in ihrer Gesamtheit inkorporiert sind. Die Mutationen in dem konstanten Bereich dieses Konstrukts (Leu²³⁴ → Ala²³⁴ und Gly²³⁷ → Ala²³⁷) wurden derart ausgestaltet, dass sie ein Binden an humane Fcγ-Rezeptoren verringerten, und sie wurden durch Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese hergestellt. Somit enthalten die hergestellten MAdCAM-Ig-Fusionen das von Sims et al. (J. Immunol., 151: 2296–2308 (1993)) und Waldmann et al. ( WO 93/02191 ) beschriebene SpeI-EcoRI-Fragment mit dem konstanten Bereich, mit der Ausnahme, dass, dass Leu²³⁴ → Ala²³⁴ und Gly²³⁷ → Ala²³⁷-Mutationen eingebracht wurden.
Das SpeI-EcoRI-Fragment von 1 kb, das den konstanten Fc-mutierten Bereich von IgG1 codiert, wurde durch Gelelektrophorese unter Verwendung des Glassmax DNA-Isolierungssystems (Gibco, Bethesda MD) isoliert. Dieses Fragment mit dem konstanten Bereich, die HindIII-SpeI-Fragmente, die entweder (a) die beiden N-terminalen Ig-Domänen von MAdCAM-1 oder (b) die gesamte extrazelluläre Domäne enthalten, wurden in einer Drei-Wege-Ligation an Vektor pEE12 ((Stephens, P.L. und M.L. Cockett, Nucl. Acids Res., 17: 7110 (1989) and Bebbington, C.R. und C.C.G. Hentschel, 1987, The use of vectors based an gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells, (Academic Press, N.Y.)) ligiert, der mit HindIII und EcoRI verdaut worden war. Es wurden Transformanten des Bakterienstammes DH10B erhalten. Kolonien wurden gezüchtet, und Minipräparate von Plasmiden wurden durch Restriktionskartierung analysiert. Drei Konstrukte, die für Fusionsproteine codieren, die entweder die gesamte extrazelluläre Domäne von MAdCAM-1 (Konstrukt HuMAdIg21) oder die beiden an den Fc-mutierten konstanten IgG1-Bereich fusionierten N-terminalen Ig-Domänen (Konstrukt HumAdIg31 oder HuMAdIg38) umfassten, wurden über die gesamten MadCAM-1-Abschnitte sequenziert, und bestätigten so die erfolgreiche Fusion von Segmenten und das Fehlen von PCR-induzierten Mutationen. Für ein anfängliches Testen wurde jedes Konstrukt unter Verwendung von Elektroporation mit einem Biorad Gene Pulser unter Standardbedingungen (960 μF, 250 V) transient auf Monoschichten von 5 × 10⁷ COS-Zellen in 1 ml RPMI-Puffer (kein Serum) und 25 μg Plasmid transfiziert. 72–96 Stunden nach der Transfektion wurden die Überstände geernet, durch 0,45 μ-Filter gefiltert und bei 4 °C in Gegenwart von 0,05 % Natriumazid gelagert. Die Herstellung der Chimäre wurde unter Verwendung eines anti-humanen-IgG1-Antikörpers als Capture-Antikörper sowie unter Verwendung desselben Antikörpers, der an alkaline Phosphatase als zweiter Antikörper für die Detektion konjugiert war, durch einen Sandwich-ELISA-Test bestätigt. Ein irrelevanter Kontroll-Antikörper (mit einem identischen konstanten Bereich) wurde als Standard verwendet. Die Chimäre wurde auch mit Hilfe von Western Blotting unter Verwendung eines anti-humanen, monoklonalen MAdCAM-1-Antikörpers analysiert und es wurde gefunden, dass deren Größe bei ungefähr 200 kd liegt, entsprechend der Größe des Homodimers.
Spezifische Bindung löslicher humaner MAdCAM-Ig-Chimären an α4β7-positive Zellen
Überstände von vier verschiedenen Transfektionen wurden auf ihre Fähigkeit, die T-Zelllinie HuT 78 zu färben, von der man im Vorfeld gezeigt hatte, dass sie MAdCAM-1 nur in Gegenwart von Mn²⁺ bindet, untersucht. Dementsprechend enthielt jede in diesem Assay verwendete Lösung 2 mM Mn²⁺. HuT 78-Zellen (eine humane T-Zell-Lymphomlinie; American Type Culture Collection, Accession Nr. ATCC TIB 161) sind α4β7-tragende Zellen. Um die Bindungsspezifität der Chimäre zu testen, wurden HuT 78-Zellen entweder mit dem Medium allein (RPMI 1640 mit 2 % FCS) oder mit Medium und 10 μg/ml des anti-β7-Antikörpers FIB 504 vorinkubiert. Ungefähr 100 000 Zellen wurden 15 Minuten lang auf Eis inkubiert und dann mit HBSS plus 2 % FCS/2 mM Ca²⁺/2 mM Mn²⁺ gewaschen. Zellen wurden dann 20 Minuten lang erneut auf Eis mit Medium gewaschen oder mit Überständen aus einer von vier unabhängigen Transfektionen, davon zwei 20 Minuten lang mit einer Chimäre enthaltend die gesamte extrazelluläre Domäne von MAdCAM-1 (Klon 21) und zwei mit einer abgeschnittenen Form von MAdCAM enthaltend die beiden N-terminalen Ig-Domänen (Klon 38). Nach dem Waschen wurden Zellen dann mit einem mit Phycoerythrin konjugierten anti-humanen IgG-Antikörper inkubiert, und das Färben vor dem Hintergrund wurde mit Hilfe von Durchflusszytometrie (FACScan) untersucht. Nur Zellen, die mit den Chimär-Überständen inkubiert waren, färbten sich vor dem Hintergrund, während die Vorinkubation mit dem β7-MAb diese Einfärbung auf die Hintergrundniveaus reduzierte und so eine spezifische Interaktion der Chimäre mit dem α4β7-Integrin (17A–17E) anzeigte.
Permanente NSO-Zelllinien, die humane MAdCAM-Ig-Chimären sekretierten, wurden nach der Transfektion durch Elektroporation und durch Aufzucht in einem Glutaminfreien Medium wie vorangehend beschrieben, selektiert (Cockett, M.L., et al., Bio/Technology, 8: 662–667 (1990)). Klonierte Zelllinien wurden so angepasst, dass sie in Rotationskulturen (spinner cultures) wachsen konnten. Überstände aus drei dieser klonierten Linien (Proben B–D) und eine teilweise gereinigte Chimäre (Klon 21, gereinigt durch das Binden an Protein A, Probe A) wurden auf ihre Fähigkeit, die Adhäsion der B-Zelllinie RPMI 8866 zu unterstützen, getestet. Kurz gesagt wurden NEN-Maxisorbplatten mit 100 μl/Well von Protein A bei 20 μg/ml in Carbonatpuffer, pH 9,5, über Nacht bei 4 °C inkubiert. Platten wurden dann 2x mit RPMI 1640-Medium (kein Serum) gewaschen. 100 μl Chimäre (oder Reihenverdünnungen in RPMI) wurden bei 37 °C 2 Stunden lang an die Wells gebunden und dann einmal gewaschen. Wells wurden dann 1 Stunde lang bei 37 °C mit FCS blockiert, einmal gewaschen und dann mit Gewebekulturüberständen vorinkubiert, die entweder einen anti-humanen VCAM-1 MAb (2G7) als Kontrolle oder das anti-humane MAdCAM-1 MAb 10G3 (Beispiel 2) enthielten. 2G7 und 10G3 MAbs wurden vor dem Hinzufügen von Zellen entfernt. RPMI 8866-Zellen wurden durch Vorinkubation mit BCECF-AM-Färbung fluoreszenzmarkiert; (BCECF-AM; 2',7'-bis-(2-Carboxyethyl)-5-(und-6)-Carboxyflourescein, Acetoxymethylester; molekulare Sonden), 100 μl Zellen wurden jedem Well hinzugefügt (bis zu einer Endkonzentration von 10⁵ Zellen/Well), und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Bindung von RPMI 8866-Zellen an immobilisierte Chimären wurde durch Lesen von Fluoreszenzwerten unter Verwendung eines Fluoreszenzkonzentrationsanalysators (IDEXX) untersucht. Spezifisches Binden wurde gezeigt, da nur das anti-humane MadCAm-1-MAb das Binden von Zellen an die MAdCAM-Ig-Chimäre blockieren konnte (Tabelle 1).

Diese und weitere derartige chimärische Fusionsproteine können für das Untersuchen der Fähigkeit eines Stoffs (z. B. eines kleinen Moleküls), die Bindung von α4β7 an die Chimäre zu blockieren, um Inhibitoren von Interaktionen zwischen α4β7 und MAdCAM zu identifizieren, verwendet werden. Zusätzlich stellen chimärische Fusionsproteine mögliche Inhibitoren der in vivo Rekrutierung von Lymphozyten an den Entzündungsherden bereit, da sie in Lösung an α4β7-positive Lymphozyten binden. TABELLE 1

Probe	Anti-HuMAd MAbs	unverdünnt	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32
A	–	195527	195527	195527	18560	4254	3558
A	+	3860	3092	1746	2200	482	564
B	–	195527	195527	195527	195528	52056	2932
B	+	6526	3626	3274	2978	1648	1518
C	–	195527	195527	35548	9570	21782	1926
C	+	4566	4094	3922	3492	2436	2566
D	–	195527	30840	46852	16270	5474	2656
D	+	7350	6794	6020	4510	6548	5122

Die α4β7-positive B-Zelllinie RPMI 8866 bindet spezifisch lösliche humane MAdCAM-Ig-Chimären. Klon 21 der Chimäre von humanem MAdCAM-1-Ig, der teilweise über Protein A (Probe A) oder Überständen aus Gewebekulturen von verschiedenen NSO-Klonen (Proben B–D) gereinigt worden war, wurden auf 96-Well-Platten mit Protein A immobilisiert und entweder mit einem anti-VCAM-1 MAb 2G7 (bezeichnet als „–" unter MAbs) als eine Negativontrolle oder mit dem anti-humanen MAdCAM MAb 10G3 („+") vorinkubiert. Gereinigte Chimären oder Überstände (entweder unverdünnt („unverdünnt") oder mit Reihenverdünnung 1:2 verwendet), wurde über Protein A an die Wells gebunden und mit fluoreszenzmarkierten RPMI 8866-Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Nach dem Waschen mit einer automatischen Plattenwaschvorrichtung (EL 404 Microplate Autowasher, BIO-TEK-Instrumente), wurden gebundene Zellen mit einem automatisierten Plattenleser (IDEXX) gezählt. Die unbearbeiteten Zahlen spiegeln somit die Anzahl der gebundenen Zellen wieder.
Beispiel 4. Inhibieren der Rekrutierung von Lymphozyten im Colon.
