KR20010071185A

KR20010071185A - 내독소혈증 치료법

Info

Publication number: KR20010071185A
Application number: KR1020007011963A
Authority: KR
Inventors: 피터 엠. 씨. 웡
Original assignee: 마틴 에스. 돌프; 템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority date: 1998-04-27
Filing date: 1999-04-26
Publication date: 2001-07-28
Also published as: AU768497B2; HK1039565B; CN1307487A; EP1073471A4; EP1073471A1; CN1840659A; WO1999055378A1; AU3759499A; CA2330033A1; JP2002512984A; CN1213768C; CN1990865A; HK1039565A1

Abstract

본 발명은 LPS 매개 시그날의 전달을 감소 조절하여 Lps^d유전자를 포함하는치료제를 제공하며, 따라서 내독소혈증을 치료 또는 그 발생을 예방하기 위해 투여될 수 있다.

Description

내독소혈증 치료법 {Method of Treating Endotoxemia}

<관련 출원에 대한 언급>

본 출원은 1998년 4월 27일에 출원된 미국 출원 제 60/083,210호로 우선권을 주장한다.

<정부 보조에 대한 언급>

본원에 개시된 발명은 국립 의료원 보조금 1RO1AI39159-01A1 및 1RO1CA70854-01에 의해 부분적으로 보조를 받았다. 연방 정부는 본 발명에 특정 권리를 소유한다.

A) LPS

리포폴리사카라이드 내독소(LPS)는 장티푸스 열병, 이질 및 요로 감염증과 같은 질병을 유발시키는 일부 특정 세균의 세포벽 및 보통 질병을 유발하지는 않으나 동물 및 인간 장관에 일반적으로 서식하는 세균에서 유래된 복합 고분자이다.이들 모든 세균은 일반적으로 동일한 세포벽 형태를 가지며 염색 특성에 따라 그람 양성균으로 분류된다.

LPS는 면역적으로 활성인 사이토카인 및 동물의 염증 반응의 다른 매개체의 생산 및 분비를 유도한다. 사이토카인은 다른 세포 및 서로를 자극하는 단핵 식세포 및 림프구와 같이 다양한 세포에 의해 생산되는 매우 활성인 물질이다. 또한, 내피 세포 및 과립구는 내독소의 주요 표적이 된다. 숙주 동물의 세포 내에서 특이적 수용체 분자 및 시그날 전달 과정은 내독소의 작용 방식을 더 명확히 이해하기 위해서 현재 집중적인 연구가 되고 있다.

B) LPS 반응의 유전학

내독소에 대한 세포 반응은 마우스의 광범위한 연구에서 제시된 바와 같이 유전적 조절을 받는다. 숙주의 LPS에 대한 다중 반응의 중요한 기본 유전적 기초는 1968년에 C3H/HeJ 변이 마우스의 발견 초기에 확립되었다[Sultzer, Nature 219, 1253-1254(1968)]. 이 종은 LPS의 지질 A 구성 성분의 면역촉진 및 병리생리학적 효과에 저반응성을 보이며, 따라서 매우 연관된 반응 종과 비교해 볼 때 LPS에 대한 반응에 근본적인 결함을 갖는 것으로 간주된다.

C3H/HeJ 결함은 특이적이며 여러가지 방법으로 발현된다. 예를 들어, C3H/HeJ 세포는 LPS에 노출될 때 증식 또는 분화하지 못하고, 콘카나발린 A에 의해 유도된 이 흉선 세포의 증식은 LPS에 의해 촉진되지 않는다[Sultzer et al., Nature New Biology(London) 240, 198-200 (1972); Sultzer, Abst. Am. Soc. Microbiol, P.85, M69 (1973); Tanabe et al., Microbiol, Immunol. 23, 1097-1104(1979); Morrison et al., Adv. Immunol. 28, 294-312 (1979); Sultzer in "Beneficial effects of Endotoxin", Ch 11, Plenum, NY (1983); Sultzer et al., Immunobioloby 187, 257-271 (1993); Glode et al., L.M. 및 D.L. Rosenstreich, J. Immunol 117, 2061, 2068 (1976); Sultzer, B.M. Infection and Immunity 13. 1579-1584 (1976)]. 대식 세포 식작용 및 세포 독성은 LPS에 의해 촉진되지 않으며, 반응세포 내에서 LPS에 의해 촉진되지 않는 사이토카인, 예를 들어 종양 괴사 인자(TNF), 인터페론(IFN), 콜로니 자극 인자(CSF), 인터루킨-1(IL-1) 및 프로스타글란딘은 C3H/HeJ 대식세포 내에서 유도되지 않는다(Morrison et al. Adv. Immunol. 28, 294-312(1979)]. 또한, C3H/HeJ 마우스는 정상의 내독소 반응 종에 비해 치사 내독소 쇼크에 큰 내성을 갖는다(Sultzer, Nature 219, 1253-1254 (1968)].

C3H/HeJ 세포의 LPS에 대한 반응의 결함은 보조 세포의 비존재 또는 억제 세포의 존재 또는 LPS의 다른 면역능 세포에 대한 결합 결여 때문이 아니다[Sultzer in "Beneficial effects of Endotoxin", Ch11, Plenum, NY(1983)]. 오히려, 그 이유는 유발 수용체의 결핍 또는 세포와 LPS의 초기 상호 작용 이후의 시그날 전달에 있어서 장애에 집중되고 있다[Sultzer et al., Immunobiology 187, 257-271 (1993)].

C3H/HeJ종과 여러 반응 종을 이용한 전형적인 형태의 교배 실험 결과로부터, LPS에 대한 분열촉진 반응이 공동 우성의 대립유전자로 이루어진 단일 유전자위(locus)에 의해 지배된다는 것이 발견되었다[Morrison et al. Adv.Immunol. 28, 294-312 (1979); Sultzer in "Beneficial effects of Endotoxin", Ch 11, Plenum, NY (1983); Sultzer et al., Immunobilogy 187, 257-271 (1993); Glode et al., J. Immunol 117, 2061-2068 (1976); Sultzer, Infection and Immunity 13, 1579-1584 (1976)]. 왓슨은 유전자위(Lpsⁿ)이 4번 염색체에 존재하며 주요 방광 단백질 유전좌위(Mup-1)에 연관되어 있으나, Mup-1 및 B 세포 활성화를 조절하는 Lyb2;2;4;6 유전자의 하류에 존재한다는 것을 확인하였다(Watson et al., J. Immunol. 120, 422-429 (1979)]. C3H/HeJ 마우스 종은 돌연변이 Lps^d대립 유전자를 포함한다.

c) Lpsⁿ유전자의 단리 및 특성

문헌[Sultzer et al., Immunobiology 187, 257-271 (1993)]은 C3H/OuJ(반응세포) 마우스 비장 세포로부터 6개의 서브라이브러리로 구성된 cDNA 라이브러리를 제조를 기재하고 있다. 2×10⁴개의 독립 클론으로 구성된 한 서브라이브러리의 C3H/HeJ LPS 비반응 비장 세포로의 도입은 LPS 노출 배양후에 양의 적혈구에 반응하는 플라크 형성 세포의 약 4배의 증가를 가져왔다.

