FR2771423A1 - Vecteurs permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodeficience et/ou sa penetration dans une cellule cible - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un vecteur viral recombinant dans le génome duquel est inséré les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, ledit vecteur viral n'étant pas un vecteur adénoviral dans le génome duquel est inséré l'ADNc codant pour le RANTES murin. Elle a également trait à une particule virale infectieuse, une cellule hôte et une composition pharmaceutique comprenant ledit vecteur, particule virale ou cellule hôte. Elle concerne également un procédé de préparation d'une telle particule virale infectieuse. Enfin, elle concerne l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur viral, d'une particule virale, d'une cellule hôte, d'un vecteur adénoviral exprimant le RANTES murin ainsi que d'un vecteur plasmidique comprenant les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies d'immunodéficience par thérapie génique.

Description

La présente invention a pour objet de nouveaux vecteurs permettant l'expression d'un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule hôte et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule ainsi que leur utilisation pour prévenir ou traiter une maladie d'immunodéficience et notamment le syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA) résultant de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIII).

Le SIDA se développe à la suite d'une infection par le virus VIH des lymphocytes T4 d'un individu. L'infection peut être asymptomatique pendant de nombreuses années, mais dès que les cellules sont activées, le virus se réplique rapidement et les détruit. Le SIDA se caractérise par un déficit de l'immunité cellulaire, qui a pour effet de rendre l'individu particulièrement sensible à toute infection opportuniste. En juillet 1992, L'OMIS a enregistré 501 272 cas de SIDA dans le monde (AIDS Information international literature on acquired immunodeficiency syndrom and related retroviruses, 1992, 8, Leeds University
Press. Editor kW. Boylston, Leeds). Mais ces chiffres sont toutefois inférieurs à la réalité, puisque cette maladie constitue une véritable épidémie dans certains pays africains. A l'heure actuelle, malgré le fait que les traitements de chimiothérapie aient permis d'augmenter l'espérance de vie des malades, le SIDA reste une maladie dont le taux de mortalité est toujours très élevé.

Le VIH est un rétrovirus qui appartient à la famille des lentivirus. Comme tout rétrovirus, il est formé d'une enveloppe entourant une capside de nature protéique, qui contient le matériel génétique constitué par une molécule d'ARN associée à diverses protéines virales nécessaires aux premières étapes du cycle réplication Dès 1984, on a mis en évidence le rôle déterminant de la molécule CD4 présente essentiellement à la surface des lymphocytes T CD4+ et des monocytes, dans la pénétration du virus au sein des cellules cibles.

De nombreuses observations accumulées au cours de ces 10 dernières années, ont suggéré l'existence de cofacteurs supplémentaires. Récemment, l'équipe de Berger a identifié le rôle du récepteur à 7 domaines transmembranaires, désigné initialement fusine et rebaptisé depuis lors CXCR-4 (Oberlin et al., 1996, Nature 382, 833-835 ; Feng et al., 1996, Science 272, 872-877), pour permettre la pénétration du virus suite à l'interaction de l'enveloppe virale et du récepteur CD4.

Son ligand SDF-1 (pour stromal cell-derived factor 1 en anglais) semble bloquer efficacement l'infection des lignées lymphocytaires par les isolats VIH-1 adaptés aux lignées immortalisées et les T-tropiques.

En outre, plusieurs groupes ont montré que les isolats à tropisme macrophage primaires ou adaptés aux lignées immortalisées utilisent un corécepteur différent pour infecter les cellules hôtes. Le récepteur CCR-5, toujours en association avec CD4, permet l'entrée de ces souches (Dragic et al., 1996, Nature 381, 667-673 ; Alkhatib et al., 1996, Science 272, 1955-1958). Ce récepteur lie normalement le RANTES (pour regulated on activation, normal T cell expressed and secreted en anglais), MIP-1 a et MIP-1 p (pour MAC inhibitory protein en anglais) et ces ss-chimiokines répriment la pénétration du virus dans les cellules, probablement par un phénomène de compétition et/ou d'internalisation du complexe récepteur/ligand. L'effet inhibiteur est supprimé en présence d'anticorps dirigés contre ces trois molécules (Cocchi et al., 1995, Science 270, 1811-1815).

Les premiers essais envisagés jusqu'à présent, mettent en oeuvre les chimiokines précitées sous forme purifiée, des antagonistes qui bloquent les récepteurs ou encore des anticorps dirigés contre le récepteur. Cependant, l'administration de telles molécules pose un certain nombre de problèmes, notamment dû au fait qu'elles sont métabolisées très rapidement dans l'organisme ce qui nécessite l'administration de fortes doses et de façon répétée et augmente le coût du traitement. La présente invention permet de remédier aux inconvénients de l'art antérieur et propose des vecteurs plus appropriés exprimant les ligands SDF- 1,
RANTES, MIP-la ou MIP-lss ou leurs dérivés, dans le but d'augmenter leur efficacité tout en diminuant les effets indésirables. Un adénovirus recombinant exprimant l'ADNc codant pour le RANTES murin a déjà été décrit dans la littérature (Braciak et al., 1996, J. Immunol. 157, 5076-5084) mais son utilisation à des fins anti-SIDA n'est pas enseignée.

