JP2000350582A - 新規の７−トランスメンブランレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規の7-トランスメンブランレセプターを提
供する。 【解決手段】 7-トランスメンブランレセプターをコー
ドする新規のポリヌクレオチドと、これらの１つと特異
的に結合もしくは免疫反応性を示す、少なくとも１つの
リガンド／レセプターを有するポリペプチド類。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、シグナル
伝達に関与する細胞レセプター超科と7-トランスメンブ
ランレセプター、さらに、７種の新規の7-トランスメン
ブランレセプターをコードするＤＮＡ配列のクローニン
グと発現に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】7-ト
ランスメンブランレセプター（ヘプタヘリカル、蛇行状
またはＧタンパク結合レセプターとしても知られてい
る）は、類似した分子構造を持つ超科を含んでなる。

【０００３】7-トランスメンブランレセプター(7TMレセ
プター)のアミノ酸配列は、既に報告されており、7TMレ
セプター間の関係については、Probstらによって検討さ
れている [DNA and Cell Biology, 11(1): 1-20 (199
2)]。 具体的には、7TMレセプター間にはアミノ酸配列
の類似性が見い出されており、いずれのレセプターも多
くの構造的特徴、例えば、細胞外領域にアミノ末端があ
ること、７つの疎水性に富んだ（約20〜30個のアミノ酸
からなる）α−ヘリックス領域を有していること（ちな
みに、これらは細胞膜間を貫通していると考えられてお
り、このことからトランスメンブラン領域１〜７と呼ば
れている)、約20個の保存性に富んだアミノ酸があるこ
と、そして、細胞内領域にカルボキシ末端があること、
などの特徴があるものと思料されている。 7TMレセプ
ター間のアミノ酸の類似性は、およそ10％から80％以上
の範囲にあり、同一または類似のリガンドを認識するレ
セプターほど一般に高い相同性を示す。

【０００４】7TMレセプターは、相同性の高さ、それに
その認識リガンドの種類、またはそのいずれか一方によ
って分類することができる。 例えば、インターロイキ
ン-8レセプター、アンジオテンシンIIレセプター、トロ
ンビンレセプター、エンドセリンレセプター、N-ホルミ
ルペプチドレセプター、C5aレセプターは、すべてペプ
チドレセプターと結合し、20〜40％のアミノ酸の類似性
を有している。

【０００５】7TMレセプターは、多数の種類のリガンド
（例えば、光、臭い、神経伝達物質、ペプチドホルモン
および低分子物質）を認識し、数種類のグアニンヌクレ
オチド結合タンパク（Ｇ−タンパク）を介してシグナル
を伝達し、種々の細胞内酵素、イオンチャンネルおよび
運搬体によって、多くの生理活性（視覚的興奮、臭覚受
容、神経伝達など）に影響を与えている。 シグナル伝
達経路は、ロドプシン[Khorana, J. Biol. Chem., 267,
1-4 (1992); Stryer, J. Biol. Chem., 266:10711-107
14 (1991)] とβアドレナリンレセプター[Dohlman et a
l., Ann. Rev.Biochem., 60: 653-688(1991)] によるも
のが明らかにされているが、他の7TMレセプターによる
経路も示唆している。

【０００６】各7TMレセプターは、原形質膜の細胞内表
面に位置する特定のＧタンパクに結合すると考えられて
いる。 レセプターのリガンドへの結合は、Ｇタンパク
を活性化（すなわち、αサブユニット上でのGTPとGDPの
変換）し、細胞内のシグナル伝達特異性酵素およびチャ
ンネルを順次刺激する。 従って、各7TMレセプターの
機能によって、まず複雑な細胞外環境から特定のリガン
ドが決定され、次に、Ｇタンパクが活性化されて特定の
細胞内シグナルが生産される。

【０００７】Cotecchiaらは、7TMレセプター上の第３ト
ランスメンブランの細胞内ループは、レセプターが特定
のＧタンパクと結合するための重要な決定因子を含むと
報告している[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2896-
2900 (1990)]が、Lefkowitzは、7TMレセプターの他の領
域も、リガントと結合するまでの間、7TMレセプターを
折り畳まれた不活性型に維持するために必要である、と
いう報告をまとめている [Nature, 265: 603-604 (199
3)]。

【０００８】最近、免疫および血液凝固に重要なリガン
ドを認識するいくつかの7TMレセプターが同定された。
Holmesらは、インターロイキン-8レセプター(IL8R1)
は、好中球の走化性に関与していることを報告し[Scien
ce, 253: 1278-1280 (1991)]、また、Sasakiらは、アン
ギオテンシンIIレセプター(AT2R)が血管の凝血作用に関
与していることを報告している[Nature, 351:230-233
(1991)]。

【０００９】同様に、エンドセリンレセプター は、血
管収縮を制御し、また、筋肉運動を平滑化する[Arai et
al., Nature. 351: 230-233 (1991)]。

【００１０】加えて、C5aレセプターは、in vitroで走
化性であり、また、顆粒酵素の放出や超酸素の生産に関
与し、さらに、in vivoでアナフィラキシーや敗血症性
ショックに関与していると考えられている [Gerard and
Gerard, Nature, 349: 614-617 (1991)] 。

【００１１】トロンビンも、7TMに認識され、血小板凝
集、単球走化性、リンパ球細胞分裂促進などの強力な活
性化物質であり、血管損傷に対する炎症反応を介在す
る。

【００１２】N-ホルミルペプチド(f-met-leu-phe)レセ
プターは、好中球の走化性および活性化の要因である[T
homas et al., J.Biol.Chem. 265: 20061 (1990)] 。

【００１３】これら7TMレセプターは、すべてペプチド
性リガンドを有し、低分子の有機化合物を認識するその
他の7TMレセプターも前炎症反応に関与している。 例
えば、血小板活性化因子レセプターは、生理活性を有す
るホスホリピドを認識し[Honda et al., Nature, 349:
342-346 (1991)] 、血小板凝集およびエンドトキシンシ
ョックを引き起こす。 また、トロンボキサンA2レセプ
ターは、アラキドン酸代謝物を認識して血管収縮や血小
板凝集を刺激し、脳卒中および気管支喘息に関与してい
る[Hirata et al., Nature, 349, 617-620 (1991)]。

【００１４】7TMレセプター（チロトロピン）の第３細
胞内ループが変異した変異体と、別の7TMレセプター
（黄体ホルモンレセプター）にて第３細胞内ループ近傍
の第６トランスメンブラン領域が変位した変異体は、そ
れぞれ甲状腺機能亢進症 [Parma et al., Nature, 365:
649-651 (1993)]、および家族性思春期早発症[Shenker
et al., Nature, 365: 652-654 (1993)]を引き起こす。
両変異体とも本質的に7TMのレセプターを活性化す
る。

【００１５】すでに、他の研究によって、7TMレセプタ
ーの活性化を阻害する変異体が、先天性腎原発性尿崩症
などの疾患の原因となる、ホルモン抵抗の状態を引き起
こすことが示されている (Rosenthal et al., J. Biol.
Chem., 268: 13030-13033 (1993) 参照)。

【００１６】さらに他の研究によって、多くの7TMレセ
プターが、原癌遺伝子としての機能を有し、突然変異に
より活性化されることが明らかになっている。 その例
として、7TMレセプターの自然発生突然変異体が、レセ
プターの正常な機能を変え、腫瘍形成やアテローム性動
脈硬化症などのヒトの病体と関連した制御不能な細胞増
殖を引き起こすことを指し示したAllenらの論文 [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11354-11358 (1991)] を
参照されたい。 従って、多くの人の病気の原因には、
その根底に7TMレセプターの変異があるのかも知れな
い。

【００１７】健康体および病疾患体に於ける免疫過程に
関する7TMレセプターに対して様々な臨床応用の可能性
があること、また、一般に、かなり多くのタンパクが、
免疫過程に関与していると考えられている。 よって、
このような過程に関与しているその他の7TMレセプター
を単離する技術、特に、アミノ酸配列決定を目的とした
これらタンパクの同定および性質に関する情報が求めら
れている。 新規の7TMレセプターをコードするDNAの単
離によっても、健康体および病疾患体に於けるレセプタ
ーの役割を決定するための基本的な情報が得られる。

【００１８】このレセプターを使った治療薬および／ま
たは診断薬を開発するための基本的情報を得るために
は、このタンパクをコードしているDNAを単離する必要
がある。このDNAを単離すると、例えば、7TMタンパクの
大量生産が可能になり、7TMタンパクを産生する細胞を
同定することができる。 また、特定の7TMレセプター
（または、レセプター群）と特異的に反応し、レセプタ
ーの生理活性を調節できる抗体および／または（天然の
リガンド、作用薬および拮抗薬などの）他の新規物質の
精製／同定が可能になる。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明は、７種の新規の
7TMレセプターをコードするポリヌクレオチド（すなわ
ち、DNA配列およびRNA転写物) V28、V31、V112、R20、R
2、R12、RM3と、７種の7TMレセプターの１つと特異的に
結合もしくは免疫反応性を示す、少なくとも１つのリガ
ンド／レセプターを有する（ペプチド断片および類似体
などの）ポリペプチド類を意図している。

【００２０】本発明の7TMレセプター断片は、Ｎ末端の
細胞外領域、トランスメンブラン領域、トランスメンブ
ラン領域に接続している個々の細胞外および細胞内ルー
プ、それに、Ｃ末端の細胞内領域および融合物本体を、
特に意図している。

【００２１】本発明で開示したDNA配列は、ゲノムおよ
びcDNA配列、それに、全部または一部を化学合成したDN
A配列である。

【００２２】特に本発明で例示したポリヌクレオチド配
列は、プラスミドに挿入された7TMレセプターのV28、V3
1、V112、R2、R12およびR20をコードするDNAであって、
それらDNAは、アメリカ合衆国 20852 メリーランド州、
ロックヴィル、パークロウン ドライブ 12301に所在の
アメリカン タイプ カルチャー コレクション(ATCC)
に、1992年10月12日に寄託されている。 寄託番号は、
それぞれATCC受託 Nos.75330、75327、75326、75329、7
5331および75328である。 また、本発明で例示した他
のポリヌクレオチド配列は、プラスミドに挿入された7T
MレセプターのRM3をコードするDNAであり、これは1992
年11月２日にATCCに寄託されて、ATCC受託No.75340が付
与されている。

【００２３】本発明のもう１つの目的に鑑み、本発明の
DNA配列を取り込んだ生理活性を有するプラスミドとウ
イルスDNAを提供し、そして7TMレセプターまたは7TMレ
セプター変異体をコードするDNAを含むベクターにて、
細胞内または細胞外での発現を制御する配列と結合する
ように操作した。

【００２４】また、本明細書で述べた原核または真核細
胞の宿主は、安定して本発明のDNA配列で形質転換また
は形質導入することから、DNA配列からコードされる7TM
レセプターポリペプチドまたは変異体ポリペプチドは、
宿主細胞において発現される。かような7TM生成物を発
現する宿主細胞は、様々な目的で利用できる。 発現さ
れた生成物が宿主細胞表面に「出現」する程度にまで、
7TMレセプターまたは7TMレセプター変異体と特異的に免
疫反応する抗体物質を発現するための効果的な免疫源
を、細胞が有しているものと思われる。 本発明の宿主
細胞は、適当な培地中で生育させると、7TMレセプター
の大量生産に特に有用であり、7TMレセプターポリペプ
チド生成物が、細胞または細胞を生育させた培地より単
離される。 新規の7TMレセプターを発現する宿主細胞
も、7TMレセプター結合の作用薬または拮抗薬を同定す
るための分析において有用である。

【００２５】

【発明の実施の形態】本発明の新規の7TMレセプター
は、天然の細胞源からも単離物として得られるものと考
えられるが、本発明の宿主細胞に関する組み換え操作に
より生産されるのが望ましい。 生成物は、宿主細胞の
選択および／または単離後の処理操作によって、全体的
または部分的に糖鎖を含むもの、部分的または全体的に
脱糖鎖処理を施したもの、または全く糖鎖を含まないも
のが得られる。

【００２６】本発明の7TMレセプター変異体は、水に可
溶および不溶のポリペプチド、またはペプチド断片から
なり、１つ以上の特定のアミノ酸が欠失または置き換え
られたペプチド類似体、例えば、(1) 7TMレセプターに
対する１つ以上の生理活性または免疫学的特異性が失わ
れていない、望ましくは強化されているもの、(2) 特定
のリガンド／レセプターの結合機能が特異的に失われて
いるもの、が含まれる。多量体形成を可能にするため
に、アミノ酸（例えば、リシン）残基を付加した類似体
ポリペプチドを意図している。

【００２７】また、本発明の7TMレセプターまたは7TMレ
セプター変異体と特異的に反応する抗体（例えば、モノ
クローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キ
メラ抗体、CDR-移植した抗体など）、またはその他の結
合タンパクも本発明に含まれる。 抗体物質は、単離さ
れた天然または組み換え体7TMレセプター生成物（ペプ
チドも含む）や、表面にこれら生成物を発現している細
胞を用いて産生させることができる。 抗体物質はま
た、抗イディオタイプ抗体を産生させるための免疫化、
本発明のポリペプチドの精製、および細胞表面にポリペ
プチドを産生している細胞の同定に有用である。 細胞
表面および血清などの液体中の7TMレセプターの検出お
よび定量のための分析には、「サンドウィッチ」分析で
の単一または複数の抗体物質が含まれる。 抗体物質な
らびに7TMレセプター結合物（例えば、低分子またはペ
プチド）に対する作用薬または拮抗薬も、本発明の7TM
レセプターとリガンド／レセプターの結合、特に、in v
ivoでの免疫および／または炎症反応を調節（すなわ
ち、停止、阻害または刺激）する上で有用である。

【００２８】本発明のDNAおよびアミノ酸配列に関する
情報の科学的重要性は明らかである。例えば、7TMレセ
プターのcDNA配列を知ることによって、7TMレセプター
をコードしているゲノムDNA配列と、プロモーターやオ
ペレーターなどの7TMレセプター遺伝子の発現を制御し
ているゲノムDNA配列とのDNA/DNAハイブリダイゼーショ
ンによる単離が可能になる。 本発明のDNA配列を用い
て、ストリージェントな条件の下で行われたDNA/DNAハ
イブリダイゼーションによっても同様に、7TMレセプタ
ーの対立遺伝子、特定の疾患に関連した7TMレセプター
の変異体、7TMレセプターに対して生物学的および／ま
たは免疫学定に特異的なその他の構造関連タンパク、お
よび7TMレセプターに相同性を示すヒト以外のタンパク
をコードしているDNAの同定が可能になる。 本発明のD
NAは、細胞の7TMレセプター合成能の有無を検出するた
めのDNA/RNAハイブリダイゼーションにおいて有用であ
る。

【００２９】本発明のDNA配列が提供されることによっ
て、通常同一の発現をしている細胞から、7TMレセプタ
ーの発現の制御に関連した治療上有用なオリゴヌクレオ
チド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、トリ
プルヘリックスまたはアプタマーのオリゴヌクレオチ
ド）を入手することが可能である。 （他のヌクレオチ
ドについては、Crooke et al., BIO/TECHNOLOGY, 10: 8
82-886 (1992)、およびAlper et al., BIO/TECHNOLOGY,
11: 1225 (1993)に記載されている。） 本発明のDNA
配列はまた、Mitani et al., TIBETECH, 11: 162-166
(1993) (治療用遺伝子の分配)、Sikora、TIBECH, 11: 1
97-201 (1993)(癌の遺伝子療法)、および、Findeis et
al., TIBTECH, 202-205 (1993) (レセプターによる遺伝
子療法)に示されているような、遺伝子療法のために開
発されたベクターにおいても有用である。

【００３０】

【実施例】本発明を、新規の7TMレセプターをコードす
るヒトゲノムおよびcDNA配列、V28、V31、V112、R20、R
2、R12およびRM3の単離に関する好適な実施例に基づい
て、以下に具体的に説明するが、本発明は、これら実施
例の開示に基づいて限定的に解釈されるべきでない。

【００３１】実施例１には、7TMレセプターのR20、V3
1、V28およびV112の一部をコードするPCR断片の単離を
記載した。

【００３２】実施例２には、全長ヒトV31ゲノムクロー
ンの単離を記載した。

【００３３】実施例３には、V31ヒトcDNAクローンの単
離、さらにはV31ゲノムクローンの性質について記載し
た。

【００３４】実施例４には、ヒトV31遺伝子の染色体上
の位置を特定する実験について記載した。

【００３５】実施例５には、全長マウスV31ゲノムクロ
ーンのクローニングを記載した。

【００３６】実施例６には、V28の全長ヒトゲノムクロ
ーンのクローニングを記載した。

【００３７】実施例７には、全長ヒトV28 cDNAの単離に
ついて記載した。

【００３８】実施例８には、全長ヒトV112 cDNAについ
て記載した。

【００３９】実施例９には、ヒトR20をコードする全長
ゲノムDNAの単離について記載した。

【００４０】実施例10には、ヒトゲノム胎児肝臓ライブ
ラリーからの全長R2およびR12 7TMレセプター遺伝子の
単離について記載した。

【００４１】実施例11には、RM3 7TMレセプターをコー
ドするcDNAのクローニングについて記載した。

【００４２】実施例12には、本発明の7TMレセプターの
アミノ酸配列と先に報告された7TMレセプターのアミノ
酸配列との比較について記載した。

【００４３】実施例13には、7TMレセプターV31をコード
するゲノムおよびcDNA配列を用いたヒト細胞の形質変換
と形質変換された細胞の表現型について詳細に記載し
た。

