DE69730358T2

DE69730358T2 - Fas-Antagonist FÜR DIE PROPHYLAXE ODER THERAPIE VON GVHD

Info

Publication number: DE69730358T2
Application number: DE69730358T
Authority: DE
Inventors: Shigekazu Suita-shi NAGATA; Takehiro Yatomi; Takashi Minoo-shi SUDA
Original assignee: Osaka Bioscience Institute; Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Osaka Bioscience Institute; Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2017-11-01
Also published as: EP1449539A2; AU4726797A; US20030109416A1; EP0992243A4; US7128905B2; EP0992243A1; CA2270423A1; JP4339405B2; CA2270423C; EP0992243B1; DE69730358D1; ATE273713T1; WO1998018487A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Fas-Antagonisten, der eine Aktivität zur Verfügung stellt zur Wechselwirkung mit der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden oder der extrazellulären Domäne des Fas und stellt eine Aktivität zur Verfügung zur Hemmung der Fas-vermittelten Apoptose zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Therapie der Transplantation-versus-Wirtserkrankung (graft versus host disease, GVHD).
Hintergrundtechnologie
Fas ist ein Zelloberflächenantigen, das ein Apoptose-Signal an die Zelle sendet und Fas wird durch den Fas-Antikörper erkannt (Yonehara, S. et al., J. Exp. Med. Band 169, 1747–1756, 1989), der ein monoklonaler Antikörper ist, der durch Immunisierung einer Maus mit menschlichem Fibroblasten hergestellt wird. Das Fas-Gen wurde kürzlich durch Itoh, N. et al. kloniert und es wurde dann herausgefunden, dass Fas ein Zellmembranprotein von ungefähr 45 kD ist und aus der Aminosäuresequenz wurde offenbart, dass Fas ein Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie ist (Cell, Band 66, Seiten 233–243, 1991). Das Maus-Fas-Gen wurde auch kloniert (Watanabe-Fukunaga, R. et al., J. Immunol., Band 148, Seiten 1274–1279, 1992) und seine Expression in Thymus, Leber, Lunge, Herz, Ovarien wurde bestätigt.
Der menschliche Fas-Ligand ist ein Polypeptid, von dem von Nagata et al. berichtet wurde, dass es ein biologisches Molekül ist, das die Apoptose von Fas-exprimierenden Zellen induziert (Tomohiro Takahashi et al., International Immunology, Band 6, Seiten 1567–1574, 1994). Menschlicher Fas-Ligand ist ein Typ II Membran Protein der TNF-Familie mit einem Molekulargewicht von ungefähr 40 kD. Wie in dem Fall von TNF wird vom menschlichen Fas-Liganden im menschlichen Körper angenommen, dass er in der Form eines Trimers vorliegt (Masato Tanaka et al., EMBO Journal, Band 14, Seiten 1129–1135, 1995). Die extrazelluläre Domäne des menschlichen Fas-Liganden ist hoch homolog mit der extrazellulären Domäne des Ratten-Fas-Liganden (Takashi Suda et al., Cell, Band 75, Seiten 1169–1178, 1993) und des Maus-Fas-Liganden (Tomohiro Takahashi et al., Cell, Band 76, Seiten 969–976, 1994). Der menschliche Fas-Ligand erkennt nicht nur das menschliche Fas sondern auch das Maus-Fas, um die Apoptose zu induzieren und umgekehrt erkennen der Ratten-Fas-Ligand und der Maus-Fas-Ligand auch das menschliche Fas, um die Apoptose zu induzieren.
Erhebliche Untersuchungen wurden über den Mechanismus der Signaltransduktion in der Zelle nach der Fas-vermittelten Apoptose durchgeführt und die Identifizierung und Klonierung des Faktors, welcher mit der extrazellulären Domäne des Fas wechselwirkt, insbesondere der Region, die "Todesdomäne" genannt wird, um das Signal weiterzuleiten oder zu blockieren, wurde berichtet. Die Möglichkeit der Involvierung von Interleukin-1-konvertierendem Enzym (ICE)-verwandten Thiolproteasen in der Fas-vermittelten Apoptose wurde auch vorgeschlagen.
Das Verhältnis zwischen der Apoptose, insbesondere der Fas-vermittelten Apoptose, mit verschiedenen Erkrankungen und physiologischen Phenomena wurde kürzlich vorgeschlagen. Zum Beispiel wurde die Möglichkeit für die Involvierung abnormaler Fas-vermittelter Apoptose in der Verringerung der T-Zellzahl in Patienten vorgeschlagen, die an AIDS leiden, in dem Tod von Hepatozyten in viraler fulminanter Hepatitis, in einigen Arten von Autoimmunerkrankungen und Ähnlichen.
Die Involvierung des Fas/Fas-Ligandensystems in anderen Funktionen als Apoptose wurde auch vorgeschlagen. Zum Beispiel wurde die Möglichkeit für das Fas/Fas-Ligandensystem vorgeschlagen, mit Neutrophilen zu reagieren, um eine proentzündliche Wirkung zu entwickeln (Kayagaki, N. et al., Rinshou Meneki (Clinical Immunology), Band 28, Seiten 667–675, 1996).
Der Zustand, bei dem Neutrophile und andere immunkompetente Zellen durch verschiedenartige Stimulation, wie ein Endotoxin oder durch Invasion oder humorale Faktoren, wie die Freisetzung von Cytokin in das Blut und die Gewebe aktiviert werden, wird als systemisches entzündliches Reaktionssyndrom bezeichnet (hiernach als SIRS abgekürzt). SIRS wird oft mit verschiedenen Organversagen assoziiert und wenn solche Organversagungen ernsthaft sind, kann SIRS in dem Mehrfachorgan-Versagungssyndrom (MODS) resultieren (Wakabayashi et al., Rinsho Kensa (Laboratory test), Band 38, Seiten 349–352, 1994). Von verschiedenen Faktoren wird gesagt, dass sie in den Prozess des Organversagens involviert sind, und die Rolle der Invasion und Akkumulierung von Neutrophilen durch die Wirkung von IL-8, dass in Macrophagen und anderen Zellen als Reaktion auf die Invasion durch IL-1 lokal hergestellt wird, ist in einem solchen Organversagen von aktuellem Interesse. Wie oben beschrieben, wird von dem Fas/Fas-Ligandensystem (hiernach als Fas/FasL-System bezeichnet) berichtet, dass die Möglichkeit seiner Involvierung in der Aktivierung der Neutrophilen besteht.
Die ischämische Reperfusionsverletzung ist in praktisch allen Geweben und Organen zu finden und ist in verschiedene Erkrankungen involviert. Die ischämische Reperfusionsverletzung ist auch ein Problem in der Konservierung und Transplantation von Organen. Unter solchen ischämischen Reperfusionsverletzungen können solche, die mit einem Infarkt der Leber, des Herzens oder der Niere und solche, die mit Chirurgie oder Transplantation assoziiert sind, und insbesondere eine Gewebeverletzung (wie Zellnekrose) und Fehlfunktion (wie kardische Arrhythmie) in dem jeweiligen Organ zum Tod des Individuums führen, wenn diese ernsthaft ist, und daher sind solche Fälle ein ernsthaftes soziales Problem. Verschiedene Organversagen und ischämische Reperfusionsverletzungen vom frühen Stadium bis zum späten Stadium sind dafür bekannt, dass sie mit der Produktion und Sezernierung von IL-8 assoziiert sind. Es ist auch bekannt, dass die Organkonservierung und Reperfusion im Kurs einer Organtransplantation mit dem Vorkommen der Apoptose assoziiert ist. Zusätzlich wurde die Beobachtung der Apoptose und Fluktuation in der Expression von Fas oder FasL für einige experimentelle Modelle berichtet. Es wurde auch eine deutliche Erhöhung in der Anzahl von Neutrophilen nach 24 Stunden nach der Reperfusion der Leber nach Ischämie und eine Verbesserung der ischämischen Reperfusionsverletzung durch den neutralisierenden Antikörper der Neutrophilen (Jaeschke, H. et al., FASEB Journal, Band 4, Seiten 3355–3359, 1990) und eine deutliche Erhöhung von IL-8, Neutrophilen und Macrophagen bei 3 Stunden nach der Reperfusion der Lunge nach Ischämie und eine Verbesserung der ischämischen Reperfusionsverletzung durch den neutralisierenden Antikörper des IL-8 (Sekido, N. et al., Nature, Band 365, Seiten 654–657, 1993) berichtet. Diese Ergebnisse deuten die signifikanten Rollen der Neutrophilen und des IL-8 in Organversagen und ischämischen Reperfusionsverletzungen im frühen bis zum späten Stadium an. Auf der anderen Seite ist bis jetzt noch nicht herausgefunden worden, wie das Fas/FasL in solche Versagen und Verletzungen involviert ist.
In der Infektion durch Bakterien induziert Endotoxin die Herstellung von verschiedenen Cytokinen in dem Körper, die z. B. in einem Endotoxin-Schock in Endotoxämie und Sepsis sowie verschiedenen Organschädigungen einschließlich der Leberschädigung (Dinarello, C. A. et al., J. American Medical Association, Band 269, Seite 1829, 1993) resultieren und ernsthafte Zustände werden mehr als nur oft induziert.
Die Beobachtung der Apoptose in einem solchen Prozess und die Möglichkeit einer Involvierung des Fas/FasL in einem solchen Prozess wurde in experimentellen Studien berichtet. Jedoch wurde bis jetzt nicht herausgefunden, wie das Fas/FasL in solchen Versagen involviert ist.
Von dem Tod von Kardiomyozyten im Falle einer Herzerkrankung wird angenommen, dass er hauptsächlich durch Nekrose stattfindet. Jedoch wird die Möglichkeit einer Involvierung der Apoptose und insbesondere der Involvierung der Fas-vermittelten Apoptose in einer solchen Herzerkrankung nun für klinische Handlungen und Experimente berichtet. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Menge der Fas-Expression sich erhöht, wenn neonatale Ratten-Kardiomyozyten unter in vitro chemische Bedingungen gestellt werden (Tanaka, M. et al., Circ. Res., 75, 426–433, 1994); und, dass NO eine Bedeutung für das Umformen von Plaques in Arteriosklerose haben kann, da IL-1 nicht nur die Synthese von Stickstoffmonoxid (NO) der vaskulären glatten Muskelzellen induziert, sondern auch Apoptose, wobei die Apoptose durch IL-1 durch einen Hemmer der NO-Synthese gehemmt wird und die Fas-Expression durch NO induziert wird (Fukuo, K. et al., Hypertension, 27, 823–826, 1996). Es wurde auch berichtet, dass die Apoptose von Kardiomyozyten in einem Modell des caninen Herzversagens gefunden wurde und dass eine solche Apoptose mit einer erhöhten Fas-Expression assoziiert ist (Lab. Invest., 73, 771–787, 1995) und dass der größte Teil des Kardiomyozyten-Todes in dem caninen myokardischen Infarktmodell durch Apoptose vorkommt und dass ein solcher Kardiomyozyten-Tod mit einer 100fachen Erhöhung in der Fas-Expression assoziiert ist (Lab. Invest., 74, 86–107, 1996). Zudem untersuchten Fukuda et al. die Fas-Expression in Kardiomyozyten von kardiomyokardial erkrankten Patienten und fanden keinerlei Fas-Expression in hypertropher Kardiomyopathie, aber einige Fas-Expression in mindestens einem Teil der Kardiomyozyten in den Fällen von Myocarditis und vergrößerter Kardiomyopathie (Idiopathic Cardiomyopathy Investigation Group, 1994 Business Year Research Report, 152–155, 1995). Jedoch wurde bis jetzt nicht herausgefunden, wie das Fas in eine solche Herzerkrankung involviert ist. Dementsprechend haben die oben beschriebenen Berichte keinerlei Daten zur Verfügung gestellt, bezüglich der Frage, ob das Fas dahingehend wirkt, die Apoptose der Kardiomyozyten zu unterstützen oder die Apoptose der Kardiomyozyten in Herzerkrankungen zu unterdrücken und es war weiterhin unklar, ob das Fas direkt in die Cytotoxizität oder den Tod der Kardiomyozyten der Patienten involviert ist, die an Herzerkrankungen leiden. Als Konsequenz sind keinerlei therapeutisches Mittel und keinerlei Therapie für die Herzerkrankung bis heute bekannt, bei der die Erkrankung durch Hemmung der Fas-vermittelten Apoptose behandelt wird.
Die Involvierung der Apoptose wird auch für Nierenerkrankungen vorgeschlagen und eine Erhöhung in der Fas-mRNA-Expression wird in einem experimentellen Modell der ischämischen Nierenreperfusionsverletzung berichtet (Haruno, N. et al., Endocrinology, Band 137, 1938–1948, 1996). Jedoch wurde nicht herausgefunden, wie das Fas/FasL-System in solche Nierenerkrankungen involviert ist.
Die Transplantations-versus-Wirtserkrankung (hiernach als GVHD bezeichnet, graft versus host disease) ist eine Erkrankung, die durch die Reaktion des Wirts gegen eine Transplantation bewirkt wird (GVH-Reaktion), welches eine Immunreaktion nach Transplantation der Lymphozyten des Spenders oder des Transplantats gegen das Gewebeantigen des Wirts ist. Beispielhafte GVHDs sind GVHD nach Knochenmarkstransplantation, wie die inkompatible Knochenmarkstransplantation oder die Knochenmarkstransplantation in kongenitalem Immunschwächesyndrom; GVHD nach Organtransplantation; GVHD nach Bluttransfusion, bei der eine große Menge an Blut an einen Patienten mit Hypoimmunität transfundiert wird; und Ähnliche. GVHD ist mit einem Organ- oder Gewebeversagen assoziiert, das auf einer GVH-Reaktion basiert, und es werden Diarrhö, Verausgabung wie Gewichtsverlust und Dünnerwerden, Exanthem, Splenomegalie und Leberfehlfunktion klinisch beobachtet. GVHD ist auch mit histologischen Symptomen, wie der Disorganisation von Knochenmarks- und Lymphgewebe und der Atrophie intestinaler Villi assoziiert.