On a maintenant montré que les cellules lymphocytaires incubées en présence de surnageants de cellules infectées par des vecteurs adénoviraux défectifs exprimant le RANTES sont protégées contre la réplication du VIH. Les expériences en modèles murins confirment la persistence du vecteur adénoviral, celui-ci pouvant être détecté dans le foie des animaux traités pendant plus de 30 jours après l'injection.

C'est pourquoi la présente invention a pour objet un vecteur viral recombinant dans le génome duquel est inséré les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, ledit vecteur viral n'étant pas un vecteur adénoviral dans le génome duquel est inséré l > ADNc codant pour le RANTES murin.

Au sens de la présente invention, un vecteur viral fait référence à un virus dont le génome a été modifié de manière à permettre le transfert et l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte eucaryote. Un vecteur viral susceptible d'être mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention, peut être dérivé notamment d'un poxvirus, d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un rétrovirus, d'un adénovirus ou d'un virus associé à l'adénovirus. Avantageusement, il s'agira d'un vecteur non intégratif et non réplication De tels vecteurs ainsi que leur technique de préparation sont connus de l'homme de l'art.

A cet égard, les adénovirus offrent plusieurs avantages qui en font des vecteurs de choix dans le cadre de la présente invention. En effet, ils infectent de nombreux types cellulaires, aussi bien des cellules en division que quiescentes, sont non-intégratifs et peu pathogènes. A titre indicatif, leur génome est constitué d'une molécule d'ADN linéaire et bicaténaire d'environ 36 kb portant plus d'une trentaine de gènes, à la fois des gènes précoces nécessaires à la replication virale et des gènes tardifs de structure. Les gènes précoces sont répartis en 4 régions (désignées El à
E4 ; E pour early signifiant précoce en anglais). Les régions El, E2 et E4 sont essentielles à la replication virale alors que la région E3 impliquée dans la modulation de la réponse immunitaire anti-adénovirus chez l'hôte ne l'est pas. Les gènes tardifs (L1 à L5 ; L pour late signifiant tardif en anglais) recouvrent en partie les unités de transcription précoces et sont, pour la plupart, transcrits à partir du promoteur majeur tardif MLP (pour Major Late Promoter en anglais).

Avantageusement, un vecteur adénoviral selon l'invention est défectif pour la réplication, c'est à dire incapable de réplication autonome dans une cellule hôte.

Généralement, un tel vecteur est obtenu à partir d'un adénovirus dont le génome a été modifié de manière à rendre non fonctionnels un ou plusieurs gènes viraux essentiels à sa replication. Ces modifications peuvent être diverses (délétion, mutation et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides) et localisées dans les régions codantes du génome viral ou en dehors de celles-ci, par exemple dans les régions promotrices.

Un vecteur adénoviral préféré selon l'invention est dépourvu de la majorité de la région El et, de façon optionnelle, de tout ou partie de la région E3. Il peut en outre comprendre des délétions ou mutations supplémentaires affectant un ou plusieurs autres gènes viraux, notamment au sein des régions E2, E4 et/ou L1-L5.

A cet égard, on peut avoir recours aux vecteurs de seconde génération de l'état de la technique (voir par exemple les demandes internationales Wu94/28152 et WO97/041 19). A titre illustratif, la délétion de la majorité de la région El et de l'unité de transcription E4 est tout particulièrement avantageuse. On indique qu'un vecteur adénoviral selon l'invention conserve les régions en cis du génome adénoviral à savoir les répétitions inversées terminales (ITR) et la région d'encapsidation. Leur longueur et séquence nucléotidique peuvent varier d'un sérotype à l'autre. Ceperidant, elles peuvent être aisément isolées à partir des données de la littérature. A titre indicatif, les ITRs correspondent aux premiers et derniers 103 nucléotides (nt) des extrémités 5' et 3' du génome de l'adénovirus de type 5 (Ad5) et la région d'encapsidation s'étend jusqu'au nt 458.

Une autre variante intéressante peut consister en des mutations ou des délétions limitées, ne nécessitant pas de complémentation des fonctions touchées. On peut citer par exemple la mutation thermosensible de la région E2 (Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339) ou la délétion partielle de la région E4 conservant les séquences codant pour les cadres de lecture ouverts (ORF) 6 et 7 (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048).

Comme déjà mentionné, le vecteur adénoviral selon l'invention est, de façon optionnelle, en outre dépourvu de tout ou partie de la région E3 non essentielle afin d'accroître les capacités de clonage. Cependant, on peut envisager de conserver les séquences E3 codant pour les polypeptides permettant l'échappement au système immunitaire de l'hôte, notamment la glycoprotéine gpl 9k (Gooding et al., 1990,
Critical Review ofImmunology 10, 53-71)
Un vecteur adénoviral préféré selon l'invention est choisi parmi les suivants (1) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie de la région El et, de manière
optionnelle, de tout ou partie de la région E3, (2) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie des régions El et E2 et, de
manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3, (3) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie des régions El et E4 et, de
manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3, (4) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie des régions El et E4 et, de
manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3, et comportant une
mutation non fonctionnelle de la région E2, et (5) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie des régions El, E2 et E4 et,
de manière optionnelle de tout ou partie de la région E3.