A. DSS-induzierte Colitis bei Mäusen
BALG/c-Mäuse erhielten für einen Zeitraum von 10 Tagen Zugang zu einer 5 %igen Lösung von Dextran-Natrium-Sulfat (DSS, dextran sodium sulfate) in ihrem Trinkwasser, wie vorangehend beschrieben (Lab. Invest. 69: 238–249, 1993). Während dieses Zeitraums entwickelten die Mäuse klinische Symptome von Colitis, einschließlich weicheren Stuhlgangs und blutigem Durchfall. Multifokale Epithelzellen-Verletzungen und Ulzerationen, ähnlich der Colitis ulcera beim Menschen, wurden bei einer histologischen Untersuchung der Colon-Mucosa von erkrankten Mäusen gefunden. Des Weiteren verloren erkrankte Mäuse bis zum 10. Tag 20–30 % ihres Körpergewichts.
Anitkörper-Blockierung von β7 und MadCAM-Interaktionen
Um die Wirksamkeit von β7-spezifischen Antikörpern beim Blockieren der Rekrutierung von Lymphozyten in das Colon zu bestimmen, wurden BALG/c-Mäusen täglich intraperitoneale (i.p.) Injektionen von 100 μg monoklonale Antikörper gegen β7 verabreicht, bestehend entweder aus FIB21 oder FIB30 in Salzlösung, wie oben dargelegt und beschrieben (Berlin, C., et al., Cell 74: 185–195, 1993; Michie, S.A., et al., Am. J. Pathol. 143: 1688–1698, 1993; Hamann, A., et al., J. Immunol. 152: 3282–3293, 1994), oder es wurde für die Dauer der 10-tägigen DSS-Behandlung ein monoklonaler Isotyp-spezifischer Kontroll-Antikörper der Ratte mit derselben Dosis (Andrew et al., siehe oben) verabreicht.
Auswertungsverfahren

Zwei Verfahren wurden verwendet, um die Wirksamkeit der Antikörpertherapie bei der Inhibition des Leukozyteninfiltration und der Mucosaverletzung bei der an Colitis erkrankten Maus zu untersuchen. In dem ersten Verfahren wurde die Behandlung histologisch mit zwei Blindbeobachtern, die ein Bewertungssystem für die Einschätzung der Verletzung der Epithelzellen und des Grades der zellulären Leukozyten-Infiltration (Tabelle 2) verwendeten, beurteilt. Für diese Untersuchung. wurde das Colongewebe zunächst in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert, dehydriert, in Paraffin eingebettet, geschnitten, und die Schnitte wurden vor der Untersuchung mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Tabelle 2: PATHOLOGISCHE DEFINITION

Grad	Definition
ENTZÜNDUNG
Normal (0)	Fehlen von Clustern von polymorphonuklearen Leukozyten (PMNs, polymorphonoclear leukocytes) oder mononuklearen Zellen in der Lamina propria; Fehlen von intraepithelialen PMNs
Leicht (1)	Fokale Ansammlungen von PMNs und/oder mononuklearen Zellen in der Lamina propria (unklar oder schwach ausgeprägt) oder Gegenwart von isolierten intraepithelialen PMNs in 3 oder weniger Krypten pro Querschnitt
Moderat (2)	Fokale Aggregate von PMNs und/oder mononuklearen Zellen in der Lamina propria (multi-fokal oder diffus 2-5x) oder intraepitheliale PMNs in mehr als 3 Krypten pro Querschnitt
Schwer (3)	Diffuse Infiltration von PMNs oder mononuklearen Zellen in der Lamina propria (diffus > 5x) oder Krypten-Abszesse
STRUKTUR- ODER EPITHELVERÄNDERUNGEN
Normal (0)	Enge Krypten, keine Erosion, columnare Epithelzellen
Leicht (1)	Unreife der Epithelzellen; unklare Unregelmäßgkeit der Epithelzelloberfläche
Moderat (2)	Wenigstens zwei Foki der Kryptenverzweigung oder Verlust von Krypten (< 50 %); Verlust des Oberflächenepithels
Schwer (3)	Diffuse oder multifokale Verzweigungen oder Verlust von Krypten (> 50 %); Fibrose; vollständiger Verlust des Epithels

Eine zusätzliche histologische Untersuchung wurde unter Verwendung von immunhistochemischen Methoden für die Detektion sowie die Semiquantifizierung von Lymphozyten, die β7-Integrine und MAdCAM exprimierende mucosale Venolen exprimieren. Wie vorangehend beschrieben (Ringler, D.J., et al., Am. J. Pathol., 134: 373–383 (1989)), wurde Colongewebe zunächst in einer OCT-Verbindung schockgefrostet, in gefrorenem Zustand geschnitten, die Schnitte wurden anschließend 10 Minuten lang bei 4 °C in Aceton fixiert. Nach dem Waschen in Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) wurden nichtspezifische Antikörper-Bindungsstellen 10 Minuten lang mit 10 % normalen, in PBS gelöstem Kaninchenserum blockiert, gefolgt von 30-minütigen, aufeinanderfolgenden Waschdurchgängen bei Raumtemperatur (RT) durch FIB21-Antikörper bei 20 μg/ml in PBS jeweils mit biotinyliertem polyklonalem Kaninchen-anti-Ratte Antikörper, Avidinperoxidase-Komplexen, und schließlich dem Chromogen, Diaminobenzidin und Hydrogenperoxid, gelöst in Tris-Puffer.
Bei dem zweiten Verfahren wurde die Rekrutierung von Lymphozyten in das Colon unter Verwendung von radioaktiv markierten Lymphozyten aus den mesenterialen Lymphknoten aus syngenischen Donor-Mäusen untersucht. Die experimentelle Gestaltung der Tierversuche war ähnlich der oben beschriebenen, außer dass BALG/c-Mäuse 9 Tage lang (statt 10) auf 5 % DSS-Kost gesetzt wurden, und am B. Tag erhielten die Mäuse i.p. Injektionen von 100 μg FIB21 (anti-β7), MECA-367 (anti-MAdCAM), einer Mischung aus beiden oder einen Isotyp-spezifischen Kontroll-Antikörper in Salzlösung. Am 9. Tag wurden mit ⁵¹Cr markierte Zellen aus mesenterialen Lymphknoten aus syngenischen BALB/c-Donor-Mäusen isoliert, und 5,0 × 10⁶ Zellen/Maus wurden 30 Minuten lang bei 37 °C mit 500 μg Kontroll-Antikörper, 250 μg MECA-367, 500 μg FIB21 oder beiden (Gesamtmenge 750 μg) in Salzlösung inkubiert. Die markierten Zellen und Antikörper wurden dann intravenös (i.v.) in die mit DSS behandelte Empfängermaus injiziert. Das Colon wurde jeweils 1 Stunde nach der Injektion in seiner vollen Läge aus sämtlichen Versuchstieren gewonnen, und die γ-Strahlung wurde unter Verwendung eines γ-Zählers gemessen.
Datenanalyse
Unterschiede zwischen durchschnittlichen Werten, die für jede Tiergruppe erhalten wurden, wurden unter Verwendung eines gepaarten Student t-Tests auf ihre statistische Signifikanz hin untersucht. Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden als signifikant betrachtet, wenn P < 0,05 war.
Ergebnisse
Histologisch waren die Entzündung sowie die Verletzungen an den Epithelzellen in dem Colon descendens, dem Rectum und dem Caecum am schwersten. Eine Analyse gefrorener Gewebeschnitte des Colon durch immunhistochemische Verfahren zeigte, dass die bedeutsamste Rekrutierung von ß7⁺-Lymphozyten in den rechten Colon stattfand. Zusätzlich wurde gefunden, dass das Expressionsniveau des mucosalen vaskulären Addressins, MAdCAM-1, in einem frühen Stadium der DSS-Behandlung (3 Tage) nur mit niedrigen Niveaus in Gefäßen in der intestinalen Mucosa exprimiert wurde, dessen Expressionsniveau sich jedoch nach 9 Tagen DSS-Behandlung stark erhöhte, was den Schluss nahelegte, dass β7- und MAdCAM-1-Interaktionen bei den entzündlichen Prozessen in der Mucosa des Colon während einer DSS-induzierten Colitis von Bedeutung sind.
Eine histologische Untersuchung von Mäusen, die 10 Tage lang auf DSS-Kost gesetzt worden und einer täglichen Therapie unter Verwendung von β7-spezifischen Antikörpern ausgesetzt waren zeigte, dass wesentliche Verringerungen der Leukozyten-Rekrutierung (P < 0,01 für FIB30 und P < 0,001 für FIB21) sowie Epithelverletzung (P < 0,05) in das rechte Colon (Colon ascendens) auftrat, im Vergleich zu Tieren, die einen Kontroll-Antikörper in derselben Dosis erhielten (7A und 7B). Des Weiteren legte eine Analyse von gefrorenen Schnitten dieser Tiere unter Verwendung von immunhistochemischen Verfahren nahe, dass die Anzahl von ß7⁺-Zellen, die in das rechte Colon, jedoch nicht in andere Teile des Colons, rekrutiert wurden, während der DSS-Behandlung verringert wurde.
Die Rekrutierung von Lymphozyten in das entzündete Colon wurde dann quantitativ unter Verwendung von radioaktiv markierten mesenterialen Lymphozyten aus syngenischen Donoren untersucht. Eine Stunde nach der Injektion dieser Zellen in DSS-behandelte Empfänger wurde eine Tendenz zur Verringerung der Anzahl der ⁵¹Cr-markierten Zellen, die in entweder mit β7-spezifischen oder den MAdCAM-spezifischen Antikörpern behandelten Mäusen in das Colon rekrutiert wurden, jedoch nicht bei Mäusen, die mit den Isotyp-spezifischen Kontroll-Antikörpern (8) behandelt wurden.
B. Induktion von Colitis in scid-Mäusen und Inhibition der Rekrutierung von Lymphknotenzellen in das Colon
Scid-Mäsue, die mit CD45RB^hi CD4⁺ T-Zellen rekonstituiert waren, entwickeln Colitis sowie ein schweres Auszehrungssyndrom. Die Colitis, die sich in mit CD45RB^hi CD4⁺ T-Zellen rekonstituierten scid-Mäusen entwickelte, unterscheidet sich von den meisten anderen murinen Modellen von CED insofern, dass die induzierte Colitis in der scid-Maus deutlich das Vorliegen von CD4⁺ T-Zellen für die Induktion, wenn nicht sogar für die Pathogenese der Krankheit, erfordert ((Powrie, Immunity, 3: 171 (1995), deren Lehren hierin durch die Bezugnahme darauf in ihrer Gesamtheit inkorporiert sind).
Eine Modifikation des Verfahrens von Morrissey et al. und Powrie et al. ((Morrissey et al. J Exp. Med., 178: 237 (1993); Powrie et al., Int. Imm., 5: 1461 (1993), deren Lehren hierin durch die Bezugnahme darauf in ihrer Gesamtheit inkorporiert sind) wurde verwendet, um aus der Milz von BALG/c isolierte CD4⁺-Zellen durch Depletion von granulytischen Leukozyten, CD8⁺ T-Zellen, B220⁺-Zellen, I-A⁺-Zellen und MAC-1⁺ Macrophagen anzureichern. CD45RB^hi-Zellen wurden durch eine Vorrichtung für das Sortieren von Zellen selektiert, wobei der hellste Gate anzeigt, dass 40–45 % der CD4⁺-Zellen mit anti-CD45RB gefärbt wurden. scid-Empfänger-Mäuse wurden durch intravenöse (i.v.) Injektion von 1 × 10⁶ CD45RB^hi oder CD45RB^lo T-Zellen in die Schwanzvene rekonstituiert. Vier Mäuse wurden mit CD45RB^hi T-Zellen rekonstituiert und vier Mäuse wurden mit CD45Rb^lo T-Zellen rekonstituiert.
