JPH07289266A

JPH07289266A - ヒトＦａｓ抗原バリアント及びそれをコードする新規ＤＮＡ

Info

Publication number: JPH07289266A
Application number: JP6105916A
Authority: JP
Inventors: Mikio Yamamoto; 本三毅夫山; Kotohiko Kimura; 村言彦木
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1994-04-21
Publication date: 1995-11-07

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒトＦａｓ抗原バリアントおよびそれをコード
するＤＮＡ、組換えＤＮＡ分子及び形質転換体を提供す
ることを目的とする。【構成】ヒトＦａｓ抗原バリアント、またはそれと実質
的に同一の機能を有する新規ペプチドおよびそれをコー
ドする新規ＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、天然に存在するヒトＦ
ａｓ抗原の変異体であるヒトＦａｓ抗原バリアント及び
それをコードする新規ＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトＦａｓ抗原は、様々な細胞の表面に
存在するポリペプチドであって、アポトーシスと呼ばれ
る細胞の死と関連していると考えられている。生体の恒
常性は細胞の増殖と分化およびその死によって巧妙に制
御されているが、アポトーシスは、死につつある細胞の
形態からネクローシス（壊死）と区別される細胞の死の
１形態である。生体の恒常性を維持するための細胞の
死、すなわち、生体にとって不必要な細胞を除去した
り、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞が細胞障害性Ｔ細胞
（CTL ）やナチュラルキラー（NK）細胞によって攻撃さ
れ、除去される場合の細胞の死は、主としてアポトーシ
スによることがわかっている。ヨネハラＳ．（Yoneha
ra S. ）等が見出したＦａｓ抗体（J. Exp. Med. 169
巻、1747-1756 頁、1989年）によって認識され、アポト
ーシスのシグナルを細胞に伝達する細胞表面抗原（Fas
抗原）がいかなるものであるかは長年不明であったが、
最近、イトウＮ．（Itoh N. ）等によって、Ｆａｓ抗
原遺伝子がクローニングされ以下のことが明らかにされ
た。Ｆａｓ抗原は、分子量約４５ｋＤの細胞膜上の糖蛋
白質であり、そのアミノ酸配列から生理学的に重要な細
胞表面膜タンパク群を構成するＮＧＦＲ（神経成長因子
レセプター）／ＴＮＦＲ（ＴＮＦレセプター）ファミリ
ーに属することが判明した（Cell、66巻、233-243 頁、
1991年）。また、マウスＦａｓ抗原遺伝子もクローニン
グされ（ワタナベ−フクナガＲ．(Watanabe-Fukunaga
R.)等、J. Immunol., 148巻、1274-1279 頁、1992
年）、マウスＦａｓ抗原のｍＲＮＡが、マウスの胸腺、
肝、肺、心臓、卵巣で発現していることが確認された。
さらに、最近キムラＫ．(Kimura K.) 等は、ラットＦ
ａｓ抗原遺伝子をクローニングするとともに、ラット肝
ｍＲＮＡ中にアルタネイティブスプライシングの相違に
より２種類のｍＲＮＡが検出されること、及び膜結合型
Ｆａｓ抗原のｍＲＮＡ以外に分子量の小さなペプチドを
コードするｍＲＮＡがあることを報告した（Biochemica
l and Biophysical Research Communications, 198巻
(2), 666-674頁、1994年）。

【０００３】このような状況の中で、Ｆａｓ抗原遺伝子
のクローニングが進み、Ｆａｓ抗原を介したアポトーシ
スと疾患との関係も明らかになりつつある。ワタナベ−
フクナガＲ．等は、自己免疫疾患によく似た症状を示
すｌｐｒマウスでは、Ｆａｓ抗原遺伝子に異常があるた
めアポトーシスが起きないことを証明した。そして、あ
る種の自己免疫疾患においては、Ｆａｓ抗原の異常、も
しくはＦａｓ抗原を介してアポトーシスを起こさせるよ
うな物質（Fas リガンド）の異常により、本来除去され
るべき自己反応性のＴ細胞が残存し、自己免疫疾患が生
じるのであろうと予想している（Nature, 356 巻、314-
417 頁、1993年）。また、コバヤシＮ．（Kobayashai
N. ）等は、エイズウイルス感染によりＦａｓ抗原の発
現が誘導されることを報告し、エイズで見られるＴ細胞
のアポトーシスがＦａｓ抗原を介した現象である可能性
を示唆している（日経サイエンス,6巻, 34-41頁, 1993
年）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、Ｆａｓ
抗原が単離され、生体内でＦａｓ抗原が発現しアポトー
シスが惹起されることが確認され、疾患との関係も明ら
かにされつつあることから、Ｆａｓ抗原を医療分野等で
用いることが望まれている。一般的に、ポリペプチドは
活性部位の構造が保存されていれば活性を有しているこ
とが知られており、分子量の小さいものは精製等が容易
で、取り扱い易い。また、可溶型のポリペプチドであれ
ば、さらに取扱が容易である。上述したようにラットＦ
ａｓ抗原については、膜結合型をコードするｍＲＮＡ以
外に分子量の小さいペプチドをコードするｍＲＮＡが検
出されたとの報告があるが、その機能は未だ明らかにさ
れておらず、ヒトのＦａｓ抗原においてこのようなｍＲ
ＮＡから生成されるＦａｓ抗原の変異体（Ｆａｓ抗原バ
リアント）が存在するのかどうかについては明らかにさ
れていない。

【０００５】Ｆａｓ抗原バリアントは、Ｆａｓリガンド
を介するアポトーシスを制御していると考えられるた
め、それを使用して、人為的に生体内で生じるアポトー
シスを調節し、疾患の治療や、診断に使用することがさ
らに容易になる。たとえば、ある種の自己免疫疾患にお
いては、人為的にＦａｓ抗原バリアントを用いてアポト
ーシスを抑制することにより、自己抗原反応性のＴ細胞
攻撃による急激な細胞死を抑制し、臓器の破壊を防ぐこ
とが可能になるであろう。ウイルス感染時には免疫反応
により細胞が除去されるが、この際には感染細胞ばかり
でなく非感染細胞も同時に除去されてしまうことが知ら
れている。Ｆａｓ抗原バリアントを使用すれば非感染正
常細胞の死を抑制することができるため、ウイルス感染
による合併症の治療に使用することができる。

【０００６】一方、Ｆａｓ抗原バリアントをコードする
塩基配列は、Ｆａｓ抗原よりも短いため、クローニング
・増幅ともに容易であり、また、分子量が小さいため分
泌発現が容易であることから、高純度のＦａｓ抗原バリ
アントを工業的に大量生産することが可能になる。これ
によって、Ｆａｓ抗原バリアントを治療薬の主成分とし
て医薬の分野に提供したり、診断薬として使用するため
の抗体の作製に利用することが可能になる。また、Ｆａ
ｓ抗原バリアントをコードする塩基配列を遺伝子治療に
使用したり、トランスジェニックマウスあるいはノック
アウトマウスを作製し、アポトーシスが関与する疾患の
新たな動物モデルを作製することもできる。さらに、Ｆ
ａｓ抗原バリアントをコードする塩基配列を利用してア
ンチセンス医薬品を製造することができる。

【０００７】ヒトＦａｓ抗原バリアントはヒトＦａｓ抗
原の機能あるいは生理学的な意義の解明においても有用
であると考えられる。そして、Ｆａｓ抗原バリアントの
生成機構を解明することによってＦａｓ抗原の発現と様
々な疾患との関係をより明らかにすることができ、医療
をはじめ、多くの分野において有効に応用できるように
なると考えられる。

【０００８】

【問題を解決するための手段】本発明の目的は、ヒトＦ
ａｓ抗原バリアントおよびＦａｓ抗原バリアントをコー
ドする塩基配列を単離し、提供することにある。また、
本発明は、Ｆａｓ抗原バリアントをコードする塩基配列
を組込んだＤＮＡ分子によって形質転換された形質転換
体を作製し、ヒトＦａｓ抗原バリアントを製造する方法
を提供することをも目的とする。

【０００９】本発明者らは、Ｆａｓ抗原バリアントを単
離すべく、鋭意研究を重ね、正常ヒト肝の全ｍＲＮＡよ
りＦａｓ抗原バリアントをコードするｃＤＮＡを単離
し、その生成機構を解明し、本発明を完成したものであ
る。

【００１０】すなわち、本発明の第１の態様は、ヒトＦ
ａｓ抗原バリアントまたはそれと実質的に同一の機能を
有するポリペプチドをコードする下記式２（配列表の配
列番号２）の配列を含む新規ＤＮＡである。式２ AGATTATCGT CCAAAAGTGT TAATGCCCAA GTGACTGACA TCAACTCCAA GGGATTGGAA 60 TTGAGGAAGA CTGTTACTAC AGTTGAGACT CAGAACTTGG AAGGCCTGCA TCATGATGGC 120 CAATTCTGCC ATAAGCCCTG TCCTCCAGGC AGG 153

【００１１】本発明の第２の態様は、下記式１（配列表
の配列番号１）のヒトＦａｓ抗原バリアントまたはそれ
と実質的に同一の機能を有する新規ポリペプチドであ
る。式１ Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn 5 10 15 Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr 20 25 30 Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys 35 40 45 Pro Cys Pro Pro Gly Arg 50 51

【００１２】本発明の第３の態様は、本発明第１の態様
のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子である。

