JP2022046635A - ムコリピドーシスｉｉ型を治療するためのアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

ムコリピドーシスｉｉ型を治療するためのアデノ随伴ウイルスベクター Download PDF

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Abstract

【課題】ムコリピドーシスＩＩ型および／またはＩＩＩ型を治療するための、ｒＡＡＶベクターを提供する。【解決手段】組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼのアルファサブユニットおよびベータサブユニット（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月１５日に出願された米国仮出願第６２／２６７，５０２号の優先権の利益を主張し、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルでの提出の内容は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１５９７９２０１２６４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、データ記録日：２０１６年１２月９日、サイズ：２１ｋｂ）。
本発明は、ムコリピドーシスＩＩ型および／またはＩＩＩ型を治療するための、ｒＡＡＶベクター、粒子、組成物、ならびにこれらに関する方法、キットおよび使用に関する。
ムコリピドーシスＩＩ型およびＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩ；ＭＬ ＩＩＩ）は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ；リソソーム酵素；Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼと略される）の欠損によって特徴づけられる、常染色体劣性のリソソーム蓄積症である。ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼは、３つの異なるサブユニットのα２、β２およびγ２からなる六量体の酵素複合体である。α２サブユニットおよびβ２サブユニットは、触媒活性を有し、単一遺伝子であるＧＮＰＴＡＢによってコードされる。酵素活性の完全喪失をもたらすＧＮＰＴＡＢの変異は、ＭＬ ＩＩを有する患者において見出される。ムコリピドーシスＩＩは、高度に進行性であり、患者は、生後１０年間を超えて生存することはまれである。加えて、ＭＬ ＩＩのために利用可能な治療の選択肢は限られたままである。少数の患者では、骨髄移植のみが、試みられている。対照的に、ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ活性の部分的な減少をもたらすＧＮＰＴＡＢの変異は、ＭＬ ＩＩＩを有する患者において見出される。これらの患者は、通常、より軽度の症状およびより遅い疾患の進行を示すが、依然として、骨格異常、発育遅延および心拡大などの重篤な健康問題を示す。
組織特異的トロピズムを呈し、導入遺伝子の持続発現を促進する、ＡＡＶ血清型が利用できることにより、ＭＬ ＩＩおよびＭＬ ＩＩＩを含む、リソソーム病の全身的な治療のためのＡＡＶ媒介遺伝子治療の可能性が提供される。したがって、ＭＬ ＩＩ／ＩＩＩのＡＡＶ媒介治療の研究は、このアプローチが、この壊滅的な疾患に対する潜在的な治療戦略を示すか否かを確立するために重要である。しかしながら、ＭＬ ＩＩ／ＩＩＩのＡＡＶ媒介治療を検討する前に、技術的な限界を克服する必要がある。ＧＮＰＴＡＢ（ヒトにおいて、５．６ｋｂ超）のコード配列は、内因性ＡＡＶゲノム（約４．７ｋｂ）よりも長い。したがって、ウイルス粒子内への効率的なパッケージングを依然として促進しつつ、機能性プロモーター／エンハンサー配列およびＡＡＶゲノムの他の成分とともに、ＧＮＰＴＡＢを収容することができるＡＡＶベクターは、非常に有利である。
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒ
ＡＡＶ）ベクターを提供する。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、アルファサブユニットおよびベータサブユニットを含む。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、プロモーターと作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、ヒトＧＮＰＴＡＢである。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。一部の実施形態において、ＣＢＡプロモーターは、改変型ＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態において、改変型ＣＢＡプロモーターは、切断型ＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態において、ＣＭＶエンハンサーは、短縮型ＣＭＶエンハンサーである。一部の実施形態において、ベクターは、イントロンを含む。一部の実施形態において、イントロンは、ＭＶＭイントロンである。一部の実施形態において、ベクターは、ポリアデニル化配列を含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列である。一部の実施形態において、ＡＡＶ末端反復配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲを含む。
一部の態様において、本発明は、上述の実施形態のいずれか１つのｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶまたはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、同じＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲおよびキャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドとは異なるＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８キャプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ機能およびｃａｐ機能をコードする核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすること、ならびにＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することによって産生される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすることによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスを宿主細胞に感染させることによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ機能およびｃａｐ機能をコードする核酸を含むＡＡＶ産生細胞によって産生され、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスをＡＡＶ産生細胞に感染させることによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む医薬組成物を提供する。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を治療するための方法であって、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子または本明細書に記載される医薬組成物のいずれかの有効量を、哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を治療するための方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の身体のサイズを維持または増加させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、ＧＮＰＴＡＢの発現は、体重増加の維持もしくは増加、および／または身長増加の維持もしくは増加をもたらす、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の身体のサイズの減少を防止する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、ＧＮＰＴＡＢの発現は、体重の減少を防止する、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の骨塩量を維持または増加させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、ＧＮＰＴＡＢの発現は、骨塩量の維持または増加をもたらす、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の骨塩量の減少を防止する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、ＧＮＰＴＡＢの発現は、骨塩量の減少を防止する、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の骨密度を維持または増加させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、ＧＮＰＴＡＢの発現は、骨密度の維持または増加をもたらす、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の骨密度の減少を防止する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、ＧＮＰＴＡＢの発現は、骨密度の減少を防止する、方法を提供する。
上述の方法の一部の実施形態において、治療は、ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和し、ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁
の肥厚および機能不全、便秘または下痢である。一部の実施形態において、治療は、ＭＬ
ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させ、ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み；ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＭＬ
ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み；ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である、方法を提供する。
上述の方法の一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、プロモーターと作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、ヒトＧＮＰＴＡＢである。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。一部の実施形態において、ＣＢＡプロモーターは、改変型ＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態において、改変型ＣＢＡプロモーターは、切断型ＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態において、ＣＭＶエンハンサーは、短縮型ＣＭＶエンハンサーである。一部の実施形態において、ベクターは、イントロンを含む。一部の実施形態において、イントロンは、ＭＶＭイントロンである。一部の実施形態において、ベクターは、ポリアデニル化配列を含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列である。一部の実施形態において、ＡＡＶ末端反復配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶまたはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、同じＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲおよびキャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドとは異なるＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８キャプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。
上述の実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコー
ドする核酸、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ機能およびｃａｐ機能をコードする核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすること、ならびにＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することによって産生される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすることによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスを宿主細胞に感染させることによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ機能およびｃａｐ機能をコードする核酸を含むＡＡＶ産生細胞によって産生され、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスをＡＡＶ産生細胞に感染させることによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。
上述の方法の一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態において、ヒトは、小児の対象である。一部の実施形態において、ヒトは、若年成人である。
上述の方法の一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、静脈内、腹腔内、動脈内、筋肉内、皮下または肝臓内に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、静脈内に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、２つ以上の場所に投与される。一部の実施形態において、投与は、繰り返される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、医薬組成物中にある。一部の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するための医薬の製造における、本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用のための医薬の製造における、本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するための医薬の製造における、本明細書に記載されるいずれかのｒＡＡＶ粒子の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用のための医薬の製造における、本明細書に記載されるいずれかのｒＡＡＶ粒子の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するための、本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用のための、本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するための、本明細書に記載されるいずれかの組換えＡＡＶの使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用のための、本明細書に記載されるいずれかの組換えＡＡＶの使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和するため、または哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させるための医薬の製造における、本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和するため、または哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させるための医薬の製造における、本明細書に記載されるいずれかのｒＡＡＶ粒子の使用を提供する。一部の実施形態において、本発
明は、哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和するため、または哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させるための、本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和するため、または哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させるための、本明細書に記載されるいずれかの組換えＡＡＶの使用を提供する。一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかのｒＡＡＶベクター、本明細書に記載されるいずれかのｒＡＡＶ粒子、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載されるいずれかの方法に従ってＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するためのものである。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載されるいずれかのｒＡＡＶベクター、本明細書に記載されるいずれかのｒＡＡＶ粒子、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を含む。一部の実施形態において、キットは、１つもしくはそれ以上の緩衝液または薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩの治療における使用のための説明書をさらに含む。
一部の態様において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ ＩＩ）の動物モデルであって、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）遺伝子の少なくとも１つのアレルは、エクソン１２およびエクソン２０の間に位置する欠失を含む、動物モデルを提供する。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の少なくとも１つのアレルは、エクソン１２およびエクソン２０にまたがる欠失を含む。一部の実施形態において、動物は、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子中の欠失についてホモ接合性である。一部の実施形態において、動物は、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子中の欠失についてヘテロ接合性である。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の一部は、レポーターおよび／または選択的マーカーをコードする遺伝子によって置き換えられている。一部の実施形態において、選択的マーカーは、ネオマイシンに対する耐性を付与する。一部の実施形態において、動物は、哺乳動物である。一部の実施形態において、哺乳動物は、げっ歯類である。一部の実施形態において、げっ歯類は、マウスである。一部の実施形態において、マウスは、１２９／Ｓｖおよび／またはＣ５７Ｂｌ／６に由来する遺伝的背景を有する。一部の実施形態において、動物は、免疫適格性または免疫不全性である。
