TW202035439A - 生成經改良的人類ｐａｈ以藉由肝導向的基因置換療法來治療重度苯丙酮尿症（ｐｋｕ） - Google Patents

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Abstract

本文提供了變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，其比野生型人類PAH更穩定並且具有更大的活性。還提供了在有需要的個體中治療苯丙酮尿症(PKU)和/或降低苯丙胺酸量的方法。本文還提供了在有需要的個體中表現所述變異體PAH多肽的表現盒、載體(例如，rAAV載體)、病毒顆粒、醫藥組成物和套組。

Description

生成經改良的人類PAH以藉由肝導向的基因置換療法來治療重度苯丙酮尿症(PKU)
本公開文本涉及變異體苯丙胺酸羥化酶多肽。在一些態樣中，本公開文本涉及以基因療法治療苯丙酮尿症的組成物和方法。
苯丙酮尿症(PKU)是催化苯丙胺酸(Phe)羥基化為酪胺酸(Tyr)的肝酶苯丙胺酸羥化酶(PAH)的遺傳缺陷。這種疾病是胺基酸代謝最常見的先天性缺陷，在北美的總發病率為1：10至1：15,000，並且在大多數發達國家係通過新生兒篩查項目檢測到。在沒有任何治療的情況下，嚴重形式的PKU導致血中Phe含量的大幅升高，這具有神經毒性，並與重度精神發育遲滯相關聯(Kochhar 2012，Ho 2014，Blau 2015)。受影響的蛋白質，PAH，是一種多結構域蛋白質，其由N末端調節結構域(1至117)、中心催化結構域(118-410)和C末端四聚結構域(411至452)所組成(Flydal 2013)。迄今為止，已有超過560種致病突變被定位到每個結構域，其中催化區是受影響最頻繁的位點(Erlandsen 2003)。同源多聚體酶通過結合到N端結構域的受質Phe經過磷酸化和別構活化(allosteric activation)的複合式調節，所述結合通過改變酶的各種構 形和多聚體狀態來微調PAH酶的活性(Knappskog 1996，Jaffe 2013，Arturo 2016)。
目前對PKU的治療是使用低蛋白飲食和液體藥物配方對Phe進行終生飲食限制(Kochhar 2012，Ho 2014，Blau 2015)。雖然有效，但藥用食物的味道不佳和對食物選擇的嚴重限制，使得兒童難以堅持飲食，且不遵守飲食的情況穩步增加，並且到青少年後期，近80%的患者血中Phe含量高於建議量(Waisbren 2007，Thomas 2017)。也有新的證據表明，儘管很好地堅持Phe限制飲食，但許多患者在各種神經認知和神經精神功能方面存在缺陷，並且注意力失常過動症(ADHD)的發病率很高。雖然其原因尚不清楚，但潛在的解釋包括腦胺基酸失衡、某些維生素和微量元素的營養缺乏，以及血中Phe含量的波動(其通常由肝臟中的PAH活性來維持穩定)(Cleary 2013，Gonzales 2016，Vogel 2017)。有趣的是，用輔因子四氫生物蝶呤(BH4)(沙丙蝶呤二鹽酸鹽)的合成形式治療輕度PKU患者不僅顯示有效降低血中Phe含量，還表明改善了神經功能，如減少ADHD症狀(Burton 2015)。這種療法通過充當藥理學分子伴侶來增加殘留的PAH酶活性，並且因此可以通過提供正常的Phe所調節的PAH活性來部分糾正遺傳缺陷(Blau 2015)。最近批准的另一種療法，係由酶替代療法所組成，其使用聚乙二醇化形式的細菌苯丙胺酸解氨酶(PAL)來將Phe代謝為反式肉桂酸。這種療法顯著降低血中Phe含量，但對神經學終點似乎不太有效(Longo 2014)。目前還不清楚主要基於降低血中Phe含量的這種療法或任何其他療法，在缺乏糾正作為系統Phe含量調節物和Tyr產生者的PAH功能的情況下，是否能夠解決即使在順從飲食的PKU患者中也觀察到的認知和神經精神問題。
本文引用的所有參考文獻(包括專利申請案和出版物)均通過引用以其整體而併入。
本發明至少部分基於發明人發現的改進的hPAH變異體，並且特別是變異體-1(V1)，其含有四種胺基酸變化，與內源性hPAH相比，所述變化導致蛋白質穩定性和酶活性的改進。以臨床相關劑量的rAAV來將編碼這種hPAH-V1變異體的cDNA遞送到肝臟，係改善了PAHenu2小鼠(一種人類PKU模型)的各種疾病終點，並且比未修飾的hPAH更有效。因此，編碼這種新變異體的rAAV載體可以藉由以減少載體劑量來獲得功效，而為PKU基因療法提供途徑。
在一些態樣中，本發明提供了包含兩個胺基酸取代的變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，其中胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。在一些態樣中，本發明提供了包含三個胺基酸取代的變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，其中胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。在一些態樣中，本發明提供了包含四個胺基酸取代的變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，所述胺基酸取代位於野生型人類PAH多肽的位點M180、K199、S250和G256處。在一些實施例中，胺基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A中的一種或多種。在一些實施例中，胺基酸取代包括K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。在一些實施例中，胺基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A。在一些實施例中，變異體PAH多肽還包含H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T胺基酸取代。在一些實施例中，野生型人類PAH多肽包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。在一些實施例中，變異體PAH多肽是人類PAH多肽。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列至少約80%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列。在一些實施例中，變異體PAH多肽還包含選自野生型人類PAH多肽的 G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A和G442A的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽還包含選自野生型人類PAH多肽的P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、S446H的一個或多個胺基酸取代，以及在野生型人類PAH多肽的位置453處添加S。在一些實施例中，變異體PAH多肽還包含選自野生型人類PAH多肽的F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P和N376P的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含選自野生型人類PAH多肽的G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A和G442A的一個或多個胺基酸取代。
在一些態樣中，本發明提供了變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含選自野生型人類PAH多肽的P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、S446H的一個或多個胺基酸取代，以及在野生型人類PAH多肽的位置453處添加S。在一些態樣中，本發明提供一種變異體PAH多肽，其包含選自野生型人類PAH多肽的F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P和N376P的一個或多個胺基酸取代。
在一些實施例中，變異體PAH多肽包含N末端截斷。在一些實施例中，N末端截斷包括N末端調節結構域的截斷。在一些實施例中，N末端截斷包括野生型PAH多肽的胺基酸殘基1至102的截斷。在一些實施例中，變異體PAH 多肽包含C末端截斷。在一些實施例中，C末端截斷包括四聚結構域的截斷。在一些實施例中，C末端截斷包括野生型PAH多肽的胺基酸殘基429至452的截斷。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含對應於野生型PAH多肽的胺基酸殘基103至428的胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體PAH多肽包含一個或多個胺基酸取代，以消除潛在的蛋白酶切割位點。在一些實施例中，消除潛在蛋白酶切割位點的一個或多個胺基酸取代位於野生型PAH多肽的位置270至295和/或380至405處。
在一些實施例中，變異體PAH多肽與肝靶向多肽融合。在一些實施例中，肝靶向多肽是HGF或其片段或者結合肝細胞去唾液酸糖蛋白受體的糖蛋白。在一些實施例中，變異體PAH多肽被聚乙二醇化和/或亞硝基化。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含I374C胺基酸取代，其中位置374處的cys殘基被亞硝基化。
在一些實施例中，本發明提供了包含如本文所述的變異體PAH多肽的組成物。在一些實施例中，所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
在一些態樣中，本發明提供了編碼如本文所述的變異體PAH多肽的經分離核酸。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，所述啟動子選自巨細胞病毒(CMV)即時早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、轉甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)、mTTR482啟動子、mA1MB2-mTTR482啟動子、TK啟動子、四環素響應型啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、LP1啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG)啟動子、延長因子1-α啟動子(EF1-α)啟動子、人類β-葡糖醛酸酶啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、修飾的雞β-肌動蛋白 (CBA)啟動子或SEQ ID NO：17、逆轉錄勞斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子，和13-肌動蛋白啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是LP1啟動子或mA1MB2-mTTR482啟動子。在一些實施例中，所述核酸還包含多腺苷酸化訊息。在一些實施例中，多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化信號、SV40多腺苷酸化訊息或HSV TK多腺苷酸化訊息。在一些實施例中，所述核酸還包含內含子。在一些實施例中，所述內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。在一些實施例中，所述內含子是SEQ ID NO：15的修飾的雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。在一些實施例中，所述核酸還包含一個或多個ITR。在一些實施例中，所述核酸還包含填充(stuffer)核酸。在一些實施例中，填充核酸係經最佳化以去除ATG序列。在一些實施例中，填充核酸是SEQ ID NO：16的A1AT內含子填充序列。
在一些態樣中，本發明提供了編碼人類PAH多肽的經分離核酸，其中所述核酸是密碼子最佳化的。在一些實施例中，所述核酸序列與SEQ ID NO：14的核酸序列至少80%相同。在一些實施例中，所述核酸包含SEQ ID NO：14的核酸序列。在一些實施例中，所述核酸是mRNA。在一些態樣中，本發明提供了包含如本文所述的核酸的組成物。在一些實施例中，所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
在一些態樣中，本發明提供了包含如本文所述的經分離核酸的載體。在一些實施例中，所述載體是重組型腺相關病毒(rAAV)載體。在一些實施例中，rAAV載體包含如本文所述的核酸，其側翼是一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。在一些實施例中，所述核酸的側翼是兩個AAV ITR。在一些實施例中，AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些實 施例中，AAV ITR是AAV2 ITR。在一些實施例中，rAAV載體從5'到3'包含AAV2 ITR、啟動子、內含子、編碼PAH多肽的核酸、填充核酸、多腺苷酸化訊息和AAV2 ITR。在一些實施例中，所述啟動子是m1A1MB2-mTTR482啟動子或LP1啟動子。在一些實施例中，所述內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。在一些實施例中，PAH多肽是如本文所述的變異體PAH多肽。在一些實施例中，編碼PAH多肽的核酸是密碼子最佳化的核酸。在一些實施例中，填充核酸包含來自人類α1抗胰蛋白酶基因內含子的核酸。在一些實施例中，人類α1抗胰蛋白酶基因的內含子係經突變以去除ATG序列。在一些實施例中，多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化訊息。在一些實施例中，所述載體是自身互補載體。在一些實施例中，所述載體包含編碼PAH多肽的第一核酸序列和編碼PAH多肽的補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可以與所述第二核酸序列沿著其大部分或全部長度形成鏈內鹼基對。在一些實施例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過經突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並且包含末端解鏈序列的突變。
在一些態樣中，本發明提供了包含如本文所述的rAAV載體的rAAV顆粒。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含經工程化的AAV衣殼。在一些實施例中，經工程化的AAV衣殼是DJ衣殼或LK03衣殼。在一些實施例中，rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼來源於相同的AAV血清型。在一些實施例中，rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼來源於不同的AAV血清型。在一 些實施例中，rAAV病毒顆粒包含AAV8衣殼。在一些實施例中，rAAV病毒顆粒包含AAV8衣殼，並且其中所述載體包含AAV2 ITR。
在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV1血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV2血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV3血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV4血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV5血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV6血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV7血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在 一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV8血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV9血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV11血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含與AAV12血清型衣殼具有至少85%序列同一性，如至少87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的衣殼。
在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含雜合衣殼。在一些實施例中，雜合衣殼是AAV1/AAV6、AAV2/AAV6、AAV3/AAV6、AAV4/AAV6、AAV5/AAV6、AAV7/AAV6、AAV8/AAV6、AAV9/AAV6、AAV10/AAV6、AAV11/AAV6、AAV12/AAV6、AAV1/AAV8、AAV2/AAV8、AAV3/AAV8、AAV4/AAV8、AAV5/AAV8、AAV7/AAV8、AAV9/AAV8、AAV10/AAV8、AAV11/AAV8、AAV12/AAV8或AAV1/AAV6/AAV8雜合衣殼。在一些實施例中，雜合衣殼是AAV8/AAV6雜合衣殼。在一些實施例中，雜合衣殼是AAV1/AAV6/AAV8雜合衣殼。
在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含雜合衣殼。在一些實施例中，雜合衣殼是AAV1/AAV6、AAV2/AAV6、AAV3/AAV6、AAV4/AAV6、AAV5/AAV6、AAV7/AAV6、AAV8/AAV6、AAV9/AAV6、AAV10/AAV6、AAV11/AAV6、AAV12/AAV6、AAV1/AAV8、AAV2/AAV8、AAV3/AAV8、AAV4/AAV8、AAV5/AAV8、AAV7/AAV8、AAV9/AAV8、AAV10/AAV8、AAV11/AAV8、AAV12/AAV8或AAV1/AAV6/AAV8雜合衣殼。在一些實施例 中，雜合衣殼是AAV8/AAV6雜合衣殼。在一些實施例中，雜合衣殼是AAV1/AAV6/AAV8雜合衣殼。
在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV1衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV2衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV3衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV4衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV5衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV6衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV7衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV8衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV9衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV10衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV12衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，雜合衣殼包含與AAV8衣殼序列的一部分具有至少95%序列同一性的胺基酸序列，如至少 96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施例中，所述部分包含至少100個胺基酸，如至少150、200、250、300、350或400個胺基酸。
在一些態樣中，本發明提供了包含如本文所述的rAAV顆粒的組成物。在一些實施例中，所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
在一些態樣中，本發明提供了包含如本文所述的分離核酸的細胞。在一些態樣中，本發明提供了產生變異體PAH多肽的方法，所述方法包括在產生變異體PAH多肽的條件下培養上述細胞。在一些實施例中，所述方法還包括純化變異體PAH多肽的步驟。
在一些態樣中，本發明提供了用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的變異體PAH多肽或如本文所述的組成物。在一些態樣中，本發明提供了用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予編碼如本文所述的變異體PAH多肽的核酸或如本文所述的核酸。在一些態樣中，本發明提供了用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的rAAV載體。在一些態樣中，本發明提供了用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的rAAV顆粒。在一些實施例中，本發明提供了用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的組成物。在一些實施例中，本發明提供了用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的細胞。在一些實施例中，所述個體缺乏PAH活性。
在一些態樣中，本發明提供了用於降低有需要的個體血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的變異體PAH多肽。在一些態樣中，本發明提供了用於降低有需要的個體血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予編碼如本文所述的變異體PAH多肽的核酸或如本文所述 的核酸。在一些態樣中，本發明提供了用於降低有需要的個體血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的rAAV載體。在一些態樣中，本發明提供了用於降低有需要的個體血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的rAAV顆粒。在一些態樣中，本發明提供了用於降低有需要的個體血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的組成物。在一些實施例中，與同等匹配對照(peer-matched control)個體的血液中苯丙胺酸含量相比，治療前個體血液中苯丙胺酸含量提高。在一些態樣中，本發明提供了用於降低有需要的個體血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予如本文所述的細胞。
在一些實施例中，核酸、rAAV載體、rAAV顆粒、組成物或細胞通過靜脈內、動脈內、肝內、門靜脈內、腹膜內或皮下投予。在一些實施例中，所述投予與另一種療法組合。在一些實施例中，另一種療法是用四氫生物蝶呤治療，用苯丙胺酸解氨酶(PAL)或聚乙二醇化PAL治療，或苯丙胺酸限制飲食。
在一些態樣中，本發明提供了用於製備PAH多肽的方法，其包括在產生PAH多肽的條件下培養如本文所述的細胞。在一些實施例中，所述方法還包括純化PAH多肽。
在一些態樣中，本發明提供了包含如本文所述的變異體PAH多肽的套組。在一些實施例中，本發明提供了包含如本文所述的核酸、如本文所述的rAAV載體、如本文所述的rAAV顆粒或如本文所述的組成物的套組。在一些實施例中，套組還包括使用說明；緩衝劑和/或醫藥上可接受的賦形劑；和/或瓶子、小瓶和/或注射器。
在一些態樣中，本發明提供了用於在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中表現盒包含可操作地連接至啟動子和增強子的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述增強子包括一個或兩 個修飾的凝血酶原增強子(pPrT2)、一個或兩個修飾的α1-微bikunin增強子(mA1MB2)、修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)、B型肝炎病毒增強子II(HEII)或CRM8增強子。在一些實施例中，mTTR啟動子是mTTR482啟動子。在一些實施例中，增強子在mTTR啟動子的5'側。
在一些態樣中，本發明提供了用於在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中表現盒包含可操作地連接至啟動子和和3'元件的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述3'元件是白蛋白3'元件(3'Alb)或連接至人類α1抗胰蛋白酶支架/基質附著區(SMAR)的白蛋白3'元件(3'AlbSMAR)。在一些實施例中，mTTR啟動子是mTTR482啟動子。在一些實施例中，3'元件位於轉基因的3'側。
在一些態樣中，本發明提供了用於在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中表現盒包含可操作地連接至啟動子和增強子和3'元件的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述增強子包括一個或兩個修飾的凝血酶原增強子(pPrT2)、一個或兩個修飾的α1-微bikunin增強子(mA1MB2)、修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)、B型肝炎病毒增強子II(HEII)或CRM8增強子，並且其中所述3'元件是白蛋白3'元件(3'Alb)或連接至人類α 1抗胰蛋白酶支架/基質附著區(SMAR)的白蛋白3'元件(3'AlbSMAR)。在一些實施例中，mTTR啟動子是mTTR482啟動子。在一些實施例中，增強子在mTTR啟動子的5'側。在一些實施例中，3'元件位於轉基因的3'側。
在一些實施例中，表現盒還包含內含子。在一些實施例中，所述內含子是雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白雜合內含子。在一些實施例中，表現盒還包含多腺苷酸化訊息。在一些實施例中，多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化訊息。
在一些實施例中，所述轉基因編碼PAH多肽或變異體PAH多肽。在一些實施例中，本發明提供了包含如本文所述的表現盒的載體。在一些實施例中，所述載體是重組型腺相關病毒(rAAV)載體。
在一些實施例中，本發明提供了包含如本文所述的表現盒的rAAV載體，所述表現盒的側翼是一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。在一些實施例中，所述表現盒的側翼是兩個AAV ITR。在一些實施例中，AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些實施例中，AAV ITR是AAV2 ITR。
在一些實施例中，所述載體是自身互補載體。在一些實施例中，所述載體包含編碼PAH多肽的第一核酸序列和編碼PAH多肽的補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可以與所述第二核酸序列沿著其大部分或全部長度形成鏈內鹼基對。在一些實施例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過經突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並且包含末端解鏈序列的突變。
在一些實施例中，本發明提供了包含如本文所述的rAAV載體的rAAV顆粒。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含經工程化的AAV衣殼。在一些實施例中，經工程化的AAV衣殼是DJ衣殼或LK03衣殼。在一些實施例中，rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼來源於相同的AAV血清型。 在一些實施例中，rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼來源於不同的AAV血清型。在一些實施例中，本發明提供了包含如本文所述的rAAV顆粒的組成物。在一些實施例中，所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
