CN108603199A

CN108603199A - 用于治疗粘脂贮积症ii型的腺伴随病毒载体

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Publication number: CN108603199A
Application number: CN201680081705.8A
Authority: CN
Inventors: N·尤; D-K·金
Original assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation; Genzyme Corp
Current assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation; Genzyme Corp
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2018-09-28
Also published as: RU2018124448A3; AU2016372035B2; KR20180098294A; JP7347932B2; JP2022046635A; IL259964A; JP2019500034A; IL259964B; RU2018124448A; EP3390644A1; CA3008268A1; AU2023204116A1; JP2024056832A; SG10201912935WA; AU2016372035A1; MX2018007330A; WO2017106313A1; RU2742612C2; US20200261598A1; BR112018012015A2

Abstract

本文提供了重组腺伴随病毒(rAAV)载体，其包含编码N‑乙酰葡糖胺‑1‑磷酸转移酶α和β亚基(GNPTAB)的核酸和至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，所述rAAV载体可以包含在rAAV颗粒中，所述rAAV颗粒可以包含在药物组合物和试剂盒中。这些载体、颗粒、组合物和试剂盒尤其可用于与治疗哺乳动物中的粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)相关的，或与在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中增加体型、骨矿物质含量和/或骨矿物质密度相关的方法和用途。

Description

用于治疗粘脂贮积症II型的腺伴随病毒载体

相关申请的交叉引用

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发明领域

本发明涉及用于治疗粘脂贮积症II型和/或III型的rAAV载体、颗粒、组合物，以及与其相关的方法、试剂盒和用途。

发明简述

粘脂贮积症II和III型(ML II；ML III)是常染色体隐性溶酶体贮积症，其特征在于缺乏UDP-GlcNAc；溶酶体酶N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(缩写为GlcNAc-1-磷酸转移酶)。GlcNAc-1-磷酸转移酶是一种六聚体酶复合物，由三个不同的亚基组成：α₂、β₂和γ₂。α₂和β₂亚基含有催化活性，并由单个基因GNPTAB编码。在MLII患者中发现导致酶活性完全丧失的GNPTAB突变。粘脂贮积症II是高度进行性的，且患者很少能够活过生命的第一个十年。此外，ML II的可用治疗选择仍然有限。仅在少数患者中尝试过骨髓移植。相反，在MLIII患者中发现导致GlcNAc-1-磷酸转移酶活性部分降低的GNPTAB中的突变。这些患者通常表现出较不严重的症状和较慢的疾病进展，但仍然存在严重的健康问题，如骨骼异常、发育迟缓和心脏肥大。

显示组织特异性趋向性和促进转基因持续表达的AAV血清型的可用性提供了用于溶酶体疾病系统性治疗的AAV介导的基因疗法的可能性，所述溶酶体疾病包括ML II和MLIII。因此，研究AAV介导的ML II/III治疗对于确定该方法是否为这种破坏性疾病提出一种潜在治疗策略是重要的。然而，在可以检查AAV介导的MLII/III治疗之前，需要克服技术限制。GNPTAB的编码序列(人类的超过5.6kb)比内源性AAV基因组(约4.7kb)长。因此，能够容纳GNPTAB以及功能性启动子/增强子序列和AAV基因组的其他组分同时仍有助于有效包装成病毒颗粒的AAV载体是非常有利的。

本发明提供了重组腺伴随病毒(rAAV)载体，其包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)和至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)的核酸。在一些实施方案中，GNPTAB包含α和β亚基。在一些实施方案中，GNPTAB与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，GNPTAB是人GNPTAB。在一些实施方案中，所述GNPTAB包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GNPTAB包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，其中所述启动子是CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，所述CBA启动子是修饰型CBA启动子。在一些实施方案中，所述修饰型CBA启动子是截短型CBA启动子。在一些实施方案中，所述CMV增强子是缩短的CMV增强子。在一些实施方案中，所述载体包含内含子。在一些实施方案中，所述内含子是MVM内含子。在一些实施方案中，所述载体包含聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化序列是牛生长激素聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，所述AAV末端重复序列是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，所述rAAV载体包含两个ITR。

在一些方面，本发明提供包含上述实施方案中任一项的rAAV载体的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述AAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含一个或多个ITR和源自相同AAV血清型的衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含一个或多个源自与所述rAAV病毒颗粒的衣壳不同的AAV血清型的ITR。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8衣壳，并且其中所述载体包含AAV2ITR。在一些实施方案中，通过用编码rAAV载体的核酸和编码AAV rep和cap功能的核酸转染宿主细胞，并提供编码AAV辅助功能的核酸来产生rAAV颗粒。在一些实施方案中，通过用编码AAV辅助功能的核酸转染宿主细胞来提供AAV辅助功能。在一些实施方案中，通过用提供AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染宿主细胞来提供AAV辅助功能。在一些实施方案中，所述AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒由AAV生产细胞产生，所述AAV生产细胞包含编码rAAV载体的核酸和编码AAVrep和cap功能的核酸，并提供编码AAV辅助功能的核酸。在一些实施方案中，所述AAV生产细胞包含编码AAV辅助功能的核酸。在一些实施方案中，通过用提供AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染AAV生产细胞来提供AAV辅助功能。在一些实施方案中，所述AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。在一些实施方案中，本发明提供包含本发明记载的任何rAAV颗粒的药物组合物。

在一些方面，本发明提供在哺乳动物中治疗粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的任何本发明记载的rAAV颗粒或本发明记载的药物组合物。

在一些方面，本发明提供在哺乳动物中治疗粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)和至少一个AAV ITR的核酸。在一些实施方案中，本发明提供在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中维持或增加身体尺寸的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达导致体重增加的维持或增加，和/或身高增加的维持或增加。在一些实施方案中，本发明提供在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中预防身体尺寸减小的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶

(GNPTAB)和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达预防体重的降低。在一些实施方案中，本发明提供在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中维持或增加骨矿物质含量的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达导致骨矿物质含量的维持或增加。在一些实施方案中，本发明提供在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中预防骨矿物质含量降低的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达预防骨矿物质含量的降低。在一些实施方案中，本发明提供在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中维持或增加骨矿物质密度的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达导致骨矿物质密度的维持或增加。在一些实施方案中，本发明提供在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中预防骨矿物质密度降低的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达预防骨矿物质密度的降低。

在上述方法的一些实施方案中，所述治疗缓解ML II或ML III的一种或多种症状，其中所述ML II或ML III的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全(insufficiency)、便秘或腹泻。在一些实施方案中，所述治疗延迟ML II或ML III的一种或多种症状的进展，其中所述ML II或ML III的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全、便秘或腹泻。在一些实施方案中，本发明提供缓解哺乳动物中ML II或ML III的一种或多种症状的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸；其中所述ML II或ML III的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全、便秘或腹泻。在一些实施方案中，本发明提供延迟哺乳动物中ML II或ML III的一种或多种症状的进展的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸；其中所述ML II或MLIII的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全、便秘或腹泻。

在上述方法的一些实施方案中，所述GNPTAB与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述GNPTAB是人GNPTAB。在一些实施方案中，所述GNPTAB包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GNPTAB包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述启动子是CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，所述CBA启动子是修饰型CBA启动子。在一些实施方案中，所述修饰型CBA启动子是截短型CBA启动子。在一些实施方案中，所述CMV增强子是缩短的CMV增强子。在一些实施方案中，所述载体包含内含子。在一些实施方案中，所述内含子是MVM内含子。在一些实施方案中，所述载体包含聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化序列是牛生长激素聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，所述AAV末端重复序列是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，所述rAAV载体包含两个ITR。在一些实施方案中，所述AAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含一个或多个ITR和源自相同AAV血清型的衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含一个或多个源自与所述rAAV病毒颗粒的衣壳不同的AAV血清型的ITR。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8衣壳，并且其中所述载体包含AAV2ITR。

在上述实施方案的一些实施方案中，通过用编码rAAV载体的核酸和编码AAV rep和cap功能的核酸转染宿主细胞，并提供编码AAV辅助功能的核酸来产生rAAV颗粒。在一些实施方案中，通过用编码AAV辅助功能的核酸转染宿主细胞来提供AAV辅助功能。在一些实施方案中，通过用提供AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染宿主细胞来提供AAV辅助功能。在一些实施方案中，所述AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒由AAV生产细胞产生，所述AAV生产细胞包含编码rAAV载体的核酸和编码AAVrep和cap功能的核酸，并提供编码AAV辅助功能的核酸。在一些实施方案中，所述AAV生产细胞包含编码AAV辅助功能的核酸。在一些实施方案中，通过用提供AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染AAV生产细胞来提供AAV辅助功能。在一些实施方案中，所述AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。

在上述方法的一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述人是儿科受试者。在一些实施方案中，所述人是年轻的成年人。

在上述方法的一些实施方案中，所述rAAV静脉内、腹膜内、动脉内、肌内、皮下或肝内施用。在一些实施方案中，所述rAAV静脉内施用。在一些实施方案中，所述rAAV施用至超过一个部位。在一些实施方案中，重复所述施用。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒在药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

在一些方面，本发明提供本发明记载的任何药物组合物在制备用于在哺乳动物中治疗ML II或ML III的药物中的用途。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何药物组合物在制备用于本发明记载的任何方法的药物中的用途。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何rAAV颗粒在制备用于在哺乳动物中治疗ML II或ML III的药物中的用途。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何rAAV颗粒在制备用于本发明记载的任何方法的药物中的用途。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何药物组合物，其用于在哺乳动物中治疗ML II或ML III。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何药物组合物，其用于本发明记载的任何方法中的用途。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何重组AAV，其用于在哺乳动物中治疗ML II或ML III。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何重组AAV用于本发明记载的任何方法中的用途。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中缓解ML II或ML III的一种或多种症状或在哺乳动物中延缓ML II或ML III的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何rAAV颗粒在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中缓解ML II或ML III的一种或多种症状或在哺乳动物中延缓ML II或ML III的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何药物组合物用于缓解ML II或ML III的一种或多种症状或在哺乳动物中延缓ML II或ML III的一种或多种症状的进展的用途。在一些实施方案中，本发明提供本发明记载的任何重组AAV用于缓解ML II或ML III的一种或多种症状或在哺乳动物中延缓ML II或ML III的一种或多种症状的进展的用途。在一些实施方案中，所述ML II或ML III的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全(insufficiency)、便秘或腹泻。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。

在一些方面，本发明提供试剂盒，其包含本发明记载的任何rAAV载体、本发明记载的任何rAAV颗粒或本发明记载的任何药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒用于根据本发明记载的任何方法治疗ML II或ML III。在一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明记载的任何rAAV载体、本发明记载的任何rAAV颗粒或本发明记载的任何药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种缓冲液或药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于在治疗ML II和/或ML III中使用的说明书。

在一些方面，本发明提供粘脂贮积症II(ML II)的动物模型，其中N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)基因的至少一个等位基因包含位于外显子12和外显子20之间的缺失。在一些实施方案中，所述GNPTAB基因的至少一个等位基因包含跨越外显子12和外显子20的缺失。在一些实施方案中，所述动物对于GNPTAB基因中的缺失是纯合的。在一些实施方案中，所述动物对于GNPTAB基因中的缺失是杂合的。在一些实施方案中，所述GNPTAB基因的一部分由编码报道分子和/或选择标记的基因替代。在一些实施方案中，所述选择标记赋予对新霉素的抗性。在一些实施方案中，所述动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，所述啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，所述小鼠具有源自129/Sv和/或C57Bl/6的遗传背景。在一些实施方案中，所述动物具有免疫活性(immunocompetent)或是免疫缺陷的。

在一些方面，本发明提供生成粘脂贮积症II(ML II)的动物模型的方法，包括在动物的GNPTAB基因的至少一个等位基因中的外显子12和外显子20之间引入缺失。在一些实施方案中，所述GNPTAB基因的至少一个等位基因包含跨越外显子12和外显子20的缺失。在一些实施方案中，将所述动物培育为对于GNPTAB基因的缺失是纯合的。在一些实施方案中，将所述动物培育为对于GNPTAB基因的缺失是杂合的。在一些实施方案中，所述GNPTAB基因的一部分由编码报道分子和/或选择标记的基因替代。在一些实施方案中，所述选择标记赋予对新霉素的抗性。在一些实施方案中，所述动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，所述啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，所述小鼠具有源自129/Sv和/或C57Bl/6的遗传背景。在一些实施方案中，所述动物具有免疫活性或是免疫缺陷的。

在一些方面，本发明提供评估用于治疗粘脂贮积症II(ML II)的药剂的方法，包括向本发明记载的动物模型施用所述药剂，其中ML II的一种或多种症状的缓解表明所述药剂提供了对ML II的有益治疗。在一些实施方案中，所述ML II的症状是体重下降，骨密度降低，骨矿物质含量降低，骨骼缺陷，认知缺陷，大运动和精细运动技能发展延迟，听力丧失，肌张力不足，突出的腹部，脐疝，气道的进行性粘膜增厚，频繁的呼吸道感染，二尖瓣增厚和关闭不全，便秘和/或腹泻。在一些实施方案中，所述药剂是小分子、多肽、抗体、核酸或重组病毒颗粒。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体以其并入。

附图简述

图1A提供了小鼠GNPTAB基因结构和用于产生GNPTAB敲除小鼠的基因捕获载体的基因组插入位点的图。

图1B是Southern印迹，显示用于产生GNPTAB敲除小鼠的小鼠ES克隆。

图2A-2C显示GNPTAB敲除小鼠中存在的生长迟缓。(图2A)6周龄野生型(+/+)、杂合(+/-)和纯合(-/-)小鼠的体重(g)(***；p<0.0001；Bonterroni多重比较检验)。(图2B)6周时野生型、杂合和纯合小鼠的鼻-肛长(mm)(*；p<0.02；Bonterroni多重比较检验)。(图2C)野生型和纯合小鼠的总体形态(gross morphology)。

图3A&3B显示来自野生型(图3A)和纯合敲除(图3B)小鼠的苏木精和伊红染色的股骨软骨的代表性切片的光学显微图像。

图4A-4F表明自噬溶酶体在敲除(KO)小鼠的唾液腺中的积累。(图4A-C)EM显示野生型小鼠唾液腺腺泡的概览，其由粘液和浆液细胞组成。(图4D)KO唾液腺腺泡的概览。整体结构被KO中大空泡的大量积累所破坏。(图4E-F)来自(图4D)的液泡的更高放大率，其被单个膜包围并包含未降解的材料。放大区域由(图4D)中的框表示。AL，自噬溶酶体；Mu，粘液细胞；N，核；SG；分泌颗粒。

图5A-5D如标记所示，显示野生型(空心圆圈)和KO小鼠(实心圆圈)的血清中溶酶体酶活性。显示N-乙酰氨基葡糖苷酶(图5A)，β-己糖胺酶A(图5B)，β-半乳糖苷酶(图5C)和β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase)(图5D)的活性。

图6A&6B提供注射实验时间表的概览。(图6A)对于在6周龄时注射了病毒载体的小鼠的研究的长期治疗的时间表。(图6B)显示了针对每个治疗组注射的小鼠(n)的总数。

图7A描绘了含有小鼠GNPTAB cDNA的pAAV2/8-GNPTAB载体的示意图。小鼠GNPTABcDNA序列基于GenBank登录号NM_001004164.2。对核苷酸序列进行了密码子优化以供在小鼠中表达。氨基酸序列未改变。