또한, 문헌[Kang et al., Infect. Immun. 64, 4612-4617 (1996)]은 C3H/OuJ cDNA 라이브러리의 편리한 스크리닝 및 분획, 및 C3H/HeJ 비장 B 세포에서 리포폴리사카라이드 매개 B 세포 반응을 회복시킬 수 있는 cDNA 클론의 단리를 기재하고 있다. 1166개의 뉴클레오티드 cDNA(SEQ ID NO.1)은 216개의 아미노산 단백질(SEQID NO.2)를 코딩하는 648 개의 뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임을 포함한다.

염기서열 분석은 이 LPS 반응 유전자, Lpsⁿ유전자가 핵의 운반에 중요한 GTPase인 Ran/TC4를 코딩한다는 것을 보여주었다[Raetz, C.R.H., Biochemistry of Endotoxins. Ann. Rev. Biochem. 59, 129-170 (1990); Watson et al., J. Immunol. 114, 1462-1468 (1975); Kabir et al., Infect. Immun. 15, 156-164 (1977)]. 아미노산 수준에서, Lpsⁿ은 인간 및 개에서 발견된 Ran/TC4 GTPase와 동일하며, 닭 및 효모의 Ju93 및 Spi1 단백질과 각각 98.6% 및 82.8%의 상동성을 보인다[Drivas et al., Mol Cell Biol 10, 1793-1798 (1990); Dupree et al., Gene 120, 325-326 (1992); Trueb et al., FEBS 306, 181-184 (1992); Matsumoto et al., Cell 66, 347-360 (1991)]. 상기 각 문헌[Kang et al., Drivas et al., Dupree et al., Trueb et al. 및 Matsumoto et al.]은 본원의 참고 문헌에 포함되어 있다. DNA 수준에서, Lpsⁿ의 인간 TC4/Ran, 개 TC4/Ran, 닭 Ju93 및 효모 Spil1과의 상동성은 각각 89.7%, 90.7%, 85.4% 및 68.7%이다(동일 문헌). 따라서, Lpsⁿ분자, 특히 분자의 구아닌 뉴클레오티드의 결합 및 가수분해에 관련된다고 보여지는 5개의 도메인, G1 내지 G5이 진화에 걸쳐 매우 보존적이다.

요약하면, Lpsⁿ유전자는 C3H/HeOuJ와 같은 LPS 반응 마우스로부터 폴리클로날하게 활성화되는 항체 생산 B 세포 내에 존재하는 기능 유전자 산물을 코딩하며,LpsⁿcDNa의 C3H/HeJ B 세포로의 도입은 LPS 자극에 대한 세포의 반응을 회복시키기에 충분하며, 결과적으로 플라크 형성 세포(PFC)를 생산하는 항체를 반응 수준으로 증가시킨다. 상기 유전자는 B 세포 및 LPS에 반응하는 다른 세포 형태 및 사이토카인 및 다른 인자를 숙주에 해를 줄 수 있는 양으로 생산하는 세포에서 발견될 것으로 생각된다.

D) 내독소혈증

LPS는 많은 병리생리학적 효과를 보이며, 이 중에 혈액 내에 많은 양의 내독소로 인해 발생하며 약 40%의 치사율을 보이는 내독소혈증 또는 패혈성 쇼크가 있다. 패혈성 쇼크의 대부분의 경우는 혈액 내의 그람 음성균이 원인이 된다. 그러나, 패혈성 쇼크 증후군은 그람 양성균 및 진균을 포함한 다른 유기체에 의해서 유발될 수 있다. 그럼에도, 패혈성 쇼크의 원인에 대한 많은 연구는 패혈성 쇼크의 발생에 중요한 인자는 그람 음성균으로부터의 LPS의 분비 및 매우 활성화된 신체 내의 여러 세포에 대한 내독소의 후속 효과이다. 결과적으로, 숙주는 많은 세포 물질로 압도되고 순환 장애, 쇼크 및 사망에 이를 수 있다.

패혈증은 중환자실에서 사망의 빈번한 원인이 되고 있으며 공중 보건의 주요 문제가 되고 있다. 패혈증이 발생할 때, TNF-알파, IL-1 및 IL-6를 포함하는 주요한 전염증 사이토사인이 관련된다. 항-TNF 항체 또는 IgG의 Fc 부위를 갖는 TNF 세포외 도메인으로 구성된 융합 단백질을 이용하여 TNF를 억제시키는 임상적 시도는 기대하지 못한 결과를 보였다[Dellinger et al., Chest 111, 744-753 (1997);Grau et al., Nature Medicine 3, 1193-1195 (1997)].

심폐 장애를 치료하는 강력한 항생제 및 약물이 이용 가능하지만, 특히 패혈증의 초기 단계 동안에 내독소혈증를 조절하기 위한 개선된 치료 및(또는) 예방적 처치 방법이 크게 요구되고 있다.

<발명의 요약>

본 발명은 유효량의 Lps^d유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 내독소혈증 치료를 필요로하는 환자의 내독소혈증을 치료하는 방법을 제공한다. Lpsⁿ유전자는 세포 내에서 저반응성 리포폴리사카라이드 내독소 반응을 유발하는 돌연변이를 포함하는 Lpsⁿ유전자와 구별된다. 본 발명의 한 실시 태양에서, Lps^d유전자는 LpsⁿcDNA의 3' 비번역 영역 내의 돌연변이에 의해 동일 종의 Lpsⁿ유전자와 구별된다. 바람직한 실시 태양에서, 돌연변이는 DNA 번역 개시 코돈으로부터 Lps DNA의 870번 위치에서 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 바람직한 실시 태양에서, Lps^d유전자는 인간 유전자이다. 바람직한 다른 실시 태양에서, Lps^d유전자는 쥐의 유전자이다. 쥐와 사람의 Lps는 동일한 단백질을 코딩하기 때문에 쥐의 유전자가 치료 요법에 사용될 수 있다. 더 바람직한 실시 태양에서, Lps^d유전자는 바이러스 벡터 형태로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 한 실시 태양에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 가장 바람직한 다른 실시 태양에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.

또한, 본 발명은 유효량의 Lps^d유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 내독소혈증 예방을 필요로하는 환자의 내독소혈증을 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시 태양에서, Lpsⁿ유전자는 바이러스 벡터 형태로 투여된다. 가장 바람직한 한 실시 태양에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 가장 바람직한 다른 실시 태양에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.

또한, 본 발명은 환자의 내독소혈증을 치료 또는 예방하는 의약 제조에 Lps^d유전자의 이용을 구성한다.

본 발명의 다른 측면 및 이점은 도면 및 하기의 바람직한 실시 태양의 상세한 설명에 기재되어 있다.

<도면의 설명>

도 1A 내지 1D는 Lps^dcDNA의 독립 클론의 DNA 서열을 나타낸다. 첫 줄은 야생형 LPS 반응 세포 C3H/HeOuJ 마우스로부터 단리된 LpsⁿcDNA의 서열이다. Lps^d-4, -10, -15 및 -17은 C3H/HeJ cDNA를 포함하는, 독립적으로 선별된 플라스미드 DNA의 서열이다. 번호는 굵은 글씨로 밑줄 그어진 번역 개시 부위, ATG의 A(위치 1)에서 시작한다. 4개의 클론의 DNA는 T 잔기가 C 잔기로 치환된 870번 위치의 동일한 돌연변이를 포함하고 있다.

