TW202403049A - 治療異染性白質失養症之方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用於在肝細胞中表現轉基因的表現匣，其中所述轉基因編碼ARSA多肽。還提供了治療異染性白質失養症(MLD)的方法。本文進一步提供了用於在有需要的個體中表現ARSA多肽的載體(例如，rAAV載體)、病毒顆粒、醫藥組合物和套組。

Description

治療異染性白質失養症之方法
本揭露提供了用於治療有需要的患者的異染性白質失養症(MLD)的方法，所述方法包括向患者的腦脊液(CSF)投予包含編碼芳基硫酸酯酶A( ARSA)的載體的重組腺相關病毒(rAAV)病毒顆粒。
異染性白質失養症(MLD)是由酶芳基硫酸酯酶A(ARSA)突變引起的常染色體隱性神經系統變性障礙。ARSA活性水準降低會導致硫苷脂的毒性累積，其特徵在於中樞神經系統和周圍神經系統中髓鞘形成細胞(少突膠質細胞和施萬細胞)變性。這導致脫髓鞘、功能障礙、神經元變性和神經發炎(星形細胞增生、小神經膠質細胞啟動)。臨床表現主要在神經系統中，導致智力殘疾、情緒和行為問題、運動技能(移動、說話、吞咽)喪失、肌肉功能差和癱瘓、目盲、聽力損失以及癲癇。
目前針對MLD的治療涉及自體造血幹細胞移植(HSCT)，包括同種異體骨髓移植。
在一些態樣，本發明提供了用於治療有需要的患者的異染性白質失養症(MLD)的方法，其包括向所述患者的腦脊液(CSF)投予包含編碼酶芳基硫酸酯酶A(ARSA)(本文也稱為ARSA多肽)的載體的重組腺相關病毒(rAAV)病毒顆粒。在一些實施例中，將所述病毒顆粒經由腦室內(ICV)投予、直接腦大池(dCM)投予或鞘內微導管(IT-CM)直接投予至所述CSF。
本發明至少部分基於rAAV病毒顆粒的開發，其包含 (a) 含有編碼芳基硫酸酯酶A(ARSA)多肽的表現匣的rAAV載體和 (b) 能夠轉導中樞神經系統(CNS)細胞的衣殼。將所述病毒顆粒投予至所述CSF可以在腦中提供ARSA蛋白的高水準表現。在特定的實施例中，所述病毒顆粒的表現匣能夠驅動中樞神經系統和周圍神經系統中的轉基因表現以治療MLD。在一些實施例中，所述表現匣包含SEQ ID NO: 2的ARSA基因。在一些實施例中，所述ARSA基因表現具有SEQ ID NO: 1的ARSA多肽。
在一些態樣，本發明提供了一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其包含rAAV載體，其中所述rAAV載體包含用於在中樞神經系統和周圍神經系統中表現ARSA多肽的表現匣，其中所述表現匣包含與啟動子和任選地增強子可操作地連接的轉基因，其中所述轉基因編碼ARSA多肽，並且其中所述AAV病毒顆粒包含能夠轉導中樞神經系統(CNS)的細胞的衣殼蛋白。在一些實施例中，所述AAV衣殼蛋白是AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 9)。在一些實施例中，所述rAAV的衣殼是經修飾的AAV9衣殼蛋白。在一些實施例中，所述rAAV的衣殼是AAV.rh10衣殼蛋白。在一些實施例中，所述ARSA基因表現具有SEQ ID NO: 1的ARSA多肽。
在一些實施例中，本揭露提供了用於CSF內投予ARSA多肽的rAAV顆粒，其包含含有靶向肽的經修飾的AAV9衣殼蛋白，其將所述rAAV顆粒靶向到腦。此類經修飾的AAV9衣殼描述於國際公開號WO 2021/102234 A1中，將其通過引用以其整體特此併入。在特定實施例中，在AAV9結構蛋白的殘基588後插入所述經修飾的AAV9衣殼的靶向肽。在一些實施例中，所述靶向肽具有SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，所述靶向肽在所述靶向肽的N末端和C末端側接連接子序列。在一些實施例中，N末端側的所述連接子序列具有序列AAA。在一些實施例中，C末端側的所述連接子序列是AS。在一些實施例中，AAV9衣殼結構蛋白的殘基588後插入的全序列具有SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，完整的經修飾的AAV9衣殼結構蛋白(VP1)具有SEQ ID NO: 12。具有SEQ ID NO: 12的衣殼蛋白在本文中被稱為AAV1999。在一些實施例中，所述完整的經修飾的AAV9衣殼結構蛋白與SEQ ID NO: 12至少90%(例如，至少92%、至少95%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%或至少99.8%)相同，其中所述經修飾的AAV9結構衣殼包含SEQ ID NO: 10的靶向肽。