图7B显示了与其对照同窝小鼠相比，注射了AAV-GNPTAB的KO小鼠的肝脏的定量分析。

图8A&8B显示对照和AAV-GNPTAB治疗的KO小鼠随时间相对于起始重量的体重变化。(图8A)对照小鼠和AAV-GNPTAB治疗的KO小鼠的总体重(*p<0.05Dunnett多重比较检验)。(图8B)表示为随时间相对于起始重量的重量变化量的数据。

图9A&9B显示对照和AAV-GNPTAB治疗的KO小鼠随时间相对于起始高度的高度变化。(图9A)表示为注射前和注射后6周的体长比的数据。(图9B)表示为注射前和注射后32周的体长比的数据。

图10A-10C提供显示在注射前(图10A)、注射后16周(图10B)和注射后32周(图10C)骨矿物质密度水平的直方图。(图10A)将用AAV-GNPTAB治疗的纯合子和纯合子的数据与野生型和杂合子的数据进行比较。(p<0.05,p<0.02，与野生型相比，*；p<0.02,**；p<0.002，与杂合子相比)。在治疗16周(图10B)和治疗32周(图10C)后，AAV-GNPTAB治疗导致纯合小鼠的BMD比率(在Tx之后/之前)的统计学显著增加。(图10B)治疗后16周，用AAV-GNPTAB治疗的GNPTAB缺失小鼠显示出比治疗后32周的其他小鼠(**；P<0.02)(图10C)在BMD比率上的显著增加，BMD比率的显著差异是在GNPTAB治疗的小鼠中观察到。(#；p<0.05,**；p<0.02)。P值通过双尾非配对t检验分析确定。数据表示为平均值±SEM。

图11A-11C提供显示在注射前(图11A)、注射后16周(图11B)和注射后32周(图11C)骨矿物质含量水平的直方图。(图11A)将用AAV-GNPTAB治疗的纯合子和纯合子的数据与野生型和杂合子的数据进行比较。(p<0.05,p<0.02，与野生型相比，*；p<0.02,**；p<0.002，与杂合子相比)。在治疗16周(图11B)和治疗32周(图11C)后，AAV-GNPTAB治疗导致纯合小鼠的BMD比率(在Tx之后/之前)的统计学显著增加。(图11B)治疗后16周，用AAV-GNPTAB治疗的GNPTAB缺失小鼠显示出比治疗后32周的其他小鼠(**；P<0.02)(图11C)在BMD比率上的显著增加，BMD比率的显著差异是在GNPTAB治疗的小鼠中观察到。(#；p<0.05,**；p<0.02)。P值通过双尾非配对t检验分析确定。数据表示为平均值±SEM。

图12A&12B提供直方图，显示注射前瘦体重百分比水平(图12A)和注射后32周瘦体重百分比的变化(图12B)。(图12A)将来自用AAV-GNPTAB治疗的纯合子和纯合子的数据与野生型和杂合子的数据进行比较。(p<0.02，与野生型相比，*；p<0.05,**；p<0.001，与杂合子相比)。(图12B)治疗后32周，在AAV-GNPTAB治疗的小鼠中未观察到％瘦体重的变化。P值通过双尾非配对t检验分析确定。数据表示为平均值±SEM。

发明详述

在一些方面，本发明提供重组腺伴随病毒(rAAV)载体，其包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶α和β亚基(GNPTAB)和至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)的核酸。本文进一步提供了包含本公开的rAAV载体的rAAV颗粒，以及包含本公开的rAAV颗粒的药物组合物。

在一些方面，本发明进一步提供在哺乳动物中治疗粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，并且所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸。本发明还提供用于在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中增加身体尺寸、骨矿物质含量和/或骨矿物质密度的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，并且所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸。在一些实施方案中，GNPTAB的表达导致身体尺寸、骨矿物质含量和/或骨矿物质密度的增加。

在一些方面，本发明还进一步提供用于治疗ML II或ML III的用途和/或试剂盒，例如，其使用本发明的rAAV载体、rAAV颗粒或药物组合物。

I.总体技术

本发明描述或参考的技术和流程整体上是得到本领域技术人员充分理解并且使用常规方法学被通常采用的，如例如，记载在如下各项中的广泛应用的方法：A LaboratoryManual(Sambrook等，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,等编，2003)；Methods in Enzymology丛书(Academic Press,Inc.)；PCR 2:A PracticalApproach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编，1995)；Antibodies,A LaboratoryManual(Harlow和Lane编，1988)；Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique and Specialized Applications(R.I.Freshney，第6版，J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Methods in MolecularBiology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编，AcademicPress,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell,编，J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1996)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis等编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编，J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等，2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:APractical Approach(D.Catty.编，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:APractical Approach(P.Shepherd和C.Dean,编，Oxford University Press,2000)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,编，Harwood AcademicPublishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编，J.B.Lippincott Company,2011)。

II.定义

“载体”如用于本文指重组质粒或病毒，其包含待体外或体内递送至宿主细胞中的核酸。

术语“多核苷酸”或“核酸”如用于本文指任何长度的核苷酸的聚合形式，或为核糖核苷酸或为脱氧核糖核苷酸。如此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、经化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。核酸主链可以包含糖和磷酸基团(正如在RNA或DNA中可以通常找到的)，或修饰的或取代的糖或磷酸基团。或者，核酸主链可以包含合成亚基如磷酰胺(phosphoramidates)的聚合物并因此可以是寡聚脱氧核苷磷酸酰胺(P-NH₂)或混合型磷酸酰胺-磷酸二酯寡聚物。此外，双链核酸可以获得自化学合成的单链多核苷酸产物，或者通过在合适条件下合成互补链并退火链，或者通过使用DNA聚合酶以及合适的引物从头合成互补链。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，并且不限于某个最小长度。这样的氨基酸残基的聚合物可以含有天然的或非天然的氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白及其片段二者都涵盖在该定义内。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。另外，就本发明而言，“多肽”指包括对天然序列的修饰如缺失、添加和取代(通常为性质保守的)的蛋白质，只要该蛋白质保持了期望的活性。这些修饰可以是有意为之，如通过定点诱变，或者可以意外发生，如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增而发生的错误。

“重组病毒载体”指包含一种或多种异源序列(即，非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组AAV载体的情况下，所述重组核酸的侧翼为至少一个，例如两个反向末端重复序列(ITR)。

“重组AAV载体(rAAV载体)”指包含一种或多种异源序列(即，非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列的侧翼为至少一个，例如两个AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于已经用合适的辅助病毒(或表达合适辅助功能的)并且表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，这样的rAAV载体可以复制并包装成感染性病毒颗粒。当将rAAV载体并入更大的多核苷酸中(例如，染色体中或另一载体如用于克隆或转染的质粒中)时，则该rAAV载体可被称作“前载体”，其可以通过在AAV包装功能和合适的辅助功能存在下的复制和封装(encapsidation)而被“拯救”。rAAV载体可以是多种形式中的任何一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合、封装在脂质体内，并且在多个实施方案中，封装在病毒颗粒尤其是AAV颗粒内。rAAV载体可以包装成AAV病毒衣壳以生成“重组腺伴随病毒颗粒(rAAV颗粒)”。

“rAAV病毒”或“rAAV病毒颗粒”指由至少一种AAV衣壳蛋白和封装的rAAV载体基因组组成的病毒颗粒。

“异源”意指源自与其与之相比的实体或与其被引入或并入的实体的其余部分相比基因型不同的实体。例如，通过遗传工程技术引入不同细胞类型的核酸是异源核酸(并且在表达时可以编码异源多肽)。类似地，并入病毒载体的细胞序列(例如，基因或其部分)相对于该载体而言是异源核苷酸序列。

术语“转基因”指被引入细胞并且能够转录成RNA并任选地在合适条件下被翻译和/或表达的核酸。在多个方面，其赋予其被引入的细胞期望的性质，或以其他方式导致期望的治疗或诊断结果。在另一方面，其可以转录成介导RNA干扰的分子，如siRNA。

术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组等效物”或“基因组拷贝”在参考病毒滴度使用时指含有重组AAV DNA基因组的病毒粒子(virion)的数量，与感染性或功能性无关。特定载体制备物中基因组颗粒的数量可以通过如本文实施例中描述的流程测量，或例如通过Clark等(1999)Hum.Gene Ther.,10:1031-1039；Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6:272-278中描述的流程测量。

术语“感染单位(iu)”、“感染性颗粒”或“复制单位”在参考病毒滴度使用时指感染性且有复制能力的重组AAV载体颗粒的数量，如通过感染中心测定(infectious centerassay)所测量的，也称为复制中心测定，如例如McLaughlin等(1988)J.Virol.,62:1963-1973中所述。

术语“转导单位(tu)”在参考病毒滴度使用时指导致功能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数量，如本文实施例中描述的功能性测定中所测量的，或例如在Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144:113-124；或Fisher等(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU测定)中描述的功能性测定中所测量的。

“反向末端重复”或“ITR”序列是在本领域得到充分理解的术语并且指方向相反的、存在于病毒基因组末端的相对短的序列。

“AAV反向末端重复(ITR)”序列，一个在本领域得到充分理解的术语，是存在于天然单链AAV基因组的两个末端的大约145个核苷酸的序列。ITR最外部的125个核苷酸可以以两种可选方向中的任一种存在，导致不同AAV基因组之间和单个AAV基因组两个末端之间的异质性。最外部的125个核苷酸也含有几个具有自互补性的较短区域(命名为A,A',B,B',C,C'和D区)，允许在ITR的这部分之中链内碱基配对的发生。

“末端解析序列”或“trs”是AAV ITR的D区中的序列，其在病毒DNA复制过程中被AAV rep蛋白切割。突变的末端解析序列难以被AAV rep蛋白切割。“AAV辅助功能”指允许AAV通过宿主细胞而被复制并包装的功能。AAV辅助功能可以以多种形式中的任何一种来提供，包括但不限于辅助病毒或帮助AAV复制和包装的辅助病毒基因。其他AAV辅助功能是本领域已知的，比如遗传毒性剂(genotoxic agent)。

“AAV辅助功能”指允许AAV通过宿主细胞而被复制并包装的功能。AAV辅助功能可以以多种形式中的任何一种来提供，包括但不限于辅助病毒或帮助AAV复制和包装的辅助病毒基因。其他AAV辅助功能是本领域已知的，比如遗传毒性剂。

用于AAV的“辅助病毒”指允许AAV(其为一种缺陷型细小病毒)通过宿主细胞而被复制和包装的病毒。已经鉴定出多种这样的辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒如牛痘病毒和杆状病毒。腺病毒涵盖多种不同的亚群，尽管C亚群的腺病毒5型(Ad5)是最常使用的。已知人、非人哺乳动物和鸟类来源的多种腺病毒并且可从保藏机构如ATCC获得。疱疹病毒科的病毒也可以从诸如ATCC的保藏机构获得，包括例如单纯疱疹病毒(HSV)，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)。从保藏机构获得的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒。

相对于参照多肽或核酸序列的“百分比(％)序列同一性”定义为在对齐序列并在必要时引入空位而实现了最大百分比序列同一性之后，并且不将任何保守取代考虑为具有序列同一性的部分的情况下，候选序列中与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。为了确定百分比氨基酸或核酸序列同一性的目的的对齐/比对可以以多种方式实现，其属于本领域的技术，例如，使用以公开方式可以获得的计算机软件程序，例如在Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编，1987),Supp.30,7.7.18节,表7.7.1中记载的，并且包括BLAST、BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。一种潜在的比对程序是ALIGN Plus(Scientific and EducationalSoftware,Pennsylvania)。本领域技术人员能够确定合适的参数用于测量比对，包括需要用来在比较的序列全长上实现最大对齐的算法。就本文而言，给定氨基酸序列A与、同或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其或者可以称为与、同或相对于给定氨基酸序列B包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是在程序对A和B的比对中通过序列比对程序计分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会被理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。就本文而言，给定核酸序列C与、同或相对于给定核酸序列D的％核酸序列同一性(其或者可以称为与、同或相对于给定核酸序列D包含特定％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算：100乘以分数W/Z，其中W是在程序对C和D的比对中通过序列比对程序计分为相同匹配的核苷酸的数目，而其中Z是D中核苷酸的总数。会被理解的是，当核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度时，C与D的％核酸序列同一性将不等于D与C的％核酸序列同一性。

“分离的”分子(例如，核酸或蛋白质)或细胞意指其已经得到鉴定并且与其天然环境中的组分分开和/或自其天然环境中的组分回收。

“有效量”是足以实现有益或期望的结果的量，包括临床结果(例如，缓解症状，实现临床终点等)。有效量可以以一次或多次施用。在疾病状态方面，有效量是足以缓解、稳定或延迟疾病发展的量。例如，有效量的rAAV颗粒表达期望量的异源核酸如治疗性多肽或治疗性核酸。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化的动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

如用于本文，“治疗/处理”是用于获得有益的或期望的临床结果的手段。就本发明而言，无论是可检测的或不可检测的，有益或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、疾病程度减低(diminishment of extent of disease)、稳定化(例如不恶化)的疾病状态、预防疾病蔓延(例如转移)、延迟或减缓疾病进展、缓解或减轻(palliation)疾病状态，以及缓和(remission)(无论是部分的或全部的)。“治疗/处理”还可以意味着与如若不接受治疗/处理的预期存活期相比延长存活期。

当参照基因或编码序列使用时，“N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(即GlcNAc-1-磷酸转移酶或GNPTAB)”指编码催化如下化学反应的酶的α和β亚基，所述化学反应涉及溶酶体酶N-acetyl-glucosaminyl-phospho-D-mannose和UMP从UDP-N-乙酰基-D-葡糖胺和溶酶体酶D-mannose(EC代码2.7.8.17)的形成。当参照多肽使用时，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(即GlcNAc-1-磷酸转移酶或GNPTAB)”指前述酶的α和β亚基(Kudo,M.等，J Biol Chem.2005,280(43):36141-9；Gelfman,CM等，Invest.Opthamol.Vis.Sci.2007,48(11):5221-5228)。完整的GlcNAc-1-磷酸转移酶酶复合物已知包括α₂、β₂和γ₂亚基，其中α和β亚基为催化活性所需。任何已知或预期催化由EC代码2.7.8.17所描述的反应和/或执行由GO条目GO:0003976所描述的分子功能的酶可以是本发明的GNPTAB。在一些实施方案中，所述GNPTAB是变体GNPTAB。在一些实施方案中，所述GNPTAB是截短的GNPTAB。在一些实施方案中，编码GNPTAB的核酸约为4.7kb。在一些实施方案中，编码GNPTAB的核酸少于约4.7kb。在一些实施方案中，所述变体(例如，截短)GNPTAB包含α和β亚基。在一些实施方案中，所述变体GNPTAB(例如，截短的GNPTAB)与天然GNPTAB至少约70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％相同。在一些实施方案中，所述变体GNPTAB(例如，截短的GNPTAB)保留了天然GNPTAB活性的至少约90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,或10％。人GNPTAB的实例由GenBank登录号NP_077288.2和NM_024312.4提供。人GNPTAB氨基酸序列的一个实例由SEQ ID NO:1提供。小鼠GNPTAB的实例由GenBank登录号NP_001004164提供。小鼠GNPTAB氨基酸序列的一个实例由SEQ ID NO:2提供。GNPTAB的额外的实例由GenBank登录号XP_001155334和XP_509312(黑猩猩(Pan troglodytes))、XP_002687680和NP_001179157(牛(Bos taurus))、XP_416329(鸡(Gallus gallus))、XP_532667(家犬(Canis familiaris))、XP_001497199(马(Equus caballus)),XP_001079967和XP_343195(褐家鼠(Rattus norviegicus))和NP_001038233(斑马鱼(Danio rerio))提供。