도 2는 레트로바이러스 유전자를 C3H/HeJ 마우스의 1차 비장 B 세포로의 전달을 보여주는 개략도이다.

도 3A는 N2 레트로바이러스 벡터의 도면이고, 도 3B는 N2-Lpsⁿ레트로바이러스 벡터의 도면이고, 도 3C는 N2-Lps^d레트로바이러스 벡터의 도면이다.

도 4A 내지 4D는 LPS 자극의 개시 및 레트로바이러스 감염 후에 MTT 증식 분석을 보여준다.

도 5는 감염된 비장 B 세포의 RT-PCR 분석을 보여준다. MM은 분자량 마커이다. 3회 이상의 반복된 실험에서 유사한 결과를 얻었다.

도 6은 동종교배된 정상 마우스(Ana I)에서 유래된 대식 세포주, C3H/HeJ LPS 저반응 마우스(GG2EE)에서 유도된 대식 세포주 및 레트로바이러스 N2-Lps(d)로 감염된 Ana I 세포(#1, #7, #9 및 P30) 내에서 LPS에 의한 TNFα 발현의 촉진을 보여준다.

도 7A 내지 7B는 각각 Lpsⁿ및 Lps^dmRNA의 3' 비번역 영역의 2차 구조를 도시한다. 위치 870번은 T(Lpsⁿ)이 C(Lps^d)로의 단일 염기 치환 부위이다.

도 8은 Ad5-Lps 아데노바이러스 벡터의 제조과정의 개략도이다. 검은 박스는 바이러스 DNA 복제에 필요한 바이러스 ITR(역위 말단 반복 서열)이다. "Ψ"는 패키징(packaging) 서열을 나타낸다. CMV는 사이토메갈로바이러스 프로모터이다. 구조물에서, Ad5의 E1 영역은 Lpsⁿ(1.1kb) cDNA, Lps^dcDNA (1.1 kb) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 (0.8 kb)로 대체된다.

도 9는 Lps^d,Lpsⁿ또는 녹색 형광 단백질 (GFP) cDNA의 LPS 민감 마우스로의 아데노바이러스 전달 후에 내독소 내성을 나타내는 도면이다. 각 마우스에 1mg의 LD₁₀₀내독소량을 투여하고 1시간 후에 10¹⁰개의 감염 바이러스 입자를 포함한 다양한 아데노바이러스 상등액을 마우스에 정맥내 주사하였다. 이어서 시간 마다 동물을 관찰하였다. 사망(●) 및 생존 동물(○)을 제시한 바와 같이 기록하였다.

도 10은 Ad5-Lps^d또는 Ad5-Lpsⁿ으로 여러 시점에서 감염된 마우스의 말초혈 다핵 세포 내에서 아데노바이러스 유전자의 발현을 나타낸다. 네스티드 RT-PCR 증폭을 실시예 6에 기재된 특이적 프라이머를 이용하여 말초혈 단핵 세포에서 추출된 전체 RNA에 대해 수행하였다. 증폭 단편의 예상 크기는 793 bp이다.

본 발명은 내독소혈증의 치료 및 예방을 위한 치료제로서 Lps^d유전자의 이용에 관한 것이다.

A) 정의 및 일반 방법론

하기의 정의는 본 발명의 범위 및 실시에 대한 이해를 돕기 위한 것이다.

"LPS"는 리포폴리사카라이드 내독소를 의미한다.

"Lpsⁿ" 및 "Lps^d"는 기원이 되는 종에 무관하게, 정상(LPS 반응성에 대해) 및 저반응성 리포폴리사카라이드 내독소 반응 유전자의 대립형질 형태를 각각 의미한다. Lps^d는 LPS 단백질을 코딩하는 임의의 유전자를 포함하지만, 세포내 저반응성 LPS 반응을 유발하는 돌연변이를 함유하는 유전자는 포함하지 않는다. 또한, Lpsⁿ유전자는 Ran/Tc4 또는 TC4/Ran으로 알려져 있다. 용어 "Lps 유전자"는 천연 발생 및 실험실에서 제조될 수 있는, LPS 내독소 반응 유전자의 Lpsⁿ, Lps^d및 다른 형태의 유전자를 포함한다.

Lpsⁿ단백질 및 Lps^d단백질은 각각 Lpsⁿ및 Lps^d유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "Lps 단백질"은 천연 발생 및 실험실에서 제조될 수 있는, LPS 내독소 반응 유전자의 산물인 Lpsⁿ, Lps^d및 다른 형태의 단백질을 포함한다.

본 발명의 한 실시 태양에서, Lps^d유전자는 mRNA의 3'-비번역 영역(3' UTR)의 코딩 부위 내의 돌연변이에 의해 동일한 유기체의 Lpsⁿ유전자와 구별된다. 이 돌연변이는 변이 영역의 mRNA 이차 구조의 차이를 가져온다. 더 바람직한 실시 태양에서, 돌연변이는 단일 점돌연변이, 예를 들어 C3H/HeJ 마우스 Lps cDNA의 870 위치(위치 번호는 번역 개시 코돈인 ATG로부터 시작함)에서 T를 C로 변화시킨 돌연변이이다.

통상, 하기에 사용되는 명명법, 및 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 혼성화의 실험 방법은 공지되어 있으며 당업계에서 일반적으로 사용된다. 핵산 재조합 방법, 폴리뉴클레오티드 합성, 세포 배양 및 이식 유전자 도입은 표준 기술을 사용하였다. 통상의 효소 반응, 올리고뉴클레오티드 합성 및 정제 단계는 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 일반적으로, 기술 및 방법은 당업계의 통상적인 방법및 당업자에게 공지된 다양한 일반 참고문헌, 예를 들면 마니아티스 (Maniatis)의 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982] 및 오수벨(Ausubel)의 [Current Protocols in Melecular Biology, Wiley and Sons, 1987](본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 따라 수행하였다.

B) 벡터 및 유전자 전달 방법

인간 및 쥐의 Lpsⁿ단백질은 아미노산 서열이 동일하며, DNA 수준에서 쥐과 및 인간의 Lpsⁿ(TC4/Ran) 유전자가 89.7%의 상동성을 보인다. 따라서, 돌연변이 인간 Lps^d유전자(cDNA)의 위치 지정 돌연변이화 기술을 사용하거나 다른 방법으로 쥐의 Lps^d돌연변이를 포함하는 제한 단편과 인간 Lpsⁿ유전자를 조합하여 제조할 수 있다. 한 실시 태양에서, 이 돌연변이는 C3H/HeJ 마우스 LpsⁿcDNA의 870번 위치에서 T를 C로 변화시킨 돌연변이이다. 인간 Lps^d유전자는 환자의 LPS에 대한 반응을 감소시켜 내독소혈증을 치료 또는 그 발생을 억제하는 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 별법으로, 쥐 및 인간 Lps 단백질이 동일하기 때문에, 쥐의 Lps^d유전자가 인간 유전자 치료 요법을 위한 치료 서열로서 이용될 수 있다.