Rekonstituierte Mäuse wurden wöchentlich auf Gewichtsveränderungen und die Entwicklung von okkultem Blut im Stuhl kontrolliert. Üblicherweise wurde die Differenz zwischen dem Körpergewicht von mit CD45RB^hi T-Zellen rekonstituierten Mäusen relativ zu den mit einer gleichen Anzahl von mit CD45Rb^lo-T-Zellen rekonstituierten scid-Mäusen 4–6 Wochen nach der Rekonstitution statistisch signifikant (18).
Colitis kann in diesem Modell mit nur 5 × 10⁴ Zellen induziert werden. Im Allgemeinen können zwischen 1 – 5 × 10⁵ Zellen verwendet werden. Auch wenn die Kinetik des Krankheitsbeginns unter den Mäusen nicht einheitlich ist, ist bei einer bestimmten Rekonstitution die Colitis von ähnlicher Schwere, sobald das Körpergewicht auf 75–85 % des Anfangsgewichts zurückgegangen ist. Histologische Beobachtungen entsprachen den Berichten anderer und zeigten an, dass die Colitis in diesem Modell durch massive Infiltration von CD4⁺ T-Zellen in der Mucosa und Submucosa, Unreife von Epithelzellen, Ulzeration, Krypten-Hyperplasie, Verlust der Becherzellen und Kryptenabszesse gekennzeichnet ist. Ähnlich dem Morbus Crohn ist auch CED in dem scid-Modell durch die transmurale Infiltration mit tiefen Fisteln gekennzeichnet. Ähnlich den anderen murinen Modellen von Colitis ist die Schwere der Krankheit nicht auf das distale Colon beschränkt, sondern in dem Colon transversum und dem proximalen Colon in gleichem Maße ausgeprägt.
Antikörper-Blockierung von Interaktionen zwischen β7 und MAdCAM
In diesen Studien wurde anti-muriner MadCAM-1-Antikörper (MAb MECA-367; American Type Culture Collection (Rockville, MD), Accession Nr. HB 9478; Streeter, P.R., et al., Nature, 331: 41 (1988); siehe auch, US-Patent Nr. 5,403,919 von Butcher) und anti-muriner β7-Antikörper (MAb FIB 504; Andrew, D.P., et al., J. Immunol., 153: 3847 (1994)) verwendet.
scid-Mäuse wurden mit 2 × 10⁵ CD45Rb^hi oder CD45RB^lo CD4⁺ T-Zellen rekonstituiert. Fünf Monate nach der Rekonstituierung wurde den Mäusen 14 Tage lang 200 μg/Tag von Ratte-IgG2a-Kontroll-Antikörper oder einer Mischung von 100 μg/Tag FIB-504 (murin β7-spezifisch) + 100 μg/Tag MECA-367 (spezifische für murines MAdCAM) injiziert. Der Antikörper befand sich in PBS. Jede Behandlungsgruppe schloss fünf Mäuse ein. Nach 14 Tagen wurden den Mäusen intravenös 5 × 10⁶ mesenteriale Lymphknotenzellen (BALG/c), die mit ¹¹¹In-Oxin markiert waren, injiziert. 24 Stunden nach einer adoptiven Übertragung der markierten Zellen wurden die Gewebe geerntet und auf Radioaktivität untersucht. Hintergrundniveaus von Radioaktivität in Geweben, zu denen nicht-spezifisches Auffangen von Zellen beigetragen hatte, wurden durch Injektion von 5 × 10⁶ markierten Zellen, die mit mit PBS gepuffertem 2 % Formaldehyd fixiert waren, untersucht. Die Ergebnisse wurden als Impulse pro Minute (CPM) in % im Colon, normalisiert auf CPM in der Milz und für den Hintergrund korrigiert, ausgedrückt.
Diese quantitative Untersuchung der Infiltration in das Colon in mit CD45Rb^hi CD4⁺ T-Zellen rekonstituierten scid-Mäusen zeigte einen Anstieg der Lokalisierung um das 10- bis 100-fache im Vergleich zu dem bei scid-Empfängern, die mit einer gleichwertigen Anzahl von CD45RB^lo CD4⁺ T-Zellen rekonstituiert worden waren, beobachteten Niveau. Diese erhöhte Ansammlung von markierten Zellen in dem Colon wurde zu 50–75 % durch 2-wöchige Behandlung mit einer Kombination aus anti-β7 und monoklonalen anti-MAdCAM Antikörpern (19) inhibiert.
In einem weiteren Experiment wurden die scid-Mäuse mit 5 × 10⁴ CD45RB^hi oder CD45RB^lo CD4⁺ T-Zellen rekonstituiert. Zum Zeitpunkt der Rekonstitution wurden Mäuse entweder mit (a) 500 μg FIB 504 (β7-spezifisch) (6 Mäuse); (b) 500 μg MECA-367 (MAdCAM-spezifisch) (3 Mäuse); (c) 1 mg Isotyp-spezifische Kontrollantikörper (7 Mäuse) oder (d) 1 mg FIB 504 + MECA-367 (jeweils 500 μg) (5 Mäuse) behandelt. Nach der Rekonstitution wurden in wöchentlichen Intervallen Antikörper verabreicht: (a) 250 μg FIB 504; (b) 250 μg MECA-367; (c) 500 μg Isotyp-spezifische Kontrolle oder (d) 500 μg FIB 504 + MECA-367 (jeweils 250 μg).
Nach vier Monaten Behandlung wurden den Mäusen 5 × 10⁶ ¹¹¹In-markierte Zellen aus mesenterialen Lymphknoten (BALG/c) injiziert, und die Rekrutierung in das Colon wurde durch das Messen von Radioaktivitätsniveaus untersucht. Die Ergebnisse wurden wie für 19 beschrieben berechnet. Die 4-monatige Behandlung von scid-Mäusen, beginnend mit dem Zeitpunkt der Rekonstitution mit FIB 504 und MECA-367, einzeln oder in Kombination, hemmte die erhöhte Rekrutierung von Lymphozyten in das Colon um 100 % (20).
scid-Mäuse wurden mit 2,0 × 10⁵ bis 4,0 × 10⁵ CD45Rb^hi oder CD45RB^lo CD4⁺ T-Zellen rekonstituiert. Nach 4 Monaten wurden die Mäuse 14 Tage lang mit einer Kombination aus FIB 504 (β7-spezifisch) + MECA-367 (MAdCAM-spezifisch) (100 μg jedes MAb pro Tag für eine Gesamtmenge von 200 μg/Tag oder einen Isotyp-spezifischen Kontroll-Antikörper (200 μg/Tag) behandelt. Der Antikörper befand sich in PBS. Jede Versuchsgruppe schloss 4 Mäuse ein. Gefrorene Schnitte des linken und rechten Colons wurden mit einem monoklonalen, für Maus-CD4 spezifischen Ratten-Antikörper gefärbt und entweder mit Fast Red oder AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazol)-Chromogen entwickelt. Ein Querschnitt des linken und rechten Colons jeder Maus wurde für das positive Färben von CD4 unter Verwendung eines Leica Quantimet 500 Image-Analyzers analysiert. Jeder Querschnitt wurde in seiner Gesamtheit unter Verwendung eines 10fach-Objektivs kontrolliert. Die Signifikanz wurde mit Hilfe eines Student t-Tests bestimmt. Die Daten stellen die mittlere positive Anzahl/Gewebebereich ± 1 Standardabweichung dar.
Histologische Untersuchungen mit Hilfe von immunhistochemischen Verfahren mit einem Verzeichnis von Antikörpern, die spezifisch für die Marker von Zell-Abstammungslinien und den Differenzierungsstatus sind, legten nahe, dass praktisch alle infiltrierenden Zellen in den Colons von mit CD45Rb^hi rekonstituierten scid-Mäusen CD4⁺-T-Zellen waren. Unter den angewandten Bedingungen konnten keine CD8⁺-T-Zellen oder B220⁺-B-Zellen identifiziert werden. Weiterhin verringerte eine Behandlung dieser Mäuse mit einer Kombination von β7- und MadCAM-spezifischen monoklonalen Antikörpern signifikant die Anzahl der CD4⁺-T-Zellen in dem Colon ascendens oder descendens im Vergleich zu den Kontrollen (21). Da Zellen von mesenterialen Lymphknoten zu ~95 % Lymphozyten sind, zeigen diese Ergebnisse, dass die Interaktion von α4β7 auf den Lymphozyten mit MadCAM wichtig für die Rekrutierung von Lymphozyten zu Entzündungsherden in dem Colon ist und dass Stoffe, die diese Interaktion blockieren, die Entzündung reduzieren können.
Beispiel 5. Resolution von Zottenveränderungen in dem Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) mit malabsorptiver Enteritis
Beschreibung des Modells
Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) sind nicht-humane Primaten der Neuen Welt, die in Gefangenschaft in dem New England Regional Primate Research Center (NERPRC) ein steroides, nichtresponsives spontanes Malabsorptionssyndrom, das durch Gewichtsverlust, Diarrhö und Veränderungen der Mucosa im Dünndarm, die zu fehlender Absorptionsfähigkeit führen, gekennzeichnet ist, entwickeln. Diese histologischen Veränderungen schließen Zottenatrophie und -fusion im Dünndarm und ein mononukleares Leukozyteninfiltrat innerhalb der Lamina propria ähnlich der Zöliakie (nichttropische Sprue) beim Menschen ein. Die retrospektive Analyse aus den Pathologie-Archivdateien des NERPRC zeigte, dass bis zu 80 % der Weißbüschelaffen zum Zeitpunkt der postmortem-Untersuchung eine malabsorptive Enteritis verschiedener Schwere aufweisen.
Protokoll der Antikörper-Therapie
Adulte Weißbüschelaffen wurden für die Studie aus der gesamten Kolonie am NERPRC ausgewählt. Basislinienstudien an allen Tieren schließen eine ärztliche Untersuchung, ein komplettes Blutbild (CBC, complete blond count), ein Blutchemieprofil, Serum B12, c-reaktives Protein und eine vollständige Jejunumbiopsie durch Laparotomie ein. Nach der Genesung von der Bauchoperation wurden die Tiere 14 Tage lang mit 2 mg/kg/Tag des monoklonalen Antikörpers ACT-1, einem blockierenden monoklonalen Antikörper gegen das konformationale Epitop von α4β7, behandelt (Schweighoffer, T., et al., J. Immunol. 151: 717–729, 1993). Frühere Studien zeigten, dass dieser Antikörper eine Kreuzreaktion mit Callithrix α4β7 aufwies. Sämtliche Untersuchungen, die vor der Antikörpertherapie durchgeführt worden waren, wurden zwischen dem 10. und dem 14 Tag der Antikörpertherapie wiederholt.