“粘脂贮积症II型”(术语MLII,ML-II和ML II型在本文可互换使用)和“粘脂贮积症III型”(术语MLIII,ML-III和ML III型在本文可互换使用)指由GNPTAB基因中的突变引起的一类疾病。两种疾病均为常染色体隐性病症。然而，ML III与MLII相比通常与引起GNPTAB功能更轻程度损失的突变相关。如此，MLII通常导致比MLIII更严重的疾病表型。MLII还称为I细胞病。对MLII的进一步描述可以参见OMIM条目#252500。MLIII也称为假Hurler多发性营养不良(pseudo-Hurler polydistrophy)。对MLIII的进一步描述可参见OMIM条目#252600。

“鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子”指源自鸡β-肌动蛋白基因的多核苷酸序列(例如，鸡(Gallus gallus)β激动蛋白，由GenBank Entrez Gene ID 396526表示)。如用于本文，“鸡β-肌动蛋白启动子”可以指含有巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的启动子和第一外显子和内含子以及兔β-球蛋白基因的剪接受体的启动子，如记载在Miyazaki,J.,等(1989)Gene 79(2):269-77中的序列。如用于本文，术语“CAG启动子”可以互换使用。如用于本文，术语“CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子”可以互换使用。

基于如下缺失研究选择了缩短的鸡β肌动蛋白启动子，该缺失研究显示可以缺失-106上游的序列而不显著影响启动子活性(Quitschke等，J.Biol.Chem.264:9539-9546,1989)。

在本文提到“约”某个值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括对“X”的描述。

如用于本文，冠词“一个”、“一种”和“所述”的单数形式包括复数指代物，除非另有提及。

应理解本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案、“由”方面和实施方案“组成”和/或“基本上由”方面和实施方案“组成”。

III.载体

在某些方面，本发明提供rAAV载体，例如，其适合用于本文所述的方法、rAAV颗粒和/或药物组合物中的任一种。例如，在一些实施方案中，将异源核酸(例如，编码功能性GNPTAB多肽的多核苷酸序列)通过本发明的rAAV载体递送至受试者。

本发明的某些方面涉及N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶α和β亚基(GNPTAB),例如，GNPTAB多肽或编码GNPTAB多肽的核酸。如本领域已知的，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(也称作N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶)酶包括两个α、两个β和两个γ亚基。α和β亚基由GNPTAB基因编码(也称作GNPTA、I-细胞病或ICD，或EG432486或mKIAA1208(在小鼠中))。GNPTAB基因的实例包括例如人GNPTAB(例如，如NCBI Gene ID No.79158所述)和小鼠GNPTAB(例如，如NCBI Gene ID No.432486所述)。

在一些实施方案中，所述GNPTAB多肽可以是人GNPTAB多肽。人GNPTAB多肽序列可以包括但不限于NCBI参考序列号NP_077288。在一些实施方案中，所述GNPTAB多肽包含SEQID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GNPTAB多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述GNPTAB是截短的GNPTAB。在一些实施方案中，编码GNPTAB的核酸约为4.7kb。在一些实施方案中，编码GNPTAB的核酸少于约4.7kb。在一些实施方案中，变体(例如，截短的)GNPTAB包含α和β亚基。在一些实施方案中，所述GNPTAB多肽是变体GNPTAB多肽(例如，截短的GNPTAB)，其保持野生型GNPTAB多肽的至少一部分活性(例如，野生型GNPTAB活性的至少约5％,10％,25％,50％,75％或100％中的任一种)。在一些实施方案中，变体GNPTAB多肽(例如，截短的GNPTAB)与野生型GNPTAB多肽相比具有更高的活性(例如，与野生型GNPTAB相比高至少约125％,150％,200％,300％或500％中任一项的活性)。

在一些实施方案中，所述异源核酸(例如，编码GNPTAB的核酸)与启动子可操作地连接。示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早起启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和CK6启动子、甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素响应启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSPs)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG启动子；Niwa等，Gene,1991,108(2):193-9)和伸长因子1-α启动子(EFl-α)启动子(Kim等，Gene,1990,91(2):217-23and Guo等，Gene Ther.,1996,3(9):802-10。所述启动子可以是组成型、诱导型或抑制型启动子。在一些实施方案中，所述启动子包括人β-葡糖醛酸酶启动子或巨细胞病毒(CMV)增强子连接于鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，所述启动子包括修饰型或截短的CBA启动子。在一些实施方案中，所述启动子包括缩短的CMV增强子。

在一些实施方案中，所述载体包含内含子。例如，在一些实施方案中，所述内含子是源自鸡β-肌动蛋白和兔β-球蛋白(globin)的嵌合型内含子。在一些实施方案中，所述内含子是小鼠微小病毒(MVM)内含子。

在一些实施方案中，所述载体包含聚腺苷酸化(polyA)序列。本领域已知聚腺苷酸化序列的多种实例，如牛生长激素(BGH)Poly(A)序列(参见,例如，登录号EF592533)、SV40聚腺苷酸化序列和HSV TK pA聚腺苷酸化序列。

不希望受限于任何理论，由于GNPTAB编码序列的较大尺寸，使rAAV载体的其他元件(例如，启动子、增强子、内含子、polyA序列等等)的大小最小化可能是有利的。在一些实施方案中，本文描述的任何启动子的缩短的变体可以用于rAAV载体中。用于生成启动子(例如，上文所列的启动子)的缩短变体的方法是本领域已知的。例如，感兴趣的启动子可以通过在启动子序列中引入一个或多个核苷酸的缺失和/或取代来突变，并且这样的变体启动子序列可以单独克隆至载体中，所述载体包括在各启动子序列调节下的报道构建体。这种系统可被用于鉴定保有指定长度的启动子缩短的变体(例如，产生的转录物的量)。在一些实施方案中，本发明的rAAV载体可以包括修饰的、截短的和/或缩短的CMV增强子/CBA启动子，例如，如本文所述。类似的方法可用于鉴定保有合适转录水平、mRNA稳定性和/或剪接的内含子的缩短的变体。在一些实施方案中，本发明的rAAV载体可以包括如本文所述的缩短的内含子。类似的方法可用于鉴定保有合适转录水平、mRNA稳定性和/或聚腺苷酸化的polyA序列的缩短的变体。在一些实施方案中，本发明的rAAV载体可以包括如本文所述的缩短的polyA序列。在一些实施方案中，所述GTNAP基因包含编码SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明涵盖重组病毒基因组用于将一个或多个编码治疗性多肽的核酸和/或用于包装进入rAAV病毒颗粒的核酸引入的用途。所述重组病毒基因组可以包括用于建立所述治疗性多肽和/或核酸表达的任何元件，例如启动子、本发明的ITR、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记、内含子、polyA信号和/或复制起点。

IV.病毒颗粒和产生病毒颗粒的方法

本发明的某些方面涉及rAAV颗粒，例如，含有本发明的rAAV载体的rAAV颗粒。在AAV颗粒中，将核酸封装在AAV颗粒中。AAV颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述核酸包含与感兴趣的编码序列(例如，GNPTAB编码序列)按照转录的方向可操作连接的元件，包括转录起始和中止序列在内的调控序列，由此形成表达盒。所述表达盒的5’和3’末端的侧翼至少有一个功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”意指ITR序列发挥旨在用于拯救、复制和包装AAV病毒粒子的功能。参见Davidson等，PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等，J.Virol.,2003,77(12):7034-40；和Pechan等，Gene Ther.,2009,16:10-16，将其每一篇通过引用全文并入本文。为了实施本发明的一些方面，重组载体包含至少全部对于封装必要的序列和用于rAAV感染的物理结构。用于本发明的载体的AAV ITR无须具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin,Hum.Gene Ther.,1994,5:793-801中所述)，并且可以通过插入、缺失或取代核苷酸而改变，或者所述AAV ITR可以源自几种AAV血清型中的任一种。目前已知超过40种AAV血清型，并且新的血清型和现存血清型的变体持续得到鉴定。参见Gao等，PNAS,2002,99(18):11854-6；Gao等，PNAS,2003,100(10):6081-6；和Bossis等，J.Virol.,2003,77(12):6799-810。任何AAV血清型的使用考虑在本发明的范围内。在一些实施方案中，rAAV载体是源自包括但不限于如下的AAV血清型的载体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVDJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV ITR等等。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV ITR等的ITR。

在一些实施方案中，rAAV颗粒包含选自如下的封装蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6(例如，野生型AAV6衣壳或变体AAV6衣壳如ShH10，如U.S.PG Pub.2012/0164106中所述)、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9(例如，野生型AAV9衣壳或修饰的AAV9衣壳，如U.S.PG Pub.2013/0323226中所述)、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、酪氨酸衣壳突变体、发夹结合的衣壳突变体、AAV2R471A衣壳、AAVAAV2/2-7m8衣壳、AAV DJ衣壳(例如，AAV-DJ/8衣壳、AAV-DJ/9衣壳或任何其他U.S.PG Pub.2012/0066783中所述衣壳)、AAV2N587A衣壳、AAV2E548A衣壳、AAV2N708A衣壳、AAV V708K衣壳、山羊AAV衣壳、AAV1/AAV2嵌合衣壳、牛AAV衣壳、小鼠AAV衣壳、rAAV2/HBoV1衣壳或美国专利号8,283,151或国际公开号WO/2003/042397中描述的AAV衣壳。在进一步的实施方案中，rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白。

将不同AAV血清型用于优化特定靶细胞的转导或用于靶向特定靶组织(例如，患病组织)内的特定细胞类型。rAAV颗粒可以包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，rAAV颗粒可以含有源自相同AAV血清型的一种或多种ITR和衣壳，或rAAV颗粒可含有源自不同于rAAV颗粒的衣壳的AAV血清型的一个或多个ITR。在某些实施方案中，rAAV颗粒含有AAV8衣壳和一个或多个(例如，2个)AAV2ITR。

AAV颗粒的产生

本领域已知多种方法用于rAAV载体的产生，包括转染、稳定细胞系生产和感染性杂交病毒生产系统，其包括腺病毒-AAV杂交株、疱疹病毒-AAV杂交株(Conway,JE等，(1997)J.Virology 71(11):8780-8789)和杆状病毒-AAV杂交株(Urabe,M.等，(2002)Human GeneTherapy 13(16):1935-1943；Kotin,R.(2011)Hum Mol Genet.20(R1):R2–R6)。用于产生rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物全部需要；1)合适的宿主细胞，2)合适的辅助病毒功能，3)AAV rep和cap基因以及基因产物；4)核酸(如治疗性核酸)，其侧翼为至少一个AAV ITR序列(例如，编码GNPTAB的AAV基因组)；和5)合适的培养基和培养基组分以支持rAAV生产。在一些实施方案中，合适的宿主细胞是灵长类宿主细胞。在一些实施方案中，合适的宿主细胞是源自人的细胞系如HeLa,A549,293或Perc.6细胞。在一些实施方案中，合适的辅助病毒功能由野生型或突变体腺病毒(如温度敏感型腺病毒)、疱疹病毒(HSV)、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供。在一些实施方案中，AAV rep和cap基因产物可以来自任何AAV血清型。概括而言，但非强制性的，AAV rep基因产物与rAAV载体基因组的ITR来自相同血清型，只要rep基因产物可以起到复制和包装rAAV基因组的作用。本领域已知的合适培养基可用于产生rAAV载体。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括改良型Eagle培养基(MEM)，Dulbecco氏改良型Eagle培养基(DMEM)，定制配制剂，如美国专利号6,566,118中描述的那些，和Sf-900II SFM培养基，如美国专利号6,723,551中所述，其全部内容通过引用整体并入本文，特别是关于用于生产重组AAV载体的定制培养基配制剂。在一些实施方案中，AAV辅助功能由腺病毒或HSV提供。在一些实施方案中，AAV辅助功能由杆状病毒提供，并且宿主细胞是昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf9)细胞)。

用于产生rAAV颗粒的一种方法是三重转染方法。简而言之，含有rep基因和衣壳基因的质粒以及辅助腺病毒质粒可以被转染(例如，使用磷酸钙法)进入细胞系(例如，HEK-293细胞)，并且可以对病毒进行收集并任选进行纯化。因此，在一些实施方案中，通过将编码rAAV载体的核酸、编码AAV rep和cap的核酸以及编码AAV辅助病毒功能的核酸三重转染到宿主细胞中来产生rAAV颗粒，其中将核酸转染到宿主细胞产生能够产生rAAV颗粒的宿主细胞。

在一些实施方案中，rAAV颗粒可以通过生产者细胞系方法产生(参见Martin等，(2013)Human Gene Therapy Methods 24:253-269；U.S.PG Pub.No.US2004/0224411；和Liu,X.L.等(1999)Gene Ther.6:293-299)。简而言之，可以用含有rep基因、衣壳基因和包含启动子-异源核酸序列(例如，GNPTAB)的载体基因组的质粒稳定转染细胞系(例如，HeLa，293，A549或Perc.6细胞系)。可筛选细胞系以选择用于rAAV产生的前导克隆(lead clone)，然后可将其扩增至生产生物反应器并用辅助病毒(例如，腺病毒或HSV)感染以启动rAAV产生。随后可以收获病毒，可以使腺病毒失活(例如，通过加热)和/或除去，并且可以纯化rAAV颗粒。因此，在一些实施方案中，rAAV颗粒由生产细胞系产生，所述生产细胞系包含编码rAAV载体的核酸、编码AAV rep和cap的核酸以及编码AAV辅助病毒功能的核酸中的一种或多种。如本文所述，与三重转染方法相比，生产细胞系方法对于产生具有过大基因组的rAAV颗粒可能是有利的。

在一些实施方案中，编码AAV rep和cap基因和/或rAAV基因组的核酸在生产细胞系中稳定维持。在一些实施方案中，编码AAV rep和cap基因和/或rAAV基因组的核酸在一个或多个质粒上被引入细胞系以产生生产细胞系。在一些实施方案中，将AAV rep，AAV cap和rAAV基因组在同一质粒上引入细胞中。在其他实施方案中，将AAV rep，AAV cap和rAAV基因组在不同质粒上引入细胞中。在一些实施方案中，用质粒稳定转染的细胞系保持质粒用于细胞系的多次传代(例如，细胞的5,10,20,30,40,50或超过50次传代)。例如，质粒可以随着细胞复制而复制，或者质粒可以整合到细胞基因组中。已经鉴定了使质粒能够在细胞(例如，人细胞)中自主复制的多种序列(参见，例如，Krysan,P.J.等(1989)Mol.Cell Biol.9:1026-1033)。在一些实施方案中，质粒可含有选择标记(例如，抗生素抗性标记)，其允许选择保持了质粒的细胞。通常用于哺乳动物细胞的选择标记包括但不限于杀稻瘟菌素，G418，潮霉素B，Zeocin，嘌呤霉素及其衍生物。将核酸引入细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于病毒转导，阳离子转染(例如，使用阳离子聚合物如DEAE-葡聚糖或阳离子脂质如Lipofectamine)，磷酸钙转染，显微注射，粒子轰击，电穿孔和纳米颗粒转染(更多细节参见例如，Kim,T.K.and Eberwine,J.H.(2010)Anal.Bioanal.Chem.397:3173-3178)。