圖1A至圖1C示出了肝臟啟動子的最佳化。圖1A示出了前病毒質體構建體的示意圖。構建體mTTR482(編號1)通過添加各種肝臟增強子元件(構建體編號2至6)或3'穩定性元件(構建體編號7至8)進行修飾。將含CBA啟動子的構建體用於比較。所有構建體都含有側翼ITR、雜合內含子和SEAP報告子。然後將構建體轉染入Huh7細胞(圖1B)或HepG2細胞(圖1C)。轉染後72小時測量分泌的SEAP活性程度，並通過來自共轉染的LacZ質體的b-半乳糖苷酶量進行標準化歸一化。每次評價包含n=3至4/質體。
圖2A和圖2B示出了通過體內SEAP生產對肝臟啟動子的評估結果。圖2A示出了正常C57BL/6小鼠中的SEAP量。圖2B示出了PAHenu2小鼠中的SEAP量。在這兩個實驗中，質體載體通過量容量注射遞送，並且在不同時間點測量血漿的SEAP活性。每個治療組含有n=3至6隻動物。
圖3A-至圖3D示出了PAHenu2小鼠中肝臟啟動子性能的比較。將從sc-LP1或ss-A1MB2-mTTR啟動子(前導)表現mPAH的rAAV8載體以4e10(L)或1e11(M)VG/小鼠投予到雄性PAHenu2小鼠。圖3A示出了在56天的時間過程中血中Phe含量。除了n=2的初始動物之外，含量是n=8/組的平均值。圖3B示出了第56天的血中Phe含量。示出了以4e10或1e11 VG/小鼠投予的兩種構建體治療的動物或未治療動物的血漿Phe含量。圖3C示出了血中Tyr含量。在載體投予前(預採血)和載體投予後7天和56天測量的量。每個值是n=8/組的平均值。圖3D 示出了第56天肝臟中的載體基因組。通過qPCR測定載體拷貝，並示出n=5/組的平均值。
圖4A至圖4D示出了對PAHenu2小鼠的腦的分析。在治療後56天處死來自未治療的、ss-mA1MB2-mTTR(前導)構建體(4e10和1e11 vg/小鼠)治療的、和sc-LP1(1e11 vg/小鼠)治療的PAHenu2小鼠的五隻動物，用PBS灌注並收集腦用於分析。將Balb/C小鼠用作野生型對照(WT)。圖4A示出了腦Phe的量。圖4B示出了血中和腦Phe含量的相關性。圖4C示出了腦中多巴胺含量。圖4D示出了腦血清素的量。所有值代表n=5/組的平均值(除了未治療的PAHenu2小鼠n=2)。如圖3A至3C所述進行研究。
圖5A和圖5B示出了人PAH cDNA的密碼子最佳化。將編碼FLAG標記的hPAH的cDNA轉殖(clone)到mTTR482-hPAH-BGHpA表現質體中。在體外和體內測試hPAH的產生。圖5A示出了Huh7細胞中的FLAG-hPAH量。轉染質體，並在48小時後製備細胞裂解物。以西方墨點法分析細胞裂解物中的PAH蛋白量。圖5B示出了C57BL/6小鼠肝臟中的FLAG-hPAH量。質體藉由高壓注射法(hydrodynamic injections)投予，並在24小時後收集肝臟。使用FLAG-ELISA對肝裂解物中FLAG標記的hPAH量進行定量，並以總蛋白量進行標準化。值代表n=4至5隻動物/組的平均值。縮寫：C，陰性對照質體；GS，Genscript，GA，GeneArt，GS CpG，除去CpG的Genscript序列；non，原始hPAH DNA序列；初始(naïve)，未經治療的動物。
圖6A是西方墨點法結果，其示出了在不同啟動子(mTTR482、CBA和LP1)的控制下，人類苯丙胺酸羥化酶(hPAH)和小鼠苯丙胺酸羥化酶(mPAH)的表現。將表現質體轉染至Huh7細胞，並且在兩天後使用針對FLAG的抗體分析細胞裂解物的FLAG-PAH量。
圖6B是西方墨點法結果，其示出了全長(FL)和雙截斷(DT)人和小鼠PAH體外表現的比較。分析方式如圖6A。
圖6C是全長(FL)和雙截斷(DT)形式兩者的hPAH和mPAH蛋白量的比較。用表現質體轉染後，通過ELISA對Huh7細胞裂解物進行FLAG標記的蛋白質的定量。
圖6D是hPAH和mPAH mRNA量的比較。通過qPCR對圖6C中所使用的材料進行RNA分析。
圖6E是西方墨點法結果，其示出了純化的hPAH和mPAH(均以全長和雙截斷形式產生)的分析。蛋白質通過FLAG親和管柱來純化，並在SDS-PAGE凝膠中運行，隨後用抗FLAG抗體檢測。
圖6F示出了在PKU小鼠模型中編碼hPAH或mPAH的rAAV8載體的功效。hPAH和mPAH兩者均由具有LP1啟動子的自身互補載體(sc-LP1)表現。將功效作為在單次IV注射到PAHenu2小鼠中之後血中Phe含量的降低來測量。
圖7A至圖7C示出了小鼠/人雜合PAH構建體的產生。圖7A示出了小鼠/人雜合PAH構建體的示意圖。顯示了來源於人(綠色)和小鼠(灰色)PAH的區域。圖7B示出了替代hPAH的N末端區域對蛋白質表現量的影響。圖7C示出了hPAH的C末端區域的變化對蛋白質表現量的影響。通過將具有CBA-PAH表現盒的質體轉染到293T細胞中進行實驗。在48小時後，收集細胞用於通過FLAG ELISA定量FLAG-PAH。
圖8A和圖8B示出了體外篩選雙截斷hPAH(hPAH-DT)變異體。圖8A示出了質體表現的hPAH蛋白變異體(編號1至編號8)的蛋白表現量。圖8B示出了質體表現的hPAH蛋白變異體的PAH活性程度。將所有變異體轉染到293細胞中，並由具有CBA啟動子的質體表現。將變異體質體的結果與表現人類或小鼠PAH的類似質體進行比較。
圖9A至圖9C示出了針對體外PAH產生對hPAH-V1-DT衍生物的表徵。圖9A示出了hPAH-V1-DT衍生物的PAH活性程度。圖9B示出了hPAH-V1-DT衍生物的PAH蛋白量。圖9C示出了hPAH-V1-DT衍生物的特定PAH活性。結果係基於對來自轉染的293細胞的細胞裂解物的分析。
圖10A至圖10C示出了針對體外PAH產生對hPAH-V1-DT衍生物的重複分析。圖10A示出了所選擇hPAH-V1-DT衍生物的PAH活性程度。圖10B示出了hPAH-V1-DT衍生物的PAH蛋白量。圖10C示出了hPAH-V1-DT衍生物的特定PAH活性。數據如圖8A和8B中所述生成。圖10D示出了變異體-1的三個雙突變體形式的PAH活性。數據如圖8A和8B中所述生成。
圖11A至圖11C示出了全長hPAH-V1與小鼠PAH(mPAH)和人類PAH(hPAH)的體外比較。圖11A是蛋白質表現的西方墨點法分析結果。圖11B示出了通過FLAG-ELISA的PAH蛋白量。圖11C示出了PAH活性程度。通過將具有肝啟動子A1MB2-mTTR482且編碼全長PAH蛋白的表現質體轉染到Huh7中，隨後分析細胞裂解物來產生數據。m表示標記泳道。
圖12A至圖12C示出了在PAHenu2小鼠中表現全長hPAH-V1的rAAV載體的功效與小鼠和人類PAH的功效的比較。圖12A示出了血中苯丙胺酸含量。圖12B示出了血中酪胺酸含量。圖12C示出了血中苯丙胺酸代謝物含量。P值表示為：*為P<0.05，**為P<0.01，並且***為P<0.001。所有治療組均由從肝臟啟動子表現FLAG標記的PAH的AAV8載體組成。在第0天通過IV途徑以3e11(hPAH、hPAH-V1和mPAH)或1e12 vg/小鼠(hPAH和hPAH-V1)注射載體。初始PAHenu2小鼠和雜合子(HET)分別用作陰性和陽性對照。
圖13A至圖13C示出了肝臟中rAAV載體基因組和3x-FLAG-PAH量的定量結果。圖13A示出了PAH蛋白量。圖13B示出了PAH活性程度。圖13C示出了肝臟中的載體基因組拷貝。如圖12A至12C所述進行實驗，並在載體投予 後69天收集肝臟。在每個圖中，示出了3e11 VG/小鼠治療組(hPAH、hPAH-V1和mPAH)和1e12 vg/小鼠治療組(hPAH、hPAH-V1)的數據。P值，***為<0.001。
圖14A至圖14D示出了腦中各種胺基酸量的定量結果。圖14A示出了腦苯丙胺酸含量。圖14B示出了腦酪胺酸含量。圖14C示出了腦與血中苯丙胺酸含量之間的相關性。圖14D示出了腦色胺酸含量。如圖12A至12C所述進行了實驗。示出的數據來自以3e11 VG/小鼠給藥的治療組(n=5/組)(第69天)。P值，***為<0.001。
圖15A至圖15D示出了腦中的神經傳導物質含量。圖15A示出了腦多巴胺含量。圖15B示出了多巴胺代謝物DOPAC的腦中含量。圖15C示出了腦血清素含量。圖15D示出了血清素代謝物HIAA的腦中含量。實驗如圖12A至12C所述進行，並且值來自3e11 VG/小鼠群組(第69天)。P值，**為P<0.01，並且***為P<0.001。
圖16A至圖16B示出了3.8和4.6kb A1MB2-mTTR-hPAV-V1載體基因組的功效比較。圖16A示出了載體的示意圖。圖16B示出了PAHenu2小鼠中的功效測試。以1e11 vg/小鼠投予一次從肝臟啟動子(前導)表現hPAH-V1的AAV8載體，並以血中Phe含量來測量功效。還將這些載體與具有hPAH-V1且不具有N末端標簽的4.6kb載體進行了比較(以1e11和3e11 vg/小鼠測試)。
圖17A至圖17C示出了用rAAV載體遞送後非人類靈長類動物肝臟中hPAH-V1與hPAH生成的體內比較結果。圖17A示出了各隻動物的肝臟中rAAV載體基因組的量。圖17B示出了每隻所治療動物的肝臟和脾臟中載體衍生的mRNA量。將每隻動物的mRNA量對載體基因組拷貝數進行標準化歸一化。圖17C示出了對肝勻漿中FLAG標記的PAH蛋白的檢測結果。通過檢測管家蛋白(housekeeping protein)GAPDH來確認裂解物的加載量相等。實驗是通過IV投予5e12 g/kg從A1MB2-mTTR啟動子表現FLAG標記的PAH或PAH-V1的rAAV載 體來進行的。2周後收集組織來分析肝臟中的載體基因組、載體衍生的mRNA和PAH蛋白。
在一些態樣中，本文所述的本發明提供了人類PAH(hPAH-V1)多肽的變異體，其包含至少兩個四個胺基酸的變化，與野生型hPAH相比，所述變化在體外和體內賦予更高的PAH蛋白量和/或活性程度。在其他態樣中，本文所述的本發明提供了改進的人PAH(hPAH-V1)的變異體，其包含至少兩個、三個或四個胺基酸的變化，與野生型hPAH相比，所述變化在體外和體內賦予更高的PAH蛋白量和/或活性程度。在一些態樣中，本發明提供了編碼所述人類PAH變異體的核酸。在一些態樣中，本發明提供了包含本公開文本的變異體PAH多肽的表現盒、重組型腺相關病毒(rAAV)載體和病毒顆粒以及醫藥組成物。在其他態樣中，本發明提供了用於治療苯丙酮尿症(PKU)的方法；例如，通過增加PAH活性，增加酪胺酸和色胺酸向腦的轉運，並使包括多巴胺和血清素的腦神經傳導物質量正常化。在額外的其他態樣中，本發明提供了以本公開文本的變異體PAH來治療個體中PKU的套組。
I. 通用技術
熟習此項技術者通常熟知並且通常使用常規方法來使用本文描述或引用的技術和程序，例如像描述在以下文獻中的廣泛使用的方法：Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook等人，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，紐約，2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel，等人編輯，2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R. Taylor編輯，1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane編輯，1988)；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney，第6版，J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編輯，Academic Press,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell編輯，J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯，1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos編輯，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編輯，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編輯，J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等人，2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.編輯，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean編輯，Oxford University Press,2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra編輯，Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人編輯，J.B.Lippincott Company,2011)。
II. 定義
如本文所用的「載體」是指包含有待在體外或在體內遞送至宿主細胞中的核酸的重組質體或病毒。
如本文所用的術語「多核苷酸」或「核酸」是指任何長度的聚合形式的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)。因此，此術語包括但不限於單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA；基因組DNA；cDNA；DNA-RNA雜合體；或者包括嘌呤和嘧啶鹼基或其他天然的、化學修飾的或生化修飾的核苷酸鹼基，非天然的或衍生的核苷酸鹼基的聚合物。多核苷酸的主鏈可包括糖和磷酸基團(正如典型地可在RNA或DNA中所見的)或者經修飾或取代的糖或磷酸基團。可替代地，多核苷酸的主鏈可以包含合成亞基(如胺基磷酸酯)的聚合物，並且因此可以是寡脫氧核苷胺基磷酸酯(P-NH2)或混合的胺基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。此外，雙鏈多核苷酸可以從化學合成的單鏈多核苷酸產物，通過合成互補鏈並在適當的條件下使這些鏈退火或者是通過使用DNA聚合酶用適當的引物從頭合成互補鏈來獲得。
術語「多肽」和「蛋白質」可互換使用以指代胺基酸殘基的聚合物，並且不限於最小長度。胺基酸殘基的此類聚合物可以含有天然或非天然胺基酸殘基，並且包括但不限於胺基酸殘基的肽、寡肽、二聚體、三聚體和多聚體。所述定義涵蓋了全長蛋白質及其片段兩者。所述術語還包括多肽的表現後修飾，例如糖基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化等。此外，出於本公開文本的目的，「多肽」是指包括對天然序列的修飾(如缺失、添加和取代，在本質上通常是保守的)的蛋白質，只要所述蛋白質保持期望的活性即可。這些修飾可能是故意的(如通過定點誘變)，或可能是偶然的(如通過產生蛋白質的宿主的突變或由於PCR擴增引起的錯誤)。
「重組病毒載體」是指包含一個或多個異源序列(即，不是病毒來源的核酸序列)的重組多核苷酸載體。在重組AAV載體的情況下，重組核酸的側翼是至少一個，且在實施例中是兩個反向末端重複序列(ITR)。
「重組AAV載體(rAAV載體)」是指包含一個或多個側翼是至少一個，且在實施例中是兩個AAV反向末端重複序列(ITR)的異源序列(即，不是AAV來源的核酸序列)的多核苷酸載體。當此類rAAV載體存在於已感染合適的輔助病毒(或所述輔助病毒表現合適的輔助功能)並且正在表現AAV rep和cap基因產物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主細胞中時，所述rAAV載體可以被複製並包裝在感染性病毒顆粒中。當將rAAV載體摻入較大多核苷酸中(例如，在染色體中或在用於轉殖或轉染的另一種載體如質體中)時，則rAAV載體可以被稱為「前載體」，其可以通過在AAV包裝功能和合適輔助功能的存在下複製和衣殼化被「挽救」。rAAV載體可以是多種形式中的任一種，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質複合、包封在脂質體內、和衣殼化於病毒顆粒(特別是AAV顆粒)中。rAAV載體可以被包裝在AAV病毒衣殼中，以產生「重組腺相關病毒顆粒(rAAV顆粒)」。
「異源的」意指衍生自基因型不同於其所比較或其所引入或摻入的實體的其餘部分的實體。例如，通過基因工程技術引入不同細胞類型中的多核苷酸是異源多核苷酸(並且在表現時可以編碼異源多肽)。類似地，摻入病毒載體的細胞序列(例如，基因或其部分)是相對於所述載體的異源核苷酸序列。
術語「轉基因」是指引入細胞並且能夠轉錄成RNA並且任選地在適當條件下轉譯和/或表現的多核苷酸。在多個態樣中，它賦予引入它的細胞以所期望的特性，或以其他方式產生所期望的治療或診斷結果。
「雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子」是指來源於雞β-肌動蛋白基因(例如，紅原雞(Gallus gallus)β肌動蛋白，以GenBank Entrez Gene ID 396526表示)的多核苷酸序列。如本文所用，「雞β-肌動蛋白啟動子」可以指含有巨細胞病毒(CMV)早期增強子元件、雞β-肌動蛋白基因的啟動子和第一外顯子和 內含子、和兔β-球蛋白基因的剪接受體的啟動子，如Miyazaki,J.等人(1989)Gene 79(2)：269-77中所述序列。如本文所用，術語「CAG啟動子」可以互換使用。如本文所用，術語「CMV早期增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子」可以互換使用。
如關於病毒滴度使用的術語「基因組顆粒(gp)」、「基因組當量」或「基因組拷貝」是指含重組AAV DNA基因組的病毒顆粒的數量，與感染性或功能性無關。特定載體製劑中基因組顆粒的數量可以通過如本文實例中或例如以下文獻中所述的程序來測量：Clark等人(1999)Hum.Gene Ther.,10：1031-1039；Veldwijk等人(2002)Mol.Ther.,6：272-278。
如本文所用的術語「載體基因組(vg)」可以指包含一組載體(例如，病毒載體)的多核苷酸序列的一種或多種多核苷酸。載體基因組可以衣殼化於病毒顆粒中。根據特定的病毒載體，載體基因組可以包含單鏈DNA、雙鏈DNA或單鏈RNA或雙鏈RNA。載體基因組可以包括與特定病毒載體相關的內源序列和/或通過重組技術插入特定病毒載體的任何異源序列。例如，重組AAV載體基因組可以包括位於啟動子側翼的至少一個ITR序列、填充片段、感興趣序列(例如RNAi)和多腺苷酸化序列。完整的載體基因組可以包括載體的全組多核苷酸序列。在一些實施例中，病毒載體的核酸滴度可以按vg/mL測量。適用於測量此滴度的方法在本領域中是已知的(例如，定量PCR)。
如關於病毒滴度使用的術語「感染單位(iu)」、「感染性顆粒」或「複製單位」是指感染性和複製型重組AAV載體顆粒的數量，如通過感染中心測定(也稱為複製中心測定)測量的，如例如McLaughlin等人(1988)J.Virol.,62：1963-1973中所述。
如關於病毒滴度使用的術語「轉導單位(tu)」是指導致產生功能轉基因產物的感染性重組AAV載體顆粒的數量，如在功能測定中測量的，如 本文實例中或例如以下文獻中所述：Xiao等人(1997)Exp.Neurobiol.,144：113-124中；或Fisher等人(1996)J.Virol.,70：520-532(LFU測定)。
「反向末端重複」或「ITR」序列是本領域中熟知的術語，並且是指在病毒基因組末端發現的處於相反方向的相對較短的序列。
「AAV反向末端重複(ITR)」序列是本領域中熟知的術語，是存在於天然單鏈AAV基因組的兩端處的大約145個核苷酸的序列。ITR的最外側的125個核苷酸能以兩個替代方向中的任一個存在，導致不同AAV基因組之間以及單個AAV基因組兩端之間的異質性。最外側的125個核苷酸也含有幾個較短的自身互補的區域(指定為A、A'、B、B'、C、C'和D區)，允許在ITR的這個部分內發生鏈內鹼基配對。
「末端解鏈序列」或「trs」是AAV ITR的D區中的序列，其在病毒DNA複製期間被AAV rep蛋白切割。突變體末端解鏈序列難以被AAV rep蛋白切割。
「AAV輔助功能」是指允許AAV被宿主細胞複製和包裝的功能。AAV輔助功能可以按多種形式中的任一種提供，包括但不限於協助AAV複製和包裝的輔助病毒或輔助病毒基因。其他AAV輔助功能在本領域中是已知的，如基因毒性劑。
AAV的「輔助病毒」是指允許AAV(其是缺陷型細小病毒)被宿主細胞複製和包裝的病毒。輔助病毒提供允許AAV複製的「輔助功能」。已經鑒定了多種此類輔助病毒，包括腺病毒、皰疹病毒和痘病毒，如牛痘和杆狀病毒。腺病毒涵蓋多種不同子群，但子群C的5型腺病毒(Ad5)是最常用的。人、非人哺乳動物和鳥類來源的許多腺病毒是已知的，並且可從如ATCC等保藏機構獲得。也可從如ATCC等保藏機構獲得的皰疹家族病毒包括例如單純皰疹病毒(HSV)、愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV) 和假狂犬病病毒(PRV)。用於複製AAV的腺病毒輔助功能的例子包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4orf6功能。可從保藏機構獲得的杆狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒。
如果感染性AAV顆粒與感染性輔助病毒顆粒的比率是至少約102：1；至少約104：1、至少約106：1；或至少約108：1或更多，則rAAV的製劑被稱為是「基本上不含」輔助病毒。在一些實施例中，製劑也不含等效量的輔助病毒蛋白(即，如果上述輔助病毒顆粒雜質以受破壞形式存在，將由於這一水準的輔助病毒而存在蛋白質)。病毒和/或細胞蛋白污染通常可以在SDS凝膠上作為考馬斯染色條帶的存在而被觀察到(例如，出現不同於對應於AAV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的那些條帶的條帶)。
將關於參考多肽或核酸序列的「序列同一性百分比(%)」定義為在比對序列並引入空位(如果需要)以實現最大序列同一性百分比之後，並且不將任何保守取代視為序列同一性的一部分，候選序列中與參考多肽或核酸序列中的胺基酸殘基或核苷酸相同的胺基酸殘基或核苷酸的百分比。用於確定胺基酸或核酸序列同一性百分比的目的的比對可以用在本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用可公開獲得的計算機軟件程序，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編輯，1987)，增刊30，第7.7.18章，表7.7.1中描述的那些，並且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。較佳的比對程序是ALIGN Plus(科學教育軟件(Scientific and Educational Software)，賓夕法尼亞州(Pennsylvania))。熟習此項技術者可以確定用於測量比對的適當參數，包括為了在被比較的序列的全長上實現最大比對所需要的任何算法。出於本文的目的，給定胺基酸序列A與(to、with或against)給定胺基酸序列B的胺基酸序列同一性%(其可以可替代地表述為具有或包含與(to、with或against)給定胺基酸序列B的一定胺基酸序列同一性%的給定胺基酸序列 A)計算如下：100乘以分數X/Y，其中，X是通過序列比對程序在所述程序對A和B的比對中被評為相同匹配的胺基酸殘基的數量，並且其中Y是B中胺基酸殘基的總數。應瞭解當胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度時，A對於B的胺基酸序列同一性%將不等於B對於A的胺基酸序列同一性%。出於本文的目的，給定核酸序列C與(to、with或against)給定核酸序列D的核酸序列同一性%(其可以可替代地表述為具有或包含與(to、with或against)給定核酸核酸D的一定核酸序列同一性%的給定核酸序列C)計算如下：100乘以分數W/Z，其中，W是通過序列比對程序在所述程序對C和D的比對中被評為相同匹配的核苷酸的數量，並且其中Z是D中核苷酸的總數。應瞭解當核酸序列C的長度不等於核酸序列D的長度時，C對於D的核酸序列同一性%將不等於D對於C的核酸序列同一性%。
「經分離的」分子(例如，核酸或蛋白質)或細胞意指已經從其天然環境的組分中鑒別並分離和/或回收。
「有效量」是足以產生有益或期望結果的量，所述結果包括臨床結果(例如，症狀的改善、臨床終點的實現等)。有效量能以一次或多次投予來投予。就疾病狀態而言，有效量是足以改善、穩定疾病或延遲疾病發展的量。
「個體」或「受試者」是哺乳動物。哺乳動物包括但不限於家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物(例如人和非人靈長類動物如猴)、兔和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)。在某些實施例中，所述個體或受試者是人。
如本文所用，「治療」是用於獲得有益或期望臨床結果的途徑。出於本公開文本的目的，有益或期望的臨床結果包括但不限於以下：緩解症狀、減小疾病的程度、穩定疾病狀態(例如不惡化)、防止疾病擴散(例如，轉移)、延遲或減緩疾病進展、改善或緩和疾病狀態、以及緩解(無論是部分或是全部)， 無論是可檢測的還是不可檢測的。「治療」還可以意指與如果沒有接受治療的預期的存活期相比，延長存活期。
如本文所用，術語「預防性治療」是指這樣的治療，其中已知或懷疑個體患有障礙或具有患上障礙的風險，但尚未展示出該障礙的症狀或展示出該障礙的最小症狀。可以在症狀發作之前治療經歷預防性治療的個體。
如本文所用，「苯丙胺酸羥化酶(PAH)」是催化苯丙胺酸芳香側鏈羥基化生成酪胺酸的酶(EC 1.14.16.1)。PAH是單加氧酶，其使用四氫生物蝶呤(BH4，一種蝶呤輔因子)和非血紅素鐵進行催化。在反應過程中，分子氧被異裂，其中將一個氧原子連續摻入BH4和苯丙胺酸受質中。苯丙胺酸羥基化為酪胺酸是苯丙胺酸分解代謝的限速步驟，並且這種酶活性的缺乏導致常染色體隱性障礙苯丙酮尿症。PAH也可稱為PH、PKU或PKU1。PAH是多結構域蛋白質，其由N末端調節結構域(1至117)、中心催化結構域(118-410)和C末端四聚結構域(411至452)組成。人PAH在GenBank中提供；例如，NM_000277、NM_00877、NM_001354304、NP_000268、NP_032803、NP_001341233、AAA60082.1、AAH26251.1、AAC51772.1和AAL78816.1(GI：18765885)。人PAH的例子是作為SEQ ID NO：1來提供。
如本文所用，「苯丙酮尿症(PKU)」是指肝酶苯丙胺酸羥化酶(PAH)的遺傳缺陷。在沒有任何治療的情況下，嚴重形式的PKU導致高度升高的血中Phe含量，這具有神經毒性，並與嚴重的精神發育遲滯相關聯。
「mTTR啟動子」是指來源於鼠甲狀腺素運載蛋白基因的多核苷酸序列。mTTR啟動子的例子mTTR482由Kyostio-Moore,(2016)和Nambiar(2017)提供。
「修飾的凝血酶原增強子(mPrT2)」是指來源於人凝血酶原基因的多核苷酸序列的兩個拷貝。mPrT2增強子的例子由(McEachern 2006，Jacobs 2008)提供。mPrT2序列的例子由SEQ ID NO：7提供。
「經修飾的α1-微bikunin(mA1MB2)」是指來源於人類α1-微bikunin/bikunin(alpha1-microglobulin/bikunin)基因的多核苷酸序列的兩個拷貝。 mA1MB2的例子是(McEachern 2006，Jacobs 2008)的增強子。mA1MB2序列的例子由SEQ ID NO：8提供。
「經修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)」是指來源於鼠類白蛋白基因的多核苷酸序列。mEalb增強子的例子由(Kramer 2003)提供。mEalb序列的例子由SEQ ID NO：9提供。
「B型肝炎病毒增強子II(HEII)」是指來源於B型肝炎病毒的位於前C區啟動子上游的多核苷酸序列。hEII增強子的例子由(Kramer 2003)提供。HEII序列的例子由SEQ ID NO：10提供。
「CRM8」是指來源於來自人類Serpina1基因的多核苷酸序列的順式作用調節模組(Chuah 2014)。CRM8序列的例子由SEQ ID NO：11提供。
「Alb 3」是指人類白蛋白基因編碼區3'側的多核苷酸序列。Alb 3'元件的例子由Wooddell(2008)提供。Alb 3'序列的例子由SEQ ID NO：12提供。「Alb3'/SMAR」是指連接至人類α1-抗胰蛋白酶基因(AF156542)的支架/基質附著區的Alb3'。Alb3'/SMAR序列的例子由SEQ ID NO：13提供。