Par ailleurs, l'origine du vecteur adénoviral selon l'invention, peut être variée aussi bien du point de vue de l'espèce que du sérotype. Il peut dériver du génome d'un adénovirus d'origine humaine ou animale (canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine, simienne...) ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines différentes. On peut citer plus particulièrement les adénovirus CAV-1 ou CAV-2 d'origine canine, DAV d'origine aviaire ou encore
Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128:171- 176 ; Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70 : 165-172 ; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60: 21-28 ; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76: 93-102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral d'origine humaine dérivant de préférence d'un adénovirus de sérotype C, notamment de type 2 ou 5.

Un vecteur adénoviral selon la présente invention peut être généré in vitro dans Escherichia coli (E. coli) par ligation ou recombinaison homologue (voir par exemple la demande internationale WO96/17070) ou encore par recombinaison dans une lignée de complémentation.

Comme indiqué précédemment, la caractéristique essentielle du vecteur viral selon l'invention est de porter au sein de son génome les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder les premières étapes d'une infection virale, le vecteur viral n'étant pas un vecteur adénoviral exprimant l'ADNc codant pour le RANTES murin.

Selon un mode de réalisation avantageux, le polypeptide en usage dans la présente invention est un ligand d'un récepteur cellulaire, ce dernier facilitant la liaison et/ ou la pénétration d'un virus d'immunodéficience au sein de la cellule cible.

Sa liaison au récepteur inhibe au moins partiellement la liaison et/ou l'entrée du virus au sein de la cellule cible. L'inhibition peut être mesurée par les techniques classiques, par exemple en évaluant l'activité de la transcriptase inverse du virus la présence de protéines virales (p24 pour le virus VIH) ou par des tests d'inhibition de fusion tels que décrits dans Dragic et al. (1996, supra) et Alkhatib et al. (1996, supra).

Le polypeptide en usage dans la présente invention est de préférence choisi parmi les ligands d'un récepteur facilitant, éventuellement en association avec CD4 > la liaison et/ou la pénétration du virus V1H-1 dans la cellule cible. On peut citer les chimiokines liant le récepteur CCR-5, CXCR-4, CCR-2B, CCR-3, US28, BOB (ou
GPR-15) ou encore BONZO (ou STRL-33) (Pleskoff et al., 1997, Science 276, 1874-1878 ; Deng et al., 1997, Nature 388, 296-300 ; Liao et al., 1997, J. Exp.

Med. 185, 2015-2023). Parmi ces ligands, on mentionnera le MDC (pour macrophage derived chemokine ; Pal et al., 1997, Science 278, 695-698) , le v MIPII (Kaposi's sarcoma-associated herpes virus ; Kledal et al., 1997, Science 277, 1656-1659) et plus particulièrement le RANTES, le MIP-la, le MlP-1 P et le SDF-1, notamment d'origine humaine.

On rappelle ci-après les propriétés des polypeptides précités.

Le RANTES est produit essentiellement par les lymphocytes du sang périphérique, les macrophages et les cellules T. Il présente plusieurs activités parmi lesquelles la chimioattraction portant sur les monocytes et les cellules CD4+/CD45 RO-. n comporte 68 acides aminés. Sa séquence est décrite dans Schall et al. (1988,
J. Immunol. 141, 1018-1045).

Le MIP-la est produit essentiellement par les lymphocytes T et les monocytes. Il permet la chimioattraction portant sur les monocytes et, à moindre échelle, sur les lymphocytes T. En outre, il inhibe la prolifération des précurseurs hématopolétiques. Sa séquence est décrite dans Obaru et al. (1986, J. Biochem. 99, 885-894).

Le MIP- 1 P est produit essentiellement par les lymphocytes T et les monocytes. Il permet la chimioattraction portant sur les monocytes et, à moindre échelle, sur les lymphocytes T. En outre, il inhibe la prolifération des précurseurs hématopoïétiques. Sa séquence est décrite dans Brown et al. (1989, J. Immunol.

142, 679-687).

Le SDF- 1 est produit essentiellement par les cellules stromales et de la moelle osseuse. Il intervient dans la chimioattraction portant principalement sur les lymphocytes. Sa séquence est décrite dans Tashiro et al. (1993, Science 261, 600603).

Dans le cadre de la présente invention, on peut mettre en oeuvre un polypeptide natif ou un dérivé de ce dernier. Il peut être obtenu par mutation, substitution, addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus du polypeptide natif sous réserve qu'il soit capable d'exercer l'effet inhibiteur recherché vis à vis de l'infection virale. De préférence, un dérivé en usage dans l'invention retient les capacités de liaison au récepteur mais a une activité biologique réduite ou nulle. En effet, il peut être avantageux de supprimer ou réduire les activités biologiques du polypeptide, afin de minimiser les effets secondaires indésirables. A cet égard, un dérivé antagoniste convient tout particulièrement. A titre d'exemples de dérivés antagonistes du RANTES, on peut citer le RANTES pourvu d'un résidu Met à l'extrémité N-terminale de la protéine mature (Proudfoot et al., 1996, J. Biol. Chem.