一部の態様において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ ＩＩ）の動物モデルを生成させる方法であって、動物のＧＮＰＴＡＢ遺伝子の少なくとも１つのアレルにおけるエクソン１２およびエクソン２０の間に欠失を導入することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の少なくとも１つのアレルは、エクソン１２およびエクソン２０にまたがる欠失を含む。一部の実施形態において、動物は、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子中の欠失についてホモ接合性となるように掛け合わされる。一部の実施形態において、動物は、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子中の欠失についてヘテロ接合性となるように掛け合わされる。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の一部は、レポーターおよび／または選択的マーカーをコードする遺伝子によって置き換えられている。一部の実施形態において、選択的マーカーは、ネオマイシンに対する耐性を付与する。一部の実施形態において、動物は、哺乳動物である。一部の実施形態において、哺乳動物は、げっ歯類である。一部の実施形態において、げっ歯類は、マウスである。一部の実施形態において、マウ
スは、１２９／Ｓｖおよび／またはＣ５７Ｂｌ／６に由来する遺伝的背景を有する。一部の実施形態において、動物は、免疫適格性または免疫不全性である。
一部の態様において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ ＩＩ）の治療のための薬剤を評価するための方法であって、本明細書に記載される動物モデルに薬剤を投与することを含み、ＭＬ ＩＩの１つまたはそれ以上の症状の緩和は、薬剤がＭＬ ＩＩの有益な治療を提供することを示す、方法を提供する。一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩの症状は、体重の減少、骨密度の減少、骨塩量の減少、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である。一部の実施形態において、薬剤は、小分子、ポリペプチド、抗体、核酸または組換えウイルス粒子である。
特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用されるすべての参考文献は、それらの全体を参照によって本明細書に組み入れる。
マウスＧＮＰＴＡＢ遺伝子構造およびＧＮＰＴＡＢノックアウトマウスを生成させるために使用される遺伝子トラッピングベクターのゲノム挿入部位の略図を示す図である。 ＧＮＰＴＡＢノックアウトマウスを生成させるために使用されるマウスＥＳクローンを示すサザンブロットである図である。 ＧＮＰＴＡＢノックアウトマウスにおいて呈される成長遅延を示す図である。（図２Ａ）６週齢の野生型（＋／＋）マウス、ヘテロ接合性（＋／－）マウスおよびホモ接合性（－／－）マウスの体重（＊＊＊；ｐ＜０．０００１；ボンフェローニの多重比較検定）。（図２Ｂ）６週齢の野生型マウス、ヘテロ接合性マウスおよびホモ接合性マウスの鼻端－肛門の長さ（ｍｍ）（＊；ｐ＜０．０２；ボンフェローニの多重比較検定）。（図２Ｃ）野生型マウスおよびホモ接合性マウスの肉眼形態。 野生型マウス（図３Ａ）およびホモ接合性ノックアウトマウス（図３Ｂ）からのヘマトキシリンおよびエオシン染色された大腿軟骨の代表切片の光学顕微鏡画像を示す図である。 ノックアウト（ＫＯ）マウスの唾液腺におけるオートリソソームの蓄積を実証する図である。（図４Ａ～図４Ｃ）ＥＭは、粘膜細胞および漿液細胞で構成される、野生型マウスの唾液腺房の概観を示す。（図４Ｄ）ＫＯの唾液腺房の概観。全体の構造は、ＫＯでは、極めて多くの大きな空胞の蓄積によって破壊される。（図４Ｅ～図４Ｆ）単一膜によって囲まれ、未分解の物質を含有する、高倍率での（図４Ｄ）の空胞。倍率の範囲を、（図４Ｄ）のボックスに示す。ＡＬ、オートリソソーム；Ｍｕ、粘膜細胞；Ｎ、核；ＳＧ、分泌顆粒。 表示されたように、野生型マウス（白丸）およびＫＯマウス（黒丸）の血清中のリソソーム酵素活性を示す図である。Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（図５Ａ）、β－ヘキソサミニダーゼＡ（図５Ｂ）、β－ガラクトシダーゼ（図５Ｃ）およびβ－グルクロニダーゼ（図５Ｄ）の活性を示す。 注射に関する実験の予定表の概要を示す図である。（図６Ａ）６週齢でウイルスベクターを注射されたマウスについての長期治療の研究の予定表。（図６Ｂ）それぞれの治療群で注射されたマウスの総数（ｎ）を示す。 マウスＧＮＰＴＡＢ ｃＤＮＡを含有するｐＡＡＶ２／８－ＧＮＰＴＡＢベクターの模式図を表す図である。マウスＧＮＰＴＡＢ ｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１００４１６４．２に基づく。ヌクレオチド配列は、マウスにおける発現のためにコドン最適化された。アミノ酸配列は、未変化である。 ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢを注射されたＫＯマウスからの肝臓の、それらの対照の同腹仔と比較した、定量分析を示す図である。 対照マウスおよびＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢ治療ＫＯマウスについての、開始時の重量からの経時的な体重の変化を示す図である。（図８Ａ）対照マウスおよびＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢ治療ＫＯマウスの総体重（＊ｐ＜０．０５、ダネットの多重比較検定）。（図８Ｂ）データを、開始時の重量からの経時的な重量変化の量として表した。 対照マウスおよびＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢ治療ＫＯマウスについての、開始時の体長からの経時的な体長の変化を示す図である。（図９Ａ）データを、注射前および注射６週間後で比較した体長の比として表した。（図９Ｂ）データを、注射前および注射３２週間後で比較した体長の比として表した。 注射前（図１０Ａ）、注射１６週間後（図１０Ｂ）および注射３２週間後（図１０Ｃ）の骨密度のレベルを示すヒストグラムを示す図である。（図１０Ａ）ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢで治療されたホモ接合性およびヘテロ接合性からのデータを、野生型およびヘテロ接合性のものと比較した（野生型と比較†；ｐ＜０．０５、‡；ｐ＜０．０２、ヘテロ接合性と比較＊；ｐ＜０．０２、＊＊；ｐ＜０．００２）。ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢ治療は、治療１６週間後（図１０Ｂ）および治療３２週間後（図１０Ｃ）のホモ接合性マウスにおける、ＢＭＤ比（後／前のＴｘ）の統計学的に有意な増加をもたらした。（図１０Ｂ）治療の１６週間後、ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢで治療されたＧＮＰＴＡＢヌルマウスは、他のマウスよりも、ＢＭＤ比の有意な増加を示した（＊＊；Ｐ＜０．０２）。（図１０Ｃ）治療の３２週間後、ＢＭＤ比の有意な相違が、ＧＮＰＴＡＢで治療されたマウスにおいて、観察された（＃；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０２）。Ｐ値は、両側の独立ｔ検定の解析によって決定された。データは、平均±ＳＥＭとして示される。 注射前（図１１Ａ）、注射１６週間後（図１１Ｂ）および注射３２週間後（図１１Ｃ）の骨塩量のレベルを示すヒストグラムを示す図である。（図１１Ａ）ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢで治療されたホモ接合性およびヘテロ接合性からのデータを、野生型およびヘテロ接合性のものと比較した（野生型と比較†；ｐ＜０．０５、‡；ｐ＜０．０２、ヘテロ接合性と比較＊；ｐ＜０．０２、＊＊；ｐ＜０．００２）。ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢ治療は、治療１６週間後（図１１Ｂ）および治療３２週間後（図１１Ｃ）のホモ接合性マウスにおける、ＢＭＤ比（後／前のＴｘ）の統計学的に有意な増加をもたらした。（図１１Ｂ）治療の１６週間後、ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢで治療されたＧＮＰＴＡＢヌルマウスは、他のマウスよりも、ＢＭＤ比の有意な増加を示した（＊＊；Ｐ＜０．０２）。（図１１Ｃ）治療の３２週間後、ＢＭＤ比の有意な相違が、ＧＮＰＴＡＢで治療されたマウスにおいて、観察された（＃；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０２）。Ｐ値は、両側の独立ｔ検定の解析によって決定された。データは、平均±ＳＥＭとして示される。 注射前のパーセント除脂肪量のレベル（図１２Ａ）、および注射３２週間後のパーセント除脂肪量の変化（図１２Ｂ）を示すヒストグラムを示す図である。（図１２Ａ）ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢで治療されたホモ接合性およびヘテロ接合性からのデータを、野生型およびヘテロ接合性のものと比較した（野生型と比較†；ｐ＜０．０２、ヘテロ接合性と比較＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．００１）。（図１２Ｂ）治療の３２週間後、％除脂肪量の変化は、ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢで治療されたマウスにおいて観察されなかった。Ｐ値は、両側の独立ｔ検定の解析によって決定された。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
一部の態様において、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼのアルファサブユニットおよびベータサブユニット（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸、ならびに少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。本明細書において、本開示のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子、および本開示のｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物をさらに提供する。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を治療するための方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む、方法をさらに提供する。本明細書において、ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の、身体のサイズ、骨塩量および／または骨密度を増加させるための方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、哺乳動物に投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む、方法をさらに提供する。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢの発現は、身体のサイズ、骨塩量および／または骨密度の増加をもたらす。
一部の態様において、本発明は、例えば、本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子または医薬組成物を使用する、ＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するための使用および／またはキットをさらに提供する。
Ｉ．一般的技法
本明細書に記載または参照される技法および手順は、一般に、従来的な手法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、２０１２年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３～８年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６年）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２年）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００年）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５年）；ならびにＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１年）に記載されている広く利用されている手法などを使用して、当業者により十分に理解され、一般的に利用されている。
ＩＩ．定義
「ベクター」は、本明細書に使用されるとき、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞に送達されるべき核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
本明細書に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるがこれらに限定されない。核酸の骨格は、糖およびリン酸基（ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて典型的に見出すことができるような）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。代替として、核酸の骨格は、ホスホロアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含み得、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ－ＮＨ２）または混合ホスホロアミデート－ホスホジエステルオリゴマーであり得る。加えて、二本鎖核酸は、相補的な鎖を合成し、これらの鎖を適切な条件下でアニーリングすること、またはＤＮＡポリメラーゼを適切なプライマーとともに使用して相補的な鎖をデノボ合成することのいずれかによって、一本鎖ポリヌクレオチドの化学合成産物から得ることができる。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して互換的に使用され、最小の長さのものに限定されない。アミノ酸残基のこのようなポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有し得、これらには、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸の二量体、三量体、および多量体が含まれるがこれらに限定されない。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義に包含される。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的で、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望される活性を維持する限り、天然の配列に対する欠失、付加、および置換（一般に、保存的な性質）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位指向的変異生成によるもののように意図的なものであってもよく、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーによるもののように偶発的なものであってもよい。
「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む、組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸には、少なくとも１つ、例えば、２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つ、例えば、２つの
ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接した１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含む、ポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染している（または好適なヘルパー機能を発現している）宿主細胞、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞に存在する場合、感染性ウイルス粒子において複製され、そこにパッケージングされる。ｒＡＡＶベクターが、より大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター）に組み込まれると、ｒＡＡＶベクターは、「プロベクター」と称することができ、これは、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下において複製およびキャプシド化によって「レスキュー」することができる。ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、線状人工染色体、脂質との複合体、リポソーム内に封入されたもの、および、実施形態において、ウイルス粒子、特にＡＡＶ粒子にキャプシド化されたものを含むがこれらに限定されない、多数の形態のうちのいずれかであり得る。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスキャプシドにパッケージングされて、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。
「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド化されたｒＡＡＶベクターゲノムで構成されるウイルス粒子を指す。
「異種」とは、比較される実体または導入もしくは組み込まれる実体の残りの部分の遺伝子型とは、遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技法によって異なる細胞型に導入された核酸は、異種核酸である（また、発現された場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれた細胞の配列（例えば、遺伝子またはその部分）は、そのベクターに対して異種のヌクレオチド配列である。
「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写することができ、場合によっては、適切な条件下で翻訳および／または発現することができる、核酸を指す。いくつかの態様において、導入遺伝子は、導入された細胞に所望される特性を付与するか、またはそうでなければ、所望される治療結果または診断結果をもたらす。別の態様では、導入遺伝子は、ＲＮＡ干渉を媒介する分子、例えば、ｓｉＲＮＡに転写される。
ウイルス力価に関して使用される「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」、または「ゲノムコピー」という用語は、感染力または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物におけるゲノム粒子の数は、本明細書の実施例に記載されているか、または例えばＣｌａｒｋら（１９９９年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１～１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２年）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２～２７８頁に記載されているものなどの手順によって測定することができる。
ウイルス力価に関して使用される「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」という用語は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３～１９７３頁に記載されているような、複製中心アッセイとしても知られている感染中心アッセイによって測定された、感染性および複製適合性の組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
ウイルス力価に関して使用される「形質導入単位（ｔｕ）」という用語は、本明細書の実施例に記載されているか、または例えば、Ｘｉａｏら（１９９７年）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒ
ｏｂｉｏｌ．，１４４：１１３～１２４頁；もしくはＦｉｓｈｅｒら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０～５３２頁（ＬＦＵアッセイ）に記載に記載されているような、機能性アッセイにおいて測定された、機能的導入遺伝子産物の産生をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
「逆位末端反復」または「ＩＴＲ」配列とは、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、ウイルスゲノムの末端に見られる、逆向きの比較的短い配列を指す。