在一些实施方案中，编码AAV rep和cap基因和/或rAAV基因组的核酸稳定整合到生产细胞系的基因组中。在一些实施方案中，编码AAV rep和cap基因和/或rAAV基因组的核酸在一个或多个质粒上被引入细胞系以产生生产细胞系。在一些实施方案中，将AAV rep，AAV cap和rAAV基因组在同一质粒上引入细胞中。在其他实施方案中，将AAV rep，AAV cap和rAAV基因组在不同质粒上引入细胞中。在一些实施方案中，质粒可含有选择标记(例如，抗生素抗性标记)，其允许选择保持了质粒的细胞。将核酸稳定整合到多种宿主细胞系中的方法是本领域已知的。例如，重复选择(例如，通过使用选择标记)可用于选择已整合了含有选择标记(和AAV cap和rep基因和/或rAAV基因组)的核酸的细胞。在其他实施方案中，核酸可以以位点特异性方式整合到细胞系中以产生生产细胞系。几种位点特异性重组系统是本领域已知的，如FLP/FRT(参见，例如，O'Gorman,S.等(1991)Science 251:1351-1355),Cre/loxP(参见，例如，Sauer,B.and Henderson,N.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5166-5170)和phi C31-att(参见，例如，Groth,A.C.等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97:5995-6000)。

在一些实施方案中，生产细胞系源自灵长类细胞系(例如，非人灵长类细胞系，如Vero或FRhL-2细胞系)。在一些实施方案中，细胞系来源自人细胞系。在一些实施方案中，生产细胞系源自HeLa，293，A549或PERC.6(Crucell)细胞。例如，在将编码AAV rep和cap基因和/或过大的rAAV基因组的核酸引入和/或稳定维持/整合到细胞系中以产生生产细胞系之前，细胞系是HeLa，293，A549或PERC.6(Crucell)细胞系或其衍生物。

在一些实施方案中，使生产细胞系适合在悬浮液中生长。如本领域已知的，锚定依赖性细胞通常不能在没有基质如微载体珠的情况下在悬浮液中生长。使细胞系适应在悬浮液中生长可以包括，例如，使用搅拌桨在旋转培养(spinner culture)中培养细胞系，使用缺少钙和镁离子的培养基以防止结块(和任选的消泡剂)，使用涂有渗硅化合物的培养容器，和在每次传代时选择培养物中的细胞(而不是在大块中或在容器的侧面上的)。有关进一步说明，参见ATCC常见问题文档(可在www.atcc.org/Global/FAQs/9/1/Adapting％20a％20monolayer％20cell％20line％20to％20suspension-40.aspx获取)和其中引用的参考文献。

在一些方面，提供了用于产生本文公开的任何rAAV颗粒的方法，包括(a)在产生rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含(i)一种或多种AAV包装基因，其中每个所述AAV包装基因编码AAV复制和/或封装蛋白；(ii)rAAV前载体(pro-vector)，其包含编码本文所述的异源核酸的核酸，其侧翼为至少一个AAV ITR，和(iii)AAV辅助功能；(b)回收宿主细胞产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述至少一个AAV ITR选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAVrh8，AAVrh8R，AAV9，AAV10，AAVrh10，AAV11，AAV12，AAV2R471A，AAV DJ，山羊AAV，牛AAV或小鼠AAV血清型ITR等。例如，在一些实施方案中，AAV血清型是AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAVrh8，AAVrh8R，AAV9，AAV10或AAVrh10。在某些实施方案中，AAV中的核酸包含AAV2ITR。在一些实施方案中，所述封装蛋白选自AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAVrh8,AAVrh8R,AAV9,AAV10,AAVrh10,AAV11,AAV12,AAV2R471A,AAV2/2-7m8,AAV DJ,AAV2N587A,AAV2E548A,AAV2N708A,AAV V708K,山羊AAV,AAV1/AAV2嵌合体,牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳蛋白或其突变体。在一些实施方案中，封装蛋白是AAV8衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8衣壳和包含AAV2ITR和编码治疗性转基因/核酸的核酸(例如，编码GNPTAB的核酸)的重组基因组。

本发明的合适的rAAV生产培养基可以补充有血清或血清衍生的重组蛋白，其水平为0.5％-20％(v/v或w/v)。或者，如本领域已知的，rAAV载体可以在无血清条件下产生，其也可以称为不含动物衍生产物的培养基。本领域普通技术人员可以理解，设计用于支持rAAV载体生产的商业或定制培养基还可以补充有本领域已知的一种或多种细胞培养组分，包括但不限于葡萄糖，维生素，氨基酸和/或生长因子，以提高生产培养物中rAAV的滴度。

rAAV生产培养物可以在适合于所用特定宿主细胞的多种条件下(在很宽的温度范围内，持续不同的时间长度等)生长。如本领域所知，rAAV生产培养物包括附着依赖性培养物，其可以在合适的附着依赖性容器中培养，例如滚瓶(roller bottle)，中空纤维过滤器，微载体和填充床或流化床生物反应器。rAAV载体生产培养物还可以包括悬浮适应性宿主细胞如HeLa，293和SF-9细胞，其可以以多种方式培养，包括例如旋转瓶(spinner flask)，搅拌槽生物反应器和一次性系统如Wave袋系统。

本发明的rAAV载体颗粒可以通过裂解生产培养物的宿主细胞或通过从生产培养物中收获用过的培养基从rAAV生产培养物中收获，条件是细胞在本领域已知的条件下培养以引起rAAV颗粒从完整细胞释放进入培养基，如美国专利号6,566,118中更全面地描述的。裂解细胞的合适方法也是本领域已知的，包括例如多次冻/融循环，超声处理，微流化和用化学品如洗涤剂和/或蛋白酶处理。

在进一步的实施方案中，纯化rAAV颗粒。如本文所用的术语“纯化的”包括rAAV颗粒的制备物，其缺乏至少一些其他组分，所述其他组分可能还存在于rAAV颗粒天然存在或rAAV颗粒最初由其制备之处。因此，例如，可以使用纯化技术制备分离的rAAV颗粒，以从来源混合物(例如培养物裂解物或生产培养物上清液)中富集它。富集可以以多种方式测量，例如，通过溶液中存在的DNA酶-抗性颗粒(DRP)或基因组拷贝(gc)的比例，或通过感染性，或者其可以参照来源混合物中存在的第二种潜在干扰性物质如污染物来测量，所述污染物包括生产培养无污染物或过程中污染物，包括辅助病毒、培养基组分等。

在一些实施方案中，澄清rAAV生产培养物收获物以除去宿主细胞碎片。在一些实施方案中，通过一系列深度过滤器过滤来澄清生产培养物收获物，包括例如DOHC级Millipore Millistak+HC Pod过滤器，A1HC级Millipore Millistak+HC Pod过滤器和0.2μm过滤器Opticap XL1O Millipore Express SHC亲水性膜过滤器。澄清也可以通过本领域已知的各种其他标准技术实现，例如离心或通过本领域已知的0.2μm或更大孔径的任何醋酸纤维素过滤器进行过滤。

在一些实施方案中，用Benzonase进一步处理rAAV生产培养物收获物，以消化生产培养物中存在的任何高分子量DNA。在一些实施方案中，Benzonase消化在本领域已知的标准条件下进行，包括例如在环境温度至37℃范围内的温度下，最终浓度为1-2.5单位/ml的Benzonase持续一段30分钟至几个小时的时间。

可以使用一个或多个下述纯化步骤分离或纯化rAAV颗粒：平衡离心；流通式阴离子交换过滤；用于浓缩rAAV颗粒的切向流过滤(TFF)；通过磷灰石层析捕获rAAV；辅助病毒的热灭活；通过疏水相互作用层析捕获rAAV；通过尺寸排阻层析(SEC)进行缓冲液交换；纳米过滤；和通过阴离子交换层析、阳离子交换层析或亲和层析捕获rAAV。这些步骤可以单独使用，以各种组合使用，或以不同顺序使用。在一些实施方案中，该方法包括按照如下所的顺序的所有步骤。例如，纯化rAAV颗粒的方法可见于例如Xiao等，(1998)Journal ofVirology 72:2224-2232；美国专利号6,989,264和8,137,948；和WO 2010/148143。

V.治疗方法

本公开的某些方面涉及在患有粘脂贮积症II型或粘脂贮积症III型的哺乳动物中治疗粘脂贮积症II型和/或粘脂贮积症III型或增加身体尺寸，增加骨矿物质含量或增加骨矿物质密度的方法。方法部分基于本文所述的发现，即在疾病的小鼠模型中，AAV介导的GNPTAB表达可以缓解MLII的症状，如骨生长受损。如上所述，两种疾病都是由GNPTAB基因的功能丧失突变引起的，该基因编码GlcNAc-1-磷酸转移酶的催化性α和β亚基。

已知MLII是由GNPTAB中的突变引起的常染色体隐性遗传病。需要GNPTAB活性将甘露糖-6-磷酸添加到蛋白质中，从而标记它们以供向溶酶体运输。在没有GNPTAB活性的情况下，溶酶体蛋白(例如，溶酶体水解酶)则在细胞外分泌。如此一来，通常在溶酶体中分解的物质，如糖胺聚糖、脂质和寡糖，在细胞中积累，导致存在大的内含物。由于这些内含物细胞(“I细胞”)的存在(其可通过显微镜识别)，MLII也被称为I细胞疾病。MLII的症状通常在出生后不久出现，可能包括骨骼异常，身材矮小，肌张力弱，缺乏肌张力(肌张力减退(hypotonia))，疝气(例如，腹部突出，脐疝)，髋关节脱位和关节畸形，心脏扩大，二尖瓣增厚和功能不全，气道进行性粘膜增厚，气粗和/或有噪音的呼吸，呼吸道常见感染，便秘，腹泻，大运动和精细运动技能的发展延迟，听力损失和发育迟缓特别是语言和运动技能，认知缺陷。这些症状对于MLII患者而言是另其虚弱的，这些患者通常不能独立行走且不能存活超过儿童时期。

与MLII一样，MLIII是本领域已知的由GNPTAB中的突变引起的常染色体隐性遗传病。然而，与MLII相比，MLIII通常由GNPTAB中较弱的功能丧失突变引起，并因此以较轻的疾病表型为特征。MLIII症状可能在3-5岁之前不完全明显，并且严重程度差异很大，一些患者活到60岁以上，而其他患者无法活过儿童时期。MLIII症状通常包括骨骼异常，身材矮小，主动脉瓣疾病，角膜混浊，轻度器官增大，活动能力丧失和关节异常。MLIII也被称为假Hurler多发性营养不良(pseudo-Hurler polydistrophy)。对于在MLII和MLIII患者中发现的特定突变和更详细描述，参见，例如，Paik,K.H.,等(2005)Hum.Mutat.26(4):308-14。

MLII和MLIII的各种诊断测试在本领域中是已知的。在一些实施方案中，MLII和/或MLIII可以通过测量血清样品或其他患者样品中的一种或多种溶酶体酶的活性来诊断(例如，皮肤样品或培养的成纤维细胞)。MLII患者血清中某些溶酶体酶的活性可能比正常患者高5至20倍。类似地，在MLIII中，这些酶的血清活性可升高高达10倍。这些酶可包括但不限于β-D-己糖胺酶(EC代码3.2.1.52)，β-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC代码3.2.1.31)，β-D-半乳糖苷酶(EC代码3.2.1.23)，α-L-岩藻糖苷酶(EC代码3.2.1.51)和α-D-甘露糖苷酶(EC代码3.2.1.24)。相反，在培养的成纤维细胞中这些活性可能不足。在一些实施方案中，可以测量N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶活性以诊断MLII或MLIII。在一些实施方案中，与来自正常患者样品的活性相比，其样品显示小于1％的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶活性的患者可以被诊断患有MLII。在一些实施方案中，与来自正常患者样品的活性相比，其样品显示在1％-10％之间的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶活性的患者可以被诊断为患有MLII。

在一些实施方案中，MLII和/或MLIII可以通过测序GNPTAB基因座(例如，编码序列、启动子/内含子序列或任何其他控制序列)的突变来诊断。MLII和MLIII也可以通过增加的尿多糖和/或尿糖胺聚糖来表征，但这些症状可能不是MLII和MLIII特异性的。在一些实施方案中，MLII和/或MLIII可以通过检查绒毛膜样品在产前诊断，例如，滋养层活组织检查(参见，例如，Poenaru,L.,等(1984)Am.J.Hum.Genet.36(6):1379-85)。如上所述，在MLII中，还可以通过显微镜鉴定来自患者样品(例如，成纤维细胞)的I细胞。

在一些实施方案中，可以测试对MLII和/或MLIII的治疗(例如，本公开的基因治疗载体)的治疗功效。例如，在一些实施方案中，MLII和/或MLIII的治疗可能导致增加的身高增长、骨矿物质含量、骨矿物质密度，或者可能导致如本文所述的MLII和/或MLIII的一种或多种症状的改善。可通过本文所述的若干标准监测rAAV施用的有效性。例如，在使用本发明的方法在受试者中治疗之后，可以通过一种或多种临床参数，包括本文描述的那些，评估受试者的例如疾病状态的一种或多种体征或症状的改善和/或稳定和/或进展的延迟。这样的测试的实例在本领域中是已知的，并且包括客观的以及主观的(例如，受试者报告的)测量结果。

在一些实施方案中，可以测量GNPTAB的表达以监测治疗功效。测量GNPTAB表达可以指测量GNPTAB mRNA和/或蛋白质表达。用于测量mRNA和/或蛋白质表达的各种方法是本领域已知的，包括但不限于qPCR、Northern印迹、RNA-seq、半定量PCR、Western印迹、质谱、ELISA等。

在一些实施方案中，一种或多种溶酶体酶的活性，包括但不限于β-D-己糖胺酶(EC代码3.2.1.52)，β-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC代码3.2.1.31)，β-D-半乳糖苷酶(EC代码3.2.1.23)，α-L-岩藻糖苷酶(EC代码3.2.1.51)和α-D-甘露糖苷酶(EC代码3.2.1.24)，可在患者样品(例如，血清样品)中测量以监测治疗效果。血清中溶酶体酶活性的降低可表明功效。

在一些实施方案中，关节或肢体功能的改善可能表明功效。在一些实施方案中，语言的改善可能表明功效。在一些实施方案中，运动功能的改善可能表明功效。在一些实施方案中，增加的生长速率(例如，身高增长的增加)可以表明功效。在一些实施方案中，如本文实施例中所述，可以评估骨矿物质密度、骨矿物质含量和/或生长(例如，身高)以监测治疗功效。用于监测身高的方法是本领域技术人员公知的。用于监测骨矿物质密度和骨矿物质含量的测试(例如，骨密度测定试验)也是本领域技术人员公知的(例如，如本文所述)并且可以包括但不限于双能X射线吸收测定(DEXA)扫描，外围双能X射线吸收测定(P-DEXA)扫描，双光子吸收测定(DPA)和计算机断层扫描(CT)扫描。

在一些实施方案中，可以在动物模型中测试对MLII和/或MLIII的治疗(例如，本公开的基因治疗载体)。MLII和MLIII的动物模型在本领域中是已知的。在一些实施方案中，可以在小鼠模型中测试对MLII和/或MLIII的治疗，如本申请实施例中描述的遗传修饰的小鼠模型。在一些实施方案中，可以在MLII的猫科动物模型中测试对MLII的治疗(进一步的描述参见Mazrier,H.,等(2003)J.Hered.94(5):363-73或Bosshard,N.U.,等(1996)Vet.Pathol.33(1):1-13)。