271, 2599 -2603) et le RANTES délété des 8 premiers résidus en position Nterminale (ci-après désigné RANTES A1-8 ; Arenzana-Seisdedos et al., 1996,
Nature 383, 400) qui ne présentent plus les propriétés chimiotactiques et d'activation des monocytes caractérisant le RANTES natif.

Les séquences nucléotidiques codant pour le polypeptide en usage dans la présente invention peuvent être isolées selon les techniques de l'art (PCR, réverse transcription, synthèse chimique, utilisation de sondes adéquates...). Il peut s'agir de séquences génomiques, ADNc qui peuvent être modifiées par exemple au niveau des introns (type minigène). Leur insertion dans le génome du vecteur viral selon l'invention a, de préférence, lieu dans une région non essentielle ou au sein d'une région modifiée/délétée. S'agissant d'un vecteur adénoviral, le site de clonage préféré est en remplacement de El. Dans le cas où l'on met en oeuvre plusieurs séquences nucléotidiques, elles peuvent être insérées au même endroit ou à des endroits différents du génome virai, utiliser les mêmes éléments de régulation ou des éléments différents et, éventuellement, être en orientation réverse les unes par rapport aux autres afin de minimiser les phénomènes d'interférence au niveau de l'expression génique.

Bien entendu, les séquences nucléotidiques sont placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte. La locution "éléments nécessaires à l'expression" désigne les éléments génétiques permettant la transcription de la séquence nucléotidique en ARN et la traduction d'un ARNm en polypeptide. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. Il peut être isolé d'un gène quelconque d'origine eucaryote ou même virale et peut être constitutif ou régulable. Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène en question. Par ailleurs, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction... Le choix d'un promoteur est à la portée de l'homme de l'art et sera adapté au vecteur viral retenu.

On peut mentionner, à titre d'exemples, les LTR rétroviraux adaptés à un vecteur rétroviral, le promoteur 7,5K du virus de la vaccine ou encore les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycerate kinase), d'immunoglobuline (lymphocyte-spécifique) ou SRa hybride entre l'origine de SV40 et le LTR de
HTLV-I (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 466-472). Dans le cadre d'un vecteur adénoviral, les promoteurs MLP Ad2 et surtout CMV précoce (Cytomégalovirus) et RSV (Rous Sarcoma Virus) sont préférés.

Bien entendu, les séquences nucléotidique en usage dans le cadre de la présente invention peuvent en outre comprendre des éléments additionnels améliorant leur expression, leur maintien dans la cellule hôte ou la localisation du polypeptide. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art. On indique que la séquence nucléotidique en usage dans le cadre de la présente invention comporte de préférence une séquence signal permettant la sécretion du polypeptide en dehors de la cellule hôte. Il peut s'agir de la séquence signal native ou d'une séquence hétérologue issue d'un polypeptide eucaryote ou viral sécrété. En outre la présence d'une séquence d'épissage peut être avantageuse pour améliorer les niveaux d'expression. A cet égard, le second intron du gène P-globine de lapin (Green et al., 1988, Nucleic Acid Res. 16, 369 ; Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med. 169, 1325) ou la séquence d'épissage synthétique trouvée dans le plasmide pCI (promega
Corp, pCI mammalian expression vector E173 1 comprenant le site donneur de l'intron 1 de la ss-globine humaine et le site accepteur du gène d'une immunoglobine de souris) constituent des exemples préférés.

Un vecteur viral selon l'invention particulièrement avantageux dérive d'un adénovirus dépourvu de l'essentiel des régions El et E3 et dans lequel est insérée à la place de la région El une cassette d'expression comportant le promoteur CMV ou RSV, une séquence d'épissage, l'ADNc codant pour le RANTES humain ou son dérivé RANTES A 1-8 et une séquence de polyadénylation.

Par tailleurs, le vecteur viral selon l'invention peut comprendre des séquences nucléotidiques exogènes additionnelles codant pour un ou plusieurs polypeptides améliorant l'effet thérapeutique à l'égard de l'infection virale (anticorps neutralisants, immunoconjugués, immunotoxines...).

L'invention a également trait à une particule virale infectieuse ainsi qu'à une cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur viral selon l'invention. Ladite cellule hôte est avantageusement une cellule de mammifère et, de préférence, une cellule humaine et peut comprendre ledit vecteur sous forme intégrée ou non dans son génome. Il s'agira de préférence d'une cellule souche ou différentiée hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...).

Une particule virale infectieuse selon l'invention est préparée selon les techniques conventionnelles dans le domaine de l'art. Sa propagation est effectuée dans une cellule de complémentation adaptée aux déficiences qu'il porte. S'agissant d'un vecteur adénoviral, on aura par exemple recours à la lignée 293 établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain, qui complémente efficacement la fonction
El (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72) ou des lignées en dérivant pour une double complémentation (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565 ; Krougliak et
Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586 ; Wang et al., 1995 Gene
Therapy 2, 775-783 ; demande internationale WO 97/04119). Mais d'autres lignées obtenues par transfection des séquences de complémentation appropriées peuvent convenir. On peut également employer des virus auxilliaires pour complémenter tout ou partie des fonctions défectives.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale infectieuse comprenant un vecteur viral selon l'invention, selon lequel
(i) on introduit ledit vecteur viral selon l'invention dans une cellule de
complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur, de
manière à obtenir une cellule de complémentation transfectée,
(ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des
conditions appropriées pour permettre la production de ladite
particule virale infectieuse, et
(iii) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture
cellulaire.