Analyse der Jejunumbiopsien
Vollständige Jejunumbiopsien jedes Weißbüschelaffen wurden durch zwei unabhängige Pathologen histologisch ausgewertet, und die Zottenstruktur wurde in Übereinstimmung mit den folgenden Gewichtungskriterien ausgewertet.
Zottenatrophie

0 – normale Mucosadicke und Zottenhöhe
1 – leichte Atrophie, leichte Verkürzung der Zotten, Höhe ungefähr 75 % der normalen Höhe
2 – moderate Atrophie, Zotten ungefähr 33–50 % der normalen Höhe
3 – schwere Atrophie; kurze (< 33 % der normalen Höhe) oder nicht sichtbare Zotten

Zottenfusion

0 – normal; keine Fusion
1 – 1–2 Zotten in der Probe fusioniert
2 – Zwischen 1–2 und 50 % der Zotten in der Probe fusioniert
3 – > 50 % der Zotten in der Probe fusioniert

Datenanalyse
Unterschiede zwischen den durchschnittlichen Werten, die für jede Tiergruppe erhalten wurden, wurden unter Verwendung eines gepaarten Student t-Tests auf statistische Signifikanz untersucht. Unterschiede zwischen den Durchschnittswerten wurden als signifikant betrachtet, wenn P < 0,05.
Ergebnisse
Die mittleren Werte für Zottenfusion und -atrophie vor und nach der Antikörpertherapie mit dem monoklonalen Antikörper ACT-1 werden jeweils in den 9 und 10 gezeigt. Wie dort gezeigt, existierte eine beinahe vollständige Resolution der Zottenatrophie (P < 0,01) und eine Tendenz hin zu einer Verbesserung der Zottenfusion nach einer zweiwöchigen Therapie mit dem ACT-1-Antikörper. Die Wirkung war nicht zweitrangig gegenüber der nicht-spezifischen Wirkung, da, wenn mit zahlreichen, auf andere Epitope als das durch ACT-1 erkannte Epitop gerichteten monoklonalen Antikörpern behandelte Tiere fremden Immunglobulinen ausgesetzt werden, die Wirkung auf die Reduktion der Werte bezüglich Zottenfusion und -atrophie ausblieb.
Beispiel 6. Resolution der Colitis in dem Lisztäffchen
Beschreibung des Modells
Das Lisztäffchen (CTT, cotton-top tamarin) (Saguinus oedipus) ist ein nicht-humaner Primat der Neuen Welt, der spontane und oftmals chronische Colitis entwickelt, die klinisch und histologisch ähnlich der Colitis ulcerosa beim Menschen ist (Madara, J.L., et al., Gastroenterology, 88: 13–19 (1985)).
Immuntherapie. Klinische Untersuchung und Mucosabiopsie
Ein Versuchsprotokoll, das eine klinische Untersuchung, eine Biopsie der Colon-Mucosa und eine Immuntherapie mit ACT-1 der an Colitis erkrankten CTTs beinhaltete, wurde aufgestellt (13). ACT-1 ist ein muriner monoklonaler IgG1-Antikörper, der mit humanem α4β7 reaktiv ist (Schweighoffer, T., et al., J. Immunol., 151: 717–729 (1993); Lazarovits, A.I., et al., J. Immunol., 133: 1857–1862 (1984); und Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153: 517–528 (1994)). Es wurde gefunden, dass ACT-1 in dem Lisztäffchen eine Kreuzreaktion zeigte, wie durch immunhistologisches Färben der colitischen Mucosa von erkrankten Tieren mit ACT-1-Antikörper untersucht wurde. Diese anfänglichen Pilotstudien zeigten, dass 40–80 % der mononuklearen Zellen innerhalb der Lamina propria des Colons erkrankter Tiere α4β7⁺ waren, ähnlich wie bei der Mucosa von an Colitis erkrankten Menschen. Es wurde ebenfalls gefunden, dass ACT-1 mit α4β7 bei dem CTT unter Verwendung von Flusszytometrie mit CTT-Lymphozyten des periphären Blutes (PBLs) eine kreuzreagierte.
CTTs mit chronischer Colitis wurden basierend auf klinischer Beobachtung der Diarrhö und des Gewichtsverlustes aus der gesamten Kolonie im New England Regional Primate Research Center, Southborough, Massachusetts, ausgewählt. Um das Vorliegen einer Colitis (wie durch einen Wert der histologischen Entzündungsaktivität von 2 oder 3 gekennzeichnet) zu bestätigen, wurden Tiere der Kolonie, bei denen eine klinische Auszehrung und Diarrhö bemerkt worden war, zu verschiedenen Zeitpunkten vor der experimentellen Untersuchung der Antikörper-Immuntherapie durch routinemäßige histologische Untersuchung von Biopsieproben der Colon-Mucosa auf ein Entzündungsgeschehen im Colon hin untersucht (13). CTTs mit chronischer Colitis wurden zu wenigstens zwei Zeitpunkten mit Hilfe einer Untersuchung von Mucosaproben aus dem terminalen Colon ascendens, 2–3 cm von dem Anus entfernt, auf colitische Entzündungsaktivität hin untersucht, und zwar unter Verwendung eines pädiatrischen faseroptischen Endoskops. Werte der Entzündungsaktivität basierten auf der relativen Anzahl von Neutrophilen innerhalb der Lamina propria, der Kryptenlumena, dem Kryptenepithel und dem Oberflächenepithel. Insbesondere wurde ein histopathologisches Bewertungssystem für akute und chronische Entzündungsaktivität verwendet (beschrieben von Madara, J.L., et al., Gastroenterology, 88: 13–19 (1985)). Sämtliche Biopsieproben wurden bewertet und in vier Kategorien eingeteilt, wobei 0 eine normale Beschaffenheit der Mucosa und 3 die am schwersten entzündete Mucosa darstellte. Werte von 0 und 1 stellen keine symptomathische Colitis dar, während Werte von 2 bis 3 eine leichte bis schwere colitische Aktivität darstellen. Für die Studie ausgewählte Tiere wiesen folgendes auf: (1) moderate (Grad 2) oder schwere (Grad 3) strukturelle Veränderungen des Oberflächen- und Kryptenepithels bei der ersten Biopsieprobe, was eine Colitis chronischer Art andeutete, und (2) moderate (Grad 2) oder schwere (Grad 3) Entzündungsaktivität bei wenigstens zwei Biopsieproben, die in einem Abstand von 3 bis 7 Tagen vor der Immuntherapie entnommen wurden. Biopsieproben, die diese Kriterien erfüllten, waren gekennzeichnet durch das Vorliegen von Kryptenverzweigung und/oder -Verlust mit polymorphonuklearer Leukozyteninfiltration (PMNs) in die Lamina propria und/oder das Epithel-Kompartiment.
Somit zeigten für die Studie ausgewählte Tiere wiederholt Anzeichen für eine Entzündungsaktivität im Colon und klinisch relevante Colitis chronischer Natur mit keinem in jüngster Zeit aufgetretenen Anzeichen für eine Remission. Des Weiteren war das Andauern der Diarrhö bis zum ersten Tag der Verabreichung von monoklonalem Antikörper eine Voraussetzung dafür, dass das Tier in die Studie aufgenommen wurde. Innerhalb von 5 Tagen nach Bestätigung der Colitis begannen die Tiere eine Immuntherapie mit dem monoklonalen Antikörper ACT-1.
Der ACT-1-Antikörper wurde durch Kultivieren in einem Zell-Fermentierer mit einer Hohlfaser unter Verwendung eines sterilen pyrogenfreien Durchflusskanals hergestellt, durch Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt, und vor der Verwendung in vivo in steriler 0,9 %iger Kochsalzlösung gelöst, erzeugt. Da CTTs eine gefährdete Spezies sind, wurde auch die Kreuzreaktion von ACT-1 mit α4β7 auf PBLs einer verwandten Spezies, dem Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus), gezeigt, um eine pharmakokinetische Analyse des Antikörpers vor dem Verabreichen an an Colitis erkrankte CTTs durchzuführen. Bei dieser Komponente der Studie wurde ACT-1 zunächst zwei normalen adulten Weißbüschelaffen als eine einzelne intravenöse Infusion und 24 Stunden später dann als eine einzelne intramuskuläre Injektion verabreicht. Intravenöses Verabreichen von 2,0 mg/kg von ACT-1 bei diesen Tieren führte zu einer geschätzten Halbwertszeit von ungefähr 50 Stunden im Serum, mit fortgesetzter Absorption von Antikörpern 2–24 Stunden nach einer einzigen intramuskulären Injektion. Bei Verwendung dieser Dosierungsart lagen die Spitzenkonzentrationen von Antikörper im Serum bei ungefähr 60 μl/ml, während die niedrigsten Konzentrationen bei ≥ 18,0 μg/ml lagen. Es wurden bei den Weißbüschelaffen, denen ACT-1 verabreicht worden war, keine klinischen Nebenwirkungen festgestellt.
Im Hinblick auf diese Beobachtungen erhielt die Hälfte der Lisztäffchen, welche die Anforderungen für die Studie erfüllten (n = 4; Kollektivalter = 31 Jahre) einen einzelnen intravenösen (i.v.) Bolus von ACT-1 bei einer Dosis von 2,0 mg/kg am ersten Tag sowie während insgesamt 8 Tagen der Immuntherapie alle 24 Stunden 7 aufeinanderfolgende intramuskuläre (I.M.) Injektionen gleicher Menge. Die andere Hälfte der an chronischer Colitis erkrankten Kontrolltiere (n = 4; Kollektivalter = 26 Jahre) erhielt Antikörper 86D, einen murinen monoklonalen Antikörper (IgGl) für Schaf-TCR γδ (Mackay, C.R., et al., Eur. J. Immunol., 19: 1477–1483 (1989)), der bei CTTs keine Kreuzreaktion aufwies (Daten nicht gezeigt). Dieser irrelevante, Isotyp-spezifische Antikörper wurde hergestellt, gereinigt, und unter identischen Bedingungen wie ACT-1 verabreicht.
Es wurden zum Zeitpunkt der ersten Antikörperinfusion (Tag 0) sowie an den Tagen 5, 10 und 20 erneut Biopsien der Colon-Mucosa gewonnen. Die Biopsien wurden durch einen unabhängigen Pathologen ausgewertet. Zusätzliche Biopsien des Colon wurden für Immunhistologie eingefroren. Für histologische Analysen wurden Proben von Biopsien der Colon-Mucosa, die 2–3 Zentimeter vor dem Anus entnommen wurden, sofort in OCT-Verbindung schockgefrostet, und aus dem umliegenden Bereich entnommene Duplikat-Proben wurden in 10 %-igem phosphatgepufferten Formalin fixiert, durch standardmäßige histologische Techniken verarbeitet, in Paraffin eingebettet, bei einer Dicke von 6,0 μm geschnitten, und die Schnitte wurden daraufhin mit Hämatoxylin und Eosin eingefärbt. Die Formalin-fixierten Proben wurden dann histopathologisch untersucht. Aceton-fixierte, gefrorene Schnitte wurden verwendet, um in vivo verabreichtes, murines IgG1 zu detektieren, indem der primäre Antikörper in der Sequenz einer vorangehend beschriebenen immunhistochemischen Technik mit Avidin-Biotin-Peroxidase eliminiert wird (Ringler, D.J., et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 49: 349–364 (1988)).