【００４４】実施例14には、ノーザンブロットおよびin
situハイブリダイゼーションで分析した種々のヒト組
織および造血系細胞における本発明の7TMレセプターの
発現について記載した。

【００４５】実施例15と16には、それぞれV31ゲノムとV
20ゲノム配列を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ
との融合タンパクとして、大腸菌にて発現させた事例に
ついて記載した。

【００４６】実施例17には、V31とV28 cDNAを、グルタ
チオン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパクとし
て、大腸菌にて発現させた事例について記載した。

【００４７】実施例18には、V31に特異的なモノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体の産生に有用なV31融合
タンパクおよびV31ペプチドと反応するポリクローナル
血清の産生について記載した。

【００４８】実施例19には、本発明の7TMレセプターの
細胞外および細胞内リガンドに関する、いくつかの同定
法について記載した。

【００４９】実施例１ 新種の7TMレセプター超科の同定法として、ポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)法を採用した。

【００５０】ＰＣＲプライマーのデザインと合成 最初に、８つの異なる変性オリゴヌクレオチドプライマ
ープールを、血小板活性化因子レセプターのアミノ酸配
列を基にデザインした。 ８つのプライマープールによ
るPCRでは、新種の7TMレセプターは全く増幅されず、い
くつかの血小板活性化因子レセプターのクローンが増幅
されただけであった。

【００５１】次に、デザインした変性プライマーの配列
を、全アミノ酸の相同性が30％であるIL8R1とAT2Rの間
において、高い相同性が認められるアミノ酸配列の領域
から選定した。 相同性の高い最初の領域は、第２トラ
ンスメンブラン内にあり、両レセプターの20残基の内、
16残基が一致していた。 5'変性プライマープール（各
プライマーは、長さ45ヌクレオチドにクローニング部位
を加えたもので、PCRに使用される一般的なプライマー
よりも長い）は、この配列に基づいて合成された。 上
流プライマーの配列を、下記の通りIUPAC命名法に従っ
て示す。 下線で示したヌクレオチドは、クローニング
時に使用するBamHI切断部位である。

【００５２】

【化１】

【００５３】このオリゴヌクレオチドプールでは、マル
チプルコドン選択と、IL8R1とAT2Rの間における４つの
アミノ酸の違いから、配列中に10箇所の変性箇所が認め
られた。 デザインの際には、10箇所は変性されず、そ
の代わりにWadaらのヒトコドン頻度表 [Nucl. Acids Re
s., 19S: 1981-1986 (1991)]に基づいて、１個の「最も
推定される」ヌクレオチドを用いてデザインした。

【００５４】IL8R1とAT2Rの間で広範に一致した第２の
領域は、推定されている第２の細胞内領域内にあり、近
接箇所に８つの同一アミノ酸が認められる。 この領域
は、下流のアンチセンスPCRプライマープール（長さ21
のヌクレオチドに制限酵素切断部位を加えたもの）のデ
ザインに用いた。 下流プライマーの配列を、下記の通
りIUPAC命名法に従って示す。 下線で示したヌクレオ
チドは、クローニング時に使用するHindIII切断部位で
ある。

【００５５】

【化２】

【００５６】イノシンは、数種のヌクレオチドと塩基対
を形成するため、このオリゴヌクレオチドは、いくつか
の変更点においてヌクレオチドのイノシンを有してい
る。

【００５７】PCRによる新規の7TMレセプターをコードす
るゲノムDNAの単離 オリゴヌクレオチドプライマープール１と２を用いて、
BlinとStaffordの方法[Nucl. Acids Res., 3, 2303-230
8 (1976)]によって、白血球細胞から精製したヒトゲノ
ムDNAを増幅した。 PCRは、Perkin-Elmer-Cetusの機器
を使い、次の温度サイクルに従って操作した。 最初の
４分間は94℃にて反応せしめ、続いて、(1) 30秒間、94
℃で変性、(2) 45秒間、50℃でアニーリング、および
(3)２分間、72℃で伸長せしめ、この(1)〜(3)を、25サ
イクル行った。 反応混合液には、合計40μlの中に、
１×PCR緩衝液、0.25mM dGTP、0.25mM dATP、0.25mM dC
TP、0.25mM dTTP、0.01μg/μlプライマープール１、0.
01μg/μlプライマープール２、0.125mg/mlヒトゲノムD
NA、および2.5単位のTaqポリメラーゼが含まれている。
PCRで認められた主生成物は、1.2％アガロースゲル電気
泳動によって、192塩基対の大きさが測定された。

【００５８】８つの異なるPCR反応が、0.5mMから2.25mM
の範囲でMgCl₂の量を増加させながら行われた。 MgCl₂
の濃度は、PCR生成物の量を変化させないと思われたた
め、全ての８つの反応液をフェノールおよびクロロホル
ムで抽出し、エタノール沈澱した後、制限酵素BamHIお
よびHindIIIによって分解した。 分解したDNAは、1.2
％アガロース上で電気泳動を行い、192塩基対のバンド
を切り出して、ゲルより抽出した。 次に、回収したゲ
ルを、BamHI-HindIII分解プラスミドBluescriptSK-(Str
atageneCloning Systems、ラヨラ、カリフォルニア州）
に連結し、細菌宿主XL-1Blueに形質転換した。 数千の
クローンが得られ、そのほとんどは、青白色選択法によ
り決定された組み換え体であると考えられる。

【００５９】20の異なるクローンをDNA塩基配列の分析
のために選別した。 プラスミドDNAを調製し、ジデオ
キシ鎖末端法により配列決定を行った。 ほとんどのプ
ラスミドは、IL8R1またはAT2Rに対応する配列を含んで
いたが、20クローンの内の２つは、IL8R1との相同性が2
8％、AT2Rとの相同性が46％のペプチドをコードする新
しい配列を含んでいた。 この新規の配列は、R20と命
名され、7TMレセプターと一致した一連のアミノ酸をコ
ードしていた。 すなわち、最初の17残基は、全般に親
水性で、保存性の高いシステイン残基を含み、残りの22
残基は疎水性で、第３トランスメンブラン領域に対応し
ていた。

【００６０】さらに新しい新規の配列を同定するため
に、プライマープール１と２を用いてPCRにより得られ
たクローンを、ハイブリダイゼーションによってスクリ
ーニングして、IL8R1、AT2RおよびR20を含むクローンを
除いた。 約1000個のクローンをそれぞれ単離し、マイ
クロプレート上で培養した。 白金耳を使ってクローン
をプレートに移し、一夜培養してニトロセルロース膜に
転写した。 ブロットしたDNAを、標準的な方法に従っ
て、変性ならびに調製した。 次に、IL8R1、AT2Rおよ
びR20に特異的な³²P-標識プローブを用いてハイブリダ
イゼーションを行った。ハイブリダイズされなかったク
ローンを選択し、配列分析にかけた。 7TMレセプター
部分をコードしていると思われる３つの新しいクローン
を同定した。 クローンの挿入部をV31、V28およびV112
と命名した。 V112(ATCC 75326)をコードしている挿入
部を、配列番号：３に示した。 7TMレセプターと思わ
れる遺伝子のV31、V28およびR20をコードしている全遺
伝子については、実施例２、６および９にそれぞれ記載
した方法に従って、λファージのヒトゲノムDNAライブ
ラリーより単離した。

【００６１】実施例２ 下記に示した特異的プライマーを用いて、PCRによっ
て、V31ゲノムクローンを単離した。

【００６２】

【化３】

【００６３】ヒトゲノムDNAλライブラリー(ATCC 3733
3)を分画して、各プールに約3000クローン、計150プー
ルを調製した。 150プールを15のグループに分け、各
グループに約30,000ファージを分配した。 V31特異性
プライマーを用いたPCRを、次の条件に従って行った。
まず、最初の４分間を94℃にて反応せしめ、続いて、
(1) 30秒間、94℃で変性、(2) 45秒間、50℃でアニーリ
ング、および(3)２分間、72℃で伸長せしめ、この(1)〜
(3)を30サイクル行った。 反応混合液には、合計50μl
の中に、１×PCR緩衝液、0.25mM dGTP、0.25mM dATP、
0.25mM dCTP、0.25mMdTTP、0.01μg/μl V31正方向プラ
イマー、0.01μg/μl V31逆方向プライマー、１μl フ
ァージプール分解物および2.5単位のTaqポリメラーゼが
含まれている。15グループの内、114bpと思料されるPCR
断片が得られ、同じ条件でPCRを行ったところ、同グル
ープの内の１つのプールから同一の断片が得られた。

【００６４】次に、V31をコードするファージを同定す
るために、ハイブリダイゼーションを行った。 まず、
約6,000のファージを、５枚の15cmプレートに添付し
た。次に、二枚に重ねたフィルターを各プレートに吸着
させ、標準的な方法に従って、ハイブリダイゼーション
処理を行った。 そして、V31特異性プライマーを使っ
て³²P-dCTPをPCR反応に取り込ませることによって、V31
部分プラスミドから³²P標識プローブを調製した。 こ
の放射性標識プローブを使ったハイブリダイゼーション
とフィルターの洗浄を、緩やかな条件で行った。 ハイ
ブリダイゼーション溶液の内容は、20％ホルムアミド、
５×SSC (0.75M塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナトリ
ウム）、５×デンハード溶液[1％ポリビニルピロリドン
(Sigma社、セントルイス、ミズーリー州）、１％フィコ
ール、１％ウシ血清アルブミン−画分Ｖ]、0.05Mリン酸
ナトリウム緩衝液、pH6.5および50ng/mlの超音波処理サ
ケ精子DNA(Sigma社)である。 42℃で一夜ハイブリダイ
ゼーションを行った後、２×SSCで、42℃でフィルター
をよく洗浄した。

【００６５】ハイブリダイズしているクローンを選び、
プラークを精製し、DNAを単離して制限酵素による分析
を行った。 ハイブリダイズしているEcoRIおよびKpnI
断片をサブクローニングし、DNAの配列分析に用いた。
配列分析より、配列をコードしているV31が単離さ
れ、PCRでクローニングされた114bpの配列と完全に一致
していることが示された。 しかし、この配列は、コー
ドしている領域の5'末端側をすべて含んではいなかっ
た。

【００６６】従って、V31のゲノムの配列をさらに様々
なラムダ-FixIIベクター(Stratagene社)中のヒト胎盤ゲ
ノムライブラリーから単離した。 V31をコードしてい
る5'末端側の配列(EcoRI-PstI断片)を利用したハイブリ
ダイゼーションによって、約600,000個のファージをス
クリーニングした。 このプローブは、³²P-dCTP、³²P-
dTTP、dGTP、dATP、ランダムヘキサマープライマーおよ
びDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を含んだ反応液中
で、約100ngの変性したV31 DNA断片を標識することによ
って調製した。 取り込まれなかったヌクレオチドは、
反応混合液を、G-25セファデックスQuick Spinカラム(B
oehringer Mannheim社) に通すことによって除去した。

【００６７】このプローブを煮沸して変性し、ハイブリ
ダイゼーション溶液（50％ホルムアミド、５×SSC、５
×デンハード溶液、0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.5)と50ng/mlの超音波処理サケ精子DNAで、ファージフ
ィルターと共に、42℃で、一夜インキュベートした。
フィルターを、0.2×SSC、0.1％SDSによって、42℃で、
10分間の洗浄を３回行った。 フィルターを空気中で乾
燥し、オートラジオグラフィーで測定した。 ６個の独
立したハイブリダイズしているクローンを選び、プラー
クを精製して制限酵素による分析を行った。 これらク
ローンの内、４つのクローンについて、ハイブリダイゼ
ーションのパターンが、V31をコードしている配列のプ
ローブを用いたゲノムサザンブロットのパターンと一致
した。

【００６８】これらファージの一つからハイブリダイズ
している1.9KbのPstI断片を単離し、Bluescript SK+プ
ラスミド(Stratagene社)のPstI部位にサブクローニング
した。

【００６９】得られたプラスミドについてDNA配列分析
を行ったところ、全てのV31の配列が含まれていること
がわかった。 ATG開始コドンと思われるコドンが、翻
訳開始を意味するKozakのコンセンサス配列[Kozak, Nuc
l. Acids Res., 12: 857-872 (1984)] と一致する配列
の直前に位置していた。 V31ゲノムクローン(ATCC 753
27)のDNAおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：６
および７に示した。

【００７０】V31クローンの配列は、7TMレセプター超科
の他のレセプター（例えば、ロドプシン、アドレナリン
レセプターまたは臭覚レセプター）よりも、IL8R1(31
％)およびAT2R(27％)の方が高い相同性を示している。

【００７１】実施例３ ヒトV31cDNAの単離 7TMレセプターV31をコードするヒトcDNAを単離した。
最初に、標準的な方法で作成したベクターpCDM8 [Invit
rogen社、サンジエゴ、カリフォルニア州] でのヒト扁
桃腺cDNAライブラリーから、PCRによってcDNAの一部を
増幅した。 PCR反応に用いたプライマーは、以下の通
りである。

【００７２】

【化４】

【００７３】プライマーV31-G+は、配列番号：６のヌク
レオチド418-437に対応しており、EcoRI部位（下線の配
列）を含み、クローニングができるように5'末端に３つ
のヌクレオチドが付加されている。

【００７４】プライマーCDM8-Downは、ベクターpCDM8の
ポリリンカーとアニールした。 得られたPCR生成物
を、ニトロセルロース膜にブロットし、放射性標識V31-
特異性プローブと反応させた。 放射性標識プローブ
を、２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、³²P標識
ヌクレオリドでアニールされたオリゴヌクレオチドの末
端を満たして作成した。 このオリゴヌクレオチドの配
列は、配列番号：10および11に記載した。 ハイブリダ
イズしているバンドをゲルから単離し、Bluescript(SK
-)(Stratagene社)にクローニングした。 得られたクロ
ーンは、pV31-5'endと命名され、そのDNA配列を配列番
号：12に示した。 pV31-5'endのヌクレオチド58-117
は、配列番号：６に示した元のゲノムクローンとは異な
る配列を含んでいるが、ヌクレオチド118-232は、配列
番号：６のヌクレオチド322-437と一致している。

【００７５】末梢血単核細胞cDNAライブラリーから全長
cDNAクローンを単離した。 V31-特異性オリゴヌクレオ
チドプライマーを用いてPCRを行い、V31クローンを含む
ライブラリーの画分を同定した。 使用したプライマー
は、以下の通りである。

【００７６】

【化５】

【００７７】プライマーV31-B1は、配列番号：12のヌク
レオチド18-36に対応している。

【００７８】V31に陽性を示す各画分をプレートに移
し、上述した放射性標識V31-特異性プローブと反応させ
てV31-5'末端クローンを単離した。 単離したクローン
PBMC75はポリAを含んでいるが、配列番号：12に記載さ
れている扁桃腺cDNAの一部よりも5'末端側が５ヌクレオ
チドだけ短い。 クローンPBMC75に挿入されたV31 cDNA
は、V31 7TMレセプターをコードするすべての配列を含
んでおり、cDNA V31-Bと命名した。

【００７９】5'-Amplifinder RACEキット(Clonetech社)
を用いてRACE PCRを行い、V31 cDNAの5'末端側を増幅し
てクローニングした。 プライマーV31-F(配列番号：5
2)およびV31-G+(配列番号：８)を、キットに添付されて
いるプライマーと共に反応させ、V31-B cDNAの上流にコ
ードされていない17個のヌクレオチド（この内の５個は
元の扁桃腺クローンで同定された５個のヌクレオチドと
同一であった）を含むcDNAをクローニングした。 17個
のヌクレオチドとV31-B cDNAを含む合成配列は、配列番
号：14に記載されており、それから推測されるアミノ酸
配列は、配列番号：15に記載されている。 V31 7TMレ
セプターの予想される７つのトランスメンブラン領域(A
-B、C-D、E-F、G-H、I-J、K-LおよびM-Nの領域を模式的
に図１に示した）は、配列番号：15のアミノ酸残基58-8
6、96-119、131-152、171-196、219-247、264-285およ
び306-331に対応している。

【００８０】ヒトV31ゲノムクローンの再特徴付け V31-Bから推測されるアミノ酸配列と実施例２に記載のV
31ゲノムクローンから推測されるアミノ酸配列の比較か
ら、アミノ末端側に２つの異なる配列があることが明ら
かになった。 ゲノムクローン（配列番号：７の残基1-
52）から推測される最初の52個のアミノ酸は、V31-B cD
NAから推測されるアミノ酸配列には存在せず、20個の別
のアミノ酸（配列番号：15の残基1-20）に置き変わって
いた。この結果から、ゲノムクローンの5'末端側には、
イントロンが含まれているものと思われる。