当該技術分野で十分に理解されている用語である「ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）」配列とは、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの一番外側の１２５個のヌクレオチドは、２つの交互の配向のうちのいずれかで存在し得、異なるＡＡＶゲノム間における異種性、および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端間における異種性をもたらす。一番外側の１２５個のヌクレオチドはまた、自己相補的な複数の短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、およびＤ領域と示される）を含有し、鎖内塩基対合がＩＴＲのこの部分で生じることが可能である。
「末端分離配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「ｔｒｓ」は、ウイルスのＤＮＡ複製時にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質によって切断される、ＡＡＶ ＩＴＲのＤ領域内の配列である。変異体末端分離配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断に不応性である。「ＡＡＶヘルパー機能」とは、ＡＡＶが宿主細胞によって複製され、パッケージングされることを可能にする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ複製およびパッケージングを補助するヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子を含むが、これらに限定されない、多数の形式のうちのいずれかで提供される。遺伝毒性物質などの他のＡＡＶヘルパー機能が、当該技術分野において既知である。
「ＡＡＶヘルパー機能」とは、ＡＡＶが宿主細胞によって複製され、パッケージングされることを可能にする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ複製およびパッケージングを補助するヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子を含むがこれらに限定されない、多数の形式のうちのいずれかで提供される。遺伝毒性物質などの他のＡＡＶヘルパー機能が、当該技術分野において既知である。
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（欠損パブロウイルスである）が、宿主細胞によって複製され、パッケージングされるのを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、例えばワクシニア、およびバキュロウイルスを含む、多くのこのようなヘルパーウイルスが、特定されている。アデノウイルスは、多数の異なる下位群を包含するが、下位群Ｃのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が、最も一般的に使用されている。ヒト起源、非ヒト哺乳動物起源、および鳥類起源の多数のアデノウイルスが既知であり、ＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能である。これもＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能なヘルペスファミリーのウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バーウイルスウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、および偽性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。受託機関から入手可能なバキュロウイルスとしては、オートグラファカリフォルニアニュークレア多角体ウイルスが挙げられる。
参照ポリペプチド配列または核酸配列に関する「配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後に、参照ポリペプチド配列または核酸配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合として定義され、任意の保存的置換は配列同一性の一部とは見なさない。アミノ酸または核酸の配列同一性パーセントを判定する目的でのアライメントは、当業者の技能の範囲内の様々
な手段で、例えば、例としてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）、Ｓｕｐｐ．３０，節７．７．１８、表７．７．１に記載されているもの、ならびにＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含む、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して、達成することができる。潜在的なアライメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書の目的で、所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（これは、代替として、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む、所与のアミノ酸配列Ａと言い換えることができる）は、次のように計算される：分率Ｘ／Ｙを１００倍し、式中、Ｘは、配列アライメントプログラムによって、そのプログラムのＡとＢとのアライメントで同一な一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％とは等しくならないことが、理解される。本明細書の目的で、所与の核酸配列Ｄに対する所与の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（これは、代替として、所与の核酸配列Ｄに対して、ある特定の核酸配列同一性％を有するまたは含む、所与の核酸配列Ｃと言い換えることができる）は、次のように計算される：分率Ｗ／Ｚを１００倍し、式中、Ｗは、配列アライメントプログラムによって、そのプログラムのＣとＤとのアライメントで同一な一致としてスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが、核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの核酸配列同一性％は、Ｃに対するＤの核酸配列同一性％とは等しくならないことが、理解される。
「単離された」分子（例えば、核酸もしくはタンパク質）または細胞とは、それが、その天然の環境の成分から特定および分離されており、かつ／または回収されていることを意味する。
「有効量」とは、臨床結果（例えば、症状の緩和、臨床エンドポイントの達成など）を含む、有益な結果または所望される結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与することができる。疾患状態に関しては、有効量は、疾患を緩和、安定化、または疾患の発症を遅延させるのに十分な量である。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、治療的ポリペプチドまたは治療的核酸などの異種核酸の所望される量を表す。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
本明細書に使用されるとき、「治療」は、有益な臨床結果または所望される臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的で、有益な臨床結果または所望される臨床結果としては、検出可能か検出不可能かに関係なく、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（例えば、悪化しないこと）、疾患の拡散（例えば、転移）の防止、疾患進行の遅延もしくは緩慢化、疾患状態の緩和または軽減、ならびに寛解（部分的または完全に関係なく）が挙げられるがこれらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けなかった場合に予測される生存と比較して、生存を延長させることも意味し得る。
遺伝子またはコード配列への言及において使用されるとき、「Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼまたはＧＮＰＴＡＢとしても知られる）」は、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンおよびリソソーム酵素Ｄ－マンノースからの、リソソーム酵素Ｎ－アセチル－グルコサミニル－ホスホ－Ｄ－マンノースならびにＵＭＰの形成に関与する化学反応を触媒する酵素のアルファサブユニットおよびベータサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を指す（ＥＣコード２．７．８．１７）。ポリペプチドへの言及において使用されるとき、「Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ａｋａ ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼまたはＧＮＰＴＡＢ）」は前述の酵素のアルファサブユニットおよびベータサブユニットを指す（Ｋｕｄｏ，Ｍ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５年、２８０（４３）：３６１４１～９頁；Ｇｅｌｆｍａｎ，ＣＭら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２００７年、４８（１１）：５２２１～５２２８頁）。完全ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ酵素複合体は、α２サブユニット、β２サブユニットおよびγ２サブユニットを含むことが既知であり、そのアルファサブユニットおよびベータサブユニットは、酵素活性のために必要である。ＥＣコード２．７．８．１７に記載されている反応を触媒すること、および／もしくはＧＯ ｔｅｒｍ ＧＯ：０００３９７６に記載されている分子機能を実行することが、既知であるか、または予測される任意の酵素は、本開示のＧＮＰＴＡＢである。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、バリアントＧＮＰＴＡＢである。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、切断型ＧＮＰＴＡＢである。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸は、約４．７ｋｂである。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸は、約４．７ｋｂ未満である。一部の実施形態において、バリアント（例えば、切断型）ＧＮＰＴＡＢは、アルファサブユニットおよびベータサブユニットを含む。一部の実施形態において、バリアントＧＮＰＴＡＢ（例えば、切断型ＧＮＰＴＡＢ）は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、天然ＧＮＰＴＡＢと同一である。一部の実施形態において、バリアントＧＮＰＴＡＢ（例えば、切断型ＧＮＰＴＡＢ）は、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％、天然ＧＮＰＴＡＢの活性を維持する。ヒトＧＮＰＴＡＢの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０７７２８８．２およびＮＭ＿０２４３１２．４によって提供される。ヒトＧＮＰＴＡＢアミノ酸配列の例は、配列番号１によって提供される。マウスＧＮＰＴＡＢの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１００４１６４によって提供される。マウスＧＮＰＴＡＢアミノ酸配列の例は、配列番号２によって提供される。ＧＮＰＴＡＢの追加の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号が、ＸＰ＿００１１５５３３４およびＸＰ＿５０９３１２（チンパンジー）、ＸＰ＿００２６８７６８０およびＮＰ＿００１１７９１５７（ウシ）、ＸＰ＿４１６３２９（ニワトリ）、ＸＰ＿５３２６６７（イヌ）、ＸＰ＿００１４９７１９９（ウマ）、ＸＰ＿００１０７９９６７およびＸＰ＿３４３１９５（ラット）ならびにＮＰ＿００１０３８２３３（ゼブラフィッシュ）によって提供される。
「ムコリピドーシスＩＩ型」（ＭＬ ＩＩ、ＭＬ－ＩＩおよびＭＬ ＩＩ型という用語を、本明細書で互換的に使用する）および「ムコリピドーシスＩＩＩ型」（ＭＬ ＩＩＩ、ＭＬ－ＩＩＩおよびＭＬ ＩＩＩ型という用語を、本明細書で互換的に使用する）は、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の変異によって引き起こされる疾患のクラスを指す。両方の疾患は、常染色体劣性遺伝疾患である。しかしながら、ＭＬ ＩＩＩは、典型的には、ＭＬ ＩＩと比較して、ＧＮＰＴＡＢ機能のより穏和な喪失を引き起こす変異と関連する。そのため、ＭＬ ＩＩは、典型的には、ＭＬ ＩＩＩよりも、より重篤な疾患表現型をもたらす。ＭＬ ＩＩはまた、Ｉ細胞病としても既知である。ＭＬ ＩＩのさらなる説明は、ＯＭＩＭエントリー＃２５２５００に見られる。ＭＬ ＩＩＩは、偽性Ｈｕｒｌｅｒポリジストロフィーとしても既知である。ＭＬ ＩＩＩのさらなる説明は、ＯＭＩＭエントリー＃２
５２６００に見られる。
「ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ３９６５２６によって表されるニワトリのベータアクチン）に由来するポリヌクレオチド配列を指す。本明細書に使用されるとき、「ニワトリβ－アクチンプロモーター」は、Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら、（１９８９年）Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９～７７頁に記載されている配列などの、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、ニワトリβ－アクチン遺伝子のプロモーターならびに第１のエクソンおよびイントロン、ならびにウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含有するプロモーターを指す。本明細書に使用されるとき、「ＣＡＧプロモーター」という用語は、互換的に使用される。本明細書に使用されるとき、「ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター」という用語は、互換的に使用される。
短縮型ニワトリベータアクチンプロモーターは、～１０６番目の配列の上流が、プロモーター活性に著しい影響を与えることなく、欠失することができることを示す、欠失の研究に基づいて選択された（Ｑｕｉｔｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９５３９～９５４６頁、１９８９年）。
本明細書における値またはパラメーターへの「約」への言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする実施形態を含む（かつ記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
本明細書に使用されるとき、冠詞の単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、別途示されない限り、複数形の参照物が含まれる。
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含むこと」、「それらからなること」、および／または「本質的にそれらからなること」を含むことが理解される。
ＩＩＩ．ベクター
ある特定の態様において、本発明は、例えば、本明細書に記載される、方法、ｒＡＡＶ粒子および／または医薬組成物のいずれかにおける使用のために適切な、ｒＡＡＶベクターを提供する。例えば、一部の実施形態において、異種核酸（例えば、機能性ＧＮＰＴＡＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）は、本開示のｒＡＡＶベクターにより対象に送達される。
本開示のある特定の態様は、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼのアルファサブユニットおよびベータサブユニット（ＧＮＰＴＡＢ）、例えば、ＧＮＰＴＡＢポリペプチドまたは ＧＮＰＴＡＢポリペプチドをコードする核酸に関する。当該技術分野において既知であるように、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼとしても既知である）酵素は、２つのアルファサブユニット、２つのベータサブユニットおよび２つのガンマサブユニットを含む。アルファサブユニットおよびベータサブユニットは、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子（ＧＮＰＴＡ、Ｉ細胞病もしくはＩＣＤ、またはマウスのＥＧ４３２４８６もしくはｍＫＩＡＡ１２０８としても既知である）によってコードされる。ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の例としては、例えば、ヒトＧＮＰＴＡＢ（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号７９１５８で記載）およびマウスＧＮＰＴＡＢ（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号４３２４８６で記載）が挙げられる。
一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢポリペプチドは、ヒトＧＮＰＴＡＢポリペプチドである。ヒトＧＮＰＴＡＢポリペプチド配列は、限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０７７２８８が挙げられる。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である、アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢは、切断型ＧＮＰＴＡＢである。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸は、約４．７ｋｂである。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸は、約４．７ｋｂ未満である。一部の実施形態において、バリアント（例えば、切断型）ＧＮＰＴＡＢは、アルファサブユニットおよびベータサブユニットを含む。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢポリペプチドは、野生型ＧＮＰＴＡＢポリペプチドの活性の少なくとも一部（例えば、野生型ＧＮＰＴＡＢの活性の少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％のいずれか）を維持する、バリアントＧＮＰＴＡＢポリペプチド（例えば、切断型ＧＮＰＴＡＢ）である。一部の実施形態において、バリアントＧＮＰＴＡＢポリペプチド（例えば、切断型ＧＮＰＴＡＢ）は野生型ＧＮＰＴＡＢポリペプチドと比較して、より高い活性を有する（例えば、野生型ＧＮＰＴＡＢと比較して、少なくとも約１２５％、１５０％、２００％、３００％または５００％高い活性のいずれか）。
一部の実施形態において、異種核酸（例えば、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸）は、プロモーターと作動可能に連結されている。例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター、Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１年、１０８（２）：１９３～９頁）および伸長因子１－アルファプロモーター（ＥＦｌ－アルファプロモーター）（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９０年、９１（２）：２１７～２３およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９６年、３（９）：８０２～１０頁）が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、またはニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されているサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含む。一部の実施形態において、プロモーターは、改変型ＣＢＡプロモーターまたは切断型ＣＢＡプロモーターを含む。一部の実施形態において、プロモーターは、短縮型ＣＭＶエンハンサーを含む。
一部の実施形態において、ベクターは、イントロンを含む。例えば、一部の実施形態において、イントロンは、ニワトリベータアクチンおよびウサギベータグロビンに由来するキメライントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロンである。