Tierpfleger erhielten keine Information über die Therapieart (ACT-1 vs. Isotyp-spezifischem irrelevanten monoklonalen Antikörper) und untersuchten täglich die Stuhlkonsistenz jedes Tieres, wobei der Stuhl nach den Kategorien Diarrhö, breiig oder fest eingeteilt wurde. Die Werte wurden wie folgt zugeordnet: 0, geformter, fester Stuhl; 1, flüssiger Stuhl mit einigen festen Komponenten (breiig); oder 2, flüssiger Stuhl (Diarrhö). Die Tiere wurden jeden zweiten Tag gewogen, während in demselben Zeitabstand Blut für Durchflusszytometrie, Hämatologie und Serum- oder Plasmalagerung für weitere Analysen, wie etwa Analysen der Antikörperkonzentration, anti-Maus-IgG-Titer, klinische Chemie oder akute Phasenproteine, abgenommen wurde.
Computergestützte morphometrische Bildanalyse
Quantitative, computergestützte morphometrische Analyse von Schnitten aus Mucosabiopsien wurde unter Verwendung eines Leica Quantimet 500 Image Analyzers durchgeführt. Zunächst wurde eine immunhistochemische Analyse von Mucosaschnitten durchgeführt, um spezifische Leukozyten-Zelltypen unter Verwendung einer Avidin-Biotin-Peroxidasetechnik, wie vorangehend beschrieben, zu beschreiben (Ringler, D.J., et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 49: 349–364 (1988)). Paraformaldehyd-, Aceton oder Formalin-fixierte, gefrorene Schnitte wurden verwendet, um jeweils Neutrophile, β7⁺-Zellen und Monozyten/Makrophagen (Mϕ) zu identifizieren, und zwar unter Verwendung eines polyklonalen Schaf-anti-Elastase- Antikörpers (Biodesign; Kennebunk; ME) für die Identifikation der Neutrophile, des monoklonalen Antikörpers FIB21 (Ratte IgG2a) für die Identifikation der β7-Kette (Andrew, D.P., et al., J. Immunol., 153: 3847–3861 (1994)), und des monoklonalen Antikörpers HAM-56 (Maus IgM) für die Identifikation der Makrophagen (Dako Corp., Carpinteria, CA), jeweils nacheinander als primäre Reagenzien. Eine Untersuchung gefärbter Gewebeschnitte unter Verwendung des Elastase-Antikörpers dokumentierte, dass dieses Reagens nur polymorphonukleare Zellen in der Colon-Mucosa von CTTs erkannte. Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte wurden verwendet, um T- und B-Zellen zu nummerieren, unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen humanes CD3 (Dako Corp., Carpinteria, CA) und des monoklonalen Antikörpers 126 (Maus IgG2a) (Dako Corp., Carpinateria, CA), jeweils nacheinander als primäre Reagenzien. Für die Detektion primärer Antikörper wurden Spezies und Isotyp-spezifische sekundäre Reagenzien verwendet, um das Erkennen von ACT-1 oder irrelevantem murinem IgG1-Antikörper in Geweben zu eliminieren. Nach immunhistochemischen Verfahren wurde jede Zellpopulation auf 2–4 zufällig gewählten Feldern/Schnitten der Mucosa gezählt. Die Zellen wurden basierend auf der Wellenlänge der Farben, die aus dem braunen Diaminobenzidin-Reaktionsprodukt entstanden waren, ausgewählt und Farbauswahlkriterien waren bei allen für den jeweiligen spezifischen Marker analysierten Schnitten identisch. Aufgrund der Morphologie der gefrorenen Schnitte und der hohen relativen Dichte von β7⁺-Lymphozyten und Makrophagen wurde eine Quantifikation dieser Zelltypen als immunreaktive Fraktionsfläche der Mucosa untersucht, während alle anderen Leukozyten-Zelltypen als Anzahl der Zellen/Bereich der Mucosa gezählt wurden. Die Werte wurden ausgedrückt als durchschnittlicher Prozentsatz (± 1 SEM) des Wertes der Vorbehandlung (Tag 0) innerhalb einer Behandlungsgruppe, der durch das Vergleichen des Wertes der Biopsieprobe jedes Tieres zu einem bestimmten Zeitpunkt mit dem bei demselben Tier am Tag 0 erhaltenen Wert erhalten wurde. Somit stellen Werte von weniger als 100 % (in Tabelle 3 unten fettgedruckt gezeigt) eine Verringerung der Leukozytenzelldichte verglichen mit den Vorbehandlungsproben dar, während Werte größer als 100 % eine Erhöhung der Leukozyten-Zelldichte der Mucosa darstellen. Die Signifikanz wurde unter Verwendung eines gepaarten Student t-Tests und das Vergleichen der mittleren unverarbeiteten Werte der Zelldichte zu einem bestimmten Zeitpunkt mit denen bei der Vorbehandlung bestimmt. Unterschiede zwischen den Durchschnittswerten wurden als signifikant betrachtet, wenn P < 0,05.
Hämatologie und Durchflusszytometrie
Lymphozyten, die α4β7-Integrin exprimierten, wurden durch Durchflusszytometrie sowie oben beschriebene, den monoklonalen Antikörper ACT-1 verwendende Verfahren (Mackay, C.R., et al., Eur. J. Immunol., 19: 1477–1483 (1989)) gezählt. Da mit dem Infusionsprotokoll Sättigungskonzentrationen von ACT-1 im Serum erreicht wurden, konnte exogen verabreichtes ACT-1 in dem Serum verwendet werden, um die Anzahl der α4β7⁺-Lymphozyten im Blut zu zählen. Kurz gesagt wurde bei jeder Blutentnahme Vollblut von jedem Tier durch Lösen von 100 μl antikoagulativem EDTA-Blut mit PBS/10 % Kaninchenserum/5 % humanem AB-Serum 20 Minuten lang bei 4 °C analysiert. Nach Entfernen des blockierenden Serums wurden entweder bei den mit ACT-1 behandelten Tieren die Blutzellen mit 100 μl Fuoresceinkonjugiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG (Dako Corporation, Carpinteria, CA) behandelt, oder bei den Tieren, denen irrelevanter Antikörper oder Vorbehandlungs-Blutproben verabreicht worden waren, ACT-1 bei 10 μg/ml zum Blut hinzugefügt, gefolgt von dem sekundären Antikörper. Für jede Probe wurden mindestens 10 000 Zellen analysiert. Routinemäßig durchgeführte Blutbilder und Differenzialanalysen wurden unter Verwendung eines Baker 5000 Hämatologieanalysators und einer geeigneten Gate-Anordnung für rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen von Lisztäffchen durchgeführt. Anhand der Hämatologieanalyse und den Ergebnissen der Durchflusszytometrie wurden die absoluten Anzahlen der α4β7⁺-Lymphozyten pro μl Blut berechnet.
Ergebnisse/Fortschritt
Serumkonzentrationen
Die Konzentration von ACT-1 sowie eines irrelevanten Isotyp-spezifischen Antikörpers im Serum betrugen in den ersten 10 Tagen der Studie im Allgemeinen jeweils ≥ 10 μg/ml. In den Tagen 2–10 der Studie konnte biotinyliertes ACT-1, das bei einer Konzentration von 10 μg/ml in Vollblut verwendet wurde, periphere Lymphozyten nicht mehr signifikant markieren, wie durch Durchflusszytometrie in mit ACT-1 behandelten Tieren untersucht worden war, während am Tag 0 und bei mit einem irrelevanten Antikörper behandelten Tieren derselbe Antikörper zwischen 70–90 % des Pools der periphären Lymphozyten erkannte, ähnlich dem Färbungsprofil von ACT-1 auf humanen Lymphozyten. Zusammen legen diese Ergebnisse den Schluss nahe, dass das Therapie-Protokoll für ACT-1 in an Colitis erkrankten CTTs zu einer Sättigung des α4β7-Integrins auf Lymphozyten in dem peripheren Blutkreislauf führte.
Die Fähigkeit von ACT-1, extravaskuläre α4β7⁺ Zellen innerhalb der Lamina propria der Colon-Mucosa von an Colitis erkrankten CTTs zu erkennen, wurde ebenfalls untersucht. Immunhistochemische Techniken wurden verwendet, um murines IgG1 bei Biopsien der Colon-Mucosa von den in der Studie verwendeten Tieren zu detektieren, und ACT-1 wurde bei allen Zeitpunkten, an denen eine Biopsie durchgeführt wurde, in den ersten 10 Tagen der Studie innerhalb der Lamina propria auf Zellmembranen von monozellulären Zellen bei den mit ACT-1 behandelten Tieren beobachtet, jedoch nicht, wie erwartet, am Tag 0 vor der Antikörper-Infusion. Es wurde keine Markierung von Zellen der Lamina propria bei Tieren, denen irrelevanter Antikörper verabreicht worden war, beobachtet. Aus diesem Grund führte die in der Studie verwendete Dosierungsart zu neutralisierenden Serumkonzentrationen von ACT-1, und zu begleitendem extravaskulären Erkennen und Markieren von Immunzellen innerhalb der colitischen Mucosa. ACT-1-Antikörper wanderten zu dem Zielort, nämlich zu den Lymphozyten innerhalb des periphären Blutes, und spezifisch zu dem extravaskulären Kompartiment innerhalb der colitischen Mucosa.
Klinische Wirkung
Alle vier Versuchstiere wiesen sowohl bei der Vorbehandlung als auch bei Biopsieproben von Tag 0, zwischen denen bei 3 Tieren 5 Tage lagen, eine colitische Entzündungsaktivität vom Grad 2 oder 3 auf. Zudem demonstrierten Veränderungen innerhalb der mucosalen Struktur aller vier Tiere, dass diese vier Tiere an einer langwierigen Colitis erkrankt waren. Aus diesem Grund schien der Krankheitsverlauf bei allen Tieren chronisch zu sein.
Eine histopathologische Analyse von Biopsien der Colon-Mucosa wurde durchgeführt. Die Ergebnisse von repräsentativen CTTs (Tiere Sgo 326-84 und Sgo 17-85) vor und fünf Tage nach der Immuntherapie mit ACT-1 veranschaulichten die therapeutische Wirkung der ACT-1-Immuntherapie auf mikroskopische Veränderungen der Colon-Mucosa bei an Colitis erkrankten CTTs. Vor der Immuntherapie existierte ein eitriges Exsudat innerhalb des Epithelkompartiments und des Kryptenlumens, eine Unreife der Epithelzellen gekennzeichnet durch den Verlust von vollständig differenzierten Becherzellen, und die Lamina propria wurde durch ein mononukleares und eitriges entzündliches Infiltrat expandiert (Sgo 326-84, muscularis mucosae). Nach der ACT-1-Immuntherapie war ACT-1 unter Verwendung von immunhistochemischen Techniken (Sgo 17-85, muscularis mucosae) zu Membranen von mononuklearen Zellen innerhalb der Lamina propria lokalisiert, und die neutrophile Komponente des entzündlichen Infiltrats war aufgelöst, vollständig differenzierte Becherzellen wurden beobachtet und die Lamina propria wurde nicht mehr durch mononukleare Zellen und/oder Neutrophile (Sgo 326-84) expandiert.