Bien entendu, la particule virale infectieuse peut être récupérée du sumageant de culture mais également des cellules. Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de congélation/décongélation pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse.

Ceux-ci peuvent être amplifiés et purifiés selon les techniques de l'art (procédé chromatographique, ultracentrifugation notamment à travers un gradient de chlorure de césium...).

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, un vecteur viral, une particule virale infectieuse ou une cellule hôte eucaryote selon l'invention en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. La composition selon l'invention est destinée au traitement préventif ou curatif des maladies liées à une infection par un virus d'immunodéficience et, tout particulièrement, par un virus VIII d'un sérotype quelconque. Il peut s'agir du VIII- 1 ou du VIH-2 (Hill et al., 1997, J. Virol. 71, 6296-6304).

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace de l'agent thérapeutique ou prophylactique à un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Les voies d'administration envisageables sont multiples (intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intrapéritonéale, intratumorale, intranasale, intrapulmonaire ou intratrachéale... etc). Mais, on préferera, une administration par voie intraveineuse, notamment dans le cas d'un vecteur adénoviral. Elle peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu à traiter, du stade de la maladie ou encore des séquences nucléotidiques à transférer.

A titre purement indicatif, les particules virales selon l'invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 10l5 ui (unités infectieuses), avantageusement 105 et 1014 ui et, de préférence, 106 et 1013 ui. La formulation peut également inclure un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique ou tout autre substance permettant d'améliorer l'effet antiviral ou la stabilité. Un exemple d'une telle substance peut être trouvée dans la demande française 97 06600.

La présente invention est relative à l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur viral, d'une particule virale infectieuse ou d'une cellule hôte eucaryote selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies d'immunodéficience et, notamment du SIDA par thérapie génique. La présente invention concerne également l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur adénoviral dans le génome duquel est inséré l'ADNc codant pour le RANTES murin ou d'un vecteur plasmidique comprenant les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies d'immunodéficience par thérapie génique. Bien entendu, le polypeptide en usage dans la présente invention a les caractéristiques énoncées ci-dessus, tout comme le vecteur adénoviral permettant l'expression de l'ADNc codant pour le
RANTES murin. Pour ce qui est du vecteur plasmidique, on peut employer un plasmide de l'état de la technique ou le construire par les techniques de manipulations génétiques. Avantageusement, il possède les éléments génétiques lui permettant de se répliquer et de se maintenir dans un microorganisme et/ou une cellule hôte, comme par exemple au moins une origine de réplication et un gène de sélection (gène codant pour une auxotrophie ou conférant une résistance à un antibiotique). Il peut également comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien, sa stabilité ou encore son intégration dans les chromosomes de l'hôte.

Un vecteur viral selon l'invention ou un vecteur plasmidique en usage dans la présente invention peut être utilisé tel quel ou en association avec d'autres composés, tels que des composés lipidiques cationiques éventuellement en présence de lipides neutres ou zwitterioniques. Ces composés sont largement décrits dans la littérature accessible à l'homme du métier.

Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo, par exemple par injection intraveineuse. Le polypeptide sera sécrété dans le sang où il pourra exercer son action antivirale. On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moëlle osseuse, lymphocytes du sang périphérique...), de les transfecter ou infecter in vîtro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient.

Enfin la présente invention a également pour objet une méthode de traitement ou de prévention du SIDA, selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'un vecteur viral, d'une particule virale ou d'une cellule hôte eucaryote selon l'invention ou d'un vecteur plasmique en usage selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.

EXEMPLES
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.

Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées notamment dans
Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. La technnique de recombinaison homologue est largement détaillée dans Chartier et al. (1996, J. Virol. 70, 4 cellulaires peuvent être utilisées. Les cellules sont cultivées selon les techniques de l'art ou selon les recommandations du fournisseur.

EXEMPLE 1 : Construction d'un vecteur adénoviral exprimant le RANTES
humain
L'ADNc codant pour le RANTES humain est cloné par transcription inverse
PCR (RT-PCR) à partir d'ARN isolés de lymphocytes humains activés pendant 3 jours en présence d'IL-2 et d'anticorps anti-CD3. La transcription-inverse est réalisée avec l'oligonucléotide oTG10794 (SEQ ID NO: 1), l'amplification par PCR avec les oligonucléotides oTG10793 (SEQ ID NO: 2) et oTG10794 en appliquant les conditions expérimentales suivantes: 30 cycles de 1 min à 94"C, 1 min à 62"C et 1 min 30 à 72"C). Le fragment amplifié (297 pb) est digéré par XbaI, purifié et inséré dans le vecteur M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99) préalablement linéarisé par XbaI et déphosphorylé, pour donner le vecteur M13TG6219. La présence du gène RANTES est confirmé par digestion enzymatique (par exemple Bgm-SacII) et sa séquence nucléotidique par séquençage selon les méthodes de l'art.