一部の実施形態において、ベクターは、ポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む。ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）配列（例えば、受入番号ＥＦ５９２５３３を参照のこと
）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列およびＨＳＶ ＴＫ ｐＡポリアデニル化配列のように、多数のポリアデニル化配列の例が、当該技術分野で既知である。
理論に縛られることを望まないが、ＧＮＰＴＡＢコード配列の大きなサイズのため、ｒＡＡＶベクターの他のエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡ配列など）のサイズを最小化することが有利である。一部の実施形態において、本明細書で記載されるプロモーターのいずれかの短縮型バリアントが、ｒＡＡＶベクターにおいて使用される。プロモーター（例えば、上述で列挙されたプロモーター）の短縮型バリアントを生成させるための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、目的のプロモーターを、プロモーター配列に１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または置換を導入することによって変異させることができ、このようなバリアントプロモーター配列は、それぞれのプロモーター配列の制御の下、レポーターコンストラクトを含むベクターに個々にクローニングすることができる。この系は、設計された強度（例えば、産生した転写物の量）を維持する、短縮型バリアントのプロモーターを特定するために使用することができる。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶベクターは、例えば、本明細書に記載されるような、改変型、切断型およびまたは短縮型の、ＣＭＶエンハンサー／ＣＢＡプロモーターを含む。同様の方法が、転写物、ｍＲＮＡ安定性および／またはスプライシングのレベルを適切に維持する、短縮型バリアントのイントロンを特定するために使用することができる。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶベクターは、本明細書に記載される短縮型イントロンを含む。同様の方法が、転写物、ｍＲＮＡ安定性および／またはポリアデニル化のレベルを適切に維持する、短縮型バリアントのポリＡ配列を特定するために使用することができる。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶベクターは、本明細書に記載される短縮型ポリＡ配列を含む。一部の実施形態において、ＧＴＮＡＰ遺伝子は、配列番号１または２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明は、治療的ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の核酸配列および／またはｒＡＡＶウイルス粒子にパッケージングするための核酸の導入のための組換えウイルスゲノムの使用を考慮する。組換えウイルスゲノムは、治療的ポリペプチドおよび／または核酸の発現を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、本開示のＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナルおよび／または複製開始点を含む。
ＩＶ．ウイルス粒子およびウイルス粒子を産生する方法
本開示のある特定の態様は、例えば、本開示のｒＡＡＶベクターを含有する、ｒＡＡＶ粒子に関する。ＡＡＶ粒子において、核酸は、ＡＡＶ粒子にキャプシド化される。ＡＡＶ粒子はまた、キャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、核酸は、転写の方向に成分と作動可能に連結された目的のコード配列（例えば、ＧＮＰＴＡＢコード配列）、転写開始配列および転写終結配列を含む制御配列を含み、それによって発現カセットが形成される。発現カセットは、５’末端および３’末端で、少なくとも１つの機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングについて、意図するように機能することを意味する。Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００年、９７（７）３４２８～３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年、７７（１２）：７０３４～４０頁；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９年、１６：１０～１６頁を参照のこと、これらのすべては、それらの全体を参照によって本明細書に組み入れる。本発明の一部の態様を実施するために、組換えベクターは、キャプシド化に必須のＡＡＶの配列の少なくともすべて、およびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を含む。本発明のベクターにおいて使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列（例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４年、５：７９３～８０１頁
に記載されている）を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって変更されるか、またはＡＡＶ ＩＴＲは、複数のＡＡＶ血清型のいずれかに由来する。４０種類を上回るＡＡＶ血清型が現在既知であり、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが、特定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２年、９９（１８）：１１８５４～６頁；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３年、１００（１０）：６０８１～６頁；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３年、７７（１２）：６７９９～８１０頁を参照のこと。いずれのＡＡＶ血清型の使用は、本発明の範囲内であると見なされる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶ ＩＴＲなどを含むが、これらに限定されない、ＡＡＶ血清型に由来するベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲなどを含む。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６（例えば、野生型ＡＡＶ６キャプシド、または米国付与前公開第２０１２／０１６４１０６号に記載されているような、ＳｈＨ１０などのバリアントＡＡＶ６キャプシド）、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９（例えば、野生型ＡＡＶ９キャプシド、または米国付与前公開第２０１３／０３２３２２６号に記載されているような、改変型ＡＡＶ９キャプシド）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、チロシンキャプシド変異体、ヘパリン結合キャプシド変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８キャプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９キャプシド、または米国付与前公開第２０１２／００６６７８３号に記載されている任意のその他のキャプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、マウスＡＡＶキャプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キャプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公開第ＷＯ／２００３／０４２３９７号パンフレットに記載されているＡＡＶキャプシドから選択されるキャプシド化されたタンパク質を含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む。
異なるＡＡＶ血清型は、特定の標的細胞の形質導入を最適化するため、または特定の標的組織（例えば、病的な組織）内の特異的な細胞型を標的化するために使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含むことができる。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、同じＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲおよびキャプシドを含有するか、またはｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子のキャプシドとは異なるＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲを含有する。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８キャプシドおよび１つまたはそれ以上（例えば、２つの）ＡＡＶ２ ＩＴＲを含有する。
ＡＡＶ粒子の産生
トランスフェクション、安定な細胞株産生、ならびにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥら（１９９７年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（１１）：８７８０～８７８９頁）、およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｕｒａｂｅ，Ｍら、（２００２年）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３（１６）：１９３５～１９４３頁；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．（２０１１年）Ｈ
ｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０（Ｒ１）：Ｒ２～Ｒ６頁）を含む感染性ハイブリッドウイルス産生システムを含む、ｒＡＡＶベクターの産生のための多数の方法が、当該技術分野で既知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養物は、１）適切な宿主細胞、２）適切なヘルパーウイルス機能、３）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接した核酸（治療的核酸など）（例えば、ＧＮＰＴＡＢをコードするＡＡＶゲノム）；ならびに５）ｒＡＡＶ産生を補助するのに適切な培地および培地成分のすべてを必要とする。一部の実施形態において、適切な宿主細胞は、霊長類の宿主細胞である。一部の実施形態において、適切な宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、２９３細胞またはＰｅｒｃ．６細胞などの、ヒト由来細胞株である。一部の実施形態において、適切なヘルパーウイルス機能は、野生型アデノウイルスまたは変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝子産物は、任意のＡＡＶ血清型に由来する。強制するものではないが、一般に、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物は、ｒｅｐ遺伝子産物が、ｒＡＡＶゲノムを複製し、パッケージングするように機能する限り、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型のものである。当該技術分野で既知の適切な培地が、ｒＡＡＶベクターの産生のために使用される。これらの培地としては、限定されるものではないが、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製およびＪＲＨ製の培地、米国特許第６，５６６，１１８号に記載のものなどの特注の配合物、および米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地が挙げられ、これらのそれぞれは、特に、組換えＡＡＶベクターの産生において使用するための特注の培地配合物に関して、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞）である。
ｒＡＡＶ粒子を産生するための１つの方法は、トリプルトランスフェクション法である。簡潔には、ｒｅｐ遺伝子およびキャプシド遺伝子を含有するプラスミドを、ヘルパーアデノウイルスプラスミドと一緒に、細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞）に、（例えば、リン酸カルシウム法を使用して）トランスフェクトし、ウイルスを、回収し、場合により、精製する。このように、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の、宿主細胞へのトリプルトランスフェクションによって産生され、宿主細胞への核酸のトランスフェクションにより、ｒＡＡＶ粒子を産生する能力を有する宿主細胞が生成する。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、産生細胞株法によって産生される（Ｍａｒｔｉｎら（２０１３年）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３～２６９頁；米国付与前公開第２００４／０２２４４１１号；およびＬｉｕ，Ｘ．Ｌ．ら（１９９９年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：２９３～２９９頁を参照のこと）。簡潔には、細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株、２９３細胞株、Ａ５４９細胞株、またはＰｅｒｃ．６細胞株）は、ｒｅｐ遺伝子、キャプシド遺伝子、およびプロモーター－異種核酸配列を含むベクターゲノム（例えば、ＧＮＰＴＡＢ）を含有するプラスミドを、安定にトランスフェクトされる。細胞株をスクリーニングして、ｒＡＡＶ産生のためのリードクローンを選択し、次いで、これを、産生バイオリアクターに展開し、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶ）を感染させて、ｒＡＡＶ産生を開始する。続いて、ウイルスを採取し、アデノウイルスを不活性化（例えば、熱により）および／または除去
し、ｒＡＡＶ粒子を精製する。このように、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含む、産生細胞株によって産生させた。本明細書に記載されるように、産生細胞株法は、トリプルトランスフェクション法と比較して、オーバーサイズゲノムを有するｒＡＡＶ粒子の産生に有利である。
一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株において安定に維持される。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１つまたはそれ以上のプラスミドで細胞株に導入され、産生細胞株を生成する。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態において、プラスミドを安定にトランスフェクトされた細胞株は、複数回の細胞株継代（例えば、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、または５０回を上回る、細胞の継代）にわたって、プラスミドを維持する。例えば、プラスミドは、細胞複製物として複製されるか、またはプラスミドは、細胞ゲノムに組み込まれる。プラスミドを細胞（例えば、ヒト細胞）において自律的に複製することを可能にする様々な配列が、特定されている（例えば、Ｋｒｙｓａｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９８９年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：１０２６～１０３３頁を参照のこと）。一部の実施形態において、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする、選択的マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有する。哺乳動物細胞において一般的に使用される選択的マーカーとしては、限定されるものではないが、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ｚｅｏｃｉｎ、ピューロマイシンおよびこれらの誘導体が挙げられる。核酸を細胞に導入するための方法は、当該技術分野で既知であり、限定されるものではないが、ウイルス形質導入、カチオン性トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストランなどのカチオン性ポリマーまたはリポフェクタミンなどのカチオン性脂質を使用する）、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、微粒子銃、エレクトロポレーションおよびナノ粒子トランスフェクションが挙げられる（さらなる詳細については、例えば、Ｋｉｍ，Ｔ．Ｋ．およびＥｂｅｒｗｉｎｅ，Ｊ．Ｈ．（２０１０年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３９７：３１７３～３１７８頁を参照のこと）。
一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株のゲノムに安定に組み込まれる。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１つまたはそれ以上のプラスミドで細胞株に導入され、産生細胞株を生成する。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態において、ＡＡＶ
ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態において、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする、選択的マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有する。様々な宿主細胞株に核酸を安定に組み込むための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、反復選択（例えば、選択的マーカーの使用による）が、選択的マーカー（およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノム）を含有する核酸が組み込まれている細胞を選択するために使用される。他の実施形態において、核酸は、部位特異的な方式で細胞株に組み込まれて、産生細胞株が生成する。ＦＬＰ／ＦＲＴ（例えば、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１～１３５５頁を参照のこと）、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｂ．およびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５１６６～５１７０
頁を参照のこと）、およびｐｈｉ Ｃ３１－ａｔｔ（例えば、Ｇｒｏｔｈ，Ａ．Ｃ．ら（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５９９５～６０００頁を参照のこと）などの、いくつかの部位特異的な組換え系が、当該技術分野で既知である。
一部の実施形態において、産生細胞株は、霊長類細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株またはＦＲｈＬ－２細胞株などの非ヒト霊長類細胞株）に由来する。一部の実施形態において、細胞株は、ヒト細胞株に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞に由来する。例えば、産生細胞株を生成するための、細胞株へのＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびに／またはオーバーサイズｒＡＡＶゲノムをコードする核酸の導入ならびに／または安定な維持／組み込みの前に、細胞株は、ＨｅＬａ細胞株、２９３細胞株、Ａ５４９細胞株、もしくはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞株、またはこれらの派生物である。