저반응성 LPS 반응을 유발하는 Lpsⁿ유전자의 돌연변이는 LPS 반응성에 대한 돌연변이의 스크리닝법과 결합된 공지된 돌연변이화 기술에 의해 유도될 수 있다.LpsⁿcDNA를 돌연변이화시키고, 적합한 벡터, 예를 들면 5' 및 3' MMLV LTR, 스플라이스 공여 및 스플라이스 수용 부위, 및 네오마이신(neomycin) 내성 마커 유전자를 함유하는 N2 레트로바이러스 벡터[Wong et al., Mol. Cell. Biol. 9, 798-808(1989); Wong et al., Genes Dev. 1, 358-365 (1987)]에 클로닝하였다. 생성된 pN2-Lps^x플라스미드 DNA를 사용하여 바이러스 패키징 세포를 형질감염시키고, 이로부터 바이러스 상등액을 수득하였다. 바이러스 입자를 공지된 기술에 의해 침전시켰다. N2-Lps^x벡터를 사용하여 대식세포, 예를 들어 정상 동종교배 마우스에서 유래한 Ana Ⅰ 거식세포의 세포주를 형질감염시켰다. 형질도입된 세포에 LPS 자극을 준 후 TNFα의 생성을 분석하였다.

형질도입된 세포에서 LPS-매개 신호의 감소 조절은 형질도입되지 않은 대조군 대식세포에 비해 TNFα의 감소로 알 수 있다. 대식세포에 도입되어 LPS 반응성의 감소 조절을 유발하는 돌연변이 cDNA를 선별하였다. Lps^x돌연변이 cDNA를 표적 이펙터(effector) 세포에 레트로바이러스 전달법의 대표적인 기술은 하기의 실시예에 기재되어 있다.

바람직하게, LPS 저반응성을 유발하는 Lpsⁿ유전자 돌연변이는 숙주세포를 내의 LPS 반응성을 크게 감소시키나 완전히 제거하지 않는다.

바람직하게, Lps^d유전자는 바이러스 벡터의 형태로 환자에 전달된다. 본발명에 사용될 수 있는 바이러스 벡터에는 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터가 있다.

아데노바이러스는 다양한 세포 유형에 핵산을 효율적으로 전달하도록 변형될 수 있는 진핵 DNA 바이러스이다. 제2형 및 제5형 인간 아데노 바이러스 및 동물 기원의 아데노바이러스를 포함하여 다양한 혈청형의 아데노바이러스가 존재한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 복제 결함성 아데노바이러스 벡터는 ITR, 인캡시데이션(encapsidation) 서열 및 해당 핵산을 포함한다. 더욱 바람직하게, 최소한 아데노바이러스 벡터의 E1 영역이 비기능적이다. E3 영역(WO95/02697호), E2 영역(WO94/28938호), E4 영역(WO94/28152호, WO94/12649호 및 WO95/02697호) 또는 임의의 후기 발현 유전자 L1 내지 L5를 포함하는 기타 영역도 변형될 수 있다.

본 발명에 따른 복제 결함성 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 특히, 이들은 아데노바이러스와 해당 DNA 서열을 포함하는 플라스미드의 동형 재조합(homologous recombination)에 의해 제조될 수 있다. 동형 재조합은 적합한 세포주에 아데노바이러스 및 플라스미드를 동시 형질감염하여 제조한다. 사용된 세포주는 상기 성분으로 형질전환이 가능해야 하며, 복제 결함성 아데노바이러스의 결함 영역을 보완할 수 있는 서열을 포함해야 한다. 사용가능한 세포주의 예에는 Ad5 아데노바이러스 게놈의 왼편(12%) 부분을 게놈에 포함하는 인간 배아 세포주 293[Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59(1997)], 및 WO94/26914호 및 WO95/02697호에 기재된 E1 및 E4의 기능을 보완할 수 있는 세포주가 있다. 당업자에게 잘 공지된 표준 생물학 기술을 이용하여 재조합 아데노바이러스를 회수 및 정제하였다.

통상, 아데노바이러스 벡터는 24시간 내에 효과적인 치료를 해야하는 내독소혈증의 치료에 바람직하다. 아데노바이러스 벡터는 높은 역가(예, ml당 10¹⁰내지 10¹²감염 단위)로 제조될 수 있고, 조직-비특이적인 방식으로 LPS 비반응성 표현형의 일시적 발현에 사용될 수 있다.

레트로바이러스는 통상 분열 세포를 감염시켜 숙주 게놈에 자신의 게놈을 결합시키는 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈은 2개의 LTR, 인캡시데이션 서열 및 3개의 코딩 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 재조합 레트로바이러스 벡터의 제작 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

통상, 재조합 레트로바이러스 벡터에서 gag, pol 및 env 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로 제거되고, 목적하는 이종의 핵산으로 대체된다. 이러한 벡터는 M-MuLV, MSV(murine Moloney sarcoma virus), HaSV(Harvey sarcoma virus), SNV(spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus) 및 프렌드(Friend) 바이러스와 같은 다양한 유형의 레트로바이러스로부터 제작할 수 있다.

통상, 본 발명의 서열을 포함하는 재조합 레트로바이러스를 제작하기 위해, LTR, 인캡시데이션 서열 및 코딩 서열을 포함하는 플라스미드를 제조한다. 이 플라스미드는 패키징 세포주를 형질감염시키는데 사용되며, 그 결과의 세포주는 플라스미드에 결여된 레트로바이러스의 기능을 트랜스(in trans)로 공급할 수 있게 된다. 따라서, 패키징 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 이러한패키징 세포주는 선행기술에 기재되어 있다. 특히, 세포주 PA317(미국 특허 제4,861,719호), PsiCRIP 세포주(WO90/02806호) 및 GP+envAm-12 세포주(WO89/07150호)가 언급될 수 있다. 재조합 레트로바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 정제될 수 있다.

HIV-1, HIV-2 및 SIV와 같은 렌티바이러스(lentiviruses)에서 유도된 레트로바이러스 벡터는 비분열 세포로의 전달용으로 사용될 수 있다. 이러한 바이러스는 M-MuLV 또는 수포성 구내염 바이러스(VSV)와 같은 다른 바이러스의 표면 당단백질을 갖는 위형(pseudotype)일 수 있다. VSV의 당단백질을 갖는 높은 역가의 HIV-1 위형을 제조하는 방법은 문헌 [Bartz and Vodicka, Methods 12(4):337-42, August 1997]에 개시되어 있으며, 다중 약독화 렌티바이러스 벡터에 대해서는 문헌 [Zuffery et al., Nature Biotechnology, 15:871-75, September 1997]에 기재되어 있다. 이러한 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 숙주의 범위가 넓으며, 한외 원심분리에 의해 높은 역가로 농축될 수 있다.