【００８１】従って、V31-B cDNAを用いて、実施例２の
ヒトV31ゲノムクローンでの３つのエキソンを同定し
た。 V31ゲノムクローンのエキソン１および３（一部
イントロンの配列を伴う）のDNAおよび推測されるアミ
ノ酸配列は、配列番号：16および17、18および19にそれ
ぞれ記載されている。 配列番号：16（エキソン１）の
ヌクレオチド151-156には、TATAボックスが含まれてい
ると考えられるが、ヌクレオチド180は転写開始部位で
あり、243-245は翻訳開始コドンと考えられる。もう１
つのプロモーター領域は、CAATボックスを含み、RNAポ
リメラーゼIIにより転写を制御していると思われる [Be
noist et al., Nuc. Acids. Res.,8: 127-142 (1980)]
が、コンセンサス配列GG(C/T)CAATCT(配列番号：21)が
あった。 同様の配列は、配列番号：16のヌクレオチド
104-113にも見られる。 V31の２番目のエキソンのDNA
と推測されるアミノ酸配列は、cDNA V31-Bからも推測さ
れるが、それぞれ配列番号：21および22に記載されてい
る。 配列番号：22（エキソン2)のアミノ酸6-15は、セ
ロトニンレセプターの相当領域[Ruat et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA, 90: 8547-8551 (1993)]よりも若干
短い疎水性領域を含んでいるが、それは、別のトランス
メンブラン領域である可能性もあるし、またシグナルペ
プチドの切断領域である可能性もある。 配列番号：18
（エキソン3)に記載のイントロンの配列は、alu反復を
コードしている一連のヌクレオチドを含んでいる。

【００８２】実施例４ V31遺伝子の染色体位置をヒト−マウス体細胞ハイブリ
ッドのサザンブロット分析[Naylor et al., J. Exp. Me
d., 57: 1020-1027 (1983)]および中期染色体のin situ
ハイブリダイゼーション[Cherif et al., Hum. Genet.,
81: 358-362(1989) and Fan et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 87: 6223-6227 (1990)]によって決定し
た。

【００８３】ヒト−マウス体細胞ハイブリッドよりDNA
を単離し、EcoRIで分解した後、プローブとしてヒトV31
遺伝子（実施例２に記載した1.9Kb PstI断片）を用い
て、サザンブロット上でハイブリダイゼーションした。
V31遺伝子のハイブリダイゼーションは、常にヒト第1
7染色体を分離した。 さらに、V31遺伝子の位置を特定
するために、蛍光標識V31遺伝子プローブを用いて（さ
らに、実施例２に記載した1.9Kb PstI断片も用いた）ヒ
ト中期染色体上でin situハイブリダイゼーションを行
った。 中期染色体への蛍光in situハイブリダイゼー
ションを用いて第17染色体のq12-q21.2領域内のV31ゲノ
ムクローンの位置を決定した。 5-ブロモデオキシウリ
ジンリンパ球同調培地より中期染色体を調製した。 プ
ローブをビオチン化し、染色体とハイブリダイズさせて
蛍光標識アビジン(Vector Labs社)で検出した。 スラ
イドを、Nikon社製蛍光顕微鏡で評価した。 45個の中
期染色体調製物を試験した。 Q-(DAPI 対比染色)およ
びRヨウ化プロピディウム対比染色)バンドを用いて染色
体の同定を確認した。 45個の細胞の内の18個におい
て、第17染色体の両クロマチド上17q12-q21.2の位置
で、蛍光シグナルが検出された。 これは、同染色体の
遺伝性家族性乳癌の位置と一致している[Hall et al.,
Science, 250: 1684-1689 (1990)] 。

【００８４】実施例５ マウス細胞C6VLから1.9Kb V31遺伝子をプローブとした
標準的な方法によって作成したマウスゲノムライブラリ
ーから、V31ゲノムクローンを単離した。 ライブラリ
ーを、緩やかな条件 (30％ホルムアミド、42℃）でプロ
ーブと反応させた。 単離されたマウスV31ゲノムクロ
ーンのDNAおよび推測されるアミノ酸配列を、それぞれ
配列番号：23および24に示した。

【００８５】実施例６ 実施例１で単離されたPCR断片であって、7TMレセプター
V28をコードする断片を用いて、V28に特異的な合成オリ
ゴヌクレオチドをデザインした。 重複箇所が二箇所あ
るオリゴヌクレオチドを、下記の通り合成した。 中央
の９bpの重複によって、断片のコード鎖および非コード
鎖を示した。

【００８６】

【化６】

【００８７】二つの合成DNAをアニールし、そして、(次
の反応にて114bpの長さになる)得られたV28特異性プロ
ーブに、³²P放射標識したヌクレオチドを組み込むため
に、クレノウポリメラーゼを適用した。 反応液は、V2
8オリゴヌクレオチド、１×クレノウ緩衝液、0.015mM d
ATP、0.015mM dGTPそれぞれの0.76μg、10μl ³²Ｐ-dCT
P(Amersham社)、10μl ³²P-dTTP(Amersham社)、および
1.5μlのクレノウポリメラーゼを含んでいた。 反応液
を、室温にて、15分間インキュベートし、そして、クイ
ック−スピンG25カラムで使用するために、組み込まれ
ていない計測分を除去した。

【００８８】V28プローブ(46×10⁶cpm)を、２分間煮沸
して変性させ、ヒト胎盤ゲノミックライブラリー（Stra
tagene社) にハイブリダイズさせた。 このライブラリ
ーは、12個のニトロセルロースフィルターに360,000個
のファージを含んでおり、30％のホルムアミドを含む上
述のハイブリダイゼーション用溶液にて、42℃にて、一
晩かけてハイブリダイゼーションを行った。 フィルタ
ーを、32℃で、２×SSCで繰り返し洗浄し、そして、３
日間暴露させた。 いくつかの強力なハイブリダイゼー
ションのシグナルが観察され、そして、プラークが単離
された。 V28プローブは、ファージDNAおよびヒトゲノ
ミックDNAのサザーンブロットでの単一の制限エンドヌ
クレアーゼ断片とハイブリダイズした。

【００８９】HindIII(約２kbp)とPstI(約 3.5kbp)断片
の双方が単離され、pBluescriptにサブクローニングさ
れ、そして、配列決定された。 V28ゲノミッククロー
ン(ATCC75330)の全長のDNAおよび推定アミノ酸配列を、
配列番号：27および28に示した。 その遺伝子は、PCR
によって単離された正確なV28配列を含んでいた。

【００９０】コードされたアミノ酸配列は、典型的な7T
MR構造と一致する構造を予期させるものである。 すな
わち、親水性領域によって分離された七つの疎水性領域
があり、また、高度に保存された残基が、これら典型的
な位置にて認められた。 V28 7TMレセプターの予想さ
れる七つのトランスメンブラン領域は、配列番号：28
の、26〜56、68〜92、107〜125、146〜167、197〜219、
232〜253および273〜297のアミノ酸残基に対応してい
る。 V28コード配列は、IL8R1と29％の相同性を示し、
AT2Rに対しては27％の相同性を示した。

【００９１】実施例７ 標準的な方法によってベクターpRc/CMV(Stratagene社)
内で調製した末梢血単核細胞ライブラリーから、ヒトV2
8 cDNAを単離した。 V28-特異性オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いてPCRを行い、V28クローンを含むライブ
ラリーの画分を同定した。 使用したプライマーは、以
下の通りである。

【００９２】

【化７】

【００９３】プライマーV28Fは、配列番号：27のヌクレ
オチド852-871に対応し、プライマーV28Xは、配列番
号：27のヌクレオチド2047-2064の相補鎖に対応してい
る。PCR反応によって、ランダムプライマーにより³²Pで
標識された1.2Kb DNA生成物を調製し、次に、これをプ
ローブとして用いて個々のV28クローンを同定した。

【００９４】ハイブリダイゼーションと洗浄の条件は、
実施例２のストリージェントなハイブリダイゼーション
の方法でのそれと同様であった。

【００９５】V28 cDNAクローンのDNAおよび推測される
アミノ酸配列を、それぞれ配列番号：31および32に記載
した。 V28のゲノムおよびcDNAクローンの比較から、V
28遺伝子の５個の非翻訳領域にイントロンがあることが
示された。 V28遺伝子の切り出し接合部は、配列番
号：31のヌクレオチド84または85に存在すると考えられ
る。

【００９６】実施例８ 標準的な方法によってベクターpRc/CMV(Stratagene社)
内で調製したマクロファージcDNAライブラリーから、実
施例１に示したV112ゲノム断片に対応するヒトV112 cDN
Aを単離した。 V112-特異性オリゴヌクレオチドプライ
マーを用いてPCRを行い、V112クローンを含むライブラ
リーの画分を同定した。 使用したプライマーは、以下
の通りである。

【００９７】

【化８】

【００９８】プライマーV112-Fは、配列番号：３のヌク
レオチド1-19に対応し、プライマーV112-Rは、配列番
号：３のヌクレオチド101-120の相補鎖に対応してい
る。 PCR反応によってランダムプライマーを用いて³²P
で標識された123bpのDNA生成物を調製し、次に、これを
プローブとして用いて個々のV112クローンを同定した。
ハイブリダイゼーションと洗浄の条件は、実施例２に示
したストリージェントなハイブリダイゼーションの方法
でのそれと同様であった。

【００９９】約850bpのV112 cDNAクローンの一部DNAお
よび推測されるアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：35
および36に示した。 配列番号：35の一部配列は、V112
の5'側の非翻訳領域を含み、V112のアミノ末端部分から
第４トランスメンブラン領域までをコードしている。
V112 7TMレセプターにて予想される7-トランスメンブラ
ン1-3は、配列番号：36のアミノ酸残基36-58、70-90お
よび108-127に対応している。

【０１００】実施例９ 実施例１の記載に従ってPCR単離したR20を用いて、全遺
伝子に対するゲノムライブラリーのスクリーニングを行
った。 下記した特異的プライマーの配列と³²P-標識ヌ
クレオチドを用いたPCRによって、R20の一部の配列を増
幅することで、R20に特異的なプローブを調製した。
下記のプライマーは、R20-61がコード鎖の最初の21塩基
に相当し、R20-153RCが非コード鎖の最初の20塩基に対
応している。

【０１０１】

【化９】

【０１０２】PCR反応は、0.07μg R20標的配列 (pBlues
cript SK-にクローニングしたR20プラスミドから単離し
たHindIII-Bam断片)、0.25mM dATP、0.25mM dGTP、0.25
mM dTTP、１μM dCTP、４μl ³²P-dCTP(Amersham)、0.0
1mg/ml R20特異的プライマー、１×PCR緩衝液および0.5
μl Taqポリメラーゼを含む40μlにて行った。 PCR
は、次の条件に従って行った。 最初の４分間は、94℃
にて反応させ、続いて(1) 30秒間、93℃で変性、(2) 30
秒間、50℃でアニーリング、および(3) １分間、72℃で
伸長し、この(1)-(3)を12サイクル行った。 なお、取
り込まれなかった標識物は、Quick-Spin G25カラムで除
去した。

【０１０３】プローブを２分間煮沸して変性せしめ、次
に、ヒト胎盤ゲノムDNAライブラリー(Stratagene社)を
スクリーニングするために用いた。 フィルターを40％
ホルムアミドを含んだハイブリダイゼーション溶液中
で、42℃で、一夜ハイブリダイゼーションした後、42
℃、0.2×SSCで洗浄し、一夜暴露させた。 ４つの強い
シグナルが得られたプラークを精製し、サブクローニン
グして塩基配列を調べた。PCRで同定したR20は、単離し
た遺伝子の中に存在していた。 この遺伝子は、他の7T
Mレセプターに似た構造を持つタンパクをコードする。
全長ゲノムR20クローン(ATCC 75328)のDNAおよび予想
されるアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：39および40
に示した。 R20 7TMレセプターの予想される7-トラン
スメンブラン領域は、配列番号：40の28-54、66-90、10
7-125、146-167、208-232、246-267および285-312のア
ミノ酸残基に対応する。 R20遺伝子生成物は、IL8R1と
28％の相同性を示し、AT2Rとは29％の相同性を示した。

【０１０４】実施例10 R20遺伝子を単離する間に、２つの弱いハイブリダイゼ
ーションを示す配列が単離されたが、他の7TMレセプタ
ーに対して有意な相同性を示した。 実施例９の方法に
従い、R20特異性プローブ(実施例９)を用いて、ヒトゲ
ノム胎児肝臓DNAライブラリー(ATCC 37333)をスクリー
ニングした。 このライブラリーでは、R20遺伝子を同
定することはできなかったが、いくつかの弱いハイブリ
ダイゼーションを示すクローンが認められたため、プラ
ークを精製し、サブクローニングして塩基配列を調べ
た。 得られた二つのクローンを、R2(ATCC 75329)およ
びR12(ATCC75331)と命名した。 R2およびR12（それぞ
れ、配列番号：41と42、43と44に存在している）の全長
DNAと予測されるアミノ酸配列は、他の7TMレセプターに
対して相同性を示した。 R2 7TMレセプターの予測され
る7-トランスメンブラン領域は、配列番号：42のアミノ
酸残基41-69、77-104、120-138、161-186、207-226、24
7-270および294-318に対応しており、R12 7TMレセプタ
ーの予測される7-トランスメンブラン領域は、配列番
号：44のアミノ酸残基33-57、68-90、106-127、145-16
8、193-217、233-251および290-312に対応している。
R2は、IL8R1と25％の相同性を示し、AT2Rとは24％の相
同性を示した。 また、R12はIL8R1と26％の相同性を示
し、AT2Rとは19％の相同性を示した。

【０１０５】実施例11 もう一つの新規の7TMレセプターが、実施例１と同様の
方法で同定された。

【０１０６】二つの変性したプライマープール（それぞ
れ、配列番号：１と２を含む）を、プラスミドpRc/CMV
(Stratagene社)でのヒトマクロファージcDNAライブラリ
ーを利用したPCR反応に用いた。 反応混合液には、そ
の合計40μlの中に、１×PCR緩衝液、0.25mM dGTP、0.2
5mM dATP、0.25mM dCTP、0.25mM dTTP、0.01μg/μlプ
ライマープール１、0.01μg/μlプライマープール２、
0.2μgヒトマクロファージcDNAライブラリーおよび2.5
μl Taqポリメラーゼが含まれていた。 PCR生成物に対
してアガロースゲル電気泳動を行ったところ、少量の18
0-200bpのバンドが観察された。 クローニングを容易
にするため、このDNAをゲルから溶出し、同条件のPCRで
再び増幅した。 ２回目のPCRで実質的により多くのDNA
が単離された。

【０１０７】実施例１の記載と同様にして、再び増幅さ
れた物質をBamHIおよびHindIIIで分解し、プラスミドBl
uescript SK-にクローニングした。 塩基配列を調べた
16のクローンの内、14個はR20に対応し、２つは別の配
列を示し、RM3と命名された。

【０１０８】RM3クローンの一部に対して特異的なプラ
イマーを用い、実施例２に記載のPCR法により全長RM3 c
DNAクローンを同定した。 RM3c DNAのDNAおよび予測さ
れるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：45および46に
示されている。 RM3 7TMレセプターの予測される7-ト
ランスメンブラン領域は、配列番号：46のアミノ酸残基
48-69、82-100、115-136、159-179、198-220、246-274
および287-311に対応している。 RM3の一部のクローン
(ATCC 75340)の配列は、配列番号：45に示されており、
ヌクレオチド438-551に対応する。 RM3の予想されるア
ミノ酸はIL-8Rと34％一致し、AT2Rと32％一致する。

【０１０９】実施例12 実施例１〜11で示した７つの新規の7TMレセプターの内
の５つのレセプター間のアミノ酸の一致数と、既に同定
されている7TMレセプターとの比較を、以下の表１に示
す。 表中、fMLPは、N-ホルミルペプチドレセプター、
ThrRは、トロンビンレセプターを示す。

【０１１０】既に同定されている7TMレエプターのアミ
ノ酸配列は、下記の論文に報告されている。 すなわ
ち、IL8R1は、Holmes et al., 前出、IL8R2レセプター
は、Murphy et al., Science, 253: 1280-1283 (199
1)、AT2Rは、Sasaki et al.,前出、C5aRは、Gerard and
Gerard, 前出、fMLPRは、Boulay, BBRC, 168:1103-110
9 (1990)、ThrRは、Vu et al., Cell, 64: 1057-1068
(1991)、そして、PAFRは、Honda et al.,前出、に報告
されている。

【０１１１】

【表１】

【０１１２】実施例13 V31ゲノムDNAを、CHO/DHFR^-細胞(ATCC CRL9096)および2
93細胞(ATCC CRL1573)に形質導入し、その細胞をノーザ
ンブロットで分析してV31の発現を調べた。

【０１１３】哺乳動物細胞に於けるV31の発現のための
ベクター構築 1.9kbのPstI断片で、実施例２に記載されている全長ラ
ムダゲノムクローン（λS-V31-3)からV31をコードする
配列を切り出し、PstIで切断した市販のプラスミドBlue
script SK+ (Stratagene社)に組み込み、中間構築物質p
V31-Pstを調製した。 次に、HindIIIおよびXbalによる
分解によって、プラスミドpV31-Pstから全V31断片と60b
pのポリリンカーを切り出し、HindIIIおよびXbalで切断
した市販の哺乳類発現プラスミドpRc/CMV(Invitrogen
社、サンジエゴ、カリフォルニア州)に組み込んだ。