Von dem Tod der Zellen, die das Wirtsgewebe in verschiedenen GVHD konstituieren, wird angenommen, dass er hauptsächlich durch Nekrose vorkommt. Jedoch wird nun die Möglichkeit einer Involvierung der Apoptose und insbesondere der Fas-vermittelten Apoptose in solchen GVHD für Experimente berichtet. Zum Beispiel wurde berichtet, dass der Tod von Epithelzellen im Darm, Haut und Zunge im Maus-GVHD-Modell hauptsächlich durch Apoptose vorkommt (Aniti C. Gilliam et al., J. Invest. Dermatol., Band 107, Seiten 377–383, 1996). In Bezug auf die Involvierung der Fas-vermittelten Apoptose wurde berichtet, dass kein Unterschied in der Überlebenszeit zwischen den Fällen bestand, bei denen der Spender Milzlymphozyten von einer Kontroll-Maus mit normalem Fas-Liganden waren, und in den Fällen, in denen der Spender Milzlymphozyten aus einer gld-Maus waren, welches eine Fas-Liganden-mutierte Maus ist, und es wurde praktisch keinerlei Schaden in Haut oder Leber induziert (Matthew, B., Barker, B. et al., J. Exp. Med., Band 183, 2645–2659, 1996). Trotz der Annahme der Involvierung der Fas-vermittelten Apoptose in GVHD gibt es keinerlei Rückschluss auf die Frage, ob die Fas-vermittelte Apoptose mit der Mortalität von GVHD assoziiert ist. Des Weiteren verwendet der oben beschriebene Bericht Milzlymphozyten aus einer gld-Maus als Material, und es ist wahrscheinlich, dass die GVHD-Reaktion durch Veränderung in der Menge der Expression der Faktoren beeinflusst werden, die nicht der Fas-Ligand sind (wie Perforin und TNF), als Ersatz für den Mangel an Fas-Ligand, und die erhaltenen Ergebnisse können nicht notwendigerweise die tatsächliche Wirkung des Mangels an Fas-Ligand reflektieren. Daher wurde bisher nicht herausgefunden, wie die Fas-vermittelte Apoptose in GVHD involviert ist, und ob die Substanz, die spezifisch die Fas-vermittelte Apoptose hemmt, als therapeutisches Agens für GVHD verwendet werden kann.
Die nicht spezifischen Immununterdrücker wie Cyclosporin, die als ein prophylaktisches oder therapeutisches Mittel der GVHD verwendet wurden, generieren eine nicht spezifische Immunsuppression und leiden daher an Nebenwirkungen wie Infektionen. Bis jetzt sind kein therapeutisches Mittel und keine Therapie für die GVHD bekannt, bei der GVHD durch Hemmung der Fas-vermittelten Apoptose behandelt wird. Zudem sind bisher kein therapeutisches Mittel und keine Therapie für die GVHD bekannt, bei der die GVHD durch Verwendung einer selektiven Immununterdrückung behandelt wird.
JP-7289266 beschreibt eine DNA (1), die eine menschliche Fas-Antigenvariante kodiert. Besagte Variante wird dahingehend beschrieben, dass sie für die Behandlung von Hepatitis, Nephritis, Multiorganinsuffizienz und Aufrechterhaltung von Organen in der Transplantation wirksam ist. EP 842 948 A1 wurde am 20. Mai 1998 veröffentlicht und am 1. Juli 1996 angemeldet und ist daher nur Stand der Technik nach Artikel 54(3) (4) EPC. Sie beschreibt die Verwendung von Anti-Fas-Ligandenantikörpern für die Verhinderung und Therapie der Erkrankungen, die angeblich mit Fas-Ligand/Antikörper assoziiert sind, wie eine Reperfusionsveränderung, die mit einem Herzinfarkt, einer Transplantations-versus-Wirtserkrankung, einer Kolitis ulcerosa und Chron's-Erkrankung.
In Bezug auf die Erkrankungen, die auf der ischämischen Reperfusionsverletzung basieren, richten sich kommerziell verfügbare Medikamente hauptsächlich auf die Thrombolyse und Verbesserung der Zirkulation und keinerlei Medikament ist verfügbar, das direkt den Schaden verhindert oder behandelt. In Bezug auf die Endotoxämie und Sepsis werden Steroid- und proteolytische Enzyminhibitoren z. B. im Falle von Schock verwendet und keinerlei Medikament ist derzeit verfügbar, das direkt den Organschaden behandelt. Die für die Erkrankungen verwendeten Medikamente, die auf Organschaden basieren, sind hauptsächlich auf eine palliative Behandlung gerichtet und keinerlei Medikament ist verfügbar, das die Erkrankungen, die auf Organschaden basieren, verhindert oder radikal behandelt. Zusätzlich ist keinerlei prophylaktisches oder therapeutisches Mittel verfügbar, das breit wirksam für verschiedene Gewebe und Organe ist.
Im Hinblick auf eine solche Situation gibt es einen Bedarf an einem Pharmazeutikum, das wirksam in der Verhinderung oder Behandlung der Erkrankungen ist, die auf dem Schaden an dem Gewebe oder dem Organ in einer weiten Vielfalt an Geweben oder Organen basieren, das in vivo wirksam ist und welches weniger toxisch für Menschen ist. Jedoch ist derzeit kein Pharmazeutikum verfügbar, das solche Voraussetzungen erfüllt.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung weitere Mittel für die Prophylaxe und Therapie der Transplantations-versus-Wirtserkrankung (GVHD) zur Verfügung zu stellen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Fas-Antagonisten zur Verfügung, der eine Aktivität zur Verfügung stellt, um mit der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden oder der extrazellulären Domäne des Fas zu wechselwirken und eine Aktivität zur Verfügung stellt, um die Fas-vermittelte Apoptose zu hemmen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Therapie der Transplantations-versus-Wirtserkrankung (graft versus host disease, GVHD).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine intensive Studie über die Funktion des Fas/Fas-Ligandensystems und die Rolle der durch das Fas/Fas-Ligandensystem vermittelten Apoptose in verschiedenen Erkrankungen durchgeführt und herausgefunden, dass die Zustände in verschiedenen Erkrankungsmodellen durch die Unterdrückung der Wirkungen des Fas/Fas-Ligandensystems verbessert werden können und insbesondere durch die Unterdrückung der Fas/Fas-Ligandensystem-vermittelten Apoptose; und dass z. B. der Tod von Kardiomyozyten nach Reperfusion nach Ischämie, dem Einsetzen der GVHD, die mit allogener Knochenmarkstransplantation assoziiert ist, und die Organschäden, die durch Endotoxin bewirkt werden, durch einen Antagonisten unterdrückt werden, der die Fas-vermittelte Apoptose hemmt. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Funde vervollständigt.
Mit anderen Worten, die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Fas-Antagonisten zur Verfügung, der eine Aktivität zur Verfügung stellt, um mit der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden oder der extrazellulären Domäne des Fas zu wechselwirken und eine Aktivität zur Verfügung stellt, um die Fas-vermittelte Apoptose zu hemmen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Therapie der Transplantations-versus-Wirtserkrankung (GVHD, graft versus host disease).
Das Mittel der vorliegenden Erfindung wird zur Prophylaxe oder Therapie von GVHD verwendet.
Der Fas-Antagonist ist vorzugsweise mindestens ein Mitglied, das aus einem Anti-Fas-Ligandenantikörper, einem Anti-Fas-Antikörper und einem Fas-Derivat ausgewählt ist, und insbesondere ist der Anti-Fas-Ligandenantikörper vorzugsweise ein humanisierter Anti-Fas-Ligandenantikörper.
Mit anderen Worten, die vorliegende Erfindung stellt neue Verwendungen des Fas-Antagonisten zur Verfügung.
Es wird darauf aufmerksam gemacht, dass in der vorliegenden Erfindung ein Fas-Antagonist eine Substanz ist, die eine unterdrückende oder hemmende Wirkung aufweist und insbesondere eine Substanz ist, die die biologischen Wirkungen des Fas/Fas-Ligandensystems unterdrückt oder hemmt und insbesondere die Fas-vermittelte Zellapoptose.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Überblick, der die Sequenzen der cDNA und die übersetzten Aminosäuren für die variable Region in der leichten Kette des Maus-F919-9-18-Antikörpers zeigt. CDRs sind unterstrichen und die erste Aminosäure in der reifen Kette ist zweifach unterstrichen.
2 ist ein Überblick, der die Sequenzen der cDNA und die übersetzten Aminosäuren für die variable Region in der schweren Kette des Maus-F919-9-18-Antikörpers zeigt. CDRs sind unterstrichen und die erste Aminosäure in der reifen Kette ist zweifach unterstrichen.
3 ist ein Überblick, der die Sequenzen der cDNA und die übersetzten Aminosäuren für die variable Region in der leichten Kette des humanisierten F919-Antikörpers zeigt. CDRs sind unterstrichen und die erste Aminosäure in der reifen Kette ist zweifach unterstrichen.
4 ist ein Überblick, der die Sequenzen der cDNA und die übersetzten Aminosäuren für die variable Region in der schweren Kette des humanisierten F919-Antikörpers zeigt. CDRs sind unterstrichen und die erste Aminosäure in der reifen Kette ist zweifach unterstrichen.
5 ist ein Überblick, der die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz zeigt, die von einem Teil eines Vektors (pM1304) abgeleitet ist, der die Nukleotidsequenz der cDNA enthält, die für das shFas(nd29)-Fc kodiert, das ein Fas-Derivat ist (bis zur 64. Aminosäure (bis zur 275. DNA)).
6 ist ein Überblick, der die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz zeigt, die von einem Teil des Vektors (pM1304) abgeleitet ist, der die Nukleotidsequenz der cDNA enthält, die für das shFas(nd29)-Fc kodiert, das ein Fas-Derivat ist (von der 65. Aminosäure bis zur 144. Aminosäure (von der 276. DNA bis zur 515. DNA)). Mögliche N-Glycosylierungsstellen sind mit einem markiert.
7 ist ein Überblick, der die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz zeigt, die von einem Teil des Vektors (pM1304) abgeleitet ist, der die Nukleotidsequenz der cDNA enthält, die für das shFas(nd29)-Fc kodiert, das ein Fas-Derivat ist (von der 145. Aminosäure bis zur 224. Aminosäure (von der 516. DNA bis zur 755. DNA)). Mögliche N-Glycosylierungsstellen sind mit einem markiert.
8 ist ein Überblick, der die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz zeigt, die von einem Teil des Vektors (pM1304) abgeleitet ist, der die Nukleotidsequenz der cDNA enthält, die für das shFas(nd29)-Fc kodiert, das ein Fas-Derivat ist (von der 225. Aminosäure bis zur 304. Aminosäure (von der 756. DNA bis zur 995. DNA)).
9 ist ein Überblick, der die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz zeigt, die von einem Teil des Vektors (pM1304) abgeleitet ist, der die Nukleotidsequenz der cDNA enthält, die für das shFas(nd29)-Fc kodiert, das ein Fas-Derivat ist (von der 305. Aminosäure (von der 996. DNA)).
10 ist ein Überblick, der die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz zeigt, die von einem Teil eines Vektors (pM1317) abgeleitet ist, der die Nukleotidsequenz der cDNA enthält, die für die shFas(nd29)-Brücke kodiert, die ein Fas-Derivat ist (bis zur 64. Aminosäure (bis zur 275. DNA)).
11 ist ein Überblick, der die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz zeigt, die von einem Teil eines Vektors (pM1317) abgeleitet ist, der die Nukleotidsequenz der cDNA enthält, die für die shFas(nd29)-Brücke kodiert, die ein Fas- Derivat ist (von der 65. Aminosäure (von der 276. DNA bis zur 515. DNA)). Mögliche N-Glycosylierungsstellen sind mit einem * markiert.
12 ist ein Überblick, der die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz zeigt, die von einem Teil des Vektors (pM1317) abgeleitet ist, der die Nukleotidsequenz der cDNA enthält, die für die shFas(nd29)-Brücke kodiert, die ein Fas-Derivat ist (von der 516. DNA).
13 ist ein Überblick, der die unterdrückende Wirkung des Fas-Derivats (hFas-Fc) für eine myokardische Infarktläsion in einem experimentellen Rattenmodell der ischämischen Reperfusionsherzverletzung zeigt.
14 ist ein Überblick, der die unterdrückende Wirkung des Fas-Derivats (hFas-Fc) zur Erhöhung des Plasma-CPK-Werts bei 3 Stunden nach der Reperfusion in einem experimentellen Rattenmodell der ischämischen Reperfusionsherzverletzung zeigt.
15 ist ein Überblick, der die Wirkung des menschlichen Fas-Fc in der Verlängerung der Überlebenszeit in dem Maus-GVHD-Modell zeigt. Ein leeres Quadrat (☐) stellt die Überlebensrate der Gruppe dar, der 10 mg/kg hFas-Fc verabreicht wurde und ein gefülltes Quadrat (
) stellt die Überlebensrate der Kontrollgruppe dar.
16 ist ein Überblick, der die unterdrückende Wirkung des anti-Mensch-Fas-Liganden-Antikörpers auf die Mortalität im Maus-Leberschaden-Modell zeigt. Ein leeres Quadrat (☐) stellt die Überlebensrate der Gruppe dar, der 0,4 mg/kg F919-9-18 verabreicht wurde, ein leeres Dreieck (Δ) zeigt die Überlebensrate der Gruppe, der 1,2 mg/kg F919-9-18 verabreicht wurde und ein (
) stellt die Überlebensrate der Kontrollgruppe dar.
17 ist ein Überblick, der die unterdrückende Wirkung des Anti-Maus-Fas-Liganden-Antikörpers (#58-11) für eine myokardische Infarktlesion in einem experimentellen Rattenmodell des ischämischen Reperfusionsherzverletzungsmodells zeigt.
18 ist ein Überblick, der die unterdrückende Wirkung des Anti-Maus-Fas-Liganden-Antikörpers (#58-11) zur Erhöhung des CPK-Werts bei 3 Stunden nach der Reperfusion in einem experimentellen Rattenmodell der ischämischen Reperfusionsherzverletzung zeigt.