一部の実施形態において、産生細胞株は、懸濁液中での増殖に適合する。当該技術分野で既知であるように、足場依存性細胞は、典型的に、マイクロキャリアビーズなどの基質なしで、懸濁液中で増殖することができない。懸濁液中での増殖に細胞株を適合させることには、例えば、撹拌パドルを用いて撹拌培養で細胞株を増殖させること、凝集塊化を防止するためにカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを欠く培養培地（および場合により、消泡剤）を使用すること、シリコン処理化合物でコーティングした培養容器を使用すること、ならびに各継代で（大きな凝集塊中または容器の側面ではなく）培養物中の細胞を選択することが含まれる。さらなる説明については、例えば、ＡＴＣＣのよくある質問文書（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｇｌｏｂａｌ／ＦＡＱｓ／９／１／Ａｄａｐｔｉｎｇ％２０ａ％２０ｍｏｎｏｌａｙｅｒ％２０ｃｅｌｌ％２０ｌｉｎｅ％２０ｔｏ％２０ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－４０．ａｓｐｘで入手可能）およびその引例を参照のこと。
一部の態様において、本明細書に開示されるいずれかのｒＡＡＶ粒子を産生するための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が産生される条件下で、（ｉ）ＡＡＶ複製タンパク質および／またはキャプシド化タンパク質をそれぞれがコードする１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲが隣接した、本明細書に記載される異種核酸をコードする核酸を含むｒＡＡＶプロベクター、ならびに（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパー機能を含む宿主細胞を培養すること；ならびに（ｂ）宿主細胞によって産生されたｒＡＡＶ粒子を回収することを含む方法が、提供される。一部の実施形態において、前記少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲなどからなる群から選択される。例えば、一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、前記キャプシド化タンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２
Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶキャプシドのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドタンパク質、またはこれらの変異体からなる群から選択される。一部の実施形態において、キャプシド化タンパク質は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８キャプシド、およびＡＡＶ２ ＩＴＲを含む組換えゲノム、ならびに治療的導入遺伝子／核酸をコードする核
酸（例えば、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸）を含む。
本発明の適切なｒＡＡＶ産生培養培地には、血清または血清由来の組換えタンパク質が０．５％～２０％（Ｖ／ＶまたはＷ／Ｖ）のレベルで補充される。あるいは、当該技術分野で既知であるように、ｒＡＡＶベクターは、血清不含条件において産生し、これは、動物由来産物不含培地とも称する。当業者であれば、ｒＡＡＶベクターの産生を補助するように設計された市販または特注の培地が、産生培養物におけるｒＡＡＶの力価を増加させるために、限定されるものではないが、グルコース、ビタミン、アミノ酸および／または成長因子を含む、当該技術分野で既知の１つまたはそれ以上の細胞培養成分も補充されることを、理解する。
ｒＡＡＶ産生培養物は、特定の宿主細胞を利用するのに適切な様々な条件（広い温度範囲にわたって、様々な長さの時間など）下、増殖させることができる。当該技術分野で既知であるように、ｒＡＡＶ産生培養物は、例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、および充填床もしくは流動床バイオリアクターなどの適切な接着依存性の容器中で培養することができる、接着依存性の培養物を含む。ｒＡＡＶベクター産生培養物はまた、例えば、撹拌フラスコ、撹拌槽バイオリアクター、およびＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てのシステムを含む、様々な方法で培養することができる、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞およびＳＦ－９細胞などの懸濁液適合宿主細胞も含む。
米国特許第６，５６６，１１８号により完全に記載されているように、本発明のｒＡＡＶベクター粒子は、産生培養物の宿主細胞の溶解によって、または細胞が、無傷の細胞から培地中にｒＡＡＶ粒子を放出させるような当該技術分野で既知の条件下で培養されるならば、産生培養からの使用済み培地の採取によって、ｒＡＡＶ産生培養物から採取される。細胞を溶解させる適切な方法はまた、当該技術分野で既知であり、例えば、複数回の凍結／解凍サイクル、超音波処理、顕微溶液化ならびに界面活性剤および／またはプロテアーゼなどの化学物質での処理を含む。
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、精製される。本明細書で使用される「精製された」という用語は、ｒＡＡＶ粒子が天然に生じる場合、または最初に調製された場合にも存在する、他の成分の少なくともいくつかを含まない、ｒＡＡＶ粒子の調製物を含む。したがって、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子は、培養溶解物または産生培養上清などの原料混合物から、それを濃縮するために精製技法を使用して、調製される。濃縮は、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合によって、または感染力によって、のような様々な方法で測定することができ、あるいは、濃縮は、原料混合物中に存在する第２の潜在的な干渉物質、例えば、例えば、ヘルパーウイルス、培地成分などを含む、産生培養混入物またはプロセス中の混入物を含む混入物に関連して測定することができる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ産生培養採取物は、宿主細胞デブリが除去するために清澄化される。一部の実施形態において、産生培養採取物は、例えば、グレードＤＯＨＣのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ Ｐｏｄ Ｆｉｌｔｅｒ、グレードＡ１ＨＣのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ Ｐｏｄ Ｆｉｌｔｅｒ、および０．２μｍのＦｉｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ１Ｏ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅフィルターを含む、一連のデプスフィルターを通じるろ過によって、清澄化される。清澄化は、遠心分離または当該技術分野で既知の細孔サイズが０．２μｍもしくはそれ以上の任意の酢酸セルロースフィルターを通じるろ過など、当該技術分野で既知の様々な他の標準的な技法によって達成することもできる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ産生培養採取物は、産生培養物中に存在する任意の高分子量のＤＮＡを消化するために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）でさらに処理される。一部の実施形態において、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化は、例えば、３０分間～数時間の時間、周囲温度から３７℃の範囲の温度で、最終濃度１～２．５単位／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を含む、当該技術分野で既知の標準的な条件下、行われる。
ｒＡＡＶ粒子は、以下の精製工程：平衡遠心分離；フロースルーアニオン交換ろ過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するためのタンジェントフローろ過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱失活；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノろ過；およびアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉、の１つまたはそれ以上を使用して、単離または精製することができる。これらの工程は、単独、様々な組合せ、または異なる順序で、使用される。一部の実施形態において、本方法は、以下に記載される順序で、すべての工程を含む。ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法は、例えば、Ｘｉａｏら（１９９８年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４～２２３２頁；米国特許第６，９８９，２６４号および米国特許第８，１３７，９４８号；ならびに国際公開第ＷＯ２０１０／１４８１４３号パンフレットに見られる。
Ｖ．治療の方法
本開示のある特定の態様は、ムコリピドーシスＩＩ型および／もしくはムコリピドーシスＩＩＩ型を治療する方法、または、ムコリピドーシスＩＩ型もしくはムコリピドーシスＩＩＩ型を有する哺乳動物における、体のサイズを増加させる方法、骨塩量を増加させる方法または骨密度を増加させる方法に関する。これらの方法は、一部分において、ＧＮＰＴＡＢのＡＡＶ－媒介発現が、マウスの疾患モデルにおける、骨成長障害などのＭＬ ＩＩの症状を緩和することができるという本明細書に記載された発見に基づく。上述のように、両方の疾患は、触媒のＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼのアルファサブユニットおよびベータサブユニットをコードする、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の機能欠失変異によって引き起こされる。
ＭＬ ＩＩは、ＧＮＰＴＡＢの変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患として既知である。ＧＮＰＴＡＢ活性は、マンノース－６－ホスフェートをタンパク質に付加するために必要であり、それによって、それらをリソソームに輸送するためにマーキングする。ＧＮＰＴＡＢ活性がない場合、リソソームタンパク質（例えば、リソソームヒドロラーゼ）は、代わりに、細胞外に分泌される。結果として、グリコサミノグリカン、脂質およびオリゴ糖などの、通常、リソソーム中で破壊される物質が、細胞内に蓄積し、大きな封入体の存在がもたらされる。ＭＬ ＩＩは、これらの封入体細胞（「Ｉ細胞」）の存在に起因して、Ｉ細胞病とも称し、これは、顕微鏡によって特定される。ＭＬ ＩＩの症状は、しばしば、出生後直ぐに存在し、骨格異常、低身長、弱い筋緊張、筋緊張の欠如（低血圧症）、ヘルニア（例えば、膨隆した腹部、臍ヘルニア）、股関節脱臼および関節変形、心拡大、僧帽弁の肥厚および機能不全、気道の進行性粘膜肥厚、粗くおよび／または騒々しい呼吸、頻繁な呼吸器感染、便秘、下痢、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、ならびに発育遅延、特に、発声および運動技能、認知障害が挙げられる。これらの症状は、ＭＬ ＩＩの患者を衰弱させ、典型的には、独立して歩くことができず、幼年期を超えて生存しない。
ＭＬ ＩＩのように、ＭＬ ＩＩＩは、ＧＮＰＴＡＢの変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患として、当該技術分野において既知である。しかしながら、ＭＬ ＩＩと比較して、ＭＬ ＩＩＩは、典型的には、ＧＮＰＴＡＢにおける、より弱い機能欠失
変異をもたらし、それによって、より穏やかな疾患表現型によって特徴づけられる。ＭＬ
ＩＩＩの症状は、３～５歳になるまで、完全には明らかではなく、重症度はかなりの可変性であり、一部の患者は６０歳を超えて生き、他の患者は幼年期を超えて生存しない。ＭＬ ＩＩＩの症状としては、典型的には、骨格異常、低身長、大動脈弁疾患、角膜薄濁、軽度の器官拡張、運動機能の喪失および関節異常が挙げられる。ＭＬ ＩＩＩはまた、偽性Ｈｕｒｌｅｒポリジストロフィーとも称する。より詳細な説明、ならびにＭＬ ＩＩおよびＭＬ ＩＩＩの患者において見出される特異的な変異は、例えば、Ｐａｉｋ，Ｋ．Ｈ．ら（２００５年）Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ．２６（４）：３０８～１４頁を参照のこと。
ＭＬ ＩＩおよびＭＬ ＩＩＩのための様々な診断検査が、当該技術分野において既知である。一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩは、血清試料または他の患者の試料（例えば、皮膚試料または培養された線維芽細胞）中の、１つまたはそれ以上のリソソーム酵素の活性を測定することによって、診断される。血清中でのある特定のリソソーム酵素の活性は、正常な患者よりも、ＭＬ ＩＩ患者では、５～２０倍高い。同様に、ＭＬ ＩＩＩでは、これらの酵素の血清活性は、１０倍まで上昇する。これらの酵素としては、限定されるものではないが、ベータ－Ｄ－ヘキソサミニダーゼ（ＥＣコード３．２．１．５２）、ベータ－Ｄ－グルクロニダーゼ（ＥＣコード３．２．１．３１）、ベータ－Ｄ－ガラクトシダーゼ（ＥＣコード３．２．１．２３）、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ（ＥＣコード３．２．１．５１）およびアルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＥＣコード３．２．１．２４）が挙げられる。対照的に、培養された線維芽細胞中でのこれらの活性は、欠損している。一部の実施形態において、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ活性は、ＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを診断するために、測定される。一部の実施形態において、試料が、正常な患者の試料からの活性と比較して、１％未満のＮ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼの活性を示す患者は、ＭＬ ＩＩと診断される。一部の実施形態において、試料が、正常な患者の試料からの活性と比較して、１％～１０％の間のＮ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼの活性を示す患者は、ＭＬ ＩＩと診断される。
一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩは、変異についてのＧＮＰＴＡＢの遺伝子座（例えば、コード配列、プロモーター／イントロン配列、または任意の他の制御配列）を配列決定することによって、診断される。ＭＬ ＩＩおよびＭＬ
ＩＩＩは、尿の多糖類および／または尿のグリコサミノグリカンの増加によっても特徴づけられるが、これらの症状は、ＭＬ ＩＩおよびＭＬ ＩＩＩに特異的ではない。一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩは、絨毛膜の試料を調べることによって、例えば、トロホブラストの組織診によって、出生前に診断される（例えば、Ｐｏｅｎａｒｕ，Ｌ．ら（１９８４年）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３６（６）：１３７９～８５頁を参照のこと）。上述するように、ＭＬ ＩＩにおいて、患者の試料（例えば、線維芽細胞）からのＩ細胞はまた、顕微鏡法によって特定される。
一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩのための治療（例えば、本開示の遺伝子治療ベクター）は、治療の効能のために試験される。例えば、一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩのための治療は、身長増加、骨塩量、骨密度の増加をもたらし、本明細書に記載されるＭＬ ＩＩおよび／もしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の緩和をもたらす。ｒＡＡＶ投与の有効性は、本明細書に記載されるいくつかの診断基準によってモニターすることができる。例えば、本発明の方法を使用して対象を治療後、対象は、例えば、本明細書に記載されるものを含む１つまたはそれ以上の臨床パラメーターによって、疾患状態の１つもしくはそれ以上の兆候または症状の進行における、改善および／または安定化および／または遅延について評価される。このような試験の例は、当該技術分野において既知であり、客観的および主観
的な（例えば、対象が報告した）測定を含む。
一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢの発現は、治療の効能をモニターするために測定される。ＧＮＰＴＡＢ発現の測定は、ＧＮＰＴＡＢ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を測定することを指す。ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を測定するための様々な方法が当該技術分野において既知であり、限定されるものではないが、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット法、ＲＮＡ－ｓｅｑ、半定量的ＰＣＲ、ウエスタンブロット法、質量分析法、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。
一部の実施形態において、限定されるものではないが、ベータ－Ｄ－ヘキソサミニダーゼ（ＥＣコード３．２．１．５２）、ベータ－Ｄ－グルクロニダーゼ（ＥＣコード３．２．１．３１）、ベータ－Ｄ－ガラクトシダーゼ（ＥＣコード３．２．１．２３）、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ（ＥＣコード３．２．１．５１）およびアルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＥＣコード３．２．１．２４）を含む、１つまたはそれ以上のリソソーム酵素の活性は、治療の効能をモニターするために、患者の試料（例えば、血清試料）において測定される。血清中のリソソーム酵素活性の減少は、効能を示す。
一部の実施形態において、関節または手足の機能の改善は、効能を示す。一部の実施形態において、発声の改善は、効能を示す。一部の実施形態において、運動機能の改善は、効能を示す。一部の実施形態において、成長速度の増加（例えば、体長増加の増加）は、効能を示す。一部の実施形態において、本明細書の実施例に記載されるように、骨密度、骨塩量および／または成長（例えば、体長）は、治療の効能をモニターするために評価される。体長をモニターするための方法は、当業者に周知である。骨密度および骨塩量をモニターするための試験（例えば、骨密度測定試験）もまた、（例えば、本明細書に記載されるように）当業者に周知であり、限定されるものではないが、二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）スキャン、末梢の二重エネルギーＸ線吸収測定（Ｐ－ＤＥＸＡ）スキャン、二重光子吸収法（ＤＰＡ）およびコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンが挙げられる。
一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩのための治療（例えば、本開示の遺伝子治療ベクター）は、動物モデルにおいて試験される。ＭＬ ＩＩおよびＭＬ ＩＩＩのための動物モデルが、当該技術分野において既知である。一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩのための治療は、本明細書の実施例で記載される、遺伝子組換えマウスモデルなどのマウスモデルで試験される。一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩのための治療は、ＭＬ ＩＩのためのネコのモデルで試験される（さらなる説明については、Ｍａｚｒｉｅｒ，Ｈ．ら（２００３年）Ｊ．Ｈｅｒｅｄ．９４（５）：３６３～７３頁またはＢｏｓｓｈａｒｄ，Ｎ．Ｕ．ら（１９９６年）Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．３３（１）：１～１３頁を参照のこと）。
特定のｒＡＡＶベクターおよび組成物の選択は、個々のヒトの医療歴および状態の特徴ならびに治療される個体を含むが、これらに限定されない、多くの異なる因子に依存する。このような特徴および適切な治療レジメンの設計の評価は、最終的には、処方医師の責任である。