【０１１４】CHOおよび293細胞の形質変換 V31発現構築物、pV31XPを市販の形質変換用試薬DOTAP(B
oehringer Mannheim社、インディアナポリス、インディ
アナ州)を用いたリポ変換によって、CHOおよび293細胞
に形質導入した。 G418耐性株の選抜に続いて、各V31
形質変換株のサブクローニングを行った。

【０１１５】ノーザンブロット分析 トランスフェクションした細胞のV31mRNAの特異的な発
現について、³²P-標識V31プローブを用いたノーザンブ
ロットハイブリダイゼーションにより分析を行った。
形質変換した細胞を対数増殖期まで培養し、次に、遠心
分離してPBSで１回洗浄した。 市販のMicro-Fast Trac
k mRNA isolation kit (Invitrogen社）を用いて、細胞
からmRNAを単離した。 mRNA試料を、2.2Ｍホルムアル
デヒドを添加した１％アガロースルゲル電気泳動によっ
て分離した。 試料を、まず50％ホルムアミドおよび2.
2Mホルムアルデヒドによって、65℃で、15分間インキュ
ベートして変性させ、次に、ゲルに乗せる前にブロムフ
ェノールブルーおよびエチジウムブロマイドを加えた。
mRNAを、50Ｖで、約４時間電気泳動した。 紫外線ト
ランスイルミネーターでゲルを見ながら写真撮影をした
後、毛管現象により一夜、20×SSCにてゲル中のmRNAを
ニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell、キーイ
ン、ニューハンプシャー州）に転写した。 プローブで
ハイブリダイゼーションする前に、ブロットしたニトロ
セルロース膜を、80℃真空中で、１〜２時間乾燥した。

【０１１６】放射性標識V31プローブを作成するため
に、鋳型DNA(全V31をコードする配列を含む1.9kb HimdI
II-XbaI断片)を煮沸して変性させ、次に、ランダムヘキ
サマープライマーの混合物とアニーリングさせた。 ク
レノウ酵素と³²P-dCTP、³²P-dTTP、dATPおよびdGTPの混
合物を使って、室温で、30分間プライマーを伸長した。

【０１１７】取り込まれなかったヌクレオチドを、G-25
Sephadex Quick Spin Column (Boehringer Mannheim
社)に反応混合物を通して除去した。 ³²Pの取り込み
は、チェレンコブカウントにより定量した。 プローブ
を煮沸して変性させ、次に、ハイブリダイゼーション溶
液(50％ホルムアミド、５×SSC、５×デンハード溶液、
50mMNaPO₄、10μg/ml変性サケDNA)にて、mRNAブロット
と共に、42℃で、一夜インキュベートした。 ブロット
膜を、２×SSC、0.1％ SDSで、室温で、10分間、２回洗
浄し、次に、0.1×SSCで、50℃で、10分間、３〜４回洗
浄した。 ブロット膜を空気中で乾燥し、次に、Ｘ線フ
ィルムに時間を変えて暴露をした。

【０１１８】トランスフェクションした12個のCHOクロ
ーンの内、唯一、１個だけがV31 mRNAを発現しているこ
とが、ハイブリダイゼーションにより認められた。 こ
の細胞系は、CH0-V31-10と命名された。 この細胞系の
シグナルは８時間観察されたが、他の細胞からは有意な
量のシグナルは認められなかった。

【０１１９】形質変換した９つの239細胞の内、２個(29
3-V31-1と293-V31-6)は、高いレベルでV31 mRNAを発現
し、３個(293-V31-5、293-V31-7および293-V31-7)は、
中程度の量を発現し、そして、４個については有意な量
の発現が認められなかった。

【０１２０】V31 mRNAを発現する形質変換した293細胞
の表現型 V31 mRNAを発現する形質変換した293細胞の表現型は、
親の293細胞との比較によって変化する。 親の293細胞
は、細胞表面にタンパクを突き出す特徴を有している。
このような突出（「スパイク」）は、形質変換された
多くの細胞に共通の特徴である。 このような細胞は、
プラスチックプレート上で偏平にならないが、接着性に
大きな（スパイクの）特徴を示し、滑らかな被覆組織を
形成しない。 反対に、高いレベルのV31 mRNAを発現す
る形質変換された293細胞(293-V31-1と293-V31-6)は偏
平になり、培養中も滑らかな組織を形成する。 この細
胞は、細胞同士が接近して連続的に互いに接触し、石を
敷き詰めたように滑らかな被覆組織を形成する。 V31
で形質変換した293細胞も、親の293細胞系と比べると、
細胞の増殖率がきわめて低くなる。 このような形態学
的な違いと増殖率の差は、V31の遺伝子発現に対して
「あまり形質転換をしていない」表現型とも一致する。
これらの結果は、他の7TMレセプターを形質変換した
細胞の場合とは著しく異なる。 例えば、セロトニンレ
セプターは、哺乳動物の細胞に形質導入すると強い形質
転換体となる[Julius et al., Science, 244: 1057 (19
89)]。

【０１２１】哺乳動物細胞でのV31 cDNAの発現 V31-B cDNAについても上述の方法と同様の方法で、pRc/
CMV内で哺乳動物の細胞で発現するように操作した。
得られた発現プラスミドを、pRcV31-Bとした。V31-B mR
NAを発現する発現プラスミドで形質変換した293細胞
は、V31ゲノムDNA構築物を形質導入した293細胞より
も、親の293細胞に近い表現型を示す。

【０１２２】実施例14 様々なヒト組織および造血系細胞における新規の7TMレ
セプターV31、V28およびR20のmRNAの発現を、放射性標
識プローブを使って、ノーザンブロット分析およびin s
ituハイブリダイゼーションにより分析した。

【０１２３】In situでのヒト組織へのV31プローブのハ
イブリダイゼーション 様々なヒト組織の凍結切片を、V31由来の放射性標識一
本鎖RNAプローブを使って、in situハイブリダイゼーシ
ョンを行った。

【０１２４】リンパ節、脾臓、胸腺および扁桃線より得
られた組織試料を、OTCブロック中で凍結し、−70℃で
保存した。 クリオスタット2800M(Leica社)を使って、
ブロックを６ミクロンの切片に切断し、Vectabond (Vec
tor Laboratories社、バーリンゲーム、カリフォルニア
州）でコートしたスライド状に加工した。 スライド
を、室温で、一夜空気乾燥させ、−70℃で保存した。
使用前に、スライドを70℃環境から取り出し、５分間55
℃に置いた。 次に、切片を４％パラホルムアルデヒド
中で、４℃で、20分間固定し、PBSで３回洗浄し、脱水
し(70-95-100％エタノール、１分、それぞれ室温で)、
そして、30分間乾燥した。 切片を、70％ホルムアミ
ド、２×SSCで、70℃で、２分間変性処理し、そして、
２×SSCで洗浄し、脱水および30分間空気乾燥した。
切片を前ハイブリダイゼーション溶液（50％ホルムアミ
ド、0.3M NaCl、20mM Tris pH8.0、10％硫酸デキストラ
ン、１×デンハード溶液、100mM DTTおよび5mM EDTA)
で、42℃で、２時間インキュベートし、次いで、放射性
標識プローブを、その前ハイブリダイゼーション溶液(6
×10 ⁵cpm/切片)に加え、そして、切片を、50℃で、12〜
16時間ハイブリダイゼーションした。

【０１２５】センスおよびアンチセンスV31プローブを
作成するために、T7およびT3 RNAポリメラーゼを用いて
ゲルから精製した直鎖状のV31の727bp HincII断片を含
むプラスミドから、³⁵S-標識転写物を合成した。

【０１２６】ハイブリダイゼーションした後、切片を、
４×SSC、10mM DTTで１時間室温で洗浄し、次に、50％
ホルムアミド、１×SSC、10mM DTTで40分間、60℃で洗
浄し、最後に２×SSCと0.1×SSCで、30分づつ、それぞ
れ室温で洗浄した。 アルコール脱水した後、空気乾燥
したスライドを、Kodak NTB2 Nuclear Emulsion（42℃
まで加熱したもの）に浸し、２時間室温で空気乾燥し、
展開するときまで遮光した。 スライドを、Kodak D19
developerに４分間、４℃に置き、４回酸反応停止液(１
ml 氷酢酸/500ml蒸留水)に浸し、Kodak fixerに４分
間、４℃に置いた。このスライドを３回水道水で洗浄
し、ヘマトキシリン／エオシンで対比染色した。

【０１２７】V31アンチセンスプローブは、４種のヒト
組織試料（リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺）のそれぞれ
と強くハイブリダイズする。 反対に、V31センス鎖か
ら調製した対照プローブは、これら組織と有意にハイブ
リダイズしなかった。

【０１２８】ヒト組織におけるV31発現ノーザンブロッ
ト分析 正常ヒト組織でのV31 mRNAの特異的発現も、ノーザンブ
ロットハイブリダイゼーションによって分析した。 常
法〔例えば、Chirgwin et al., Biochemistry,18; 5294
-5299 (1979)を参照〕によって、ヒト組織からRNAを調
製し、そして、mRNAを多くするために、オリゴ-dTセル
ロースにて分画した。 mRNA試料を、ホルムアルデヒド
−アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に転
写して実施例13に示した³²P-標識V31プローブとハイブ
リダイズさせた。 V31プローブは明らかに、ヒトリン
パ組織、扁桃腺、リンパ節および脾臓とハイブリダイズ
する。副腎、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓または精
巣でのハイブリダイゼーションは認められなかった。
小腸については少量のハイブリダイゼーションが認めら
れ、これは、この組織でのリンパ突起を示すものであろ
う。

【０１２９】造血細胞系に於けるV31発現のノーザンブ
ロット分析 いくつかの造血細胞系から単離した細胞を、対数増殖期
まで培養し、遠心分離して回収し、150mM NaClで２回洗
浄し、ペレットを−70℃で保存した。 RNAを抽出する
ために、細胞をグアニジウム−イソチオシアネート緩衝
液(GIT)に懸濁し、ポリトロンミキサーで20秒間粉砕し
た。 RNA/GIT混合物を、塩化セシウムの上層に乗せ、3
5,000rpm(179,000×g)で、21時間遠心した。 RNAペレ
ットを水に懸濁し、エタノールで沈澱させ、プロテイナ
ーゼＫで処理をして混在しているRNaseを除去した。
フェノール／クロロホルム抽出後、RNAを再沈澱し、水
に再懸濁して分光光度計で定量した。

【０１３０】各RNA試料の10μｇをノーザンブロット分
析に用いた。 試料を変性し、ホルムアルデヒド／アガ
ロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写
して実施例13で示した³²P-標識V31プローブとハイブリ
ダイズさせた。

【０１３１】V31プローブは、Ｔ細胞系Hut 78、および
Ｂ細胞系RajiおよびJijoyeと強くハイブリダイズした。
Ｔ細胞系CEMも、V31とハイブリダイズするが、それほ
ど強くはなかった。 反対に、Ｔ細胞系SKW3およびMolt
4は、V31とハイブリダイズせず、また脊髄細胞系KG1、K
562、HL-60およびU937も、V31とハイブリダイズしなか
った。 ここで、ヒト組織におけるノーザンブロットお
よびin situハイブリダイゼーションの結果を確認し
た。 すなわち、V31は、特異的にリンパ系細胞および
組織で発現される。 他の造血細胞系におけるV31 mRNA
の発現に対するノーザンブロット分析の結果を、以下の
表２に示す。

【０１３２】

【表２】

【０１３３】ヒト組織および細胞系でのV28発現のノー
ザンブロット分析 様々なヒト組織におけるV28 mRNAの発現を、³²P-標識V2
8プローブを用いてノーザンブロット分析によって分析
した。

【０１３４】具体的には、凍結組織試料を乳鉢と乳棒を
使って液体窒素中で粉砕し、RNAを、ChomczynskiとSacc
hiのAPGCプロトコール[Analytical Biochemistry, 162:
156-159 (1986)]に従って単離した。 すなわち、試料
を、４Ｍグアニジウムチオシアネート緩衝液中で均質化
し、酸フェノール抽出処理とイソプロパノール沈澱処理
を何度か繰り返した。 RNA試料を、RNaseを含まないDN
ase(Stratagene Cloning System社、ラヨラ、カリフォ
ルニア州) で、30分間、37℃で処理し、混在しているDN
Aを除去し、フェノール／クロロホルム処理を２回行
い、そして、エタノール沈澱、DEPC処理水に再溶解し
て、次に使用するまで−70℃で保存した。

【０１３５】細胞系からのRNAは、上述のV31の分析方法
で述べた方法によって調製した。

【０１３６】各RNA試料の10〜30μgを、50％ホルムアミ
ドおよび3.5Mホルムアルデヒドで、10分間、60℃でイン
キュベートして変性させ、電気泳動の前に、臭化フェノ
ールブルーと臭化エチジウムを添加した。 試料を、２
％ホルムアルデヒドを含んだ1.2％アガロースゲル上に
て、90ボルトで、４時間電気泳動をした。 紫外線トラ
ンスイルミネーターで観察しながら写真撮影し、毛管現
象により、一夜、20×SSCで、RNAをゲルからニトロセル
ロース膜(Schlelcher and Schuell社)に移した。ブロッ
トしたニトロセルロース膜を、ハイブリダイゼーション
する前に、１〜２時間、真空中で、80℃で乾燥させた。

【０１３７】放射性標識V28プローブを作成するための
鋳型として、全V28をコードする配列を含む1.5kb EcoRI
断片を使用した。 標識付け、ハイブリダイゼーション
および洗浄方法の詳細は、実施例２に記載の方法に従っ
た。 ノーザンブロット分析の結果を、以下の表３に示
した。

【０１３８】

【表３】

【０１３９】ヒト組織におけるR20のノーザンブロット
分析 様々なヒト組織におけるR20の発現を、ノーザンブロッ
ト分析によって検定した。 様々なヒト組織からPoly-A
mRNAを単離し、変性アガロールゲル電気泳動によって
分画し、ニトロセルロース膜上にブロットした。

【０１４０】R20の1.5kb HidIII-PstI断片からのプロー
ブの調製は、次のようにして行った。

【０１４１】ゲルから精製した断片を50ngを取り、１μ
ｇのランダムヘキサマーとアニールさせた。 試料を、
Klenow緩衝液（実施例２参照）、dATP、dGTP、³²P-dCTP
および³²P-dTTPの存在下で、クレノウ酵素で処理し、室
温で、75分間反応させた。

【０１４２】G-25 Quikspin column (Boehringer Mannh
eim社) に通過させることで、標識断片と、取り込まれ
なかったヌクレオチドとを分離し、煮沸して変性した
後、氷上で冷却した。 このプローブは、５×SSC、50m
M NaPO₄、５×デンハード溶液および10μg/mlサケ精子D
NAを含む溶液中で、42℃で、16時間、フィルターとハイ
ブリダイズさせた。 続いて、このフィルターを、0.1
×SSC、50℃で洗浄した。ハイブリダイゼーションは、
オートラジオグラフィーによって視覚化した。

【０１４３】組織分析の結果によれば、胎盤RNAに最も
強いシグナルが認められた。 同じ見かけの分子量で観
察したリンパ節、腎臓および胸腺のRNAの場合では、よ
り弱いシグナルが得られた。 肝臓、卵巣または精巣RN
Aでは、ハイブリダイゼーションは認められなかった。

【０１４４】実施例15 V31をコードしている配列（およびその断片）とグルタ
チオン-S-トランスフェラーゼ(GST) [Smith et al., Ge
ne, 67: 31-40 (1988)]との融合タンパクとして大腸菌
で発現させるために、遺伝子操作を行った。 GSTとの
融合タンパクは、一般に大量に発現され、グルタチオン
−アガロース−ビーズ上で容易に精製することができ
る。 これらの融合タンパクは、生化学の研究において
多くの材料を提供し、抗体調製の際の免疫源として有用
である。

【０１４５】V31をコードしている全配列を遺伝子操作
により処理し、アミノ末端がGST、カルボキシル末端がV
31であるような融合タンパクを発現するプラスミドpGEX
-2Tを調製した。 プラスミドpGEX-2Tには、GSTの発現
を促進するlacプロモーターが含まれている。 GST遺伝
子の3'末端側には、BamHIとEcoRIの切断部位が含まれて
おり、またトロンビンの切断部位もコードしている。
V31の5'末端のBamHI部位とPCR直接突然変異処理を施し
た3'末端のEcoRI部位を導入して、V31遺伝子を、BamHI
とEcoRIで分解処理したpGEX-2Tにクローニングした。
5'オリゴヌクレオチド(V31-A、配列番号：47)は、pGEX-
2Tの225と226番目の残基をコードするBamHI部位とメチ
オニン開始コドン(ATG)から開始しているV31遺伝子の17
塩基を含んでいる。 下流のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド(V31-B、配列番号：48) は、EcoRI部位と天然の
停止コドンを含むV31コード配列の3'端側の17塩基を含
んでいる。 PCRは、Perkin Elmer Cetusの機器にて、
次の温度サイクルに従って行った。 最初の４分間は、
94℃にて反応せしめ、続いて、(1) 30秒間、94℃で変
性、(2) 30秒間、60℃でアニーリング、および(3) 30秒
間、72℃で伸長し、この(1)〜(3)を25サイクル行った。
反応混合液には、合計50μlの中に、１×PCR緩衝液、
0.25mM dGTP、0.25mM dATP、0.25mM dCTP、0.25mM dTT
P、0.01μg/μlの各プライマー、３×10^-7mgの鋳型DNA
および2.5単位のTaqポリメラーゼが含まれている。 PC
Rに続いて、反応液をフェノールおよびクロロホルムで
処理し、エタノール沈澱を行った。