特定rAAV载体和组合物的选择取决于许多不同因素，包括但不限于单个人的病史以及要治疗的病症和个体的特征。对这些特征的评估和适当治疗方案的设计最终是处方医师的责任。

在一些方面，本发明提供通过施用有效量的本公开的rAAV颗粒来治疗MLII和/或MLIII的方法。rAAV可以施用于感兴趣的特定组织，或者可以全身施用。在一些实施方案中，可以肠胃外施用有效量的rAAV。肠胃外施用途径可包括但不限于静脉内，腹膜内，骨内，动脉内，脑内，肌肉内，鞘内，皮下，脑室内，肝内等。在一些实施方案中，可以通过一种施用途径施用有效量的rAAV。在一些实施方案中，可以通过超过一种施用途径的组合施用有效量的rAAV。在一些实施方案中，将有效量的rAAV施用于一个位置。在其他实施方案中，可以将有效量的rAAV施用于超过一个位置。

取决于治疗目的，施用有效量的rAAV(在一些实施方案中为颗粒形式)。例如，在低百分比的转导可以实现期望的治疗效果的情况下，治疗的目的通常是满足或超过该转导水平。在一些情况下，这种转导水平可以通过仅转导所需组织类型的约1至5％的靶细胞来实现，在一些实施方案中至少约20％的所需组织类型的细胞，在一些实施方案中至少约50％，在一些实施方案中至少约80％，在一些实施方案中至少约95％，在一些实施方案中至少约99％的所需组织类型的细胞。rAAV组合物可以通过一次或多次施用来施用，或者在相同的过程中施用，或者间隔数天，数周，数月或数年。可以使用本文所述的任何给药途径中的一种或多种。在一些实施方案中，可以使用多种载体来治疗人。

鉴定由AAV病毒颗粒转导的细胞的方法是本领域已知的；例如，免疫组织化学或使用标记如增强的绿色荧光蛋白可用于检测病毒颗粒的转导；例如，包含具有一个或多个氨基酸取代的rAAV衣壳的病毒颗粒。

在一些实施方案中，将有效量的rAAV颗粒同时或依次施用于超过一个位置。在其他实施方案中，将有效量的rAAV颗粒施用于单个位置超过一次(例如，重复)。在一些实施方案中，rAAV病毒颗粒的多次注射之间不超过1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，9小时，12小时或24小时。

取决于治疗的目的，施用有效量的rAAV(在一些实施方案中以颗粒的形式)。例如，在低百分比的转导可以实现期望的治疗效果的情况下，治疗的目的通常是满足或超过该转导水平。在一些情况下，这种转导水平可以通过仅转导所需组织类型的约1至5％的靶细胞来实现，在一些实施方案中至少约20％的所需组织类型的细胞，在一些实施方案中至少约50％，在一些实施方案中至少约80％，在一些实施方案中至少约95％，在一些实施方案中至少约99％的所需组织类型的细胞。rAAV组合物可以通过一次或多次施用来施用，或者在相同的过程中施用，或者间隔数天，数周，数月或数年。可以使用本文所述的任何给药途径中的一种或多种。在一些实施方案中，可以使用多种载体来治疗哺乳动物(例如，人)。

在一些实施方案中，本发明的rAAV组合物可用于向人施用。在一些实施方案中，本发明的rAAV组合物可用于儿科施用。不希望受限于理论，因为MLII和MLIII的许多症状是发育性的(例如，生长、肢体和关节缺陷；语言和运动延迟)，尽可能在生命早期治疗MLII和/或MLIII可能特别有利。在一些实施方案中，将有效量的rAAV(在一些实施方案中以颗粒的形式)施用于患者，该患者不到一个月，不到两个月，不到三个月，不到四个月，不到五个月，不到六个月，不到七个月，不到八个月，不到九个月，不到十个月，不到十一个月，不到一年，不到13个月，不到14个月，不到15个月，不到16个月，不到17个月，不到18个月，不到19个月，不到20个月，不到21个月，不到22个月，不到两岁，或不到三岁大。

在一些实施方案中，本发明的rAAV组合物可用于向年轻的成年人施用。在一些实施方案中，将有效量的rAAV(在一些实施方案中以颗粒的形式)施用于患者，所述患者不到12岁大，不到13岁大，不到14岁大，不到15岁大，不到16岁大，不到17岁大，不到18岁大，不到19岁大，不到20岁大，不到21岁大，不到22岁大，不到23岁大，不到24岁大或不到25岁大。

VI.试剂盒或制品

如本文所述的rAAV载体，颗粒，和/或药物组合物可包含在试剂盒或制品中，例如，设计用于本文所述的本发明方法之一。

通常，该系统包括套管、一个或多个注射器(例如，1、2、3、4或更多个)，以及适合在本发明的方法中使用的一种或多种流体(例如，1、2、3、4或更多种)。

注射器可以是任何合适的注射器，只要它能够连接到套管以输送流体。在一些实施方案中，该系统具有一个注射器。在一些实施方案中，该系统有两个注射器。在一些实施方案中，该系统具有三个注射器。在一些实施方案中，该系统具有四个或更多个注射器。适用于本发明方法的流体包括本文所述的那些，例如，一种或多种流体，每种流体包含有效量的一种或多种如本文所述的载体，和一种或多种包含一种或多种治疗剂的流体。

在一些实施方案中，该试剂盒包含单一流体(例如，包含有效量的载体的药学上可接受的流体)。在一些实施方案中，该试剂盒包含2种流体。在一些实施方案中，该试剂盒包含3种流体。在一些实施方案中，该试剂盒包含4种或更多种流体。流体可以包括稀释剂，缓冲液，赋形剂，或本领域已知的或适于递送，稀释，稳定，缓冲或以其他方式运输本公开的rAAV载体组合物的任何其他液体。在一些实施方案中，该试剂盒包含一种或多种缓冲液，例如，含水pH缓冲溶液。缓冲液的实例可包括但不限于磷酸盐，柠檬酸盐，Tris，HEPES和其他有机酸缓冲液。

在一些实施方案中，该试剂盒包含容器。合适的容器可以包括，例如，管型瓶、袋、注射器和瓶。所述容器可以由像玻璃、金属或塑料等材料中的一种或多种制成。在一些实施方案中，将所述容器用于容纳本发明的rAAV组合物。在一些实施方案中，所述容器也可容纳流体和/或其他治疗剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含与本发明的rAAV组合物一起的另一种治疗剂。在一些实施方案中，所述rAAV组合物和所述另一种治疗剂可以被混合。在一些实施方案中，所述rAAV组合物和所述另一种治疗剂可以保持分开。在一些实施方案中，所述rAAV组合物和所述另一种治疗剂可以在相同容器中。在一些实施方案中，所述rAAV组合物和所述另一种治疗剂可以在不同容器中。在一些实施方案中，所述rAAV组合物和所述另一种治疗剂可以同时施用。在一些实施方案中，所述rAAV组合物和所述另一种治疗剂可以在同一天施用。在一些实施方案中，所述rAAV组合物可以在所述另一种治疗剂的施用的一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、两周、三周、四周、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月之内施用。

在一些实施方案中，该试剂盒包含在AAV施用前瞬时抑制免疫系统的治疗剂。在一些实施方案中，在注射病毒之前和之后不久对患者进行短暂免疫抑制以抑制T细胞对AAV颗粒的应答(例如，见Ferreira等，Hum.Gene Ther.25:180-188,2014)。在一些实施方案中，该试剂盒进一步提供环孢菌素，霉酚酸酯，和/或甲基强的松龙。

本发明的rAAV颗粒和/或组合物可以进一步包装到包括使用说明的试剂盒中。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于递送(例如，本文所述的任何类型的胃肠外施用)所述rAAV颗粒的组合物的装置。在一些实施方案中，所述使用说明包括根据本发明方法之一的说明。在一些实施方案中，所述说明印刷在与容器一起提供(贴于其上)的标签上。在一些实施方案中，使用说明包括给哺乳动物(例如，人)施用有效量的rAAV颗粒的说明，例如用于治疗粘脂贮积症II型(ML II)和/或粘脂贮积症III型(ML III)，增加身体尺寸，增加骨矿物质含量，和/或增加骨矿物质密度。

VII.动物模型

本发明提供了粘脂贮积症II的动物模型。GNPTAB突变小鼠可以通过使用标准方法将胚胎干(ES)细胞克隆显微注射到宿主胚泡中来产生。简而言之，可以通过与含有报告基因或选择标记基因的替代载体进行同源重组来进行小鼠GNPTAB基因座的靶向破坏(例如，从外显子12到外显子20被缺失)。通过剪尾DNA中的聚合酶链反应分析对所有后代进行基因分型。本研究中使用的所有小鼠均为野生型(+/+)小鼠或杂合的(+/-)或纯合的(-/-)。在一些实施方案中，GNPTAB基因的至少一个等位基因包含位于外显子12和外显子20之间缺失。在一些实施方案中，GNPTAB基因的至少一个等位基因包含跨越外显子12和外显子20的缺失。在一些实施方案中，缺失包含外显子12、13、14、15、16、17、18、19或20中一个或多个的缺失。在一些实施方案中，GNPTAB基因的一部分被编码报道分子和/或选择标记的基因取代。在一些实施方案中，选择标记赋予对新霉素的抗性。在一些实施方案中，动物是哺乳动物(例如，啮齿动物，兔，猫，狗，猪，猴)。在一些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物(例如，小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠)。在一些实施方案中，该动物具有免疫活性或是免疫缺陷的。在一些实施方案中，动物模型包括转基因动物。ML II的其他小鼠模型由Gelfman等，(Invest.Optham.Visual Sci.2007,48:5221-5228)和Paton,L.等，(J Biol Chem.2014,289(39):26709-21)提供。

在一些方面，本发明提供评估治疗粘液贮积症II(ML II)的药剂的方法，包括将所述药剂施用给如本文所述的动物模型，其中ML II的一种或多种症状的缓解表明该药剂可以提供ML II的有益治疗。在一些实施方案中，ML II的症状是体重下降，骨密度降低，骨矿物质含量降低，骨骼缺陷，认知缺陷，大运动和精细运动技能发展延迟，听力丧失，肌张力不足，突出的腹部，脐疝，气道的进行性粘膜增厚，频繁的呼吸道感染，二尖瓣增厚和关闭不全，便秘和/或腹泻。在一些实施方案中，该试剂是小分子，多肽，抗体，核酸或重组病毒颗粒。

实施例

通过参考以下实施例将更全面地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且在其启示下本领域技术人员将被提示对其进行各种修改或改变，并且这些修改或改变包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。

实施例1：GNPTAB敲除小鼠的产生和表征

粘脂贮积症II型(ML II型或ML-II，又称I细胞病；OMIM条目#252500)是由N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)缺乏引起的常染色体隐性溶酶体贮积症。在成纤维细胞的细胞质中存在多个包涵体，缺乏粘多糖尿症(mucopolysacchariduria)，血清中溶酶体酶活性增加和GlcNAc-磷酸转移酶活性降低是该疾病的标志。为了研究ML II型的病理学，开发并表征了GNPTAB敲除(KO)小鼠。

方法

AAV2/8-GNPTAB构建体的生成

通过Genescript(Piscataway，NJ，USA)扩增了小鼠GNPTAB的编码序列并进行了密码子优化以在小鼠中表达。由于GNPTAB cDNA的大尺寸和AAV的有限容量，该cDNA不适合任何可用的载体。因此，设计了一种新的表达盒，其含有缩短形式的CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子，以及非常小的内含子。通过体外瞬时感染HEK293细胞然后进行定量RT-PCR确认了全长GNPTAB mRNA的表达。纯化了该AAV2/8-GNPTAB，在-70℃下储存，并以2.5x10¹²个DNase抗性颗粒/mL的浓度使用。将缩短的增强子和启动子序列用于这些研究。

动物

通过使用标准方法将胚胎干(ES)细胞克隆显微注射到宿主胚泡中来产生GNPTAB突变小鼠。简而言之，通过与含有新霉素抗性基因的替代载体的同源重组进行小鼠GNPTAB基因座的靶向破坏(从外显子12到外显子20被缺失)。本研究中使用的小鼠具有混合遗传背景(129/Sv和C57BL/6)。通过剪尾DNA中的聚合酶链反应分析对所有后代进行基因分型。在该研究中使用的所有小鼠是被鉴定为野生型(+/+)小鼠或杂合(+/-)或纯合(-/-)的雄性。

在12小时光暗循环下，将小鼠以每笼2-5只的组饲养在群落室中。可随意获得啮齿动物饮食(Harlan Teklad#8604,Madison,WI,USA)和水。按照实验动物护理和使用指南(National Academy Press,Washington DC,1996)中描述的指导养护动物。

载体注射

对6周龄的GNPTAB KO小鼠进行PBS或AAV-GNPTAB的单次双边i.v.注射。注射PBS的一组野生型或杂合小鼠作为对照组。注射AAV-GNPTAB的每只小鼠接受3x10¹¹个载体颗粒。为了减少或消除免疫应答，根据Halbert el al.,(1998)J.Virol.72:9795-9805单独注射抗CD40配体抗体(MR1)。

生长学

通过使用电子数字卡尺测量总体重(g)和体长(鼻-肛距离，mm)每周检查所有小鼠。

组织学

使10月龄的野生型和GNPTAB^-/-小鼠镇静并用PBS通过心脏灌注。灌注后，取出股骨，用4％多聚甲醛(PFA)固定，用0.5M EDTA脱钙，并石蜡包埋。用苏木精-伊红染色股骨切片(4μM)。Aperio ScanScope AT(v101.0)用于在4℃下扫描载玻片和分析。将组织包埋并切割用于TEM或苏木精和伊红(H&E)。

超微结构分析

将野生型和KO小鼠断头，取出唾液腺并通过在4℃下浸入2.5％戊二醛的PBS溶液中过夜固定。将唾液腺脱水，然后在PBS缓冲液中再洗涤30分钟，然后在室温下用1％四氧化锇后固定(post-fixation)1小时。将样本通过梯度酒精系列脱水并包埋在Epon 812中。以2.5μM(Leica ultracut UCT)切割半薄系列切片，用甲苯胺蓝染色并在光学显微镜下观察。用Mirgagni显微镜(FEI)进行透射电子显微镜观察。

溶酶体酶测定

取血并将样品离心15分钟(8000x g)并将血浆储存在-70℃。在韩国三星医疗中心的化学病理学部门测量血浆溶酶体酶活性。在ML II中，无法测量特异性GlcNAc-磷酸转移酶活性。因此，基于升高的血浆溶酶体酶进行诊断。

DEXA分析

用pDEXASaber X射线骨密度计在麻醉的小鼠中测量骨矿物质密度(BMD)，骨矿物质含量(BMC)和瘦肉量(lean mass)。施用麻醉后，记录每只小鼠的重量，然后将小鼠置于DEXA扫描仪中。对于数据分析，定义了包含整个小鼠体的区域。

实时PCR

使用ABI PRISM 7900HT系统和TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行实时聚合酶链反应以定量GNPTAB的mRNA水平。mRNA水平相对于GAPDH水平表示。2-^ΔΔCT方法用于使用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。

统计学分析

GraphPad Prism Version 5用于统计分析和绘制图形和表格。差异的显著性由未配对的Student’s t检验和单因素ANOVA检验确定。除非另有说明，否则所有数据均以平均值±SEM表示。

结果

使用基因捕获策略来产生GNPTAB KO小鼠。如图1A所示，使用以含有外显子12和20之间的新霉素抗性基因的替换载体进行的同源重组来产生小鼠。如图1B所示，通过Southern印迹分析证实ES克隆的GNPTAB基因中存在基因捕获。

对野生型、杂合和纯合动物进行全面的表型分析。KO小鼠可以通过它们的小尺寸在视觉上区别于野生型(WT)同窝小鼠。在KO小鼠中平均体重(图2A)和长度(图2B)显著降低。与它们的小尺寸一致，纯合小鼠表现出粗糙的面部形状(图2C)。.