19 ist ein Überblick, der die Wirkung des Anti-Maus-Fas-Liganden-Antikörpers (#58-11) in der Verbessung der Überlebensrate des Maus-GVHD-Modells zeigt. Ein leerer Kreis (o) stellt die Überlebensrate der GVHD-negativen Gruppe dar, ein gefüllter Kreis (⦁) stellt die Überlebensrate der Gruppe dar, der 10 mg/kg von #58-11 verabreicht wurde und ein gefülltes Quadrat (
) stellt die Überlebensrate der Kontrollgruppe dar, der 10 mg/kg des Kontrollantikörpers verabreicht wurde.
20 ist ein Überblick, der die unterdrückende Wirkung des Anti-Maus-Fas-Liganden-Antikörpers (#58-11) zur Erhöhung des Plasmaharnstoff-Stickstoffs in einem Maus-ischämischen Nieren-Reperfusionsverletzungs-Modell zeigt.
21 ist ein Überblick, der die unterdrückende Wirkung des Anti-Maus-Fas-Liganden-Antikörpers (#58-11) zur Erhöhung des Plasmakreatinins in einem Maus-ischämischen-Nierenreperfusionsverletzungs-Modell zeigt.
Bester Modus zur Durchführung der Erfindung
Als nächstes wird die vorliegende Erfindung in mehr Detail beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Fas-Antagonisten zur Verfügung, der eine Aktivität zur Verfügung stellt, um mit der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden oder der extrazellulären Domäne des Fas zu wechselwirken und stellt eine Aktivität zur Verfügung zur Hemmung der Fas-vermittelten Apoptose zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Therapie der Transplantations-versus-Wirtserkrankung (GVHD).
In einer solchen Krankheit betreffen die biologischen Wirkungen des Fas/Fas-Ligandensystems und insbesondere die Fas-vermittelte Apoptose den Beginn, den Verbleib oder die Verschlechterung der Symptome oder der Pathologie einer solchen Krankheit oder tragen dazu bei.
GVHD umfasst GVHD nach Knochenmarkstransplantation, wie bei der inkompatiblen Knochenmarkstransplantation und der Knochenmarkstransplantation in kongenitaler Immunschwäche; GVHD nach Organtransplantation; Posttransfusions-GVHD, wie GVHD nach Bluttransfusion einer großen Menge an einen Patienten mit Hypoimmunität. GVHD ist mit Organ- oder Gewebeversagen, die auf der GVH-Reaktion basieren, assoziiert und Diarrhö, Erschöpfung wie Gewichtsverlust und Dünnerwerden, Exanthem und Leberfehlfunktion werden beobachtet. GVHD ist auch mit histologischen Symptomen, wie der Disorganisation von Knochenmark und Lymphgewebe und der Atrophie von intestinalen Villi assoziiert.
Es ist erwähnenswert, dass die vorliegende Erfindung zur Verwendung im Menschen, aber auch in Tieren, die nicht Menschen sind, adaptiert ist.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Fas-Antagonist kann korrekt als ein Antagonist für das Fas/Fas-Ligandensystem bezeichnet werden und der Fas-Antagonist ist nicht auf irgend einen bestimmten Typ eingeschränkt, so lange er die Signalbildung oder Transduktion durch das Fas in irgend einem Stadium verhindert oder blockiert und er unterdrückt oder hemmt die Funktion oder die biologische Wirkung des Fas/Fas-Ligandensystems und insbesondere die Fas-vermittelte Apoptose und besonders die Fas-vermittelte Apoptose durch den Fas-Liganden. Der Fas-Antagonist kann über verschiedene Mechanismen wirken und beispielhafte Fas-Antagonisten sind solche, die die Wirkung oder die Funktion des Fas-Liganden oder des Fas hemmen; solche, die mit der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden oder der extrazellulären Domäne des Fas wechselwirken; solche, die die Wechselwirkung zwischen dem Fas-Liganden und dem Fas hemmen; solche, die die Wechselwirkung zwischen der intrazellulären Domäne des Fas und einem intrazellulären Faktor betreffen, der damit wechselwirkt; solche, die die Aktivität des intracytoplasmatischen Faktors unterdrücken (wie eine ICE-artige Protease), der in der Signaltransduktion der Fas-vermittelten Apoptose involviert ist. Die Fas-Antagonisten umfassen sowohl hoch molekulargewichtige proteinartige Substanzen wie auch gering molekulargewichtige Verbindungen. Zur bessern Illustration umfassen beispielhafte Fas-Antagonisten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ein Fas-Derivat, einen Anti-Fas-Ligandenantikörper, einen Anti-Fas-Antikörper, ein Antisens-Oligonukleotid für die mRNA oder das Gen des Fas oder des Fas-Liganden, eine Substanz, die mit der intrazellulären Domäne des Fas wechselwirkt, einen ICE-Hemmer, die mit der Aktivität ausgestatten sind, die Wirkung des Fas/FasL-Systems zu hemmen und insbesondere die Fas-vermittelte Apoptose. Vorzugsweise kann der in der vorliegenden Erfindung verwendete Fas-Antagonist ein Fas-Derivat, ein Anti-Fas-Antikörper oder ein Anti-Fas-Ligandenantikörper sein, der eine hemmende Wirkung für die Fas-vermittelte Apoptose aufzeigt. Zusätzlich sind das Fas und der Fas-Ligand vorzugsweise von menschlichem Ursprung; der Anti-Fas-Antikörper und der Anti-Fas-Ligandenantikörper sind vorzugsweise jeweils ein menschlicher Fas-Antikörper und ein menschlicher Anti-Fas-Ligandenantikörper; und der Anti-Fas-Ligandenantikörper ist vorzugsweise ein humanisierter Anti-Fas-Ligandenantikörper. Der humanisierte Anti-Fas-Ligandenantikörper ist vorzugsweise derjenige, bei dem die konstante Region und die Gerüstregion von menschlichem Ursprung sind, und die Komplementaritätsbestimmenden Regionen sind von nicht menschlichem Ursprung. Der Fas-Antagonist, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise derjenige, der die Apoptose inhibiert, wenn die Fas-exprimierende Zelle in einem geeigneten Assay ist, der in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 beschrieben wird.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Antikörper kann entweder ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper sein und die molekulare Spezies, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht besonders eingeschränkt. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Antikörper kann entweder ein Antikörpermolekül von normaler Form oder ein Fragment davon sein, das in der Lage ist, an das Antigen zu binden, um die Fas-Antigen-vermittelte Apoptose zu hemmen, z. B., Fab, F(ab')₂, Fv oder einzelkettiges Fv (scFv), welches das Fv der schweren Kette ist, das an das Fv der leichten Kette durch einen geeigneten Linker verbunden ist, um eine einzelne Kette auszubilden. Zudem kann der in der vorliegenden Erfindung verwendete Antikörper ein Immunglobulin jeglicher Klasse, Unterklasse oder Isotyps sein. Wie oben beschrieben, ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete Antikörper nicht auf einen jeweiligen Typ eingeschränkt, solange er in der Lage ist, an den Fas-Liganden oder das Fas- Antigen zu binden, um die biologischen Wirkungen des Fas/Fas-Ligandensystems zu hemmen und insbesondere die Fas-Antigen-vermittelte Apoptose.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Anti-Fas-Ligandenantikörper kann ein Antikörper jeglichen Typs (entweder monoklonal oder polyklonal) und jeglichen Ursprungs sein, der durch jegliches geeignetes Verfahren hergestellt wird. Jedoch ist der Anti-Fas-Ligandenantikörper vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der aus einem Säugetier abgeleitet ist. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete monoklonale Antikörper kann in jeglicher Tierspezies hergestellt werden, solange es sich um ein Säugetier handelt, welches ein Mensch oder kein Mensch sein kann. Der monoklonale Antikörper aus einem Säugetier, das nicht Mensch ist, kann der von einem Kaninchen oder anderen Nagetieren sein. Die nicht einschränkenden bevorzugten Beispiele solcher Nagetiere sind Maus, Ratte und Hamster und die Verwendung solcher Tiere erleichtert eine einfache Herstellung des monoklonalen Antikörpers. Des Weiteren kann der monoklonale Antikörper derjenige sein, der in der Lage ist, das Antigen in einem konventionellen Immunverfahren, wie einem Radioimmuno-Assay (RIA), Enzymimmuno-Assay (EIA, ELISA), einer Immunfluoreszenz-Analyse oder Ähnlichem zu erkennen und dessen Aktivität der Unterdrückung der Apoptose der Fas-Antigen-exprimierenden Zelle ist durch ein geeignetes Assay-Verfahren messbar, das in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 beschrieben wird.
Unter diesen ist ein Beispiel des am meisten bevorzugten Anti-Fas-Ligandenantikörpers der Maus-F919-9-18-Antikörper, der durch die Hybridomzelle F919-9-18 hergestellt wird, die ursprünglich am 22. Juni 1995 in dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) (Zugangsnummer P-15002) hinterlegt wurde und von der ursprünglichen Hinterlegung zur internationalen Hinterlegung am 9. Mai 1996 transferiert wurde (Zugangsnummer FERM BP-5535). Die Sequenzen der variablen Regionen des Antikörpers werden in 1 gezeigt (cDNA wird in SEQ. ID Nr. 1 beschrieben) und 2 (cDNA wird in SEQ. ID Nr. 2 beschrieben).
Der Anti-Fas-Ligandenantikörper und der Anti-Fas-Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können z. B. durch das in der Internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293, der internationalen Patent anmeldung Nr. PCT/JP96/01820 und der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/10540 beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Wenn ein monoklonaler Antikörper in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ein solcher monoklonaler Antikörper durch das Verfahren hergestellt werden, das auf dem Gebiet bekannt ist, z. B. durch Verwendung des Fas-Antigens, Fas-Liganden oder eines Teilpeptids davon als das Immunisierungsantigen, das Immunisieren eines Tieres mit einem solchen Antigen gemäß einem konventionellen Verfahren, das Fusionieren der resultierenden immunisierten Zelle mit einer bekannten parentalen Zelle durch ein konventionelles Zellfusionsverfahren und das Untersuchen auf die monoklonale Antikörperproduzierende Zelle durch ein konventionelles Screening-Verfahren.
Genauer gesagt, wenn das Immunisierungsantigen menschlicher Fas-Ligand oder sein Fragment ist, dann wird die Nukleotidsequenz des menschlichen Fas-Liganden verwendet, die in Takahashi, T. (International Immunology, Band 6, Seiten 1567–1574, 1994) offenbart wird, und diese Nukleotidsequenz wird in ein bekanntes Expressionsvektorsystem eingefügt, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, das gewünschte Fas-Ligandenprotein wird durch Aufreinigung aus der transformierten Zelle oder dem Kulturüberstand der transformierten Zelle erhalten und das so erhaltene aufgereinigte Fas-Ligandenprotein wird als das Immunisierungsantigen verwendet.
Das Säugetier, das mit dem Immunisierungsantigen immunisiert wird, ist nicht auf irgend eine Art eingeschränkt und das Säugetier kann unter Berücksichtigung der Kompatibilität mit der in der Zellfusion verwendeten parentalen Zelle ausgewählt werden. Beispielhafte Tiere sind Maus, Ratte, Hamster und Kaninchen.
Die Immunisierung des Tieres mit dem Immunisierungsantigen kann durch jegliches bekanntes Verfahren durchgeführt werden. Nach der Immunisierung und Bestätigung der Erhöhung des Serumspiegels des gewünschten Antikörpers werden die Immunoozyten aus dem Tier isoliert und einer Zellfusion unterzogen. Die bevorzugten Immunozyten sind Milzzellen.
Die mit dem Immunozyten zu fusionierende parentale Zelle ist nicht auf irgend einen Typ eingeschränkt. Jedoch ist die Verwendung bekannter Säugetier-Myelomzellinien und insbesondere eine Maus-Myelomzellinie wie P3-X63-Ag8-U1 (P3-U1) bevorzugt. Die Zellfusion des oben beschriebenen Immunozyten und der Myelomzelle kann grundsätzlich gemäß einem bekannten Verfahren, wie dem Verfahren von Milstein et al. (Milstein et al., Methods Enzymol. 73: 3–46, 1981) durchgeführt werden.
Die Hybridomzelle wird dann auf eine hin untersucht, die den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zielantikörper herstellt und anschließend kloniert.
Der monoklonale Antikörper wird aus der so hergestellten Hybridomzelle erhalten, die den in der vorliegenden Erfindung verwendeten monoklonalen Antikörper herstellt, durch solche Verfahren, wie die Kultivierung der Hybridomzelle gemäß dem konventionellen Verfahren und der Gewinnung des monoklonalen Antikörpers aus dem Überstand; oder das Transplantieren der Hybridomzelle in ein Säugetier, das mit der Hybridomzelle kompatibel ist, zum Wachstum und der Gewinnung des monoklonalen Antikörpers aus der Flüssigkeit des Säugetiers. Das vorgenannte Verfahren wird zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers in hoher Reinheit angepasst und das letztere Verfahren wird zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers in einer großen Menge angepasst.
Der durch ein solches Verfahren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung hergestellte monoklonale Antikörper kann weiter durch ein bekanntes Aufreinigungsmittel, wie Salzfällung, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, aufgereinigt werden.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete monoklonale Antikörper ist nicht auf denjenigen eingeschränkt, der unter Verwendung einer Hybridomzelle hergestellt wird und kann derjenige sein, der durch eine Antikörper-produzierende Zelle hergestellt wird, die durch EBV immortalisiert ist, oder diejenige sein, die durch ein rekombinantes genetisches Verfahren hergestellt wird.
Zusätzlich ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete Anti-Fas-Ligandenantikörper oder der Anti-Fas-Antikörper vorzugsweise ein chimärer oder ein humanisierter Antikörper, welches ein Antikörper ist, der vorsätzlich für den Zweck der Verringerung der Heteroantigenizität gegenüber Menschen verändert ist.
Die Verwendung eines nicht menschlichen monoklonalen Antikörpers, wie eines Maus-Antikörpers, ist mit Fehlern assoziiert, wenn er wiederholt in der Behandlung eines Menschen verwendet wird. Der erste Fehler ist, dass der Maus-monoklonale Antikörper eine relativ kurze Zirkulationshalbwertzeit aufweist und wenn er für einen Menschen verwendet wird, wird der Maus-monoklonale Antikörper nicht andere wichtige funktionelle Eigenschaften des Immunglobulins entwickeln.