【０１４６】次に、DNAを、37℃にて、BamHIおよびEcoR
Iで分解し、１％アガロース／２％ナシーブアガロース
ゲル上で電気泳動した。 PCR主生成物に関して、電気
泳動の移動度と予測された1241bpの大きさとが一致して
いた。 このDNAを電気泳動で溶出して、BamHIとEcoRI
で処理して、電気泳動によって単離したpGEX-2T DNA断
片と結合させた。 得られたDNAをコンピテント大腸菌
に形質導入し、新しく作成されたプラスミドpGEX-V31-F
4を含んだクローンを選び出し、分析した。

【０１４７】V31融合タンパクをコードしている挿入DNA
を、ジデオキシ末端法によって配列決定した。 V31の
最初の90個のアミノ酸（第１細胞外領域と思われる）だ
けを含んでいる短い融合タンパクも、GSTで調製した。
上述した実施例と同様にして、V31をコードする配列
をPCR直接突然変異処理し、BamHIとEcoRIの切断部位を
導入した。

【０１４８】5'オリゴヌクレオチド(V31-A)は、最初のG
ST融合タンパクの調製に使用したものと同一で、GST遺
伝子のBamHI部位とV31遺伝子の17塩基を含んでいる。
下流のアンチセンスオリゴヌクレオチド(V31-C、配列番
号：49)は、V31遺伝子の18塩基を含み(V31の90番目のア
ミノ酸の後に)、停止コドンが導入され、その後にEcoRI
部位が続いている。 PCRの条件は、最初のGST融合タン
パクの調製の時と全く同様に行った。 PCR生成物は、
フェノール／クロロホルム抽出を行い、BamHIとEcoRIで
分解した。 このDNAを、１％アガロース／２％ナシー
ブアガロースゲル上で電気泳動したところ、予想したサ
イズの281bpの移動度が観察された。 このDNAを電気泳
動で溶出し、pGEX-2Tと結合させた。 得られたプラス
ミドの挿入部分、pGEX-V31-N1、を塩基配列分析で確認
した。

【０１４９】４つの細胞外領域全体と融合したGSTを含
む第３の融合タンパクを調製した。

【０１５０】V31のアミノ酸配列の領域は、親水性に基
づいた領域として定義され、各領域の末端には１〜５の
疎水性残基が含まれる（トラスメンブランセグメントを
形成する)。 この分子のデザインによって領域間を分
割するため、融合タンパクは、全体的な親水性の性質に
変化はない。 PCR反応を４つに分けて行い、各領域を
コードしているDNAを増幅した。 領域をコードしてい
る配列を融合するために用いた方法は、Erlich, Ed., p
p.61-70 in PCR Technology, Stocken Press,New York,
(1989)に概要がまとめられている。 使用したたいてい
の5'オリゴヌクレオチド(V31-A)は、前項の２つのV31融
合タンパクで使用したものと同一であり、GST遺伝子配
列に連結するためのBamHI部位を含んでいた。 3'オリ
ゴヌクレオチド(V31-J、配列番号：56）は、V31遺伝子
の17塩基を含み、V31の343位のアミノ酸の後に停止コド
ンが導入され、その後に、EcoRI部位が続いている。

【０１５１】オリゴヌクレオチドV31-D(配列番号：50)
は、上流のV31-Aと対を形成して第１細胞外領域をコー
ドする249bpの断片を増幅する。 V31-Aオリゴヌクレオ
チドも、第２細胞外領域オリゴヌクレオチド(V31-E、配
列番号：51) に相同性を示す12個の塩基を含んでいる。
第二細胞外領域を、オリゴヌクレオチドV31-EとV31-F
(配列番号：52)で増幅した。 オリゴヌクレオチドV31-
Eは、第１細胞外領域の12塩基を含み、その後に第２細
胞外領域の17塩基が続いている。 つまり、第１細胞外
領域3'末端のPCR生成物は、第２細胞外領域5'末端のPCR
生成物と比較すると、24個の同一のアミノ酸を含んでお
り、このため２つのPCR生成物が一緒にアニーリングさ
れ、（オリゴヌクレオチドV31-AやオリゴヌクレオチドV
31-Fを使ってPCRにより）融合したDNA断片と同様に再び
増幅される。 この増幅方法は、第３および第４細胞外
領域にも応用した。 第３細胞外領域は、オリゴV31-G
(配列番号：53)とV31-H(配列番号：54)を使って増幅
し、また、第４細胞外領域は、オリゴV31-I(配列番号：
55)とV31-Jを使って増幅し、得られたPCR断片をアニー
ルし、オリゴV31-GおよびV31-Jを使って再び増幅した。
最後に、第１／第２と第３／第４細胞外領域を含んで
いる２つのDNA断片を、断片をアニーリングしてオリゴ
ヌクレオチドV31-AとV31-Jを使った３回目のPCR反応に
よって増幅することで融合した。 PCRの条件とBamHIと
EcoRIによる分解は、最初の２つのV31融合タンパクと同
様に行った。 最初の４つのPCR反応の生成物を、１％
アガロース／２％ナシーブアガロース上で電気泳動した
ところ、各反応物は、予想通りのサイズの断片であった
（１〜４細胞外領域それぞれ294bp、75bp、105bpおよび
111bp)。２回目の増幅反応も同様のPCRの条件で行われ
たが、目的とする配列は、電気泳動ゲルに直接マイクロ
ピペットのチップを突き刺して抜き出した。 取り出し
たアガロース（体積にして２〜３μl)は、そのまま２回
目のPCR反応に使用した。

【０１５２】これらの反応物は、予想通りのDNA断片の
サイズ、すなわち、345bp (第１／第２細胞外領域）お
よび192bp(第３／第４細胞外領域）を示した。 これら
１度アニーリングしたDNA断片を、同様に鋳型DNAとして
用い、オリゴV31-AおよびV31-Jを使った最後のPCR反応
に使用した。 最終のPCR生成物を、BamHIおよびEcoRI
で分解したところ、予測された513bpに一致した移動度
を示した。 このDNAを、電気泳動溶出し、pGEX-2Tと結
合させた。 得られたプラスミドを、pGEX-V31-XI0と
し、予想通りのDNA塩基配列であることを確認した。

【０１５３】増幅した配列とGST遺伝子との接合部の塩
基配列を調べて、全部で３つのデザインした遺伝子が適
当に構築されているかどうかを調べた。 ３つのGST/V3
1融合遺伝子を大腸菌中で培養し、これらの合成物をIPT
Gで誘導した。 培養は、後期指数増殖期まで行い、遠
心により集菌した。 細胞をPBSに懸濁し、超音波で粉
砕した。 細胞破壊物を遠心して除き、上清にグルタチ
オン−アガロースビーズ(Sigma社)を混合した。 次
に、このビーズをPBSでよく洗浄した。 ビーズに結合
したタンパクは、還元型グルタチオン(Sigma社)を加え
て溶出した。 精製過程の各段階から一部試料を取り、
SDSポリアルリルアミドゲル電気泳動により、タンパク
の分析を行った。 GSTは、この方法で容易に精製さ
れ、グルタチオン−アガロースから主要タンパクとして
(90％以上)溶出される。 全長V31をコードする配列を
含むGST融合タンパクは、全長の融合タンパクより分子
量の小さいいくつかのタンパクのバンドを示した（GST
より1000、2500および4000ダルトン大きい)。 これら
の生成物は、グルタチオン−アガロースビーズから溶出
されたが、GSTよりも低いレベルで発現されていた。
これらのタンパクは、タンパク分解を受けたのかもしれ
ない（下記参照）。 全長V31-GST融合タンパクの分子
量に相当するバンドは認められなかった。

【０１５４】第１細胞外領域(pGEX-V31-N1)を含むGST融
合タンパクは、グルタチオンアガロースでの精製後にい
くつかのバンドを示した。 予想されたサイズに近い
（GSTより10,000ダルトン大きい）バンドの一つと、そ
れより小さい３つのバンドは、全長のV31を含むGST融合
タンパクと同一の移動度を示した。

【０１５５】４つ全ての細胞外領域を含むGST融合タン
パク(pGEX-V31-X10)の精製も試みた。

【０１５６】極小量のタンパクが、グルタチオン−アガ
ロースビーズから溶出されたが、pGEX-V31-F4のバン
ド、および、さらに小さいpGEX-V31-X10のバンドと同様
の移動度を示した。 しかし、大量のタンパクが細胞ペ
レットに結合しており、これらは予想された融合タンパ
クのサイズに一致した移動度を示した。 電気泳動的に
精製した材料でアミノ末端のアミノ酸配列の決定を行っ
たところ、その配列は、GSTのアミノ末端の配列であっ
た。 このタンパクは、４つのV31細胞外領域を有するG
ST融合タンパクで、タンパク合成中に封入体を形成した
と思われる。 従って、不溶化して細胞ペレットに結合
したのかも知れない。

【０１５７】V31がプロテアーゼを認識することは、何
度か観察されている。 V31の構造は、トロンビンレセ
プターの構造に極めてよく似ている。 V31は、トロン
ビンレセプターに対して30％の相同性を示し、両分子と
も通常長い第１細胞外領域を有する(V31は89残基、トロ
ンビンは100残基)。 トロンビンレセプターは、第１細
胞外領域内にトロンビン切断部位を持ち、このレセプタ
ーは、タンパク分解後活性型となる。 V31は、主なタ
ンパク分解認識配列をもち、そこに連続した５個のリシ
ン(第18〜第22位のアミノ酸)が含まれている。 この配
列は、塩基残基に特異性を示すプロテアーゼにとって良
好な標的となるはずである（このようなプロテアーゼは
いくつか存在する、例えばトリプシン）。 さらに、GS
T-V31融合タンパクの実験的観察から、第１細胞外領域
は、明らかに大腸菌のプロテアーゼの標的になってい
る。 ３つの融合タンパクをそれぞれ単離する間、前項
で述べたように、ある種の材料は、一部が分解されてい
ることがわっかた。 第１細胞外領域は、３つの融合タ
ンパクに共通する唯一の配列であることから、タンパク
分解を受けるのはおそらくこの部位である。 分解生成
物の内、少なくとも一つの大きさ(GSTより2500ダルトン
大きい)は、連続したリシンの位置もしくはその近傍で
分解を受けたことと一致する。 この結果から、第１細
胞外領域は、大腸菌のプロテアーゼの分解を受けること
が示唆されるが、ヒトのプロテアーゼでも分解され、in
vivoでV31のシグナル形質導入が展開されると考えられ
る。

【０１５８】実施例16 R20配列の細胞外領域も、GSTとの融合タンパクが大腸菌
で発現するように遺伝子操作を施した。 V31領域に関
して実施例15に記載したようにして、R20領域はその親
水性によって選択した。 ４つの独立したPCR反応を行
い、それぞれの領域を増幅した。

【０１５９】5'オリゴヌクレオチド(R20-X1、配列番
号：57)は、GST遺伝子との結合用にBamHI部位をコード
し、続いて(メチオニン開始コドンで始まる)R20遺伝子
の15ヌクレオチドが続く。 たいていの3'オリゴヌクレ
オチド (R20-Y4、配列番号：64)は、R20遺伝子(第４細
胞外コード部分)の18残基を含み、R20の289番目のアミ
ノ酸の後に停止コドンが導入されており、続いてEcoRI
部位が導入されている。第１細胞外領域をコードする配
列は、実施例15に記載された条件を用い、オリゴヌクレ
オチドR20-X1およびR20-Y1（配列番号：58）でPCRを行
って、調製した。同様にして、第２、第３、第４細胞外
領域をコードする配列を、それぞれR20-X2(配列番号：5
9)とR20-Y2(配列番号：60)、R20-X3(配列番号：61)とR2
0-Y3(配列番号：62)、および、R20-X4(配列番号：63)と
R20-Y4のプライマー対を用いて増幅した。 実施例15と
同様にして、第１および第２細胞外領域をコードする配
列を、２回目のPCR反応で融合した。 (プライマーR20-
Y1とR20-X2は、30個のヌクレオチドが重複しており、２
つのPCR生成物のアニーリングを許容する融合したDNAを
増幅するために、このPCR反応には、１回目の２つのPCR
生成物とプライマーR20-X1とR20-Y2が含まれている。）
第３および第４細胞外領域をコードする配列も、同様
にプライマーR20-X3とR20-Y4を用いて、PCR反応で融合
した。 最後に２回目の反応から得られたPCR生成物を
アニーリングさせて、プライマーR20-X1とR20-Y4を用い
た３回目のPCR反応で増幅した。 この反応によって、
第４細胞外領域をコードするDNAが得られた。 次に、
実施例15に従って、このDNAをBamHIとEcoRIで分解し、p
GEX-2Tと結合させた。 得られたプラスミドをpGEX-RDF
6と命名し、挿入部をDNA塩基配列分析で確認した。

【０１６０】実施例15に従って、プラスミドを持つ大腸
菌を培養し、GST-R20領域融合タンパクの生産を分析し
た。 適当な移動度を示すタンパクのバンドが、SDS-PA
GEグルタチオン−アガロース精製物質上で観察された。
より低分子量（約1000ダルトン小さい）の試料もいく
つか観察され、タンパク分解物があるものと思われた。
これらの全てのバンドはトロンビンで分解され、GSTと
同時に泳動するバンドが得られた。 この結果から、大
腸菌の培養により、R20細胞外領域配列とのGST融合タン
パクが産生されることが示唆された。 下記の実施例18
に記載されている通り、グルタチオン−アガロース上で
精製した物質で直接マウスを免疫し、抗体を調製した。

【０１６１】実施例17 実施例15および16と同様の方法で、V31-BとV28をコード
する配列を操作して、GST融合タンパクを発現させた。

【０１６２】挿入部でコードされている配列（実施例３
のV31-B cDNAまたは実施例７のV28cDNA）を、pGEX-2Tの
BamHIおよびEcoRI部位にクローニングした。 このプラ
スミドを持つ１個の細菌コロニーを、50mlのＬ培地／カ
ルベニシリンに植菌し、37℃で一夜培養した。 一夜培
養した培地を、Ｌ培地／カルベニシリンで10倍に希釈し
て500mlとし、37℃で1.5時間培養した。 IPTGを１mMに
なるように加え、37℃で3.5時間培養した。 細菌をペ
レットにし、15mlのPBS/１％ Triton X-100に溶解し、
氷中で45秒間超音波処理して細胞破砕した。 この均質
物を取り、マイクロ遠心機で、最高速度で、５分間遠心
した。 細胞を、３mlのPBS/１％ Triton X-100に懸濁
した。 試料の半分量に、3.5mlの水、4.5mlの２×試料
緩衝液、および0.5mlの2M DTTを加えて全量を10mlとし
た。 試料を３分間煮沸し、２つの10％アクリルアミド
SDS調製用ゲルに乗せる前に遠心した。 ゲルは、30mA
でおよそ15時間泳動し、氷冷0.4M塩化カリウム中でイン
キュベートしてタンパクのバンドを視覚化した。 誘導
したバンドを切り出し、透析チューブ中で、約10mlのTr
is−グリシン緩衝液(SDS含まず)で、４時間、50Aで電気
泳動溶出した。 必要な場合は、溶出した融合タンパク
を、30kd分子量分離基準のAmiconミクロ濃縮機で濃縮し
た。

【０１６３】実施例18 V31融合タンパク質に対する抗体の調製 実施例15で述べたGST-V31融合タンパクV31-N1およびV31
-X10を、グルタチオン−アガロース上で精製し、同量の
フロインドアジュバンド(初回注入は完全アジュバン
ド、それ以降は不完全アジュバンド)で乳化した。 ２
匹のBalb/cマウスを初回免疫し、続いて約200μlで免疫
した。 次の免疫は２週間毎に行い、３回後に後眼点よ
り採血して屠殺せしめた。

【０１６４】免疫学的反応性を、ウエスタンブロット分
析で検定した。 約25μgの免疫タンパクまたはGSTを、
10％ポリアクリルアミドゲルに溶解し、ニトロセルロー
ス膜に転写した。 フィルターを、５％脱脂乾燥ミルク
および１％BSAを含むPBS中で、２〜15時間、４℃でブロ
ックした。 （前免疫または免疫処置した）血清を、ブ
ロッキング緩衝液で１：50に希釈し、最終体積を２mlと
した。 フィルター細片を用いて、４℃で、１時間イン
キュベートし、50mlのPBSで、３回洗浄した。 セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼを結合したヒツジ抗マウスIg
抗体（Amersham社)を、PBSで１：500に希釈し、各フィ
ルターと共に、１時間、４℃でインキュベートした。
フィルターを、100mlのPBSで、３回洗浄し、５mlの3,3'
ジアミノベンジジン(10mM Tris-HCl；0.6％ NiCl₂；0.0
6％ H₂O₂中にて0.6mg/ml)の中に置いた。 V31融合タン
パクに対する免疫反応性が、V31-N1およびV31-X10で免
疫処置したマウスの血清から観察された。 さらに、免
疫反応性は、スロンビンで分解したV31-N1生成物(GSTお
よびV31アミノ末端領域双方)に対しても観察された。