如图3A所示，在正常软骨中，清楚的腔隙空间包围软骨细胞。细胞质含有单个清晰的空泡。在KO小鼠中，股骨软骨细胞显著肥大并完全填充其扩大的空隙(图3B)。肥大软骨细胞的细胞质因含有很少量细颗粒两亲物质的大量微泡而扩张。软骨细胞的固定相关收缩较少，其填补了扩大的空隙。这与野生型软骨细胞形成对比，野生型软骨细胞含有单个大而清晰的空泡，仅有部分填充的空隙。

当通过光学显微镜检查时，由粘液和浆液型分泌细胞组成的外分泌唾液腺的腺泡在KO小鼠中表现出广泛的空泡化(Gelfman等，2007,Invest.Optham.Visual Sci.48:5221-5228)。为了深入了解潜在的病理学，通过电子显微镜(EM)分析颌下腺唾液腺。

在野生型小鼠中容易观察到粘液和浆液型分泌细胞二者(图4A-C)。相比之下，KO小鼠的颌下唾液腺的总体结构被严重破坏，以至于它极大地妨碍了EM切片中浆液细胞的鉴定(图4D-F)。粘液型分泌细胞填充有包含异质材料的大膜结合空泡(图4E、F)。大空泡充满未降解的细胞质材料，其积聚在KO粘液细胞中并被单个膜包围。这些观察结果表明它们可能代表通过自噬区室与溶酶体融合形成的自体溶酶体。

ML-II患者血清中的溶酶体酶水平大大升高，因为无法合成甘露糖-6-磷酸识别标记，这对于将这些酶正确靶向溶酶体至关重要。这种运输缺陷导致酶过度分泌到血液中。图5A-5D显示与野生型小鼠相比，KO小鼠表现出大大增加的溶酶体酶水平，如N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(图5A)，β-己糖胺酶A(图5B)，β-半乳糖苷酶(图5C)，和β-葡糖醛酸糖苷酶(图5D)。如果GlcNAc-1-磷酸转移酶活性在纯合小鼠中有缺陷，则可以预期这种表型，这与人类观察结果一致。

总之，这些实验证明，与野生型小鼠相比，GNPTAB KO小鼠显示出明显的表型差异，特别是在生长，唾液腺形态和溶酶体酶水平方面。这些结果表明GNPTAB KO小鼠代表了在其中研究ML-II的治疗性处理的模型系统。

实施例2：在GNPTAB KO小鼠中评估AAV介导的GNPTAB施用

因为患有ML-II的患者显示出生长迟缓，所以该研究的主要目标是评估可以促进ML-II模型中的生长的AAV介导的GNPTAB施用的功效。因此，与注射AAV-GNPTAB的GNPTAB KO小鼠相比，分析了野生型，GNPTAB杂合和GNPTAB KO小鼠的表型。

如图6A和6B所示，所有分析评估在注射后两个时期进行：第一次开始于注射后16周(12周龄)，第二次开始于注射后32周(38周龄)。注射后6周加入辅助分析。

构建质粒，其含有表达由CMV增强子/CBA启动子和BGH polyA信号调节的小鼠GNPTAB cDNA的表达盒(图7A)。如本文所述，全长GNPTAB在缩短的CMV增强/CBA启动子的控制下。来自注射AAV2/8-GNPTAB的GNPTAB KO小鼠的肝脏的定量实时PCR分析表明AAV-GNPTAB的特异性和高度表达。如所预期的，来自对照同窝小鼠的样品中不存在任何AAV-GNPTAB mRNA(图7B)。

作为确定AAV介导的基因转移是否以生理学相关方式影响代谢的初始测试，在注射后监测体重增加达32周。如图8A所示，在KO小鼠中没有观察到AAV-GNPTAB处理的效果。图8B显示在对照和AAV-GNPTAB处理的KO小鼠之间在增加的体重方面没有观察到差异。

接下来，评估了减弱KO小鼠的侏儒症表型的有效性。在注射了AAV-GNPTAB的KO小鼠中治疗6周后注意到侏儒症的改善，显示身体大小增加(图9A，9B和下表1)。

表1.身高变化

数值表示为平均值±SEM.

接下来，测量骨矿物质密度(BMD)，骨矿物质含量(BMC)和身体组成。DEXA是一种基于X射线的成像技术，用于测定骨矿物质和身体组成(按照体脂肪量)。AAV-GNPTAB转移在注射了AAV的KO小鼠中诱导了BMC和BMD的相对增加。图10A-10C显示在注射前的原始BMD数据(图10A)以及比较注射前和注射后的BMD的相对比率(图10B，10C)。这些数据也在下表2中提供。这些结果证明了基因转移对骨矿物质密度的显著影响。

表2.骨矿物质密度(BMD)变化

数值表示为平均值±SEM.

类似地，原始骨矿物质含量(BMC)数据显示出强烈的基因治疗效果(图11A)。比率数据(图11B，11C)也接近骨生长的显著效果。这些数据也在下表3中提供。

表3.骨矿物质含量(BMC)变化

数值表示为平均值±SEM.

接下来，使用DEXA扫描仪分析身体瘦肉含量，发现在KO小鼠中瘦肉量也降低(图12A)。如图12B所示，注射后32周，与注射前的数据相比，对照小鼠显示瘦肉量百分比显著降低。然而，在AAV-GNPTAB处理的KO小鼠中未观察到瘦肉量的显著变化。这些数据也在下表4中提供。

表4.百分比瘦肉量的变化

数值表示为平均值±SEM.

总之，GNPTAB KO小鼠未能茁壮成长并且具有较弱的骨密度，如人ML型II中的情况。使用该模型，检查了使用AAV载体治疗ML II型的基因治疗的潜力。发现过表达的GNPTAB部分保护KO小鼠的骨生长受损。总而言之，通过AAV载体全身递送GNPTAB是高效的，并且代表了用于校正ML II型骨病理学的有希望的方法。

序列

全部多肽按照N末端至C末端示出，除非另行说明。

全部核酸序列按照5’至3’示出，除非另行说明。

GNPTAB

人GNPTAB蛋白质序列(SEQ ID NO:1)

MLFKLLQRQTYTCLSHRYGLYVCFLGVVVTIVSAFQFGEVVLEWSRDQYHVLFDSYRDNIAGKSFQNRLCLPMPIDVVYTWVNGTDLELLKELQQVREQMEEEQKAMREILGKNTTEPTKKSEKQLECLLTHCIKVPMLVLDPALPANITLKDLPSLYPSFHSASDIFNVAKPKNPSTNVSVVVFDSTKDVEDAHSGLLKGNSRQTVWRGYLTTDKEVPGLVLMQDLAFLSGFPPTFKETNQLKTKLPENLSSKVKLLQLYSEASVALLKLNNPKDFQELNKQTKKNMTIDGKELTISPAYLLWDLSAISQSKQDEDISASRFEDNEELRYSLRSIERHAPWVRNIFIVTNGQIPSWLNLDNPRVTIVTHQDVFRNLSHLPTFSSPAIESHIHRIEGLSQKFIYLNDDVMFGKDVWPDDFYSHSKGQKVYLTWPVPNCAEGCPGSWIKDGYCDKACNNSACDWDGGDCSGNSGGSRYIAGGGGTGSIGVGQPWQFGGGINSVSYCNQGCANSWLADKFCDQACNVLSCGFDAGDCGQDHFHELYKVILLPNQTHYIIPKGECLPYFSFAEVAKRGVEGAYSDNPIIRHASIANKWKTIHLIMHSGMNATTIHFNLTFQNTNDEEFKMQITVEVDTREGPKLNSTAQKGYENLVSPITLLPEAEILFEDIPKEKRFPKFKRHDVNSTRRAQEEVKIPLVNISLLPKDAQLSLNTLDLQLEHGDITLKGYNLSKSALLRSFLMNSQHAKIKNQAIITDETNDSLVAPQEKQVHKSILPNSLGVSERLQRLTFPAVSVKVNGHDQGQNPPLDLETTARFRVETHTQKTIGGNVTKEKPPSLIVPLESQMTKEKKITGKEKENSRMEENAENHIGVTEVLLGRKLQHYTDSYLGFLPWEKKKYFQDLLDEEESLKTQLAYFTDSKNTGRQLKDTFADSLRYVNKILNSKFGFTSRKVPAHMPHMIDRIVMQELQDMFPEEFDKTSFHKVRHSEDMQFAFSYFYYLMSAVQPLNISQVFDEVDTDQSGVLSDREIRTLATRIHELPLSLQDLTGLEHMLINCSKMLPADITQLNNIPPTQESYYDPNLPPVTKSLVTNCKPVTDKIHKAYKDKNKYRFEIMGEEEIAFKMIRTNVSHVVGQLDDIRKNPRKFVCLNDNIDHNHKDAQTVKAVLRDFYESMFPIPSQFELPREYRNRFLHMHELQEWRAYRDKLKFWTHCVLATLIMFTIFSFFAEQLIALKRKIFPRRRIHKEASPNRIRV

小鼠GNPTAB蛋白质序列(SEQ ID NO:2)

MLLKLLQRQTYTCLSHRYGLYVCFVGVVVTIVSAFQFGEVVLEWSRDQYHVLFDSYRDNIAGKSFQNRLCLPMPIDVVYTWVNGTDLELLKELQQVREHMEEEQRAMRETLGKNTTEPTKKSEKQLECLLTHCIKVPMLVLDPPLPANCTLKDLPTLYPSFHAASDMFNVAKPKNPSTNVSVVVFDTTKDVEDAHAGPFKGGSKQMVWRAYLTTDKEAPGLVLMQGLAFLSGFPPTFKETSQLKTKLPEKLSSKIKLLRLYSEASVALLKLNNPKGFQELNKQTKKNMTIDGKELTISPAYLLWDLSAISQSKQDEDVSASRFEDNEELRYSLRSIERHAPWVRNIFIVTNGQIPSWLNLDNPRVTIVTHQDIFQNLSHLPTFSSPAIESHIHRIEGLSQKFIYLNDDVMFGKDVWPDDFYSHSKGQKVYLTWPVPNCAEGCPGSWIKDGYCDKACNNSACDWDGGDCSGNTAGNRFVAGGGGTGNIGAGQHWQFGGGINTISYCNQGCANSWLADKFCDQACNVLSCGFDAGDCGQDHFHELYKVTLLPNQTHYVVPKGEYLSYFSFANIARRGVEGTYSDNPIIRHASIANKWKTIHLIMHSGMNATTIYFNLTLQNANDEEFKIQIAVEVDTREAPKLNSTTQKAYESLVSPVTPLPQADVPFEDVPKEKRFPKIRRHDVNATGRFQEEVKIPRVNISLLPKEAQVRLSNLDLQLERGDITLKGYNLSKSALLRSFLGNSLDTKIKPQARTDETKGNLEVPQENPSHRRPHGFAGEHRSERWTAPAETVTVKGRDHALNPPPVLETNARLAQPTLGVTVSKENLSPLIVPPESHLPKEEESDRAEGNAVPVKELVPGRRLQQNYPGFLPWEKKKYFQDLLDEEESLKTQLAYFTDSKHTGRQLKDTFADSLRYVNKILNSKFGFTSRKVPAHMPHMIDRIVMQELQDMFPEEFDKTSFHKVRHSEDMQFAFSYFYYLMSAVQPLNISQVFHEVDTDQSGVLSDREIRTLATRIHDLPLSLQDLTGLEHMLINCSKMLPANITQLNNIPPTQEAYYDPNLPPVTKSLVTNCKPVTDKIHKAYKDKNKYRFEIMGEEEIAFKMIRTNVSHVVGQLDDIRKNPRKFVCLNDNIDHNHKDARTVKAVLRDFYESMFPIPSQFELPREYRNRFLHMHELQEWRAYRDKLKFWTHCVLATLIIFTIFSFFAEQIIALKRKIFPRRRIHKEASPDRIRV

序列表

<110> 建新公司

<120> 用于治疗粘脂贮积症II型的腺伴随病毒载体

<130> 159792012640

<140> 尚未指定

<141> 随附提交

<150> US 62/267,502

<151> 2015-12-15

<160> 2

<170> FastSEQ，用于Windows的版本4.0

<210> 1

<211> 1256

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Leu Phe Lys Leu Leu Gln Arg Gln Thr Tyr Thr Cys Leu Ser His

1 5 10 15

Arg Tyr Gly Leu Tyr Val Cys Phe Leu Gly Val Val Val Thr Ile Val

20 25 30

Ser Ala Phe Gln Phe Gly Glu Val Val Leu Glu Trp Ser Arg Asp Gln

35 40 45

Tyr His Val Leu Phe Asp Ser Tyr Arg Asp Asn Ile Ala Gly Lys Ser

50 55 60

Phe Gln Asn Arg Leu Cys Leu Pro Met Pro Ile Asp Val Val Tyr Thr

65 70 75 80

Trp Val Asn Gly Thr Asp Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Gln Val

85 90 95

Arg Glu Gln Met Glu Glu Glu Gln Lys Ala Met Arg Glu Ile Leu Gly

100 105 110

Lys Asn Thr Thr Glu Pro Thr Lys Lys Ser Glu Lys Gln Leu Glu Cys

115 120 125

Leu Leu Thr His Cys Ile Lys Val Pro Met Leu Val Leu Asp Pro Ala

130 135 140

Leu Pro Ala Asn Ile Thr Leu Lys Asp Leu Pro Ser Leu Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Phe His Ser Ala Ser Asp Ile Phe Asn Val Ala Lys Pro Lys Asn Pro

165 170 175

Ser Thr Asn Val Ser Val Val Val Phe Asp Ser Thr Lys Asp Val Glu

180 185 190

Asp Ala His Ser Gly Leu Leu Lys Gly Asn Ser Arg Gln Thr Val Trp

195 200 205

Arg Gly Tyr Leu Thr Thr Asp Lys Glu Val Pro Gly Leu Val Leu Met

210 215 220

Gln Asp Leu Ala Phe Leu Ser Gly Phe Pro Pro Thr Phe Lys Glu Thr

225 230 235 240

Asn Gln Leu Lys Thr Lys Leu Pro Glu Asn Leu Ser Ser Lys Val Lys

245 250 255

Leu Leu Gln Leu Tyr Ser Glu Ala Ser Val Ala Leu Leu Lys Leu Asn

260 265 270

Asn Pro Lys Asp Phe Gln Glu Leu Asn Lys Gln Thr Lys Lys Asn Met

275 280 285

Thr Ile Asp Gly Lys Glu Leu Thr Ile Ser Pro Ala Tyr Leu Leu Trp

290 295 300

Asp Leu Ser Ala Ile Ser Gln Ser Lys Gln Asp Glu Asp Ile Ser Ala

305 310 315 320

Ser Arg Phe Glu Asp Asn Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Leu Arg Ser Ile