Der zweite Mangel ist, dass der nicht menschliche monoklonale Antikörper eine wesentliche Länge an Aminosäuren umfasst, die immunogen sind, wenn sie in einen menschlichen Patienten injiziert werden. Genauer gesagt, es wurde durch eine Reihe von Studien nachgewiesen, dass nach der Injektion eines fremden Antikörpers eine extrem starke Immunreaktion gegen den Antikörper in dem Patienten induziert werden kann, um im Wesentlichen die therapeutische Wirksamkeit des Antikörpers nach der ersten Behandlung auszulöschen. Des Weiteren, wenn verschiedene Maus-monoklonale Antikörper oder andere monoklonale Antikörper mit der Antigenizität gegen einen Menschen in der Zukunft entwickelt werden und einer oder mehrere solcher nicht menschlichen Antikörper einmal oder mehrfach verwendet werden, dann kann die anschließende Verabreichung eines solchen nicht menschlichen Antikörpers nach einer solchen ersten Verabreichung durch die Kreuzreaktivität ausgelöscht werden, sogar, wenn die anschließende Therapie keinerlei Bezug zur ursprünglichen Therapie hatte. In solch einem Fall kann der nach der ersten Verabreichung verabreichte nicht menschliche Antikörper sogar als gefährliche Substanz wirken.
Ein Beispiel eines solchen chimären Antikörpers ist ein chimärer Antikörper, der die variable Region des monoklonalen Antikörpers eines Säugetiers enthält, das nicht menschlich ist, wie eine Maus und die konstante Region des menschlichen Antikörpers. Solch ein chimärer Antikörper kann durch einen bekannten chimären Antikörper-Herstellungsprozess hergestellt werden und insbesondere durch ein genetisches rekombinantes Verfahren.
Mehr bevorzugt ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete Anti-Fas-Ligandenantikörper ein umgeformter menschlicher Antikörper, bei dem die Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) des menschlichen Antikörpers durch die Komplementaritäts-bestimmende Region ersetzt wird, die aus dem Antikörper eines Säugetiers abgelei tet wird, das nicht Mensch ist, wie einer Maus. Genauer gesagt, die konstante Region und die Gerüstregion sind vorzugsweise von menschlichem Ursprung und die Komplementaritäts-bestimmende Region ist vorzugsweise von nicht menschlichem Ursprung. Ein bevorzugtes Beispiel eines umgeformten menschlichen Antikörpers (humanisierten Antikörpers) ist ein humanisierter Antikörper mit der CDR, die aus dem Maus-F919-9-18-Antikörper abgeleitet ist, der in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 97/02290 (Anmeldenummer PCT/JP96/01820) offenbart wird. Beispiele der variablen Regionen werden in 3 (cDNA wird in SEQ. ID Nr. 3 beschrieben) und 4 (cDNA wird in SEQ. ID Nr. 4 beschrieben) gezeigt.
Es ist erwähnenswert, dass, falls notwendig, eine Aminosäure in der Gerüst(framework, FR)-Region in der variablen Region des Antikörpers durch eine andere Aminosäure derart substituiert werden kann, dass die Komplementaritäts-bestimmende Region des humanisierten Antikörpers eine geeignete Antigen-Bindungsstelle ausbilden würde.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete humanisierte Antikörper kann gemäß Leachman et al. (Nature 332: 323 (1988) und der europäischen Patentveröffentlichung Nr. EP-A-0239400); Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989), der internationalen Patentveröffentlichung mit den Veröffentlichungsnummern WO 90/07861 und WO 92/11018; Co et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869 (1991)); Co und Queen (Nature 351: 501 (1991)); Co et al. (J. Immunol. 148: 1149 (1992)) hergestellt werden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Fas-Derivat ist nicht auf einen jeweiligen Typ eingeschränkt, solange es in der Lage ist, mindestens den Fas-Liganden zu binden oder in der Lage ist, die Fas-Liganden-vermittelte Apoptose zu hemmen. Das Fas-Derivat kann auch ein solches sein, welches eine Aminosequenz eines bekannten Fas umfasst, das zufällig durch Substitution, Deletion, Addition und/oder Insertion mutiert wurde und welches die biologischen Wirkungen des Fas/Fas-Ligandensystems hemmt und insbesondere die Fas-vermittelte Apoptose, wobei die Bindungsaktivität an den Fas-Liganden beibehalten wird. Das Fas-Derivat kann auch eine Mutante des Fas, Fas in trunkierter Form, ein chimäres Protein, ein Fusionsprotein und chemisch modifiziertes Fas sein. Das Fas, von dem das Fas-Derivat abgeleitet ist, kann ein solches sein, das aus jeglicher Tierspezies abgeleitet ist, obwohl die Verwendung des Fas von menschlichem Ursprung bevorzugt ist in Bezug auf die Antigenizität.
Beispielhafte Fas-Derivate sind die extrazelluläre Domäne eines bekannten Fas; ein Fas-Antigen, aus dem eine Transmembrandomäne deletiert wurde; ein chimäres Protein der extrazellulären Domäne eines Fas und ein anderes Protein, wie hFas-Fc, welches ein chimäres Protein der extrazellulären Domäne des menschlichen Fas und des Fc-Fragments von menschlichem Immunglobulin ist. Das Fas-Derivat kann ein solches sein, das durch jegliches Herstellungsverfahren durch Verwendung bekannter Fas-Sequenzen und bekannter gentechnischer Techniken hergestellt wird. Zum Beispiel wird das Verfahren zur Herstellung des menschlichen Fas-Fc in den Beispielen der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 beschrieben. Ein anderes bevorzugtes Fas-Derivat ist das Fas mit einer Deletion in seinem N-terminalen Bereich. Ein Fas-Derivat, das in Plasmiden (pM1304 und pM1317) kodiert wird, die in den E. coli eingeschlossen sind, die ursprünglich am 14. März 1996 in dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi I-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) (Zugangs-Nr. P-15514 und P-15515) hinterlegt wurden und die von der ursprünglichen Hinterlegung zur internationalen Hinterlegung am 6. März 1997 transferiert wurden (Zugangs-Nr. FERM BP-5854 und Zugangs-Nr. FERM BP-5855) (die Zugangsnummern in Taiwan waren jeweils CCRC 940171 und CCRC 940170) ist ein Derivat, das die extrazelluläre Domäne des bekannten menschlichen Fas umfasst, von dem die N-terminale Sequenz von mindestens der 1. bis zur 29. Aminosäure deletiert wurden, und dieses hochaktive Derivat ist ein bevorzugtes Beispiel der wirksamen Komponente für das prophylaktische/therapeutische Mittel der vorliegenden Erfindung (Teilnukleotidsequenzen in dem Vektor (pM1304) einschließlich der Nukleotidsequenz der cDNA, die für shFas(nd29) kodiert, werden in den 5 bis 9 und SEQ. ID Nr. 5 beschrieben; und teilweise Nukleotidsequenzen in dem Vektor (pM1317), einschließlich der Nukleotidsequenz der cDNA, die für die shFas(nd29)-Brücke kodiert, werden in den 10 bis 12 und SEQ. Nr. 6 beschrieben). Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Fas-Derivate, wie sie oben beschrieben werden, können auf ihre Bindungsaktivität mit dem Fas-Liganden oder ihre hemmende Aktivität für die Fas-vermittelte Apoptose durch ein geeignetes Assay-Verfahren bestätigt werden.
Das Antisens-Oligonukleotid für das Gen oder die mRNA des Fas oder des Fas-Liganden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist nicht auf eine jeweilige Sequenz eingeschränkt, solange es die Expression des Fas oder des Fas-Liganden hemmt und kann z. B. das Antisens-Oligonukleotid des Fas-Liganden sein, der in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 offenbart wird.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete prophylaktische/therapeutische Mittel kann in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Kits in der Form einer Injektion oder eines oralen Medikaments vorliegen, wobei der Fas-Antagonist mit mindestens einem pharmazeutischen Träger oder Medium kombiniert wird, wie sterilisiertem Wasser, physiologischer Salzlösung, einem Pflanzenöl, einem Mineralöl, einem höheren Alkohol, einer höheren Fettsäure oder einem nichttoxischen organischen Lösungsmittel; und optional Additiven wie einem Trägermittel, einem Farbmittel, einem Emulgator, einem Suspensionsmittel, einem Tensid, einem solubilisierendem Mittel, einem adsorptionshemmenden Mittel, einem Stabilisator, einem Konservierungsmittel, einem Befeuchter, einem Antioxidans, einem Puffer, einem isotonen Mittel oder einem schmerzstillenden Mittel. Vorzugsweise wird das in der vorliegenden Erfindung verwendete Medikament parenteral entweder systemisch oder lokal verabreicht und schnell oder langsam, z. B. durch intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale oder subkutane Injektion. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete prophylaktische/therapeutische Mittel sollte in einer adäquaten Dosierung verabreicht werden, die durch die Berücksichtigung des Zustandes und des Alters des Patienten sowie des Verabreichungsweges bestimmt wird. Zum Beispiel kann eine geeignete getrennte Dosis im Bereich von ungefähr 0,1 bis 100 mg/kg im Falle einer systemischen Verabreichung ausgewählt werden. Das prophylaktische/therapeutische in der vorliegenden Erfindung verwendete Mittel ist jedoch nicht auf den Verabreichungsweg und die wie oben beschriebene Dosierung eingeschränkt. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete prophylaktische/therapeutische Mittel kann auch eine Kombination von zwei oder mehr Fas-Antagonisten enthalten und kann in Kombination mit einem anderen Medikament verwendet werden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete prophylaktische/therapeutische Mittel kann zu einer pharmazeutischen Zubereitung in einem normalen Verfahren formuliert werden. Zum Beispiel kann eine Injektion durch Auflösen des aufgereinigten Fas-Antagonisten in einem Medium wie physiologischer Salzlösung oder einem Puffer hergestellt werden und optional das Supplementieren der Lösung mit einem Additiv wie einem Antiadsorptionsmittel. Die Zubereitung kann auch in der Form eines Lyophilisats vorliegen, die vor der Verwendung rekonstituiert wird, und kann jegliche Hilfsstoffe enthalten, die im Allgemeinen verwendet werden, um die Lyophilisierung zu erleichtern.
Der in dem prophylaktischen/therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung verwendete Fas-Antagonist unterdrückt die Verletzung des Organs oder Gewebes des Wirts und zeigt die Wirkung der Erhöhung der Überlebenszeit und Überlebensrate in dem ischämischen Herzreperfusionsmodell wie es in den Beispielen beschrieben wird oder in dem GVHD-Modell und insbesondere in dem GVHD-Modell, wie es in den Beispielen beschrieben wird. Der Fas-Antagonist zeigt auch die unterdrückende Wirkung für die Erhöhung von Serumcreatinin in dem Nierenkrankheitsmodell und die unterdrückende Wirkung für die Erhöhung der GOT, GPT und Ähnlichem, die Indizes von Leberschaden sind sowie die Wirkung der Erhöhung der Überlebensrate in dem Endotoxin-induzierten Leberschadenmodell. Entsprechend wird das in der vorliegenden Erfindung verwendete prophylaktische/therapeutische Mittel, das einem Patienten verabreicht wird, der an solchen Erkrankungen leidet, die Wirkung der Unterdrückung der Verletzung und des Zelltodes aufzeigen und insbesondere der Apoptose der Zellen des jeweiligen Organs oder des Gewebes und somit die Wirkung der Verhinderung oder Behandlung der Erkrankung, die Wirkung der Verbesserung des Zustandes und der Pathologie, die mit der Krankheit assoziiert sind, und die Wirkung der Unterdrückung des weiteren Verlaufs oder der Verschlechterung der Zustände.
Zusätzlich hat das Mittel der vorliegenden Erfindung die Wirkung der Erleichterung der Konservierung verschiedener Organe wie in der in vitro-cytotoxizitätshemmenden Wirkung gezeigt wird sowie der Unterdrückung des Gewebeschadens in ischämischen Herz- und Nieren-Reperfusionsmodellen.
Es ist erwähnenswert, dass die in den Beispielen unter Verwendung des Anti-Fas-Ligandenantikörpers verwendeten Tiere Nagetiere (Maus und Ratte) sind und daher die prophylaktischen und therapeutischen Wirkungen hauptsächlich durch die Verwendung des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers gezeigt werden. Ähnliche Wirkungen zu denen in den Beispielen sind für den Anti-menschlichen-Fas-Ligandenantikörper und den humanisierten Anti-Mensch-Fas-Ligandenantikörper zu erwarten, wenn diese einem Menschen verabreicht werden.
Der Fas-Antagonist hat prophylaktische und therapeutische Wirkungen auf GVHD. Daher sind der Fas-Antagonist, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und das Medikament, das einen solchen Fas-Antagonisten enthält, sehr nützlich als prophylaktische und therapeutische Mittel für GVHD, bei der die Fas-vermittelte Apoptose involviert ist.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Mittel ist in der Lage, GVHD zu verhindern und zu behandeln und die mit der GVHD assoziierten Zustände und Pathologie. Die GVHDs umfassen GVHD nach Knochenmarkstransplantation wie die inkompatible Knochenmarkstransplantation und die Knochenmarkstransplantation in kongenitaler Immunschwäche; GVHD nach Organtransplantation; posttransfusionale GVHD wie die GVHD nach der Bluttransfusion einer großen Menge an einen Patienten mit Hypoimmunität; und Ähnliche. Die GVHD ist mit einem Organ- oder Gewebeversagen basierend auf der GVH-Reaktion assoziiert und es werden Diarrhö, Erschöpfung wie Gewichtsverlust und Dünnerwerden, Exanthem und Leberdysfunktion beobachtet. Die GVHD ist histologisch durch solche Symptome wie Disorganisation des Knochenmarks und des Lymphgewebes und Atrophie der intestinalen Villi charakterisiert. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Mittel kann auch zur Verhinderung und Behandlung solcher Zustände und der Pathologie verwendet werden, die mit der GVHD assoziiert sind.