一部の態様において、本発明は、本開示のｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することによる、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩを治療する方法を提供する。ｒＡＡＶは、目的の特定の組織に投与されるか、または、全身的に投与される。一部の実施形態において、有効量のｒＡＡＶは、非経口的に投与される。非経口の投与経路としては、限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、骨内、動脈内、大脳内、筋肉内、髄腔内、皮下、脳室内、肝臓内などが挙げられる。一部の実施形態において、有効量のｒＡＡＶは、１つの投与
経路を通じて投与される。一部の実施形態において、有効量のｒＡＡＶは、２つ以上の投与経路の組合せを通じて投与される。一部の実施形態において、有効量のｒＡＡＶは、１つの場所に投与される。他の実施形態において、有効量のｒＡＡＶは、２つ以上の場所に投与される。
有効量のｒＡＡＶは（一部の実施形態において、粒子の形態で）、治療の目的に応じて、投与される。例えば、低い割合の形質導入で、所望される治療効果を達成することができる場合、したがって、治療の目的は、通常、このレベルの形質導入を満たすか、またはそれを上回ることである。一部の事例において、このレベルの形質導入は、所望される組織型の標的細胞の約１～５％のみの形質導入、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約２０％、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約５０％、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約８０％、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約９５％、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成することができる。ｒＡＡＶ組成物は、同じ手順の間に、または数日間、数週間、数カ月間、もしくは数年間の間を空けてのいずれかで、１回またはそれ以上の投与によって投与される。本明細書に記載される投与経路のいずれか１つまたはそれ以上を使用することができる。一部の実施形態において、ヒトを治療するために、複数のベクターが使用される。
ＡＡＶウイルス粒子によって形質導入された細胞を特定するための方法は、当該技術分野において既知であり；例えば、免疫組織化学的検査もしくは高感度緑色蛍光タンパク質などのマーカーの使用を、ウイルス粒子；例えば、アミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を有するｒＡＡＶキャプシドを含むウイルス粒子の形質導入を検出するために使用することができる。
一部の実施形態において、有効量のｒＡＡＶ粒子は、２つ以上の場所に、同時または連続して投与される。他の実施形態において、有効量のｒＡＡＶ粒子は、単一の場所に、２回以上投与される（例えば、繰り返して）。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間または２４時間以下の時間を空ける。
有効量のｒＡＡＶは（一部の実施形態において、粒子の形態で）、治療の目的に応じて、投与される。例えば、低い割合の形質導入で、所望される治療効果を達成することができる場合、したがって、治療の目的は、通常、このレベルの形質導入を満たすか、またはそれを上回ることである。一部の事例において、このレベルの形質導入は、標的細胞の約１～５％のみの形質導入、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約２０％、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約５０％、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約８０％、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約９５％、一部の実施形態では、所望される組織型の細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成することができる。ｒＡＡＶ組成物は、同じ手順の間に、または数日間、数週間、数カ月間、もしくは数年間の間を空けてのいずれかで、１回またはそれ以上の投与によって投与される。一部の実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）を治療するために、複数のベクターが使用される。
一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶ組成物は、ヒトへの投与のために使用される。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶ組成物は、小児の投与のために使用される。理論に縛られることを望まないが、ＭＬ ＩＩおよびＭＬ ＩＩＩの症状の多くは、自然に発症するので（例えば、成長、手足および関節の異常；発声および運動の遅延）、生存中に可能な限り早く、ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩを治療することが特に有利である。一部の実施形態において、有効量のｒＡＡＶは（一部の実施形態において、
粒子の形態で）、１カ月未満、２カ月未満、３カ月未満、４カ月未満、５カ月未満、６カ月未満、７カ月未満、８カ月未満、９カ月未満、１０カ月未満、１１カ月未満、１歳未満、１３カ月未満、１４カ月未満、１５カ月未満、１６カ月未満、１７カ月未満、１８カ月未満、１９カ月未満、２０カ月未満、２１カ月未満、２２カ月未満、２歳未満または３歳未満の患者に投与される。
一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶ組成物は、若年成人への投与のために使用される。一部の実施形態において、有効量のｒＡＡＶは（一部の実施形態において、粒子の形態で）、１２歳未満、１３歳未満、１４歳未満、１５歳未満、１６歳未満、１７歳未満、１８歳未満、１９歳未満、２０歳未満、２１歳未満、２２歳未満、２３歳未満、２４歳未満または２５歳未満の患者に投与される。
ＶＩ．キットまたは製品
本明細書に記載されるｒＡＡＶベクター、粒子および／または医薬組成物は、例えば、本明細書に記載される本発明の方法の１つにおける使用のために設計された、キットまたは製品内に含有される。
一般に、システムは、本発明の方法における使用のために適切な、カニューレ、１つまたはそれ以上のシリンジ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）、および１つまたはそれ以上の液体（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）を含む。
シリンジは、液体の送達のためにカニューレに連結できるものである限り、任意の適切なシリンジである。一部の実施形態において、システムは、１つのシリンジを有する。一部の実施形態において、システムは、２つのシリンジを有する。一部の実施形態において、システムは、３つのシリンジを有する。一部の実施形態において、システムは、４つまたはそれ以上のシリンジを有する。本発明の方法における使用のために適切な液体は、本明細書に記載されるもの、例えば、本明細書に記載される有効量の１つまたはそれ以上のベクターをそれぞれ含む１つまたはそれ以上の液体、および１つまたはそれ以上の治療薬剤を含む１つまたはそれ以上の液体を含む。
一部の実施形態において、キットは、単一の液体（例えば、有効量のベクターを含む薬学的に許容される液体）を含む。一部の実施形態において、キットは、２つの液体を含む。一部の実施形態において、キットは、３つの液体を含む。一部の実施形態において、キットは、４つまたはそれ以上の液体を含む。液体としては、希釈剤、緩衝液、賦形剤、または本開示のＡＡＶベクター組成物の送達、希釈、安定化、緩衝化もしくはそうでなければ輸送のために適切な、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で既知の任意の他の液体が挙げられる。一部の実施形態において、キットは、１つまたはそれ以上の緩衝液、例えば、ｐＨ緩衝水溶液を含む。緩衝液の例としては、限定されるものではないが、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、および他の有機酸緩衝液が挙げられる。
一部の実施形態において、キットは、容器を含む。適切な容器としては、例えば、バイアル、バッグ、シリンジおよびボトルが挙げられる。容器は、ガラス、金属またはプラスチックなどの、１つまたはそれ以上の物質製である。一部の実施形態において、容器は、本開示のｒＡＡＶ組成物を保持するために使用される。一部の実施形態において、容器は、液体および／または他の治療薬剤も保持する。
一部の実施形態において、キットは、本開示のｒＡＡＶ組成物とともに、追加の治療薬剤を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療薬剤は、混合される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療薬剤は、別々に保持され
る。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療薬剤は、同じ容器中にある。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療薬剤は、異なる容器中にある。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療薬剤は、同時に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療薬剤は、同じ日に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、追加の治療薬剤の投与の、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、２カ月以内、３カ月以内、４カ月以内、５カ月以内または６カ月以内に投与される。
一部の実施形態において、キットは、ＡＡＶの投与の前に免疫系を一時的に抑制するための治療薬剤を含む。一部の実施形態において、患者は、ＡＡＶ粒子に対するＴ細胞応答を阻害するために、ウイルス注射の直前および後に、一時的に免疫が抑制される（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５：１８０～１８８頁、２０１４年を参照のこと）。一部の実施形態において、キットは、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチルおよび／またはメチルプレドニゾロンをさらに提供する。
本発明のｒＡＡＶ粒子および／または組成物は、使用のための説明書を含めて、キット内にさらに包装される。一部の実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物の送達（例えば、本明細書に記載される任意の種類の非経口投与）のためのデバイスをさらに含む。一部の実施形態において、使用のための説明書は、本明細書に記載される方法の１つによる説明書を含む。一部の実施形態において、説明書は、容器に提供される（例えば、貼付される）ラベルに印刷される。一部の実施形態において、使用のための説明書は、例えば、ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）および／またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を治療するため、身体のサイズを増加させるため、骨塩量を増加させるため、および／または骨密度を増加させるために、哺乳動物（例えば、ヒト）に、有効量のｒＡＡＶ粒子を投与するための説明書を含む。
ＶＩＩ．動物モデル
本発明はムコリピドーシスＩＩの動物モデルを提供する。ＧＮＰＴＡＢ変異マウスは、標準的な方法を使用して、宿主のブラストシストへの胚性幹（ＥＳ）細胞クローンのマイクロインジェクションによって生成される。簡潔には、マウスＧＮＰＴＡＢ遺伝子座の標的の破壊は（例えば、エクソン１２～エクソン２０を欠失させた）、レポーターまたは選択的マーカー遺伝子を含有する置換ベクターでの相同組換えによって行われる。すべての子孫は、テールスニップＤＮＡにおけるポリメラーゼ連鎖反応解析により遺伝子型が特定された。本研究において使用されるすべてのマウスは、野生型（＋／＋）マウスまたはヘテロ接合性（＋／－）マウスもしくはホモ接合性（－／－）マウスとして特定されたオスであった。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の少なくとも１つのアレルは、エクソン１２およびエクソン２０の間に位置する欠失を含む。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の少なくとも１つのアレルは、エクソン１２およびエクソン２０にまたがる欠失を含む。一部の実施形態において、欠失は、エクソン１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の１つまたはそれ以上の欠失を含む。一部の実施形態において、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の一部は、レポーターおよび／または選択的マーカーをコードする遺伝子によって置き換えられている。一部の実施形態において、選択的マーカーは、ネオマイシンに対する耐性を付与する。一部の実施形態において、動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル）である。一部の実施形態において、哺乳動物は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）である。一部の実施形態において、動物は、免疫適格性または免疫不全性である。一部の実施形態において、動物モデルは、遺伝子組換え動物を含む。ＭＬ ＩＩの他のマウスモデルは、Ｇｅｌｆｍａｎら（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｍ．Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ．２００７年、４８：５２２１～５２２８頁）およびＰａｔｏｎ，Ｌ．ら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ
．２０１４年、２８９（３９）：２６７０９～２１頁）によって提供される。
一部の態様において、本発明は、ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ ＩＩ）の治療のための薬剤を評価するための方法であって、本明細書において記載される動物モデルに薬剤を投与することを含み、ＭＬ ＩＩの１つまたはそれ以上の症状の緩和が、薬剤がＭＬ ＩＩの有益な治療を提供することを示す、方法を提供する。一部の実施形態において、ＭＬ ＩＩの症状は、体重の減少、骨密度の減少、骨塩量の減少、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘および／または下痢である。一部の実施形態において、薬剤は、小分子、ポリペプチド、抗体、核酸または組換えウイルス粒子である。
本発明は、以下の実施例への言及によって、より完全に理解されるであろう。しかしながら、これらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例および実施形態は、実例の目的のためのみであること、ならびにそれらを考慮して様々な改変または変更を当業者に示唆するものであって、様々な改変または変更が、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
実施例１：ＧＮＰＴＡＢノックアウトマウスの生成および特性評価
ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ型またはＭＬ－ＩＩ、IＩ細胞病としても知られ
る；ＯＭＩＭエントリー＃２５２５００）は、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）の欠損によって引き起こされる常染色体劣性のリソソーム蓄積障害である。線維芽細胞の細胞質における多数の封入体の存在、ムコ多糖尿の欠如、血清中のリソソーム酵素活性の増加、およびＧｌｃＮＡｃ－ホスホトランスフェラーゼ活性の低下は、この疾患の特質である。ＭＬ ＩＩ型の病理を研究するために、ＧＮＰＴＡＢノックアウト（ＫＯ）マウスを、発生させ、特性を評価した。
方法
ＡＡＶ２／８－ＧＮＰＴＡＢコンストラクトの生成
マウスＧＮＰＴＡＢのコード配列を増幅し、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）によって、マウスにおける発現のためにコドン最適化した。ＧＮＰＴＡＢ ｃＤＮＡの大きなサイズおよびＡＡＶの制限された容量のために、ｃＤＮＡは、いずれの利用可能なベクターにも適さない。したがって、ＣＭＶエンハンサーおよびニワトリベータアクチンプロモーターの短縮型ならびに非常に小さなイントロンを含有する新たな発現カセットを設計した。全長ＧＮＰＴＡＢ ｍＲＮＡの発現を、インビトロでのＨＥＫ２９３細胞の一過性の感染、続いて、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって確認した。このＡＡＶ２／８－ＧＮＰＴＡＢを精製し、－７０℃で保管し、２．５×１０１２ＤＮａｓｅ耐性粒子／ｍＬの濃度で使用した。短縮型エンハンサーおよびプロモーター配列を、これらの研究のために使用した。
動物
ＧＮＰＴＡＢ変異マウスを、標準的な方法を使用して、宿主のブラストシストへの胚性幹（ＥＳ）細胞クローンのマイクロインジェクションによって生成させた。簡潔には、マウスＧＮＰＴＡＢ遺伝子座の標的の破壊を（エクソン１２～エクソン２０を欠失させた）、ネオマイシン耐性遺伝子を含有する置換ベクターでの相同組換えによって行った。本研究に使用されるマウスは、混合した遺伝的背景であった（１２９／ＳｖおよびＣ５７ＢＬ／６）。すべての子孫は、テールスニップＤＮＡにおけるポリメラーゼ連鎖反応解析により遺伝子型が特定された。本研究において使用されるすべてのマウスは、野生型（＋／＋
）マウスまたはヘテロ接合性（＋／－）マウスもしくはホモ接合性（－／－）マウスとして特定されたオスであった。
マウスを、１２時間の明暗サイクル下、コロニー室で、ケージあたり２～５頭の群で収容した。げっ歯類の餌（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ＃８６０４、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）および水は自由に摂取可能とした。動物の管理は、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、１９９６年）に記載されているガイドラインに従って実施した。
ベクター注射
ＰＢＳまたはＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢの単回の両側ｉ．ｖ．注射を６週齢のＧＮＰＴＡＢ
ＫＯマウスに行った。ＰＢＳを注射された野生型マウスまたはヘテロ接合性マウスの群を、対照群とした。ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢを注射されたそれぞれのマウスは、３×１０１１ベクター粒子を投与された。免疫応答を低減または除去するために、抗ＣＤ４０リガンド抗体（ＭＲＩ）を、単独で、Ｈａｌｂｅｒｔら（１９９８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９７９５～９８０５頁によるプロトコールに従って注射した。
成長学
すべてのマウスを、電子デジタルキャリパーを使用して、総体重（ｇ）および体長（鼻端－肛門の距離、ｍｍ）を測定することによって、毎週、調べた。
組織学
１０月齢の野生型マウスおよびＧＮＰＴＡＢ－／－マウスを鎮静させ、ＰＢＳで心臓を経由して灌流させた。灌流に続いて、大腿骨を取り出し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定し、０．５ＭのＥＤＴＡで脱灰し、パラフィン包埋した。大腿骨片（４μＭ）を、ヘマトキシリン－エオシンで染色した。４℃でのスライドのスキャニングおよび解析のために、Ａｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＡＴ（ｖ１０１．０）を使用した。この組織を、包埋し、ＴＥＭまたはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）のために切断した。
微細構造解析
野生型マウスおよびＫＯマウスを、断頭し、唾液腺を取り出し、２．５％ のＰＢＳ中のグルタルアルデヒドに、４℃で終夜、浸漬することによって固定した。唾液腺を脱水し、次いで、さらに３０分間ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、続いて、１％の四酸化オスミウムで、室温で１時間、後固定した。検体を、段階的なアルコールシリーズを通して脱水し、Ｅｐｏｎ８１２中に包埋した。半薄型の連続切片を、２．５μＭで切断し（Ｌｅｉｃａ ｕｌｔｒａｃｕｔ ＵＣＴ）、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡下で観察した。透過型電子顕微鏡観察を、Ｍｉｒｇａｇｎｉ顕微鏡（ＦＥＩ）で行った。