Le vecteur de transfert adénoviral pTG6600 est généré par introduction au sein de la région El de l'AdS du fragment BglII-BamHI isolé de pCI (Promega) et portant le promoteur CMV, une séquence d'épissage synthétique (site donneur ss- globine humain/intron 1/site accepteur d'immunoglobuline IgG), un site multiple de clonage (MCS) et la séquence de polyadénylation du virus SV40 (voir la demande française 97 06757), de sorte que les éléments de régulation sont localisés en 3' des séquences Ad5 s'étendant des nucléotides 1 à 458 et en 5' de celles en positions 3329 à 6241. Le fragment XbaI isolé de M13TG6219 codant pour l'ADNc RANTES est inséré au niveau du MCS, pour donner pTG6230. Le génome adénoviral recombinant désigné pTG6232 est reconstitué par recombinaison homologue entre le fragment PacI-BstEII de pTG6230 et le vecteur pTG4656 clivé par ClaI. Ce dernier est un vecteur adénoviral recombinant comprenant le gène LacZ en remplacement de la région El.

En parallèle, le fragment Hindm-EcoRV de M13TG6219 est également inséré dans la région El du vecteur pTG8348 similaire au pTG6600 mis à part la constitution de la cassette d'expression. Celle-ci contient le promoteur viral RSV, l'intron 2 du gène p-globine de lapin et le signal de polyadénylation de ce même gène. On obtient pTG6254. Le vecteur adénoviral pTG6264 est construit par recombinaison homologue entre le vecteur pTG4656 digéré par ClaI et le fragment
PacI-BstEII du vecteur de transfert pTG6254. On indique que pTG6264 est un vecteur délété des régions El (nt 459 à 3328) et E3 (nt 28592 à 30470) et comportant la cassette "prom RSV - intron - RANTES - pA P-globine" à la place des séquences El.

Les virions AdTG6232 et AdTG6264 sont obtenus de la façon suivante : les plasmides correspondants sont transfectés dans la lignée de complémentation 293.

Le surnageant cellulaire est récupéré après 3 cycles de congélation -décongélation et utilisé pour infecter la lignée de complémentation A549-E1+ et produire un préstock viral, Le profil deql'ADN adénoviral est analysé selon la technique de Hirth (Glutzman et Von Doren, 1983, J. Virol. 45, 91- 103). Le stock viral est produit par amplification des particules sur la lignée A549-E1+ et les virions sont purifiés sur gradient de chlorure de césium. Le titre viral en ufp (unités formant des plages) est déterminé selon les techniques de l'art pâr titration sur cellules 293. Le nombre de particules infectieuses ui (unités infectieuses) est évalué par immunofluorescence de la protéine adénovirale DBP utilisant un anticorps anti-DBP (Reich et al., 1983,
Virology 128, 480-484).

EXEMPLE 2 : Construction d'un vecteur adénoviral exprimant le dérivé
RANTES humain délété des 8 premiers résidus (RANTES A 1-8).

Le dérivé RANTES 1\ 1-8 est obtenu par mutagénèse dirigée du vecteur
M13TG6219 avec l'oligonucléotide oTGl 1428 (SEQ ID NO: 3), afin de déléter les 8 premiers acides aminés de la protéine mature. Après vérification de la mutagénèse par séquençage, le fragment HindIII-EcoRV du vecteur M13TG6267 ainsi généré est introduit dans le plasmide de transfert pTG8348. Après digestion du vecteur en résultant par PacI et BstEll et recombinaison homologue avec pTG4656 coupé par
ClaI, on génère pTG6283 lequel est délété des régions El (nt 459 à 3328) et E3 (nt 28592 à 30470) et comporte la cassette "prom RSV - intron - RANTES A 1-8 - pA '3-globine" à la place des séquences El. Les adénovirus recombinants AdTG6283 sont produits selon la méthode indiquée ci-dessus.

EXEMPLE 3 : Evaluation in vitro de l'effet antiviral des adénovirus AdTG6232.

AdTG6264 et AdTG6283.

Les cellules-cibles humaines A549 ou simiennes Vero sont infectées par les adénovirus recombinants à une multiplicité d'infection égale à 50 ou à 100. Les surnageants de culture sont récoltés 48 et 72 heures après infection, et sont centrifugés pendant 5 minutes à 3500 rpm afin d'éliminer les débris cellulaires. Le
RANTES est dosé dans les surnageants de culture par ELISA (kit R & D Systems #
DRN00). Sa concentration varie entre 200 et 1000 ng/ml selon les productions.

Puis, on évalue la capacité du RANTES produit par les virions recombinants à inhiber l'infection des cellules lymphocytaires PMl par le virus VIII. Pour ce faire, elles sont mises en présence des surnageants cellulaires obtenus de la lignée A549 ou Vero infectée par les adénovirus recombinants AdTG6232 ou AdTG6264. On évalue la concentration de RANTES dans les surnageants recueillis par ELISA. Les cellules PMl sont pré-incubées en présence de surnageant comprenant 500 ng RANTES /106 cellules pendant 2 heures, puis éprouvées par le Vomi, isolat Mtropique Bal (multiplicité d'infection l0-3 ou 1M). La culture est poursuivie en présence de surnageant comprenant 100 nglml de RANTES à partir de J3. La réplication du VIII est suivie par analyse de l'activité de la transcriptase-inverse dans les surnageants de culture PMl (voir par exemple Virology Methods Manual 1996, ed. B. Mahy and H. Kangro Academic Press, Harcourt Brace & Company
Publishers). On utilise à titre de contrôle du RANTES obtenu par voie recombinante.