如本文公開的包含經修飾的AAV9衣殼蛋白的rAAV顆粒包含三種結構衣殼蛋白，VP1、VP2和VP3。所述三種衣殼蛋白是選擇性剪接變體。全長VP1蛋白具有SEQ ID NO: 9的序列。VP2蛋白包含SEQ ID NO: 9的胺基酸138至736。VP3蛋白包含SEQ ID NO: 9的胺基酸203至736。在一些實施例中，將所述靶向肽(SEQ ID NO: 10)插入rAAV顆粒中的AAV9 VP3衣殼蛋白中。在一些實施例中，將所述靶向肽(SEQ ID NO: 10)插入rAAV顆粒中的AAV9 VP2衣殼蛋白中。在一些實施例中，將所述靶向肽(SEQ ID NO: 10)插入rAAV顆粒中的AAV9 VP1衣殼蛋白中。在一些實施例中，將所述靶向肽(SEQ ID NO: 10)插入rAAV顆粒內的VP1、VP2和VP3衣殼蛋白中。在一些實施例中，所述經修飾的AAV9衣殼蛋白中的靶向肽在所述靶向肽的N末端和C末端側接連接子序列。在一些實施例中，N末端側的所述連接子序列具有序列AAA。在一些實施例中，C末端側的所述連接子序列是AS。
已經發現，包含含有SEQ ID NO: 10的靶向肽的經修飾的AAV9衣殼蛋白的rAAV顆粒在向受試者的腦投予(例如，CSF內投予)後顯示出非常高水準的轉基因表現。例如，在CSF內投予rAAV顆粒後，與包含能夠轉導CNS的細胞的其他衣殼(例如AAV9和AAV.rh10)的rAAV顆粒相比，包含具有SEQ ID NO: 12的經修飾的VP1衣殼蛋白(和/或具有SEQ ID NO: 13的經修飾的VP2衣殼蛋白和/或具有SEQ ID NO: 14的經修飾的VP2衣殼蛋白)的rAAV顆粒在腦和脊髓中顯示出更高水準的轉基因表現。相反，在CSF內投予包含含有SEQ ID NO: 10的靶向肽的經修飾的AAV9衣殼的rAAV顆粒後，在其他器官(如心臟和肝臟)中表現的轉基因水準顯著更低。此外，相對於包含能夠轉導CNS的細胞的其他衣殼(例如AAV9和AAV.rh10)的rAAV顆粒，可以用更低劑量的包含含有SEQ ID NO: 10的靶向肽的經修飾的AAV9衣殼的rAAV顆粒實現高水準的表現。因此，相對於包含AAV9衣殼或AAV.rh10衣殼的rAAV顆粒，包含含有SEQ ID NO: 10的靶向肽的經修飾的AAV9衣殼蛋白的rAAV顆粒具有改善的治療指數。
因此，在一態樣，本發明提供了用於治療有需要的患者的MLD的方法，所述方法包括向患者的腦脊液(CSF)投予重組腺相關病毒(rAAV)病毒顆粒，所述rAAV病毒顆粒包含 (1) 編碼ARSA多肽的載體和 (2) 經修飾的AAV9衣殼蛋白，其中所述經修飾的rAAV衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 10的靶向肽。在一些實施例中，所述包含SEQ ID NO: 10的經修飾的AAV9衣殼蛋白與具有SEQ ID NO: 12的衣殼蛋白至少90%(例如，至少92%、至少95%、至少98%、至少98,5%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%、或至少99.8%)相同。在一些實施例中，所述衣殼蛋白具有SEQ ID NO: 12。
在上述態樣的一些實施例中，所述rAAV顆粒包含載體，所述載體包含側接一個或多個AAV末端反向重複(ITR)序列的表現匣。在一些實施例中，所述表現匣側接兩個AAV ITR。在一些實施例中，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAV.rh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些實施例中，所述AAV ITR是AAV2 ITR。在一些實施例中，所述載體是自身互補載體。在一些實施例中，所述載體包含編碼ARSA多肽的第一核酸序列和編碼ARSA多肽的補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可以與所述第二核酸序列沿著其大部分或全部長度形成股間鹼基對。在一些實施例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並且包含末端解股序列(terminal resolution sequence)的突變。