リソソーム酵素アッセイ
血液を取り出し、試料を、１５分間遠心分離し（８０００ｘｇ）、血漿を、－７０℃で保管した。血漿のリソソーム酵素活性を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｓａｍｓｕｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、韓国で測定した。ＭＬ ＩＩにおいて、特異的なＧｌｃＮＡｃ－ホスホトランスフェラーゼ活性は、測定することができなかった。したがって、上昇した血漿のリソソーム酵素に基づいて診断を行った。
ＤＥＸＡ解析
骨密度（ＢＭＤ）、骨塩量（ＢＭＣ）および除脂肪量を、ｐＤＥＸＡ ＳａｂｒｅＸ線骨デンシトメーターを用いて、麻酔されたマウスで測定した。麻酔を投与した後、それぞれのマウスの重量を記録し、次いで、マウスを、ＤＥＸＡスキャナーに置いた。データの解析のために、マウスの全身を含む領域の輪郭を示した。
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴシステムおよびＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、ＧＮＰＴＡＢのｍＲＮＡレベルの定量を行った。ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨのレベルに関して表す。２－ΔΔＣＴ法を使用して、ＳＤＳ２．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してデータを解析した。
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５を、統計解析、ならびに図および表の作成のために使用した。有意差を、独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定および一元ＡＮＯＶＡ検定によって、決定した。特に規定のない限り、すべてのデータは、平均±ＳＥＭで表される。
結果
遺伝子トラップ法を使用して、ＧＮＰＴＡＢ ＫＯマウスを生成した。図１Ａで説明されるように、エクソン１２およびエクソン２０の間にネオマイシン耐性遺伝子を含有する置換ベクターでの相同組換えを使用して、マウスを生成した。図１Ｂに示されるように、ＥＳクローンのＧＮＰＴＡＢ遺伝子における遺伝子トラップの存在を、サザンブロット解析により確認した。
網羅的な表現型解析を、野生型動物、ヘテロ接合性動物およびホモ接合性動物で行った。ＫＯマウスは、それらの小さなサイズによって、野生型（ＷＴ）の同腹仔から、視覚的に識別できた。平均体重（図２Ａ）および平均体長（図２Ｂ）は、ＫＯマウスにおいて、有意に減少していた。それらの小さなサイズと一致して、ホモ接合性マウスは、粗い顔面形状を示した（図２Ｃ）。
図３Ａに示されるように、正常軟骨において、明瞭な小窩スペースが、軟骨細胞を取り囲んでいた。細胞質は、単一の明瞭な空胞を含有していた。ＫＯマウスにおいて、大腿骨の軟骨細胞は、著しく肥大し、それらの拡大した小窩は完全に満たされていた（図３Ｂ）。肥大軟骨細胞の細胞質は、不十分な量の微粒状の両染性物質を含有する豊富な微小空胞によって膨張していた。固定化に関連する軟骨細胞の収縮は少なく、拡大した小窩を満たしていた。これは、単一の大きく明瞭な空胞を含有し、部分的にのみ小窩が満たされた、野生型の軟骨細胞とは対照的である。
光学顕微鏡によって調べると、粘液型および漿液型の分泌細胞からなる、外分泌唾液腺の腺房は、ＫＯマウスにおいて広範囲の空胞化を示した（Ｇｅｌｆｍａｎら、２００７年、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｍ．Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ．４８：５２２１～５２２８頁）。内在する病状への洞察を得るために、顎下の唾液腺を、電子顕微鏡（ＥＭ）によって解析した。
粘液型および漿液型両方の分泌細胞は、野生型マウスにおいて、容易に観察された（図４Ａ～図４Ｃ）。対照的に、ＫＯマウスの顎下の唾液腺の全体的な構造は、非常に全体的に破壊されており、ＥＭ切片における漿液細胞の識別を大きく妨げた（図４Ｄ～図４Ｆ）。粘液型の分泌細胞は、異種物質を含有する大きな膜結合性の空胞でいっぱいであった（
図４Ｆ、図４Ｆ）。大きな空胞は、ＫＯマウスの粘膜細胞に蓄積した、未分解の細胞質物質で満たされており、単一膜によって取り囲まれていた。これらの観察は、これらが、オートファジー性の区画とリソソームとの融合によって、形成されたオートリソソームを示す可能性があることを示す。
ＭＬ－ＩＩを有する患者は、リソソームに対するこれらの酵素の正確な標的化のために必須のマンノース－６－ホスフェート認識マーカーを合成できないので、その血清中に非常に上昇したレベルでリソソーム酵素を有する。この輸送の欠如は、血液への酵素の分泌過多をもたらす。図５Ａ～図５Ｄは、野生型マウスと比較して、ＫＯマウスが、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（図５Ａ）、β－ヘキソサミニダーゼＡ（図５Ｂ）、β－ガラクトシダーゼ（図５Ｃ）およびβ－グルクロニダーゼ（図５Ｄ）などのリソソーム酵素の非常に増加したレベルを示したことを示す。ヒトにおける観察と一致して、ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ活性が、ホモ接合性マウスにおいて欠如している場合、この表現型が予想される。
要約すると、これらの実験は、ＧＮＰＴＡＢ ＫＯマウスが、野生型マウスと比較して、特に、成長、唾液腺の形態およびリソソーム酵素のレベルに関して、明らかな、異なる表現型を呈したたことを実証する。これらの結果は、ＧＮＰＴＡＢ ＫＯマウスが、ＭＬ－ＩＩのための治療的処置を研究するためのモデル系となることを示す。
実施例２：ＧＮＰＴＡＢ ＫＯマウスにおけるＧＮＰＴＡＢのＡＡＶ－媒介投与の評価
ＭＬ－ＩＩを有する患者は、成長遅延を示すので、この研究の主たる目標は、ＭＬ－ＩＩモデルにおいて成長を促進するＡＡＶ－媒介ＧＮＰＴＡＢ投与の効能を評価することであった。したがって、野生型マウス、ＧＮＰＴＡＢヘテロ接合性マウスおよびＧＮＰＴＡＢ ＫＯマウスの表現型を、ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢを注射されたＧＮＰＴＡＢ ＫＯマウスと比較して、解析した。
図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、すべての解析の評価を、注射後２つの期間に実施した：最初は、注射後１６週（１２週齢で）に開始し、２回目は、注射後３２週（３８週齢で）に開始した。成長学解析を、注射後６週に加えた。
ＣＭＶエンハンサー／ＣＢＡプロモーターによって制御されるマウスＧＮＰＴＡＢ ｃＤＮＡおよびＢＧＨポリＡシグナルを発現する発現カセットを含有するプラスミドを構築した（図７Ａ）。全長ＧＮＰＴＡＢは、本明細書で記載される短縮型ＣＭＶエンハンサー／ＣＢＡＣＢＡプロモーターの制御下であった。ＡＡＶ２／８－ＧＮＰＴＡＢを注射されたＧＮＰＴＡＢ ＫＯマウスからの肝臓の定量的リアルタイムＰＣＲ解析は、ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢの特異的で高度な発現を示した。予想されたように、いずれのＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢ ｍＲＮＡも、対照の同腹仔からの試料中には存在しなかった（図７Ｂ）。
ＡＡＶ媒介遺伝子導入が、生理学的に関連する方法で、代謝に影響を及ぼすかどうかを決定するための最初の試験として、体重増加を、注射後３２週間モニターした。図８Ａに示されるように、ＫＯマウスにおいて、ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢの治療の効果は観察されなかった。図８Ｂは、体重増加の点で、対照およびＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢ治療ＫＯマウスの間で観察された相違がなかったことを示す。
次に、ＫＯマウスの低身長症の表現型を弱める有効性を評価した。ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢを注射されたＫＯマウスにおいて、治療の６週後に低身長症の改善が認められ、身体のサイズの増加を示す（図９Ａ、図９Ｂおよび下記の表１）。
Figure 2022046635000001
次に、骨密度（ＢＭＤ）、骨塩量（ＢＭＣ）および身体組成を測定した。ＤＥＸＡは、骨塩および身体組成（体脂肪量として）を決定するためのＸ線に基づく画像処理技術である。ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢの導入は、ＡＡＶを注射されたＫＯマウスのＢＭＣおよびＢＭＤの相対的増加を誘導した。図１０Ａ～図１０Ｃは、注射前に得られたＢＭＤの生データ（図１０Ａ）、ならびに注射の前および後と比較したＢＭＤの相対比率（図１０Ｂ、図１０Ｃ）を示す。これらのデータも、以下の表２に示す。これらの結果は、骨密度に対する遺伝子導入の有意な効果を実証する。
Figure 2022046635000002
同様に、骨塩量（ＢＭＣ）の生データは、強い遺伝子治療効果を示した（図１１Ａ）。比率のデータ（図１１Ｂ、図１１Ｃ）も、骨の成長における有意な効果に近かった。これらのデータも、以下の表３に示す。
Figure 2022046635000003
次に、ＤＥＸＡスキャナーを使用する身体の除脂肪含量の分析は、除脂肪量もＫＯマウスにおいて減少したことを明らかにした（図１２Ａ）。図１２Ｂに示されるように、注射後３２週で、対照マウスは、注射前のデータとの比較において、除脂肪量の百分率の有意な減少を示した。しかしながら、除脂肪量の有意な変化は、ＡＡＶ－ＧＮＰＴＡＢ治療ＫＯマウスでは観察されなかった。これらのデータも、以下の表４に示す。
Figure 2022046635000004
要約すると、ＧＮＰＴＡＢ ＫＯマウスは、ヒトＭＬ ＩＩ型の場合のように、健康に育つことができず、低い骨密度を有していた。このモデルを使用して、ＭＬ ＩＩ型の治療のためにＡＡＶベクターを使用する遺伝子治療の可能性を調べた。過剰発現したＧＮＰＴＡＢは、ＫＯマウスにおける骨成長障害を部分的に保護することがわかった。全体として、ＡＡＶベクターによるＧＮＰＴＡＢの全身送達は、非常に効率的であり、ＭＬ ＩＩ型における骨の病態を是正するための有望な一アプローチである。
配列
別途注記されない限り、すべてのポリペプチド配列はＮ末端～Ｃ末端で示される。
別途注記されない限り、すべての核酸配列は５’～３’で示される。
ＧＮＰＴＡＢ
ヒトＧＮＰＴＡＢタンパク質配列（配列番号１）
MLFKLLQRQTYTCLSHRYGLYVCFLGVVVTIVSAFQFGEVVLEWSRDQYHVLFDSYRDNIAGKSFQNRLC
LPMPIDVVYTWVNGTDLELLKELQQVREQMEEEQKAMREILGKNTTEPTKKSEKQLECLLTHCIKVPMLV
LDPALPANITLKDLPSLYPSFHSASDIFNVAKPKNPSTNVSVVVFDSTKDVEDAHSGLLKGNSRQTVWRG
YLTTDKEVPGLVLMQDLAFLSGFPPTFKETNQLKTKLPENLSSKVKLLQLYSEASVALLKLNNPKDFQEL
NKQTKKNMTIDGKELTISPAYLLWDLSAISQSKQDEDISASRFEDNEELRYSLRSIERHAPWVRNIFIVT
NGQIPSWLNLDNPRVTIVTHQDVFRNLSHLPTFSSPAIESHIHRIEGLSQKFIYLNDDVMFGKDVWPDDF
YSHSKGQKVYLTWPVPNCAEGCPGSWIKDGYCDKACNNSACDWDGGDCSGNSGGSRYIAGGGGTGSIGVG
QPWQFGGGINSVSYCNQGCANSWLADKFCDQACNVLSCGFDAGDCGQDHFHELYKVILLPNQTHYIIPKG
ECLPYFSFAEVAKRGVEGAYSDNPIIRHASIANKWKTIHLIMHSGMNATTIHFNLTFQNTNDEEFKMQIT
VEVDTREGPKLNSTAQKGYENLVSPITLLPEAEILFEDIPKEKRFPKFKRHDVNSTRRAQEEVKIPLVNI
SLLPKDAQLSLNTLDLQLEHGDITLKGYNLSKSALLRSFLMNSQHAKIKNQAIITDETNDSLVAPQEKQV
HKSILPNSLGVSERLQRLTFPAVSVKVNGHDQGQNPPLDLETTARFRVETHTQKTIGGNVTKEKPPSLIV
PLESQMTKEKKITGKEKENSRMEENAENHIGVTEVLLGRKLQHYTDSYLGFLPWEKKKYFQDLLDEEESL
KTQLAYFTDSKNTGRQLKDTFADSLRYVNKILNSKFGFTSRKVPAHMPHMIDRIVMQELQDMFPEEFDKT
SFHKVRHSEDMQFAFSYFYYLMSAVQPLNISQVFDEVDTDQSGVLSDREIRTLATRIHELPLSLQDLTGL
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マウスＧＮＰＴＡＢタンパク質配列（配列番号２）
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Claims (121)

  1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。
  2. ＧＮＰＴＡＢは、アルファサブユニットおよびベータサブユニットを含む、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
  3. ＧＮＰＴＡＢは、プロモーターと作動可能に連結されている、請求項１または２に記載のｒＡＡＶベクター。
  4. ＧＮＰＴＡＢは、ヒトＧＮＰＴＡＢである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  5. ＧＮＰＴＡＢは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  6. ＧＮＰＴＡＢは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  7. プロモーターは、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項１～６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  8. ＣＢＡプロモーターは、改変型ＣＢＡプロモーターである、請求項７に記載のｒＡＡＶベクター。
  9. 改変型ＣＢＡプロモーターは、切断型ＣＢＡプロモーターである、請求項８に記載のｒＡＡＶベクター。
  10. ＣＭＶエンハンサーは、短縮型ＣＭＶエンハンサーである、請求項７～９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  11. ベクターは、イントロンを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  12. イントロンは、ＭＶＭイントロンである、請求項１１に記載のｒＡＡＶベクター。
  13. ベクターは、ポリアデニル化配列を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  14. ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列である、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター。
  15. ＡＡＶ末端反復配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項１～１４のいずれか１項に
    記載のｒＡＡＶベクター。
  16. ｒＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲを含む、請求項１５に記載のｒＡＡＶベクター。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子。
  18. ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶまたはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項１７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  19. ｒＡＡＶ粒子は、同じＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲおよびキャプシドを含む、請求項１７または１８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  20. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドとは異なるＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲを含む、請求項１７または１８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  21. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８キャプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項２０に記載のｒＡＡＶ粒子。
  22. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐ機能およびｃａｐ機能をコードする核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすること、ならびにＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することによって産生される、請求項１７～２１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  23. ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすることによって提供される、請求項２２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  24. ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスを宿主細胞に感染させることによって提供される、請求項２２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  25. ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項２４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  26. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐ機能およびｃａｐ機能をコードする核酸を含むＡＡＶ産生細胞によって産生され、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供する、請求項１７～２１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  27. ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む、請求項２６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  28. ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスをＡＡＶ産生細胞に感染させることによって提供される、請求項２６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  29. ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項２８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  30. 請求項１７～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物。
  31. 哺乳動物におけるムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を治療するための方法であって、請求項１７～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項３０に記載の医薬組成物の有効量を、該哺乳動物に投与することを含む前記方法。
  32. 哺乳動物におけるムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を治療するための方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、該哺乳動物に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む、前記方法。