【００１３】本発明の第４の態様は、本発明の第３の態
様の組換えＤＮＡ分子で形質転換された形質転換体であ
る。

【００１４】本発明の第５の態様は、本発明の第４の態
様の形質転換体を用いる本発明の第１の態様のＤＮＡで
コードされる新規ポリペプチドの製造方法である。

【００１５】本発明の第６の態様は、本発明の第２の態
様のポリペプチドを認識する新規抗体である。

【００１６】以下に詳細に本発明を説明する。ヒトＦａ
ｓ抗原バリアントは、ヒトＦａｓ抗原と染色体遺伝子を
共有し、アルタネイティブスプライシングにより異なっ
たメカニズムによって生産される天然に存在する既知の
膜結合型Ｆａｓ抗原とは異なるポリペプチドである。本
発明第１の態様の新規ＤＮＡは、Ｆａｓ抗原バリアント
またはそれと実質的に同一の機能を有するポリペプチド
をコードする塩基配列を有することを特徴とする。本明
細書のＤＮＡ及び組換えＤＮＡ分子の説明において「塩
基配列を有するＤＮＡ」とは、あるＤＮＡがその塩基配
列からなるＤＮＡであってもよく、また、その塩基配列
の５’末端あるいは３’末端のいずれか一方、もしくは
その両方に１つ以上の任意の塩基が付加された配列から
なるものであってもよいことを意味する。

【００１７】本発明の新規ＤＮＡは、好ましくは、式１
（配列表の配列番号１）または式３（配列表の配列番号
３）のアミノ酸配列をコードする塩基配列の少なくとも
一部を有するものである。一般に、アミノ酸をコードす
るＤＮＡのトリプレット（コドン）は、アミノ酸の種類
によって１種類から６種類まで存在することが知られて
いるので、式１または式３に記載のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡの塩基配列は１種類には限定されない。従
って、式１（配列表の配列番号１）または式３（配列表
の配列番号３）のアミノ酸配列の少なくとも一部をコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡである限り、いかなる塩
基配列からなるものであっても、本発明の範囲内に含ま
れる。本発明の新規ＤＮＡは、より好ましくは、式１に
記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列（配
列表の配列番号２）または式３に記載のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号４）の
少なくとも一部を有するＤＮＡであることが好ましい。

【００１８】本発明のＤＮＡは、特に好ましくは、式２
（配列表の配列番号２）または式４（配列表の配列番号
４）の塩基配列の全体を有するものである。式２（配列
表の配列番号２）の塩基配列の全体を有するＤＮＡを適
当なシグナル配列の下流に接続した組換えＤＮＡ分子を
作製し、これを用いて宿主を形質転換させると、ここで
得られた形質転換体の培養時にはその培養上清中に式１
に記載のアミノ酸配列を有するタンパクを分泌させるこ
とができる。式４（配列表の配列番号４）の塩基配列は
式２の塩基配列の５’末端にシグナル配列が接続した配
列である。また、配列表の配列番号３には、配列番号４
の塩基配列に対応するＦａｓバリアントのアミノ酸配列
を示す。式３ Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val -15 -10 -5 Ala Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile -1 1 5 10 Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu 15 20 25 Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His 30 35 40 Lys Pro Cys Pro Pro Gly Arg 45 50 51

【００１９】式４ ATGCTGGGCA TCTGGACCCT CCTACCTCTG GTTCTTACGT CTGTTGCTAG ATTATCGTCC 60 AAAAGTGTTA ATGCCCAAGT GACTGACATC AACTCCAAGG GATTGGAATT GAGGAAGACT 120 GTTACTACAG TTGAGACTCA GAACTTGGAA GGCCTGCATC ATGATGGCCA ATTCTGCCAT 180 AAGCCCTGTC CTCCAGGCAG G 201 本発明のＤＮＡはｃＤＮＡであっても染色体ＤＮＡであ
ってもよい。しかし、遺伝子工学的な取扱の容易さか
ら、本発明のＤＮＡはｃＤＮＡであることが好ましい。
Ｆａｓ抗原等の細胞表面タンパクは、これらを発現して
いる細胞あるいは組織よりライセートを調製し精製する
ことが多いが、タンパクの精製効率は、夾雑タンパクの
量に左右されるために、上述のような細胞や組織のライ
セートから精製する場合と、培養上清から精製する場合
とを比較すると、後者の方が効率的である。従って、本
発明第１の態様の新規ＤＮＡを使用すれば、Ｆａｓバリ
アント蛋白質を分泌発現することが可能となり、Ｆａｓ
抗原バリアントを安価で大量に生産し、かつ高純度のも
のを得ることが可能となり、本発明の第２の態様の新規
ポリペプチドを生産する点に於いて非常に有用である。

【００２０】本発明の第１の態様のＤＮＡは、いかなる
方法で得られた物であってもよい。すなわち、式１を参
考にして化学合成されたものであってもよく、適当なＤ
ＮＡライブラリーからクローニングされたものであって
もよい。本発明のＤＮＡは、以下のようにして化学合成
をすることができる。具体的には、本発明のＤＮＡを約
２０塩基からなる断片に分けて、ＤＮＡ化学合成機（例
えば、３９４型、アプライドバイオシステムズ社製）を
用いて、複数の断片として合成し、その後、必要に応じ
て各断片の５’末端をリン酸化して各断片をアニーリン
グし、ライゲーションして目的のＤＮＡを得る。また、
本発明のＤＮＡを適当なＤＮＡライブラリーから得る場
合には、以下のように行う。適当なゲノムＤＮＡやｃＤ
ＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるス
クリーニングや抗体を用いたイムノスクリーニングによ
ってスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローン
を増殖させて、ここから制限酵素等を用いて切り出せば
よい。

【００２１】ハイブリダイゼーションによるスクリーニ
ングは、式２または式４の塩基配列またはその一部を有
するＤＮＡを［³²Ｐ］等の放射性同位元素を用いてラベ
ルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対
して公知の方法（例えば、マニアティスＴ．(Maniati
s T.) 等：Molecular Cloning; a Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク（New
York）, 1982年, 参照）によって行うことができる。イ
ムノスクリーニングに用いる抗体は、後述する本発明第
６の態様の新規抗体を使用することができる。本発明の
ＤＮＡはまた、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡラ
イブラリーを鋳型とするＰＣＲ(Polymerase Chain Reac
tion) 法によっても得ることができる。ＰＣＲ法を用い
る場合、式２（配列表の配列番号２）の塩基配列をもと
に、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを作
製し、任意のＤＮＡライブラリーに対して公知の方法
（ミカエル A.I（Michael A.I.）等編、Polymerase Cha
inReaction, PCR Protocols, a guide to methods and
applications(1990年) 、アカデミック出版（Academic
Press）、参照）を行うことによって得ることができ
る。

【００２２】本発明によれば、本発明の新規ＤＮＡに対
応するＲＮＡ、あるいは本発明の新規ＤＮＡと相補的な
配列を有するＤＮＡ及びＲＮＡも提供される。本発明の
新規ＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡ、及びＲＮＡとは、
互いに相補的に結合して２本鎖、あるいは３本鎖を形成
していても良い。本発明の新規ＤＮＡはまた、［³²Ｐ］
等の放射性同位体、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素、化学発光物質あるいは蛍光物
質等で標識されていてもよい。

【００２３】本発明の新規ＤＮＡは、本発明の第２の態
様の新規ポリペプチドを大量に生産するために使用する
ことができる。本発明の新規ＤＮＡを用いて本発明の第
２の態様の新規ポリペプチドを産生する方法は、本発明
第５の態様で説明する。本発明の新規ＤＮＡを上述のよ
うに標識して、組織における本発明の第２の態様の新規
ポリペプチドの発現状況を検査するために使用すること
ができる。本発明の新規ＤＮＡを使用して細胞における
本発明の新規ポリペプチドの発現量を確認することによ
り、本発明のポリペプチドの製造に適した細胞や細胞の
培養条件を決定することができる。さらに、本発明の新
規ＤＮＡをベクターに連結し生体細胞に直接導入して、
自己免疫疾患、肝炎、腎炎等の患者の治療を行うことも
できる。また、本発明の新規ＤＮＡの有する塩基配列を
もとにアンチセンス医薬品を開発することもできる。

【００２４】次に、本発明の第２の態様の新規ポリペプ
チドについて説明する。本発明の新規ポリペプチドの説
明において、「アミノ酸配列を有する新規ポリペプチ
ド」とは、以下のことを意味する；第１は、その新規ポ
リペプチドがそのアミノ酸配列で規定されるものであっ
てもよいという意味であり、第２は、そのアミノ酸配列
に加えてそのアミノ酸配列のＮ末端あるいはＣ末端のい
ずれか一方、もしくは両方に任意の１つ以上のアミノ酸
が付加してなるものであってもよいという意味である。
また「アミノ酸配列の少なくとも一部を有する新規ポリ
ペプチド」とは、そのアミノ酸全体を有する新規ポリペ
プチド、およびそのアミノ酸配列に含まれる任意の長さ
からなる任意の一部分の配列を有する新規ポリペプチド
を意味する。