또한, 아데노바이러스 및 레트로바이러스의 키메라 벡터 시스템도 효과적인 유전자 전달 및 장기간의 유전자 발현에 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터가 생체 내에서 일시적인 레트로바이러스 생산 세포를 제조하여, 생성된 레트로바이러스 입자가 주변 세포를 감염시키는 키메라 바이러스 시스템은 문헌 [Feng et al., Nature Biotechnology 15:866-70, September 1997]에 기재되어 있다.

통상, 레트로바이러스 벡터는 내독소혈증의 증상이 발전할 위험성이 높은 환자의 증상을 예방하는데 바람직하다. 예를 들면, 화상 환자는 거의 100% 내독소혈증이 발생한다. 레트로바이러스 벡터는 조혈 간세포에 결합될 수 있기 때문에, 이들은 LPS 내성 T 세포, B 세포 및 대식세포의 저장기로 작용할 수 있다.

재조합 바이러스는 내독소혈증을 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 환자에 투여된다. 유효량은 환자의 특성, 치료해야할 질병의 유형 및 심각성, 바람직한 치료 기간, 투여 방법 및 기타 한정 요소에 따라 달라진다. 유효량은 의사 또는 유자격 의학 전문가에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 바이러스는 일반적으로 약 10⁴내지 10¹⁴pfu의 투여량의 형태로 제형화 및 투여된다.

본 발명의 실시는 하기의 실시예에 의해 예시된다. 본 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

<실시예 1> C3H/HeJ 마우스 Lps^d유전자의 단리 및 특성 조사

문헌[Kang et al., Infect. Immun. 64, 4612-4617(1996)]의 연구는 Lpsⁿ유전자가 C3H/HeJ 세포주의 비장 B 세포에서 리포폴리사카라이드 매개된 B 세포의 반응을 복구할 수 있음을 보여주었다.

C3H/HeJ 마우스의 게놈에 Lps 유전자의 결함이 있고, 이러한 결함이 LPS 자극에 대한 저반응성을 유발시킨다는 것을 증명하기 위해, pCD-HeJ cDNA 라이브러리로부터 Lps 유전자를 단리하였다.

오까야마-버그(Okayama-Berg) cDNA 발현 라이브러리[Okayama, H., and Berg, P., Mol Cell Biol 2, 161-170 (1982)]를 C3H/HeJ 비장 B 세포의 RNA를 사용하여제작하였다. pCD-HeJ cDNA 라이브러리를 8개의 접시(150mm 접시당 5.8×10⁴개의 클론)에 도말하고, 상기 라이브러리에 C3H/HeOuJ LPS 반응 마우스의 세포로부터 수득한 LpsⁿcDNA의 0.9kb의 BamHⅠ-PstⅠ 단편을 프로브로 사용하였다[Infect. Immun. 64, 4612-4617 (1996)]. 그 결과 25개의 양성 클론을 수득하였다.

C3H/HeOuJ(야생형) LpsⁿcDNA의 크기와 비교했을 때, 분석된 25개의 클론 중 8개가 전장 cDNA였다. 이어서, 상기 전장 cDNA 클론 중 4개를 서열분석하였다(Lps^d-4, -10, -15 및 -17). 상기 4개의 독립 클론을 야생형의 LpsⁿcDNA와 비교하였다.

도 1A 내지 1D에 도시된 바와 같이, 4개의 모든 클론이 LpsⁿcDNA의 870 위치(ATG로부터 잔기 번호 시작)에서 T 잔기가 C 잔기로 대체되는 동일한 점돌연변이였다. 흥미롭게도, 상기 단일 점돌연변이는 3'-비번역 부분에 나타났다. 노던 (RNA) 블롯 분석 결과, C3H/HeJ 및 C3H/HeOuJ 세포는 RNA 수준에서 유의한 차이가 없었다.

이 데이타는 HeJ Lps^d유전자 내의 점 돌연변이로 인해 LPS에 대한 C3H/HeJ 세포의 저반응성이 나타난다는 것을 의미한다.

GCG 서열 분석 패키지(Wisconsin)의 SQUIGGLES 프로그램을 이용하여 Lpsⁿ과 Lps^dmRNA의 이차 구조를 비교하였다. 도 7의 A(Lpsⁿ) 및 B(Lps^d)는 점돌연변이 인접부의 RNA 이차 구조가 현저하게 차이나고, 점돌연변이에서 먼 거리에 있는 영역은 차이가 없음을 보여준다. Lps^dmRNA의 3'UTR에 나타나는 단일 염기 치환은 조절 단백질이 결합하고, 전사 효율, mRNA 안정도, 수송 또는 세포내 위치 지정에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 조절작용이 일어날 수 있는 독특한 mRNA 도메인의 존재를 시사한다. 또한, Lpsⁿ및 Lps^d레트로바이러스 벡터를 제작하여 야생형 및 돌연변이 Lps 유전자 산물 및 LPS에 대한 반응에서 이들의 역할의 특성을 조사하였다.

<실시예 2> Lpsⁿ및 Lps^d레트로바이러스 벡터의 제작

실시예 1의 Lpsⁿ및 Lps^dcDNA를 N2 레트로바이러스 벡터의 XhoⅠ 부위에 클로닝하였다[Wong et al., Mol. Cell. Biol. 9, 798-808 (1989); Wong et al., Genes Dev. 1, 358-365 (1987)]. N2 레트로바이러스 벡터는 5' 및 3' MMLV LTR, 스플라이스 공여 및 스플라이스 수용 부위, 및 네오마이신 내성 마커 유전자를 포함하고 있다.

pCD-LPS[Infect. Immun. 64, 4612-1617 (1996)]의 XhoⅠ제한효소 단편으로부터 LpsⁿcDNA를 단리하고, N2 레트로바이러스 벡터의 XhoⅠ 제한 단편 부위에 클로닝하여 pN2-Lpsⁿ을 제조하였다. 돌연변이된 Lps^dcDNA를 사용한 것을 제외하고, 동일한 방법으로 pN2-Lps^d벡터를 제조하였다.

GP/E 바이러스 패키징 세포[Markwitz et al., J. Virol. 62, 1120-1124(1998)]를 pN2-Lpsⁿ또는 pN2-Lps^d플라스미드 DNA로 인산칼슘 DNA 동시 침전법을 이용하여 각각 형질감염시켜 Lpsⁿ및 Lps^d서열을 가지고 있는 레트로바이러스 저장액을 제조하였다. 양성 형질전환체를 1mg/ml의 G418을 함유하는 배지에서 선별하였다. 각각의 G418 내성 클론을 단리하고 증폭시켜 특성을 조사하였다.

생산 세포로부터 바이러스를 회수하고, 600㎕의 바이러스 상등액을 사용하여 4℃에서 계속 교반하면서 1 내지 1.5시간 동안 0.4M NaCl 및 8.5% PEG8000(Sigma) 중에서 바이러스를 침전시켜 농축된 바이러스 상등액을 제조하였다. 7,500rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 원래 부피의 1% NTE 완충액(100mM NaCl, 10mM Tris-Cl pH7.4, 1mM EDTA, 여과 멸균)에 펠렛을 용해시켰다. 이 용액을 4℃의 세파로스 CL-4B 컬럼에 로딩하였다. 여러 분획을 수집하였다. 수집된 각각의 분획을 여과 멸균하고, 문헌 [Wong et al., Mol. Cell. Biol. 9, 798-808 (1989)]에 기재된 바와 같이 NIH/3T3 세포의 G418 내성에 의해 바이러스 역가를 측정하였다.