BEISPIELE
Als nächstes wird die vorliegende Erfindung in weiterem Detail durch Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben, die keineswegs den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
Beispiel 1. Herstellung des shFas(nd29)-Fc und shFas(nd29)-Brücke
(1) Herstellung und Kultivierung von Transformanten
Die Transformanten COS-1/pM1304, COS-1/pM1317 und COS-1/pBF-Fcl wurden durch das unten beschriebene Verfahren durch Verwendung von pM1304, pM1317 und pBF-Fcl (das Expressionsplasmid für das chimäre Protein (oft als hFas-Fc bezeichnet) der extrazellulären Domäne des menschlichen Fas-Antigens und der Fc-Region des menschlichen IgG1) hergestellt, die in Beispiel 1 der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 beschrieben werden. 100 μg der Plasmid-DNA wurde jeweils in 500 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4/1 mM Ethylendiamintetraessigsäurelösung (hiernach als TE-Puffer abgekürzt) aufgelöst. Die Lösungen wurden jeweils mit 0,2 mg/ml DEAE-Dextran und 125 ml D-MEM (Nissui Seiyaku), supplementiert mit 50 mM Tris HCl (pH 7,4), supplementiert, um eine DNA-DEAE-Dextran gemischte Lösung herzustellen. Die gemischten DNA-DEAE-Dextranlösungen wurden jeweils zu Monoschichtkulturen von COS-1-Zellen hinzugefügt, die zur Semikonfluenz in 1700 cm² Rollflaschen inkubiert worden waren (hergestellt durch Corning Inc.) und weiter bei 37°C inkubiert, um die Transformanten COS-1/pM1304, COS-1/pM1317 und COS-1/pBF-Fcl zu erhalten. Nach 4 Stunden wurde die gemischte DNA-DEAE-Dextranlösung gegen D-MEM-Kulturmedium ausgetauscht, das mit 10% fötalem Rinderserum supplementiert war (hergestellt durch Lifetech Oriental K. K.) und die Inkubation wurde für 24 Stunden weitergeführt. Das Medium wurde weiterhin gegen Phenolrot-freies D-Mem (FBS, BSA-frei) ausgetauscht und in Inkubation wurde für weitere 72 Stunden durchgeführt. Der Kulturüberstand wurde dann geerntet.
(2) Aufreinigung des shFas(nd29)-Fc
(i) Affinitätschromatographie
Nach der Fällung von 1 Liter des Kulturüberstandes von COS-1/pM1304 mit Ammoniumsulfat (70% Sättigung) wurde das Präzipitat in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) suspendiert und gegen PBS dialysiert. Auf eine Affi Prep Protein A präparative Säulenhülse (hergestellt durch Biorad Inc., 7,3 ml) wurden 57 ml der resultierenden Suspension aufgetragen und das eluierte shFas(nd29)-Fc wurde gesammelt und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Filtron Omega-Zelle (hergestellt durch Fuji-Filter K. K., fraktioniertes Molekulargewicht: 30 kD) aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde gegen 0,9% NaCl dialysiert, um aufgereinigtes shFas(nd29)-Fc zu erhalten. hFas-Fc wurde in ähnli cher Weise aufgereinigt. Die Menge des Proteins in jeder Spezies wurde durch Lowry's-Verfahren unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard gemessen.
Das resultierende aufgereinigte shFas(nd29)-Fc wurde auf einem 5 bis 20%-Gradienten Polyacrylamidgeld elektrophoretisch behandelt, das 0,1% SDS enthält und mit 2D-Silver Stain-II "Daiichi"^® (hergestellt durch Daiichi Kagakuyakuhin K. K.) gefärbt, um die Banden nachzuweisen. Das aufgereinigte shFas(nd29)-Fc wurde unter nicht reduzierenden Bedingungen als im Wesentlichen einzelne Bande von ungefähr 85 kD nachgewiesen, die mit dem Dimer korrespondiert und unter reduzierenden Bedingungen als eine im Wesentlichen einzelne Bande von ungefähr 43 kD, die mit dem Monomer korrespondiert.
Das resultierende shFas(nd29)-Fc wurde auf eine VYDAC C4-Säule (4,6 mm Durchm. × 25 cm, hergestellt durch Cypress Inc.) aufgetragen, die zuvor mit 0,05% Trifluoressigsäure equilibriert worden war und die Säule wurde mit 0,05% Trifluoressigsäure gewaschen. Nach dem Waschen wurde die Säule bei einem linearen Konzentrationsgradientenverfahren bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute unter Verwendung von 0,05% Trifluoressigsäure/0 bis 100% Acetonitril eluiert.
Die Elutionsfraktion der Hauptspitze wurde lyophilisiert und in 70% Ameisensäure zur Verwendung als Probe aufgelöst und die Probe wurde auf ihre N-terminale Aminosäuresequenz hin durch das Modell 477A Protein Sequenziersystem-120A PTH Analyzer (hergestellt durch Perkin Elmer Inc.) analysiert. In der Analyse wurde die PTH-Aminosäure durch Messung der Absorption bei 270 nm in der ultravioletten Region nachgewiesen und durch den Vergleich der Daten durch Verwendung der Retentionszeit der Standard PTH-Aminosäure (hergestellt durch Perkin Elmer Inc.), die zuvor durch das gleiche Verfahren abgetrennt worden war. Es wurde dann herausgefunden, dass die Probe die N-terminale Sequenz des menschlichen Fas-Antigens aufweist, von der 29 N-terminale Aminosäurereste deletiert worden waren (Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp).
(3) Aufreinigung der shFas(nd29)-Brücke
Der Anti-Fas monoklonale Antikörper (4B4-B3), der durch ein bekanntes Verfahren (Kohler und Milstein, Nature, Band 256, Seite 495, 1975) unter Verwendung der Milzzellen der Maus, die mit dem menschlichen Fas-Antigen immunisiert worden war und der Maus-Myelomazelle hergestellt wurde, wurde mit Formylcellulofin (hergestellt durch Seikagaku Kogyo K. K.) vermischt, um eine Antikörperaffinitätssäule durch das Standardverfahren herzustellen.
10 Liter der Kulturüberstände von COS-1/pM1317 wurden auf 1,5 Liter durch Ultrafiltration unter Verwendung des Filtron Mini Kits (fraktioniertes Molekulargewicht: 10 kD; hergestellt durch Fuji-Filter K. K.) aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde mit 1 M Tris-HCl (pH 9,0) supplementiert, um den pH auf 8,0 anzupassen und die Lösung wurde auf eine Affinitätssäule mit dem Anti-Fas-Antigen-monoklonalen Antikörper aufgetragen, der darauf immobilisiert worden war, die mit 50 m Tris-HCl (pH 8,0), das 1 M NaCl enthält, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 320 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), das 1 M NaCl enthält, gewaschen und die shFas(nd29)-Brücke wurde mit 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5) eluiert. Die Fraktionen, die die shFas(nd29)-Brücke enthalten, wurden zusammengeführt und aufkonzentriert durch Verwendung der Filtron Omega-Zelle (fraktioniertes Molekulargewicht: 10 kD; hergestellt durch Fuji Filter K. K.). Das Konzentrat wurde gegen 0,9% NaC dialysiert, um die aufgereinigte shFas(nd29)-Brücke zu erhalten.
Die resultierende aufgereinigte shFas(nd29)-Brücke wurde auf einem 5 bis 20%-Gradienten Polyacrylamidgel elektrophoretisch behandelt, das 0,1% SDS enthält, und mit 2D-Silver Stain-II "Daiichi"^® (hergestellt durch Daiichi Kagakuyakuhin K. K.) gefärbt, um die Banden nachzuweisen. Das aufgereinigte shFas(nd29)-Fc wurde unter nicht reduzierenden Bedingungen als zwei Banden nachgewiesen bei einem Molekulargewicht von ungefähr 43 kD und ungefähr 27 kD und unter reduzierenden Bedingungen als zwei Banden von ungefähr 23 kD und 27 kD.
Die resultierende shFas(nd29)-Brücke wurde auf ihre N-terminale Aminosäuresequenz durch das Wiederholen der oben beschriebenen Prozedur analysiert. Es wurde dann herausgefunden, dass die shFas(nd29)-Brücke die N-terminale Sequenz des menschlichen Fas-Antigens aufweist, von der 29 N-terminale Aminosäurereste deletiert worden waren.
(4) Vergleich der Apoptose-hemmenden Aktivität zwischen shFas(nd29)-Fc und der shFas(nd29)-Brücke
Das shFas(nd29)-Fc und das hFas-Fc wurden jeweils auf ihre Aktivität gemessen, die cytotoxische Aktivität der 1A12-Zelle und FLm14-Zelle gegen die WC8-Zelle und W4-Zelle zur Verwendung als Index zu hemmen. Die 1A12-Zelle ist eine Transformante der Maus WR19L-Zelle, die zur Expression des menschlichen Fas-Liganden transformiert wurde und die FLm14-Zelle ist eine Transformante der Maus FDC-P1-Zelle, die zur Expression des Maus-Fas-Liganden transformiert worden war. Die WC8-Zelle und die W4-Zelle sind Transformanten der Maus-WR19L, die jeweils zur Expression des menschlichen Fas-Antigens und des Maus-Fas-Antigens transformiert worden waren. Die WR19L-Zelle ist eine Zelle, die kaum das Maus-Fas-Antigen exprimiert und die empfindlich gegenüber der cytotoxischen Wirkung von TNF ist. Die Messung der cytotoxischen Aktivität wurde gemäß dem Verfahren von Rouvier, E. et al. (Journal of Exp. Med., Band 177, Seiten 195–200, 1993) durchgeführt. Zuerst wurden jeweils die 1A12-Zelle und die FLm14-Zelle mit RPMI 1640 gewaschen, das mit 10% inaktiviertem FBS zur Verwendung als Effektorzellen supplementiert worden war. In der Zwischenzeit wurden jeweils 1 × 10⁶ WC8-Zellen und W4-Zellen bei 37°C für 2 Stunden in 100 μl RPMI 1640 inkubiert, das mit 10% inaktiviertem FBS zusammen mit 20 μCi [⁵¹Cr] Natriumchromat (hergestellt durch NEN Inc.) supplementiert worden war. Nach dem Waschen der Zellen mit dem RP 1640, das mit 10% inaktiviertem FBS supplementiert worden war, wurden die Zellen als Zielzellen verwendet. 1 × 10⁴ 1A12-Zellen oder 1 × 10⁵ FLm14-Zellen und 1 × 10⁴ Zielzellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen des shFas(nd29)-Fc und des hFas-Fc in den Vertiefungen einer Rundbodenmikrotiterplatte vermischt, so dass die Gesamtmenge der Flüssigkeit 100 μl betrug. Die Platte wurde bei 800 Upm für 2 Minuten zentrifugiert, bei 37°C für 4 Stunden inkubiert und weiter bei 1200 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. Eine Probe von 50 μl, die aus jeder Vertiefung gesammelt wurde, wurde auf ihre Radioaktivität hin mit einem γ-Zähler gemessen, um den Prozentanteil der spezifischen Zelllyse zu bestimmen. Die spontane Freisetzung von ⁵¹Cr wurde durch die Inkubation nur der Zielzellen in dem Kulturmedium bestimmt. Die maximale Freisetzung wurde durch die Zugabe von Triton X-100 zu den Zielzellen zu 0,1% bestimmt.
Das shFas(nd29)-Fc und das hFas-Fc wurden auf ihre Aktivität hin verglichen, die Cytotoxizität zu hemmen durch das Vergleichen der Unterdrückung, wenn die 1A12-Zellen als Effektorzellen verwendet wurden und die WC8-Zellen als Zielzellen verwendet wurden und wenn die FLm14-Zellen als Effektorzellen verwendet wurden und die W4-Zellen als Zielzellen verwendet wurden, und es wurde herausgefunden, dass shFas(nd29)-Fc eine Cytotoxizitäts-hemmende Aktivität gegenüber dem hFas-Fc aufweist, die 3 bis 10 mal höher ist.
Wenn in einem ähnlichen Verfahren beurteilt, hatte die shFas(nd29)-Brücke eine Cytotoxizitäts-hemmende Aktivität gegenüber der von hFas-Fc, die 3 bis 10 mal höher lag.
Vergleichendes Beispiel 2. Wirkungen des Fas-Antagonisten in dem Herzerkrankungsmodell
(1) Herstellung des ischämischen Herzreperfusionsmodells
Männliche Wistar-Ratten von 320 bis 450 g (Charles River, Japan K. K.) wurden durch intraperitoneale Verabreichung von 60 mg/kg Nembutal (hergestellt durch Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) betäubt. Nach dem Fixieren der Ratte, die bei 35°C in auf dem Rücken liegender Position gehalten wurde, auf einer Temperatur-haltenden Platte (IKEDA SCIENTIFIC CO. LTD.) wurde die Trachea eingeschnitten, um einen Respirator zu verbinden (hergestellt durch Shinano Seisakusho, SN-480-7) und die Brust wurde dann auf der linken Seite geöffnet, vierter intercostaler Zwischenraum, um das Herz zu exponieren und 2 bis 3 mm oberhalb dem Ursprung der linken Koronaarterie wurde durch einen einzelnen Knoten mit einer eingefädelten Nahtnadel abgebunden (leicht gebogene Augennadel, hergestellt durch Natsume Seisakusho, K. K.). Das Abbinden wurde nach 20 Minuten durch das Aufbinden des einzelnen Knotens unterbrochen und die Arterie wurde für 3 Stunden reperfundiert. Die Arterie wurde wiederum abgebunden, um die Region der Ischämie zu bestimmen und physiologische Salzlösung, die 1% Evans Blau enthält, wurde von der linken femoralen Vene injiziert. Das Herz wurde dann herausgenommen, in flüssigem Stickstoff eingefroren, in fünf Stücke mit einem Rasiermesser geschnitten (hergestellt durch Feather Safety Razor K. K.) und in physiologischer Salzlösung bei 37°C für 20 Minuten gefärbt, die 1% TTC (2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) enthält. Die Schnitte wurden in 10% neutral gepuffertem Formaldehyd zur anschließenden Analyse aufbewahrt. Blut wurde aus der zervikalen Vene bei 1 Stunde und 3 Stunden nach der Reperfundierung zur Messung der Creatinkinase (CPK) in Plasma gesammelt.