本文對「約」某一值或參數的提及包括(並描述)涉及所述值或參數本身的實施例。例如，提及「約X」的描述包括「X」的描述。
除非另外說明，否則如本文所用，冠詞的單數形式「一個(a)」、「一種(an)」和「所述」包括複數指示物。
應理解，本文所述的公開文本的態樣和實施例包括「包含」態樣和實施例、「由態樣和實施例組成」和/或「基本上由態樣和實施例組成」。
III. PAH變異體
在一些態樣中，本發明提供了變異體PAH多肽，當在個體中表現時，其賦予更高的PAH表現和/或活性程度。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含至少兩個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250、S251、H264、G256、G272、G275、P279、T323和F327的位點處。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含在H264和G275處的至少兩個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含至少三個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含在野生型人類PAH多肽的位點M180、K199、S250和G256處的四個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含在M180、K199、S250、S251、G256、G272和P279處的五個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含在M180、K199、S250、G256、T323和F327處的六個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含H264P和G275H的至少兩個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含選自M180T、K199P、S250P和G256A的至少三個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含包括以下的胺基酸取代：K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。在一些實施例中，變異體PAH多肽還包含胺基酸取代H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽是表1至3中列出的任一種變異體PAH多肽。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A，並且包含另外的 胺基酸取代，同時至少大致保持野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性。在一些實施例中，胺基酸取代的位置基於野生型人類PAH多肽；例如，包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的人類PAH多肽。
在一些實施例中，變異體PAH多肽是人類PAH多肽。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列的變異體PAH多肽具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性。在一些實施例中，包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列的變異體PAH多肽具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的SEQ ID NO：1的野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性。
在一些實施例中，變異體PAH多肽是保持苯丙胺酸羥化酶活性的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含N末端截斷。在一些實施例中，N末端截斷是N末端調節結構域的部分或全部截斷。在一些實施例中，N末端截斷是野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的胺基酸殘基1至約胺基酸殘基102的缺失。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含C末端截斷。在一些實施例中，C末端截斷是四聚結構域的部分或全部截斷。在一些實施例中，C末端截斷是野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的約429至452的胺基酸殘基的缺失。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含N末端截斷和C末端截斷。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含N末端調節序列的部分或全部截斷以及四聚結構域的部分或全部截斷。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的胺基酸 殘基1至約胺基酸殘基102和約429至約452的缺失。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含對應於野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的約102至約428的胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含對應於野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的102至428的胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，截斷型PAH多肽還包含在野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的位點M180、K199、S250和G256處的四個胺基酸取代。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含選自M180T、K199P、S250P和G256A的四個胺基酸取代。在一些實施例中，截斷型的變異體PAH多肽還包含表1至3中列出的胺基酸取代的任一種組合。在一些實施例中，截斷型PAH多肽具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的野生型PAH(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的苯丙胺酸羥化酶活性。
在一些實施例中，變異體PAH多肽包含在以下位點的一個或多個處的一個或多個胺基酸取代：G33、G46、G103、G139、G148、G188、G218、G239、G247、G257、G272、G289、G307、G312、G332、G337、G344、G352或G442。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含以下胺基酸取代中的一個：G33A、G46(A、P)、G103A、G139(A、P)、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A或G442A。在一些實施例中，變異體編號1PAH多肽還包含在以下位點的一個或多個位點的一個或多個胺基酸取代：G33、G46、G103、G139、G148、G188、G218、G239、G247、G257、G272、G289、G307、G312、G332、G337、G344、G352或G442。在一些實施例中，變異體編號1的PAH多肽包含以下胺基酸取代中的一個或多個：G33A、G46(A、P)、G103A、G139(A、P)、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A或G442A。
在一些實施例中，變異體PAH多肽(例如變異體編號1的PAH多肽)包含以下胺基酸取代中的一個或多個：P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、S446H。在一些實施例中，變異體PAH多肽(例如變異體編號1)還包含在人類PAH的C末端處的絲胺酸殘基(Ser453)。
在一些實施例中，變異體PAH多肽(例如變異體編號1的PAH多肽)包含以下胺基酸取代中的一個或多個：F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P、N376P。
在一些實施例中，變異體PAH多肽(例如變異體編號1的PAH多肽)包含任何胺基酸取代，以消除潛在的蛋白酶切割位點。在一些實施例中，用於消除潛在蛋白酶切割位點的胺基酸取代位於PAH片段270至295和380至405內。
在一些實施例中，變異體PAH多肽(例如變異體編號1的PAH多肽)包含轉譯後修飾，以增強人類PAH的穩定性。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含轉譯後修飾，如聚乙二醇化和通過外部亞硝基化試劑對Cys殘基(特別是I374C)進行的亞硝基化。
III. 核酸
在一些態樣中，本發明提供了編碼變異體PAH多肽的核酸，當在個體中表現時，所述變異體PAH多肽賦予更高的PAH活性程度。在一些實施例中，所述核酸編碼包含至少三個胺基酸取代的變異體PAH多肽，其中所述胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。在一些實施例中，所述核酸編碼包含在野生型人類PAH多肽的位點M180、K199、 S250和G256處的四個胺基酸取代的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含選自M180T、K199P、S250P和G256A的至少三個胺基酸取代的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含包括以下的胺基酸取代的變異體PAH多肽：K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。在一些實施例中，所述核酸編碼包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼還包含胺基酸取代H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T胺基酸取代的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼是表1至3中列出的任一種變異體PAH多肽的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A，並且包含另外的胺基酸取代，同時至少大致保持野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性的變異體PAH多肽。在一些實施例中，由所述核酸編碼的胺基酸取代的位置基於野生型人類PAH多肽；例如，包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的人類PAH多肽。
在一些實施例中，所述核酸編碼變異體人類PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列並且具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列並且具有至少 約25%、50%、75%、100%或大於100%的SEQ ID NO：1的野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性的變異體PAH多肽。
在一些實施例中，所述核酸編碼是保持苯丙胺酸羥化酶活性的截斷型PAH多肽的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含N末端截斷的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼是N末端調節結構域的部分或全部截斷的N末端截斷。在一些實施例中，所述核酸編碼包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的胺基酸殘基1至約胺基酸殘基102的缺失的N末端截斷。在一些實施例中，所述核酸編碼包含C末端截斷的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼是四聚結構域的部分或全部截短的C末端截斷。在一些實施例中，所述核酸編碼包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的約429至452的胺基酸殘基的缺失的C末端截斷。在一些實施例中，所述核酸編碼包含N末端截斷和C末端截斷的變異體PAH多肽。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含N末端調節序列的部分或全部截斷以及四聚結構域的部分或全部截斷。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的胺基酸殘基1至約胺基酸殘基102和約429至約452的缺失。在一些實施例中，所述核酸編碼包含對應於野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的約102至約428的胺基酸殘基的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含對應於野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的102至428的胺基酸殘基的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼截斷型PAH多肽，該截斷PAH多肽還包含在野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的位點M180、K199、S250和G256處的四個胺基酸取代。在一些實施例中，所述核酸編碼截斷型PAH多肽，該截斷PAH多肽包含選自M180T、K199P、S250P和G256A的四個胺基酸取代的。在一些實施例中，所述核酸編碼截斷型變異體 PAH多肽，該截斷型變異體PAH多肽還包含表1至3中列出的胺基酸取代的任一種組合。在一些實施例中，所述核酸編碼截斷型PAH多肽，該截斷型PAH多肽具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的野生型PAH(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的苯丙胺酸羥化酶活性。
在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，所述啟動子選自巨細胞病毒(CMV)即時早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、小鼠轉甲狀腺素蛋白啟動子(mTTR)、mTTR482啟動子、mA1MB2-mTTR482啟動子、TK啟動子、四環素響應型啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、LP1啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG)啟動子、延長因子1-α啟動子(EF1-α)啟動子、人類β-葡糖醛酸酶啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、逆轉錄勞斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子和13-肌動蛋白啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是LP1啟動子或mA1MB2-mTTR482啟動子。
在一些實施例中，所述核酸還包含多腺苷酸化訊息。在一些實施例中，多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化訊息、SV40多腺苷酸化訊息或HSV TK pA。在一些實施例中，多腺苷酸化訊息是合成的多腺苷酸化訊息，如Levitt,N等人(1989),Genes Develop.3：1019-1025中所述。
在一些實施例中，所述核酸還包含內含子。對於熟習此項技術者而言可用於本發明的各種內含子是已知的，並且包括MVM內含子、F IX截斷型內含子1、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈SA、腺病毒SD/免疫球蛋白SA、SV40晚期SD/SA(19S/16S)和雜合腺病毒SD/IgG SA。(Wu等人2008,Kurachi等人，1995,Choi等人2014,Wong等人，1985,Yew等人1997,Huang和Gorman(1990)。在一些 實施例中，所述內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。在一些實施例中，內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜交啟動子和內含子，其中所有的ATG位點被去除以最小化錯誤轉譯起始位點(SEQ ID NO：15)。
在一些實施例中，核酸可以包括(一種或多種)填充核酸。在一些實施例中，填充核酸可以包含編碼報導多肽的序列。如熟習此項技術者將理解的，填充核酸可以位於核酸內的多個區域內，並且可以由核酸內的一個連續序列(例如，在單個位置中的單個填充核酸)或多個序列(例如，在超過一個位置(例如2個位置、3個位置等)中的超過一個填充核酸)組成。在一些實施例中，填充核酸可以位於編碼變異體PAH多肽的核酸序列的下游。在實施例中，填充核酸可以位於編碼變異體PAH多肽的核酸序列的上游(例如，在啟動子與編碼變異體PAH多肽的核酸序列之間)。如熟習此項技術者還將理解的，可以使用各種核酸作為填充核酸。在一些實施例中，填充核酸包含人類α-1-抗胰蛋白酶(AAT)填充序列或C16 P1染色體16 P1殖株(人類C16)填充序列的全部或一部分。在一些實施例中，填充序列包含基因的全部或一部分。例如，填充序列包含人類AAT序列的一部分。熟習此項技術者將理解，基因(例如人類AAT序列)的不同部分可以用作填充片段。例如，填充片段可以來自基因的5'末端、基因的3'末端、基因的中間部分、基因的非編碼部分(例如內含子)、基因的編碼區(例如外顯子)、或基因的非編碼部分和編碼部分的混合物。熟習此項技術者還將理解，填充序列的全部或一部分可以用作填充序列。在一些實施例中，填充序列被修飾以去除內部ATG密碼子。在一些實施例中，填充序列包含SEQ ID NO：16的核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼人類PAH多肽的分離核酸是密碼子最佳化的。在一些實施例中，編碼人類PAH多肽的分離核酸針對在特定細胞(如真核細胞)中表現進行了密碼子最佳化。真核細胞可以是特定生物的那些或源自於 特定生物，所述生物如哺乳動物，包括但不限於人類、小鼠、大鼠、兔、狗或非人類靈長類動物。通常，密碼子最佳化是指藉由以更頻繁或最常用於所述宿主細胞的基因中的密碼子來替代天然序列中的至少一個密碼子來修飾核酸序列，以增強在感興趣宿主細胞中的表現，同時保持天然胺基酸序列的過程。各種物種表現出對特定胺基酸的某些密碼子的特別偏好。密碼子使用表很容易獲得，例如在「密碼子使用數據庫」中，並且這些表可以以多種方式修改(例如參見，Nakamura,Y.等人(2000)Nucleic Acids Res.28：292)。還可獲得用於針對在特定宿主細胞中的表現對特定序列進行密碼子最佳化的計算機算法，如Gene Forge(Aptagen；雅各布斯區(Jacobus)，賓夕法尼亞州)、DNA2.0、GeneArt(GA)或Genscript(GS)以及與CpG含量的降低相結合的GS算法。在一些實施例中，編碼PAH多肽的核酸使用GA算法進行密碼子最佳化。在一些實施例中，所述核酸序列與SEQ ID NO：14的核酸序列至少80%相同。在一些實施例中，所述核酸包含SEQ ID NO：14的核酸序列。
IV. 肝臟特異性表現盒
在一些態樣中，本發明提供了用於在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中表現盒包含可操作地連接至啟動子和增強子的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述增強子包括一個或兩個修飾的凝血酶原增強子(mPrT2)、一個或兩個修飾的α1-微bikunin增強子(mA1MB2)、經修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)、B型肝炎病毒增強子II(HEII)或CRM8增強子。在一些實施例中，mTTR啟動子是mTTR482啟動子。在一些實施例中，增強子在mTTR啟動子的5'側。在一些實施例中，所述轉基因係編碼如本文所述的變異體PAH多肽。
在一些實施例中，本發明提供了用於在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中表現盒包含可操作地連接至啟動子和和3'元件的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述3'元件是白蛋白3'元件(3'Alb)或連接至人類α 1抗胰蛋白酶支架/基質附著區(SMAR)的白蛋白3'元件(3'AlbSMAR)。在一些實施例中，mTTR啟動子是mTTR482啟動子。在一些實施例中，3'元件位於轉基因的3'側。在一些實施例中，所述轉基因編碼如本文所述的變異體PAH多肽。
在一些實施例中，本發明提供了用於在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中表現盒包含可操作地連接至啟動子和增強子和3'元件的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述增強子包括一個或兩個修飾的凝血酶原增強子(mPrT2)、一個或兩個修飾的α1-微bikunin增強子(mA1MB2)、修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)、B型肝炎病毒增強子II(HEII)或CRM8增強子，並且其中所述3'元件是白蛋白3'元件(3'Alb)或連接至人類α1抗胰蛋白酶支架/基質附著區(SMAR)的白蛋白3'元件(3'AlbSMAR)。在一些實施例中，mTTR啟動子是mTTR482啟動子。在一些實施例中，增強子在mTTR啟動子的5'側。在一些實施例中，3'元件位於轉基因的3'側。在一些實施例中，所述轉基因編碼如本文所述的變異體PAH多肽。
在一些實施例中，表現盒還包含內含子。在一些實施例中，所述內含子是MVM內含子、F IX截斷型內含子1、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈SA、腺病毒SD/免疫球蛋白SA、SV40晚期SD/SA(19S/16S)或雜合腺病毒SD/IgG SA。在一些實施例中，所述內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。
在一些實施例中，表現盒還包含多腺苷酸化訊息。在一些實施例中，多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化訊息、SV40多腺苷酸化訊息或HSV TK pA。
在一些實施例中，表現盒被納入載體中。在一些實施例中，表現盒被納入病毒載體中。在一些實施例中，病毒載體是如本文所述的rAAV載體。
V. 載體和病毒顆粒
在某些態樣中，編碼變異體PAH多肽的核酸包含在載體中。在一些實施例中，本發明設想使用重組病毒基因組來引入編碼變異體PAH多肽的核酸序列，以包裝至病毒顆粒，例如下面描述的病毒顆粒。重組病毒基因組可以包括建立變異體PAH多肽的表現的任何元件，例如啟動子、ITR、核糖體結合元件、終止子、增強子、選擇標記、內含子、多聚A信號和/或複製起點。下面更詳細地描述用於病毒顆粒的示例性病毒基因組元件和遞送方法。
非病毒遞送系統
常規的非病毒基因轉移方法也可以用於將核酸引入細胞或目標組織。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、裸露核酸和與遞送系統複合的核酸。例如，所述載體可以與脂質(例如陽離子或中性脂質)、脂質體、聚陽離子、奈米顆粒或增強核酸細胞攝取的試劑複合。所述載體可以複合於適用於本文所述任何遞送方法的試劑。在一些實施例中，所述核酸包含一個或多個病毒ITR(例如AAV ITR)。
病毒顆粒
在一些實施例中，包含編碼變異體PAH多肽的核酸的載體是重組型腺相關病毒(rAAV)載體、重組型腺病毒載體、重組型慢病毒載體或重組型單純皰疹病毒(HSV)載體。
rAAV顆粒
在一些實施例中，所述載體是重組AAV(rAAV)載體。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸的側翼是一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。在一些實施例中，病毒顆粒是包含核酸的重組AAV顆粒，所述核酸包含側翼是一個或兩個ITR的編碼變異體PAH多肽的核酸。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸的側翼是兩個AAV ITR。
在一些實施例中，編碼本公開文本的變異體PAH多肽的核酸可操作地連接在轉錄方向上的構件(component)、控制序列(包括轉錄起始序列和終止序列)，從而形成表現盒。表現盒的5'和3'末端的側翼是至少一個功能性AAV ITR序列。「功能性AAV ITR序列」意指旨在用來釋出(rescue)、複製和包裝AAV病毒顆粒的ITR序列功能。參見Davidson等人，PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等人，J.Virol.,2003,77(12)：7034-40；和Pechan等人，Gene Ther.,2009,16：10-16，其全部通過引用以其整體併入本文。為了實施本發明的一些態樣，重組載體至少包含為衣殼化所必需的所有AAV序列和用於由rAAV感染的物理結構。用於本發明載體的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin,Hum.Gene Ther.,1994,5：793-801中所述)，並且可以通過核苷酸的插入、缺失或取代來改變，或者AAV ITR可以來源於幾種AAV血清型中的任一種。目前已知超過40種AAV血清型，並且仍在鑒定出新的血清型和現有血清型的變異體。參見Gao等人，PNAS,2002,99(18)：11854-6；Gao等人，PNAS,2003,100(10)：6081-6；和Bossis等人，J.Virol.,2003,77(12)：6799-810。
使用任何AAV血清型都被視為在本發明的範圍內。在一些實施例中，rAAV載體是來源於AAV血清型的載體，包括但不限於，AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV ITR等。在一些實施例中，AAV中的核酸包含AAV ITR的ITR，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV等。在某些實施例中，AAV ITR是AAV2 ITR。
在一些實施例中，載體可以包括填充核酸。在一些實施例中，填充核酸可以編碼綠色螢光蛋白。在一些實施例中，填充核酸可以位於編碼本公開文本的變異體PAH多肽的核酸的3'側。
在一些態樣中，本發明提供了包含重組自身互補基因組的病毒顆粒。在一些實施例中，所述載體是自身互補載體。具有自身互補基因組的AAV病毒顆粒和使用自身互補的AAV基因組的方法描述在以下文獻中：美國專利號6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；和Wang Z.，等人，(2003)Gene Ther 10：2105-2111，所述文獻各自通過引用以其整體併入本文。包含自身互補基因組的rAAV將借助其部分互補的序列(例如，轉基因的互補編碼鏈和非編碼鏈)迅速形成雙鏈DNA分子。在一些實施例中，本發明提供了包含AAV基因組的AAV病毒顆粒，其中所述rAAV基因組包含第一異源多核苷酸序列(例如，本發明的變異體PAH多肽的編碼鏈)和第二異源多核苷酸序列(例如，本公開文本的變異體PAH多肽的非編碼或反義鏈)，其中所述第一異源多核苷酸序列可以與所述第二多核苷酸序列沿著其大部分或全部長度形成鏈內鹼基對。