Une nette inhibition de l'infection virale peut être observée en présence des surnageants des cellules infectées par l'AdTG6232 ou AdTG6264 ou de la protéine recombinante.

Des expériences de dose-réponse sont effectuées comme suit. Les cellules PM 1 sont mises en pré-incubation avec les surnageants de cellules infectées par
AdTG6232 ou AdTG6264 contenant des doses variables de RANTES (0 - 50 - 100 - 500 ng / 106 cellules). La culture est poursuivie en présence des surnageants cellulaires contenant des doses de RANTES variant de 5 à 100 ng/ml (5 - 25 - 50 - 75 - 100 ng/ml). Les cellules sont ainsi protégées vis-à-vis d'une infection virale jusqu'à 25 ng/ml RANTES, quelle que soit les conditions de pré-incubation.

EXEMPLE 4 : Evaluation in vivo des adénovirus AdTG6232. AdTG6264 et
AdTG6283.

Les différentes constructions ont été injectées à des souris immunocompétentes
C57Black/6 et immunodéficientes SCID afin de suivre l'expression du RANTES ou de son dérivé RANTES A 1-8, d'analyser la persistence du génome adénoviral, ainsi qu'une éventuelle toxicité liée à l'expression constitutive et forte des chimiokines.

En premier lieu, 5x109 ui d'adénovirus recombinants AdTG6232 et AdTG6283 sont injectées par voie intraveineuse à des souris immunocompétentes C57Black/6.

La concentration sérique en RANTES et RANTES A 1-8 est déterminée par ELISA comme indiqué précédemment. On a pu détecter de 140 à 200 ng/ml de sérum dans les animaux ayant reçu les virions AdTG6232, le maximum d'expression se situant à J3. Les souris injectées avec la construction AdTG6283 produisent 23 à 85 ng/ml de RANTES A1-8 pendant plus de 15 jours après l'injection. Ces données confirment la fonctionnalité des virions de l'invention.

L'ADN isolé des foies de souris traitées est analysé par la technique de
Southern à l'aide d'une sonde spécifique reconnaissant la jonction E3/E4 du génome Ad5. On observe une persistence du génome adénoviral dans les cellules hépatiques jusqu'à 30 jours après l'injection, quel que soit le vecteur injecté. En outre, les expériences d'anatomo-pathologie réalisées sur les foies des souris traitées n'ont pas mis en évidence une quelconque toxicité des adénovirus exprimant le RANTES. On utilise à titre de contrôle des animaux injectés avec un vecteur adénoviral non recombinant.

Des expériences similaires sont réalisées en souris immunodéficientes SCID: les animaux traités avec les virions AdTG6232 et AdTG6283 produisent des quantités de RANTES et RANTES A1-8 comprises entre 130 à 630 ng/ml. La concentration sérique est légèrement plus faible (20 à 60 ng/ml) dans le cas des souris injectées avec l'AdTG6264. En outre, l'expression est stable et persistente sur plus de 30 jours lorsque l'on met en ouvre les vecteurs utilisant le promoteur viral
RSV (AdTG6264 et AdTG6283). Les analyses par la technique de Southern montrent la persistence du génome adénoviral jusqu'à plus de 15 jours après l'injection, quel que soit le vecteur utilisé. L'injection des constructions virales s accompagne d'une certaine toxicité de type hépatique surtout dans le cas de l'AdTG6232, probablement liée à l'état d'immunodéficience des animaux.

LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Transgene S.A.

(B) RUE: 11 rue de Molsheim
(C) VILLE: Strasbourg
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 67082
(G) TELEPHONE: 03 88 27 91 00
(H) TELECOPIE: 03 88 27 91 11
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Vecteurs permettant d'inhiber ou retarder la
liaison d'un virus d'immunodeficience et/ou sa penetration
dans une cellule hote.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1. 0, Version #1. 25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: amorce PCR et RT-PCR oTG10794
(clonage ADNc RANTES humain)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
AAGTTCAGGT TTCTAGAGGT ACCATCCTAG 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: amorce PCR oTG10793 (clonage ADNc
RANTES humain)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CCTCTCTAGA GGTACCATGG GGGTCTC 27 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligo de mutagenese oTG11428 (RANTES
del 1-8)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GCTCCTGCAT CTGCCCCCTG CTGCTTTGCC 30

Claims (23)

1. génome duquel est inséré l'ADNc codant pour le RANTES murin.