N2 모벡터, N2-Lpsⁿ및 N2-Lps^d벡터의 제작은 도 3의 A 내지 C에 각각 나타나있다.

<실시예 3> C3H/HeJ 마우스의 비장 B 세포로 Lpsⁿ및 Lps^d유전자의 레트로바이러스 전달

A) 레트로바이러스 유전자 전달

C3H/HeJ 마우스의 비장 B 세포에서 적혈구를 제거하고 1 내지 100 ㎍/㎖의 LPS 존재 하에 레트로바이러스로 감염시키고, 이어서 전구 B 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려진, S17 스트로마 세포에 조건화된 배지에서 배양하였다[Collinset al., J. Immunol. 138, 1082-1087 (1987); Dorshkindet al., J. Immunol. Methods123, 93-101 (1989); Narendranet al., Eur. J. Immunol. 22, 1001-1006 (1992)]. 도 2에 도시된 흐름도에 기재된 바와 같이, 농축된 바이러스 상등액의 새로운 저장액을 반복하여 배양에 공급하여 레트로바이러스 감염 효율을 최대화하였다. N2 모벡터인 N2-Lpsⁿ또는 N2-Lps^d의 농축된 저장액의 바이러스 역가를 ㎖ 당 2 x 10⁶G418^r콜로니로 표준화하였다.

B) MTT 증식 측정

LPS 자극 및 레트로바이러스 감염의 개시 후 여러 시점에서 세포를 회수하여 MTT [3-94,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드] 증식 측정법을 수행하였다[Han et al., Pro. Natl. Acad. Sci. 92, 11014-11018 (1995)].

적혈구가 제거된 1000만개의 C3H/HeJ 비장세포를 10 ㎖의 S17CM(10% 소태아 혈청 및 50 μM 2-메르캡토에탄올을 함유하는 RPMI에서 24시간 동안 배양한 S17 세포, 일련의 0, 12, 24, 및 48시간)을 함유하는 100 mm 세포 배양 플레이트에 6시간 동안 배치하였다. 배양 후, 비부착 세포를 회수하여 10 ㎖의 감염 혼합물이 있는 100 mm 플레이트에서 다시 감염시켰다. 감염 혼합물은 역가가 2 x 10⁶바이러스/㎖인 농축된 바이러스 상등액 3㎖, 1 ㎖의 S17CM, 10 ㎍/㎖의 폴리브렌 및 살모넬라티피무리움(Salmonella typhimurium)으로부터 가열된 페놀 추출된 10 내지 100 ㎍/㎖의 LPS를 16시간 동안 함유하였다. 16시간 후, 세포를 회수하고 새로운 감염 혼합물로 16시간 동안 추가로 재감염시켰다. 감염 후, 회수된 세포를 2 ㎖의 S17CM 내의 10 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖의 LPS로 자극시키고 0, 12, 24, 48시간 동안 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 이어서, 레트로바이러스에 감염되고 LPS 자극된 세포 100 ㎕를 96 웰 플레이트에 배치하였다. 10 ㎕의 5 mg/㎖ MTT를 첨가하고 세포와 혼합한 다음 플레이트를 배양기에 배치하였다. 배양 4시간 후, 이소프로판올 내 0.04N 염산 100 ㎕를 웰에 첨가하고 완전히 혼합하였다. O.D.570 nm에서 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다.

32시간(=도 2에 표시된 0시간 배양)에서, 모든 배양물 중에서 세포증식에 유의한 차이는 발견되지 않았다(도 4A). 44시간(=도 2에 표시된 12시간 배양)에서, N2-Lpsⁿ감염 세포는 세포 증식에 명백한 증가를 보였지만 N2-Lps^d및 N2-감염 세포는 상기와 같은 세포 증식을 보이지 않았다(도 4B). 감염 배양을 개시 후 68시간(=도 2에 표시된 48시간 배양)에서, N2-Lpsⁿ감염 배양물과 N2- 또는 N2-Lps^d감염 배양물 사이에 LPS 반응에 최대 4배 차이가 있었다. 이어서, 상기 반응은 92시간에서 감퇴하기 시작하였다.

C3H/HeJ 비장 B 세포의 N2-Lpsⁿ감염 배양에서 44시간에 관찰된 LPS 반응은 LPS 자극 후 24시간된 C3H/HeOuJ 반응 비장 B 세포와 동일하였다(자료 미제시). 이러한 C3H/HeJ 비장 B 세포의 LPS 반응의 지체는 (1) 48시간 이상 후, 약 50%의세포만이 N2-Lpsⁿ벡터로 형질도입되고, (2) 지체시간이 바이러스 삽입 및 형질도입된 유전자의 발현에 필요하다는 점에 기인한다. 세포 증식은 N2- 또는 N2-Lps^d감염 배양 보다 N2-Lpsⁿ감염 배양에서 명백히 더욱 현저하였는데, 이는 증식하는 소림프구 및 배발생 중인 세포의 수가 N2- 또는 N2-Lps^d감염 배양 보다 N2-Lpsⁿ감염 배양에서 훨씬 더욱 높았기 때문이다(자료 미제시). 또한, 폴리클로날 B 세포 분화도 일어났는데, 이는 N2-Lpsⁿ벡터로 형질전도입된 C3H/HeJ 비장 B 세포는 LPS로 자극되어 이전에 문헌[Kanget al., Infect Immuno.64, 4612-5617 (1996)]에 기재된 바와 유사한 양의 용해성 적혈구에서 항체를 생산할 수 있었으나, N2- 또는 N2-Lps^d벡터로 형질전환된 C3H/HeJ 비장 B 세포는 상기와 같이 항체를 생산할 수 없었다.

(C) RT-PCR 분석

대응하는 야생형 또는 돌연변이형 Ran cDNA의 성공적인 레트로바이러스 전달에 기인한 LPS에 대한 반응 유무를 확인하기 위하여, RT-PCR 분석을 모든 배양물의 세포에 대해 수행하였다. 레트로바이러스 벡터 내에 존재하는 SV40 프로모터의 서열에 특이적인 5' 올리고 프라이머 및 Lpsⁿ또는Lps^dcDNA에 특이적인 3' 프라이머를 사용하였다.

전체 RNA를 4M GTC 및 페놀/클로로포름을 이용하여 레트로바이러스로 감염된비장 B 세포로부터 추출하였다. AMV-RT를 cDNA 합성하는 데 사용하였다. 두 종의 프라이머가 PCR 반응에 이용하여 907bp 단편을 생성하였다: XhoI 단편의 pCD 부위로부터 5' 프라이머(TCTAAAAGCTGCTGCAGG, SEQ ID NO. 3) 및 Lps cDNA로부터 3' 프라이머(GTACACGATCTGCTTAGC, SEQ ID NO. 4). 결과를 도 5에 나타내었다.