在一些實施例中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列通過促進鏈內鹼基配對的序列連接；例如髮夾DNA結構。髮夾結構在本領域中是已知的，例如在siRNA分子中。在一些實施例中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列通過經突變的ITR(例如，右ITR)連接。經突變的ITR包含含末端解鏈序列的D區的缺失。因此，在複製AAV病毒基因組時，rep蛋白將不會在突變的ITR處切割病毒基因組，並且依此，以5'至3'順序包含以下的重組病毒基因組將被包裝在病毒衣殼中：AAV ITR、包括調節序列的第一異源多核苷酸序列、經突變的AAV ITR、與第一異源多核苷酸反向的第二異源多核苷酸和第三AAV ITR。
在一些實施例中，第一異源核酸序列和第二異源核酸序列通過經突變的ITR(例如，右ITR)連接。在一些實施例中，ITR包含多核苷酸序列5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3'(SEQ ID NO：17)。突變的ITR包含含末端解鏈序列的D區的缺失。因此，在複製AAV病毒基因組時，rep蛋白將不會在突變的ITR處切割病毒基因組，並且因此，以5'至3'順序包含以下的重組病毒基因組將被包裝在病毒衣殼中：AAV ITR、包括調節序列的第一異源多核苷酸序列、經突變的AAV ITR、與第一異源多核苷酸反向的第二異源多核苷酸和第三AAV ITR。
在一些實施例中，所述載體被衣殼化在病毒顆粒中。在一些實施例中，病毒顆粒是包含重組AAV載體的重組AAV病毒顆粒。使用不同的AAV血清型來最佳化特定目標細胞的轉導或靶向特定的目標組織(例如，眼部組織)內的特定細胞類型。rAAV顆粒可以包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，在一些實施例中，rAAV顆粒可以包含本發明的AAV2衣殼蛋白和至少一種AAV2 ITR，或其可以包含AAV2衣殼蛋白和至少一種AAV1 ITR。 本文提供了生產rAAV顆粒的AAV血清型的任何組合，如同每個組合都已在本文中明確說明一樣。在一些實施例中，本發明提供了包含本發明的AAV2衣殼的rAAV顆粒。在一些實施例中，本發明提供了包含本發明的AAVrh8R衣殼的rAAV顆粒。
在一些實施例中，rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼(例如，野生型AAV6衣殼，或變異體AAV6衣殼如ShH10，如美國授予前公開2012/0164106中所述)、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼(例如，野生型AAV9衣殼，或如美國授予前公開2013/0323226中所述的修飾的AAV9衣殼)、AAV10衣殼、AAVrh10衣殼、AAV11衣殼、AAV12衣殼、酪胺酸衣殼突變體、肝素結合衣殼突變體、AAV2R471A衣殼、AAVAAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼(例如，AAV-DJ/8衣殼、AAV-DJ/9衣殼，或美國授予前公開2012/0066783中所述的任何其他衣殼)、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1衣殼，或者美國專利號8,283,151或國際公開號WO/2003/042397中所述的AAV衣殼。在一些實施例中，突變體衣殼蛋白保留形成AAV衣殼的能力。在一些實施例中，rAAV顆粒包含AAV5酪胺酸突變體衣殼(Zhong L.等人，(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(22)：7827-7832。在進一步的實施例中，rAAV顆粒包含來自進化枝(Clade)A至F的AAV血清型的衣殼蛋白(Gao等人，J.Virol.2004,78(12)：6381)。在一些實施例中，rAAV顆粒包含AAV1衣殼蛋白或其突變體。在其他實施例中，rAAV顆粒包含AAV2衣殼蛋白或其突變體。在一些實施例中，AAV血清型是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10或AAVrh10。在一些實施例中，rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼。在一些實施例中，rAAV顆粒包含 AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些實施例中，重組AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣殼。在一些實施例中，AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣殼包含酪胺酸突變或乙醯肝素結合突變，例如如下所述。在一些實施例中，衣殼是肝靶向衣殼；例如但不限於LK03衣殼、HSC15衣殼或17衣殼。在一些實施例中，衣殼是經工程化的AAV衣殼(例如，改組(shuffled)衣殼)。經工程化的AAV衣殼的例子包括但不限於DJ(Grimm D等人，J Virol.2008,82：5887-911)、LK03(Lisowski L等人，Nature,2014,506：382-6)以及HSC15和HSC17(Smith LJ等人，Mol Ther,2014 Sep；22(9)：1625-34)。
已知AAV(例如AAV2、AAV8等)的衣殼包括三種衣殼蛋白：VP1、VP2和VP3。這些蛋白質含有大量重疊的胺基酸序列和獨特的N末端序列。AAV2衣殼包括60個按照二十面體對稱排列的亞基(Xie,Q.，等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(16)：10405-10)。已經發現VP1、VP2和VP3以1：1：10的比率存在。
在一些實施例中，rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白的rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含在與硫酸乙醯肝素蛋白聚糖相互作用的一個或多個位置處的一個或多個胺基酸取代，和b)包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複序列的rAAV載體。
在一些實施例中，rAAV顆粒包含衣殼蛋白的一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代減少或消除rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白聚糖的結合，和/或其中所述一個或多個胺基酸取代位於基於AAV2的VP1編號來編號的位置484、487、532、585或588處。如本文所用，「基於AAV2的VP1編號」是指對應於AAV2的VP1的所述胺基酸的所述衣殼蛋白的胺基酸。例如，如果一個或多個胺基酸取代位於基於AAV2的VP1編號的位置347、350、390、395、448、451、 484、487、527、532、585和/或588處，則所述一個或多個胺基酸取代位於所述衣殼蛋白對應於AAV2的VP1的胺基酸347、350、390、395、448、451、484、487、527、532、585和/或588的一個或多個胺基酸處。在一些實施例中，所述一個或多個胺基酸取代位於AAV2的VP1的位置484、487、532、585或588處。在一些實施例中，所述一個或多個胺基酸取代位於基於AAV2的VP1編號的AAV3的VP1的位置484、487、532、585或588處。在一些實施例中，所述一個或多個胺基酸取代位於基於AAVrh8R的VP1編號的位置485、488、528、533、586或589處。在一些實施例中，在對應於胺基酸585和/或588(基於AAV2的VP1編號)的一個或多個位置處的一個或多個胺基酸被精胺酸殘基替代(例如，AAV1或AAV6的S586和/或T589；AAV9的S586和/或A589；AAVrh8R的A586和/或T589；AAV8的Q588和/或T591；以及AAVrh10的Q588和/或A591)。在其他實施例中，在對應於胺基酸484、487、527和/或532(基於AAV2的VP1編號)的一個或多個位置處的一個或多個胺基酸(例如精胺酸或離胺酸)被一個或多個非正電荷胺基酸(如丙胺酸)替代(例如AAV1或AAV6的R485、R488、K528和/或K533；AAV9或AAVrh8的RR485、R488、K528和/或R533；以及AAV8或AAVrh10的R487、R490、K530和/或R535)。
AAV顆粒的產生
在本領域中已知許多方法用於產生rAAV載體，包括轉染、穩定細胞株生產和感染性雜合病毒生產系統，所述系統包括腺病毒-AAV雜合體、皰疹病毒-AAV雜合體(Conway,JE等人，(1997) J.Virology 71(11)：8780-8789)和杆狀病毒-AAV雜合體(Urabe,M.等人，(2002)Human Gene Therapy 13(16)：1935-1943；Kotin,R.(2011)Hum Mol Genet.20(R1)：R2-R6)。用於產生rAAV病毒顆粒的rAAV生產培養物都需要：1)合適的宿主細胞；2)合適的輔助 病毒功能；3)AAV rep和cap基因和基因產物；4)側翼為至少一個AAV ITR序列(例如，編碼變異體PAH多肽的AAV基因組)的核酸(如治療性核酸)；以及5)支持rAAV產生的合適的培養基和培養基成分。在一些實施例中，合適的宿主細胞是靈長類動物宿主細胞。在一些實施例中，合適的宿主細胞是人源細胞株，如HeLa、A549、293或Perc.6細胞。在一些實施例中，合適的輔助病毒功能由野生型或突變體腺病毒(如溫度敏感性腺病毒)、皰疹病毒(HSV)、杆狀病毒或提供輔助功能的質體構建體提供。在一些實施例中，AAV rep和cap基因產物可以來自任何AAV血清型。通常但不是必須的，AAV rep基因產物與rAAV載體基因組的ITR具有相同血清型，只要rep基因產物可以發揮複製和包裝rAAV基因組的作用即可。本領域中已知的合適的培養基可以用於產生rAAV載體。這些培養基包括但不限於Hyclone Laboratories和JRH生產的培養基，包括改良伊格爾培養基(MEM)；達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)；定制型配製品，如美國專利號6,566,118所描述者；以及如美國專利號6,723,551中描述的Sf-900 II SFM培養基，每個文獻(特別是關於用於產生重組AAV載體的定制型培養基配製品)均通過引用以其整體併入本文。在一些實施例中，AAV輔助功能由腺病毒或HSV提供。在一些實施例中，AAV輔助功能由杆狀病毒提供，並且宿主細胞是昆蟲細胞(例如，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞)。
用於產生rAAV顆粒的一種方法是三重轉染方法。簡而言之，可以將含rep基因和衣殼基因的質體連同輔助腺病毒質體轉染(例如利用磷酸鈣法)到細胞株(例如，HEK-293細胞)中，並可以收集並視情況地純化病毒。因此，在一些實施例中，通過將編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸以及編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染到宿主細胞中來產生rAAV顆粒，其中核酸向宿主細胞的轉染產生能夠產生rAAV顆粒的宿主細胞。
在一些實施例中，rAAV顆粒可以通過生產細胞株方法產生(參見Martin等人，(2013)Human Gene Therapy Methods 24：253-269；美國專利授予前公開號US 2004/0224411；和Liu,X.L.等人(1999)Gene Ther.6：293-299)。簡而言之，可以用含有rep基因、衣殼基因和包含啟動子-異源核酸序列(例如，變異體PAH多肽)的載體基因組的質體穩定地轉染細胞株(例如，HeLa、293、A549或Perc.6細胞株)。可以篩選細胞株，以選擇用於rAAV產生的前導殖株(lead clone)，然後可以將其擴增至生產用生物反應器，並且用輔助病毒(例如，腺病毒或HSV)感染，以啟動rAAV生產。隨後可以收集病毒，可以將腺病毒失活(例如，通過加熱)和/或加以去除，並且可以純化rAAV顆粒。因此，在一些實施例中，通過包含編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸中的一種或多種的生產細胞株產生rAAV顆粒。如本文所述，與三重轉染方法相比，生產細胞株方法對於產生具有超大型基因組(oversized genome)的rAAV顆粒而言可能是有利的。
在一些實施例中，編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因組的核酸穩定地維持在生產細胞株中。在一些實施例中，將編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因組的核酸在一種或多種質體上引入細胞株中以產生生產用細胞株。在一些實施例中，將AAV rep、AAV cap和rAAV基因組在相同質體上引入細胞中。在其他實施例中，將AAV rep、AAV cap和rAAV基因組在不同質體上引入細胞中。在一些實施例中，用質體穩定地轉染的細胞株在細胞株的多次繼代(例如，5、10、20、30、40、50或超過50次細胞繼代)中維持質體。例如，所述一種或多種質體可以在細胞複製時複製，或者所述一種或多種質體可以整合到細胞基因組中。已經鑒定了使質體能夠在細胞(例如，人類細胞)中自主複製的多種序列(參見例如，Krysan,P.J.等人(1989)Mol.Cell Biol.9：1026-1033)。在一些實施例中，所述一種或多種質體可以含有允許選擇維持 質體的細胞的選擇標記(例如，抗生素抗性標記)。通常用於哺乳動物細胞的選擇標記包括但不限於殺稻瘟素、G418、潮黴素B、博萊黴素、嘌呤黴素及其衍生物。用於將核酸引入細胞中的方法在本領域中是已知的，並且包括但不限於病毒轉導、陽離子轉染(例如，使用陽離子聚合物如DEAE-葡聚糖或陽離子脂質如lipofectamine)、磷酸鈣轉染、顯微注射、粒子轟擊、電穿孔和奈米顆粒轉染(關於更多細節，參見例如，Kim,T.K.和Eberwine,J.H.(2010)Anal.Bioanal.Chem.397：3173-3178)。
在一些實施例中，編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因組的核酸穩定地整合到生產細胞株的基因組中。在一些實施例中，將編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因組的核酸在一種或多種質體上引入細胞株中以產生生產細胞株。在一些實施例中，將AAV rep、AAV cap和rAAV基因組在相同質體上引入細胞中。在其他實施例中，將AAV rep、AAV cap和rAAV基因組在不同質體上引入細胞中。在一些實施例中，所述一種或多種質體可以含有允許選擇維持質體的細胞的選擇標記(例如，抗生素抗性標記)。用於將核酸穩定地整合到多種宿主細胞株中的方法在本領域中是已知的。例如，重複選擇(例如，通過使用選擇標記)可以用於選擇已整合含有選擇標記(和AAV cap和rep基因和/或rAAV基因組)的核酸的細胞。在其他實施例中，核酸能以位點特異性方式整合到細胞株中以產生生產用細胞株。一些位點特異性重組系統是本領域已知的，如FLP/FRT(參見例如，O'Gorman,S.等人(1991)Science 251：1351-1355)、Cre/loxP(參見例如，Sauer,B.和Henderson,N.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5166-5170)和phi C31-att(參見例如，Groth,A.C.等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97：5995-6000)。
在一些實施例中，生產用細胞株衍生自靈長類動物細胞株(例如，非人類靈長類動物細胞株，如Vero或FRhL-2細胞株)。在一些實施例中， 細胞株衍生自人類細胞株。在一些實施例中，生產用細胞株衍生自HeLa、293、A549或PERC.6®(Crucell)細胞。例如，在將編碼AAV rep和cap基因和/或超大型rAAV基因組的核酸引入和/或穩定維持/整合到細胞株中以產生生產用細胞株之前，細胞株是HeLa、293、A549或PERC.6®(Crucell)細胞株或其衍生物。
在一些實施例中，生產用細胞株適於在懸浮液中生長。如在本領域中已知的，錨定依賴性細胞通常不能在沒有基質(如微載體珠)的情況下在懸浮液中生長。使細胞株適於在懸浮液中生長可以包括例如使用缺少鈣和鎂離子的培養基以防止結塊(和視情況存在的消泡劑)，使用用滲矽化合物塗佈的培養容器，使細胞株在具有攪拌槳的旋動培養中生長，並且在每次繼代時選擇培養物中(而不是在大塊中或在容器的側面上)的細胞。關於進一步的描述，參見例如，ATCC常見問題文件(可在www.atcc.org/Global/FAQs/9/1/Adapting%20a%20monolayer%20cell%20line%20to%20suspension-40.aspx處獲得)和其中引用的參考文獻。
在一些態樣中，提供了用於生產本文公開的任何rAAV顆粒的方法，所述方法包括(a)在產生rAAV顆粒的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含(i)一種或多種AAV包裝基因，其中每種所述AAV包裝基因編碼AAV複製蛋白和/或衣殼化蛋白；(ii)rAAV前載體，其包含編碼如本文所述的異源核酸、側翼為至少一個AAV ITR的核酸，和(iii)AAV輔助功能；和(b)回收由宿主細胞產生的rAAV顆粒。在一些實施例中，所述至少一個AAV ITR選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR等。例如，在一些實施例中，AAV血清型是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10或AAVrh10。在某些實施例中，AAV中的核酸包含AAV2 ITR。在一些實施例中，所述衣殼化蛋 白選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼蛋白或其突變體。在一些實施例中，衣殼化蛋白是AAV8衣殼蛋白。在一些實施例中，rAAV顆粒包含AAV8衣殼和包含AAV2 ITR的重組基因組，以及編碼治療性轉基因/核酸的核酸(例如，編碼變異體PAH多肽的核酸)。
本發明的合適的rAAV生產培養基可以補充有0.5%至20%(v/v或w/v)量的血清或血清衍生之重組蛋白。或者，如在本領域中已知的，rAAV載體可以在無血清條件下產生，所述無血清條件也可以稱為不含動物源產品的培養基。熟習此項技術者可以理解，設計用於支持rAAV載體產生的商業或定制培養基還可以補充有本領域中已知的一種或多種細胞培養組分，包括但不限於葡萄糖、維生素、胺基酸和/或生長因子，以便提高生產培養物中rAAV的滴度。
rAAV生產培養物可以在適合於所用特定宿主細胞的多種條件(在廣泛的溫度範圍內、持續不同的時間長度，等等)下生長。如本領域已知的，rAAV生產培養物包括附著依賴培養物，其可以在合適的附著依賴容器(例如像滾瓶、中空纖維過濾器、微載體和填充床或流化床生物反應器)中培養。rAAV載體生產培養物也可以包括適應懸浮液的宿主細胞，如HeLa、293和SF-9細胞，它們可以以多種方式培養，包括例如旋轉式燒瓶、攪拌槽式生物反應器和一次性系統，如Wave袋系統。
本發明的rAAV載體顆粒可以通過裂解生產用培養物的宿主細胞或通過從生產用培養物中收集用過的培養基而從rAAV生產用培養物中來收取，條件是細胞在本領域中已知的引起rAAV顆粒從完整細胞釋放到培養基中的條件下培養，如美國專利號6,566,118中更全面地描述的。裂解細胞的合適方法 在本領域中也是已知的，並且包括例如多次冷凍/解凍循環、超聲處理、微流化和用化學品(如洗滌劑和/或蛋白酶)處理。
在另一實施例中，rAAV顆粒被純化。如本文所用的術語「純化的」包括rAAV顆粒的製劑，其缺少至少一些也可存在於rAAV顆粒天然存在或最初所製備的地方的其他組分。因此，例如，經分離的rAAV顆粒可以使用純化技術使其從來源混合物(如培養裂解物或生產用培養上清液)富集而製備。能以多種方式測量富集情況，例如像根據溶液中存在的DNA酶抗性顆粒(DRP)或基因組拷貝(gc)的比例、或根據感染性，或者可以根據源混合物中存在的第二潛在干擾物質(如污染物，包括生產培養污染物或進程內污染物，包括輔助病毒、培養基組分等)來測量。
在一些實施例中，將rAAV生產用培養收穫物加以澄清化以除去宿主細胞碎片。在一些實施例中，通過經由一系列深度過濾器過濾來澄清生產培養收穫物，所述深度過濾器包括例如DOHC級Millipore Millistak+ HC Pod過濾器、A1HC級Millipore Millistak+ HC Pod過濾器和0.2μm Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC親水膜過濾器。澄清也可以通過本領域中已知的多種其他標準技術來實現，如離心或通過本領域中已知的0.2μm或更大孔徑的任何醋酸纖維素過濾器過濾。
在一些實施例中，用Benzonase®進一步處理rAAV生產用培養收穫物以消化生產培養物中存在的任何高分子量DNA。在一些實施例中，Benzonase®消化在本領域中已知的標準條件下進行，所述標準條件包括例如1至2.5單位/ml的Benzonase®的終濃度，在範圍從環境溫度至37℃的溫度下持續30分鐘至幾小時的時間段。
可以使用以下一個或多個純化步驟來分離或純化rAAV顆粒：平衡離心；流過式陰離子交換過濾；用於濃縮rAAV顆粒的切向流過濾(TFF)； 通過磷灰石色譜捕獲rAAV；輔助病毒的熱滅活；通過疏水相互作用色譜捕獲rAAV；通過尺寸排阻色譜(SEC)進行緩衝液交換；納濾；以及通過陰離子交換色譜、陽離子交換色譜或親和色譜捕獲rAAV。這些步驟可以單獨使用，以各種組合使用，或者以不同順序使用。在一些實施例中，所述方法以如下所述的順序包括所有步驟。純化rAAV顆粒的方法見於例如以下文獻中：Xiao等人，(1998)Journal of Virology 72：2224-2232；美國專利號6,989,264和8,137,948；以及WO 2010/148143。
VI. 治療方法
本公開文本的某些態樣涉及在有需要的個體中治療苯丙酮尿症和/或降低苯丙胺酸含量的方法。苯丙酮尿症(PKU)是苯丙胺酸羥化酶(PAH)缺乏引起的，這種缺乏導致血中Phe含量升高，對腦有毒並隨後在不進行治療的情況下導致嚴重精神障礙。目前通過飲食限制進行的治療是有效的，但青少年和成年人的不遵從性是一個主要問題。
治療PKU的努力受到基因治療載體中人類PAH活性低的阻礙。本方法部分基於發現與內源性人類PAH多肽相比具有改善的蛋白質穩定性和酶活性的變異體PAH多肽。與編碼內源性人類PAH的載體相比，使用編碼本文所述變異體PAH多肽的rAAV載體通過基因治療來治療PKU導致血液和腦Phe含量的更好降低。此外，雖然hPAH和hPAH-V1都改善了Tyr和Trp向腦的轉運，但只有變異體PAH治療的動物具有正常化的腦神經傳導物質含量(包括多巴胺和血清素)，表明對Phe影響的功能有不同的敏感性。
在一些實施例中，本發明提供了治療PKU的方法，其包括向有需要的個體投予治療有效量的如本文所述的變異體PAH多肽。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含至少三個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代位於選自野生 型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含在野生型人類PAH多肽的位點M180、K199、S250和G256處的四個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含選自M180T、K199P、S250P和G256A的至少三個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含包括以下的胺基酸取代：K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A。在一些實施例中，變異體PAH多肽還包含胺基酸取代H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T胺基酸取代。在一些實施例中，變異體PAH多肽是表1至3中列出的任一種變異體PAH多肽。在一些實施例中，變異體PAH多肽包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A，並且包含另外的胺基酸取代，同時至少大致保持野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性。在一些實施例中，胺基酸取代的位置基於野生型人類PAH多肽；例如，包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的人類PAH多肽。在一些實施例中，變異體PAH多肽是融合多肽。在一些實施例中，變異體PAH多肽是與組織靶向肽融合的融合多肽。在一些實施例中，變異體PAH多肽是與肝靶向多肽融合的融合多肽。肝靶向多肽的例子包括但不限於人肝細胞生長因子的片段(Eavri和Lorberboum-Galkski,J Biol Chem 2007,282：23402-23409)或與肝細胞去唾液酸糖蛋白受體結合的糖蛋白(Huang,等人，Bioconjugate Chemistry 2017,28：283-295)。
在一些實施例中，本發明提供了通過投予有效量的本公開文本的變異體PAH多肽來治療PKU的方法。變異體PAH多肽可以投予到特定的感興趣組織，或者可以全身投予。在一些實施例中，可以腸胃外投予有效量的變異體PAH多肽。腸胃外投予途徑可以包括但不限於靜脈內、腹膜內、骨內、動脈內、 大腦內、肌內、鞘內、皮下、腦室內、肝內等。在一些實施例中，可以通過一種投予途徑投予有效量的變異體PAH多肽。在一些實施例中，可以通過多於一種投予途徑的組合投予有效量的變異體PAH多肽。在一些實施例中，將有效量的變異體PAH多肽投予到一個位置。在其他實施例中，可以將有效量的變異體PAH多肽投予到多於一個位置。
在一些實施例中，本發明提供了治療PKU的方法，其包括向有需要的個體投予治療有效量的編碼如本文所述的變異體PAH多肽的核酸(例如DNA或mRNA)。在一些實施例中，所述核酸編碼包含至少三個胺基酸取代的變異體PAH多肽，其中所述胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。在一些實施例中，所述核酸編碼包含在野生型人類PAH多肽的位點M180、K199、S250和G256處的四個胺基酸取代的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含選自M180T、K199P、S250P和G256A的至少三個胺基酸取代的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含包括以下的胺基酸取代的變異體PAH多肽：K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。在一些實施例中，所述核酸編碼包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼還包含胺基酸取代H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T胺基酸取代的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼是表1至3中列出的任一種變異體PAH多肽的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A，並且包含另外的胺基酸取代，同時至少大致保持野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性的變 異體PAH多肽。在一些實施例中，由所述核酸編碼的胺基酸取代的位置基於野生型人類PAH多肽；例如，包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的人類PAH多肽。
在一些實施例中，所述核酸編碼變異體人類PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列並且具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列並且具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的SEQ ID NO：1的野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性的變異體PAH多肽。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸是DNA。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸是RNA(例如mRNA)。