   dans ladite cellule, ledit vecteur viral n'étant pas un vecteur adénoviral dans le

   d'un virus d'immunodéflcience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus

   codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison

   Revendications 1. Un vecteur viral recombinant dans le génome duquel est inséré les séquences
2. 2. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le

   polypeptide est un ligand d'un récepteur cellulaire, ledit récepteur facilitant la

   liaison et/ ou la pénétration d'un virus d'immunodéficience dans la cellule cible.
3. 3. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que

   le polypeptide est un ligand d'un récepteur, ledit récepteur facilitant la liaison et/

   ou la pénétration du virus de l'immunodéficience acquise (VIT) dans la cellule

   cible, éventuellement en association avec CD4.
4. 4. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit

   polypeptide est un ligand d'un récepteur choisi parmi le groupe constitué par les

   récepteurs CCR-5, CXCR-4, CCR-2B, CCR-3, US28, BOB et BONZO.
5. 5. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que

   le ligand est choisi parmi le groupe constitué par les ligands RANTES, MIP-la, MIP-1 ss et SDF-1, notamment d'origine humaine.
6. 6. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en

   ce que le polypeptide est un dérivé d'un polypeptide natif, en particulier un

   dérivé antagoniste.
7. 7. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que le

   polypeptide est un dérivé antagoniste du RANTES et, notamment le dérivé RANTESA 1-8.
8. 8. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en

   ce qu'il dérive d'un adénovirus.
9. 9. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il

   dérive d'un adénovirus dépourvu au moins de la majorité de la région El et, de

   façon optionnelle, de tout ou partie de la région E3.
10. 10. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce

    qu'il dérive d'un adénovirus:

    (1) dépourvu de tout ou partie de la région El et, de manière

    optionnelle, de tout ou partie de la région E3,

    (2) dépourvu de tout ou partie des régions El et E2 et, de manière

    optionnelle, de tout ou partie de la région E3,

    (3) dépourvu de tout ou partie des régions El et E4 et, de manière

    optionnelle, de tout ou partie de la région E3,

    (4) dépourvu de tout ou paitie des régions El et E4 et, de manière

    optionnelle, de tout ou partie de la région E3, et comportant une

    mutation non fonctionnelle de la région E2, ou

    (5) dépourvu de tout ou partie des régions El, E2 et E4 et, de manière

    optionnelle de tout ou partie de la région E3.
11. 11. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé

    en ce qu'il dérive d'un adénovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine,

    murine, ovine, porcine ou simienne ou encore d'un hybride comprenant des

    fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines différentes.
12. 12. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé

    en ce que les séquences codant pour ledit polypeptide sont placées sous le

    contrôle du promoteur précoce du virus CMV (Cytomégalovirus) ou du

    promoteur RSV (Rous Sarcoma Virus).
13. 13. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé

    en ce qu'il dérive d'un adénovirus dépourvu de l'essentiel des régions El et E3

    et dans lequel est insérée à la place de la région El une cassette d'expression

    comportant le promoteur CMV ou RSV, une séquence d'épissage, l'ADNc codant pour le RANTES humain ou son dérivé RANTES 1\ 1-8 et une séquence

    de polyadénylation.
14. 14. Une particule virale infectieuse comprenant un vecteur viral selon l'une des

    revendications 1 à 13.
15. 15. Une cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur viral selon l'une des

    revendications 1 à 13 ou infectée par une particule virale infectieuse selon la

    revendication 14.
16. 16. Un procédé de préparation d'une particule virale infectieuse selon la

    revendication 14, selon lequel

    (i) on introduit ledit vecteur viral dans une cellule de complémentation

    capable de complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir

    une cellule de complémentation transfectée,

    (ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des

    conditions appropriées pour permettre la production de ladite

    particule virale infectieuse, et (iii) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture

    cellulaire.
17. 17. Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou

    prophylactique un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 13, une

    particule virale infectieuse selon la revendication 14 ou obtenue en mettant en

    oeuvre un procédé de préparation selon la revendication 16 ou une cellule hôte

    eucaryote selon la revendication 15, en association avec un support

    acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
18. 18. Une composition pharmaceutique selon la revendication 17, destinée au

    traitement des maladies d'immunodéficience et, plus particulièrement du

    SIDA.
19. 19. Une composition pharmaceutique selon la revendication 17 ou 18,

    caractérisée en ce que le support acceptable d'un point de vue

    pharmaceutique est de nature à permettre une administration

    intraveineuse de ladite composition.
20. 20. Utilisation thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur viral selon l'une

    des revendications 1 à 13, d'une particule viral infectieuse selon la

    revendication 14 ou obtenue en mettant en oeuvre un procédé de

    préparation selon la revendication 16 ou d'une cellule hôte eucaryote

    selon la revendication 15, pour la préparation d'un médicament destiné au

    traitement des maladies d'immunodéficience par thérapie génique.
21. 21. Utilisation thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur adénoviral dans

    le génome duquel est inséré l'ADNc codant pour le RANTES murin ou

    d'un vecteur plasmidique comprenant les séquences codant pour au moins

    un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus

    d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus

    dans ladite cellule, pour la préparation d'un médicament destiné au

    traitement des maladies d'immunodéficience par thérapie génique.
22. 22. Utilisation thérapeutique ou prophylactique selon la revendication 21,

    caractérisée en ce que ledit polypeptide a les caractéristiques énoncées

    aux revendications 2 à 7.
23. 23. Utilisation thérapeutique ou prophylactique selon l'une des revendications

    20 à 22, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du

    SIDA par thérapie génique.