【００２５】本発明の第２の態様の新規ポリペプチド
は、ヒトＦａｓ抗原バリアントまたはそれと実質的に同
一の機能を有することを特徴とし、この特徴を有するも
のである限り、そのアミノ酸配列は特に限定されない。
しかしながら、本発明の新規ポリペプチドは、式１のア
ミノ酸配列の少なくとも一部を有することが好ましい。
より好ましくは、式１のアミノ酸配列全体を有するもの
である。上述したように、Ｆａｓ抗原等の細胞表面タン
パクの精製効率は、夾雑タンパクの量に左右されるため
に、細胞や組織のライセートから精製する場合と、培養
上清から精製する場合とを比較すると、後者の方が効率
的である。本発明第２の態様の新規ポリペプチドは、当
該ポリペプチドを生産する細胞の培養上清から回収する
ことができ、生産上の有用性が高い。

【００２６】一般に、ポリペプチドは、種の相違あるい
は個体の相違によって、そのポリペプチドが本来有する
機能を基本的に有したまま、進化の過程において生じた
変異によりアミノ酸配列が異なっている。ここでいうア
ミノ酸配列の変異とは、１）ポリペプチド中のアミノ酸
配列中の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、２）他のアミ
ノ酸残基への置換、３）上記のアミノ酸配列中の任意の
位置に１つ以上のアミノ酸の挿入あるいは付加をいう。
このような変異は、遺伝子工学的な技術を用いて人工的
に生じさせることも可能である。また、疎水性アミノ酸
残基を他の疎水性アミノ酸残基の置換すること、陽性電
荷を持つアミノ酸を他の陽性電荷を持つアミノ酸へ置換
すること、ＧｌｕとＡｓｐあるいはＬｙｓとＨｉｓとＡ
ｒｇとの間の相互置換、または、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅ
ｔ、Ｌｅｕからなる群間、Ｇｌｙ、Ａｌａからなる群
間、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅからなる群間での置換は十
分推定できる。このため、上述のような変異の生じたア
ミノ酸配列を有するものであっても、ヒトＦａｓバリア
ントと実質的に同一の機能を有する限り、本発明の新規
ポリペプチドに含まれる。

【００２７】本発明第２の態様の新規ポリペプチドは、
糖鎖を有していても有していなくてもよく、また、いか
なる修飾を受けていてもよい。さらに、ポリペプチドの
精製過程において受ける変性等によりポリペプチドの分
子量が異なる場合もある。従って、本発明のポリペプチ
ドは、式１のアミノ酸配列を有する限り、その分子量は
特に限定されない。

【００２８】本発明の新規ポリペプチドは、いかなる生
産方法によって生産されたものであってもよい。すなわ
ち、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー
４３０型、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて
化学合成して得たものであってもよく、また、ヒトの組
織、細胞あるいは体液から精製して得たものであっても
よい。ヒトの体液としては、血液や尿を挙げることがで
き；細胞としては、胸腺細胞、リンパ球系の細胞、脾、
肝、腎及びそれらの培養株化細胞等の本発明の新規ポリ
ペプチドを産生する細胞を適宜選択して使用すればよ
い。これらの細胞の使用に当たっては、ノーザンブロッ
トや逆転写ＰＣＲ（combined reverse transcription-p
olymerase chain reaction）等を行って本発明の新規ポ
リペプチドをコードするｍＲＮＡの発現量の多いものを
選択して使用する。ＰＭＡ（ホルボールミリステートア
セテート）、イオノマイシン、ＰＨＡ（フィトヘムアグ
ルチニン）、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）、ＩＬ−２
（インターロイキン−２）等の刺激剤を適宜使用してポ
リペプチドの発現誘導を行ってもよい。当該ポリペプチ
ドを含む培養上清や体液からの精製は、濃縮、各種のク
ロマトグラフィー、塩析等、一般的にポリペプチドの精
製に用いられている手法を適宜組み合わせて行う。精製
の際の指標には、分子量、抗体を用いたイムノアッセ
イ、セルソータ解析及びアポトーシスの阻害活性等を用
いる。

【００２９】しかしながら、本発明の新規ポリペプチド
は、ヒト由来の他の夾雑タンパクを含まないこと、生産
量あるいは生産されたタンパクの均一性の面から遺伝子
工学的に生産されたものであることが好ましい。本発明
の新規ポリペプチドを遺伝子工学的に産生させる方法と
しては、上述した本発明の第１の態様の新規ＤＮＡ、も
しくは第３の態様の組換えＤＮＡ分子を用いて適当な宿
主を形質転換し、得られた形質転換体を培養して培養混
合物を回収し、その後精製を行う。また、本発明の第１
の態様の新規ＤＮＡや組換えＤＮＡ分子を使用して、無
細胞系で合成する方法（サムブルックＪ．(Sambrook
J.) 等: Molecular Cloning 2nd ed.,Cold Spring Harb
or Laboratory, ニューヨーク（New York）, 1989年，
参照）によって得てもよい。遺伝子工学的に本発明の新
規ポリペプチドを製造する好ましい方法は、後述する本
発明の第５の態様で説明する。

【００３０】近年の技術開発により、ポリペプチドを様
々に修飾することが可能となった。例えば、ポリエチレ
ングリコール、スチレン−マレイン酸コポリマー、デキ
ストラン、ピランコポリマー、ポリリジン等の高分子、
多糖類やタンパクなどの天然高分子、ホルモン等の生理
活性分子、マグネタイト等の無機物質等に結合させるこ
とができるようになった（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 84巻, 1487-1491頁（1981年）; Biochemistry, 28
巻, 6619-6624 頁（1989年））。ポリペプチドにポリエ
チレングリコールを結合させる方法の一例を以下に簡単
に説明する。まず、ポリペプチドが失活しない範囲の塩
基性pHの緩衝液にポリペプチドを溶解する。この溶液
に、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジル
サクシネートのような活性化ポリエチレングリコールを
混合し、室温で一定時間反応させ、ポリペプチドにポリ
エチレングリコールを結合させる。その後、ゲル濾過等
によって活性を有する画分を分取する。本発明の新規ポ
リペプチドも上述のような公知の方法の組み合わせによ
って上述のような修飾が可能である。従って、本発明の
新規ポリペプチドには、本発明第２の態様のポリペプチ
ドの特徴を完全には失わない限り、このような修飾を受
けたものあるいは他のポリペプチドとの融合体等も含ま
れる。

【００３１】本発明の新規ポリペプチドは、Ｆａｓバリ
アントを発現するように形質転換された組換え体の培養
上清やライセートから得られ、安定した生産量が期待で
きるため、医薬組成物の有効成分として特に有用と考え
られる。また、本発明の新規ポリペプチドは、配列番号
１のアミノ酸配列の一部を含むことを特徴とする。本発
明第２の態様のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸
配列中の一部分であればよく、大きさも特に限定されな
い。前述のように、本発明の新規ポリペプチドは、アポ
トーシスの制御において重要な機能を果たしていると考
えられる。そして、一般的なポリペプチドの性質から見
て、本発明の新規ポリペプチドの一部であっても同一の
機能を保持する場合がある。従って、配列表の配列番号
１のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドは、それ自
体を医薬品の有効成分として使用することができる。

【００３２】本発明の新規ポリペプチドは、Ｆａｓ抗原
の細胞外領域と相同性を有しているためにＦａｓリガン
ドとＦａｓ抗原との結合を拮抗的に阻害してアポトーシ
スの誘導を阻害し得る。従って、例えば、肝炎等の重篤
な感染症時の際に肝細胞のアポトーシスの誘導を妨げ、
主要臓器・組織における細胞の急激な減少を防ぐことに
よってこれらの組織・臓器の機能の低下を防止すること
ができる。加えて腎炎、多臓器不全、移植の際の臓器保
全にも有効である。また、本発明の新規ポリペプチド
は、本発明の新規ポリペプチドを認識する抗体を得るた
めの抗原として有用である。このような抗体は、本発明
の新規ポリペプチドを精製する際のアフィニティークロ
マトグラフィー用カラムの作製に使用することができ
る。

【００３３】次に、本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ
分子について説明する。本発明の第３の態様の組換えＤ
ＮＡ分子は、上述した本発明の第２の態様の新規ＤＮＡ
を含むことを特徴とする。本発明の新規組換えＤＮＡ分
子は、環状、直鎖状等、いかなる形態のものであっても
よく、また、いかなる用途に使用されるものであっても
よい。例えば、本発明の第１の態様の新規ポリペプチド
を産生させる際に用いるものであってもよいし、本発明
第２の態様の新規ＤＮＡを増幅させ量産するために用い
るものであってもよい。本発明の新規ＤＮＡ分子に含ま
れる本発明の新規ＤＮＡは、その塩基配列の５’末端、
あるいは３’末端のいずれか一方、もしくはその両方に
任意の１つ以上の塩基が付加されたものであってもよ
い。ここで付加される塩基は、本発明の新規ＤＮＡに、
コーディングフレームのずれを生じさせない限りいかな
るものであってもよく、例えば、リンカー配列、シグナ
ル配列をコードする塩基配列、β−ガラクトシダーゼ等
の他のポリペプチドをコードする塩基配列、もしくはＤ
ＮＡプローブ等を作製する際にその検出感度の増加を目
的として付加される配列等を挙げることができる。