(2) Verabreichung von menschlichem Fas-Fc
Das verwendete menschliche Fas-Fc (hFas-Fc) war dasjenige, das gemäß dem Verfahren in Beispiel 1 der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Das hFas-Fc wurde mit physiologischer Salzlösung verdünnt, die mit 0,1% menschlichem Serumalbumin (hergestellt durch Research Institute of Chemotherapy and Serotherapy (Foundation)) supplementiert worden war, und bei einer Dosis von 1 mg/10 ml/kg von der rechten femoralen Vene direkt nach dem Start der Reperfundierung verabreicht. Die Gruppe von fünf Ratten, denen 1 mg/kg hFas-Fc und die Kontrollgruppe von acht Ratten wurden verwendet.
(3) Messung der nicht-ischämischen, ischämischen und nekrotischen Regionen
Der Anteil der nicht-ischämischen Region (die Region, die positiv für Evans Blau und positiv für TTC ist), der ischämischen Region (die Region, die negativ für Evans Blau und positiv für TTC ist) und die nekrotische Region (die Region, die negativ für Evans Blau und negativ für TTC ist) in den Schnitten wurden wie unten beschrieben berechnet. Die durch ein stereoskopisches Mikroskop erhaltenen Bilder (SHZ10, hergestellt durch Olympus Optical Co., Ltd.) von beiden Seiten (obere Seite, untere Seite) der Herzschnitte wurden in eine Bildanalysiersoftware (Image Command 5098, Produkt der Olympus Optical Co., Ltd.) eingegeben, die nicht-ischämischen, ischämischen und nekrotischen Regionen wurden auf dem Monitor definiert und jede der derart definierten nicht-ischämischen, ischämischen und nekrotischen Regionen wurde ausgedruckt. Die Fläche jeder Region wurde durch ein digitales Planimeter (hergestellt durch Uchida Yoko Co., Ltd.) gemessen. Danach wurde das Nassgewicht jeder Region durch die folgende Formel berechnet. Das Nassgewicht jeder Region = 0,5 × (A + B) × Nassgewicht des Schnittes, wobei A und B jeweils der Flächenanteil der Regionen der oberen und unteren Seite des Schnitte sind.
(4) Berechnung des Anteils (%) der nicht-ischämischen, ischämischen und nekrotischen Region in der Herzprobe
Die Summe der Nassgewichte der nicht-ischämischen Region jedes Schnittes wurde als das Gesamtgewicht der nicht-ischämischen Regionen bezeichnet. Der Anteil (%) des gesamten Nassgewichts der nicht-ischämischen Regionen in der Summe des Nassgewichts von jedem Schnitt (Gesamtnassgewicht der Herzprobe) wurde als der Anteil (%) der nicht-ischämischen Region in der Herzprobe bezeichnet. Das gesamte Nassgewicht und der Anteil (%) in der Herzprobe wurden in einer ähnlichen Weise für die ischämische und die nekrotische Region berechnet.
(5) Messung der Creatinkinase (CPK) in Plasma
Der Wert der Creatinkinase (CPK) in Plasma wurde unter Verwendung von CPK-TestWako und Autoanalyzer (COBAS FARA, hergestellt durch Roche) gemessen.
(6) Ergebnisse
Der Anteil (%) der nekrotischen Region zur ischämischen Region in der hFas-Fc-behandelten Gruppe war geringer als der der Kontrollgruppe (13). Die Creatinkinase (CPK) Aktivität der hFas-Fc-behandelten Gruppe war geringer als die der Kontrollgruppe (14).
Beispiel 3. Toxizitätstest von hFas-Fc
(1) Verfahren
Männliche ICR-Mäuse im Alter von 7 Wochen (Nihon SLC K. K.) wurden intraperitoneal 2,5 mg/kg hFas-Fc für 3 Tage jeden Tag verabreicht. Die Mäuse wurden jeden Tag auf Körpergewicht von einem Tag vor dem Start der Verabreichung bis einem Tag nach Beendigung der Verabreichung gemessen, um die Wirkungen der hFas-Fc-Verabreichund auf das Körpergewicht zu untersuchen. Die Mäuse wurden einer Autopsie einen Tag nach Beendigung der Verabreichung unterzogen und die Hauptorgane wurden mit dem bloßen Auge inspiziert und Splenozyten wurden gezählt, um die Wirkungen der hFas-Fc-Verabreichung zu untersuchen.
(2) Ergebnisse
Die intraperitoneale tägliche Verabreichung des hFas-Fc bei einer Dosierung von 2,5 mg/kg für 3 Tage ergab keinerlei Auswirkungen auf das Körpergewicht und die Splenozytenzahl. Es wurden keinerlei Wirkungen der Verabreichung des hFas-Fc in der Autopsie beobachtet.
Beispiel 4. Wirkungen des Fas-Antagonisten im Maus GVHD-Modell
(1) Myelounterdrückung in der Wirtsmaus
Männliche BDF1-Mäuse im Alter von 6 Wochen (Charles River, Japan K. K.) wurden als Wirtsmäuse verwendet. Den Wirtsmäuse wurde intraperitoneal 450 mg/kg Cyclophosphamid verabreicht (Shionogi & Co., Ltd., Endoxan), um eine Myelounterdrückung zu induzieren.
(2) Herstellung der Milzlymphozyten aus der Donormaus und Transplantation der Milzlymphozyten in die Wirtsmaus
Eine 7 Wochen alte männliche C57BL/6-Maus (Charles River, Japan K. K.) wurde als Spendermaus verwendet. Die Milz aus der Spendermaus wurde in Hank's-Lösung (hergestellt durch Nissui Seiyaku K. K.) mit Zangen zerlegt, zentrifugiert und in 0,017 M Tris-0,747% Ammoniumchloridlösung zur selektiven Hämolyse der Erythrozyten suspendiert. Die verbleibenden Zellen, die mit Hank's-Lösung gewaschen worden waren, wurden als Milzlymphozyten der Spendermaus verwendet und 3 × 10⁷-Zellen/Maus wurden den Wirtsmäusen in die Schwanzvene am nächsten Tag der Cyclophosphamidbehandlung wie oben beschrieben transplantiert.
(3) Beurteilung der Wirkungen von hFas-Fc
Es wurden die Wirkungen der hFas-Fc-Verabreichung auf die Überlebenszeit durch Verabreichung von 1, 3 oder 10 mg/kg hFas-Fc aus der Schwanzvene am nächsten Tag der Transplantation der Milzlymphozyten aus der Spendermaus beurteilt. Es ist erwähnenswert, dass der Kontrollgruppe die physiologische Salzlösung verabreicht wurde, die mit 0,1% menschlichem Serumalbumin supplementiert worden war (hergestellt durch Research Institute of Chemotherapy and Serotherapy (Foundation)), welches das Verdünnungsmittel war, das für hFas-Fc verwendet wurde. n war für jede Gruppe 5. Die verlängernde Wirkung auf die Überlebenszeit wurde für die Gruppe beobachtet, die mit 10 mg/kg hFas-Fc im Vergleich zu der Kontrollgruppe (15) behandelt wurde. Diese Gruppe zeigte auch weniger Gewichtsverlust.
Beispiel 5. Herstellung der shFas(nd29)-Fc-herstellenden CHO-Zelle (CHO(pM1304)72-105-55)
(1) Herstellung der shFas(nd29)-Fc-Transformante
16 μg des Plasmids pM1304 wurden in 5,5 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Ethylendiamintetraessigsäurelösung aufgelöst. F-12 Nährstoffmischung (Ham) Medium wurde zu dieser Lösung (hergestellt durch GIBCO BRL Inc., hiernach als HamF12-Medium abgekürzt) bis auf ein Gesamtvolumen von 800 μl hinzugegeben, um Lösung A herzustellen. Ham F12-Medium wurde zu 96 μl Lipofect AMINE-Reagenz (hergestellt durch GIBCO BRL Inc.) auf ein Gesamtvolumen von 800 μl hinzugefügt, um Lösung B herzustellen. Die Lösung A und die Lösung B wurden vermischt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und mit 6,4 ml HamF12-Medium supplementiert, um eine DNA-Lipofect AMINE gemischte Lösung zu ergeben. 1,2 × 10⁶ CHO DXB11-Zellen, die in Petrischalen von 10 cm Durchmesser (hergestellt durch Corning) am vorangegangenen Tag inokuliert worden waren, wurden mit HamF12-Medium gewaschen und mit 8 ml DNA-Lipofect AMINE gemischter Lösung supplementiert. Die Zellen wurden in der Gegenwart von 5% Co₂/95% Luft bei 37°C für 7,5 Stunden inkubiert, die DNA-Lipofect AMINE gemischte Lösung wurde entfernt und mit HamF12-Medium substituiert, das mit 10% inaktiviertem fötalen Rinderserum (hergestellt durch JRH BIOSCIENCES Inc.) supplementiert worden war, und die Kultur wurde für weitere 24 Stunden fortgeführt. Das Medium wurde wiederum gegen HamF12-Medium substituiert, das mit 10% inaktiviertem fötalen Rinderserum supplementiert worden war und die Kultivierung wurde für weitere 24 Stunden fortgeführt. Die Zellen wurden bei 10³, 10⁴ und 10⁵ Zellen/10 ml HamF12-Medium reinokuliert, das mit 10% inaktiviertem fötalen Rinderserum supplementiert worden war, pro Petrischale von 10 cm Durchmesser. 2 Tage nach der Reinokulierung wurde das Medium gegen minimales essentielles α-Medium ohne Ribo nukleotide und Deoxyribonukleotide ausgetauscht (hergestellt durch GIBO BRL, hiernach als MEMα(-), supplementiert mit 10% inaktiviertem und dialysiertem fötalem Rinderserum, um die Auswahl der Zellen mit einem darin eingebrachten DHFR-Gen auszulösen. Das Medium wurde alle 3 oder 4 Tage mit neuem MEMα(-), supplementiert mit 10% inaktiviertem und dialysiertem fötalem Rinderserum, ersetzt und Kolonien der DHFR(Dihydrofolatreduktase)-positiven Zellen bildeten sich in ungefähr 2 Wochen. Die DHFR-positiven Zellen, die shFas(nd29)-Fc exprimieren, wurden dann gemäß dem Verfahren von Nobuhara et al. (Jikken Igaku (Experimental Medicine), Band 5, Nr. 11, 1987, Seiten 1108–1112) kloniert. Genauer gesagt, ungefähr 100 einzelne Kolonien wurden unter Verwendung eines Penicillinbechers kloniert und auf Platten mit 48 Vertiefungen unterkloniert (hergestellt durch NUNC). Die Zellen wurden durch Ersetzen des Mediums alle 3 oder 4 Tage mit neuem MEMα(-) inkubiert, das mit 10% inaktiviertem und dialysiertem fötalem Rinderserum supplementiert worden war, und die Kultivierung wurde in einem größeren Maßstab weitergeführt, wenn die Vertiefung konfluent wurde. Wenn die Zellen in einem Ausmaße proliferierten, dass die Vertiefungen von Platten mit 6 Vertiefungen (hergestellt durch NUNC) konfluent wurden, wurde die Zellzahl angepasst durch das Inokulieren bei 2,5 × 10⁵ Zellen/500 μl MEMα(-), das mit 10% inaktiviertem und dialysiertem fötalem Rinderserum supplementiert worden war, pro 24 er Platten (hergestellt durch NUNC) und der Kulturüberstand wurde nach 2 bis 3 Tagen geerntet. Der Anteil an shFas(nd29)-Fc in dem Überstand wurde durch EIA gemessen, um die Zelllinie hoher Expression auszuwählen (CHO(pM1304)72).
(2) Herstellung der Zelllinie, die shFas(nd29)-Fc in einer großen Menge exprimiert (CHO(pM1304)72-105-55), durch Genamplifikation
Eine Genamplifikation mit Methotrexat (MTX) wurde gemäß dem Verfahren von Nobuhara et al. (Jikken Igaku (Experimental Medicine), Band 6, Nr. 11, 1987, Seiten 1108–1112) durchgeführt, um die Zelllinie der höchsten shFas(nd29)-Fc-Expression herzustellen. Genauer gesagt, die CHO(pM1304)72 Zellen wurden bei 10³, 10⁴ und 10⁵ Zellen/10 ml MEMα(-)-Medium, das mit 10% inaktiviertem fötalem Rinderserum supplementiert worden war/pro Petrischale von 10 cm Durchm. inokuliert und das Medium wurde mit MEMα(-) ersetzt, das mit 10% inaktiviertem und dialysiertem fötalen Rinderserum supplementiert worden war, das 5 nM MTX (hergestellt durch Lederle) enthält, um die Genamplifikation auszulösen. Das Medium wurde alle 3 bis 4 Tage mit neuem MEMα(-) substituiert, das mit 10% inaktiviertem und dialysiertem fötalen Rinderserum supplementiert worden war, das 5 nM MTX enthält, und die Kolonien von MTX-resistenten Zellen begannen sich in ungefähr 2 Wochen auszubilden. Das zur Herstellung der CHO(pM1304)72 Zellen angepasste Verfahren wurde wiederholt, um eine Zelllinie von hoher shFas(nd29)-Fc-Expression herzustellen, die resistent gegen 5 nM MTX ist (CHO(pM1304)72-105). Eine ähnliche Prozedur wurde auch wiederholt, um eine Zelllinie von hoher shFas(nd29)-Fc-Expression herzustellen, die resistent gegen 50 nM MTX ist (CHO(pM1304)72-105-55).