在一些實施例中，所述核酸編碼是保持苯丙胺酸羥化酶活性的截斷型PAH多肽的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含N末端截斷的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼是N末端調節結構域的部分或全部截斷的N末端截斷。在一些實施例中，所述核酸編碼包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的胺基酸殘基1至約胺基酸殘基102的缺失的N末端截斷。在一些實施例中，所述核酸編碼包含C末端截斷的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼是四聚結構域的部分或全部截斷的C末端截斷。在一些實施例中，所述核酸編碼包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的約429至452的胺基酸殘基的缺失的C末端截斷。在一些實施例中，所述核酸編碼包含N末端截斷和C末端截斷的變異體PAH多肽。 在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含N末端調節序列的部分或全部截斷以及四聚結構域的部分或全部截斷。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的胺基酸殘基1至約胺基酸殘基102和約429至約452的缺失。在一些實施例中，所述核酸編碼包含對應於野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的約102至約428的胺基酸殘基的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含對應於野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的102至428的胺基酸殘基的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼還包含在野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的位點M180、K199、S250和G256處的四個胺基酸取代的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼包含選自M180T、K199P、S250P和G256A的四個胺基酸取代的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼還包含表1至3中列出的胺基酸取代的任一種組合的截斷型變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述核酸編碼具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的野生型PAH(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的苯丙胺酸羥化酶活性的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸編碼與組織靶向肽融合的融合多肽。在一些實施例中，變異體PAH多肽是與肝靶向肽融合的融合多肽。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸是DNA。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸是RNA(例如mRNA)。
在一些實施例中，本發明提供了通過投予有效量的編碼本公開文本的變異體PAH多肽的核酸來治療PKU的方法。編碼變異體PAH多肽的核酸可以投予到特定的感興趣組織，或者可以全身投予。在一些實施例中，可以腸胃外投予有效量的編碼變異體PAH多肽的核酸。腸胃外投予途徑可以包括但不限於靜脈內、腹膜內、骨內、動脈內、大腦內、肌內、鞘內、皮下、腦室內、肝 內等。在一些實施例中，來自肝臟以外組織的變異體PAH的表現可能需要輔因子BH4的存在(例如，系統遞送或從核酸共表現)Ding等人，Mol Ther 2008,16：673-681。在一些實施例中，可以通過一種投予途徑投予有效量的編碼變異體PAH多肽的核酸。在一些實施例中，可以通過多於一種投予途徑的組合投予有效量的編碼變異體PAH多肽的核酸。在一些實施例中，可以將有效量的編碼變異體PAH多肽的核酸投予到一個位置。在其他實施例中，可以將有效量的變異體PAH多肽投予到多於一個位置。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸是DNA。在一些實施例中，編碼變異體PAH多肽的核酸是RNA(例如mRNA)。
在本發明的一些態樣中，通過病毒載體將編碼變異體PAH多肽的核酸遞送到個體。用於基因治療的病毒載體是本領域已知的。在一些態樣中，本發明提供了通過投予有效量的編碼本公開文本的變異體PAH多肽的慢病毒顆粒來治療PKU的方法。在一些態樣中，本發明提供了通過投予有效量的編碼本公開文本的變異體PAH多肽的rAAV顆粒來治療PKU的方法。rAAV可以投予到特定的感興趣組織，或者可以全身投予。在一些實施例中，可以腸胃外投予有效量的rAAV。腸胃外投予途徑可以包括但不限於靜脈內、腹膜內、骨內、動脈內、大腦內、肌內、鞘內、皮下、腦室內、肝內等。在一些實施例中，可以通過一種投予途徑投予有效量的rAAV。在一些實施例中，可以通過多於一種投予途徑的組合投予有效量的rAAV。在一些實施例中，將有效量的rAAV投予到一個位置。在其他實施例中，可以將有效量的rAAV投予到多於一個位置。
根據治療目的，投予有效量的rAAV(在一些實施例中為顆粒形式)。例如，當低百分比的轉導可以實現期望的治療效果時，則治療的目標通常是達到或超過這一轉導水準。在一些情況下，這種轉導水準可以通過轉導僅約1%至5%的所期望組織類型的靶細胞，在一些實施例中至少約20%的所期望組織類型的細胞，在一些實施例中至少約50%，在一些實施例中至少約80%，在一 些實施例中至少約95%，在一些實施例中至少約99%的所期望組織類型的細胞來實現。rAAV組成物可以通過在同一程序期間或者間隔數天、數周、數月或數年的一次或多次投予來投予。可以使用本文所述的任何投予途徑中的一種或多種。在一些實施例中，可以使用多個載體來治療人。
鑒定由AAV病毒顆粒轉導的細胞的方法是本領域已知的；例如，免疫組織化學或標記物如增強型綠色螢光蛋白的使用可以用於檢測病毒顆粒的轉導；例如包含具有一個或多個胺基酸取代的rAAV衣殼的病毒顆粒。
在一些實施例中，同時或依次地將有效量的rAAV顆粒投予到多於一個位置。在其他實施例中，多於一次(例如重複)地將有效量的rAAV顆粒投予到單個位置。在一些實施例中，多次注射rAAV病毒顆粒間隔不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、9小時、12小時或24小時。
在一些實施例中，本發明提供了用於通過投予有效量的包含編碼本公開文本的變異體PAH多肽的重組病毒載體的醫藥組成物來治療患有PKU的人的方法。在一些實施例中，所述醫藥組成物包含一種或多種醫藥上可接受的賦形劑。
在一些實施例中，所述方法包括投予有效量的包含編碼本公開文本的變異體PAH多肽的重組病毒載體的醫藥組成物，以在有需要的個體中治療PKU。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、10×1012、11×1012、15×1012、20×1012、25×1012、30×1012或50×1012個基因組拷貝/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度約為以下中的任一者：5×1012至6×1012、6×1012至7×1012、7×1012至8×1012、8×1012至9×1012、9×1012至10×1012、10×1012至11×1012、11×1012至15×1012、15×1012至20×1012、20×1012至25×1012、25×1012至30×1012、30×1012至50×1012或50×1012至100 ×1012個基因組拷貝/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度約為以下中的任一者：5×1012至10×1012、10×1012至25×1012或25×1012至50×1012個基因組拷貝/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、10×109、11×109、15×109、20×109、25×109、30×109或50×109個轉導單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度約為以下中的任一者：5×109至6×109、6×109至7×109、7×109至8×109、8×109至9×109、9×109至10×109、10×109至11×109、11×109至15×109、15×109至20×109、20×109至25×109、25×109至30×109、30×109至50×109或50×109至100×109個轉導單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度約為以下中的任一者：5×109至10×109、10×109至15×109、15×109至25×109或25×109至50×109個轉導單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、10×1010、11×1010、15×1010、20×1010、25×1010、30×1010、40×1010或50×1010個感染單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5×1010至6×1010、6×1010至7×1010、7×1010至8×1010、8×1010至9×1010、9×1010至10×1010、10×1010至11×1010、11×1010至15×1010、15×1010至20×1010、20×1010至25×1010、25×1010至30×1010、30×1010至40×1010、40×1010至50×1010或50×1010至100×1010個感染單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5×1010至10×1010、10×1010至15×1010、15×1010至25×1010或25×1010至50×1010個感染單位/mL。
在一些實施例中，投予到個體的病毒顆粒的劑量至少約為以下中的任一者：1×108至約6×1013個基因組拷貝/kg體重。在一些實施例中，投予到 個體的病毒顆粒的劑量約為以下中的任一者：1×108至約6×1013個基因組拷貝/kg體重。
在一些實施例中，投予到個體的病毒顆粒的總量至少約為以下中的任一者：1×109至約1×1014個基因組拷貝。在一些實施例中，投予到個體的病毒顆粒的總量約為以下中的任一者：1×109至約1×1014個基因組拷貝。
本發明的組成物(例如，包含編碼本公開文本的變異體PAH多肽的載體的重組病毒顆粒)可以單獨使用或與用於治療PKU的一種或多種另外的治療劑組合使用。依次投予之間的間隔可以是按至少(或，可替代地，少於)分鐘、小時或天計算。
根據治療目的，投予有效量的rAAV(在一些實施例中為顆粒形式)。例如，當低百分比的轉導可以實現期望的治療效果時，則治療的目標通常是達到或超過這一轉導水準。在一些情況下，這種轉導水準可以通過轉導僅約1%至5%的靶細胞，在一些實施例中至少約20%的所期望組織類型的細胞，在一些實施例中至少約50%，在一些實施例中至少約80%，在一些實施例中至少約95%，在一些實施例中至少約99%的所期望組織類型的細胞來實現。rAAV組成物可以通過在同一程序期間或者間隔數天、數周、數月或數年的一次或多次投予來投予。在一些實施例中，可以使用多個載體來治療哺乳動物(例如，人)。
在一些實施例中，本公開文本的rAAV組成物可以用於投予到人。在一些實施例中，本公開文本的rAAV組成物可以用於兒科投予。不希望被理論束縛，因為PKU的許多症狀本質上是發展性的(例如，嚴重的精神障礙)，因此盡可能早地治療PKU可能是特別有利的。在一些實施例中，將有效量的rAAV(在一些實施例中為顆粒形式)投予至年齡小於一個月、小於兩個月、小於三個月、小於四個月、小於五個月、小於六個月、小於七個月、小於八個月、小於九個月、小於十個月、小於十一個月、小於一歲、小於13個月、小於14個月、 小於15個月、小於16個月、小於17個月、小於18個月、小於19個月、小於20個月、小於21個月、小於22個月、小於兩歲或小於三歲的患者。
在一些實施例中，本公開文本的rAAV組成物可以用於投予到年輕成人。在一些實施例中，將有效量的rAAV(在一些實施例中為顆粒形式)投予至小於12歲、小於13歲、小於14歲、小於15歲、小於16歲、小於17歲、小於18歲、小於19歲、小於20歲、小於21歲、小於22歲、小於23歲、小於24歲或小於25歲的患者。
在一些實施例中，本發明提供了治療PKU的方法，其包括向有需要的個體投予治療有效量的包含編碼如本文所述的變異體PAH多肽的核酸的細胞。在一些實施例中，所述細胞包含編碼包含至少三個胺基酸取代的變異體PAH多肽的核酸，其中所述胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含在野生型人類PAH多肽的位點M180、K199、S250和G256處的四個胺基酸取代的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含選自M180T、K199P、S250P和G256A的至少三個胺基酸取代的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含包括以下的胺基酸取代的變異體PAH多肽：K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼還包含胺基酸取代H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T胺基酸取代的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼是表1至3中列出的任一種變異體PAH多肽的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包 含胺基酸取代M180T、K199P、S250P和G256A，並且包含另外的胺基酸取代，同時至少大致保持野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性的變異體PAH多肽。在一些實施例中，由所述細胞中的核酸編碼的胺基酸取代的位置基於野生型人類PAH多肽；例如，包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的人類PAH多肽。
在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼變異體人類PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列並且具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少約為80%、85%、90%、95%或99%中任一同一性的胺基酸序列並且具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的SEQ ID NO：1的野生型PAH的苯丙胺酸羥化酶活性的變異體PAH多肽。
在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼是保持苯丙胺酸羥化酶活性的截斷型PAH多肽的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含N末端截斷的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼是N末端調節結構域的部分或全部截斷的N末端截斷。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的胺基酸殘基1至約胺基酸殘基102的缺失的N末端截斷。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含C末端截斷的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼是四聚結構域的部分或全部截斷的C末端截斷。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多 肽)的約429至452的胺基酸殘基的缺失的C末端截斷。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含N末端截斷和C末端截斷的變異體PAH多肽。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含N末端調節序列的部分或全部截斷以及四聚結構域的部分或全部截斷。在一些實施例中，截斷型PAH多肽包含野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的胺基酸殘基1至約胺基酸殘基102和約429至約452的缺失。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含對應於野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的約102至約428的胺基酸殘基的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含對應於野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的102至428的胺基酸殘基的胺基酸序列的變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼還包含在野生型人類PAH多肽(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的位點M180、K199、S250和G256處的四個胺基酸取代的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼包含選自M180T、K199P、S250P和G256A的四個胺基酸取代的截斷型PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼還包含表1至3中列出的胺基酸取代的任一種組合的截斷型變異體PAH多肽。在一些實施例中，所述細胞中的核酸編碼具有至少約25%、50%、75%、100%或大於100%的野生型PAH(例如，SEQ ID NO：1的PAH多肽)的苯丙胺酸羥化酶活性的截斷型PAH多肽。
在一些實施例中，本發明提供了通過投予有效量的包含編碼本公開文本的變異體PAH多肽的核酸的細胞來治療PKU的方法。包含編碼變異體PAH多肽的核酸的細胞可以投予到特定的感興趣組織，或者可以全身投予。在一些實施例中，可以腸胃外投予有效量的包含編碼變異體PAH多肽的核酸的細胞。腸胃外投予途徑可以包括但不限於靜脈內、腹膜內、骨內、動脈內、大腦內、肌內、鞘內、皮下、腦室內、肝內等。在一些實施例中，所述細胞被包封或在裝置中。在一些實施例中，肝臟外表現PAH的細胞可能需要外源添加或共表現輔因 子BH4。在一些實施例中，所述細胞被包封或在還包含BH4的裝置中。在一些實施例中，可以通過一種投予途徑投予有效量的包含編碼變異體PAH多肽的核酸的細胞。在一些實施例中，可以通過多於一種投予途徑的組合投予有效量的編碼變異體PAH多肽的核酸。在一些實施例中，可以將有效量的編碼變異體PAH多肽的核酸投予到一個位置。在其他實施例中，可以將有效量的變異體PAH多肽投予到多於一個位置。
在一些實施例中，包含編碼變異體PAH多肽的核酸的細胞是肝細胞、肌肉細胞、成纖維細胞、內皮細胞、上皮細胞、血細胞、骨髓細胞、幹細胞或誘導多能幹細胞。在一些實施例中，所述細胞還包含外源添加的輔因子BH4和/或共表現的輔因子BH4。
在一些實施例中，所述細胞是細胞株(例如CHO細胞株、HeLa細胞株等)。在一些實施例中，本發明提供了產生變異體PAH多肽的方法，其包括在產生變異體PAH多肽的條件下培養包含編碼變異體PAH多肽的核酸(例如，編碼變異體PAH多肽的表現載體)的細胞。在一些實施例中，產生變異體PAH多肽的方法還包括一個或多個純化變異體PAH多肽的步驟。
VII. 套組或製品
如本文所述的變異體PAH多肽、核酸、rAAV載體、顆粒和/或醫藥組成物可以包含在例如設計用於如本文所述的本發明方法之一的套組或製品中。
通常，所述系統包括適用於本發明方法的套管、一個或多個注射器(例如，1、2、3、4或更多)和一種或多種流體(例如，1、2、3、4或更多)。
注射器可以是任何合適的注射器，只要它能夠連接至用於遞送流體的套管。在一些實施例中，所述系統具有一個注射器。在一些實施例中，所 述系統具有兩個注射器。在一些實施例中，所述系統具有三個注射器。在一些實施例中，所述系統具有四個或更多個注射器。適用於本發明方法的流體包括本文所述的流體，例如，各自包含有效量的如本文所述的一種或多種載體的一種或多種流體，以及包含一種或多種治療劑的一種或多種流體。
在一些實施例中，套組包含單一流體(例如，包含有效量載體的醫藥上可接受的流體)。在一些實施例中，套組包含2種流體。在一些實施例中，套組包含3種流體。在一些實施例中，套組包含4種或更多種流體。流體可以包括稀釋劑、緩衝劑、賦形劑或本文所述或本領域已知的適用於遞送、稀釋、穩定、緩衝或以其他方式運輸本公開文本的變異體PAH多肽或rAAV載體組成物的任何其他液體。在一些實施例中，套組包含一種或多種緩衝劑，例如含水的pH緩衝溶液。緩衝劑的例子可以包括但不限於磷酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、HEPES和其他有機酸緩衝劑。
在一些實施例中，套組包含容器。合適的容器可以包括例如小瓶、袋、注射器和瓶子。容器可以由一種或多種材料(如玻璃、金屬或塑膠)製成。在一些實施例中，將容器用於容納本公開文本的rAAV組成物。在一些實施例中，容器還可以容納流體和/或其他治療劑。
在一些實施例中，套組包含附加治療劑與本公開文本的rAAV組成物。在一些實施例中，rAAV組成物和附加治療劑可以混合。在一些實施例中，rAAV組成物和附加治療劑可以保持分離。在一些實施例中，rAAV組成物和附加治療劑可以在同一容器中。在一些實施例中，rAAV組成物和附加治療劑可以在不同容器中。在一些實施例中，rAAV組成物和附加治療劑可以同時投予。在一些實施例中，rAAV組成物和附加治療劑可以在同一天投予。在一些實施例中，rAAV組成物可以在投予附加治療劑的一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、兩周、三周、四周、兩個月、三個月、四個月、五個月或六個月內投予。
在一些實施例中，套組包含在AAV投予之前短暫抑制免疫系統的治療劑。在一些實施例中，在注射病毒之前和之後不久，對患者進行短暫的免疫抑制，以抑制T細胞對AAV顆粒的響應(例如，參見Ferreira等人，Hum.Gene Ther.25：180-188,2014)。在一些實施例中，套組還提供環孢黴素、黴酚酸酯和/或甲基強的松龍。
本發明的rAAV顆粒和/或組成物還可以被包裝到包括使用說明的套組中。在一些實施例中，套組還包括用於遞送(例如，本文所述的任何類型的腸胃外投予)rAAV顆粒組成物的裝置。在一些實施例中，使用說明包括根據本文所述的方法之一的說明。在一些實施例中，所述說明被印刷在與容器一起提供(例如，附著到容器)的標簽上。在一些實施例中，使用說明包括用於向個體(例如人)投予有效量的rAAV顆粒，例如用於治療個體中的PKU的說明。
VIII. 示例性實施例
實施例1. 一種變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，包含兩個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。
實施例2. 一種變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，包含三個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。
實施例3. 一種變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，包含四個胺基酸取代，所述胺基酸取代位於野生型人類PAH多肽的位點M180、K199、S250和G256處。
實施例4. 實施例1至3中任一項的變異體PAH多肽，其中胺基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A中的一種或多種。
實施例5. 實施例1至4中任一項的變異體PAH多肽，其中胺基酸取代包括K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。
實施例6. 實施例1至5中任一項的變異體PAH多肽，其中胺基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A。
實施例7. 實施例1至6中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽還包含H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T胺基酸取代。
實施例8. 實施例1至7中任一項的變異體PAH多肽，其中野生型人類PAH多肽包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
實施例9. 實施例1至8中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽是人類PAH多肽。
實施例10. 實施例1至9中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列至少約80%相同的胺基酸序列。
實施例11. 實施例1至6中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列。
實施例12. 實施例1至11中任一項的變異體PAH，其中變異體PAH多肽還包含選自野生型人類PAH多肽的G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A和G442A的一個或多個胺基酸取代。
實施例13. 實施例1至12中任一項的變異體PAH，其中變異體PAH多肽還包含選自野生型人類PAH多肽的P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、 S446H的一個或多個胺基酸取代，以及在野生型人類PAH多肽的位置453處添加S。
實施例14. 實施例1至13中任一項的變異體PAH，其中變異體PAH多肽還包含選自野生型人類PAH多肽的F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P和N376P的一個或多個胺基酸取代。
實施例15. 一種變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含選自野生型人類PAH多肽的G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A和G442A的一個或多個胺基酸取代。
實施例16. 一種變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含選自野生型人類PAH多肽的P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、S446H的一個或多個胺基酸取代，以及在野生型人類PAH多肽的位置453處添加S。
實施例17. 一種變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含選自野生型人類PAH多肽的F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P和N376P的一個或多個胺基酸取代。
實施例18. 實施例1至17中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含N末端截斷。
實施例19. 實施例18的變異體PAH多肽，其中N末端截斷包括N末端調節結構域的截斷。