Die klinische Wirkung von ACT-1 auf die Stuhlkonsistenz bei an Colitis erkrankten CTTs war frappierend (14). Eine Verbesserung der Diarrhö bis zu wenigstens breiiger Stuhlkonsistenz wurde bei allen Tieren innerhalb von 24 Stunden nach der ersten Dosis beobachtet, während eine vollständige Resolution zu einem festen Stuhl bei allen Tieren innerhalb von 72 Stunden auftrat. Der Gesundheitszustand der Kontrolltiere verbesserte sich nicht, und es wurde beobachtet, dass sie während der gesamten Dauer der Studie Diarrhö hatten, was zudem zeigte, dass die Kriterien für die Vorauswahl bei dieses Gruppe von Tieren die Tiere mit spontanen Remissionen wirksam eliminierten.
Alle Tiere hatten noch 1 Woche nach der Beendigung der Antikörperinjektionen festen Stuhl (11). Unter Bezugnahme auf einzelne Tiere hatte ein Tier (Sgo 63-93) von Tag 4 bis zum Ende des Protokolls am Tag 20 festen Stuhl (11). Zwei Tiere (Sgo 129-91 und Sgo 17-85) wiesen nach Tag 14 in der Studie leichte Rückfälle zu breiigem Stuhl auf (11). Das vierte Tier (Sgo 326-84) zeigte von Tag 6 bis Tag 20 eine anhaltende Besserung/Resolution der Diarrhö.
In ähnlicher Weise wurden Leukozyteninfiltrate in dem Colon bei CTTs, denen ACT-1 verabreicht worden war, merklich gelindert. Verglichen mit Vorbehandlungs-Biopsien zeigten histologische Analysen der Colon-Mucosa (Formalin-fixierte Biopsieproben der Colon-Mucosa) von mit ACT-1 behandelten Tieren eine Besserung hinsichtlich. der Enzündungsaktivität sowie in Bezug auf die assoziierten strukturellen Veränderungen der Mucosa. Unter Verwendung eines histologischen Bewertungssystems der Entzündungsaktivität im Colon (Madara, J.L., et al., Gastroenterology, 88: 13–19 (1985)), wurde bei mit ACT-1 behandelten Tieren zu allen Zeitpunkten ein ausgeprägter Rückgang der Werte für die Entzündungsaktivität im Vergleich zu den Basislinien-Vorbehandlungs-Werten verzeichnet, während sich Werte von Tieren, denen der Kontroll-Antikörper verabreicht worden war, nicht änderten (15). An Tag 20 gab es keine Veränderungen hinsichtlich der Entzündungswerte für die irrelevante Behandlungsgruppe (15). Mittlere unverarbeitete Werte der Entzündungsaktivität zu allen Zeitpunkten in der mit ACT-1 behandelten Gruppe waren statistisch gesehen niedriger als die von denselben Tieren an Tag 0 (Tag 5 und 10, P < 0,05; Tag 20, P < 0,01).
Unter Bezugnahme auf einzelne Tiere zeigte sich bei allen vier Versuchstieren eine Verbesserung hinsichtlich der Entzündungsaktivität während oder nach der ACT-1- Immuntherapie. Bei zwei Tieren (Sgo 129-91 und Sgo 17-85) war die Colitis an Tag 10 vollständig verschwunden (12). Ein weiteres Tier (Sgo 63-93) zeigte kein komplettes Verschwinden der Colitisaktivität bis Tag 20 (12), während die Werte der Mucosabiopsie des vierten Tieres (Sgo 326-84) eine Verbesserung während der gesamten Studiendauer zeigten (12; zwei Biopsien an Tag 20 bei Sgo 326-84 wurden als 0 und 1 gewertet). Des Weiteren nahm Tier 326-84 während der Dauer der Studie 20 % seines ursprünglichen Körpergewichts zu.
Um eine in höherem Maße quantitative Analyse der Wirkung bereitzustellen, wurde eine computergestützte morphometrische Bildanalyse von Leukozyten-Subsets innerhalb der Colon-Mucosa aller Versuchstiere durchgeführt. Tabelle 3 veranschaulicht die Ergebnisse einer Analyse der Wirkung von ACT-1-Immuntherapie auf die Entzündungsaktivität in chronisch colitischen CTTs (ausgedrückt als ein Prozentsatz der Vorbehandlungs-Werte). Die ACT-1-Immuntherapie führte zu einem signifikanten Rückgang der Dichte der Mucosa-Leukozyten verglichen mit Basislinien-Zahlen, die vor der Antikörper-Verabreichung aufgestellt worden waren, während die Kontrollgruppe im Allgemeinen entweder ähnliche oder höhere Leukozytenzahlen in der Mucosa nach der Verabreichung des irrelevanten Antikörpers aufwies. Zehn Tage nach der ersten Dosis an ACT-1-Antikörper war die Anzahl der mononuklearen Leukozyten in der Mucosa, welche β7-Integrine exprimierten, im Vergleich zu den Vorbehandlungswerten um ungefähr 30 % niedriger. Dieser Rückgang wurde nicht auf eine Verringerung der Anzahl von α4β7⁺-Lymphozyten in dem peripheren Blutkreislaufpool (16) zurückgeführt, noch stand er in Verbindung mit einer Manipulation oder nichtspezifischen Wirkungen, da die Zahl der β7⁺-Leukozyten der Colon-Mucosa der Kontrolltiere entweder anstieg oder größtenteils unverändert blieb. In ähnlicher Weise wurden mucosale T-Zellen am Tag 5 um ungefähr 50 % und am Tag 10 um ungefähr 25 % bei mit ACT-1 behandelten Tieren verringert, während mucosale T-Zellen in der Gruppe mit den irrelevanten Antikörpern sich zu denselben Zeitpunkten nicht veränderten. Vergleichbare Reduzierung der mucosalen B-Zellen wurden in der mit ACT-1 behandelten Gruppe beobachtet, jedoch nicht in der Kontrollgruppe. Interessanterweise verringerte eine ACT-1-Immuntherapie auch die Dichte der mucosalen Leukozyten, die entweder wenig oder gar kein α4β7 exprimieren. Neutrophile wurden an den Tagen 10 und 20 bei Tieren, die mit ACT-1 behandelt worden waren, um 40–45 % verringert, jedoch wurde keine Reduktion der PMNs in der Kontrollgruppe beobachtet. In ähnlicher Weise verringerte sich die Anzahl der mucosalen Makrophagen in sämtlichen nach der Behandlung entnommenen Biopsieproben bei Tieren, denen ACT-1 verabreicht worden war, um 30–45 %, während sich die Anzahl der Makrophagen in der Kontrollgruppe nicht veränderte.
Interessanterweise wurde bei Verwendung von immunhistochemischen Verfahren und eines kreuzreaktiven, für geklontes MAdCAM des Menschen (10G3, Beispiel 2) spezifischen monoklonalen Antikörpers keine Veränderung der Expression bei colitischen CTTs, die mit ACT-1 oder einem Kontroll-Antikörper behandelt worden waren, beobachtet.
Es wurde bei den Studientieren keine offenkundige Toxizität beobachtet, die auf das Verabreichen von ACT-1 zurückgeführt werden konnte. Keines der Studientiere zeigte Veränderungen in den klinischen chemischen Untersuchungen von Leber- und Nierenfunktion (Daten nicht gezeigt). Der ACT-1-Antikörper ist ein nicht-lytisches, monoklonales Reagens (Lazarovits, A.I., et al., J. Immunol., 133: 1857–1862 (1984)), und eine Leukopenie wurde während der Studie bei keinem Tier beobachtet. Tatsächlich gab es bei allen Versuchstieren, einschließlich der Kontrolltiere, eine Tendenz zu Neutrophilie (maximale Anzahl im peripheren Blut bis zu 40 × 10³/μl; der normale CTT-Bereich liegt bei 1,4 – 12,0 × 10³/μl) während der ersten Woche der Studie, als täglich Narkose/Manipulation verwendet wurde, um die Antikörper zu verabreichen. Auch lag eine Tendenz zu Lymphozytose bei den Tieren, denen ACT-1 verabreicht worden war, vor, mit absoluten Lymphozytenzahlen von nahezu 18 × 10³/μl (der normale CTT-Bereich liegt bei 0,6 – 5,7 × 10³/μl) in peripherem Blut. Aus diesem Grund konnte eine geringere Rekrutierung jedes Leukozyten-Zelltyps in das Colon in der mit ACT-1 behandelten Gruppe nicht auf Veränderungen der Leukozytenanzahl in dem peripheren Zirkulationspool zurückgeführt werden.
Zusammenfassung
Bei Verabreichung an Lisztaffen mit chronischer Colitis heilte ein monoklonaler Antikörper gegen das α4β7-Integrin schnell Diarrhö und Entzündungsaktivität im Colon, was die Wirksamkeit bei der Verbesserung von Colitis zeigte. Es schien eine günstige Korrelation zwischen histologischen Werten der Entzündungsaktivität und der Stuhlkonsistenz zu geben. Die Beobachtung, dass die Stuhlkonsistenz sich bei Tieren, die ACT-1-Antikörper erhielten, im Allgemeinen innerhalb von 1–2 Tagen besserte, ist erwähnenswert. Des Weiteren wurde die relative Dichte der Subsets der mucosalen Leukozyten als Reaktion auf die Immuntherapie mit anti-α4β7-Antikörpern in hohem Maße verringert. Diese Ergebnisse beweisen auch eine wirksame Therapie für einen Entzündungsprozess, die auch organ- oder gewebespezifisch (mucosaspezifisch) sein kann.
Die therapeutische Wirkung von ACT-1 bei an Colitis erkrankten CTTs kann durch Inhibieren der Lymphozytenrekrutierung in den Darm vermittelt werden. Alternativ oder zusätzlich kann die beobachtete therapeutische Wirkung Veränderungen bei anderen Zellinteraktionen oder Signalübertragungsereignissen, die durch α4β7-Integrin vermittelt wurden, reflektieren. Diese Ergebnisse zeigen an, dass ACT-1-Antikörper ein wirksamer Antagonist der α4β7-Integrin-Funktion ist, und dass die Inhibition der α4β7-Integrinfunktion eine organ- oder gewebespezifische Behandlungsmodalität bei der klinischen Behandlung von Individuen mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen sein kann. Ferner zeigen die Ergebnisse an, dass α4β7-Integrin in der Pathogenese von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen eine Rolle spielt. α4β7-Integrin stellt ein potenziell organspezifisches therapeutisches Ziel für chronisch-entzündliche Darmkerkrankungen bereit.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine isolierte Nucleinsäure, welche für folgendes codiert (a) ein natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Protein, dem in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigten Protein, dem in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Protein und der reifen Form von jedem der vorstehenden Proteine; oder (b) eine funktionelle Variante desselben, welche α4β7-Integrin bindet; oder (c) ein funktionelles Fragment eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, welches α4β7-Integrin bindet und mindestens eine Immunglobulinähnliche Domäne umfasst, wobei die Aminosäuresequenz der funktionellen Variante zu der Sequenz eines in 1 (SEQ ID NO: 2), in 2 (SEQ ID NO: 4) oder in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Proteins eine 75 % Ähnlichkeit aufweist und die Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz mittels der „Clustal method with the PAM250 residue weight table" unter Verwendung einer Gap Penalty von 10, einer Gap Length Penalty von 10 und den „pairwise alignment parameters" k-tuple = 1, Gap Penalty = 3, Window = 4 und Diagonals saved = 5 ermittelt wird.