325 330 335

Glu Arg His Ala Pro Trp Val Arg Asn Ile Phe Ile Val Thr Asn Gly

340 345 350

Gln Ile Pro Ser Trp Leu Asn Leu Asp Asn Pro Arg Val Thr Ile Val

355 360 365

Thr His Gln Asp Val Phe Arg Asn Leu Ser His Leu Pro Thr Phe Ser

370 375 380

Ser Pro Ala Ile Glu Ser His Ile His Arg Ile Glu Gly Leu Ser Gln

385 390 395 400

Lys Phe Ile Tyr Leu Asn Asp Asp Val Met Phe Gly Lys Asp Val Trp

405 410 415

Pro Asp Asp Phe Tyr Ser His Ser Lys Gly Gln Lys Val Tyr Leu Thr

420 425 430

Trp Pro Val Pro Asn Cys Ala Glu Gly Cys Pro Gly Ser Trp Ile Lys

435 440 445

Asp Gly Tyr Cys Asp Lys Ala Cys Asn Asn Ser Ala Cys Asp Trp Asp

450 455 460

Gly Gly Asp Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Ser Arg Tyr Ile Ala Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ile Gly Val Gly Gln Pro Trp Gln Phe Gly

485 490 495

Gly Gly Ile Asn Ser Val Ser Tyr Cys Asn Gln Gly Cys Ala Asn Ser

500 505 510

Trp Leu Ala Asp Lys Phe Cys Asp Gln Ala Cys Asn Val Leu Ser Cys

515 520 525

Gly Phe Asp Ala Gly Asp Cys Gly Gln Asp His Phe His Glu Leu Tyr

530 535 540

Lys Val Ile Leu Leu Pro Asn Gln Thr His Tyr Ile Ile Pro Lys Gly

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Tyr Phe Ser Phe Ala Glu Val Ala Lys Arg Gly Val

565 570 575

Glu Gly Ala Tyr Ser Asp Asn Pro Ile Ile Arg His Ala Ser Ile Ala

580 585 590

Asn Lys Trp Lys Thr Ile His Leu Ile Met His Ser Gly Met Asn Ala

595 600 605

Thr Thr Ile His Phe Asn Leu Thr Phe Gln Asn Thr Asn Asp Glu Glu

610 615 620

Phe Lys Met Gln Ile Thr Val Glu Val Asp Thr Arg Glu Gly Pro Lys

625 630 635 640

Leu Asn Ser Thr Ala Gln Lys Gly Tyr Glu Asn Leu Val Ser Pro Ile

645 650 655

Thr Leu Leu Pro Glu Ala Glu Ile Leu Phe Glu Asp Ile Pro Lys Glu

660 665 670

Lys Arg Phe Pro Lys Phe Lys Arg His Asp Val Asn Ser Thr Arg Arg

675 680 685

Ala Gln Glu Glu Val Lys Ile Pro Leu Val Asn Ile Ser Leu Leu Pro

690 695 700

Lys Asp Ala Gln Leu Ser Leu Asn Thr Leu Asp Leu Gln Leu Glu His

705 710 715 720

Gly Asp Ile Thr Leu Lys Gly Tyr Asn Leu Ser Lys Ser Ala Leu Leu

725 730 735

Arg Ser Phe Leu Met Asn Ser Gln His Ala Lys Ile Lys Asn Gln Ala

740 745 750

Ile Ile Thr Asp Glu Thr Asn Asp Ser Leu Val Ala Pro Gln Glu Lys

755 760 765

Gln Val His Lys Ser Ile Leu Pro Asn Ser Leu Gly Val Ser Glu Arg

770 775 780

Leu Gln Arg Leu Thr Phe Pro Ala Val Ser Val Lys Val Asn Gly His

785 790 795 800

Asp Gln Gly Gln Asn Pro Pro Leu Asp Leu Glu Thr Thr Ala Arg Phe

805 810 815

Arg Val Glu Thr His Thr Gln Lys Thr Ile Gly Gly Asn Val Thr Lys

820 825 830

Glu Lys Pro Pro Ser Leu Ile Val Pro Leu Glu Ser Gln Met Thr Lys

835 840 845

Glu Lys Lys Ile Thr Gly Lys Glu Lys Glu Asn Ser Arg Met Glu Glu

850 855 860

Asn Ala Glu Asn His Ile Gly Val Thr Glu Val Leu Leu Gly Arg Lys

865 870 875 880

Leu Gln His Tyr Thr Asp Ser Tyr Leu Gly Phe Leu Pro Trp Glu Lys

885 890 895

Lys Lys Tyr Phe Gln Asp Leu Leu Asp Glu Glu Glu Ser Leu Lys Thr

900 905 910

Gln Leu Ala Tyr Phe Thr Asp Ser Lys Asn Thr Gly Arg Gln Leu Lys

915 920 925

Asp Thr Phe Ala Asp Ser Leu Arg Tyr Val Asn Lys Ile Leu Asn Ser

930 935 940

Lys Phe Gly Phe Thr Ser Arg Lys Val Pro Ala His Met Pro His Met

945 950 955 960

Ile Asp Arg Ile Val Met Gln Glu Leu Gln Asp Met Phe Pro Glu Glu

965 970 975

Phe Asp Lys Thr Ser Phe His Lys Val Arg His Ser Glu Asp Met Gln

980 985 990

Phe Ala Phe Ser Tyr Phe Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Val Gln Pro Leu

995 1000 1005

Asn Ile Ser Gln Val Phe Asp Glu Val Asp Thr Asp Gln Ser Gly Val

1010 1015 1020

Leu Ser Asp Arg Glu Ile Arg Thr Leu Ala Thr Arg Ile His Glu Leu

1025 1030 1035 1040

Pro Leu Ser Leu Gln Asp Leu Thr Gly Leu Glu His Met Leu Ile Asn

1045 1050 1055

Cys Ser Lys Met Leu Pro Ala Asp Ile Thr Gln Leu Asn Asn Ile Pro

1060 1065 1070

Pro Thr Gln Glu Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Leu Pro Pro Val Thr Lys

1075 1080 1085

Ser Leu Val Thr Asn Cys Lys Pro Val Thr Asp Lys Ile His Lys Ala

1090 1095 1100

Tyr Lys Asp Lys Asn Lys Tyr Arg Phe Glu Ile Met Gly Glu Glu Glu

1105 1110 1115 1120

Ile Ala Phe Lys Met Ile Arg Thr Asn Val Ser His Val Val Gly Gln

1125 1130 1135

Leu Asp Asp Ile Arg Lys Asn Pro Arg Lys Phe Val Cys Leu Asn Asp

1140 1145 1150

Asn Ile Asp His Asn His Lys Asp Ala Gln Thr Val Lys Ala Val Leu

1155 1160 1165

Arg Asp Phe Tyr Glu Ser Met Phe Pro Ile Pro Ser Gln Phe Glu Leu

1170 1175 1180

Pro Arg Glu Tyr Arg Asn Arg Phe Leu His Met His Glu Leu Gln Glu

1185 1190 1195 1200

Trp Arg Ala Tyr Arg Asp Lys Leu Lys Phe Trp Thr His Cys Val Leu

1205 1210 1215

Ala Thr Leu Ile Met Phe Thr Ile Phe Ser Phe Phe Ala Glu Gln Leu

1220 1225 1230

Ile Ala Leu Lys Arg Lys Ile Phe Pro Arg Arg Arg Ile His Lys Glu

1235 1240 1245

Ala Ser Pro Asn Arg Ile Arg Val

1250 1255

<210> 2

<211> 1235

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Met Leu Leu Lys Leu Leu Gln Arg Gln Thr Tyr Thr Cys Leu Ser His

1 5 10 15

Arg Tyr Gly Leu Tyr Val Cys Phe Val Gly Val Val Val Thr Ile Val

20 25 30

Ser Ala Phe Gln Phe Gly Glu Val Val Leu Glu Trp Ser Arg Asp Gln

35 40 45

Tyr His Val Leu Phe Asp Ser Tyr Arg Asp Asn Ile Ala Gly Lys Ser

50 55 60

Phe Gln Asn Arg Leu Cys Leu Pro Met Pro Ile Asp Val Val Tyr Thr

65 70 75 80

Trp Val Asn Gly Thr Asp Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Gln Val

85 90 95

Arg Glu His Met Glu Glu Glu Gln Arg Ala Met Arg Glu Thr Leu Gly

100 105 110

Lys Asn Thr Thr Glu Pro Thr Lys Lys Ser Glu Lys Gln Leu Glu Cys

115 120 125

Leu Leu Thr His Cys Ile Lys Val Pro Met Leu Val Leu Asp Pro Pro

130 135 140

Leu Pro Ala Asn Cys Thr Leu Lys Asp Leu Pro Thr Leu Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Phe His Ala Ala Ser Asp Met Phe Asn Val Ala Lys Pro Lys Asn Pro

165 170 175

Ser Thr Asn Val Ser Val Val Val Phe Asp Thr Thr Lys Asp Val Glu

180 185 190

Asp Ala His Ala Gly Pro Phe Lys Gly Gly Ser Lys Gln Met Val Trp

195 200 205

Arg Ala Tyr Leu Thr Thr Asp Lys Glu Ala Pro Gly Leu Val Leu Met

210 215 220

Gln Gly Leu Ala Phe Leu Ser Gly Phe Pro Pro Thr Phe Lys Glu Thr

225 230 235 240

Ser Gln Leu Lys Thr Lys Leu Pro Glu Lys Leu Ser Ser Lys Ile Lys

245 250 255

Leu Leu Arg Leu Tyr Ser Glu Ala Ser Val Ala Leu Leu Lys Leu Asn

260 265 270

Asn Pro Lys Gly Phe Gln Glu Leu Asn Lys Gln Thr Lys Lys Asn Met

275 280 285

Thr Ile Asp Gly Lys Glu Leu Thr Ile Ser Pro Ala Tyr Leu Leu Trp

290 295 300

Asp Leu Ser Ala Ile Ser Gln Ser Lys Gln Asp Glu Asp Val Ser Ala

305 310 315 320

Ser Arg Phe Glu Asp Asn Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Leu Arg Ser Ile

325 330 335

Glu Arg His Ala Pro Trp Val Arg Asn Ile Phe Ile Val Thr Asn Gly

340 345 350

Gln Ile Pro Ser Trp Leu Asn Leu Asp Asn Pro Arg Val Thr Ile Val

355 360 365

Thr His Gln Asp Ile Phe Gln Asn Leu Ser His Leu Pro Thr Phe Ser

370 375 380

Ser Pro Ala Ile Glu Ser His Ile His Arg Ile Glu Gly Leu Ser Gln

385 390 395 400

Lys Phe Ile Tyr Leu Asn Asp Asp Val Met Phe Gly Lys Asp Val Trp

405 410 415

Pro Asp Asp Phe Tyr Ser His Ser Lys Gly Gln Lys Val Tyr Leu Thr

420 425 430

Trp Pro Val Pro Asn Cys Ala Glu Gly Cys Pro Gly Ser Trp Ile Lys

435 440 445

Asp Gly Tyr Cys Asp Lys Ala Cys Asn Asn Ser Ala Cys Asp Trp Asp

450 455 460

Gly Gly Asp Cys Ser Gly Asn Thr Ala Gly Asn Arg Phe Val Ala Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Thr Gly Asn Ile Gly Ala Gly Gln His Trp Gln Phe Gly

485 490 495

Gly Gly Ile Asn Thr Ile Ser Tyr Cys Asn Gln Gly Cys Ala Asn Ser

500 505 510

Trp Leu Ala Asp Lys Phe Cys Asp Gln Ala Cys Asn Val Leu Ser Cys

515 520 525

Gly Phe Asp Ala Gly Asp Cys Gly Gln Asp His Phe His Glu Leu Tyr

530 535 540

Lys Val Thr Leu Leu Pro Asn Gln Thr His Tyr Val Val Pro Lys Gly

545 550 555 560

Glu Tyr Leu Ser Tyr Phe Ser Phe Ala Asn Ile Ala Arg Arg Gly Val

565 570 575

Glu Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Pro Ile Ile Arg His Ala Ser Ile Ala

580 585 590

Asn Lys Trp Lys Thr Ile His Leu Ile Met His Ser Gly Met Asn Ala

595 600 605

Thr Thr Ile Tyr Phe Asn Leu Thr Leu Gln Asn Ala Asn Asp Glu Glu

610 615 620

Phe Lys Ile Gln Ile Ala Val Glu Val Asp Thr Arg Glu Ala Pro Lys

625 630 635 640

Leu Asn Ser Thr Thr Gln Lys Ala Tyr Glu Ser Leu Val Ser Pro Val

645 650 655

Thr Pro Leu Pro Gln Ala Asp Val Pro Phe Glu Asp Val Pro Lys Glu

660 665 670

Lys Arg Phe Pro Lys Ile Arg Arg His Asp Val Asn Ala Thr Gly Arg

675 680 685

Phe Gln Glu Glu Val Lys Ile Pro Arg Val Asn Ile Ser Leu Leu Pro

690 695 700

Lys Glu Ala Gln Val Arg Leu Ser Asn Leu Asp Leu Gln Leu Glu Arg

705 710 715 720

Gly Asp Ile Thr Leu Lys Gly Tyr Asn Leu Ser Lys Ser Ala Leu Leu

725 730 735

Arg Ser Phe Leu Gly Asn Ser Leu Asp Thr Lys Ile Lys Pro Gln Ala

740 745 750

Arg Thr Asp Glu Thr Lys Gly Asn Leu Glu Val Pro Gln Glu Asn Pro

755 760 765

Ser His Arg Arg Pro His Gly Phe Ala Gly Glu His Arg Ser Glu Arg

770 775 780

Trp Thr Ala Pro Ala Glu Thr Val Thr Val Lys Gly Arg Asp His Ala

785 790 795 800

Leu Asn Pro Pro Pro Val Leu Glu Thr Asn Ala Arg Leu Ala Gln Pro

805 810 815

Thr Leu Gly Val Thr Val Ser Lys Glu Asn Leu Ser Pro Leu Ile Val

820 825 830

Pro Pro Glu Ser His Leu Pro Lys Glu Glu Glu Ser Asp Arg Ala Glu

835 840 845

Gly Asn Ala Val Pro Val Lys Glu Leu Val Pro Gly Arg Arg Leu Gln

850 855 860

Gln Asn Tyr Pro Gly Phe Leu Pro Trp Glu Lys Lys Lys Tyr Phe Gln

865 870 875 880

Asp Leu Leu Asp Glu Glu Glu Ser Leu Lys Thr Gln Leu Ala Tyr Phe

885 890 895

Thr Asp Ser Lys His Thr Gly Arg Gln Leu Lys Asp Thr Phe Ala Asp

900 905 910

Ser Leu Arg Tyr Val Asn Lys Ile Leu Asn Ser Lys Phe Gly Phe Thr

915 920 925

Ser Arg Lys Val Pro Ala His Met Pro His Met Ile Asp Arg Ile Val

930 935 940

Met Gln Glu Leu Gln Asp Met Phe Pro Glu Glu Phe Asp Lys Thr Ser

945 950 955 960

Phe His Lys Val Arg His Ser Glu Asp Met Gln Phe Ala Phe Ser Tyr

965 970 975

Phe Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Val Gln Pro Leu Asn Ile Ser Gln Val