  33. ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の身体のサイズを維持または増加させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、該哺乳動物に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、該ＧＮＰＴＡＢの発現は、体重増加の維持もしくは増加、および／または身長増加の維持もしくは増加をもたらす、前記方法。
  34. ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の身体のサイズの減少を防止する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、該哺乳動物に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）をコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、該ＧＮＰＴＡＢの発現は、体重の減少を防止する、前記方法。
  35. ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の骨塩量を維持または増加させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、該哺乳動物に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ
    ＩＴＲを含み、該ＧＮＰＴＡＢの発現は、骨塩量の維持または増加をもたらす、前記方法。
  36. ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の骨塩量の減少を防止する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、該哺乳動物に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢおよび少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲをコードする核酸を含み、該ＧＮＰＴＡＢの発現は、骨塩量の減少を防止する、前記方法。
  37. ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の骨密度を維持または増加させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、該哺乳動物に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ
    ＩＴＲを含み、該ＧＮＰＴＡＢの発現は、骨密度の維持または増加をもたらす、前記方法。
  38. ムコリピドーシスＩＩ型（ＭＬ ＩＩ）またはムコリピドーシスＩＩＩ型（ＭＬ ＩＩＩ）を有する哺乳動物の骨密度の減少を防止する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を
    、該哺乳動物に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、該ＧＮＰＴＡＢの発現は、骨密度の減少を防止する、前記方法。
  39. 治療は、ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和し、該ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である、請求項３１に記載の方法。
  40. 治療は、ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させ、該ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である、請求項３１に記載の方法。
  41. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、該哺乳動物に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み；該ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である、前記方法。
  42. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、該哺乳動物に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、ＧＮＰＴＡＢをコードする核酸および少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み；該ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である、前記方法。
  43. ＧＮＰＴＡＢは、プロモーターと作動可能に連結されている、請求項３１～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. ＧＮＰＴＡＢは、ヒトＧＮＰＴＡＢである、請求項３１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. ＧＮＰＴＡＢは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. ＧＮＰＴＡＢは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. プロモーターは、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項４３～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. ＣＢＡプロモーターは、改変型ＣＢＡプロモーターである、請求項４７に記載の方法。
  49. 改変型ＣＢＡプロモーターは、切断型ＣＢＡプロモーターである、請求項４７に記載の方法。
  50. ＣＭＶエンハンサーは、短縮型ＣＭＶエンハンサーである、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. ベクターは、イントロンを含む、請求項３１～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. イントロンは、ＭＶＭイントロンである、請求項５１に記載の方法。
  53. ベクターは、ポリアデニル化配列を含む、請求項３１～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列である、請求項５３に記載の方法。
  55. ＡＡＶ末端反復配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項３１～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. ｒＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶまたはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項３１～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. ｒＡＡＶ粒子は、同じＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲおよびキャプシドを含む、請求項３１～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドとは異なるＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲを含む、請求項３１～５７のいずれか１項に記載の方法。
  60. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８キャプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項５９に記載の方法。
  61. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ機能およびｃａｐ機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすること、ならびにＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することによって産生される、請求項３１～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすることによって提供される、請求項６１に記載の方法。
  63. ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスを宿主
    細胞に感染させることによって提供される、請求項６２に記載の方法。
  64. ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項６３に記載の方法。
  65. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ機能およびｃａｐ機能をコードする核酸を含むＡＡＶ産生細胞によって産生され、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供する、請求項３１～６０のいずれか１項に記載の方法。
  66. ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む、請求項６５に記載の方法。
  67. ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスをＡＡＶ産生細胞に感染させることによって提供される、請求項６６に記載の方法。
  68. ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項６７に記載の方法。
  69. 哺乳動物は、ヒトである、請求項３１～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. ヒトは、小児の対象である、請求項６９に記載の方法。
  71. ヒトは、若年成人である、請求項６９に記載の方法。
  72. ｒＡＡＶは、静脈内、腹腔内、動脈内、筋肉内、皮下または肝臓内に投与される、請求項３１～７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. ｒＡＡＶは、静脈内に投与される、請求項７２に記載の方法。
  74. ｒＡＡＶは、２つ以上の場所に投与される、請求項３１～７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 投与は、繰り返される、請求項３１～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. ｒＡＡＶウイルス粒子は、医薬組成物中にある、請求項３１～７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. 医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するための医薬の製造における、請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
  79. 請求項３１～７７のいずれか１項に記載の方法における使用のための医薬の製造における、請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
  80. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するための医薬の製造における、請求項１７～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子の使用。
  81. 請求項３１～７７のいずれか１項に記載の方法における使用のための医薬の製造における、請求項１７～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子の使用。
  82. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するための、請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
  83. 請求項３１～７７のいずれか１項に記載の方法における使用のための、請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
  84. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するための、請求項１７～２９のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶ粒子の使用。
  85. 請求項３１～７７のいずれか１項に記載の方法における使用のための、請求項１７～２９のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶ粒子の使用。
  86. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和するため、または哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させるための医薬の製造における、請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
  87. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和するため、または哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させるための医薬の製造における、請求項１７～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子の使用。
  88. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和するため、または哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させるための、請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
  89. 哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状を緩和するため、あるいは哺乳動物におけるＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状の進行を遅延させるための、請求項１７～２９のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶ粒子の使用。
  90. ＭＬ ＩＩもしくはＭＬ ＩＩＩの１つまたはそれ以上の症状は、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘または下痢である、請求項８６～８９のいずれか１項に記載の使用。
  91. 哺乳動物は、ヒトである、請求項７８～９０のいずれか１項に記載の使用。
  92. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター、請求項１７～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項３０に記載の医薬組成物を含むキット。
  93. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター、請求項１７～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項３０に記載の医薬組成物を含む、請求項３１～７７のいずれか１項に記載の方法に従って、ＭＬ ＩＩまたはＭＬ ＩＩＩを治療するためのキット。
  94. １つもしくはそれ以上の緩衝液または薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項９２または９３に記載のキット。
  95. ＭＬ ＩＩおよび／またはＭＬ ＩＩＩの治療における使用のための説明書をさらに含む、請求項９２～９４のいずれか１項に記載のキット。
  96. ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ ＩＩ）の動物モデルであって、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）遺伝子の少なくとも１つのアレルは、エクソン１２およびエクソン２０の間に位置する欠失を含む、前記動物モデル。
  97. ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の少なくとも１つのアレルは、エクソン１２およびエクソン２０にまたがる欠失を含む、請求項９６に記載の動物モデル。
  98. 動物は、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子中の欠失についてホモ接合性である、請求項９６または９７に記載の動物モデル。
  99. 動物は、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子中の欠失についてヘテロ接合性である、請求項９６または９７に記載の動物モデル。
  100. ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の一部は、レポーターおよび／または選択的マーカーをコードする遺伝子によって置き換えられている、請求項９６～９９のいずれか１項に記載の動物モデル。
  101. 選択的マーカーは、ネオマイシンに対する耐性を付与する、請求項１００に記載の動物モデル。
  102. 動物は、哺乳動物である、請求項９６～１０１のいずれか１項に記載の動物モデル。
  103. 動物は、げっ歯類である、請求項１０２に記載の動物モデル。
  104. げっ歯類は、マウスである、請求項１０３に記載の動物モデル。
  105. マウスは、１２９／Ｓｖおよび／またはＣ５７Ｂｌ／６に由来する遺伝的背景を有する、請求項１０４に記載の動物モデル。
  106. 動物は、免疫適格性または免疫不全性である、請求項９６～１０４のいずれか１項に記載の動物モデル。
  107. ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ ＩＩ）の動物モデルを生成させる方法であって、該動物のＧＮＰＴＡＢ遺伝子の少なくとも１つのアレルにおいて、エクソン１２およびエクソン２０の間に欠失を導入することを含む前記方法。
  108. ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の少なくとも１つのアレルは、エクソン１２およびエクソン２０にまたがる欠失を含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. 動物は、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子中の欠失についてホモ接合性となるように掛け合わされる、請求項１０７または１０８に記載の方法。
  110. 動物は、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子中の欠失についてヘテロ接合性となるように掛け合わされる、請求項１０７または１０８に記載の方法。
  111. ＧＮＰＴＡＢ遺伝子の一部は、レポーターおよび／または選択的マーカーをコードする遺伝子によって置き換えられている、請求項１０７～１１０のいずれか１項に記載の方法
    。
  112. 選択的マーカーは、ネオマイシンに対する耐性を付与する、請求項１１１に記載の方法。
  113. 動物は、哺乳動物である、請求項１０７～１１２のいずれか１項に記載の方法。
  114. 動物は、げっ歯類である、請求項１１３に記載の方法。
  115. げっ歯類は、マウスである、請求項１１４に記載の方法。
  116. マウスは、１２９／Ｓｖおよび／またはＣ５７Ｂｌ／６に由来する遺伝的背景を有する、請求項１１５に記載の方法。
  117. 動物は、免疫適格性または免疫不全性である、請求項９６～１０４のいずれか１項に記載の方法。
  118. 請求項１０７～１１７のいずれか１項に記載の方法によって生成させる、ムコリピドーシスＩＩの動物モデル。
  119. ムコリピドーシスＩＩ（ＭＬ ＩＩ）の治療のための薬剤を評価するための方法であって、請求項９６～１０６のいずれか１項に記載の動物モデルに該薬剤を投与することを含み、ＭＬ ＩＩの１つまたはそれ以上の症状の緩和は、該薬剤がＭＬ ＩＩの有益な治療を提供することを示す、前記方法。
  120. ＭＬ ＩＩの症状は、体重の減少、骨密度の減少、骨塩量の減少、骨格異常、認知障害、粗大および微細運動能力の発達の遅延、難聴、筋緊張の欠如、膨隆した腹部、臍ヘルニア、気道の進行性粘膜肥厚、頻繁な呼吸器感染、僧帽弁の肥厚および機能不全、便秘ならびに／または下痢である、請求項１１９に記載の方法。
  121. 薬剤は、小分子、ポリペプチド、抗体、核酸または組換えウイルス粒子である、請求項１１９または１２０に記載の方法。
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