Die isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die isolierte Nucleinsäure rekombinant und/oder im Wesentlichen rein ist.
Eine isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei (a) die Nucleinsäure unter hoch stringenten Bedingungen mit einer zweiten Nucleinsäure hybridisiert, wobei die zweite Nucleinsäure eine Nucleotidsequenz wie in 1 (SEQ ID NO: 1), in 2 (SEQ ID NO: 3) oder in 3 (SEQ ID NO: 5) gezeigt aufweist oder eine Sequenz hat, welche komplementär zu dem offenen Leseraster von einer der obigen Nucleinsäuren ist; oder (b) die Nucleinsäure für das in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigte Polypeptid, das in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigte Polypeptid, das in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigte Polypeptid oder die entsprechenden reifen Proteine codiert.
Die isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 3, wobei die Nucleinsäure eine Nucleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Nucleotidsequenz wie in 1 (SEQ ID NO: 1), einer Nucleotidsequenz wie in 2 (SEQ ID NO: 3) oder einer Nucleotidsequenz wie in 3 (SEQ ID NO: 5) gezeigt und ein Abschnitt von einer der obigen, die codierende Sequenz umfassenden Nucleotidsequenzen.
Ein isoliertes rekombinantes Nucleinsäure-Konstrukt, das eine Nucleinsäure nach Anspruch 1 umfasst.
Das isolierte rekombinante Nucleinsäure-Konstrukt nach Anspruch 5, wobei (a) die rekombinante Nucleinsäure funktionsfähig an eine Kontrollsequenz für die Expression gebunden ist; oder (b) das Nucleinsäure-Konstrukt eine Nucleinsäure umfasst, wobei diese Nucleinsäure ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz wie in 1 (SEQ ID NO: 2), wie in 2 (SEQ ID NO: 4) oder wie in 3 (SEQ ID NO: 6) dargelegt; oder (c) diese Nucleinsäure unter hoch stringenten Bedingungen mit einer zweiten Nucleisäure hybridisiert, wobei die zweite Nucleinsäure eine Nucleotidsequenz wie in 1 (SEQ ID NO: 1), in 2 (SEQ ID NO: 3), in 3 (SEQ ID NO: 5) gezeigt aufweist oder eine Sequenz hat, welche komplementär zu dem offenen Leseraster von einer der obigen Nucleinsäuren ist.
Ein isoliertes Protein mit der Aminosäuresequenz (a) eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Protein, dem in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigten Protein, dem in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Protein und der reifen Form von jedem der vorstehenden Proteine; oder (b) einer funktionellen Variante desselben, welche α4β7-Integrin bindet; oder (c) eines funktionellen Fragments eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, welches α4β7-Integrin bindet und mindestens eine Immunglobulin-ähnliche Domäne umfasst, wobei die Aminosäuresequenz der funktionellen Variante mit der Sequenz eines in 1 (SEQ ID NO: 2), in 2 (SEQ ID NO: 4) oder in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Proteins eine 75 % Ähnlichkeit aufweist und die Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz mittels der „Clustal method with the PAM250 residue weight table" unter Verwendung einer Gap Penalty von 10, einer Gap Length Penalty von 10 und „pairwise alignment parameters" mit k-tuple = 1, Gap Penalty = 3, Window = 4 und Diagonals saved = 5 ermittelt wird.
Ein isoliertes Protein nach Anspruch 7, wobei (a) das MAdCAM von Primaten ein humanes MAdCAM ist, das von einer Nucleinsäure codiert wird, welche unter hoch stringenten Bedingungen an eine zweite Nucleisäure hybridisiert, wobei die zweite Nucleinsäure eine Nucleotidsequenz wie in 1 (SEQ ID NO: 1), in 2 (SEQ ID NO: 3) oder in 3 (SEQ ID NO: 5) gezeigt aufweist oder eine Sequenz hat, welche komplementär zu dem offenen Leseraster von einer der obigen Nucleinsäuren ist; oder (b) das MAdCAM von Primaten ein humanes MAdCAM wie das in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigte, das in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigte oder das entsprechende reife Proteine von einem der vorstehenden ist; oder (c) das MAdCAM von Primaten ein Makaken-MAdCAM wie in 3 (SEQ ID NO: 6) oder das entsprechende reife Protein ist.
Ein isoliertes natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten mit einer oder mehreren Funktionen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Bindung an α4β7-Integrin und Vermittlung von Zelladhäsion.
Das isolierte MAdCAM von Primaten nach Anspruch 9, wobei die Zelladhäsion abhängig von α4β7-Integrin ist.
Das isolierte MAdCAM von Primaten nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Bindung selektiv für α4β7 ist.
Eine Wirtszelle mit einer rekombinanten Nucleinsäure, welche (a) für ein natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Protein, dem in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigten Protein, dem in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Protein und der reifen Form von einem der vorstehenden Proteine; oder (b) für eine funktionelle Variante desselben codiert, welche α4β7-Integrin bindet; oder (c) für ein funktionelles Fragment eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten codiert, welches α4β7-Integrin bindet und mindestens eine Immunglobulin-ähnliche Domäne umfasst, wobei die Aminosäuresequenz der funktionellen Variante mit der Sequenz eines in 1 (SEQ ID NO: 2), in 2 (SEQ ID NO: 4) oder in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Proteins eine 75 % Ähnlichkeit aufweist und die Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz mittels der „Clustal method with the PAM250 residue weight table" unter Verwendung einer Gap Penalty von 10, einer Gap Length Penalty von 10 und den „pairwise alignment parameters" k-tuple = 1, Gap Penalty = 3, Window = 4 und Diagonals saved = 5 ermittelt wird.
Die Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die rekombinante Nucleinsäure funktionsfähig an eine Kontrollsequenz für die Expression gebunden ist, wobei das natürlich vorkommende MAdCAM von Primaten oder die funktionelle Variante, die α4β7-Integrin bindet, oder das funktionelle Fragment eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, das α4β7-Integrin bindet, exprimiert wird, wenn die Wirtszelle unter für die Expression geeigneten Bedingungen gehalten wird.
Ein Fusionsprotein mit (a) einem natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Protein, dem in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigten Protein, dem in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Protein und der reifen Form von einem der vorstehenden Proteine; oder (b) einer funktionellen Variante desselben, welche α4β7-Integrin bindet; oder (c) einem funktionellen Fragment eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, welches α4β7-Integrin bindet und mindestens eine Immunglobulin-ähnliche Domäne umfasst, wobei die Aminosäuresequenz der funktionellen Variante mit der Sequenz eines in 1 (SEQ ID NO: 2), in 2 (SEQ ID NO: 4) oder in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Proteins eine 75 % Ähnlichkeit aufweist und die Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz mittels der „Clustal method with the PAM250 residue weight table" unter Verwendung einer Gap Penalty von 10, einer Gap Length Penalty von 10 und den „pairwise alignment parameters" k-tuple = 1, Gap Penalty = 3, Window = 4 und Diagonals saved = 5 ermittelt wird.
Das Fusionsprotein nach Anspruch 14 mit einem ersten Anteil und einem zweiten Anteil, wobei der erste Anteil die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten aufweist oder die funktionelle Variante desselben oder das funktionelle Fragment und der zweite Anteil zumindest einen Teil einer Immunglobulinkette oder eine Variante derselben darstellen.
Das Fusionsprotein nach Anspruch 15, wobei (a) der erste Anteil an seinem C-terminalen Ende an das N-terminale Ende des zweiten Anteils gebunden ist; oder (b) der erste Anteil ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem die gesamte extrazelluläre Domäne enthaltendem funktionellen Fragment des MAdCAM vom Menschen und zwei N-terminale Immunglobulin-Domänen enthaltendem funktionellen Fragment des MAdCAM vom Menschen; oder (c) der zweite Anteil mindestens ein Bereich einer konstanten Region einer schweren Immunglobulinkette oder eine funktionelle Variante derselben darstellt.
Das Fusionsprotein nach Anspruch 16, wobei die schwere Immunglobulinkette von der IgG-Klasse ist und/oder der zweite Anteil die Gelenk-, CH2 und CH3-Domäne der schweren Immunglobulinkette umfasst.
Ein Hybrid-Immunglobulin mit einem Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 14 bis 17.
Hybrid-Immunglobulin nach Anspruch 18, wobei das Hybrid-Immunglobulin ein Homodimer ist.
Ein rekombinantes Nucleinsäure-Konstrukt, welches eine codierende Sequenz enthält, die für ein Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 codiert, wobei die codierende Sequenz optional an eine Kontrollsequenz für die Expression funktionsfähig gebunden ist.
Ein Verfahren zur Produktion eines Proteins nach Anspruch 7, welches den Schritt umfasst, dass eine Wirtszelle, welche eine für dieses Protein codierende rekombinante Nucleinsäure umfasst, unter für die Expression dieser Nucleinsäure geeigneten Bedingungen gehalten wird, wodurch das Protein produziert wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, das ferner die folgenden Schritte umfasst: (a) Einführen eines Nucleinsäure-Konstrukts, welches eine für das Protein codierende Nucleinsäure umfasst, in eine Wirtszelle, wodurch eine rekombinante Wirtszelle produziert wird, in welcher die codierende Sequenz an mindestens eine Kontrollsequenz für die Expression funktionsfähig gebunden ist und (b) Halten der in Schritt (a) produzierten Wirtszelle in einem geeigneten Medium unter Bedingungen, wobei die Nucleinsäure exprimiert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 21 oder 22 mit dem Schritt des Isolierens des Proteins.
Ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment desselben, welches ein natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten, eine funktionelle Variante eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, welches α4β7-Integrin bindet, und/oder ein funktionelles Fragment eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, welches α4β7-Integrin bindet und mindestens eine Immunglobulin-ähnliche Domäne umfasst, wie in Anspruch 7 definiert, bindet.
Ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 24 zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Verwendung eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments nach Anspruch 24 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pankreatitis, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Mastitis, Cholezystitis, Cholangitis, Pericholangitis, chronischer Bronchitis, chronischer Sinusitis, Asthma und Transplantat-Wirt-Reaktion.
Verwendung eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments nach Anspruch 24 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Darmerkrankung.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 24 oder 25 oder Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei (a) der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment sowohl entweder die Bindungsfunktion oder die zelluläre Adhäsionsmolekül-Funktion als auch beide Funktionen eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten hemmen können; oder (b) der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment die α4β7-abhängige Adhäsion selektiv hemmen können; oder (c) der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment die Bindung eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten an α4β7-Integrin hemmen können.
Der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment nach Anspruch 24, 25 oder 28 oder die Verwendung gemäß Anspruch 27 oder 28, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment ein monoklonaler Antikörper oder ein monoklonales Antigen-bindendes Fragment sind.