Beispiel 6. Herstellung von shFas(nd29)-Fc durch Verwendung der CHO-Zelle und seine Aufreinigung
(1) Kultur der shFas(nd29)-Fe-produzierenden CHO-Zelle
2,3 × 10⁴ Zellen/cm² CHO(pM1304)72-105-55, die in Beispiel 5 hergestellt wurden, wurden in der Cell Factory (hergestellt durch Nunc) mit einer Kulturfläche von 6000 cm² durch Verwendung von IBL Media I inokuliert (hergestellt durch Meneki Seibutsu Kenkyujo K. K.), das 50 mM MTX enthält, für das Wachstumsmedium in der Gegenwart von 5% CO₂/95% Luft bei 37°C für 6 Tage inokuliert. Nach der Bestätigung der Konfluenz wurde das Medium gegen IBL-Media I ausgetauscht, aus dem Insulin und Transferin (produktives Medium) entfernt worden waren. Die Zellen wurden in der Gegenwart von 5% CO₂/95% Luft bei 37°C für weitere 4 Tage kultiviert und die Überstände wurden geerntet. Die Zellen wurden nach dem Sammeln des Überstandes mit dem produktiven Medium supplementiert und die Zellen wurden für weitere 4 Tage für eine zweite Ernte des Überstandes kultiviert.
(2) Aufreinigung von shFas(nd29)-Fc aus dem Kulturüberstand der CHO-Zelle
Das Verfahren des Beispiels 1 (2) wurde für die Aufreinigung des shFas(nd29)-Fc aus dem Kulturüberstand wiederholt wie es oben unter Verwendung der Protein A-Chromatografie beschrieben wird.
Beispiel 7. Toxizitätstest des shFas(nd29)-Fc
Um die Toxizität des shFas(nd29)-Fc zu bestimmen, wurde BDF1-Mäusen im Alter von 6 Wochen (Charles River, Japan K. K.) eine Dosis von 10 bis 30 mg/kg mit shFas(nd29)-Fc einmal alle zwei Tage für 12 Tage verabreicht, genauer gesagt, für insgesamt 7 mal in die Schwanzvene, um die Wirkungen zu untersuchen. Das Experiment wurde unter Verwendung von drei Gruppen durchgeführt, genauer gesagt, der Kontrollgruppe, der Gruppe, der 10 mg/kg shFas(nd29)-Fc verabreicht wurde und der Gruppe, der 30 mg/kg shFas(nd29)-Fc verabreicht wurde, und n war 3 für jede Gruppe. Es ist erwähnenswert, dass, um die gleiche Menge, nämlich, 30 mg/kg Protein zu verabreichen, der Kontrollgruppe 30 mg/kg menschliches Serumalbumin verabreicht wurde; der Gruppe mit 10 mg/kg shFas(nd29)-Fc-Verabreichung wurden 10 mg/kg shFas(nd29)-Fc und 20 mg/kg menschliches Serumalbumin verabreicht; und der Gruppe der 30 mg/kg shFas(nd29)-Fc-Verabreichung wurden 30 mg/kg shFas(nd29)-Fc verabreicht.
Das Körpergewicht wurde einmal alle zwei Tage vom Tag des Beginns der Verabreichung gemessen. Das Blut wurde aus der orbitalen Vene am 14. Tag vom Beginn der Verabreichung gesammelt und nach dem Zählen der Blutzellen wurde Plasma hergestellt, um GOT, GPT und Creatinin zu messen. Die Mäuse wurden einer Autopsie nach dem Blutsammeln unterzogen und die Hauptorgane (Lunge, Herz, Leber, Niere, Milz und Darm) wurden mit dem nackten Auge untersucht, ob es irgendwelche Veränderungen gab. Die Blutzellen wurden gezählt unter Verwendung eines automatischen Blutzellzählers K-2000 von Sysmex Inc. GOT, GPT und Creatinin wurden durch Verwendung eines Autoanalysators (COBAS FARA, hergestellt durch Roche) gemessen.
Es wurde dann herausgefunden, dass die Verabreichung von 10 oder 30 mg/kg shGas(nd29)-Fc einmal alle zwei Tage für 12 Tage an die Maus, nämlich für 7 mal insgesamt, keinerlei signifikanten Wirkungen auf Gewichtszunahme, Blutzellzählung, Leber (GOT, GPT), Niere (Creatinin) und andere Hauptorgane (Untersuchung mit dem nackten Auge) hatte.
Vergleichendes Beispiel 8. Wirkungen des Fas-Antagonisten in dem Endotoxininduzierten Leberschadenmodell
(1) Die Leberschaden-hemmende Wirkung von shFas(nd29)-Fc in der Maus
C57BL/6Cr Slc-Mäuse (männlich, 9 Wochen alt, Japan SLC K. K.) wurden als Testtiere durch die Ausbildung von 3 Gruppen von Tieren, die jeweils 5 Mäuse umfassen, verwendet. Den Mäusen wurde in die Schwanzvene 0,2 ml physiologische Kochsalzlösung verabreicht, in der Hitze-abgetötete Propionibacterium acness (P. acness) (RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH, INC.) in einer Konzentration von 5,0 mg/ml aufgelöst waren. 8 Tage nach der Verabreichung wurde den Mäusen in die Schwanzvene shGas(nd29)-Fc, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, das mit einem Verdünnungsmittel verdünnt wurde (physiologische Kochsalzlösung, die 0,1% menschliches Serumalbumin enthält) bei einer Dosierung von 0,3 mg/8 ml/kg oder 1 mg/8 ml/kg verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde das Verdünnungsmittel verabreicht. Nach 5 Minuten wurde den Mäusen intraperitoneal 0,2 ml einer Lösung Lipopolysaccharid verabreicht (hergestellt durch Sigma), die mit Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 5 μg/ml eingestellt wurde. 75 μl Blut wurden aus dem orbitalen Auge nach 8 und 24 Stunden nach der Verabreichung der Lipopolysaccharide gesammelt. Das gesammelte Blut wurde mit 8,3 μl einer 3,8% wässrigen Lösung von Natriumcitrat gemischt und bei 3000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das resultierende Plasma durch flüssigen Stickstoff eingefroren und bei –30°C bis zur Verwendung gelagert. GOT und GPT wurden mit dem GOT-FA TestWako (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), GPT-FA TestWako (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und einem Autoanalysator (Roche, COBAS FARA) gemessen. Es wurde dann herausgefunden, dass die GOT- und GPT-Werte in der Gruppe, der 1 mg/8 ml/kg shFas(nd29)-Fe verabreicht worden war, geringer waren als die Werte der Kontrollgruppe, um die Leberschaden-hemmende Wirkung zu zeigen.
(2) Leberschaden-hemmende Wirkung der shFas(nd29)-Brücke in der Maus
Das oben beschriebene Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von C57BL/6Cr Slc-Mäusen (männlich, 9 Wochen alt, Japan SLC K. K.) als Testtiere durch Ausbildung von 3 Gruppen von Tieren, die jeweils 5 Mäuse umfassen. Es wurde dann herausgefunden, dass die GOT- und GPT-Werte in der Gruppe, der die shFas(nd29)-Brücke verabreicht worden war, geringer waren als die Werte der Kontrollgruppe, um die Leberschaden-hemmende Wirkung zu zeigen.
Vergleichendes Beispiel 9. Wirkungen des Anti-Mensch-FasL-Antikörpers in dem Endotoxin-induzierten Leberschadenmodell
(1) Herstellung der Leberschaden Modell Maus
Es wurden männliche, 5 Wochen alte BALB/c-Mäuse (Japan SLC K. K.) verwendet. Den Mäusen wurde 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, die 5,0 mg/ml des Hitzeinaktivierten Propionibacterium acness (P. acness) (RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH, INC.) enthalten, in die Schwanzvene verabreicht. 10 Tage nach der Verabreichung wurde den Mäusen in die Schwanzvene 0,2 ml einer 50 μg/ml Verdünnung der extrazellulären Domäne des menschlichen Fas-Liganden in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht, die mit 0,1% menschlichem Serumalbumin supplementiert worden war, um die Leberschaden Modell Mäuse herzustellen. Es ist erwähnenswert, dass die extrazelluläre Domäne des menschlichen Fas-Liganden durch das Transformieren des Pichia-Hefe (Pichia pastoris) GS 115 Stamms (hergestellt durch Invitrogen) mit einem Expressionsplasmid erhalten wurde, welches ein Plasmid für Pichia-Hefe pPIC9 ist (hergestellt durch Invitrogen), das eine die DNA aufweist, die für die extrazelluläre Domäne des menschlichen Fas-Liganden kodiert, die darin eingebaut ist; die Gewinnung des Kulturüberstandes der Transformante; und die Aufreinigung des Kulturüberstandes durch Mittel der Salzfällung mit 80% gesättigtem Ammoniumsulfat, Protein A-Cellulofine-Affinitätssäule mit einem darauf gebundenen hFas-Fc, Mono S (hergestellt durch Pharmacia) Säule oder andere Aufreinigungsmittel (Tanaka, M. et al., Nature Medicine, Band 2, Seiten 317–322, 1996). Diejenige, die durch das Verfahren hergestellt wird, das in Beispiel 18 der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 beschrieben wird, ist auch verwendbar.
(2) Die mortalitätsunterdrückende Wirkung des Anti-Mensch-Fas-Ligandenantikörpers
Es wurde der Maus-Anti-Mensch-Fas-Liganden monoklonale Antikörper F919-9-18 verwendet, der durch die Hybridomzelle F919-9-18 mit der Zugangsnummer FERM BP-5535 hergestellt wurde. Die Gruppe, der der Maus-Anti-Mensch-Fas-Liganden monoklonale Antikörper F919-9-18 verabreicht worden war, wurde in den Schwanz 0,4 mg/kg oder 1,2 mg/kg F919-9-18 5 Minuten vor der Verabreichung der extrazellulären Domäne des menschlichen Fas-Liganden verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde physiologische Kochsalzlösung verabreicht, die mit 0,1% menschlichem Serumalbumin supplementiert worden war, welches das gleiche Verdünnungsmittel für den Anti-Mensch-Fas-Ligandenantikörper ist. n war für jede Gruppe 5. Es hat sich dann gezeigt, dass in der Kontrollgruppe alle Mäuse vor 8 Stunden nach der Verabreichung des Anti-Mensch-Fas-Ligandenantikörpers tot waren, während die Überlebensrate nach 24 Stunden nach der Verabreichung an die Gruppe, der 0,4 mg/kg des Anti-Mensch-Fas-Ligandenantikörpers verabreicht worden waren, 20% betrug und die Überlebensrate bei 24 Stunden nach der Verabreichung der Gruppe, der 1,2 mg/kg der Anti-Mensch-Fas-Ligandenantikörper verabreicht worden waren, 100% betrug (16).
Beispiel 10. Herstellung des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers und seiner Aufreinigung
(1) Herstellung des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers
Es wurde ein Plasmid, das den menschlichen Verlängerungsfaktor (Elongation Factor, EF) Promotor und stromabwärts davon, das Gen enthält, das für das chimäre Protein kodiert, durch das Fusionieren der extrazellulären Domäne des Maus-Fas-Liganden aus dem löslichen Maus-Fas-Liganden WX2 (J. Immunology, Band 157, Seiten 3918–3924, 1996) und der intrazellulären Domäne, der Transmembrandomäne und einem Teil der extrazellulären Domäne (von N-terminal bis zur 78. Aminosäure) des Maus CD40-Liganden hergestellt wird, hergestellt (Mizushima-Nagata, Nucleic Acids Research, Band 18, Seite 5322, 1990). Das Plasmid wurde in die WR19L-Zelle transfiziert, um eine rekombinante W40LFL-Zelle zu erhalten, die den Maus-Fas-Liganden auf ihrer Zellmembran exprimiert zur Verwendung als das zu verabreichende Antigen. Armenische Hamster wurden als zu immunisierende Tiere verwendet. Den armenischen Hamstern wurde subkutan 1 × 10⁷ W40LFL, vermischt mit Freund's vollständigem Adjuvans, verabreicht und einem Monat später subkutan 2 × 10⁷ W40LFL, das in PBS suspendiert war, subkutan verabreicht, und einen weiteren Monat später 5 × 10⁶ W40LFL, das in PBS suspendiert war, in den Fußballen verabreicht. 3 Tage nach der Verabreichung wurden Lymphknotenzellen gesammelt und mit der Maus-Myelomzelle P3-X63-Ag8-U1 (P3-U1) fusioniert. Nach dem Auswählen der Hybridomzelle durch HAT-Medium (Hypoxanthin-Aminopterin-thymidin) wurden die Hybridomazellen FLIM4 (#4-2), FLIM23 (#23-2), FLIM58 (#58-11) von den überlebenden Hybridomzellen gewonnen, deren Überstän de eine neutralisierende Aktivität für die Cytotoxizität des Maus-Fas-Liganden aufwiesen.
(2) Herstellung von FLIM58 (#58-11) und seine Aufreinigung
Die Hybridomzelle (#58-11) wurde in serumfreien Medium Hybridoma-SFM (GIBCO BRL) kultiviert und der Kulturüberstand wurde durch Protein A-Säule aufgereinigt (PROSEP-A, Bioprocessing), um den aufgereinigten Antikörper FLIM58 (#58-11) zu erhalten. Die Konzentration des Proteins wurde aus der Absorption bei 280 nm berechnet.
Beispiel 11. Neutralisierende Aktivität des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11 für die Maus- und Ratten-Fas-Liganden
Die neutralisierende Aktivität für den Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 wurde durch einen Assay unter Verwendung der Freisetzung von ⁵¹Cr als Index durch Wiederholung des Verfahrens, das in dem Beispiel der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 beschrieben wird, untersucht.
(1) Herstellung der Effektorzellen
Milzzellen aus männlichen, 7 Wochen alten ICR-Mäusen (Charles River, Japan K. K.) und männliche 11 Wochen alten Wistar-Ratten (Charles River, Japan K. K.) wurden durch die Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 4 hergestellt. Die resultierenden Milzzellen wurden auf eine Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und über Nach bei 37°C in PRMI 16040 Medium (GIBCO BRL) inkubiert, das mit 40 U/ml rekombinantem menschlichen IL-2 (Boehringer Mannheim) und 10% inaktiviertem FBS (JRH Bioscience) supplementiert worden war, in der Gegenwart von 5% CO₂-Gas inkubiert. Es wurden 100 nM Conkanamycin A (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) hinzugefügt und die Kultur wurde für 1 Stunde inkubiert und 10 ng/ml PMA (Sigma) und 500 ng/ml lonocycin (CALBIOCHEM) wurden hinzugefügt und die Kultur wurde für weitere 2 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt, mit dem RPMI 1640 Medium gewaschen, das mit 10% inaktiviertem FBS supplementiert worden war, und in dem RPMI 1640 Me dium auf 2,5 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert, das mit 10% inaktiviertem FBS supplementiert worden war.