【００３４】本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明の第
１の態様の新規ＤＮＡに加えて、必要により他の塩基配
列を有していてもよい。ここでいう「他の塩基配列」と
は、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾ
ーム結合配列、ＤＮＡのコピー数の増幅を目的として使
用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基
配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ
付加配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子等を
いう。どのような塩基配列が必要となるかは、作製する
組換えＤＮＡ分子の使用目的によって定まるが、少なく
とも、本発明の第１の態様の新規ＤＮＡに加えて複製開
始点と選択マーカーを有していることが好ましい。マー
カー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマ
イシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジン
キナーゼ遺伝子等を挙げることができる。コピー数の増
幅を目的として使用される配列としては、デヒドロ葉酸
レダクターゼ遺伝子（以下、dhfrと表す）の配列等を使
用することができる。

【００３５】本発明の組換えＤＮＡ分子の好ましい例
は、本発明の第２の態様の新規ポリペプチドを発現する
ように大腸菌を形質転換させ得るものである。従って、
本発明の組換えＤＮＡ分子は、少なくとも、大腸菌の複
製開始点、マーカー配列に加えて大腸菌内部で機能する
プロモーター配列を有していることが好ましく、さらに
シグナルペプチドをコードする配列を有していることが
好ましい。大腸菌で機能する好適なプロモーター配列と
しては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター等で
あり、大腸菌で機能するシグナルペプチドとしては、大
腸菌のアルカリフォスファターゼのシグナルペプチドが
好適である。

【００３６】また、本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発
明の第２の態様の新規ポリペプチドを発現するように動
物細胞あるいは酵母等の真核細胞を形質転換させるもの
であってもよい。この場合には、本発明の組換えＤＮＡ
分子は、少なくとも、マーカー遺伝子に加えてポリＡ付
加配列を有していることが好ましい。これらの配列に加
えて、さらに動物細胞で機能するＳＶ４０のプロモータ
ー、ヒト伸長因子（Elongation Factor 1α（EF 1
α））のプロモーター、ＳＲαプロモーターを有するも
の、酵母で機能するアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ
１）のプロモーターを有するもの、ＳＶ４０の複製開始
点及びプロモータを有するもの等も本発明の組換えＤＮ
Ａ分子の好適な例として挙げられる。

【００３７】本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子
は、本発明の第１の態様の新規ＤＮＡを任意の塩基配列
を有する他のＤＮＡ断片とライゲーションする方法、ま
たは任意のベクターに導入する方法（サムブルック
Ｊ．（Sambrook J. ）等: Molecular Cloning, a Labor
atory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laborator
y,ニューヨーク(New York), 1989年, 参照）等で得るこ
とができる。宿主細胞が有する適当なプロモーターの下
流に、本発明の第１の態様のＤＮＡが組み込まれれば、
宿主細胞は、本発明第２の態様の新規ポリペプチドを生
産するようになる。このような形質転換体は、本発明第
２の態様の新規ポリペプチドを生産するために使用する
ことができる。具体的には、ＤＮＡとベクターとをそれ
ぞれ適当な制限酵素で消化して、得られた各断片をＤＮ
Ａリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。ベク
ターとしては、プラスミドベクター、ファージベクタ
ー、ウイルスベクター等いかなるものでもよく、市販品
を利用してもよい。ベクターの代表的なものとしては、
ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ＰＨＩＬ−Ｓ１、λＺａｐ
ＩＩ、λｇｔ１０、ｐＡｃ７００、ＹＲＰ１７、ｐＥＦ
−ＢＯＳ、ｐＥＦＮ−ＩＩ等が挙げられる。

【００３８】次に、本発明の第４の態様の形質転換体に
ついて説明する。本発明の形質転換体は、本発明の第３
の態様の組み換えＤＮＡ分子で形質転換されたことを特
徴とする。すなわち、本発明の形質転換体は、本発明の
第３の態様の組換えＤＮＡ分子を、宿主となる細胞や微
生物に導入する事によって得ることができる。宿主細胞
に組換えＤＮＡ分子を導入する方法としては、エレクト
ロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属
法、リン酸カルシウムゲル法、ＤＥＡＥデキストラン
法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用い
てインフェクションさせる方法、その他の公知方法（実
験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック1991年3 月20
日発行、羊土社、参照）を挙げることができ、いずれの
方法を用いて導入してもよい。

【００３９】本発明の形質転換体は、本発明の第１の態
様の新規ＤＮＡを大量に得ることを目的として使用する
ことができる。また、上述のように、本発明の第１の態
様の新規ＤＮＡを適当なプロモーターの制御下に連結
し、宿主細胞を組換えて得た形質転換体は、本発明の第
２の態様の新規ポリペプチドを産生するようになる。ま
た、本発明の組換えＤＮＡ分子の機能を充分に発揮させ
るためには、本発明の組換えＤＮＡ分子の作成に使用す
るベクターは、宿主細胞に適した種類のものでなければ
ならない。組換えＤＮＡ分子に使用したベクターと宿主
との好ましい組合わせの例としては、ｐＵＣ１１８と大
腸菌、ｐＥＦ−ＢＯＳとＣＯＳ細胞あるいはＣＨＯ細
胞、Ｙａｃと酵母、ＡｃＮＰＶとＳｆ細胞等（実験医学
臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック1991年3 月20日発
行、羊土社、参照）を挙げることができる。同様に、組
換えＤＮＡ分子に含まれるプロモーター、シグナルペプ
チドをコードする塩基配列、マーカー遺伝子等も宿主に
適したものを使用する。本発明の形質転換体は、原核細
胞、真核細胞等いかなる細胞を形質転換したものであっ
てもよいが、ＣＨＯ細胞等の動物細胞；大腸菌、酵母等
を形質転換したものが例示される。これらの中でも、外
来タンパクの発現量の多い大腸菌や酵母が好ましく、修
飾が起こらない点で特に大腸菌が好ましい。

【００４０】本発明の第４の態様の形質転換体は、本発
明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子を大量に製造する目
的や、本発明の第２の態様の新規ポリペプチドを製造す
る目的等に使用できる。本発明の形質転換体はいかなる
目的で使用するものであってもよいが、本発明の新規ポ
リペプチドを産生するものが好ましく、本発明の新規ポ
リペプチドを培養液中に分泌するものであることがさら
に好ましい。

【００４１】本発明の第５の態様の製造方法は、本発明
の第４の態様の形質転換体を使用することを特徴とする
本発明の第２の態様の新規ポリペプチドの製造方法であ
る。形質転換体の作製方法については上述した通りであ
る。本発明の製造方法においては、本発明の第４の態様
の形質転換体を培養し、必要に応じて遺伝子の発現誘導
や増幅を行う。次いで混合培養物を回収し、濃縮、可溶
化、透析、各種のクロマトグラフィー等の操作を適宜組
み合わせて、本発明の新規ポリペプチドの精製を行う。
形質転換体の培養は、各種の成書を参考にして、一般的
な手法で行うことができる（例えば、「微生物実験法」
社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行、
1992年、参照）。遺伝子の発現誘導を行う場合には、組
み込まれたプロモーターによって適当な薬剤を選択して
使用する。例えば、ｔｒｐプロモーターが組み込まれて
いる場合には３β−インドールアクリル酸を用い、ＭＭ
ＴＶプロモーターの場合にはデキサメタゾンを、またＡ
ＯＸ１プロモーターの場合にはメタノールをそれぞれ使
用するとよい。遺伝子の増幅を行う場合の代表的な例と
しては、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞を宿主とし、ｄｈｆｒ
を有するベクターを使用した際にメトトレキセートを使
用する場合等が挙げられる。

【００４２】本発明の第５の態様において、「培養混合
物」とは、培養上清または細胞のライセートをいい、産
生された上記の新規ポリペプチドが細胞培養上清中に分
泌される場合は、培養上清から上記ポリペプチドを精製
できる。本発明の形質転換体は本発明の新規ポリペプチ
ドを分泌するものが好ましいが、分泌しない場合もしく
はその量が少ない場合には、リゾチーム、界面活性剤、
凍結融解、加圧等の方法から宿主細胞に適したものを適
宜選択して細胞を破砕した後、遠心分離、濾過等の方法
により上記ポリペプチドを抽出し、精製する。宿主細胞
が大腸菌であって、上記新規ポリペプチドがペリプラズ
ムに蓄積される場合には、ウィルスキー（Willsky ）等
の方法（J. Bacteriol., 127巻, 595-609 頁、1976年）
を採用して上記ポリペプチドを回収することができる。

【００４３】上述の培養混合物から本発明の第２の態様
の新規ポリペプチドを精製する方法としては、通常ポリ
ペプチドの精製に使用されている方法のなかから適当な
方法を適宜選択して行う。具体的には、塩析法、限外濾
過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや
抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティクロマト
グラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマト
グラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用
される方法の中から適切な方法を適宜選択し組み合わ
せ、必要によりＨＰＬＣシステム等を用いて精製を行え
ば良い。なお、大腸菌を使用して、本発明の新規ポリペ
プチドを、インクルージョンボディーとして産生させた
場合には、精製の際に適当なステップにおいて、可溶
化、デネイチャー、リフォールディングの操作を行う
（トマス E. 及びクライトンJ.(Thomas E. and Creight
on J.): Molecular Biology, 87巻, 563-577 頁、1974
年）。