980 985 990

Phe His Glu Val Asp Thr Asp Gln Ser Gly Val Leu Ser Asp Arg Glu

995 1000 1005

Ile Arg Thr Leu Ala Thr Arg Ile His Asp Leu Pro Leu Ser Leu Gln

1010 1015 1020

Asp Leu Thr Gly Leu Glu His Met Leu Ile Asn Cys Ser Lys Met Leu

1025 1030 1035 1040

Pro Ala Asn Ile Thr Gln Leu Asn Asn Ile Pro Pro Thr Gln Glu Ala

1045 1050 1055

Tyr Tyr Asp Pro Asn Leu Pro Pro Val Thr Lys Ser Leu Val Thr Asn

1060 1065 1070

Cys Lys Pro Val Thr Asp Lys Ile His Lys Ala Tyr Lys Asp Lys Asn

1075 1080 1085

Lys Tyr Arg Phe Glu Ile Met Gly Glu Glu Glu Ile Ala Phe Lys Met

1090 1095 1100

Ile Arg Thr Asn Val Ser His Val Val Gly Gln Leu Asp Asp Ile Arg

1105 1110 1115 1120

Lys Asn Pro Arg Lys Phe Val Cys Leu Asn Asp Asn Ile Asp His Asn

1125 1130 1135

His Lys Asp Ala Arg Thr Val Lys Ala Val Leu Arg Asp Phe Tyr Glu

1140 1145 1150

Ser Met Phe Pro Ile Pro Ser Gln Phe Glu Leu Pro Arg Glu Tyr Arg

1155 1160 1165

Asn Arg Phe Leu His Met His Glu Leu Gln Glu Trp Arg Ala Tyr Arg

1170 1175 1180

Asp Lys Leu Lys Phe Trp Thr His Cys Val Leu Ala Thr Leu Ile Ile

1185 1190 1195 1200

Phe Thr Ile Phe Ser Phe Phe Ala Glu Gln Ile Ile Ala Leu Lys Arg

1205 1210 1215

Lys Ile Phe Pro Arg Arg Arg Ile His Lys Glu Ala Ser Pro Asp Arg

1220 1225 1230

Ile Arg Val

1235

Claims

1.一种重组腺伴随病毒(rAAV)载体，其包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)和至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)的核酸。

2.权利要求1的rAAV，其中所述GNPTAB包含α和β亚基。

3.权利要求1或2的rAAV载体，其中所述GNPTAB与启动子可操作地连接。

4.权利要求1-3中任一项的rAAV载体，其中所述GNPTAB是人GNPTAB。

5.权利要求1-4中任一项的rAAV载体，其中所述GNPTAB包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％相同的氨基酸序列。

6.权利要求1-5中任一项的rAAV载体，其中所述GNPTAB包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

7.权利要求1-6中任一项的rAAV载体，其中所述启动子是CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。

8.权利要求7的rAAV载体，其中所述CBA启动子是修饰型CBA启动子。

9.权利要求8的rAAV载体，其中所述修饰型CBA启动子是截短型CBA启动子。

10.权利要求7-9中任一项的rAAV载体，其中所述CMV增强子是缩短的CMV增强子。

11.权利要求1-10中任一项的rAAV载体，其中所述载体包含内含子。

12.权利要求11的rAAV载体，其中所述内含子是MVM内含子。

13.权利要求1-12中任一项的rAAV载体，其中所述载体包含聚腺苷酸化序列。

14.权利要求13的rAAV载体，其中所述聚腺苷酸化序列是牛生长激素聚腺苷酸化序列。

15.权利要求1-14中任一项的rAAV载体，其中所述AAV末端重复序列是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。

16.权利要求15的rAAV载体，其中所述rAAV载体包含两个ITR。

17.一种rAAV颗粒，其包含权利要求1-16中任一项的rAAV载体。

18.权利要求17的rAAV颗粒，其中所述AAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。

19.权利要求17或18的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含一个或多个ITR和源自相同AAV血清型的衣壳。

20.权利要求17或18的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含一个或多个源自与所述rAAV病毒颗粒的衣壳不同的AAV血清型的ITR。

21.权利要求20的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含AAV8衣壳，并且其中所述载体包含AAV2ITR。

22.权利要求17-21中任一项的rAAV颗粒，其中通过用编码rAAV载体的核酸和编码AAVrep和cap功能的核酸转染宿主细胞，并提供编码AAV辅助功能的核酸来产生rAAV颗粒。

23.权利要求22的rAAV颗粒，其中通过用编码AAV辅助功能的核酸转染宿主细胞来提供AAV辅助功能。

24.权利要求22的rAAV颗粒，其中通过用提供AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染宿主细胞来提供AAV辅助功能。

25.权利要求24的rAAV颗粒，其中所述AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。

26.权利要求17-21中任一项的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒由AAV生产细胞产生，所述AAV生产细胞包含编码rAAV载体的核酸和编码AAV rep和cap功能的核酸，并提供编码AAV辅助功能的核酸。

27.权利要求26的rAAV颗粒，其中所述AAV生产细胞包含编码AAV辅助功能的核酸。

28.权利要求26的rAAV颗粒，其中通过用提供AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染AAV生产细胞来提供AAV辅助功能。

29.权利要求28的rAAV颗粒，其中所述AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。

30.一种药物组合物，其包含权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒。

31.一种在哺乳动物中治疗粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒或权利要求30的药物组合物。

32.一种在哺乳动物中治疗粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)和至少一个AAV ITR的核酸。

33.一种在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中维持或增加身体尺寸的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达导致体重增加的维持或增加，和/或身高增加的维持或增加。

34.一种在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中预防身体尺寸减小的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达预防体重的降低。

35.一种在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中维持或增加骨矿物质含量的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达导致骨矿物质含量的维持或增加。

36.一种在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中预防骨矿物质含量降低的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达预防骨矿物质含量的降低。

37.一种在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中维持或增加骨矿物质密度的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达导致骨矿物质密度的维持或增加。

38.一种在患有粘脂贮积症II型(ML II)或粘脂贮积症III型(ML III)的哺乳动物中预防骨矿物质密度降低的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸，其中所述GNPTAB的表达预防骨矿物质密度的降低。

39.权利要求31的方法，其中所述治疗缓解ML II或MLIII的一种或多种症状，其中所述ML II或ML III的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全(insufficiency)、便秘或腹泻。

40.权利要求31的方法，其中所述治疗延迟ML II或ML III的一种或多种症状的进展，其中所述ML II或ML III的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全、便秘或腹泻。

41.一种缓解哺乳动物中ML II或ML III的一种或多种症状的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸；其中所述ML II或ML III的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全、便秘或腹泻。

42.一种延迟哺乳动物中ML II或ML III的一种或多种症状的进展的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包含rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码GNPTAB和至少一个AAV ITR的核酸；其中所述ML II或ML III的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全、便秘或腹泻。

43.权利要求31-42中任一项的方法，其中所述GNPTAB与启动子可操作地连接。

44.权利要求31-43中任一项的方法，其中所述GNPTAB是人GNPTAB。

45.权利要求31-44中任一项的方法，其中所述GNPTAB包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列。

46.权利要求31-45中任一项的方法，其中所述GNPTAB包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

47.权利要求43-46中任一项的方法，其中所述启动子是CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。

48.权利要求47的方法，其中所述CBA启动子是修饰型CBA启动子。

49.权利要求47的方法，其中所述修饰型CBA启动子是截短型CBA启动子。

50.权利要求47-49中任一项的方法，其中所述CMV增强子是缩短的CMV增强子。

51.权利要求31-50中任一项的方法，其中所述载体包含内含子。

52.权利要求51的方法，其中所述内含子是MVM内含子。

53.权利要求31-52中任一项的方法，其中所述载体包含聚腺苷酸化序列。

54.权利要求53的方法，其中所述聚腺苷酸化序列是牛生长激素聚腺苷酸化序列。

55.权利要求31-54中任一项的方法，其中所述AAV末端重复序列是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。

56.权利要求55的方法，其中所述rAAV载体包含两个ITR。

57.权利要求31-56中任一项的方法，其中所述AAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。

58.权利要求31-57中任一项的方法，其中所述rAAV颗粒包含一个或多个ITR和源自相同AAV血清型的衣壳。

59.权利要求31-57中任一项的方法，其中所述rAAV颗粒包含一个或多个源自与所述rAAV病毒颗粒的衣壳不同的AAV血清型的ITR。

60.权利要求59的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8衣壳，并且其中所述载体包含AAV2ITR。

61.权利要求31-60中任一项的方法，其中通过用编码rAAV载体的核酸和编码AAV rep和cap功能的核酸转染宿主细胞，并提供编码AAV辅助功能的核酸来产生rAAV颗粒。

62.权利要求61的方法，其中通过用编码AAV辅助功能的核酸转染宿主细胞来提供AAV辅助功能。

63.权利要求62的方法，其中通过用提供AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染宿主细胞来提供AAV辅助功能。

64.权利要求63的方法，其中所述AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。

65.权利要求31-60中任一项的方法，其中所述rAAV颗粒由AAV生产细胞产生，所述AAV生产细胞包含编码rAAV载体的核酸和编码AAV rep和cap功能的核酸，并提供编码AAV辅助功能的核酸。

66.权利要求65的方法，其中所述AAV生产细胞包含编码AAV辅助功能的核酸。

67.权利要求66的方法，其中通过用提供AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染AAV生产细胞来提供AAV辅助功能。

68.权利要求67的方法，其中所述AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。

69.权利要求31-68中任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。

70.权利要求69的方法，其中所述人是儿科受试者。

71.权利要求69的方法，其中所述人是年轻的成年人。

72.权利要求31-71中任一项的方法，其中所述rAAV静脉内、腹膜内、动脉内、肌内、皮下或肝内施用。

73.权利要求72的方法，其中所述rAAV静脉内施用。

74.权利要求31-73中任一项的方法，其中所述rAAV施用至超过一个部位。

75.权利要求31-74中任一项的方法，其中重复所述施用。

76.权利要求31-75中任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒在药物组合物中。

77.权利要求76的方法，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

78.权利要求30的药物组合物在制备用于在哺乳动物中治疗ML II或ML III的药物中的用途。

79.权利要求30的药物组合物在制备用于权利要求31-77中任一项的方法的药物中的用途。

80.权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒在制备用于在哺乳动物中治疗ML II或ML III的药物中的用途。

81.权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒在制备用于权利要求31-77中任一项的方法的药物中的用途。

82.权利要求30的药物组合物，其用于在哺乳动物中治疗ML II或ML III。

83.权利要求30的药物组合物，其用于权利要求31-77中任一项的方法。

84.权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒，其用于在哺乳动物中治疗ML II或ML III。

85.权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒，其用于权利要求31-77中任一项的方法。

86.权利要求30的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中缓解ML II或ML III的一种或多种症状或在哺乳动物中延缓ML II或ML III的一种或多种症状的进展。

87.权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中缓解ML II或ML III的一种或多种症状或在哺乳动物中延缓ML II或ML III的一种或多种症状的进展。

88.权利要求30的药物组合物，其用于缓解ML II或ML III的一种或多种症状或在哺乳动物中延缓ML II或ML III的一种或多种症状的进展。

89.权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒，其用于缓解ML II或ML III的一种或多种症状或在哺乳动物中延缓ML II或ML III的一种或多种症状的进展。

90.权利要求86-89中任一项的用途，其中所述ML II或ML III的一种或多种症状是骨骼缺陷、认知缺陷、大运动和精细运动技能发育的延迟、听力丧失、肌张力缺乏、腹部突出、脐疝、气道进行性粘膜增厚、频繁的呼吸道感染、二尖瓣增厚和关闭不全(insufficiency)、便秘或腹泻。

91.权利要求78-90任一项的用途，其中所述哺乳动物是人。

92.一种试剂盒，其包含权利要求1-16中任一项的rAAV载体、权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒或权利要求30的药物组合物。

93.一种用于根据权利要求31-77中任一项的方法治疗ML II或ML III的试剂盒，其中所述试剂盒包含权利要求1-16中任一项的rAAV载体、权利要求17-29中任一项的rAAV颗粒或权利要求30的药物组合物。

94.权利要求92或93的试剂盒，其还包含一种或多种缓冲液或药学上可接受的赋形剂。

95.权利要求92-94中任一项的试剂盒，其还包含用于在治疗ML II和/或ML III中使用的说明书。

96.一种粘脂贮积症II(ML II)的动物模型，其中N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)基因的至少一个等位基因包含位于外显子12和外显子20之间的缺失。

97.权利要求96的动物模型，其中所述GNPTAB基因的至少一个等位基因包含跨越外显子12和外显子20的缺失。

98.权利要求96或97的动物模型，其中所述动物对于GNPTAB基因中的缺失是纯合的。

99.权利要求96或97的动物模型，其中所述动物对于GNPTAB基因中的缺失是杂合的。

100.权利要求96-99中任一项的动物模型，其中所述GNPTAB基因的一部分由编码报道分子和/或选择标记的基因替代。

101.权利要求100的动物模型，其中所述选择标记赋予对新霉素的抗性。

102.权利要求96-101中任一项的动物模型，其中所述动物是哺乳动物。

103.权利要求102的动物模型，其中所述哺乳动物是啮齿动物。

104.权利要求103的动物模型，其中所述啮齿动物是小鼠。

105.权利要求104的动物模型，其中所述小鼠具有源自129/Sv和/或C57Bl/6的遗传背景。

106.权利要求96-104中任一项的动物模型，其中所述动物具有免疫活性或是免疫缺陷的。

107.一种生成粘脂贮积症II(ML II)的动物模型的方法，包括在动物的GNPTAB基因的至少一个等位基因中的外显子12和外显子20之间引入缺失。

108.权利要求107的方法，其中所述GNPTAB基因的至少一个等位基因包含跨越外显子12和外显子20的缺失。

109.权利要求107或108的方法，其中将所述动物培育为对于GNPTAB基因的缺失是纯合的。

110.权利要求107或108的方法，其中将所述动物培育为对于GNPTAB基因的缺失是杂合的。

111.权利要求107-110中任一项的方法，其中所述GNPTAB基因的一部分由编码报道分子和/或选择标记的基因替代。

112.权利要求111的方法，其中所述选择标记赋予对新霉素的抗性。

113.权利要求107-112中任一项的方法，其中所述动物是哺乳动物。

114.权利要求113的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物。

115.权利要求114的方法，其中所述啮齿动物是小鼠。

116.权利要求115的方法，其中所述小鼠具有源自129/Sv和/或C57Bl/6的遗传背景。

117.权利要求96-104中任一项的方法，其中所述动物具有免疫活性或是免疫缺陷的。

118.权利要求107-117中任一项的方法生成的黏脂贮积症II的动物模型。

119.一种评估用于治疗粘脂贮积症II(ML II)的药剂的方法，包括向权利要求96-106中任一项的动物模型施用所述药剂，其中ML II的一种或多种症状的缓解表明所述药剂提供了对ML II的有益治疗。

120.权利要求119的方法，其中所述ML II的症状是体重下降，骨密度降低，骨矿物质含量降低，骨骼缺陷，认知缺陷，大运动和精细运动技能发展延迟，听力丧失，肌张力不足，突出的腹部，脐疝，气道的进行性粘膜增厚，频繁的呼吸道感染，二尖瓣增厚和关闭不全，便秘和/或腹泻。

121.权利要求119或120的方法，其中所述药剂是小分子、多肽、抗体、核酸或重组病毒颗粒。