【０１６５】V31ペプチドに対する抗体の産生 V31ペプチドは、V31特異性抗体を生成するものを使用す
る。

【０１６６】例えば、以下のペプチドである。

【０１６７】

【化１０】

【０１６８】12番目のアミノ酸残基（システイン）をペ
プチドに加えて、免疫源運搬体のためのペプチドの接合
体を作成した。

【０１６９】他のペプチドとして、例えば、以下のペプ
チドがある。

【０１７０】

【化１１】

【０１７１】ペプチドECDN-Bは、V31の第１細胞外領域
のアミノ末端に相当し、ペプチドECD2は、V31の第２細
胞外領域の領域に相当する。

【０１７２】実施例19 本発明の7TMレセプターに対する細胞外および細胞内リ
ガンドの同定には、様々な方法がある。

【０１７３】例えば、7TMレセプターは、Ｇタンパクと
結合して、生物学的反応に影響を与えることから、Ｇタ
ンパクによって利用される二次シグナル伝達 [Linder e
t al., Sci. Am., 267: 56-65,(1992)] を利用して、組
換え体7TMレセプターの機能を検定できる。 Ｇタンパ
クエフェクター分子（例えば、アデニルシクラーゼ、ホ
スホリパーゼＣ、イオンチャンネルおよびホスホジエス
テラーゼ）の活性の検定については既に報告されてい
る。 例えば、サイクリックAMPの濃度が、市販のラジ
オイムノアッセイで測定できることや、ホスホイノシタ
イド生成物が容易に観察できること[Downes et al., Bi
ochem. J. 198: 133-140 (1981)]、それに、細胞内カル
シウムイオンの一次的放出が、分光蛍光法で観察できる
ことが報告されている。 これらの検定は、本発明の7T
Mレセプターを発現する哺乳動物細胞で行うことがで
き、7TMレセプターの潜在的リガンドの同定または精製
のための試験化合物の存在および非存在下で可能であ
る。 また、7TMレセプターの作用薬または拮抗薬の同
定または精製に、利用できると考えられる。

【０１７４】他の例として、カルシウム流動検定法が、
本発明の7TMレセプターに対するリガンドを含む溶液ま
たは細胞抽出物の同定に利用できる。 特に、本発明の
7TMレセプターをコードするDNA配列で形質変換した293
細胞を、10cmプレート上のMEM+10％血清中で、約90％の
細胞密度に達するまで培養する。 細胞を、CMF-PBSで
洗浄し、4ml MEM+10％血清＋１μM Fura-2 AM(分子プロ
ーブ、１mM濃度を、DMSOに溶解保存し、分割して冷凍保
存したもの）中で、30分間、室温でインキュベートし
て、Fura-2を添加する。 細胞を再び洗浄し、ヴェルシ
ーンを用いてプレートから除去する。 細胞をペレット
にし、D-PBS(１mM Ca⁺⁺を含む)で洗浄し、約500μlのD-
PBSで懸濁し、濃度が約10⁷/mlになるようにした。 Hit
achi F-4010蛍光分光光度計で、蛍光の変化を測定す
る。 約10⁶個の細胞を、合計1.8mlのD-PBSで懸濁し、3
7℃の温度を保ちながらキュベットを攪拌した。 励起
波長を、340nmから380nmの間で、４秒間隔で変化させ、
510nmにて蛍光をモニターする。試験化合物を注入部か
ら添加する。 実験の終了時にイノマイシンを加えてCa
⁺⁺の最高流動を測定する。

【０１７５】一次的なCa⁺⁺の流動は、試験溶液中に存在
する7TMレセプターのリガンドの存在の指標になる。

【０１７６】配列表のフリーテキスト<210> ２（配列番
号：２）<222> 12<223> この位置での修飾塩基は、イノ
シンである。<210> ２（配列番号：２）<222> 15<223>
この位置での修飾塩基は、イノシンである。<210> ２
（配列番号：２）<222> 18<223> この位置での修飾塩基
は、イノシンである。<210> ２（配列番号：２）<222>
置換 (21,"")<223> この位置でのヌクレオチドも、イノ
シンであると思われる。<210> ２（配列番号：２）<222
> 27<223> この位置での修飾塩基は、イノシンである。

【０１７７】

【発明の効果】このように本願発明によれば、所期の目
的であった、シグナル伝達に関与する新規の7-トランス
メンブランレセプターおよびその変異体、それに、これ
らの発現をコードするDNA配列を獲得できる。

【０１７８】また、前出のDNA配列を取り込んだプラス
ミドとウイルスDNAを含むベクターを作成することで、
細胞内または細胞外での遺伝子発現を可能ならしめ、こ
れにより、原核または真核細胞の宿主を安定して本発明
のDNA配列で形質転換または形質導入でき、目的とする7
TMレセプターポリペプチドまたは変異体ポリペプチドが
これら宿主細胞において発現および取得できる。