【００４４】次に、本発明の第６の態様の新規抗体につ
いて説明する。本発明の第６の態様の新規抗体は、本発
明の第２の態様の新規ポリペプチドと結合することを特
徴とし、この特徴を有する限り、モノクローナル抗体で
あっても、ポリクローナル抗体であってもよい。抗体、
すなわち、免疫グロブリンの構造は、Ｈ鎖とＬ鎖とから
なり、物理化学的性質や免疫学的性質は、５つのクラス
（IgG, IgA, IgM, IgD, IgE ）に分けられ、このうち、
ＩｇＧ、ＩｇＡはさらにＨ鎖のタイプによって、サブク
ラスに分けられる。本発明の新規抗体は、これらのいず
れのクラス、サブクラスのいずれに属するものであって
もよい。さらに、免疫グロブリンは例えばペプシンで分
解すると、Ｆ（ａｂ’）₂とＦｃ’に、また、パパイン
で分解するとＦａｂとＦｃの２つのフラグメントに分か
れる。本発明の新規抗体は、抗原と結合するものであれ
ば、完全な抗体分子でもあってもよく、上述のような一
部のフラグメントであってもよい。また、本発明の新規
抗体はキメラ抗体であってもよい。

【００４５】本発明の新規抗体は、それがポリクローナ
ル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよ
く、公知の方法を参考にして得ることができる（例え
ば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発
行、参照）。以下に簡単に、その方法を説明する。本発
明の新規抗体を得るには、まず、動物に免疫抗原として
本発明の第２の態様の新規ポリペプチドを接種する。接
種は、必要に応じてフロイントの完全アジュバント（Ｆ
ＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジ
ュバントとともに行ってもよい。また、必要があれば２
〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後に採血を行
い、抗血清を得る。抗原として用いる本発明の新規ポリ
ペプチドは、抗体の精製用に使用しうる精製度のもので
ある限り、いかなる方法で得られたものであってもよ
い。また、免疫抗原として本発明のポリペプチドの一部
の１０〜２０アミノ酸からなるペプチドを合成し、この
ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）等のキャリアと結合させて使用し、本発明のポリペ
プチドと結合する抗体を選別してもよい。本発明の新規
ポリペプチドで免疫する動物は、いかなる種であっても
良いが、通常、免疫学的な実験に使用されるラット、マ
ウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、
ウシ等の中から目的の抗体を産生しうる動物種を選択し
て使用することが好ましい。

【００４６】ポリクローナル抗体は、上述の様にして得
られた抗血清を精製して得ることができる。抗血清を、
塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィー等の公知の方法を適宜組み合わせて精
製し、ポリクローナル抗体を得ることができる。モノク
ローナル抗体は、以下のようにしてを得ることができ
る。すなわち、免疫した動物から脾細胞またはリンパ球
等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、
センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によ
って、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを
作製する。その後、本発明の第２の態様の新規ポリペプ
チドに結合する抗体を産生しているクローンを選択して
培養し、その選択されたクローンの培養上清より、モノ
クローナル抗体を精製する。モノクローナル抗体は、塩
析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて精製す
る。

【００４７】また、遺伝子工学的な方法を用いても本発
明の新規抗体が得られる。具体的には、以下のようにし
て行う。すなわち、本発明第２の態様の新規ポリペプチ
ドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明
第２の態様の新規ポリペプチドに対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、
これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と
反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニング
し、得られたクローンを培養し、その培養混合物から目
的とする抗体を上述のような公知の方法を組み合わせ
て、精製することができる。

【００４８】本発明の新規抗体は、体液中や組織中に存
在する本発明の新規ポリペプチドを検出するために使用
することができる。また、本発明の新規ポリペプチドを
精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各
分画中の本発明の新規ポリペプチドを検出するために使
用することができる。

【００４９】

【実施例】以下に、実施例をもって本発明を一層具体的
に説明するが、これらは一例として示すものであり、本
発明はこれらにより何等限定されるものではない。ま
た、以下の記載において用いる略号は、当該分野におけ
る慣用略号に基づくものである。なお、以下に示す実施
例中の諸操作は、主に下記の雑誌、成書を参考として実
施した。

【００５０】１．マニアティスＴ．(Maniatis T.)
等：Molecular Cloning; a LaboratoryManual, Cold Sp
ring Harbor Laboratory, ニューヨーク（New York）,
1982年２．ミカエル A.I（Michael A.I.）等編、Polymerase C
hain Reaction, PCRProtocols, a guide to methods an
d applications(1990年) 、アカデミック出版（Academi
c Press）３．サムブルックＪ．(Sambrook J.) 等: Molecular
Cloning 2nd ed.,ColdSpring Harbor Laboratory, ニ
ューヨーク（New York）, 1989年４．実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック1991年
3 月20日発行、羊土社５．「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会
社東京化学同人発行、1992年６．トマス E. 及びクライトン J.(Thomas E. and Crei
ghton J.): MolecularBiology, 87巻, 563-577 頁、197
4年７．免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発
行

【００５１】（１）ヒトＦａｓ抗原バリアント分子の存
在の確認正常ヒト肝の全ＲＮＡは、部分摘出ヒト肝臓よりグアニ
ジン−イソチオシアナート／酸フェノール法で調製し
た。上述のようにして得た正常ヒト肝の全ＲＮＡを用い
て、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）により目的とする
ＤＮＡの増幅を行った。すなわち、ヒトＦａｓ抗原ｃＤ
ＮＡの塩基配列（イトウＮ．(Itoh N.) 等、 Cell, 6
6 巻，233-243 頁、1991年）をもとに、ヒトＦａｓ抗原
ｃＤＮＡの細胞外領域の一部分を、増幅可能な一対のオ
リゴヌクレオチドプライマー（プライマー１及びプライ
マー２）を設定し、上述の正常ヒト肝の全ＲＮＡを用い
て逆転写ＰＣＲ法により増幅させた。ここで使用するプ
ライマー１は、Ｎｔ３５６−３８０（５’−ＴＧＡＴＧ
ＧＣＣＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＴＡＡＧ−３’）であり、
プライマー２はＮｔ４２６−４０３（５’−ＣＣＡＴＴ
ＧＡＣＴＧＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＡＧ−３’）である
（それぞれ、イトウＮ．(Itoh N.) 等 Cell, 66 巻,
233-243 頁、1991年）。

【００５２】１）逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）ＲＴ−ＰＣＲは下記のように行った。まず、１μｇのヒ
ト肝の全ＲＮＡと０．２μｇのプライマー２を滅菌水中
にて７０℃で１０分間加温し、その後氷水中で急冷し
た。この溶液に、４種のデオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸（deoxyribonucleotide triphosphate(dNTP)、ファ
ルマシア社製）をそれぞれ終濃度５００μＭになるよう
に加え、２０ユニット（unit) のリコンビナントMoMuLV
逆転写酵素（Superscript II、ＢＲＬ社製）、この酵素
に添付された５×バッファー及び０．１Ｍのジチオスレ
イトール（DTT ）を最終濃度が０．０１Ｍとなるように
加えて、最終容量を１５μｌとした（ＲＴ反応溶液）。
その後、上述の各成分を含むＲＴ反応溶液を４５℃で１
時間反応させ、逆転写反応を行った。逆転写反応の終了
後、上記のＲＴ反応溶液のうちの２．５μｌを用いてＰ
ＣＲ反応を行った。反応溶液の残りは−８０℃で保存
し、後述する操作に使用した。

【００５３】ＰＣＲ反応は、１ｕｎｉｔのＴａｑポリメ
ラーゼ及び５μｌのＴａｑポリメラーゼに添付された１
０×反応液（ベーリンガーマンハイム（Boehringer
Mannheim）社製）、４μｌの２５ｎＭＭｇＣｌ₂、５
μｌの２ｍＭｄＮＴＰ、各１μｇのプライマー１およ
び２を含む最終容量５０μｌのＰＣＲ反応溶液中で行な
った。５０μｌのミネラルオイルを上記ＰＣＲ反応液に
重層し、サーマルサイクラーＰＣ７００（アステック社
製）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲサイクルは、９
５℃で１分間、６２℃で１分間そして７５℃で３０秒を
１サイクルとして、３５サイクル行った。最終サイクル
の終了後、反応溶液を７５℃で２分間保温し、次いで４
℃まで冷却し、反応を停止させた。重層したミネラルオ
イルを１００μｌのエーテルで２回抽出して除去し、上
記ＰＣＲ反応溶液を４％のポリアクリルアミドゲル（３
９：１のアクリルアミドモノマー：ビスアクリルアミ
ド）の電気泳動を行い産物を分離し、０．５μｇ／ｍｌ
濃度のエチジウムブロマイドで染色した。結果を図１に
示す。図１に示したように、７１ｂｐの位置に主産物の
バンドが認められたが、このバンドは、既知の膜結合型
Ｆａｓ抗原由来の産物であると推定された。

【００５４】２）ＲＴ−ＰＣＲ産物を用いたクローンの
単離主産物以外のバンドは、生成量が少ないために明瞭に認
められなかったものもあると考えられたので、主産物よ
り易動度の小さい部分（すなわち分子量の大きい約１５
０ｂｐ程度までの領域）のポリアクリルアミドゲルを切
り出してエレクトロフォレティックコンセントレータ
モデル７５０（ＩＳＣＯ社）を使いＴＢＥバッファー中
で１Ｗで２時間通電して抽出した。抽出液をフェノール
処理、クロロホルム処理した後、エタノール沈殿により
精製し、この部分に含まれているＤＮＡ断片を回収し
た。抽出したＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩで切断し
たプラスミドベクターｐＵＣ１１８にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いてブラントエンドライゲーション法により連
結して組込み、Ｒｂ法（サムブルックＪ．，モレキュ
ラークローニング，１９８９年、参照）で調製した大腸
菌コンピテントセルＮ３８にトランスフォーメーション
し多数のクローンを得た。これらのクローンについて、
常法に従い、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア
社製）を用いたジデオキシチェーンターミネイション法
を用いて［³²Ｐ］ｄＣＴＰ標識により塩基配列の決定を
行った。