實施例20. 實施例18或19的變異體PAH多肽，其中N末端截斷包括野生型PAH多肽的胺基酸殘基1至102的截斷。
實施例21. 實施例1至20中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含C末端截斷。
實施例22. 實施例21的變異體PAH多肽，其中C末端截斷包括四聚結構域的截斷。
實施例23. 實施例21或22的變異體PAH多肽，其中C末端截斷包括野生型PAH多肽的胺基酸殘基429至452的截斷。
實施例24. 實施例1至23中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含對應於野生型PAH多肽的胺基酸殘基103-428的胺基酸序列。
實施例25. 實施例1至24中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含一個或多個胺基酸取代，以消除潛在的蛋白酶切割位點。
實施例26. 實施例25的變異體PAH多肽，其中消除潛在蛋白酶切割位點的一個或多個胺基酸取代位於野生型PAH多肽的位置270-至295和/或380至405處。
實施例27. 實施例1至26中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽與肝靶向多肽融合。
實施例28. 實施例27的變異體PAH多肽，其中肝靶向多肽是HGF或其片段或者結合肝細胞去唾液酸糖蛋白受體的糖蛋白。
實施例29. 實施例1至25中任一項的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽被聚乙二醇化和/或亞硝基化。
實施例30. 實施例26的變異體PAH多肽，其中變異體PAH多肽包含I374C胺基酸取代，其中位置374處的cys殘基被亞硝基化。
實施例31. 一種組成物，其包含實施例1至30中任一項的變異體PAH多肽。
實施例32. 實施例31的組成物，其中所述組成物還包含醫藥上 可接受的載劑。
實施例33. 一種分離核酸，其編碼實施例1至30中任一項的變異體PAH多肽。
實施例34. 實施例33的分離核酸，其中編碼變異體PAH多肽的核酸可操作地連接至啟動子。
實施例35. 實施例34的分離核酸，其中所述啟動子選自巨細胞病毒(CMV)即時早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、轉甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)、mTTR482啟動子、mA1MB2-mTTR482啟動子、TK啟動子、四環素響應型啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、LP1啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG)啟動子、延長因子1-α啟動子(EF1-α)啟動子、人類β-葡糖醛酸酶啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、修飾的雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子或SEQ ID NO：17、逆轉錄勞斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子和13-肌動蛋白啟動子。
實施例36. 實施例34或35的分離核酸，其中所述啟動子是LP1啟動子或mA1MB2-mTTR482啟動子。
實施例37. 實施例33至36中任一項的分離核酸，其中所述核酸還包含多腺苷酸化訊息。
實施例38. 實施例37的分離核酸，其中所述多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化訊息、SV40多腺苷酸化訊息或HSV TK pA。
實施例39. 實施例33至38中任一項的分離核酸，其中所述核酸還包含內含子。
實施例40. 實施例39的分離核酸，其中所述內含子是雞β-肌動蛋 白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。
實施例41. 實施例39的分離核酸，其中所述內含子是SEQ ID NO：15的修飾的雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。
實施例42. 實施例33至41中任一項的分離核酸，其中所述核酸還包含一個或多個ITR。
實施例43. 實施例33至42中任一項的分離核酸，其中所述核酸還包含填充核酸。
實施例44. 實施例43的分離核酸，其中所述填充核酸被最佳化以去除ATG序列。
實施例45. 實施例44的分離核酸，其中所述填充核酸是SEQ ID NO：16的A1AT內含子填充序列。
實施例46. 一種編碼人類PAH多肽的分離核酸，其中所述核酸是密碼子最佳化的。
實施例47. 實施例46的分離核酸，其中所述核酸序列與SEQ ID NO：14的核酸序列至少80%相同。
實施例48. 實施例46的分離核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO：14的核酸序列。
實施例49. 實施例33的分離核酸，其中所述核酸是mRNA。
實施例50. 一種組成物，其包含實施例33-至49中任一項的核酸。
實施例51. 實施例50的組成物，其中所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
實施例52. 一種載體，其包含實施例33至49中任一項的核酸。
實施例53. 實施例52的載體，其中所述載體是重組腺相關病毒 (rAAV)載體。
實施例54. 一種包含實施例33至41或43至49中任一項的核酸的rAAV載體，所述核酸的側翼是一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。
實施例55. 實施例54的rAAV載體，其中實施例33-48中任一項的核酸的側翼是兩個AAV ITR。
實施例56. 實施例54或55的rAAV載體，其中AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
實施例57. 實施例54至56中任一項的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
實施例58. 實施例57的rAAV載體，其中所述rAAV載體從5'到3'包含AAV2 ITR、啟動子、內含子、編碼PAH多肽的核酸、填充核酸、多腺苷酸化訊息和AAV2 ITR。
實施例59. 實施例58的rAAV載體，其中所述啟動子是m1A1MB2-mTTR482啟動子或LP1啟動子。
實施例60. 實施例58或59的rAAV載體，其中所述內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。
實施例61. 實施例58至59中任一項的rAAV載體，其中PAH多肽是實施例1至30中任一項的變異體PAH多肽。
實施例62. 實施例58至60中任一項的rAAV載體，其中編碼PAH多肽的核酸是實施例46至48中任一項的密碼子最佳化的核酸。
實施例63. 實施例58至62中任一項的rAAV載體，其中所述填充核酸包含來自人類α 1抗胰蛋白酶基因內含子的核酸。
實施例64. 實施例63的rAAV載體，其中人類α 1抗胰蛋白酶基因的內含子已經突變以去除ATG序列。
實施例65. 實施例58至64中任一項的rAAV載體，其中多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化訊息。
實施例66. 實施例53至65中任一項的rAAV載體，其中所述載體是自身互補的載體。
實施例67. 實施例66的rAAV載體，其中所述載體包含編碼PAH多肽的第一核酸序列和編碼PAH多肽的補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可以與所述第二核酸序列沿著其大部分或全部長度形成鏈內鹼基對。
實施例68. 實施例67的rAAV載體，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變AAV ITR連接，其中所述突變AAV ITR包含D區的缺失，並且包含末端解鏈序列的突變。
實施例69. 一種rAAV顆粒，其包含實施例53至68中任一項的rAAV載體。
實施例70. 實施例中69的rAAV顆粒，其中AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼。
實施例71. 實施例69的rAAV顆粒，其中AAV病毒顆粒包含經工程化的AAV衣殼。
實施例72. 實施例71的rAAV顆粒，其中經工程化的AAV衣殼是DJ衣殼或LK03衣殼。
實施例73. 實施例69或70的rAAV顆粒，其中rAAV病毒顆粒的 ITR和衣殼來源於相同AAV血清型。
實施例74. 實施例69或70的rAAV顆粒，其中rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼來源於不同AAV血清型。
實施例75. 實施例69至70或73至74中任一項的rAAV顆粒，其中rAAV病毒顆粒包含AAV8衣殼。
實施例76. 實施例74的rAAV顆粒，其中rAAV病毒顆粒包含AAV8衣殼，並且其中所述載體包含AAV2 ITR。
實施例77. 一種組成物，其包含實施例69至76中任一項的rAAV顆粒。
實施例78. 實施例77的組成物，其中所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
實施例79. 一種細胞，其包含實施例33至49中任一項的核酸或請求項52或53的載體或實施例54至68中任一項的rAAV載體。
實施例80. 一種產生變異體PAH多肽的方法，所述方法包括在產生變異體PAH多肽的條件下培養實施例79的細胞。
實施例81. 實施例80的方法，其還包括純化變異體PAH多肽的步驟。
實施例82. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予實施例1至30中任一項的變異體PAH多肽或實施例31或32的組成物。
實施例83. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予編碼實施例1至30中任一項的變異體PAH多肽的核酸或實施例33、34或49的核酸。
實施例84. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法， 其包括向所述個體投予實施例53-至68中任一項的rAAV載體。
實施例85. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予實施例69至76中任一項的rAAV顆粒。
實施例86. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予實施例31、32、50、51、77或78的組成物。
實施例87. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予實施例79的細胞。
實施例88. 實施例82至87中任一項的方法，其中所述個體缺乏PAH活性。
實施例89. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例1至30中任一項的變異體PAH多肽或請求項31或32的組成物。
實施例90. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予編碼實施例1至30中任一項的變異體PAH多肽的核酸或實施例33、34或49的核酸。
實施例91. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例53至68中任一項的rAAV載體。
實施例92. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例69至76中任一項的rAAV顆粒。
實施例93. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例31、32、50、51、77或78的組成物。
實施例94. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例79的細胞。
實施例95. 實施例89至94中任一項的方法，其中與同等匹配對 照個體的血液中苯丙胺酸含量相比，治療前個體血液中苯丙胺酸含量升高。
實施例96. 實施例82至95中任一項的方法，其中變異體PAH多肽、核酸、rAAV載體、rAAV顆粒、組成物或細胞通過靜脈內、動脈內、肝內、門靜脈內、腹膜內或皮下投予。
實施例97. 實施例82至96中任一項的方法，其中所述投予與另一種療法組合。
實施例98. 實施例97的方法，其中所述另一種療法是用四氫生物蝶呤治療，用苯丙胺酸解氨酶(PAL)或聚乙二醇化PAL治療，或苯丙胺酸限制飲食。
實施例99. 一種用於製備PAH多肽的方法，其包括在產生PAH多肽的條件下培養實施例79的細胞。
實施例100. 實施例99的方法，其還包括純化所述PAH多肽。
實施例101. 一種套組，其包含實施例1至24中任一項的變異體PAH多肽。
實施例102. 一種套組，其包含實施例33至46中任一項的核酸、實施例53-68中任一項的rAAV載體、實施例69至76中任一項的rAAV顆粒或實施例77或78的組成物。
實施例103. 實施例101或102的套組，其中所述套組還包括使用說明；緩衝劑和/或醫藥上可接受的賦形劑；和/或瓶子、小瓶和/或注射器。
實施例104. 一種用於在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中所述表現盒包含可操作地連接至啟動子和增強子的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述增強子包括一個或兩個修飾的凝血酶原增強子(pPrT2)、一個或兩個修飾的α1-微bikunin增強子(mA1MB2)、修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)、B型肝炎病毒增強子II(HEII)或CRM8增 強子。
實施例105. 實施例104的表現盒，其中所述mTTR啟動子是mTTR482啟動子。
實施例106. 實施例104或105的表現盒，其中所述增強子在mTTR啟動子的5'側。
實施例107. 一種用於在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中所述表現盒包含可操作地連接至啟動子和和3'元件的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述3'元件是白蛋白3'元件(3'Alb)或連接至人類α 1抗胰蛋白酶支架/基質附著區(SMAR)的白蛋白3'元件(3'AlbSMAR)。
實施例108. 實施例107的表現盒，其中所述mTTR啟動子是mTTR482啟動子。
實施例109. 實施例107或108的表現盒，其中所述3'元件位於轉基因的3'側。
實施例110. 一種用於在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中所述表現盒包含可操作地連接至啟動子和增強子和3'元件的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述增強子包括一個或兩個修飾的凝血酶原增強子(pPrT2)、一個或兩個修飾的α1-微bikunin增強子(mA1MB2)、修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)、B型肝炎病毒增強子II(HEII)或CRM8增強子，並且其中所述3'元件是白蛋白3'元件(3'Alb)或連接至人類α 1抗胰蛋白酶支架/基質附著區(SMAR)的白蛋白3'元件(3'AlbSMAR)。
實施例111. 實施例110的表現盒，其中所述mTTR啟動子是mTTR482啟動子。
實施例112. 實施例110或111的表現盒，其中所述增強子在mTTR 啟動子的5'側。
實施例113. 實施例110至112中任一項的表現盒，其中所述3'元件位於轉基因的3'側。
實施例114. 實施例104至113中任一項的表現盒，其中所述表現盒還包含內含子。
實施例115. 實施例114的表現盒，其中所述內含子是雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白雜合內含子。
實施例116. 實施例104至115中任一項的表現盒，其中所述表現盒還包含多腺苷酸化訊息。
實施例117. 實施例116的表現盒，其中多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化訊息。
實施例118. 實施例104至117中任一項的表現盒，其中所述轉基因編碼PAH多肽或變異體PAH多肽。
實施例119. 實施例118的表現盒，其中變異體PAH多肽是實施例1至30中任一項的變異體PAH多肽。
實施例120. 一種載體，其包含實施例104至119中任一項的表現盒。
實施例121. 實施例120的載體，其中所述載體是重組腺相關病毒(rAAV)載體。
實施例122. 一種包含實施例104至119中任一項的表現盒的rAAV載體，所述表現盒的側翼是一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。
實施例123. 實施例122的rAAV載體，其中實施例104至118中任一項的表現盒的側翼是兩個AAV ITR。
實施例124.實施例122或123的rAAV載體，其中AAV ITR是AAV1、 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
實施例125. 實施例122至124中任一項的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
實施例126. 實施例122至125中任一項的rAAV載體，其中所述載體是自身互補的載體。
實施例127. 實施例126的rAAV載體，其中所述載體包含編碼PAH多肽的第一核酸序列和編碼PAH多肽的補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可以與所述第二核酸序列沿著其大部分或全部長度形成鏈內鹼基對。
實施例128. 實施例127的rAAV載體，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變AAV ITR連接，其中所述突變AAV ITR包含D區的缺失，並且包含末端解鏈序列的突變。
實施例129. 一種rAAV顆粒，其包含實施例122至127中任一項的rAAV載體。
實施例130. 實施例中129的rAAV顆粒，其中AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼。
實施例131. 實施例130的rAAV顆粒，其中AAV病毒顆粒包含經工程化的AAV衣殼。
實施例132. 實施例131的rAAV顆粒，其中經工程化的AAV衣殼是DJ衣殼或LK03衣殼。
實施例133. 實施例131或132的rAAV顆粒，其中rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼來源於相同AAV血清型。
實施例134. 實施例131或132的rAAV顆粒，其中rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼來源於不同AAV血清型。
實施例135. 一種組成物，其包含實施例129至134中任一項的rAAV顆粒。
實施例136. 實施例135的組成物，其中所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
實施例137. 一種細胞，其包含實施例104至119中任一項的表現盒或實施例120-128中任一項的載體。
實施例138. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予實施例104至119中任一項的表現盒。
實施例139. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予實施例122至128中任一項的rAAV載體。
實施例140. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予實施例129至134中任一項的rAAV顆粒。
實施例141. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予實施例135或136的組成物。
實施例142. 一種用於治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予實施例137的細胞。
實施例143. 實施例138至142中任一項的方法，其中所述個體缺乏PAH活性。
實施例144. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例104至119中任一項的表現盒。
實施例145. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例122至128中任一項的rAAV載體。
實施例146. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例129至134中任一項的rAAV顆粒。
實施例147. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例135或136的組成物。
實施例148. 一種用於降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸含量的方法，其包括向所述個體投予實施例137的細胞。
實施例149. 實施例144至148中任一項的方法，其中與同等匹配對照個體的血液中苯丙胺酸含量相比，治療前個體血液中苯丙胺酸含量升高。
實施例150. 實施例138至149中任一項的方法，其中核酸、rAAV載體、rAAV顆粒、組成物或細胞通過靜脈內、動脈內、肝內、門靜脈內、腹膜內或皮下投予。
實施例151. 實施例138至150中任一項的方法，其中所述投予與另一種療法組合。
實施例152. 實施例151的方法，其中所述另一種療法是用四氫生物蝶呤治療，用苯丙胺酸解氨酶(PAL)或聚乙二醇化PAL治療，或苯丙胺酸限制飲食。
實施例153. 一種套組，其包含實施例104至119中任一項的表現盒、實施例122至128中任一項的rAAV載體、實施例129至134中任一項的rAAV顆粒或實施例135或136的組成物。
實施例154. 實施例153的套組，其中所述套組還包括使用說明；緩衝劑和/或醫藥上可接受的賦形劑；和/或瓶子、小瓶和/或注射器。
實例
通過參考以下實例將更全面地理解本發明。然而，它們不應被解讀為限制本發明的範圍。應理解，本文描述的實例和實施例僅用於說明目的，並且根據它們進行的各種修改或改變將為熟習此項技術者知曉，並且應包括在本申請的精神和範圍內以及所附實施例的範圍內。
實例1. 肝臟特異性表現盒的產生
進行以下研究以開發在個體肝臟中表現轉基因的強表現構建體。
實例1至3的材料和方法
PAH表現盒和rAAV載體的構建
為了增加肝臟啟動子的強度，將含有小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子、內源性mTTR增強子和牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化(pA)位點的質體mTTR482-HI-hFVIII-BGHpA用於另外的修飾(Kyostio-Moore 2016,Nambiar 2017)。在此質體中，用編碼分泌型胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)的cDNA替代FVIII cDNA，並且用1069bp的雞b-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子替代現有內含子。在mTTR482增強子上游轉殖了各種肝臟增強子序列。這些包括修飾的凝血酶原增強子(mPrT2，兩個拷貝)、修飾的α1-微bikunin(mA1MB2，兩個拷貝)(McEachern 2006，Jacobs 2008)、修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)(Kramer 2003)、B型肝炎病毒增強子II(E11)(Kramer 2003)和CRM8(Chuah 2014)。另外，在BGH pA下游測試並轉殖了兩個3'元件，即白蛋白(Alb 3')(Wooddell 2008)和白蛋白加人A1AT1 SMAR元件(AF156542)(Alb3'/SMAR)(圖1A)。一些增強子中的修飾由將肝核因子(HNF)3和4結合位點改變為更高親和力的序列組成，類似於先前對mTTR482進行的修飾(Nambiar 2017；增刊 1)。
為了產生人或小鼠PAH質體表現盒，將編碼全長PAH(胺基酸1至452)的對應cDNA轉殖到三個表現質體中。這些質體含有肝臟特異性(LP1；Nathwani 2011)、A1MB2-mTTR482或CBA啟動子、雜合內含子和pA序列(BGH或猿猴病毒40[SV40]pA)(Nathwani 2011，Kyostio-Moore 2016)。所有表現質體都含有側翼AAV2 ITR。將mTTR482(Nambiar 2017)用作主鏈來評價編碼hPAH的各種cDNA。四個密碼子最佳化的cDNA由DNA2.0、GeneArt(GA)或Genscript(GS)和結合CpG含量的降低的GS算法生成。在每個表現質體中，將PAH蛋白用N末端22-胺基酸3xFLAG肽(MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(SEQ ID NO：18))標記，用於檢測和定量目的。
將所選含有AAV2 ITR的具有肝啟動子、雜合內含子、PAH cDNA和BGHpA的質體用於rAAV載體的生產。使用三重轉染法，隨後用CsCl2純化(Univ.Massachusetts Gene Therapy Core)產生具有AAV8血清型衣殼的rAAV載體。通過針對BGHpA的qPCR將載體批次定量(Nambiar 2017)。
體外細胞培養物
所有組織培養試劑均獲自Irvine Scientific(聖安娜，加利福尼亞州)或Invitrogen。為了瞬時轉染，將人293或人肝癌細胞(Huh7或HepG2)(8×105個細胞/孔)鋪板於6孔培養皿中的杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)上，所述培養基具有高葡萄糖、10%胎牛血清(FBS)和10ml/L Pen Strep(10個單位/ml青黴素和10μg/ml鏈黴素)。將質體(2μg)用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染。在48或72小時後，分別收穫細胞裂解物或培養基用於PAH分析或SEAP活性。
SEAP活性的定量
收集條件培養基或血清，並將樣品在65℃下加熱30分鐘以滅活內 源性鹼性磷酸酶。使用鹼性磷酸酶(ALP)-SL試劑(Sekisui Diagnostics)測量SEAP活性，並將樣品孵育10分鐘至2小時，隨後讀取405nm處的吸光度。將人鹼性磷酸酶HPAP用作標準(Calbiochem)。通過將樣品值除以轉換因子0.103mU/ng，將SEAP活性表示為ug/ml。
PAH蛋白和活性的定量
在48小時後，通過在裂解緩衝液或RIPA緩衝液中裂解細胞產生全細胞裂解物。另外，在一些實驗中，將超聲波處理或剪切用於增強細胞裂解。在解凍後，將裂解物在測定前以14,000g旋轉30分鐘。根據製造商的說明，並且使用套組標準或內部純化的3xFLAG-mPAH-FL作為蛋白質標準，通過FLAG ELISA(SE002-flag；ABSbio)測量FLAG融合蛋白的量。通過由BCA蛋白質測定套組(Pierce)測量的總蛋白質含量歸一化體內樣品。PAH蛋白的酶活性如先前Yew等人2013所述進行了測量，其中做了一些小的修改。使用標準方案，使用抗hPAH抗體(LS-C344145；LSBio)或抗FLAG抗體(F1804；Sigma)進行PAH檢測的西方墨點法分析。
體內研究
在Taconic飼養了一群BTBR-PAHenu2/J小鼠(McDonald 1996)。在8-12周齡時獲得純合(HOM)和雜合(HET)雄性小鼠，並根據動物護理和使用的人道準則進行飼養和維持。對於SEAP表現質體分析，通過向C57BL/6小鼠尾靜脈中以高壓注射法大容量注射投予無菌鹽水中的質體(10μg/小鼠)，其中每測試品最少n=8。通過靜脈內途徑經由尾靜脈投予重組AAV8載體(6至10隻動物/治療)。在大多數研究中，將動物在810周後通過異氟醚麻醉處死。通過眶後竇將全血收集到EDTA收集管中，旋轉並冷凍保存直至分析。在組織收集前將一些動物經由左心室灌注PBS。收集肝臟樣品並冷凍，直至分析。對於腦分析，從顱骨收穫全腦，稱重，矢狀切割，並在-80℃下冷凍直至分析。