【０１７９】さらに、これら新規の7TMレセプターを発
現する宿主細胞は、7TMレセプター結合の作用薬または
拮抗薬を同定するための分析においても有用である。

【０１８０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ICOS CORPORATION <120> NOVEL TRANSMEMBRANE RECEPTORS <130> 2000PA0236 <140> PCT/US93/11153 <141> 1993-11-17 <150> US 07/977,452 <141> 1992-11-17 <160> 64 <210> 1 <211> 69 <212> DNA <400> 1 gacggatccg tttttctgtt gaatttggct ctggctgacy taykctttky mctgacyttg 60 ccmmtstgg 69 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <220> <221> modified base <222> (12) <223> The modified base at this position is an inosine. <220> <221> modified base <222> (15) <223> The modified base at this position is an inosine. <220> <221> modified base <222> (18) <223> The modified base at this position is an inosine. <220> <221> misc difference <222> (replace (21, "")) <223> The nucleotide at this position may also be an inosine. <220> <221> modified base <222> (27) <223> The modified base at this position is an inosine. <400> 2 ggctaagctt gnacnatngc yagrtancgr tc 32 <210> 3 <211> 120 <212> DNA <400> 3 gtggataaag aagcatctct aggactgtgg aggacgggct ccttcctgtg caaagggagc 60 tcctacatga tctccgtcaa tatgcactgc agtgtcctcc tgctcacttg catgagtgtt 120 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <400> 4 tgggcctaca gcgcggccaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <400> 5 tcaatgctga tgcaaagaag 20 <210> 6 <211> 2058 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (166)...(1395) <400> 6 gatgaaccac tattcctccg cctgggcaac atggcagaat cccatctcta ctaaaaatac 60 aaaaattcgc tggggtgtgg tggcataagg ctgtggtccc agctactcag gaggctgaag 120 tggaaggatc acctgagcct ggagaggccg aggctgcagg gagcc atg att gca 174 Met Ile Ala 1 cca ctg cac tcc agc ctg ggc aac aga gtg aga cca tgt ctc aag aaa 222 Pro Leu His Ser Ser Leu Gly Asn Arg Val Arg Pro Cys Leu Lys Lys 5 10 15 aaa aaa aaa gaa aga aac cac tgc tct agg cta aat ccc agc cag agt 270 Lys Lys Lys Glu Arg Asn His Cys Ser Arg Leu Asn Pro Ser Gln Ser 20 25 30 35 tgg agc cac cca gct aaa ctg gcc tgt ttt ccc tca ttt cct tcc ccg 318 Trp Ser His Pro Ala Lys Leu Ala Cys Phe Pro Ser Phe Pro Ser Pro 40 45 50 aag gta tgc ctg tgt caa gat gag gtc acg gac gat tac atc gga gac 366 Lys Val Cys Leu Cys Gln Asp Glu Val Thr Asp Asp Tyr Ile Gly Asp 55 60 65 aac acc aca gtg gac tac act ttg ttc gag tct ttg tgc tcc aag aag 414 Asn Thr Thr Val Asp Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Leu Cys Ser Lys Lys 70 75 80 gac gtg cgg aac ttt aaa gcc tgg ttc ctc cct atc atg tac tcc atc 462 Asp Val Arg Asn Phe Lys Ala Trp Phe Leu Pro Ile Met Tyr Ser Ile 85 90 95 att tgt ttc gtg ggc cta ctg ggc aat ggg ctg gtc gtg ttg acc tat 510 Ile Cys Phe Val Gly Leu Leu Gly Asn Gly Leu Val Val Leu Thr Tyr 100 105 110 115 atc tat ttc aag agg ctc aag acc atg acc gat acc tac ctg ctc aac 558 Ile Tyr Phe Lys Arg Leu Lys Thr Met Thr Asp Thr Tyr Leu Leu Asn 120 125 130 ctg gcg gtg gca gac atc ctc ttc ctc ctg acc ctt ccc ttc tgg gcc 606 Leu Ala Val Ala Asp Ile Leu Phe Leu Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala 135 140 145 tac agc gcg gcc aag tcc tgg gtc ttc ggt gtc cac ttt tgc aag ctc 654 Tyr Ser Ala Ala Lys Ser Trp Val Phe Gly Val His Phe Cys Lys Leu 150 155 160 atc ttt gcc atc tac aag atg agc ttc ttc agt ggc atg ctc cta ctt 702 Ile Phe Ala Ile Tyr Lys Met Ser Phe Phe Ser Gly Met Leu Leu Leu 165 170 175 ctt tgc atc agc att gac cgc tac gtg gcc atc gtc cag gct gtc tca 750 Leu Cys Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Val Ala Ile Val Gln Ala Val Ser 180 185 190 195 gct cac cgc cac cgt gcc cgc gtc ctt ctc atc agc aag ctg tcc tgt 798 Ala His Arg His Arg Ala Arg Val Leu Leu Ile Ser Lys Leu Ser Cys 200 205 210 gtg ggc atc tgg ata cta gcc aca gtg ctc tcc atc cca gag ctc ctg 846 Val Gly Ile Trp Ile Leu Ala Thr Val Leu Ser Ile Pro Glu Leu Leu 215 220 225 tac agt gac ctc cag agg agc agc agt gag caa gcg atg cga tgc tct 894 Tyr Ser Asp Leu Gln Arg Ser Ser Ser Glu Gln Ala Met Arg Cys Ser 230 235 240 ctc atc aca gag cat gtg gag gcc ttt atc acc atc cag gtg gcc cag 942 Leu Ile Thr Glu His Val Glu Ala Phe Ile Thr Ile Gln Val Ala Gln 245 250 255 atg gtg atc ggc ttt ctg gtc ccc ctg ctg gcc atg agc ttc tgt tac 990 Met Val Ile Gly Phe Leu Val Pro Leu Leu Ala Met Ser Phe Cys Tyr 260 265 270 275 ctt gtc atc atc cgc acc ctg ctc cag gca cgc aac ttt gag cgc aac 1038 Leu Val Ile Ile Arg Thr Leu Leu Gln Ala Arg Asn Phe Glu Arg Asn 280 285 290 aag gcc atc aag gtg atc atc gct gtg gtc gtg gtc ttc ata gtc ttc 1086 Lys Ala Ile Lys Val Ile Ile Ala Val Val Val Val Phe Ile Val Phe 295 300 305 cag ctg ccc tac aat ggg gtg gtc ctg gcc cag acg gtg gcc aac ttc 1134 Gln Leu Pro Tyr Asn Gly Val Val Leu Ala Gln Thr Val Ala Asn Phe 310 315 320 aac atc acc agt agc acc tgt gag ctc agt aag caa ctc aac atc gcc 1182 Asn Ile Thr Ser Ser Thr Cys Glu Leu Ser Lys Gln Leu Asn Ile Ala 325 330 335 tac gac gtc acc tac agc ctg gcc tgc gtc cgc tgc tgc gtc aac cct 1230 Tyr Asp Val Thr Tyr Ser Leu Ala Cys Val Arg Cys Cys Val Asn Pro 340 345 350 355 ttc ttg tac gcc ttc atc ggc gtc aag ttc cgc aac gat ctc ttc aag 1278 Phe Leu Tyr Ala Phe Ile Gly Val Lys Phe Arg Asn Asp Leu Phe Lys 360 365 370 ctc ttc aag gac ctg ggc tgc ctc agc cag gag cag ctc cgg cag tgg 1326 Leu Phe Lys Asp Leu Gly Cys Leu Ser Gln Glu Gln Leu Arg Gln Trp 375 380 385 tct tcc tgt cgg cac atc cgg cgc tcc tcc atg agt gtg gag gcc gag 1374 Ser Ser Cys Arg His Ile Arg Arg Ser Ser Met Ser Val Glu Ala Glu 390 395 400 acc acc acc acc ttc tcc cca taggcgactc ttctgcctgg actagaggga 1425 Thr Thr Thr Thr Phe Ser Pro 405 410 cctctcccag ggtccctggg gcggggatag ggagnagatg caatgactca ggacatcccc 1485 ccgccaaaag ctgctcaggg aaaagcagct ctcccctcag agtgcaagcc ctgctccaga 1545 agttagcttc accccaatcc cagctacctc aaccaatgcc gaaaaagaca gggctgataa 1605 gctaacacca gacagacaac actgggaaac agaggctatt gtcccctaaa ccaaaaactg 1665 aaagtgaaag tccagaaact gttcccacct gctggagtga aggggccaag gagggtgagt 1725 gcaaggggcn gtgggagtgg cctgaagagt cctctgaatg aaccttctgg cctcccacag 1785 actcaaatgc tcagaccagc tcttccgaaa accaggcctt atctccaaga ccagagatag 1845 tggggagact tcttggcttg gtgaggaaaa gcggacatca gcagctggtc aaacaaactc 1905 tctgaacccc tccctccatc gttttcttca ctgtcctcca agccagcggg aatgcagctg 1965 ccacgccgcc ctaaaagcac actcatcccc tcacttgccg cgtcgccctc ccaggctctc 2025 aacaggggag agtgtggtgt ttccttcctg cag 2058 <210> 7 <211> 410 <212> PRT <400> 7 Met Ile Ala Pro Leu His Ser Ser Leu Gly Asn Arg 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Leu Ser Gln Glu Gln Leu 340 345 350 Arg Gln Trp Ser Ser Cys Arg His Ile Arg Arg Ser Ser Met Ser Val 355 360 365 Glu Ala Glu Thr Thr Thr Thr Phe Ser Pro 370 375 <210> 16 <211> 360 <212> DNA <220> <221> intron <222> (253)...(360) <220> <221> CDS <222> (243)...(251) <220> <221> TATA signal <222> (151)...(156) <220> <221> 5' UTR <222> (180)...(242) <400> 16 ggatcctatg accagcgact gtcaccctct gtcacctttc ttctgccctt tatctctgaa 60 ggcattgaag gggccctgca tgagtcaggg agggctgggg ggaggagcaa gggtgggagg 120 ggcagggaag agggtggctt ctccgacaac ttaaaagggg cttgaaccac ttcctcccca 180 gacaggggta gtgcgaggcc gggcacagcc ttcctgtgtg gttttaccgc ccagagagcg 240 tc atg gac ctg ggtgagtgag cctcttcatg tgagaaggaa cagtaccagg 291 Met Asp Leu 1 gtcttggaca cccagactga ccctgtggaa tgggggtgga ggatgcgggt ggagcgcata 351 ggggtgctt 360 <210> 17 <211> 3 <212> PRT <400> 17 Met Asp Leu 1 <210> 18 <211> 1900 <212> DNA <220> <221> intron <222> (1)...(168) <220> <221> exon <222> (169)...(1245) <220> <221> 3' UTR <222> (1246)...(1900) <400> 18 ctgcagggag ccatgattgc accactgcac tccagcctgg gcaacagagt gagaccatgt 60 ctcaagaaaa aaaaaaaaga aagaaaccac tgctctaggc taaatcccag ccagagttgg 120 agccacccag ctaaactggc ctgttttccc tcatttcctt ccccgaag gta tgc ctg 177 Val Cys Leu 1 tgt caa gat gag gtc acg gac gat tac atc gga gac aac acc aca gtg 225 Cys Gln Asp Glu Val Thr Asp Asp Tyr Ile Gly Asp Asn Thr Thr Val 5 10 15 gac tac act ttg ttc gag tct ttg tgc tcc aag aag gac gtg cgg aac 273 Asp Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Leu Cys Ser Lys Lys Asp Val Arg Asn 20 25 30 35 ttt aaa gcc tgg ttc ctc cct atc atg tac tcc atc att tgt ttc gtg 321 Phe Lys Ala Trp Phe Leu Pro Ile Met Tyr Ser Ile Ile Cys Phe Val 40 45 50 ggc cta ctg ggc aat ggg ctg gtc gtg ttg acc tat atc tat ttc aag 369 Gly Leu Leu Gly Asn Gly Leu Val Val Leu Thr Tyr Ile Tyr Phe Lys 55 60 65 agg ctc aag acc atg acc gat acc tac ctg ctc aac ctg gcg gtg gca 417 Arg Leu Lys Thr Met Thr Asp Thr Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Val Ala 70 75 80 gac atc ctc ttc ctc ctg acc ctt ccc ttc tgg gcc tac agc gcg gcc 465 Asp 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60 Val Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Phe 65 70 75 80 Val Ala Thr Leu Pro Phe Trp Thr His Tyr Leu Ile Asn Glu Lys Gly 85 90 95 Leu His Asn Ala Met Cys Lys Phe Thr Thr Ala Phe Phe Phe Ile Gly 100 105 110 Phe Phe Gly Ser Ile Phe Phe Ile Thr Val Ile Ser Ile Asp Arg Tyr 115 120 125 Leu Ala Ile Val Leu Ala Ala Asn Ser Met Asn Asn Arg Thr Val Gln 130 135 140 His Gly Val Thr Ile Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Ala Ile Leu Val 145 150 155 160 Ala Ala Pro Gln Phe Met Phe Thr Lys Gln Lys Glu Asn Glu Cys Leu 165 170 175 Gly Asp Tyr Pro Glu Val Leu Gln Glu Ile Trp Pro Val Leu Arg Asn 180 185 190 Val Glu Thr Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Pro Leu Leu Ile Met Ser 195 200 205 Tyr Cys Tyr Phe Arg Ile Ile Gln Thr Leu Phe Ser Cys Lys Asn His 210 215 220 Lys Lys Ala Lys Ala Ile Lys Leu Ile Leu Leu Val Val Ile Val Phe 225 230 235 240 Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Val Met Ile Phe Leu Glu Thr Leu 245 250 255 Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Pro Ser Cys Asp Met Arg Lys Asp Leu Arg 260 265 270 Leu Ala Leu Ser Val Thr Glu Thr Val Ala Phe Ser His Cys Cys Leu 275 280 285 Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu 290 295 300 Tyr His Leu Tyr Gly Lys Cys Leu Ala Val Leu Cys Gly Arg Ser Val 305 310 315 320 His Val Asp Phe Ser Ser Ser Glu Ser Gln Arg Ser Arg His Gly Ser 325 330 335 Val Leu Ser Ser Asn Phe Thr Tyr His Thr Ser Asp Gly Asp Ala Leu 340 345 350 Leu Leu Leu 355 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <400> 33 tgggtggata aagaagcatc tc 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <400> 34 aacactcatg caagtgagca 20 <210> 35 <211> 720 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (258)...(719) <400> 35 gaattctttt tgtattctaa tacagttcaa atcagtgtgg ctggttcatt tcaactcctt 60 cactaccaaa ctaggaggca gggactggct tcagtttttc tgccttctct ttttcactga 120 tgaccagggt ataaagatat ctgctgcatc gaactttaaa cttcacattg tccttatttt 180 tcttgatctt gacagattca gcatcctttc attgggctgt gaacagaaag tccagatttg 240 gaatctgctc tttggtg atg gac cca gaa gaa act tca gtt tat ttg gat 290 Met Asp Pro Glu Glu Thr Ser Val Tyr Leu Asp 1 5 10 tat tac tat gct acg agc cca aac tct gac atc agg gag acc cac tcc 338 Tyr Tyr Tyr Ala Thr Ser Pro Asn Ser Asp Ile Arg Glu Thr His Ser 15 20 25 cat gtt cct tac acc tct gtc ttc ctt cca gtc ttt tac aca gct gtg 386 His Val Pro Tyr Thr Ser Val Phe Leu Pro Val Phe Tyr Thr Ala Val 30 35 40 ttc ctg act gga gtg ctg ggg aac ctt gtt ctc atg gga gcg ttg cat 434 Phe Leu Thr Gly Val Leu Gly Asn Leu Val Leu Met Gly Ala Leu His 45 50 55 ttc aaa ccc ggc agc cga aga ctg atc gac atc ttt atc atc aat ctg 482 Phe Lys Pro Gly Ser Arg Arg Leu Ile Asp Ile Phe Ile Ile Asn Leu 60 65 70 75 gct gcc tct gac ttc att ttt ctt gtc aca ttg cct ctc tgg gtg gat 530 Ala Ala Ser Asp Phe Ile Phe Leu Val Thr Leu Pro Leu Trp Val Asp 80 85 90 aaa gaa gca tct cta gga ctg tgg cgg acg ggc tcc ttc ctg tgc aaa 578 Lys Glu Ala Ser Leu Gly Leu Trp Arg Thr Gly Ser Phe Leu Cys Lys 95 100 105 ggg agc tcc tac atg atc tcc gtc aat atg cac tgc agt gtc ctc ctg 626 Gly Ser Ser Tyr Met Ile Ser Val Asn Met His Cys Ser Val Leu Leu 110 115 120 ctc act tgc atg agt gtt gac cgc tac ctg gcc att gtg tgg cca gtc 674 Leu Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val Trp Pro Val 125 130 135 gta tcc agg aaa ttc aga agg aca gac tgt gca tat gta gtc tgt g 720 Val Ser Arg Lys Phe Arg Arg Thr Asp Cys Ala Tyr Val Val Cys 140 145 150 <210> 36 <211> 154 <212> PRT <400> 36 Met Asp Pro Glu Glu Thr Ser Val Tyr Leu Asp Tyr Tyr Tyr Ala Thr 1 5 10 15 Ser Pro Asn Ser Asp Ile Arg Glu Thr His Ser His Val Pro Tyr Thr 20 25 30 Ser Val Phe Leu Pro Val Phe Tyr Thr Ala Val Phe Leu Thr Gly Val 35 40 45 Leu Gly Asn Leu Val Leu Met Gly Ala Leu His Phe Lys Pro Gly Ser 50 55 60 Arg Arg Leu Ile Asp Ile Phe Ile Ile Asn Leu Ala Ala Ser Asp Phe 65 70 75 80 Ile Phe Leu Val Thr Leu Pro Leu Trp Val Asp Lys Glu Ala Ser Leu 85 90 95 Gly Leu Trp Arg Thr Gly Ser Phe Leu Cys Lys Gly Ser Ser Tyr Met 100 105 110 Ile Ser Val Asn Met His Cys Ser Val Leu Leu Leu Thr Cys Met Ser 115 120 125 Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val Trp Pro Val Val Ser Arg Lys Phe 130 135 140 Arg Arg Thr Asp 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gct gat atc ttc att gct agc ctg gcg gtg gct 423 Glu Lys Arg Arg Ser Ala Asp Ile Phe Ile Ala Ser Leu Ala Val Ala 60 65 70 gac ctg acc ttc gtg gtg acg ctg ccc ctg tgg gct acc tac acg tac 471 Asp Leu Thr Phe Val Val Thr Leu Pro Leu Trp Ala Thr Tyr Thr Tyr 75 80 85 90 cgg gac tat gac tgg ccc ttt ggg acc ttc ttc tgc aag ctc agc agc 519 Arg Asp Tyr Asp Trp Pro Phe Gly Thr Phe Phe Cys Lys Leu Ser Ser 95 100 105 tac ctc atc ttc gtc aac atg tac gcc agc gtc ttc tgc ctc acc ggc 567 Tyr Leu Ile Phe Val Asn Met Tyr Ala Ser Val Phe Cys Leu Thr Gly 110 115 120 ctc agc ttc gac cgc tac ctg gcc atc gtg agg cca gtg gcc aat gct 615 Leu Ser Phe Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val Arg Pro Val Ala Asn Ala 125 130 135 cgg ctg agg ctg cgg gtc agc ggg gcc gtg gcc acg gca gtt ctt tgg 663 Arg Leu Arg Leu Arg Val Ser Gly Ala Val Ala Thr Ala Val Leu Trp 140 145 150 gtg ctg gcc gcc ctc ctg gcc atg cct gtc atg gtg tta cgc acc acc 711 Val Leu Ala Ala Leu Leu Ala Met Pro Val Met Val Leu Arg Thr Thr 155 160 165 170 ggg gac ttg gag aac acc act aag gtg cag tgc tac atg gac tac tcc 759 Gly Asp Leu Glu Asn Thr Thr Lys Val Gln Cys Tyr Met Asp Tyr Ser 175 180 185 atg gtg gcc act gtg agc tca gag tgg gcc tgg gag gtg ggc ctt ggg 807 Met Val Ala Thr Val Ser Ser Glu Trp Ala Trp Glu Val Gly Leu Gly 190 195 200 gtc tcg tcc acc acc gtg ggc ttt gtg gtg ccc ttc acc atc atg ctg 855 Val Ser Ser Thr Thr Val Gly Phe Val Val Pro Phe Thr Ile Met Leu 205 210 215 acc tgt tac ttc ttc atc gcc caa acc atc gct ggc cac ttc cgc aag 903 Thr Cys Tyr Phe Phe Ile Ala Gln Thr Ile Ala Gly His Phe Arg Lys 220 225 230 gaa cgc atc gag ggc ctg cgg aag cgg cgc cgg ctg ctc agc atc atc 951 Glu Arg Ile Glu Gly Leu Arg Lys Arg Arg Arg Leu Leu Ser Ile Ile 235 240 245 250 gtg gtg ctg gtg gtg acc ttt gcc ctg tgc tgg atg ccc tac cac ctg 999 Val Val Leu Val Val Thr Phe Ala Leu Cys Trp Met Pro Tyr His Leu 255 260 265 gtg aag acg ctg tac atg ctg ggc agc ctg ctg cac tgg ccc tgt gac 1047 Val Lys Thr Leu Tyr Met Leu Gly Ser Leu Leu His Trp Pro Cys Asp 270 275 280 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ttgtcctatg cacatccttt 1451 aactgtcccc tgattctgcc cgccctgtcc tcctctactg ctttattctt tctcagaggt 1511 ttgtggttta ggggaaagag actgggctct acagacctga ccctgcacaa gccatttaat 1571 ctcactcagc ctcagtttct ccattggtat gaaatggggg aaagtcatat tgatcctaaa 1631 atgttgaagc ctgagtctgg acgcagtaaa agcttgtttc cctctgctgc tttcttagat 1691 ctgcaatcgt ctttcctccc ctctttcctt gtagtttttc cccncacnac tctctgcacg 1751 tgccgctcnt tatcccngct tctggcacca atcccctcct acagctcgtc cccctcnctc 1811 gatccatcct tctcgcctgt ctactttctt gttctgaagg gctactaagg gttaaggatc 1871 c 1872 <210> 40 <211> 380 <212> PRT <400> 40 Met Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Asn Tyr Tyr Gly Ala Asp Asn Gln 1 5 10 15 Ser Glu Cys Glu Tyr Thr Asp Trp Lys Ser Ser Gly Ala Leu Ile Pro 20 25 30 Ala Ile Tyr Met Leu Val Phe Leu Leu Gly Thr Thr Gly Asn Gly Leu 35 40 45 Val Leu Trp Thr Val Phe Arg Ser Ser Arg Glu Lys Arg Arg Ser Ala 50 55 60 Asp Ile Phe Ile Ala Ser Leu Ala Val Ala Asp Leu Thr Phe Val Val 65 70 75 80 Thr Leu Pro Leu Trp Ala Thr Tyr Thr Tyr Arg Asp Tyr Asp Trp 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atgggggcag 480 tatatttcag ggggacctct gatgctgctg accctggaga tagactagag ttctcagcct 540 aggtgtgtcc atg gcg tca gga aac cct tgg tcc tct act ctc atg cgt 589 Met Ala Ser Gly Asn Pro Trp Ser Ser Thr Leu Met Arg 1 5 10 gtg tcc gcc ctc act ctc cag gtc ctc ccg acg gcc atg aac act aca 637 Val Ser Ala Leu Thr Leu Gln Val Leu Pro Thr Ala Met Asn Thr Thr 15 20 25 tct tct gca gca ccc ccc tca cta ggt gta gag ttc atc tct ctg ctg 685 Ser Ser Ala Ala Pro Pro Ser Leu Gly Val Glu Phe Ile Ser Leu Leu 30 35 40 45 gct atc atc ctg ctg tca gtg gcg ctg gct gtg ggg ctt ccc ggc aac 733 Ala Ile Ile Leu Leu Ser Val Ala Leu Ala Val Gly Leu Pro Gly Asn 50 55 60 agc ttt gtg gtg tgg agt atc ctg aaa agg atg cag aag cgc tct gtc 781 Ser Phe Val Val Trp Ser Ile Leu Lys Arg Met Gln Lys Arg Ser Val 65 70 75 act gcc ctg atg gtg ctg aac ctg gcc ctg gcc gac ctg gcc gta ttg 829 Thr Ala Leu Met Val Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Ala Val Leu 80 85 90 ctc act gct ccc ttt ttc ctt cac ttc ctg gcc caa ggc acc tgg agt 877 Leu Thr Ala 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aag ctg ctg gag ggc acg 1549 Leu Arg Ser Ala Gly Val Gly Phe Val Ala Lys Leu Leu Glu Gly Thr 320 325 330 ggc tcc gag gcg tcc agc acg cgc cgc ggg ggc agc ctg ggc cag acc 1597 Gly Ser Glu Ala Ser Ser Thr Arg Arg Gly Gly Ser Leu Gly Gln Thr 335 340 345 gct agg agc ggc ccc gcc gct ctg gag ccc ggc cct tcc gag agc ctc 1645 Ala Arg Ser Gly Pro Ala Ala Leu Glu Pro Gly Pro Ser Glu Ser Leu 350 355 360 365 act gcc tcc agc cct ctc aag tta aac gaa ctg aac taggcctggt 1691 Thr Ala Ser Ser Pro Leu Lys Leu Asn Glu Leu Asn 370 375 ggaaggaggc gcactttcct cctggcagaa tcgtagctct gagccagttc agtacctgga 1751 ggaggagcag gggcgtggag ggcgtggagg gcgtgggagc gtgggaggcg ggagtggagt 1811 ggaagaagag ggagagatgg agcaaagtga gggccgagtg agagcgtgct ccagcctggc 1871 tcccacaggc agctttaacc attaaaactg aagtctgaaa tttggtcaac cttgtgagtg 1931 gggtacatgt gctgtgggta tcggggtgct cgtgggcgcc ctggtggggc ccctctcggt 1991 agttgagagt cacgtccttt agttccccat gatttacaat tttggaaggg acacaaagaa 2051 acatagactg cccccatccc agatgattcc gagtacatag tctgcag 2098 <210> 42 <211> 377 <212> PRT <400> 42 Met Ala Ser Gly Asn Pro Trp Ser Ser Thr Leu Met Arg Val Ser Ala 1 5 10 15 Leu Thr Leu Gln Val Leu Pro Thr Ala Met Asn Thr Thr Ser Ser Ala 20 25 30 Ala Pro Pro Ser Leu Gly Val Glu Phe Ile Ser Leu Leu Ala Ile Ile 35 40 45 Leu Leu Ser Val Ala Leu Ala Val Gly Leu Pro Gly Asn Ser Phe Val 50 55 60 Val Trp Ser Ile Leu Lys Arg Met Gln Lys Arg Ser Val Thr Ala Leu 65 70 75 80 Met Val Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Ala Val Leu Leu Thr Ala 85 90 95 Pro Phe Phe Leu His Phe Leu Ala Gln Gly Thr Trp Ser Phe Gly Leu 100 105 110 Ala Gly Cys Arg Leu Cys His Tyr Val Cys Gly Val Ser Met Tyr Ala 115 120 125 Ser Val Leu Leu Ile Thr Ala Met Ser Leu Asp Arg Ser Leu Ala Val 130 135 140 Ala Arg Pro Phe Val Ser Gln Lys Leu Arg Thr Lys Ala Met Ala Arg 145 150 155 160 Arg Val Leu Ala Gly Ile Trp Val Leu Ser Phe Leu Leu Ala Thr Pro 165 170 175 Val Leu Ala Tyr Arg Thr Val Val Pro Trp Lys Thr Asn Met Ser Leu 180 185 190 Cys Phe Pro Arg Tyr Pro Ser Glu Gly His Arg Ala Phe His Leu Ile 195 200 205 Phe Glu Ala Val Thr Gly Phe Leu Leu Pro Phe Leu Ala Val Val Ala 210 215 220 Ser Tyr Ser Asp Ile Gly Arg Arg Leu Gln Ala Arg Arg Phe Arg Arg 225 230 235 240 Ser Arg Arg Thr Gly Arg Leu Val Val Leu Ile Ile Leu Thr Phe Ala 245 250 255 Ala Phe Trp Leu Pro Tyr His Val Val Asn Leu Ala Glu Ala Arg Arg 260 265 270 Ala Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val Gly Lys Arg Leu 275 280 285 Ser Leu Ala Arg Asn Val Leu Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ser Ser Ser 290 295 300 Val Asn Pro Val Leu Tyr Ala Cys Ala Gly Gly Gly Leu Leu Arg Ser 305 310 315 320 Ala Gly Val Gly Phe Val Ala Lys Leu Leu Glu Gly Thr Gly Ser Glu 325 330 335 Ala Ser Ser Thr Arg Arg Gly Gly Ser Leu Gly Gln Thr Ala Arg Ser 340 345 350 Gly Pro Ala Ala Leu Glu Pro Gly Pro Ser Glu Ser Leu Thr Ala Ser 355 360 365 Ser Pro Leu Lys Leu Asn Glu Leu Asn 370 375 <210> 43 <211> 1901 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (701)...(1717) <400> 43 ggatccagaa agcccccaag agagatgctg aaactctcag gtgggtaaaa agagtagacc 60 tctgacgtcc cagggtacag cccttgctgc catcctgggg gcaccctcct aagtgccagg 120 ggcaagccat ggtcagggga agcagaaagc ggtgacaccc cggccactgc acctgtgggc 180 aggtgggtca gggagggtcc aggcactcag gatgaacaga actcacctgc caaggcttgg 240 gctgaggagg agctggaatc ctggagacac actgcccccg cccctcacca cccctgtcac 300 tcagacagca cacctcagag gcagaacaga aaacccagag cctcacccag gcaaggctca 360 cgtcccattc cccgccatgg cactgacccg gtcctcccag ctctgaggag cctcagatct 420 cctgggtggc aggggtgcag ctgcatagcg ccgaaattcc aagccctggt tctgcgtttg 480 ccttgtgctg aagttcagaa tgcctctgac gctcacgcac accaaatgga caaggaggtc 540 ccctcagcag ccccgtgggc ggtgctgagc ttgaaagtgg gaggttctga aggcattgga 600 ggcctgactt ctggacttca gagagcgtga agctgcctag atcgcaagct cattgtgaac 660 tgtttgcttg ttccctccag gctctgactc cagccaaagc atg aat ggc ctt gaa 715 Met Asn Gly Leu Glu 1 5 gtg gct ccc cca ggt ctg atc acc aac ttc tcc ctg gcc acg gca gag 763 Val Ala Pro Pro Gly Leu Ile Thr Asn Phe Ser Leu Ala Thr Ala Glu 10 15 20 caa tgt ggc cag gag acg cca ctg gag aac atg ctg ttc gcc tcc ttc 811 Gln Cys Gly Gln Glu Thr Pro Leu Glu Asn Met Leu Phe Ala Ser Phe 25 30 35 tac ctt ctg gat ttt atc ctg gct tta gtt ggc aat acc ctg gct ctg 859 Tyr Leu Leu Asp Phe Ile Leu Ala Leu Val Gly Asn Thr Leu Ala Leu 40 45 50 tgg ctt ttc atc cga gac cac aag tcc ggg acc ccg gcc aac gtg ttc 907 Trp Leu Phe Ile Arg Asp His Lys Ser Gly Thr Pro Ala Asn Val Phe 55 60 65 ctg atg cat ctg gcc gtg gcc gac ttg tcg tgc gtg ctg gtc ctg ccc 955 Leu Met His Leu Ala Val Ala Asp Leu Ser Cys Val Leu Val Leu Pro 70 75 80 85 acc cgc ctg gtc tac cac ttc tct ggg aac cac tgg cca ttt ggg gaa 1003 Thr Arg Leu Val Tyr His Phe Ser Gly Asn His Trp Pro Phe Gly Glu 90 95 100 atc gca tgc cgt ctc acc ggc ttc ctc ttc tac ctc aac atg tac gcc 1051 Ile Ala Cys Arg Leu Thr Gly Phe Leu Phe Tyr Leu Asn Met Tyr Ala 105 110 115 agc atc tac ttc ctc acc tgc atc agc gcc gac cgt ttc ctg gcc att 1099 Ser Ile Tyr Phe Leu Thr Cys Ile Ser Ala Asp Arg Phe Leu Ala Ile 120 125 130 gtg cac ccg gtc aag tcc ctc aag ctc cgc agg ccc ctc tac gca cac 1147 Val His Pro Val Lys Ser Leu Lys Leu Arg Arg Pro Leu Tyr Ala His 135 140 145 ctg gcc tgt gcc ttc ctg tgg gtg gtg gtg gct gtg gcc atg gcc ccg 1195 Leu Ala Cys Ala Phe Leu Trp Val Val Val Ala Val Ala Met Ala Pro 150 155 160 165 ctg ctg gtg agc cca cag acc gtg cag acc aac cac acg gtg gtc tgc 1243 Leu Leu Val Ser Pro Gln Thr Val Gln Thr Asn His Thr Val Val Cys 170 175 180 ctg cag ctg tac cgg gag aag gcc tcc cac cat gcc ctg gtg tcc ctg 1291 Leu Gln Leu Tyr Arg Glu Lys Ala Ser His His Ala Leu Val Ser Leu 185 190 195 gca gtg gcc ttc acc ttc ccg ttc atc acc acg gtc acc tgc tac ctg 1339 Ala Val Ala Phe Thr Phe Pro Phe Ile Thr Thr Val Thr Cys Tyr Leu 200 205 210 ctg atc atc cgc agc ctg cgg cag ggc ctg cgt gtg gag aag cgc ctc 1387 Leu Ile Ile Arg Ser Leu Arg Gln Gly Leu Arg Val Glu Lys Arg Leu 215 220 225 aag acc aag gca gtg cgc atg atc gcc ata gtg ctg gcc atc ttc ctg 1435 Lys Thr Lys Ala Val Arg Met Ile Ala Ile Val Leu Ala Ile Phe Leu 230 235 240 245 gtc tgc ttc gtg ccc tac cac gtc aac cgc tcc gtc tac gtg ctg cac 1483 Val Cys Phe Val Pro Tyr His Val Asn Arg Ser Val Tyr Val Leu His 250 255 260 tac cgc agc cat ggg gcc tcc tgc gcc acc cag cgc atc ctg gcc ctg 1531 Tyr Arg Ser His Gly Ala Ser Cys Ala Thr Gln Arg Ile Leu Ala Leu 265 270 275 gca aac cgc atc acc tcc tgc ctc acc agc ctc aac ggg gca ctc gac 1579 Ala Asn Arg Ile Thr Ser Cys Leu Thr Ser Leu Asn Gly Ala Leu Asp 280 285 290 ccc atc atg tat ttc ttc gtg gct gag aag ttc cgc cac gcc ctg tgc 1627 Pro Ile Met Tyr Phe Phe Val Ala Glu Lys Phe Arg His Ala Leu Cys 295 300 305 aac ttg ctc tgt ggc aaa agg ctc aag ggc ccg ccc ccc agc ttc gaa 1675 Asn Leu Leu Cys Gly Lys Arg Leu Lys Gly Pro Pro Pro Ser Phe Glu 310 315 320 325 ggg aaa acc aac gag agc tcg ctg agt gcc aag tca gag ctg 1717 Gly Lys Thr Asn Glu Ser Ser Leu Ser Ala Lys Ser Glu Leu 330 335 tgagcggggg gcgccgtcca gcgcgagcgc agactgttta ggactcagca gacccagcaa 1777 gaggcatctg ccctttcccc agccacctcc ccggcaagca acctgaaatc tcagcagatg 1837 cccaccattt ctctagatcg cctagtctca acccataaaa aggaagaact gacaaagggg 1897 atcc 1901 <210> 44 <211> 339 <212> PRT <400> 44 Met Asn Gly Leu Glu Val Ala Pro Pro Gly Leu Ile Thr Asn Phe Ser 1 5 10 15 Leu Ala Thr Ala Glu Gln Cys Gly Gln Glu Thr Pro Leu Glu Asn Met 20 25 30 Leu Phe Ala Ser Phe Tyr Leu Leu Asp Phe Ile Leu Ala Leu Val Gly 35 40 45 Asn Thr Leu Ala Leu Trp Leu Phe Ile Arg Asp His Lys Ser Gly Thr 50 55 60 Pro Ala Asn Val Phe Leu Met His Leu Ala Val Ala Asp Leu Ser Cys 65 70 75 80 Val Leu Val Leu Pro Thr Arg Leu Val Tyr His Phe Ser Gly Asn His 85 90 95 Trp Pro Phe Gly Glu Ile Ala Cys Arg Leu Thr Gly Phe Leu Phe Tyr 100 105 110 Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Tyr Phe Leu Thr Cys Ile Ser Ala Asp 115 120 125 Arg Phe Leu Ala Ile Val His Pro Val Lys Ser Leu Lys Leu Arg Arg 130 135 140 Pro Leu Tyr Ala His Leu Ala Cys Ala Phe Leu Trp Val Val Val Ala 145 150 155 160 Val Ala Met Ala Pro Leu Leu Val Ser Pro Gln Thr Val Gln Thr Asn 165 170 175 His Thr Val Val Cys Leu Gln Leu Tyr Arg Glu Lys Ala Ser His His 180 185 190 Ala Leu Val Ser Leu Ala Val Ala Phe Thr Phe Pro Phe Ile Thr Thr 195 200 205 Val Thr Cys Tyr Leu Leu Ile Ile Arg Ser Leu Arg Gln Gly Leu Arg 210 215 220 Val Glu Lys Arg Leu Lys Thr Lys Ala Val Arg Met Ile Ala Ile Val 225 230 235 240 Leu Ala Ile Phe Leu Val Cys Phe Val Pro Tyr His Val Asn Arg Ser 245 250 255 Val Tyr Val Leu His Tyr Arg Ser His Gly Ala Ser Cys Ala Thr Gln 260 265 270 Arg Ile Leu Ala Leu Ala Asn Arg Ile Thr Ser Cys Leu Thr Ser Leu 275 280 285 Asn Gly Ala Leu Asp Pro Ile Met Tyr Phe Phe Val Ala Glu Lys Phe 290 295 300 Arg His Ala Leu Cys Asn Leu Leu Cys Gly Lys Arg Leu Lys Gly Pro 305 310 315 320 Pro Pro Ser Phe Glu Gly Lys Thr Asn Glu Ser Ser Leu Ser Ala Lys 325 330 335 Ser Glu Leu <210> 45 <211> 1317 <212> DNA <220> <221> CDS <222> (201)...(1211) <400> 45 gagttgtagg attctacatt aattctcttg tgcccttagc ccactacttc agaatttcct 60 gaagaaagca agcctgaatt ggttttttaa attgctttaa aaattttttt taactgggtt 120 aatgcttgct gaattggaag tgaatgtcca ttcctttgcc tcttttgcag atatacactt 180 cagataacta caccgaggaa atg ggc tca ggg gac tat gac tcc atg aag 230 Met Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys 1 5 10 gaa ccc tgt ttc cgt gaa gaa aat gct aat ttc aat aaa atc ttc ctg 278 Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu 15 20 25 ccc acc atc tac tcc atc atc ttc tta act ggc att gtg ggc aat gga 326 Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly 30 35 40 ttg gtc atc ctg gtc atg ggt tac cag aag aaa ctg aga agc atg acg 374 Leu Val Ile Leu Val Met Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr 45 50 55 gac aag tac agg ctg cac ctg tca gtg gcc gac ctc ctc ttt gtc atc 422 Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile 60 65 70 acg ctt ccc ttc tgg gca gtt gat gcc gtg gca aac tgg tac ttt ggg 470 Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly 75 80 85 90 aac ttc cta tgc aag gca gtc cat gtc atc tac aca gtc aac ctc tac 518 Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr 95 100 105 agc agt gtc ctc atc ctg gcc ttc atc agt ctg gac cgc tac ctg gcc 566 Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala 110 115 120 atc gtc cac gcc acc aac agt cag agg cca agg aag ctg ttg gct gaa 614 Ile Val His Ala Thr Asn Ser Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu 125 130 135 aag gtg gtc tat gtt ggc gtc tgg atc cct gcc ctc ctg ctg act att 662 Lys Val Val Tyr Val Gly Val Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile 140 145 150 ccc gac ttc atc ttt gcc aac gtc agt gag gca gat gac aga tat atc 710 Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile 155 160 165 170 tgt gac cgc ttc tac ccc aat gac ttg tgg gtg gtt gtg ttc cag ttt 758 Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe 175 180 185 cag cac atc atg gtt ggc ctt atc ctg cct ggt att gtc atc ctg tcc 806 Gln His Ile Met Val Gly Leu Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser 190 195 200 tgc tat tgc att atc atc tcc aag ctg tca cac tcc aag ggc cac cag 854 Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln 205 210 215 aag cgc aag gcc ctc aag acc aca gtc atc ctc atc ctg gct ttc ttc 902 Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe 220 225 230 gcc tgt tgg ctg cct tac tac att ggg atc agc atc gac tcc ttc atc 950 Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile 235 240 245 250 ctc ctg gaa atc atc aag caa ggg tgt gag ttt gag aac act gtg cac 998 Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His 255 260 265 aag tgg att tcc atc acc gag gcc cta gct ttc ttc cac tgt tgt ctg 1046 Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu 270 275 280 aac ccc atc ctc tat gct ttc ctt gga gcc aaa ttt aaa acc tct gcc 1094 Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala 285 290 295 cag cac gca ctc acc tct gtg agc aga ggg tcc agc ctc aag atc ctc 1142 Gln His Ala Leu Thr Ser Val Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu 300 305 310 tcc aaa gga aag cga ggt gga cat tca tct gtt tcc act gag tct gag 1190 Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu 315 320 325 330 tct tca agt ttt cac tcc agc taacacagat gtaaaagact ttttttatac 1241 Ser Ser Ser Phe His Ser Ser 335 gataaataac ctttttttaa gttacacatt tttcagatat aaaagactga ccaatattga 1301 aaaaaaaaaa aaaaaa 1317 <210> 46 <211> 337 <212> PRT <400> 46 Met Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu 1 5 10 15 Glu Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile 20 25 30 Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met 35 40 45 Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His 50 55 60 Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala 65 70 75 80 Val Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala 85 90 95 Val His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu 100 105 110 Ala Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn 115 120 125 Ser Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly 130 135 140 Val Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala 145 150 155 160 Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro 165 170 175 Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly 180 185 190 Leu Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile 195 200 205 Ser Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys 210 215 220 Thr Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr 225 230 235 240 Tyr Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys 245 250 255 Gln Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr 260 265 270 Glu Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala 275 280 285 Phe Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser 290 295 300 Val Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly 305 310 315 320 Gly His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser 325 330 335 Ser <210> 47 <211> 26 <212> DNA <400> 47 gttggatcca tgattgcacc actgca 26 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <400> 48 cgcgctgtag gcccaggctt taaagttcc 29 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <400> 49 tttaaagcct gggcctacag cgcggccaa 29 <210> 50 <211> 29 <212> DNA <400> 50 gtcactgtac aggagcttgc aaaagtgga 29 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <400> 51 ttttgcaagc tcctgtacag tgacctccag 30 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <400> 52 ctgggccagg acgataaagg cctccacatg 30 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <400> 53 gaggccttta tcgtcctggc ccagacggt 29 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <400> 54 tcagaattca ggtgacgtcg taggcga 27 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <400> 55 actgaattct atggggagaa ggtgg 25 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <400> 56 ggtgaattca ggctttaaag ttccgcac 28 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <400> 57 ctggatccat ggaggaaggt ggt 23 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <400> 58 atagtcccgg tacgtggccc ccgaggattt 30 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <400> 59 aaatcctcgg gggccacgta ccgggactat 30 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <400> 60 cccggtggtg cgtaagaggt agctgctgag ct 32 <210> 61 <211> 33 <212> DNA <400> 61 ctcagcagct acctcttacg caccaccggg gac 33 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <400> 62 gtacagcgtc ttcacaagcc cacggtggtg g 31 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <400> 63 accaccgtgg gctttgtgaa agacgctgta cat 33 <210> 64 <211> 28 <212> DNA <400> 64 aggaattcta gaagaggtca aagtcaca 28