예상된 907bp 밴드는 N2-Lpsⁿ또는 N2-Lps^d바이러스로 형질도입된 배양물에서 나타났으나, N2 바이러스로 형질도입된 배양물에서는 나타나지 않은 것으로 성공적인 유전자 전달 및 형질도입된 유전자의 발현을 확인하였다. 게놈 DNA가 PCR 반응에 이용되었을 때, 도 5에서 보여진 907 bp 밴드를 관찰할 수 없었기 때문에 상기 프라이머는 Lps RNA에 특이적이다. 이것은 5' 프라이머가 Lps cDNA의 벡터 서열 상부에 특이적이기 때문이다. 따라서, C3H/HeJ 마우스의 비장 B 세포에 LpsⁿcDNA를 도입 및 발현하여 LPS 자극에 대한 반응을 유의하게 회복시켰으나, Lps^dcDNA 경우에는 그렇지 못하였다. C3H/HeJ 종과 다른 반응 종의 고전적인 교배 실험은 LPS의 분열촉진 반응이 공동 우성 대립유전자로 구성된 단일 좌위에 의해 지배받는다는 것을 시사한다. 본원에 제시된 결과로부터, Ran은 C3H/HeJ LPS 저반응성 마우스의 게놈에 결함이 있는 Lps 반응 유전자인 것 같다.

<실시예 4> 정상 동종교배 마우스의 대식세포로의 Lps^d유전자의 레트로바이러스 전달

Ana I은 정상 동종교배 마우스에서 유래된 대식세포이고, GG2EE 세포는C3H/HeJ LPS 저반응 마우스로부터 유래된 대식세포이다. Ana I 세포를 실시예 2의 N2-Lps(d) 레트로바이러스 벡터로 감염시키고 형질도입된 세포의 TNFα생산을 LPS 자극 후 다양한 시간에서 측정하였다.

레트로바이러스 형질도입을 위하여, 현탁액 중 1X10⁶개의 세포를 10 ㎍/㎖의 폴리브렌 존재 하에 5 ㎖의 레트로바이러스 상등액으로 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 빈번한 진탕과 함께 4시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, D₁₀G(10% 열처리로 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 10 ㎍/㎖의 젠타마이신 및 1 ㎎/㎖의 G418로 보충된 DMEM)로 세척한 후 5 ㎖의 D₁₀G에 다시 현탁하였다. 1.6 ㎖ 메틸셀룰로스와 0.4 ㎖의 레트로바이러스 형질도입된 세포 및 1 ㎎/㎖의 G418을 혼합하여 메틸셀룰로스 혼합물을 제조하고 상기 혼합물(플레이트 당 약 1.1 ㎖)을 35 mm 접시에 도말하였다. 콜로니를 찍어 증폭시킨 후 2주 동안 모았다.

LPS 자극을 위하여, 세포(Ana I, GG2EE 및 레트로바이러스 형질도입된 Ana I 세포)를 24 웰 플레이트(5×10⁵세포/웰)에 접종하고 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 세포를 0, 24, 48, 또는 72시간 동안 100 ng/㎖의 LPS로 자극시켰다. 상등액을 모으고 TNFA의 양을 ELISA 분석법을 이용하여 측정하였다.

TNFα 측정을 위하여, 50 ㎕의 TNFα 포획 항체(2 ㎍/㎖)를 마이크로플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밤새 4℃에서 배양하였다. 이어서, 상기 플레이트를 PBST로 4회 세척하고, 블로킹 완충액(200 ㎕)을 각 웰에 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBST로 4회 세척하고, 시료(웰 당 100 ㎕)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션한 다음 PBST로 4회 세척하였다. TNFα 검출을 위하여, 바이오틴 부착 TNFα 항체(1 ㎍/㎖, 100 ㎕/웰)를 웰에 첨가하고, 이 플레이트를 1시간 동안 실온에서 배양한 후, PBST로 세척하였다. 스트렙타비딘-HRP 접합된 효소(1:1000 희석, 100 ㎕/웰)를 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 실온에서 배양한 다음, PBST로 8회 세척하였다. ABTS 기질(웰 당 100 ㎕)을 첨가하고, 플레이트를 발색을 위해 실온에서 인큐베이션하였다. 발색도를 OD 405 nm에서 측정하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.

#1, #7 및 #9은 독립된 클론인 반면, P30은 독립된 30개 클론의 혼합물로부터 유래된 세포였다. 이 실험은 Ana I 반응 세포에서 Lps^d유전자의 발현이 상기 세포 내의 LPS 매개 시그날 전달을 감소 조절한다는 것을 시사한다. 따라서, Lps^d유전자는 환자의 내독소혈증의 치료 또는 그 발생을 예방하기 위한 치료 DNA로 이용될 수 있다.

<실시예 5> 아데노바이러스 벡터의 제작 및 생체 내 아데노바이러스 Lps 전달용 바이러스 생산

Lps^d, Lpsⁿ및 GFP 유전자를 하기와 같이 Ad5 아데노바이러스 벡터에 클로닝하여 E1 부위를 대체하였다. 벡터 제작은 도 8에 개략적으로 도시하였다.

Lps^d및 LpsⁿcDNA를 pCD-Lpsⁿ및 pCD-Lps^d(cDNA의 870 위치에 T-C 돌연변이가 있는 pCD-Lps^d는 스템셀 테라팩틱스사에 의해 공급됨)의 3249 및 35 위치에서 BamHI으로 절단하였다. 상기 pCD-Lpsⁿ및 pCD-Lps^d를 Ad5 게놈의 E1 부위에 삽입하여 CMV 프로모터로 조절하였다. pEGFP 플라스미드(클론텍사, 라 졸라)부터 GFP(green fluorescence protein) 유전자를 BamHI 및 NotI으로 절단하고 동일한 위치에 삽입하여 마찬가지로 CMV 프로모터로 조절하였다. 재조합 아데노바이러스는 E1의 제거로 인해 복제 결함을 보인다. 그러나, 상기 재조합 아데노바이러스는 E1 유전자를 함유하는 293 세포 내에서 복제할 수 있다. 재조합 바이러스를 생산하기 위하여, 293 세포를 재조합 Ad5 DNA로 형질전환시켰다. 형질전환으로부터 10일 후, 세포를 배양 플라스크로부터 긁어 모았다. 에탄올/드라이아이스조에서 동결하고 37℃에서 빠른 해동을 3회 연속 수행한 후, 1 ㎖의 바이러스 용해액을 20개의 150 mm 플레이트 내에 293 세포를 감염시키는 데 이용하였다. 3일 후, 바이러스를 상기한 바와 같이 회수하고 염화세슘 띠 형성법으로 정제한 후 PBS에 대하여 3회 투석하였다. 바이러스 역가를 측정하기 위하여, 293 세포를 6 웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후 24시간에, 바이러스 저장액을 연속 희석하여 세포를 감염시켰다. 감염 후 2시간에, 배지를 제거하고 세포를 2% FBS 및 1% 아가로스를 함유하는 배지로 덮었다. 10일 후, 바이러스 플라크 수를 기록하였다. 아데노바이러스 벡터의 역가는 10¹²pfu/㎖이었다.