血液和組織分析
使用配備有與API 4000三重四極質譜儀(AB SCIEX，弗雷明漢，美國馬薩諸塞州)聯用的Dionex Ultimate 3000 HPLC(Thermo Fisher，沃爾瑟姆，美國馬薩諸塞州)的Transcend II LX4多重系統，通過UHPLC-MS/MS分析血漿Phe和Tyr含量。使用L-Phe和L-Tyr(Sigma-Aldrich，聖路易斯，美國密蘇裡州)來製備標準溶液，並將標記的L-Phe-13C9,15N和標記的L-Tyr-13C9,15N(Sigma-Aldrich)用作內標。在正離子模式下進行MS/MS檢測。所述分析使用Acquity BEH C18柱(1.7μm，2.1×30mm)用梯度分離進行，所述梯度分離包括在98%流動相A(水中0.1%甲酸)下保持10秒，隨後在2%-45%流動相B(乙腈中0.1%甲酸)梯度下保持30秒，增加到75% B並保持15秒，在75% B下洗滌10秒，並且在98% A下再平衡1分鐘，流速為0.5mL/分鐘。MS/MS轉換為：Phe為166.1/120.1，Tyr為182.1/136.1，標記的Phe為176.1/129.1，以及標記的Tyr為192.1/145.1。
對於腦神經傳導物質的定量，按照稍作修改的描述處理腦(Kankaanpaa 2001)。簡而言之，用Bead Ruptor 24(Omni)在冰冷的裂解緩衝液(1mM草酸、3mM半胱胺酸、0.1M乙酸)中，以4.85m/秒在4℃下，將半個矢狀切割的、PBS灌注的腦勻漿20秒。將樣品以14K旋轉10分鐘，並且隨後將上清液冷凍。然後使用與API 5000三重四極質譜儀(AB SCIEX，弗雷明漢，美國馬薩諸塞州)聯用的Acquity UPLC(Waters Corporation，米爾福德市，美國馬薩諸塞州)，通過UPLC-MS/MS定量大腦勻漿(200mg/mL)的左旋多巴、多巴胺、高香草酸(HVA)、血清素、5-羥基色胺酸(5-HTP)、5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)和去甲腎上腺素含量。為了提高神經傳導物質的穩定性，使用0.1%甲酸(FA)和乙腈中的300ng/mL半胱胺酸作為樣品稀釋緩衝液。類似於如上所述的樣品，製備每種分析物(Sigma-Aldrich)的標準品和標準溶液。在正離子模式下進行 MS/MS檢測(在負離子模式下檢測HVA)。所述分析使用Acquity HSS C18 SB(1.7μm，2.1 x 100mm)用梯度分離進行，所述梯度分離包括在98%流動相A(水中0.1% FA)下保持0.5分鐘，隨後在2%至40%流動相B(乙腈中0.1% FA)梯度下保持3.5分鐘，增加到95% B並保持0.1分鐘，在95% B下洗滌0.5分鐘，並且在98% A下再平衡2.4分鐘，流速為0.5mL/分鐘。正離子MS/MS轉換為：左旋多巴為198/152，血清素為177/160.1，多巴胺為154/137.1，5-HIAA為192/146，去甲腎上腺素為170.1/107，5-HTP為221.1/201。除了取消梯度的初始保持階段之外，類似於上述方法，以負離子模式進行HVA檢測。負離子模式下HVA的MS/MS轉換為181.1/137.1。將所述含量表示為μg/mL勻漿或uM。如上一節所述定量大腦Phe和Tyr含量。
對於肝臟樣品，定量載體基因組、PAH活性和蛋白質含量。通過qPCR定量載體基因組的拷貝(Martin 2013)。如下進行FLAG標記的蛋白質的定量。在勻漿器(Bead Ruptor 24；Omni)中，將肝樣品在具有珠(15-340-153；Fisher Scientific)的管中，在含有1×蛋白酶抑制劑的1×PBS或RIPA緩衝液中，以5.65rpm在4℃下勻漿20-30秒。將樣品在4℃下以14,000g旋轉30分鐘。然後通過FLAG ELISA測定將上清液用於PAH定量，並以總蛋白量標準化(BCA蛋白質測定套組；Pierce)。如上所述進行肝勻漿中的PAH蛋白活性。
結果
先前描述了肝臟mTTR482啟動子，其含有小鼠甲狀腺素運載蛋白核心啟動子及其5'增強子元件(在HNF-3和HNF-4結合位點中具有修飾)(Nambiar 2016)。本研究的目標是進一步增加啟動子強度。將此啟動子上游的各種基於肝臟的增強子或BGH pA下游的3'穩定性元件添加到表現盒中，並且然後在體外測量分泌的鹼性磷酸酶(SEAP)量作為兩種人肝臟系中的報告物(圖1A)。將SEAP質體瞬時轉染入Huh7和HepG2細胞表明，具有mA1MB2增強子的 表現盒(編號3)在培養基中產生最高的SEAP量，並且在兩種細胞株中比親代mTTR482構建體高大約2倍(圖1B、1C)。通過在正常C57BL/6小鼠中進行高壓注射對前病毒質體的體內評價也顯示了含有mA1MB2增強子的質體的最高和最持久的SEAP表現。在第1、7、14和28天，SEAP量分別比用親代mTTR482-SEAP質體治療的動物中檢測到的量高2.8、4.4、4和3.6倍(圖2A)。在PAHenu2小鼠中評價了具有和不具有mA1MB2增強子的mTTR482前病毒質體(圖2B)。含有mA1MB2增強子的質體一致地產生比用親代mTTR482構建體獲得的量高2倍的血漿SEAP含量。儘管SEAP在整個28天的研究中穩定分泌，但PKU小鼠中的SEAP量比用這些質體在C57Bl/6小鼠中獲得的量低大約10倍。基於此數據，選擇mA1MB2-mTTR482啟動子作為候選肝臟啟動子。
實例2. PAH enu2 小鼠中最佳化的肝臟啟動子與LP1啟動子的比較
為了在PKU疾病模型中驗證吾人所最佳化的肝臟啟動子，產生了AAV8/mA1MB2-mPAH載體，並將其與可與Yagi等人(2011)使用的載體相比的AAV8/scLP1-mPAH進行了比較。將兩種載體以兩種不同劑量(4e10和1e11，VG/小鼠)靜脈內投予，並測量血中Phe含量。在兩種劑量下，與sc-LP1載體相比，mA1MB2-mTTR482載體在降低血中Phe含量方面更有效(圖3A、圖3B)。使用較高劑量(1e11 vg/小鼠)的兩種載體都增加血中Tyr含量；已經在第7天(第一次投予後測量)檢測到升高，並保持升高直到第56天(研究結束)(圖3C)。儘管在較低劑量治療的動物中也檢測到血液Tyr增加，但所述增加與對應動物的治療前值沒有顯著差異。肝臟中病毒載體基因組的定量顯示，在第56天，自身互補載體的VG拷貝增加了2至3倍(圖3D)。
因為腦Phe含量是病理學的主要原因，所以測量了腦中的Phe含量。用1e11劑量，僅mA1MB2-mTTR482構建體提供了與野生型腦(HET)相似的低 腦Phe含量(圖4A)。腦Phe含量的降低與血液中測量的Phe含量密切相關(圖4B)。腦神經傳導物質含量的分析表明，兩種構建體的多巴胺升高是相當的(圖4C)。mA1MB2-mTTR482構建體在較低(4e10)劑量下也觀察到相似的功效。腦血清素定量顯示，與sc-LP1載體相比，使用mA1MB2-mTTR482構建體治療產生的血清素明顯更多(圖4D)。總之，用mA1MB2-mTTR482構建體對血中Phe含量的有效降低轉化為腦Phe含量的穩健降低，並隨後增強所治療動物腦中的多巴胺和血清素合成。
實例3. 評價密碼子最佳化的hPAH cDNA的hPAH產生
先前發表的研究表明，在PAHenu2小鼠中，編碼hPAH的rAAV載體功效不佳。為了測試更好地生產的hPAH是否能獲得增強的功效，測試了各種密碼子使用的效果。為此，基於不同的算法產生了hPAH的四種不同的密碼子最佳化的cDNA。從mTTR482啟動子下游轉殖所得序列，並在體外和體內評價hPAH蛋白量。質體轉染入人Huh7細胞顯示，hPAH cDNA之間幾乎沒有差異(均在2倍以內)(圖5A)。當經以高壓注射法將表現質體遞送到正常C57BL/6小鼠的肝臟中時，在構建體之間觀察到大得多的差異(圖5B)。具體地，與具有內源、未修飾(非)序列的質體相比，具有用GA算法產生的hPAH cDNA的表現質體在肝裂解物中導致高7倍的FLAG標記的蛋白檢測。基於此，將用GA算法產生的人cDNA用於後續研究。
實例4：人類PAH和小鼠PAH的體外和體內比較
方法
質體載體和重組AAV產生。
肝臟特異性啟動子(LP1和mTTR482)、雜合內含子、多聚腺苷 酸化位點(牛生長激素[BGH]和猿猴病毒40[SV40])的產生是本領域已知的，並已在Nathwani(2012)和Nambiar(2017)中進行了描述。構建了具有肝臟特異性或雞b-肌動蛋白(CBA)啟動子、雜合內含子、編碼全長(FL)人(h)或小鼠(m)PAH和BGH多聚A的cDNA的各種質體載體。還產生了具有mPAH和hPAH的雙截斷形式(DT；胺基酸103-428)或具有各種雜合構建體的表現盒。在具有CBA啟動子、雜合內含子、PAH-DT和BGH多聚A的質體載體中評價了hPAH-DT和mPAH中的胺基酸修飾。通過合成改變的DNA序列或通過定點誘變(Genscript)引入變化來產生PAH-DT胺基酸序列變異體(V)中的胺基酸變化。為了檢測和定量目的，大多數構建體含有在PAH cDNA上游的編碼N-末端22-胺基酸3xFLAG-肽的序列(MDYKDHDG DYKDHDI DYKDDDDK(SEQ ID NO：18))。
將具有肝臟特異性啟動子(LP1或mA1MB2-mTTR482)、1069bp雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白混合內含子、hPAH cDNA(或變異體)cDNA和BGHpA的所選擇PAH質體載體再轉殖(subclone)到含AAV2 ITR的質體中。最終的hPAH-V1載體構建體另外地含有去除了ATG的修飾內含子和來自α1抗胰蛋白酶內含子的0.9kb「填充」序列(減少了ATG)，以將載體基因組大小增加到4.6kb。所有rAAV載體都是用AAV8血清型衣殼使用三重轉染法產生的，隨後進行CsCl2純化。通過針對BGHpA的qPCR將載體批次定量(Martin 2013)。
PAH蛋白的純化。
根據製造商的說明，在無血清懸浮培養環境中，使用Expi293F表現系統套組(LifeTechnologies)進行Expi293F細胞(LifeTechnologies)的瞬時轉染。將編碼帶有FL或DT形式的3xFLAG標記的hPAH、hPAH-V1和mPAH的pCBA-PAH-BGHpA表現質體用於轉染。使細胞旋轉沉降，並在裂解緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA和1% Triton X-100)中產生全細胞裂解物。使用FLAG親和管柱(ANTI-FLAG M2親和凝膠；Sigma-Aldrich) 純化Flag標記的PAH蛋白。使用0.1M甘胺酸-HCl(pH 3.5)或TBS中的100ug/ml FLAG肽(Sigma-Aldrich)來洗脫蛋白質。將蛋白質重新懸浮在50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl(一些批次另外地含有10%甘露醇以提高穩定性，Nascimento 2010)中。在SDS-PAGE 4%-12% Tris-BIS-MES凝膠上分析蛋白質，並通過考馬斯藍染色進行染色。還使用抗FLAG肽或PAH蛋白的抗體通過西方墨點法來分析蛋白質。
PAH蛋白和活性程度的定量。
使用Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)，用含有FLAG標記的PAH表現盒的質體瞬時轉染HEK293T細胞。在48小時後，通過在裂解緩衝液或RIPA緩衝液(Pierce/ThermoFisher)中裂解細胞產生全細胞裂解物。另外，在一些實驗中，將超聲波處理或剪切用於增強細胞裂解。在解凍後，將裂解物在測定前以14,000g旋轉30分鐘。根據製造商的說明，並且使用套組標準或內部純化的3xFLAG-mPAH-FL作為蛋白質標準，通過FLAG ELISA(SE002-flag；ABSbio)測量FLAG融合蛋白量的定量。PAH蛋白的酶活性如先前所述(Yew 2013)進行了測量，其中做了一些小的修改。使用本領域已知的標準方案，使用抗hPAH抗體(LSBio)或抗FLAG抗體(Sigma)進行PAH檢測的西方墨點法分析。
結果
對人和小鼠PAH蛋白在Huh7和293細胞中的產生進行了體外評估。為了定量hPAH和mPAH的產生，所有表現的蛋白質中都含有N末端3xFLAG標簽。數據顯示與mPAH相比，在全Huh7細胞裂解物中hPAH的量較低，並且與所使用的表現盒無關(圖6A)。與mPAH相比，全長(F1，1至452)和雙截斷(DT)形式的hPAH顯示hPAH的產生較低(圖6B、圖6C)。DT形式是由胺基酸103至428組成的PAH的縮短和組成型活性形式，因此缺乏PAH的N末端調節結構域和C末端四聚結構域。
每種構建體的mRNA定量顯示了可比較的信息水準，表明hPAH與mPAH蛋白量的差異是轉錄後效應(圖6D)。當使用FLAG親和管柱純化hPAH和mPAH(FL和DT形式)時，人類PAH(FL和DT兩種形式)顯示出對於小鼠PAH沒有觀察到的極為不同的降解模式(圖6E)。
在PAHenu2小鼠中測試了編碼人和mPAH的rAAV8/sc-LP1載體。用編碼mPAH的載體治療的動物顯示出正常的血中Phe含量，而在用相當劑量的hPAH載體治療的小鼠中，觀察到血中Phe含量幾乎沒有降低(圖6F)。編碼mPAH的sc-LP1載體的功效先前已得到證實(Yagi 2011年)。
綜上所述，此數據表明hPAH的內源形式不如mPAH有效，並且這與體外觀察到的hPAH蛋白的產生/穩定性差相關。
實例5：人類PAH的改良變異體的產生
產生含有源自mPAH的不同長度的N-末端或C-末端序列的雜合hPAH構建體(圖7A)。測試了這些構建體的FLAG標記的蛋白的體外生產，並且表明用對應的小鼠序列替代hPAH的N末端或C末端都不能提高蛋白量(圖7B、圖7C)。因此，含有催化核心(103-448，DT)的區域對mPAH的穩定性負責。
為了提高hPAH核心區的穩定性，將各種修飾引入hPAH-DT主鏈。使用hPAH-DT主鏈將各種胺基酸修飾引入hPAH序列。根據其他物樹包括小鼠、雞和細菌)中PAH的胺基酸序列將胺基酸變化建模(表1)。所有構建體還在柔性N-末端中含有3x-FLAG-標簽。在體外在293細胞中表現人變異體(V；V1至13)，並對全細胞裂解物進行PAH蛋白和活性程度的定量，並與hPAH和mPAH的DT形式進行比較(圖8A)。蛋白質定量顯示，一些hPAH變異體，如V1、V5(與V1相比增加了一個變化)和V8(兩個胺基酸變化與V1不同)與未修飾的hPAH相比具有提高的蛋白質量。然而，當測試這些變異體的PAH酶活性時，僅V1具有顯 著提高的PAH活性(圖8B)。V1由位於催化結構域的三個不同部分的四個胺基酸變化(M180T、K199P、S250P和G256A)組成。在構建體V9-13中沒有觀察到變化(數據未顯示)。
Figure 108136919-A0202-12-0093-1
Figure 108136919-A0202-12-0094-2
產生了V1的另外衍生物。第一組包括僅有一個胺基酸改變的構建體(V14-17，表1)。PAH活性結果表明，所有這些構建體的PAH量和活性都很差，與未修飾的hPAH相當，並且因此表明這些變化都不能單獨提供任何改善(圖9A-圖9C、圖10A-圖10C)。第二組構建體是V1的衍生物，其中四個胺基酸中的一個被還原為人野生型胺基酸。
Figure 108136919-A0202-12-0094-3
Figure 108136919-A0202-12-0095-4
然後確定三個胺基酸變化是否足夠(V18-21)。其中最好的是沒有S250P變化的V20，具有大約67%的V1活性(圖9A)。有趣的是，此變異體儘管由於PAH蛋白量降低而具有較低的總酶活性，但與親代V1相比具有提高2倍的比活性(specific activity)(圖9B、圖9C)。
還測試了人類PAH變異體-1的一組雙突變體衍生物。與單突變體系列(V14-17)不同，雙突變體V29和V30在活性上獲得了一些改善，但是不如V1改善得多(圖10D)。
為了進一步改善V1，引入了額外的變化，其中一些變化旨在增加比活性(V22-28，表2)。雖然這些變化都沒有提高總的PAH活性，但一些修飾確實提高了PAH蛋白量或其比活性。例如，V23具有比hPAH-V1高2倍的PAH蛋白。
通過對hPAH中103-428區域內存在的那些殘基一次連續改變兩個或三個殘基，進行mPAH的「反向」誘變。跨越此區域的五個構建體的活性測試表明，這些改變都沒有導致mPAH生產降低到針對hPAH觀察到的量(數據未顯示)。
表3. 小鼠PAH變異體
Figure 108136919-A0202-12-0096-5
構建了表現盒，所述表現盒編碼表現最佳的變異體(V1)，其作為全長蛋白，並從A1MB2-mTTR啟動子表現。在將質體轉染入Huh7細胞後，將此構建體與可比較的小鼠PAH和hPAH表現質體進行PAH蛋白產生和活性的比較。數據表明，與內源性hPAH相比，hPAH-V1使PAH蛋白的產生和活性提高了大約10倍(圖11A-圖11C)。所有PAH蛋白具有相當的活性與蛋白質的比率，這表明比活性大致相似。
綜上所述，所述數據證明了通過胺基酸變化(例如，2、3、4、5或6個胺基酸變化)改善人類PAH特徵的可行性，所有這些胺基酸變化都有助於觀察到的改善。
實例6：通過PAH-V1校正高苯丙胺酸血症
方法
血液和組織分析。
如實例1至3中所述進行腦和組織分析。
動物實驗。
如實例1至3中所述進行動物實驗。
結果
為了在體內測試修飾的hPAH的功效，產生了編碼hPAH-V1的rAAV8載體，以及具有小鼠或hPAH(均為FL形式)的相似載體。表現hPAH-V1的載體在PKU的PAHenu2小鼠模型中顯示出血中Phe含量的快速降低以及血液Tyr的增加(圖12A、圖12B)。對於在血液中測量的各種Phe代謝物觀察到類似的效果(圖12C)。總體上，與內源性hPAH相比，修飾的hPAH-V1對所有這些終點更有效。hPAH-V1的功效提高與肝臟中PAH蛋白量和活性的提高直接相關(圖13A、圖13B)。所有治療組在肝臟中都具有可比較的載體基因組拷貝(圖13C)。
分析了不同的腦終點(對3e11 VG/小鼠治療組進行)。數據表明，與初始PAHenu2小鼠相比，治療小鼠腦中Phe含量顯著降低，並且Tyr含量升高(圖14A、圖14B)。腦Phe含量的變化與血中Phe含量的降低密切相關，並且也顯示了hPAH-V1治療組對Phe的更好控制(圖14C)。因為胺基酸Phe、Tyr和Trp都使用相同的大的中性胺基酸轉運體(LAT1)，所以在腦Trp含量上觀察到類似的改善(圖14D)。hPAH和hPAH-V1兩者都導致腦中這些胺基酸含量的可比較增加。
測量了治療的小鼠腦中的腦神經傳導物質多巴胺和血清素含量及其代謝物含量。數據顯示，與hPAH相比，hPAH-V1治療的動物中這些神經傳導物質的增加顯著更高(圖15A-圖15D)。
總之，hPAH-V1蛋白的改良特性轉化為增強的降低血液和腦Phe含量以及增加腦中Tyr和神經傳導物質含量的能力。由於肝臟中存在可比較的載體基因組含量，所述數據表明用編碼hPAH-V1的載體獲得了更高的效力。
產生了用於mA1MB2-mTTR482啟動子/hPAH-V1載體的4.6kb基因組。除了在BGH pA下游引入的填充序列，此基因組在內含子序列中不包含 「ATG」序列(圖16A)。當在PAHenu2小鼠中測試此載體時，當與親代3.8kb載體相比時，觀察到作為血中Phe含量降低而測量的顯著更好的功效(圖16B)。此實驗還包含4.6kb的載體，其缺乏用於測量PAH蛋白量的N-末端FLAG標簽。所述數據顯示，去除此標簽並沒有改變載體基因組的功效。綜上所述，修飾的hPAH-V1賦予相對於內源性hPAH更高的效力，並且因此，與編碼hPAH的載體相比，預期以更低的載體劑量提供功效。
實例7. NHP肝臟中提高的hPAH-V1蛋白量
材料和方法：
重組AAV載體的構建
除了使用雜合衣殼之外，如實例4中所述進行A1MB2-HI-hPAH和A1MB2-HI-hPAH-V1的載體產生。
動物實驗
2至3歲(2-4kg)的雄性食蟹猴(cynomolgus monkey，Macaca fascicularis)通過緩慢靜脈內輸注(1ml/min)到隱靜脈來接受10ml的測試品。治療組由媒介物組(PBS，n=1)、rAAV/hPAH(n=3)和rAAV/hPAH-V1(n=3)組成。在兩周後對動物進行人道安樂死，並收集各種組織並在-80℃下冷凍直至分析。
載體基因組、mRNA和PAH蛋白的定量
如實例1至3中所述，使用針對BGHpA的引物/探針通過qPCR定量肝臟和脾臟中的載體基因組和載體衍生的mRNA的拷貝。如實例1至3中所述，通過西方墨點法針對FLAG標簽分析肝勻漿中人類PAH蛋白的量。
結果：
為了測試A1MB2-mTTR啟動子在NHP肝臟中的功能，在載體遞 送後的兩個時間評價了mRNA和PAH的產生量。平均而言，在所有載體治療的動物的肝臟中檢測到可比較的載體和載體衍生的mRNA的量(標準化為載體基因組拷貝)(圖17A、圖17B)。通過比較肝臟和脾臟中的載體mRNA(兩種組織中的mRNA量標準化為載體基因組拷貝)來分析表現的肝臟特異性，並證明肝臟中的轉錄物/VG比率高於脾臟(圖17B)。還通過測試肝中載體衍生的FLAG標記的PAH蛋白的檢測來評價轉導。用編碼PAH-V1的載體治療的所有動物都證明肝臟中存在大小正確的hPAH-V1。相比之下，在用編碼hPAH的載體治療的動物中檢測到極少至無的hPAH蛋白(圖17C)。由於載體基因組和mRNA量兩者在兩個治療組中都是可比較的，因此這些結果表明NHP肝臟中的hPAH-V1蛋白具有更好的穩定性。這些觀察結果類似於在小鼠中進行的研究以及用人肝細胞株進行的體外研究，表明hPAH-V1在所有測試系統中的優越性。
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序列
人苯丙胺酸羥化酶(GenBank AAA60082.1和AAC51772.1)-胺基酸序列
Figure 108136919-A0202-12-0105-9
Figure 108136919-A0202-12-0105-10
(SEQ ID NO：1)
人苯丙胺酸羥化酶(GenBank AAH26251.1)-胺基酸序列
Figure 108136919-A0202-12-0105-7
Figure 108136919-A0202-12-0106-8
Figure 108136919-A0202-12-0106-11
(SEQ ID NO：2)
人類PAH-V1胺基酸序列(M180T、K199P、S250P和G256A)
Figure 108136919-A0202-12-0106-12
Figure 108136919-A0202-12-0106-13
(SEQ ID NO：3)
人類PAH-V1 DNA序列
Figure 108136919-A0202-12-0107-14
Figure 108136919-A0202-12-0108-15
Figure 108136919-A0202-12-0108-16
(SEQ ID NO：4)
3.8kb最佳化載體基因組序列(ITR-A1MB2-mTTR-HI-hPAH V1-BGHpA-ITR)
Figure 108136919-A0202-12-0108-17
Figure 108136919-A0202-12-0109-18
Figure 108136919-A0202-12-0110-19
Figure 108136919-A0202-12-0111-20
(SEQ ID NO：5)
4.6kb最佳化載體基因組序列(ITR-A1MB2-mTTR-HI[noATGs]-hPAH V1-BGHpA-填充核酸-ITR)(4561bp)
Figure 108136919-A0202-12-0111-21
Figure 108136919-A0202-12-0112-22
Figure 108136919-A0202-12-0113-23
Figure 108136919-A0202-12-0114-24
Figure 108136919-A0202-12-0115-25
Figure 108136919-A0202-12-0115-26
(SEQ ID NO：6)
肝臟表現盒中使用的5'和3'序列
修飾的PrT2增強子序列
Figure 108136919-A0202-12-0115-27
(SEQ ID NO：7)
加底線的，肝核因子結合位點；粗體，引入以產生更高親和力的結合位點的修飾，斜體，重複序列
修飾的A1MB2增強子
Figure 108136919-A0202-12-0116-28
Figure 108136919-A0202-12-0116-29
(SEQ ID NO：8)
加底線的，肝核因子結合位點；粗體，引入以產生更高親和力的結合位點的修飾，斜體，重複序列
修飾的Ealb序列
Figure 108136919-A0202-12-0116-30
Figure 108136919-A0202-12-0117-31
Figure 108136919-A0202-12-0117-32
(SEQ ID NO：9)
加底線的，肝核因子結合位點；粗體，引入以產生更高親和力的結合位點的修飾，斜體，重複序列
HEII增強子
Figure 108136919-A0202-12-0117-33
Figure 108136919-A0202-12-0117-34
(SEQ ID NO：10)
CRM8增強子
GGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCAC(SEQ ID NO：11)
3'Alb穩定性元件
Figure 108136919-A0202-12-0117-35
Figure 108136919-A0202-12-0118-36
Figure 108136919-A0202-12-0118-37
(SEQ ID NO：12)
3'alb和SMAR穩定性元件
Figure 108136919-A0202-12-0118-38
Figure 108136919-A0202-12-0119-39
Figure 108136919-A0202-12-0119-40
(SEQ ID NO：13)
密碼子最佳化的人類PAH cDNA
Figure 108136919-A0202-12-0119-41
Figure 108136919-A0202-12-0120-42
Figure 108136919-A0202-12-0121-43
(SEQ ID NO：14)
修飾的雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合啟動子/內含子
Figure 108136919-A0202-12-0121-44
Figure 108136919-A0202-12-0122-45
Figure 108136919-A0202-12-0122-47
(SEQ ID NO：15)
粗體=變為T以消除ATG的G、A、A、A、A(5個變化)
0.9kb A1AT內含子填充序列
Figure 108136919-A0202-12-0122-48
Figure 108136919-A0202-12-0123-49
(SEQ ID NO：16)
粗體=變化以消除ATG的7個鹼基；都是A變為T。
<110> 美商健臻公司(GENZYME CORPORATION)
<120> 生成經改良的人類PAH以藉由肝導向的基因置換療法來治療重度苯丙酮尿症(PKU)
<130> 15979-20166.00
<140> 尚未分配
<141> 同時隨同提交
<150> US 62/744,944
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<160> 18
<170> Windows版本4.0的FastSEQ
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<211> 452
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 108136919-A0202-12-0124-50
Figure 108136919-A0202-12-0125-51
<210> 2
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure 108136919-A0202-12-0126-52
Figure 108136919-A0202-12-0127-53
<210> 3
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Figure 108136919-A0202-12-0127-55
Figure 108136919-A0202-12-0128-56
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
Figure 108136919-A0202-12-0129-57
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 5
Figure 108136919-A0202-12-0129-58
Figure 108136919-A0202-12-0130-60
Figure 108136919-A0202-12-0131-61
<210> 6
<211> 4561