【図面の簡単な説明】

【図１】 V31 7TMレセプターにおける７つのトランス
メンブラン領域を示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (72)発明者 グレイ， パトリック， ダブリュ. アメリカ合衆国 98112 ワシントン シ アトル 38ス プレイス イースト 2244 (72)発明者 シュエイッカート， ヴィクキ， ルイス アメリカ合衆国 98102 ワシントン シ アトル ベルモント プレイス イー ＃307， 763

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも一つのリガンド／抗リガンド
   結合活性、または7-トランスメンブランレセプターに特
   異的な免疫学的特性を有する、配列番号：15に示したV3
   1-7-トランスメンブランレセプターまたはその断片のア
   ミノ酸配列をコードする、精製および単離したポリヌク
   レオチド。
2. 【請求項２】 少なくとも一つのリガンド／抗リガンド
   結合活性、または7-トランスメンブランレセプターに特
   異的な免疫学的特性を有する、配列番号：36に示したV1
   12-7-トランスメンブランレセプターまたはその断片の
   アミノ酸配列をコードする、精製および単離したポリヌ
   クレオチド。
3. 【請求項３】 少なくとも一つのリガンド／抗リガンド
   結合活性、または7-トランスメンブランレセプターに特
   異的な免疫学的特性を有する、配列番号：40に示したR2
   0-7-トランスメンブランレセプターまたはその断片のア
   ミノ酸配列をコードする、精製および単離したポリヌク
   レオチド。
4. 【請求項４】 少なくとも一つのリガンド／抗リガンド
   結合活性、または7-トランスメンブランレセプターに特
   異的な免疫学的特性を有する、配列番号：42に示した R
   2-7-トランスメンブランレセプターまたはその断片のア
   ミノ酸配列をコードする、精製および単離したポリヌク
   レオチド。
5. 【請求項５】 少なくとも一つのリガンド／抗リガンド
   結合活性、または7-トランスメンブランレセプターに特
   異的な免疫学的特性を有する、配列番号：44に示したR1
   2-7-トランスメンブランレセプターまたはその断片のア
   ミノ酸配列をコードする、精製および単離したポリヌク
   レオチド。
6. 【請求項６】 少なくとも一つのリガンド／抗リガンド
   結合活性、または7-トランスメンブランレセプターに特
   異的な免疫学的特性を有する、配列番号：46に示したRM
   3-7-トランスメンブランレセプターまたはその断片のア
   ミノ酸配列をコードする、精製および単離したポリヌク
   レオチド。