Der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment nach Anspruch 24, 25, 28 oder 29 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei das natürlich vorkommende MAdCAM von Primaten ein natürlich vorkommendes MAdCAM des Menschen ist.
Verwendung eines MAdCAM von Primaten, einer α4β7-Integrin bindenden funktionellen Variante desselben oder eines Hybrid-Immunglobulins mit einem MAdCAM von Primaten oder einer α4β7-Integrin-bindenden Variante desselben für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pankreatitis, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Mastitis, Cholezystitis, Cholangitis, Pericholangitis, chronischer Bronchitis, chronischer Sinusitis, Asthma und Transplantat-Wirt-Reaktion; wobei das MAdCAM von Primaten ein Protein mit der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Protein, dem in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigten Protein, dem in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Protein und der reifen Form von einem der vorstehenden Proteine oder ein funktioneller Abschnitt derselben, welcher α4β7-Integrin-bindet, ist, wobei der funktionelle Abschnitt mindestens eine Immunglobulin-ähnliche Domäne umfasst, und wobei die Aminosäuresequenz der funktionellen Variante mit der Sequenz eines in 1 (SEQ ID NO: 2), in 2 (SEQ ID NO: 4) oder in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Proteins eine 75 % Ähnlichkeit aufweist und die Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz mittels der „Clustal method with the PAM250 residue weight table" unter Verwendung einer Gap Penalty von 10, einer Gap Length Penalty von 10 und den „pairwise alignment parameters" k-tuple = 1, Gap Penalty = 3, Window = 4 und Diagonals saved = 5 ermittelt wird.
Verwendung eines MAdCAM von Primaten, einer α4β7-Integrin bindenden funktionellen Variante desselben oder eines Hybrid-Immunglobulins mit einem MAdCAM von Primaten oder einer α4β7-Integrin-bindenden Variante desselben für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Darmerkrankung, wobei das MAdCAM von Primaten ein Protein mit der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Protein, dem in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigten Protein, dem in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Protein und der reifen Form von jedem der vorstehenden Proteine oder ein funktioneller Abschnitt derselben, welcher α4β7-Integrin-bindet, ist, wobei der funktionelle Abschnitt mindestens eine Immunglobulin-ähnliche Domäne umfasst, und wobei die Aminosäuresequenz der funktionellen Variante mit der Sequenz eines in 1 (SEQ ID NO: 2), in 2 (SEQ ID NO: 4) oder in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Proteins eine 75 % Ähnlichkeit aufweist und die Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz mittels der „Clustal method with the PAM250 residue weight table" unter Verwendung einer Gap Penalty von 10, einer Gap Length Penalty von 10 und den „pairwise alignment parameters" k-tuple = 1, Gap Penalty = 3, Window = 4 und Diagonals saved = 5 ermittelt wird.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei (a) das MAdCAM von Primaten, die funktionelle Variante oder das Hybrid-Immunglobulin die Wechselwirkung von einem MAdCAM von Primaten mit einem α4β7-Integrin hemmen können; oder (b) das Hybrid-Immunglobulin ein Fusionsprotein enthält, das einen ersten und einen zweiten Anteil umfasst, wobei der erste Anteil ein MAdCAM von Primaten ist und der zweite Anteil mindestens ein Abschnitt einer Immunglobulinkette ist.
Verwendung eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments desselben, welches die β7-Kette von α4β7-Integrin bindet und die Bindung des MAdCAM von Primaten an α4β7-Integrin hemmt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pankreatitis, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Mastitis, Cholezystitis, Cholangitis, Pericholangitis, chronischer Bronchitis, chronischer Sinusitis, Asthma und Transplantat-Wirt-Reaktion; wobei das MAdCAM von Primaten (a) ein natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Protein, dem in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigten Protein, dem in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Protein und der reifen Form von einem der vorstehenden Proteine, oder (b) eine funktionelle Variante desselben ist, welches an α4β7-Integrin bindet; und wobei die Aminosäuresequenz der funktionellen Variante mit der Sequenz eines in 1 (SEQ ID NO: 2), in 2 (SEQ ID NO: 4) oder in 3 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Proteins eine 75 % Ähnlichkeit aufweist und die Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz mittels der „Clustal method with the PAM250 residue weight table" unter Verwendung einer Gap Penalty von 10, einer Gap Length Penalty von 10 und den „pairwise alignment parameters" k-tuple = 1, Gap Penalty = 3, Window = 4 und Diagonals saved = 5 ermittelt wird.
Verwendung eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments desselben, welches die β7-Kette von α4β7-Integrin bindet und die Bindung des MAdCAM von Primaten an α4β7-Integrin hemmt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Darmerkrankung.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei der Antikörper oder das Antigenbindende Fragment desselben die Adhäsion von Leukozyten, die ein die β7-Kette enthaltendes Integrin exprimieren sowie MAdCAM exprimierendes Endothel hemmen.
Verwendung nach Anspruch 35 oder 36, wobei (a) mehr als ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment desselben, welche die Bindung von Leukozyten an Endothel-MAdCAM hemmen. verwendet werden; oder (b) mehr als ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment desselben, welche die Bindung von Leukozyten an Endothel-Liganden hemmen, verwendet werden und mindestens ein Antikörper oder ein Fragment die Bindung von Leukozyten an einen anderen Endothel-Liganden als MAdCAM hemmt.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei der Antikörper oder das Antigenbindende Fragment die Bindung von Leukozyten an Endothel-MAdCAM hemmen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment desselben ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem chimären Antikörper, einem chimäres Antigenbindenden Fragment, einem humanisierten Antikörper und einem humanisiertes Antigen-bindenden Fragment.
Verwendung nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei die Erkrankung Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Zöliakie, eine mit einer seronegativen Gelenkerkrankung assoziierten Enteropathie, eine mikroskopische oder Kollagencolitis, eine eosinophile Gastroenteritis oder Pouchitis ist.
Verwendung eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments desselben, welches α4β7-Integrin bindet, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pankreatitis, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Mastitis, Cholezystitis, Cholangitis, Pericholangitis, chronischer Bronchitis, chronischer Sinusitis, Asthma und Transplantat-Wirt-Reaktion, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment die Epitopspezifität des monoklonalen Antikörpers ACT-1 aufweisen.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 26, 31, 34 und 41, wobei die Erkrankung Pancreatitis oder Insulin abhängiger Diabetes mellitus ist.
Verwendung eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments desselben, welches α4β7-Integrin bindet, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Darmerkrankung beim Menschen, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment die Epitopspezifität des monoklonalen Antikörpers ACT-1 aufweisen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 38 und 43, wobei die entzündliche Darmerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Zöliakie, mit einer seronegativen Gelenkerkrankung assoziierten Enteropathie, mikroskopischer oder Kollagencolitis, einer eosinophile Gastroenteritis oder Pouchitis
Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 38, 43 und 44, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment desselben ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem chimären Antikörper, einem chimäres Antigen-bindenden Fragment, einem humanisierten Antikörper und einem humanisiertes Antigen-bindenden Fragment.
Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 38, 43 und 44, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment desselben ein monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment desselben sind.
Ein Verfahren zur Detektion eines ausgewählten MAdCAM von Primaten in einer Probe, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren einer Probe mit einem Antikörper oder einem Antigenbindenden Fragment desselben nach Anspruch 24 unter Bedingungen, die für spezifische Bindung des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Fragments daran geeignet sind; und (b) Detektieren der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper oder dem Fragment und MAdCAM.
Ein Verfahren zur Detektion oder zur Identifizierung eines Liganden von oder eines an MAdCAM von Primaten bindenden Stoffes, das folgende Schritte umfasst: Zusammenbringen eines zu untersuchenden Stoffes mit einem isolierten Protein nach Anspruch 7 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 12 unter Bedingungen, die für die Bindung des Liganden geeignet sind und Detektieren oder Messen der Bildung eines Komplexes zwischen dem Stoff und dem Protein.
Ein Verfahren zur Detektion eines Inhibitors der Bindung eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten an einen Liganden desselben, das folgende Schritte umfasst: (a) Zusammenbringen eines zu untersuchenden Stoffes mit einem Liganden des MAdCAM von Primaten und einer Zusammensetzung, welche ein isoliertes Protein nach Anspruch 7 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 12 umfasst, unter Bedingungen, die für die Bindung des Liganden an dasselbe geeignet sind, und (b) Detektieren oder Messen der Bindung zwischen dem Protein oder der Wirtszelle und dem Liganden, wobei eine im Vergleich mit einer geeigneten Kontrolle geringere Bindung anzeigt, dass der Stoff ein Inhibitor ist.
Ein Verfahren zur Detektion eines Inhibitors der Bindung eines natürlich vorkommenden MAdCAM von Primaten an einen Liganden desselben, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Zusammenbringen eines zu untersuchenden Stoffes mit einem Liganden des MAdCAM von Primaten und einem Hybrid-Immunglobulin nach Anspruch 18 oder 19 oder einem Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 14 bis 17 unter Bedingungen, die für die Bindung eines Liganden an ein natürlich vorkommendes MAdCAM von Primaten geeignet sind; und (b) Detektieren oder Messen der Bindung zwischen dem Hybrid-Immunglobulin oder dem Fusionsprotein und dem Liganden, wobei eine im Vergleich mit einer geeigneten Kontrolle geringere Bindung anzeigt, dass der Stoff ein Inhibitor ist.
Das Verfahren nach Anspruch 50, wobei der Ligand α4β7-Integrin ist und ein zu untersuchender Stoff, eine α4β7-Integrin exprimierende Zelle und ein Hybrid-Immunglobulin nach Anspruch 18 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 14 oder 15 zusammengebracht werden.
Ein Verfahren zur Detektion eines Inhibitors der von MAdCAM vermittelten Zelladhäsion, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Zusammenbringen eines zu untersuchenden Stoffes, einer Wirtszelle nach Anspruch 12 und einer zweiten, ein α4β7-Integrin tragenden Zelle unter Bedingungen, die für die Adhäsion der Wirtszelle an die zweite Zelle geeignet sind; und (b) Detektieren oder Messen der Adhäsion zwischen der Wirtszelle und der zweiten Zelle, wobei eine im Vergleich mit einer geeigneten Kontrolle geringere Adhäsion anzeigt, dass der Stoff ein Inhibitor ist.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 52, wobei der Stoff ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment desselben ist.
Die isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 4, wobei die Nucleinsäure funktionsfähig an eine Kontrollsequenz für die Expression gebunden ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 26, 31, 34 und 41, wobei die Erkrankung Mastitis ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 26, 31, 34 und 41, wobei die Erkrankung Cholecystitis, Cholangitis oder Pericholangitis ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 26, 31, 34 und 41, wobei die Erkrankung chronische Bronchitis, chronische Sinusitis oder Asthma ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 26, 31, 34 und 41, wobei die Erkrankung Graft-versus-Host-Disease ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 26, 31, 34 und 41, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment desselben ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem chimären Antikörper, einem chimäres Antigen-bindenden Fragment, einem humanisierten Antikörper und einem humanisiertes Antigen-bindenden Fragment.