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 6
Figure 108136919-A0202-12-0131-62
Figure 108136919-A0202-12-0132-63
Figure 108136919-A0202-12-0133-64
<210> 7
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 7
Figure 108136919-A0202-12-0133-65
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 8
Figure 108136919-A0202-12-0133-66
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 9
Figure 108136919-A0202-12-0134-67
<210> 10
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 10
Figure 108136919-A0202-12-0134-68
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 11
Figure 108136919-A0202-12-0134-69
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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Figure 108136919-A0202-12-0135-70
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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Figure 108136919-A0202-12-0135-71
Figure 108136919-A0202-12-0136-72
<210> 14
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<223> 合成構建體
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Figure 108136919-A0202-12-0136-73
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 15
Figure 108136919-A0202-12-0137-74
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 16
Figure 108136919-A0202-12-0137-75
Figure 108136919-A0202-12-0138-76
<210> 17
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 17
Figure 108136919-A0202-12-0138-77
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 18
Figure 108136919-A0202-12-0138-78

Claims (136)

  1. 一種變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，包含兩個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。
  2. 一種變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，包含三個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代位於選自野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。
  3. 一種變異體苯丙胺酸羥化酶(PAH)多肽，包含四個胺基酸取代，所述胺基酸取代位於野生型人類PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位點處。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述胺基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A中的一個或多個。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述胺基酸取代包括K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述胺基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽還包含H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T胺基酸取代。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述野生型人類PAH多肽包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽是人類PAH多肽。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列至少約80%相同的胺基酸序列。
  11. 如請求項1至6中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的變異體PAH，其中所述變異體PAH多肽還包含選自野生型人類PAH多肽的G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A和G442A中的一個或多個胺基酸取代。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的變異體PAH，其中所述變異體PAH多肽還包含選自野生型人類PAH多肽的P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、S446H中的一個或多個胺基酸取代，以及在野生型人類PAH多肽的位置453處添加S。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的變異體PAH，其中所述變異體PAH多肽還包含選自野生型人類PAH多肽的F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P和N376P中的一個或多個胺基酸取代。
  15. 一種變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含選自野生型人類PAH多肽的G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、 G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A和G442A中的一個或多個胺基酸取代。
  16. 一種變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含選自野生型人類PAH多肽的P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、S446H中的一個或多個胺基酸取代，以及在野生型人類PAH多肽的位置453處添加S。
  17. 一種變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含選自野生型人類PAH多肽的F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P和N376P中的一個或多個胺基酸取代。
  18. 如請求項1至17中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含N末端截斷。
  19. 如請求項18所述的變異體PAH多肽，其中所述N末端截斷包括N末端調節結構域的截斷。
  20. 如請求項18或19所述的變異體PAH多肽，其中所述N末端截斷包括所述野生型PAH多肽的胺基酸殘基1至102的截斷。
  21. 如請求項1至20中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含C末端截斷。
  22. 如請求項21所述的變異體PAH多肽，其中所述C末端截斷包括四聚結構域的截斷。
  23. 如請求項21或22所述的變異體PAH多肽，其中所述C末端截斷包括所述野生型PAH多肽的胺基酸殘基429至452的截斷。
  24. 如請求項1至23中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含對應於所述野生型PAH多肽的胺基酸殘基103至428的胺基酸序列。
  25. 如請求項1至24中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含一個或多個胺基酸取代，以消除潛在的蛋白酶切割位點。
  26. 如請求項25所述的變異體PAH多肽，其中消除潛在蛋白酶切割位點的所述一個或多個胺基酸取代位於所述野生型PAH多肽的位置270至95及/或380至405處。
  27. 如請求項1至26中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽與肝靶向多肽融合。
  28. 如請求項27所述的變異體PAH多肽，其中所述肝靶向多肽是HGF或其片段或者是結合肝細胞去唾液酸糖蛋白受體的糖蛋白。
  29. 如請求項1至25中任一項所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽被聚乙二醇化及/或亞硝基化。
  30. 如請求項26所述的變異體PAH多肽，其中所述變異體PAH多肽包含I374C胺基酸取代，其中位置374處的cys殘基被亞硝基化。
  31. 一種組成物，其包含如請求項1至30中任一項所述的變異體PAH多肽。
  32. 如請求項31所述的組成物，其中所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
  33. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至30中任一項所述的變異體PAH多肽。
  34. 如請求項33所述的經分離核酸，其中編碼所述變異體PAH多肽的核酸可操作地連接至啟動子。
  35. 如請求項34所述的經分離核酸，其中所述啟動子選自巨細胞病毒(CMV)即時早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、轉甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)、mTTR482啟動子、mA1MB2-mTTR482啟動子、TK啟動子、四環素響應型啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、LP1啟動子、嵌合式肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG)啟動子、延長因子1-α啟動子(EF1-α)啟動子、人類β-葡糖醛酸酶啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、經修飾的雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子或SEQ ID NO：17、逆轉錄勞斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子，和13-肌動蛋白啟動子。
  36. 如請求項34或35所述的經分離核酸，其中所述啟動子是LP1啟動子或mA1MB2-mTTR482啟動子。
  37. 如請求項33至36中任一項所述的經分離核酸，其中所述核酸還包含多腺苷酸化訊息。
  38. 如請求項37所述的經分離核酸，其中所述多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化訊息、SV40多腺苷酸化訊息或HSV TK pA。
  39. 如請求項33至38中任一項所述的經分離核酸，其中所述核酸還包含內含子。
  40. 如請求項39所述的經分離核酸，其中所述內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。
  41. 如請求項39所述的經分離核酸，其中所述內含子是SEQ ID NO：15之經修飾的雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。
  42. 如請求項33至41中任一項所述的經分離核酸，其中所述核酸還包含一個或多個ITR。
  43. 如請求項33至42中任一項所述的經分離核酸，其中所述核酸還包含填充核酸。
  44. 如請求項43所述的經分離核酸，其中所述填充核酸係經最佳化以去除ATG序列。
  45. 如請求項44所述的經分離核酸，其中所述填充核酸是SEQ ID NO：16的A1AT內含子填充序列。
  46. 一種編碼人類PAH多肽的經分離核酸，其中所述核酸是密碼子最佳化的。
  47. 如請求項46所述的經分離核酸，其中所述核酸序列與SEQ ID NO：14的核酸序列至少80%相同。
  48. 如請求項46所述的經分離核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO：14的核酸序列。
  49. 如請求項33所述的經分離核酸，其中所述核酸是mRNA。
  50. 一種組成物，其包含如請求項33至49中任一項所述的核酸。
  51. 如請求項50所述的組成物，其中所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
  52. 一種載體，其包含如請求項33至49中任一項所述的核酸。
  53. 如請求項52所述的載體，其中所述載體是重組型腺相關病毒 (rAAV)載體。
  54. 一種rAAV載體，其包含如請求項33至41或43至49中任一項所述的核酸，所述核酸的側翼是一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。
  55. 如請求項54所述的rAAV載體，其中如請求項33-48中任一項所述的核酸的側翼是兩個AAV ITR。
  56. 如請求項54或55所述的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
  57. 如請求項54至56中任一項所述的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
  58. 如請求項57所述的rAAV載體，其中所述rAAV載體從5'到3'包含AAV2 ITR、啟動子、內含子、編碼PAH多肽的核酸、填充核酸、多腺苷酸化訊息和AAV2 ITR。
  59. 如請求項58所述的rAAV載體，其中所述啟動子是m1A1MB2-mTTR482啟動子或LP1啟動子。
  60. 如請求項58或59所述的rAAV載體，其中所述內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。
  61. 如請求項58至59中任一項所述的rAAV載體，其中所述PAH多肽是如請求項1至30中任一項所述的變異體PAH多肽。
  62. 如請求項58至60中任一項所述的rAAV載體，其中編碼所述PAH多肽的所述核酸是如請求項46至48中任一項所述的密碼子最佳化的核酸。
  63. 如請求項58至62中任一項所述的rAAV載體，其中所述填充核酸包含來自人類α 1抗胰蛋白酶基因的內含子的核酸。
  64. 如請求項63所述的rAAV載體，其中所述人類α 1抗胰蛋白酶基因的內含子係經突變以去除ATG序列。
  65. 如請求項58至64中任一項所述的rAAV載體，其中所述多腺苷酸化訊息是牛生長激素多腺苷酸化訊息。
  66. 如請求項53至65中任一項所述的rAAV載體，其中所述載體是自身互補型載體。
  67. 如請求項66所述的rAAV載體，其中所述載體包含編碼所述PAH多肽的第一核酸序列和編碼所述PAH多肽之補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可以與所述第二核酸序列沿著其大部分或全部長度形成鏈內鹼基對。
  68. 如請求項67所述的rAAV載體，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過經突變的AAV ITR連接，其中所述經突變的AAV ITR包含D區的缺失並且包含末端解鏈序列的突變。
  69. 一種rAAV顆粒，其包含如請求項53至68中任一項所述的rAAV載體。
  70. 如請求項69所述的rAAV顆粒，其中所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血 清型衣殼。
  71. 如請求項69所述的rAAV顆粒，其中所述AAV病毒顆粒包含經工程化的AAV衣殼。
  72. 如請求項71所述的rAAV顆粒，其中所述經工程化的AAV衣殼是DJ衣殼或LK03衣殼。
  73. 如請求項69或70所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼係來源於相同的AAV血清型。
  74. 如請求項69或70所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼係來源於不同的AAV血清型。
  75. 如請求項69至70或73至74中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒包含AAV8衣殼。
  76. 如請求項74所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒包含AAV8衣殼，並且其中所述載體包含AAV2 ITR。
  77. 一種組成物，其包含如請求項69至76中任一項所述的rAAV顆粒。
  78. 如請求項77所述的組成物，其中所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
  79. 一種細胞，其包含如請求項33至49中任一項所述的核酸或如請求項52或53所述的載體或如請求項54至68中任一項所述的rAAV載體。
  80. 一種產生變異體PAH多肽的方法，所述方法包括在產生所述變異體PAH多肽的條件下培養如請求項79所述的細胞。
  81. 如請求項80所述的方法，其還包括純化所述變異體PAH多肽的步 驟。
  82. 一種治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如請求項1至30中任一項所述的變異體PAH多肽或如請求項31或32所述的組成物。
  83. 一種治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予編碼如請求項1至30中任一項所述的變異體PAH多肽的核酸或如請求項33、34或49所述的核酸。
  84. 一種治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如請求項53至68中任一項所述的rAAV載體。
  85. 一種治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如請求項69至76中任一項所述的rAAV顆粒。
  86. 一種治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如請求項31、32、50、51、77或78所述的組成物。
  87. 一種治療有需要的個體中苯丙酮尿症的方法，其包括向所述個體投予如請求項79所述的細胞。
  88. 如請求項82至87中任一項所述的方法，其中所述個體缺乏PAH活性。
  89. 一種降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸量的方法，其包括向所述個體投予如請求項1至30中任一項所述的變異體PAH多肽或如請求項31或32所述的組成物。
  90. 一種降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸量的方法，其包括向所述個體投予編碼如請求項1至30中任一項所述的變異體PAH多肽的核酸或如請 求項33、34或49所述的核酸。
  91. 一種降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸量的方法，其包括向所述個體投予如請求項53至68中任一項所述的rAAV載體。
  92. 一種降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸量的方法，其包括向所述個體投予如請求項69至76中任一項所述的rAAV顆粒。
  93. 一種降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸量的方法，其包括向所述個體投予如請求項31、32、50、51、77或78所述的組成物。
  94. 一種降低有需要的個體的血液中苯丙胺酸量的方法，其包括向所述個體投予如請求項79所述的細胞。
  95. 如請求項89至94中任一項所述的方法，其中與同等匹配之對照個體其血液中的苯丙胺酸量相比，治療前所述個體血液中的苯丙胺酸量係升高。
  96. 如請求項82至95中任一項所述的方法，其中所述變異體PAH多肽、所述核酸、rAAV載體、rAAV顆粒、組成物或細胞，係通過靜脈內、動脈內、肝內、門靜脈內、腹腔內或皮下投予。
  97. 如請求項82至96中任一項所述的方法，其中所述投予係與另一種療法組合。
  98. 如請求項97所述的方法，其中所述另一種療法是用四氫生物蝶呤治療，用苯丙胺酸解氨酶(PAL)或聚乙二醇化PAL治療，或苯丙胺酸限制飲食。
  99. 一種用於製備PAH多肽的方法，其包括在產生所述PAH多肽的條件下培養如請求項79所述的細胞。
  100. 如請求項99所述的方法，其還包括純化所述PAH多肽。
  101. 一種套組，其包含如請求項1至24中任一項所述的變異體PAH多 肽。
  102. 一種套組，其包含如請求項33至46中任一項所述的核酸、如請求項53至68中任一項所述的rAAV載體、如請求項69至76中任一項所述的rAAV顆粒或如請求項77或78所述的組成物。
  103. 如請求項101或102所述的套組，其中所述套組還包括使用說明；緩衝劑和/或醫藥上可接受的賦形劑；和/或瓶子、小瓶和/或注射器。
  104. 一種在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中所述表現盒包含可操作地連接至啟動子和增強子的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述增強子包括一個或兩個經修飾的凝血酶原增強子(pPrT2)、一個或兩個經修飾的α1-微bikunin增強子(alpha1-microbikunin enhancers，mA1MB2)、經修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)、B型肝炎病毒增強子II(HEII)或CRM8增強子。
  105. 如請求項104所述的表現盒，其中所述mTTR啟動子是mTTR482啟動子。
  106. 如請求項104或105所述的表現盒，其中所述增強子在所述mTTR啟動子的5'側。
  107. 一種在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中所述表現盒包含可操作地連接至啟動子和和3'元件的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述3'元件是白蛋白3'元件(3'Alb)或連接至人類α 1抗胰蛋白酶支架/基質附著區(SMAR)的白蛋白3'元件(3'AlbSMAR)。
  108. 如請求項107所述的表現盒，其中所述mTTR啟動子是mTTR482啟動子。
  109. 如請求項107或108所述的表現盒，其中所述3'元件位於所述轉基因的3'側。
  110. 一種在肝細胞中表現轉基因的表現盒，其中所述表現盒包含可操作地連接至啟動子和增強子和3'元件的轉基因，其中所述啟動子包括小鼠甲狀腺素運載蛋白(mTTR)啟動子，並且所述增強子包括一個或兩個經修飾的凝血酶原增強子(pPrT2)、一個或兩個經修飾的α1-微bikunin增強子(mA1MB2)、經修飾的小鼠白蛋白增強子(mEalb)、B型肝炎病毒增強子II(HEII)或CRM8增強子，並且其中所述3'元件是白蛋白3'元件(3'Alb)或連接至人類α 1抗胰蛋白酶支架/基質附著區(SMAR)的白蛋白3'元件(3'AlbSMAR)。
  111. 如請求項110所述的表現盒，其中所述mTTR啟動子是mTTR482啟動子。
  112. 如請求項110或111所述的表現盒，其中所述增強子在所述mTTR啟動子的5'側。
  113. 如請求項110至112中任一項所述的表現盒，其中所述3'元件位於所述轉基因的3'側。
  114. 如請求項104至113中任一項所述的表現盒，其中所述表現盒還包含內含子。
  115. 如請求項114所述的表現盒，其中所述內含子是雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白雜合內含子。
  116. 如請求項104至115中任一項所述的表現盒，其中所述表現盒還包含多腺苷酸化訊息。
  117. 如請求項116所述的表現盒，其中所述多腺苷酸化訊息是牛生長 激素多腺苷酸化訊息。
  118. 如請求項104至117中任一項所述的表現盒，其中所述轉基因編碼PAH多肽或變異體PAH多肽。
  119. 如請求項118所述的表現盒，其中所述變異體PAH多肽是如請求項1至30中任一項所述的變異體PAH多肽。
  120. 一種載體，其包含如請求項104至119中任一項所述的表現盒。
  121. 如請求項120所述的載體，其中所述載體是重組型腺相關病毒(rAAV)載體。
  122. 一種rAAV載體，其包含如請求項104至119中任一項所述的表現盒，所述表現盒的側翼是一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。
  123. 如請求項122所述的rAAV載體，其中如請求項104至119中任一項所述的表現盒的側翼是兩個AAV ITR。
  124. 如請求項122或123所述的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
  125. 如請求項122至124中任一項所述的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
  126. 如請求項122至125中任一項所述的rAAV載體，其中所述載體是自身互補型載體。
  127. 如請求項126所述的rAAV載體，其中所述載體包含編碼所述PAH多肽的第一核酸序列和編碼所述PAH多肽之補體的第二核酸序列，其中所 述第一核酸序列可以與所述第二核酸序列沿著其大部分或全部長度形成鏈內鹼基對。
  128. 如請求項127所述的rAAV載體，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過經突變的AAV ITR連接，其中所述經突變的AAV ITR包含D區的缺失並且包含末端解鏈序列的突變。
  129. 一種rAAV顆粒，其包含如請求項122至127中任一項所述的rAAV載體。
  130. 如請求項128所述的rAAV顆粒，其中所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼。
  131. 如請求項130所述的rAAV顆粒，其中所述AAV病毒顆粒包含經工程化的AAV衣殼。
  132. 如請求項131所述的rAAV顆粒，其中所述經工程化的AAV衣殼是DJ衣殼或LK03衣殼。
  133. 如請求項131或132所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼係來源於相同的AAV血清型。
  134. 如請求項131或132所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼係來源於不同的AAV血清型。
  135. 一種組成物，其包含如請求項129至134中任一項所述的rAAV顆 粒。
  136. 如請求項135所述的組成物，其中所述組成物還包含醫藥上可接受的載劑。
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