<실시예 6> 생체 내 아데노바이러스 Lps 전달

이 연구에서, 찰스 리버사에서 구입한 이종교배 CD1 마우스에 패혈성 쇼크를 유도하고 Lpsⁿ, Lps^d또는 GFP cDNA를 포함하는 벡터로 처리하였다. 이종교배 CD1을 실험 결과에서 이종성 정도를 관찰할 수 있도록 하기 위하여 이용하였다.

A. 접종

내독소의 LD₅₀및 LD₁₀₀은 마우스를 이용하여 각각 0.6 mg 및 1 mg으로 측정되었다. 그 후, 각 마우스에 LD₁₀₀에 해당하는 1 mg의 내독소를 복강내 주사로 접종하였다. 1시간 후, 10¹⁰pfu를 함유하는 Ad5-Lps^d, Ad5-Lpsⁿ또는 Ad5-GFP 바이러스 0.5 ㎖을 각 마우스에 정맥내 투여하였다.

B. 생존

동물을 6 내지 12시간 간격으로 관찰하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 1 mg의 LPS로 처리된 모든 마우스가 36시간 내에 사망하였고, Ad5-Lpsⁿ또는 Ad5-GFP로 처리된 마우스도 마찬가지로 폐사하였다. Ad5-Lps^d로 처리된 마우스의 절반은 상기와 동일한 시간 내에 사망하였으나, 나머지 절반은 생존하였다(도 9). 유전자 전달 처리 후 생존 이질성은 이종교배 CD1 마우스의 이용과 관련되었다. 생존한 군내 한 마리 마우스는 초기에 악태증을 보였으나, 회복 후 건강해졌다. Ad5 바이러스로만 처리된 마우스 중에는 한 마리도 사망하지 않아 독성이 없음을 나타내었다. 따라서, 돌연변이 Lps^dcDNA의 전달은 패혈증 쇼크로부터 내독소-민감성 마우스를 구할 수 있다.

C. 형질도입 마우스의 PCR

아데노바이러스성 유전자 전달의 존재를 증명하기 위하여, 생체내 유전자 전달 후 Ad5-Lpsⁿ또는 Ad5-Lps^s로 형질도입된 마우스의 말초혈 단핵 세포를 다양한 시간에서 회수하여 하기에 기재된 바와 같이 RNA를 추출하였다.

CD1 마우스를 약 10¹⁰pfu 감염성 재조합 아데노바이러스 입자로 꼬리를 통해 정맥내 접종하였다. 2, 4, 6, 10 및 24시간 후, 전혈을 헤마토크리트 튜브에 회수하였다. 원심분리 후, 백혈구 담황색층을 회수하고 RNA 추출을 위하여 GTC 완충액(Wonget al., J. Virol. 68, 5523-5531, 1994)에서 용해시켰다. 각 RNA 시료의 최종 부피는 10 ㎕였고 상기 모든 RNA를 기재된(동일 문헌) 바와 같이 올리고-dT 프라이머를 이용한 역전사에 이용하였다. 전체 RT 반응 부피는 20 ㎕였다. 20 ㎕ 중 2 ㎕를 본 발명자들의 이전 보고(상기 문헌)에 기재된 것과 유사한 네스티드 PCR 증폭에 사용하였다. 각 반응에서, 50 ㎕의 반응 부피에 1.5 유닛의 Taq 중합효소(시그마)를 이용하였다. 1회 PCR 증폭시, 시료를 먼저 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 변성(94℃, 1분), 어닐링(60℃, 1분) 및 프라이머 확장(72℃, 1분)을 20회 반복 수행하였다. 마지막회에서, 프라이머 확장을 72℃에서 10분으로 연장하였다. 2회 PCR 증폭시, T7 프로모터 서열에 특이적인 5'프라이머 서열(T7 센스)은 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3'(SEQ ID No. 5)이고, Lps cDNA(810nt 위치에서 시작)에 특이적인 안티센스 서열인 3'프라이머 서열은 5'-GAA ATT CAG AAA GGA AAC AAC TCT GTT CCA-3'(SEQ ID No. 6)이었다. 증폭된 DNA 단편의 예상 크기는 1020bp이었다. 2회 네스티드 PCR 증폭시, 1회 PCR 증폭의 총 50 ㎕ 반응 부피 중 2 ㎕를 두 번째 PCR 반응에 이용하였다. 5'프라이머는 제작하는 동안 아데노바이러스 벡터의 Lps cDNA에 부착된 pcDNA3 서열에 특이적인, pcDNA3(인비트로젠사) 센스 서열인 5'-ACT ATA GGG AGA CCC AAG CT-3'(SEQ ID No. 7)였다. 3' 프라이머(R1 안티센스) 서열은 Lps cDNA(606nt 위치에서 시작)에 특이적인 5'-AGC AGT CGT CTG AGC AAC CT-3'(SEQ ID No. 8)였다. PCR 증폭 산물의 예상 크기는 790bp이었다. 시료를 먼저 95℃에서 5분간 변성한 후 94℃에서 1분, 60℃에서 1분및 72℃에서 1분으로 30회 반복 수행한 후, 프라이머 확장 반응을 10분 동안 연장 수행하였다.

D. PCR 결과

생체 내 유전자 전달 후 2시간 정도의 초기에 세포의 RNA는 793bp 밴드를 함유하였는데, 이는 아데노바이러스 mRNA의 존재를 시사한다(도 10). 상기 밴드는 역전사 또는 cDNA 주형 부재 하에서 관찰되지 않았다(도 10). 상기 자료는 정맥내 벡터 접종 후 2시간 정도의 초기에 아데노바이러스 유전자 발현이 일어날 수 있었음을 시사한다.

합성, 제조 및 분석 방법이 개시된 것을 포함한 인용된 모든 참고문헌은 본원에 포함된다.

본 발명은 취지 또는 그의 본질적인 특성을 벗어나지 않고서 다른 특정한 형태에서 구현될 수 있고, 따라서, 본 발명 범위의 지표로서 명세서보다는 첨부된 청구항을 참조해야 한다.

Claims

유효량의 Lps^d유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 내독소혈증 치료를 필요로 하는 환자의 내독소혈증 치료 방법.
제1항에 있어서, Lps^d유전자가 Lps cDNA의 3' 비번역 영역 내의 변이에 의해 동일 종의 대응하는 Lpsⁿ유전자와 구별되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 변이가 번역 개시 코돈으로부터 상기 cDNA의 870번 위치의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, Lps^d유전자가 바이러스 벡터 형태로 투여되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 방법.
제4항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
유효량의 Lps^d유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 내독소혈증의 예방을 필요로 하는 환자의 내독소혈증 예방 방법.
제7항에 있어서, Lps^d유전자가 Lps cDNA의 3' 비번역 영역 내의 변이에 의해 동일 종의 대응하는 Lpsⁿ유전자와 구별되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 변이가 번역 개시 코돈으로부터 상기 cDNA의 870번 위치의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, Lps^d유전자가 바이러스 벡터 형태로 투여되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 방법.
제10항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
제7항에 있어서, 환자가 화상 환자인 방법.