【００５５】３）クローンの塩基配列の決定得られたクローンのうち３２個について塩基配列決定を
行ったところ、既知のＦａｓ−ｃＤＮＡと全く配列の異
なる１６個のリコンビナントクローンが独立に得られ
た。これら１６個のクローンのうち、９個のクローンは
プライマー１や２すらも全く有さず、配列もＦａｓ−ｃ
ＤＮＡと無関係であったため、アーチファクトとして廃
棄した。残りの７クローンは、プライマー１とプライマ
ー２の塩基配列を持ち、同一の塩基配列を持っていた。
その結果を図２に示す。

【００５６】図２には、ヒトＦａｓ抗原バリアントｃＤ
ＮＡを含むクローンより得られた部分的塩基配列を、既
知のＦａｓ抗原と共に示した。図２に示すように、これ
らのクローンの塩基配列は、既知の膜結合型Ｆａｓ−ｃ
ＤＮＡと大部分一致したが、既知の膜結合型Ｆａｓ−ｃ
ＤＮＡの塩基配列のほぼ中央部にある・・・・ＣＣＴＣ
ＣＡＧの後にＧＣＡＧという４塩基の挿入があり、この
後に引き続いてＧＴＧＡＡＡＧＧ・・・・と既知の配列
が続いていた。このような挿入塩基を有するクローンを
Ｆａｓ抗原バリアントと命名した。

【００５７】４）Ｆａｓ抗原バリアントのアミノ酸配列図３及び配列表の配列番号１に示すように、上述のよう
にして得られたＦａｓ抗原バリアントのアミノ酸配列に
よれば、既知の膜結合型Ｆａｓ抗原のアミノ酸配列の５
１番目のＧｌｕの替わりにＡｒｇが導入されており、こ
の直後に停止コドンＴＧＡが位置していた（配列表の配
列番号１）。従って、既知のＦａｓ抗原が膜貫通部位を
有する３１９アミノ酸よりなる典型的な膜タンパクであ
るのに対し（図９）、上記のＦａｓ抗原バリアントは、
シグナル部分を除いてわずか５１個のアミノ酸より構成
されていた。また、上記のＦａｓ抗原バリアントは、既
知のＦａｓ抗原のＮ−末端側に位置しており、細胞外ド
メインの一部と同じ配列を共有し、Ｃ末端側にアルギニ
ン残基を付加した形となった。また、上記のようなＦａ
ｓ抗原バリアントには、膜を貫通するのに必要な連続し
た疎水性アミノ酸領域は存在せず、分泌可能な天然に存
在する可溶型の分子となっている。

【００５８】（２）ヒトゲノム上におけるＦａｓ抗原バ
リアント生成のメカニズムヒトＦａｓ抗原のｍＲＮＡには、膜結合型の他にそれに
４塩基の挿入されたバリアント型が混在することが上述
の（１）の解析により明らかとなった。この様な４塩基
の挿入がゲノム上で起こるメカニズムとしては、主とし
て次の三つの可能性がある。すなわち、ａ）スプライス
供与部の選択、ｂ）スプライス受容部の選択、ｃ）わず
か４塩基より構成され選択的に利用される独立したエキ
ソンの存在である。このメカニズムを明らかにするため
に、ヒトゲノムライブラリーをＦａｓ抗原−ｃＤＮＡの
細胞外ドメインをコードする領域をプローブとしてスク
リーニングした。

【００５９】１）ヒト染色体ＤＮＡライブラリーのスク
リーニングヒト（胎盤）染色体ＤＮＡファージライブラリー（ＥＭ
ＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ）社）を指示菌（ＮＭ５３８）に感染させ、軟寒天
と混合し、寒天プレートに重層した。３７℃にて一晩イ
ンキュベーションし、ファージプラークを形成された。
これを一旦、４℃で約１時間冷却し、その後、ファージ
をニトロセルロースフィルターに転写した。一方、実施
例（１）−１）で得たヒト肝由来ｃＤＮＡを鋳型とし
て、センスプライマー３（ＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＴ
ＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴ）およびアンチセンスプライマ
ーＦ−Ａ７０３（２２）（ＧＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴ
ＴＧＣＡＣＴＴＧＧ）配列を作製し、これらを用いてＲ
Ｔ−ＰＣＲを行い、細胞外ドメインをコードする約３５
０ｂｐのｃＤＮＡを増幅させた。ランダムプライマーラ
ベリングキット（日本ジーン社製）を使用して説明書に
従い増幅産物を［³²Ｐ］標識し、プローブを調製した。
このプローブとニトロセルロースフィルターをハイブリ
ダイズさせた。すなわち、フィルターを５０％ホルムア
ミド、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、２５０μ
ｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む５×ＳＳＣ中で、
４２℃で６時間プレハイブリダイゼーションした。次
に、５０％ホルムアミド、１×デンハルト溶液、０．１
％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１
０％（Ｗ／Ｖ）デキストラン硫酸を含む５×ＳＳＣに上
述のプローブを１．０×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌとなるよう
に添加し、前記フィルターを４２℃で１８時間ハイブリ
ダイゼーションさせた。０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳ
Ｃを用い、室温で２回フィルターを洗浄し、次いで、
０．１％ＳＤＳを含む０．３×ＳＳＣを用い、３７℃で
３回洗浄した。オートラジオグラフィーを行なったとこ
ろ、多数のポジティブクローンが検出された。得られた
ポジティブクローンのうち２つのクローンλｈＦａｓ１
およびλｈＦａｓ２から公知の方法(Sambrook J.等、Mo
lecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed.Cold
Spring Harbor Laboratory, New York, 1989 年) に従
いファージＤＮＡを調製した。

【００６０】２）ゲノムクローンλｈＦａｓ１の解析Ｆａｓ抗原ゲノムＤＮＡクローンλｈＦａｓ１を制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩで切断し、次いでｐＵＣ１１８をＢａｍ
ＨＩで切断してクローニングサイトを形成し、このクロ
ーニングサイトに上記の２つのうちクローンλｈＦａｓ
１をショットガンサブクローニングした。前記１）で調
製したｃＤＮＡをプローブとして上述した方法で陽性ク
ローンを選択し、塩基配列を解析した。結果を図４及び
配列表の配列番号３に示す。図４には、ヒトゲノム内に
おける４つの塩基挿入配列直前部分のエクソン−イント
ロン領域の塩基配列を、エクソンの塩基配列を大文字
で、また、イントロンの塩基配列を小文字でそれぞれ示
した。イントロンの塩基配列の最上流部にはスプライス
供与部コンセンサス配列gtatgt--- が見られた。図４に
示すように、このクローンの塩基配列解析の結果から、
Ｆａｓ抗原バリアントの４塩基の挿入のあった部位は、
エキソン−イントロン接合部であることが明らかになっ
た。また、このゲノムクローンは挿入配列の部分より上
流域のエキソンを含むものであった。しかしながら、問
題の４塩基配列は、エキソン部分に直接引き続いては出
現しなかった。

【００６１】３）ゲノムクローンλｈＦａｓ２の解析もうひとつのゲノムクローンλｈＦａｓ２から同様な手
法により、Ｓａｕ３ＡＩサブクローンをもとめ塩基配列
を決定した。結果を図５及び配列表の配列番号４に示
す。図５には、ヒトゲノム内における４つの塩基の挿入
配列部分、及びその直前直後の塩基配列を示した。図中
の下線は挿入された塩基配列ＧＣＡＧを示す。この挿入
された塩基配列の直前には、スプライス受容部コンセン
サスからややはずれた-----tttccttggが存在していた。
図５に示すように、ゲノムクローンλｈＦａｓ２には、
図４に引き続くエキソン部分が存在し、その直前部分は
ＧＣＡＧという配列であることが明らかになった。この
配列はバリアントに見られる挿入配列そのものであるた
め、Ｆａｓ抗原バリアントの生成機構は、スプライス受
容部の選択によると考えられる。

【００６２】（３）Ｆａｓ抗原バリアントをコードする
ｍＲＮＡのｃＤＮＡクローンの分離ヒトＦａｓ抗原のｃＤＮＡの塩基配列をもとに、新たに
２種のプライマー、プライマー３（５’−ＧＣＴＣＡＡ
ＣＡＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴ−３’）とプラ
イマー４（５’−ＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡ
ＣＡＧＧＧＣＴＴＡ−３’）を設定し、実施例（１）−
１）で得たヒト肝ｃＤＮＡより、（１）と同様にＰＣＲ
法を行い増幅させた。結果を図６に示す。