(2) Herstellung von Zielzellen
Die Herstellung der Zielzellen wurde durch ein Verfahren durchgeführt, das dem ähnelt, das in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 beschrieben wird. Genauer gesagt, es wurde eine Maus-Fas-exprimierende W4-Zelle als Zielzelle verwendet und 10⁶ W4-Zellen wurden in RPMI 1640 Medium zur ⁵¹Cr-Markierung bei 37°C in der Gegenwart von 5% Co₂-Gas für 2 Stunden inkubiert, das mit 20 μCi ⁵¹Cr Natriumchromat (NEN) supplementiert worden war.
(3) Neutralisierende Aktivität des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11 für die Maus- und Ratten-Fas-Liganden
Verschiedene Konzentrationen des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11 wurden jeweils zu 1 × 10⁶ aktivierten Maus- und Ratten-Milzzellen wie oben beschrieben hinzugefügt und die Zellen wurden bei 37°C für 30 Minuten in der Gegenwart von 5% CO₂-Gas inkubiert. Zu den Kulturen wurden dann 1 × 10⁴ W4-Zellen hinzugefügt, die wie oben beschrieben mit ⁵¹Cr markiert waren, und nach der Zentrifugation bei 800 Upm für 2 Minuten wurden die Zellen bei 37°C für 4 Stunden in der Gegenwart von 5% CO₂-Gas inkubiert. Die Überstände wurden auf die Menge an ⁵¹Cr nach der Zentrifugation bei 1200 Upm für 5 Minuten gemessen, um die Wirkung des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11 zu untersuchen. Zudem, um zu bestätigen, dass die cytotoxische Aktivität der aktivierten Maus- und Ratten-Milzzellen, wie sie oben beschrieben werden, die cytotoxische Aktivität ist, die durch das FasL, shFas(nd29)-Fc ausgelöst wird, welches das Fas-Derivat ist, das in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/JP97/10502 beschrieben wird, wurde es in der gleichen Weise wie im Falle des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11 als eine positive Kontrolle des Assays hinzugefügt. Die so erhaltenen Ergebnisse wurden durch ein Verfahren analysiert, das dem Assayverfahren gleicht, das in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/13293 beschrieben wird, unter Verwendung der Freisetzung von ⁵¹Cr als Index. Es wurde dann gezeigt, dass das shFas(nd29)-Fc, das als positive Kontrolle verwendet wird, die cytotoxische Aktivität der aktivierten Maus- und Ratten- Milzzellen in einer dosisabhängigen Weise bei einer Konzentration im Bereich von 0,3 μg/ml bis 3 μg/ml hemmt und dass die aktivierten Maus- und Ratten-Milzzellen, die verwendet werden, eine FasL-abhängige Cytotoxizität aufzeigen. Es wurde auch gezeigt, dass der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 die cytotoxische Aktivität der aktivierten Maus- und Ratten-Milzzellen in einer dosisabhängigen Weise bei einer Konzentration im Bereich von 0,3 μg/ml bis 3 μg/ml wie im Falle des shGas(nd29)-Fc hemmt. Wie oben beschrieben hemmte der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 die Maus- und die Ratten-Fas-Liganden.
Beispiel 12. Toxizitätstest des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11
(1) Verfahren
Es wurden männliche, 8 Wochen alte DBA/1J-Mäuse und C3H/He-Mäuse (Charles River, Japan K. K.) verwendet. Den Mäusen wurde in ihre Schwanzvene Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 bei einer Dosierung von 100 mg/30 ml/kg verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde in die Schwanzvene eine physiologische Kochsalzlösung (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) bei einer Dosierung von 30 ml/kg verabreicht. n betrug 3 für beide Gruppen. Der Beobachtungszeitraum betrug 7 Tage und es wurden eine Körpergewichtsmessung, hämatologische Tests (rote Blutzelle, weiße Blutzelle, Plättchen) und hämatobiologische Tests (GOT, GPT, Harnstoffstickstoff) und eine Autopsie mit dem bloßen Auge durchgeführt.
(2) Ergebnisse
Die Erhöhung des Körpergewichtes, die hämatologischen Testwerte (rote Blutzelle, weiße Blutzelle, Plättchen) und die hämatobiologischen Testwerte (GOT, GPT, Harnstoffstickstoff) der Gruppe, der der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 verabreicht wurde, entscheidet sich nicht wesentlich von solchen der Kontrollgruppe. Zusätzlich wurden keinerlei Abnormalitäten durch Autopsie mit bloßem Auge in der Gruppe gefunden, der der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 verabreicht wurde.
Beispiel 13. Wirkungen des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers in der ischämischen Herzreperfusionsverletzung
(1) Verfahren
Das Rattenherz- ischämische Reperfusionsmodell wurde durch die Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 2 hergestellt. Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, die mit 0,1% Albumin supplementiert worden war, und an Ratten in ihre rechte femorale Vene bei einer Dosierung von 1 mg/5 ml/kg direkt nach dem Beginn der Reperfusion verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde der IgG-Antikörper (Cappel) verabreicht, der aus normalem Hamsterserum abgeleitet wurde, bei einer Dosierung von 1 mg/5 ml/kg. Die Gruppe, der der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 verabreicht wurde, bestand aus 3 Ratten, und die Kontrollgruppe bestand aus 3 Ratten. Die Messung der nicht-ischämischen, ischämischen und nekrotischen Regionen der Schnitte und die Plasmacreatininkinase (CPK) Messung wurden durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 2 durchgeführt.
(2) Ergebnisse
Die Anteile (%) der nekrotischen Region in der ischämischen Region der Gruppe, der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 verabreicht wurde, war geringer als der der Kontrollgruppe (17). Der Plasma-CPK-Wert der Gruppe, der der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 verabreicht worden war, war geringer als der der Kontrollgruppe (18).
Beispiel 14. Wirkung des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers auf die Überlebensrate im Maus-GVHD-Modell
(1) Myelounterdrückung in der Wirtsmaus
Es wurden männliche, 6 Wochen alte DBA/2-Mäuse (Charles River, Japan K. K.) als Wirtsmäuse verwendet. Den Wirtsmäusen wurde intraperitoneal 350 mg/kg Cyclophosphamid verabreicht ((Shionogi & Co., Ltd. Endoxan), um eine Myelounterdrückung zu induzieren.
(2) Herstellung der Milzlymphozyten aus der Spendermaus und Transplantation der Milzlymphozyten in die Wirtsmaus
Es wurde eine männliche B10.D2-Maus im Alter von 7 bis 8 Wochen (Nihon SLC K. K.) als Spendermaus verwendet. Die Milz aus der Spendeermaus wurde in Hank's Lösung (hergestellt durch Nissui Seiyaku K. K.) mit einer Zange zerlegt und zentrifugiert, und die so erhaltenen Zellen wurden in 0,017 M Tris-0,747% Ammoniumchloridlösung zur selektiven Hemolyse der Erythrozyten suspendiert. Die verbleibenden mit Hank's Lösung gewaschenen Zellen wurden als Milzzellen der Spendermaus verwendet und 3 × 10⁷ Zellen/Maus wurden in die Wirtsmaus in deren Schwanzvene am nächsten Tag der oben beschriebenen Cyclophosphamidverabreichung transplantiert.
(3) Beurteilung der Wirkungen des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11
Es wurde die Überlebensrate durch die Verabreichung von 10 mg/kg des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11 oder des IgG-Antikörpers (Cappel), der aus normalem Hamsterserum abgeleitet wurde, in die Schwanzvene 30 Minuten vor der Transplantation der Milzlymphozyten aus der Spendermaus untersucht. Es ist erwähnenswert, dass im Falle der GVHD-negativen Gruppe der Antikörper mit 10 ml/kg physiologischer Kochsalzlösung ersetzt wurde (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), die verwendet worden war, um den Antikörper zu verdünnen, und die Milzlymphozyten wurden mit Hank's-Lösung ersetzt, die zur Suspendierung der Lymphozyten verwendet worden war (n war 8 für jede Gruppe). Die Überlebensrate am 8 Tag nach der Transplantation der Milzzellen betrug 63% in der GVHD-negativen Gruppe, 63% in der Gruppe, der der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 verabreicht worden war, und 38% in der Gruppe, der der Kontrollantikörper verabreicht worden war. Der Vergleich der Überlebensrate mit der Gruppe, der der Kontrollantikörper verabreicht worden war, zeigte, dass die überlebensverbessernde Wirkung in GVHD für die Gruppe, der der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikönper #58-11 verabreicht worden war, vorhanden war (19).
Vergleichendes Beispiel 15. Wirkungen des Anti-Maus-Fas-Ligangenantikörpers in dem ischämischen Nierenreperfusionsmodell
(1) Herstellung des ischämischen Nierenreperfusionsmodells
Männliche, 6 Wochen alte ICR-Mäuse (Nihon SLC K. K.) wurden in auf dem Rücken liegender Position auf einem Operationstisch nach Anästhesie mit Pentobarbital fixiert und abdominal präpariert. Die rechte Niere wurde aus der abdominalen Öffnung herausgenommen und ein ischämischer Zustand wurde durch das Blockieren der linken Nierenarterie und der Vene mit einem Clip (VASCULAR CLIP AS-1, Kyowa Tokei Kogyo) geschaffen. Nach 30 Minuten wurde der Clip geöffnet und das Blut wurde fließen gelassen. Das Blut wurde aus der abdominalen großen Vene 24 Stunden nach der Reperfusion gesammelt und auf Plasmacreatinin und Harnstoffstickstoff gemessen. Creatinin wurde unter Verwendung des Detamina CRE 55s (Kyowa Medics) gemessen und Harnstoffstickstoff wurde unter Verwendung des Urea Nitrogen B TestWako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einem Autoanalysator (COBAS FARA, Roche) gemessen.
(2) Verabreichung des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11
Der Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörper #58-11 wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, die mit 0,1% BSA (SIGMA) supplementiert worden war und den Mäusen wurde intravenös die Verdünnung bei einer Dosierung von 0,3 mg/10 ml/kg oder 3 mg/10 ml/kg direkt vor der Ischämie der linken Nierenarterie und direkt nach der Reperfusion verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde die physiologische Kochsalzlösung verabreicht, die mit 0,1% BSA supplementiert worden war. In dem Fall der Kontrollgruppe wurde die physiologische Salzlösung, die mit 0,1% BSA supplementiert worden war, ohne die Herstellung des ischämischen Zustandes nach dem Herausnehmen der rechten Niere verabreicht. Alle Gruppen bestanden aus 8 Fällen.
(3) Ergebnisse
Der Plasmacreatininwert und der Harnstoffstickstoffwert der Gruppe, der 3 mg/kg des Anti-Maus-Fas-Ligandenantikörpers #58-11 verabreicht worden waren, waren geringer als solche der Kontrollgruppe, um die hemmende Wirkung für die ischämische Nierenreperfusionsverletzung zu zeigen (20 und 21). Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass das prophylaktische/therapeutische Mittel, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, exzellente Wirkungen auf GVHD aufweist. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete prophylaktische/therapeutische Mittel zeigte keine erkennba re Toxizität und es wurde keine Toxizität zumindestens in Bezug auf die Hemmung der biologischen Wirkungen des Fas/Fas-Ligandensystems festgestellt. Dem entsprechend ist das prophylaktische/therapeutische Mittel der vorliegenden Erfindung, das einen Fas-Antagonisten als wirksame Komponente enthält, in der Behandlung von GVHD nützlich, wobei die biologische Wirkung des Fas/Fas-Ligandensystems und insbesondere der Fas-vermittelte Zelltod und insbesondere die Apoptose involviert ist, solange wie die Signalbildung oder Transduktion durch Fas blockiert ist und die biologische Wirkung des Fas/Fas-Ligandensystems unterdrückt wird.
Industrielle Anwendbarkeit
Das prophylaktische/therapeutische Mittel, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, das einen Fas-Antagonisten als wirksame Komponente enthält, unterdrückt die biologische Wirkung des Fas/Fas-Ligandensystems und insbesondere den Fas-vermittelten Zelltod und insbesondere die Apoptose und zeigt prophylaktische oder therapeutische Wirkungen für GVHD. Zusätzlich hat das prophylaktische/therapeutische Mittel, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, keine erkennbare Toxizität und es wurde keinerlei Toxizität zumindestens in Bezug auf die Hemmung der biologischen Wirkungen des Fas/Fas-Ligandensystems gefunden. Daher sollte der in der vorliegenden Erfindung verwendete Fas-Antagonist ein prophylaktisches/therapeutisches Mittel für GVHD darstellen, bei der der Zelltod und insbesondere die Apoptose involviert ist.
SEQUENZEN UND FIGURENBESCHREIBUNG SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verwendung eines Fas-Antagonisten, der eine Aktivität zur Verfügung stellt, um mit der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden oder der extrazellulären Domäne des Fas zu wechselwirken, und eine Aktivität zur Verfügung stellt, um die Fas-vermittelte Apoptose zu hemmen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Therapie der Transplantation-versus-Wirtserkrankung (GVHD).
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, worin besagter Fas-Antagonist ein Fas-Derivat, ein Anti-Fas-Ligandenantikörper oder ein Anti-Fas-Antikörper ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 2, worin besagter Anti-Fas-Ligandenantikörper ein humanisierter Anti-Fas-Ligandenantikörper ist.
Verwendung eines Fas-Derivats, eines Anti-Fas-Ligandenantikörpers oder eines Anti-Fas-Antikörpers, das oder der eine Aktivität zur Verfügung stellt, um mit der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden oder der extrazellulären Domäne des Fas zu wechselwirken, und eine Aktivität zur Verfügung stellt, um die Fas-vermittelte Apoptose zu hemmen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Therapie der Transplantationversus-Wirtserkrankung (GVHD).