【００６３】図６に示すように産物のサイズは約２２０
ｂｐであり、Ｆａｓ抗原バリアントの上流域が膜結合型
と同一であると仮定した産物のサイズである２１６ｂｐ
と全く矛盾しなかった。ここで得られた上記のＤＮＡ断
片をポリアクリルアミドゲルから切り出して電気泳動的
に溶出した後、実施例（１）−２）に記載のｐＵＣ１１
８のＳｍａＩ消化ベクターとライゲーションし、Ｒｂ処
理大腸菌コンピテントセルＮ３８にトランスフォーメー
ションした。得られた多数のクローンをシークエンス
し、その結果を図７及び配列表の配列番号５に示す。プ
ラスミドＤＮＡをｐＵｓｈＦａｓ５１と命名し、組換え
大腸菌Ｎ３８（ｐＵｓｈＦａｓ５１）を工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託している。（寄託番号ＦＥＲ
ＭＰ−１４２７８）図７には、比較のため文献に示されたＦａｓ−ｃＤＮＡ
の同一領域の塩基配列が示してあるが、やはりＦａｓ抗
原バリアントにおける４塩基の挿入を除いて両者は完全
に一致した。次いで、図８及び配列表の配列番号３に、
Ｆａｓ抗原バリアントのｍＲＮＡによってコードされる
アミノ酸配列を示す。

【００６４】図８に示すように、−１６のＭｅｔから始
まり−１のＡｌａまで、及び＋１のＡｒｇから＋５０の
Ｇｌｙまでは既知のＦａｓ抗原とＦａｓ抗原バリアント
のアミノ酸配列は完全に一致したが、＋５１以降が相違
した。すなわち、既知のＦａｓ抗原では＋５１よりＧｌ
ｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ・・・・・と連続して行くのに対
し、Ｆａｓ抗原バリアントでは＋５１はＡｒｇであり、
次に停止コドンＴＧＡが位置してポリペチド鎖合成が停
止していた。従ってこの分子は、シグナル配列が切り離
された後に、５１アミノ酸よりなる分子量５，４３０の
分泌型可溶性蛋白質と考えられた。

【００６５】（４）本発明の新規ＤＮＡを使用した、本
発明の新規ポリペプチドの製造１）プラスミドｐＭ４６８の構築以下の実施例で使用する発現ベクター、プラスミドｐＭ
４６８を、プラスミドｐＭ４６３を材料に以下の方法で
作製した。なお、プラスミドｐＭ４６３は、プラスミド
ｐＢＲ３２２の誘導体であり、大腸菌内にて複製する機
能、アンピシリン耐性遺伝子、トリプトファンプロモー
ター、アルカリフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシグナ
ルペプチドおよびヒト膵分泌性トリプシンインヒビター
（以下、ＰＳＴＩと略す）をコードするＤＮＡを有する
プラスミドとして構築されたプラスミドである（カナモ
リＴ.(Kanamori T.)等、Gene, 66巻、295-300 頁、19
88年) 。まず、プラスミドｐＭ４６３を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＮｒｕＩにて二重消化し、得られたＤＮＡ
断片混合物を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、
約３．４ｋｂのＤＮＡ断片をジエチルアミノエチルセル
ロース紙（以後、ＤＥＡＥセルロース紙と略す）に吸着
させ、残りのＤＮＡ断片と分離した。さらに、ＤＥＡＥ
セルロース紙を高濃度塩溶液（２ＭＮａＣｌ／１０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭＥＤＴ
Ａ）にて洗浄し、約３．４ｋｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥ
セルロース紙より回収した。一方、ＳＤ配列、大腸菌ア
ルカリフォスファターゼシグナルペプチドをコードする
塩基配列、ＰＳＴＩのＮ末端側のアミノ酸配列の一部を
コードする塩基配列から成るリンカーを設計し、それを
６つの断片に分割し、各断片を化学合成機（３８１Ａ、
アプライドバイオシステムズ社製）にて合成した（図１
０）。

【００６６】これら６つの断片のうち、Ｓ３４、Ｓ３
５、Ｓ１８、Ｓ１９をＡＴＰの存在下、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼで５’末端をリン酸化した。続いて、オ
リゴヌクレオチドＳ３３とＳ３４、Ｓ３５とＳ１８、お
よびＳ１９とＳ２０をそれぞれアニーリングさせた後、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を使用してライゲ
ーションした。ライゲーション後のサンプルを８％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に供し、約１００ｂｐのＤ
ＮＡ断片（リンカー１）を分離、調製した。次に上記の
約３．４ｋｂのＤＮＡ断片とこの約１００ｂｐのＤＮＡ
断片をライゲーションし、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換させ、所望のアンピシリン耐性コロニーを分離した。
得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、プ
ラスミドｐＭ４６８と命名した。

【００６７】２）プラスミドｐＭ１０５９の構築得られたプラスミドｐＭ４６８をさらにＨｉｎｄIII 、
ＢａｍＨＩで二重消化し、０．８％ローメルティングア
ガロースゲル（シーケムＧＴＧ（SeakemGTG)、宝酒造社
製）で分離し、目的とするＤＮＡ断片を含むゲルを切り
出した。６５℃にてアガロースを融解させフェノール処
理しエタノール沈殿により目的のＤＮＡ断片を抽出・精
製し、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、
プラスミドｐＭ４６８を鋳型に、ＢｓｔＥII／Ｋｐｎ
Ｉ、ＢａｍＨＩサイトを有するように設計したアンチセ
ンスプライマーＡ−Ｂｓｔ−ｐｈｏ（３９）（ＣＧＣＧ
ＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＡＣＣＧ
ＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧ）とトリプロファンプロモーター
のＨｉｎｄIII サイト上流に位置するセンスプライマー
ｔｒｐＳ３３３（ＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡ
ＡＧＣ）を化学合成し、ＯＰＣカラム（アプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて精製し、さらに逆相ＨＰＬ
Ｃで精製したのち、ＰＣＲを行なった。すなわち、上述
のＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡを含む溶液１００μｌ中に上記
のプライマーを添加し、ジーンアンプキット（Gene Amp
^TM DNA Amplification Reagent kit with AmpliTaq^TM、
宝酒造社製）により、９４℃１分間、５５℃２分間、７
２℃３分間を１サイクルとして、３０サイクルのＰＣＲ
を行なった。ＰＣＲ終了後の増幅産物を、２％アガロー
スゲル電気泳動に供したところ、目的とする約１２０ｂ
ｐのサイズの単一のバンドが確認された。得られた増幅
産物をＨｉｎｄIII 、ＢａｍＨＩで二重消化し４％ロー
メルティングアガロースゲル（既述）を用いた電気泳動
で分離し約１２０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出、精製し調製
した。この断片を上述したプラスミドｐＭ４６８由来の
約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ
１０９にトランスフォーメーションすることにより、プ
ラスミドｐＭ１０５９を得た。

【００６８】３）発現プラスミドｐＭ１０６５の構築得られたプラスミドｐＭ１０５９をさらにＢｓｔＥII、
ＢａｍＨＩで二重消化し、０．８％ローメルディングア
ガロースゲル（既述）で分離し約３．３ｋｂｐのＤＮＡ
断片を調製した。また、プラスミドｐＵｓｈＦａｓ５１
を鋳型に、５１アミノ酸をコードするヒトＦａｓ抗原バ
リアンドｃＤＮＡを組み換えられるように、ＢｓｔＥII
サイトとＦａｓ抗原Ｎ末端配列を有するセンスプライマ
ーＢｓｔ−ｐＡ−ｓＦ（２８）（ＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣ
ＡＡＡＧＣＣＡＧＡＴＴＡＴＣＧＴＣＣ）とＢａｍＨＩ
サイトと終止コンドＴＧＡを有するアンチセンスプライ
マーＡ−ｖａｒＦ（３０）（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡ
ＴＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡ）を化学合成
し、ＯＰＣ、ＨＰＬＣにより精製した。上述したように
１００μｌの反応液、９４℃１分間、５５℃２分間、７
２℃３分間を１サイクルとして、３０サイクルのＰＣＲ
を行なった。ＰＣＲ終了後の増幅産物を２％アガロース
ゲル電気泳動に供したところ、目的とする約２００ｂｐ
のサイズの単一バンドが確認された。得られた増幅産物
をＢｓｔＥII、ＢａｍＨＩで二重消化し、２％ローメル
ティングアガロースゲル電気泳動で分離し、約１９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を調製した。これを上述したプラスミド
ｐＭ１０５９由来の約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片とライ
ゲーションし、大腸菌ＤＨ５にトランスフォーメーショ
ンすることにより発現プラスミドを得、プラスミドＤＮ
Ａを調製した。ＤＮＡシーケンサー（ＤＮＡシーケンサ
ー３７３Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）にて、
このプラスミドＤＮＡのシーケンシングを行い、目的と
する塩基配列を有することを確認し、ｐＭ１０６５と命
名した。

【００６９】４）形質転換体の作製および培養上記発現用プラスミドｐＭ１０６５を用い、ハナハンの
方法（Hanahan, D. 著、Techniques for Transformatio
n of E. Coli, In: DNA cloning, vol.1, Glover, D.
M.(ed.), 109-136 頁、ＩＲＬ出版（IRL Press), 1985
年）により大腸菌ＪＥ５５０５株を形質転換し、大腸菌
ＪＥ５５０５（ｐＭ１０６５）を作製した。得られた形
質転換体それぞれを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ
−ブロース５ｍｌにて終夜培養した。次いで、５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含む、５０倍量のＭ９ＣＡ培地
に、この培養液を植菌し、３７℃にて約１時間培養した
後、培地に終濃度１０μｇ／ｍｌの３β−インドールア
クリル酸（和光純薬工業社製）を添加し、さらに１６時
間培養した。得られた培養混合物を遠心分離器（ＣＲ２
０Ｂ３、日立工機社製）を使用して遠心分離し、上清を
回収した。

【００７０】５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による新規ペプチドの確認得られた培養上清をラエムリ（Laemmli ）の方法（Laem
mli U. K., Nature, 227巻、680-685 頁、1970年）を参
考にして、以下の方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）に供した。
まず、上記培養上清に等容量のセプラゾールII（第一化
学薬品社製）を加えて、１００℃で５分間加熱処理を行
なった。熱処理後のサンプルを１５％ゲル（５ｃｍ×９
ｃｍ、厚さ１ｍｍ）にアプライし、１５ｍＡにて６０分
間、ついで３０ｍＡにて３５分間の電気泳動を行なっ
た。なお、分子量マーカーとしては、市販のキット（エ
レクトロフォレーシスキャリブレーションキット(Ele
ctrophoresis Calibration Kit) 、ファルマシア社製）
を使用した。泳動終了後、市販の銀染色キット（２Ｄ−
銀染色試薬・II「第一」、第一化学薬品社製）にて染色
を行なった。その結果、ＪＥ５５０５の培養上清には認
められないバンドがＪＥ５５０５（ｐＭ１０６５）の培
養上清において認められた。

【００７１】

【発明の効果】本発明により、ヒトＦａｓ抗原の細胞外
領域の一部である天然に存在するヒトＦａｓ抗原バリア
ントが提供された。本発明のヒトＦａｓ抗原バリアント
は、可溶型のポリペプチドであり、分子量が約５，４０
０と小さいことから抗原性が低い。また、ヒトＦａｓ抗
原との相同性が高いため、このような治療の際に本発明
のヒトＦａｓ抗原バリアントを使用することにより、Ｆ
ａｓリガントのＦａｓ抗原への結合を阻害してアポトー
シスの誘導を調節することが可能となる。従って、本発
明のヒトＦａｓ抗原バリアントは肝炎、腎炎、多臓器不
全の治療や移植の際の臓器の保全などに有効である。

【００７２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列 Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn 1 5 10 15 Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr 20 25 30 Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys 35 40 45 Pro Cys Pro Pro Gly Arg 50 51

【００７３】配列番号：２配列の長さ：１５３配列の型：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 AGATTATCGT CCAAAAGTGT TAATGCCCAA GTGACTGACA TCAACTCCAA GGGATTGGAA 60 TTGAGGAAGA CTGTTACTAC AGTTGAGACT CAGAACTTGG AAGGCCTGCA TCATGATGGC 120 CAATTCTGCC ATAAGCCCTG TCCTCCAGGC AGG 153

【００７４】配列番号：３配列の長さ：６７配列の型：アミノ酸配列 Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val -15 -10 -5 Ala Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile -1 1 5 10 Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu 15 20 25 Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His 30 35 40 Lys Pro Cys Pro Pro Gly Arg 45 50 51

【００７５】配列番号：４配列の数：２０１配列の型：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 ATGCTGGGCA TCTGGACCCT CCTACCTCTG GTTCTTACGT CTGTTGCTAG ATTATCGTCC 60 AAAAGTGTTA ATGCCCAAGT GACTGACATC AACTCCAAGG GATTGGAATT GAGGAAGACT 120 GTTACTACAG TTGAGACTCA GAACTTGGAA GGCCTGCATC ATGATGGCCA ATTCTGCCAT 180 AAGCCCTGTC CTCCAGGCAG G 201

【００７６】配列番号：５配列の数：２１６配列の型：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 -15 -10 -5 Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu GCTCAACAACC ATG CTG GGC ATC TGG ACC CTC CTA CCT CTG GTT CTT 47 -1 1 5 10 Thr Ser Val Ala Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val ACG TCT GTT GCT AGA TTA TCG TCC AAA AGT GTT AAT GCC CAA GTG 92 15 20 25 Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr ACT GAC ATC AAC TCC AAG GGA TTG GAA TTG AGG AAG ACT GTT ACT 137 30 35 40 Thr Val Glu Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln ACA GTT GAG ACT CAG AAC TTG GAA GGC CTG CAT CAT GAT GGC CAA 182 45 50 Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Arg End TTC TGC CAT AAG CCC TGT CCT CCA GGC AGG TGA A 216

【００７７】配列番号：６配列の数：２１２配列の型：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 -15 -10 -5 Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu GCTCAACAACC ATG CTG GGC ATC TGG ACC CTC CTA CCT CTG GTT CTT 47 -1 1 5 10 Thr Ser Val Ala Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val ACG TCT GTT GCT AGA TTA TCG TCC AAA AGT GTT AAT GCC CAA GTG 92 15 20 25 Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr ACT GAC ATC AAC TCC AAG GGA TTG GAA TTG AGG AAG ACT GTT ACT 137 30 35 40 Thr Val Glu Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln ACA GTT GAG ACT CAG AAC TTG GAA GGC CTG CAT CAT GAT GGC CAA 182 45 50 Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu TTC TGC CAT AAG CCC TGT CCT CCA GGT GAA 212

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト肝ＲＮＡのプライマーを用いたＲＴ−Ｐ
ＣＲプロファイルを示すゲル電気泳動を示す図面代用写
真である。

【図２】ヒトＦａｓ抗原バリアントｃＤＮＡクローン
の部分的塩基配列を示す図である。

【図３】ヒトＦａｓ抗原バリアントの予想アミノ酸配
列を示す図である。

【図４】ヒトゲノム内における４塩基挿入配列直前直
後のエクソン−インロン領域の塩基配列を示す図であ
る。

【図５】ヒトゲノム内における４塩基挿入配列部分、
及びその直前直後の塩基配列を示す図である。

【図６】ヒト肝ＲＮＡのプライマーを用いたＲＴ−Ｐ
ＣＲプロファイルを示すゲル電気泳動を示す図面代用写
真である。

【図７】ヒトＦａｓ抗原バリアントｃＤＮＡクローン
の塩基配列を示す図である。

【図８】ヒトＦａｓ抗原バリアントの全アミノ酸配列
を示す図である。

【図９】ヒトＦａｓ抗原およびマウスＦａｓ抗原の全
アミノ酸配列を示す図である。

【図１０】プラスミドｐＭ４６８のリンカーを分割し
た各断片の塩基配列を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトＦａｓ抗原バリアント、またはそれと
実質的に同一の機能を有するペプチドをコードする新規
ＤＮＡ。
【請求項２】下記式１（配列表の配列番号１）のアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とする
請求項１に記載の新規ＤＮＡ。式１ Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn 5 10 15 Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr 20 25 30 Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys 35 40 45 Pro Cys Pro Pro Gly Arg 50 51
【請求項３】下記式２（配列表の配列番号２）の塩基配
列を有することを特徴とする請求項１または２に記載の
新規ＤＮＡ。式２ AGATTATCGT CCAAAAGTGT TAATGCCCAA GTGACTGACA TCAACTCCAA GGGATTGGAA 60 TTGAGGAAGA CTGTTACTAC AGTTGAGACT CAGAACTTGG AAGGCCTGCA TCATGATGGC 120 CAATTCTGCC ATAAGCCCTG TCCTCCAGGC AGG 153
【請求項４】下記式３（配列表の配列番号３）のアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とする
請求項１に記載の新規ＤＮＡ。式３ Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val -15 -10 -5 Ala Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile -1 1 5 10 Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu 15 20 25 Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His 30 35 40 Lys Pro Cys Pro Pro Gly Arg 45 50 51
【請求項５】下記式４（配列表の配列番号４）の塩基配
列を有することを特徴とする請求項１または４に記載の
新規ＤＮＡ。式４ ATGCTGGGCA TCTGGACCCT CCTACCTCTG GTTCTTACGT CTGTTGCTAG ATTATCGTCC 60 AAAAGTGTTA ATGCCCAAGT GACTGACATC AACTCCAAGG GATTGGAATT GAGGAAGACT 120 GTTACTACAG TTGAGACTCA GAACTTGGAA GGCCTGCATC ATGATGGCCA ATTCTGCCAT 180 AAGCCCTGTC CTCCAGGCAG G 201
【請求項６】前記式３（配列表の配列番号３）のアミノ
酸配列をコードする新規ＤＮＡまたは前記式４（配列表
の配列番号４）に記載の新規ＤＮＡの少なくとも一部を
有することを特徴とする請求項１に記載の新規ＤＮＡ。
【請求項７】ヒトＦａｓ抗原バリアントまたはそれと実
質的に同一の機能を有する新規ポリペプチド。
【請求項８】下記式１（配列表の配列番号１）のアミノ
酸配列を有することを特徴とする請求項７に記載の新規
ポリペプチド。式１ Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn 5 10 15 Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr 20 25 30 Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys 35 40 45 Pro Cys Pro Pro Gly Arg 50 51
【請求項９】前記式１（配列表の配列番号１）に記載の
アミノ酸配列の少なくとも一部を有することを特徴とす
る請求項７に記載の新規ポリペプチド。
【請求項１０】請求項１ないし６のいずれかに記載の新
規ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１】請求項１０に記載の組換えＤＮＡ分子で
形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項１２】請求項１１に記載の形質転換体を培養
し、その培養混合物から請求項７ないし９のいずれかに
記載の新規ポリペプチドを回収することを特徴とする、
請求項７ないし９のいずれかに記載の新規ポリペプチド
の製造方法。
【請求項１３】請求項７ないし９のいずれかに記載の新
規ポリペプチドを認識する新規抗体。