在一些態樣，本發明提供了一種包含本文所述的任何rAAV顆粒的組合物。在一些實施例中，所述組合物進一步包含醫藥上可接受的載劑。
在一些態樣，本發明提供了一種包含本文所述的任何rAAV顆粒的細胞。在一些態樣，本發明提供了一種產生ARSA多肽的方法，所述方法包括在產生ARSA多肽的條件下培養如本文所述的細胞。在一些實施例中，所述方法進一步包括純化所述ARSA多肽的步驟。
在一些態樣，本發明提供了用於治療有需要的個體的MLD的方法，所述方法包括向所述個體投予如本文所述的rAAV顆粒。在一些實施例中，本發明提供了用於治療有需要的個體的MLD的方法，所述方法包括向所述個體投予如本文所述的組合物。在一些實施例中，本發明提供了用於治療有需要的個體的MLD的方法，所述方法包括向所述個體投予如本文所述的細胞。在一些實施例中，所述個體缺乏ARSA活性。
在一些實施例中，本發明提供了在有需要的個體中使ARSA活性增加至少約5%的方法，所述方法包括向所述個體投予如本文所述的rAAV顆粒。在其他實施例中，本發明提供了在有需要的個體中使ARSA活性增加至少約10%的方法，所述方法包括向所述個體投予如本文所述的rAAV顆粒。在其他實施例中，本發明提供了在有需要的個體中使ARSA活性增加至少約20%的方法，所述方法包括向所述個體投予如本文所述的rAAV顆粒。在其他實施例中，本發明提供了在有需要的個體中使ARSA活性增加至少約30%的方法，所述方法包括向所述個體投予如本文所述的rAAV顆粒。在其他實施例中，本發明提供了在有需要的個體中使ARSA活性增加至少約50%的方法，所述方法包括向所述個體投予如本文所述的rAAV顆粒。
所述rAAV顆粒的投予可以通過各種途徑進行。在一些實施例中，所述投予包括直接脊髓注射和/或腦內投予。在一些實施例中，所述投予是在選自以下的部位：大腦、髓質、腦橋、小腦、顱內腔、腦周圍的腦膜、硬膜、蛛網膜、軟膜、腦周圍的蛛網膜下腔的腦脊液(CSF)、小腦的小腦深核、大腦的腦室系統、蛛網膜下腔、紋狀體、皮質、隔膜、丘腦、下丘腦和腦實質。在一些實施例中，所述投予包括腦室內注射到至少一個大腦側腦室中。在一些實施例中，所述投予包括在頸椎、胸椎和/或腰椎區域鞘內注射。在一些實施例中，所述投予包括紋狀體內注射。在一些實施例中，所述投予包括丘腦內注射。
在上述態樣的一些實施例中，將所述rAAV顆粒經由直接注射到脊髓中、經由鞘內注射和/或經由腦池內注射來投予。在一些實施例中，將所述rAAV顆粒投予於脊髓或腦大池的多於一個位置。在一些實施例中，將所述rAAV顆粒投予於脊髓的多於一個位置。在一些實施例中，將所述rAAV顆粒投予於脊髓的腰蛛網膜下腔、胸蛛網膜下腔和頸蛛網膜下腔的一處或多處。在一些實施例中，將所述rAAV顆粒投予腦大池。
在上述態樣的一些實施例中，將所述rAAV顆粒向有需要的患者投予僅一次。在一些實施例中，將所述rAAV顆粒向有需要的患者投予多次(例如，在一個月或多個月或者一年或多年內)。在其他實施例中，將所述rAAV顆粒向有需要的患者每年投予一次。在其他實施例中，將所述rAAV顆粒向有需要的患者每年投予兩次。
在一些實施例中，本發明提供了包含如本文所述的rAAV顆粒、組合物或細胞中的任一種的套組。在一些實施例中，所述套組進一步包含使用說明；緩衝液和/或醫藥上可接受的賦形劑；和/或瓶子、小瓶和/或注射器。
相關申請的交叉引用
本申請要求2022年5月16日提交的美國臨時申請號63/342,590和2023年4月14日提交的美國臨時申請號63/459,564的優先權權益，將其中的每一個的內容通過引用以其整體併入。 對電子序列表的引用
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在一些態樣，本發明提供了包含編碼ARSA多肽的轉基因的表現匣、重組腺相關病毒(rAAV)載體和病毒顆粒以及醫藥組合物。在進一步的態樣，本發明提供了用於治療異染性白質失養症(MLD)的方法，例如，通過增加ARSA活性，減少腦、脊髓、肝臟、血漿和CSF中的硫苷脂累積，增加和正常化胼胝體中的髓鞘形成，增加腦中的少突膠質細胞群體，以及由於腦區中的硫苷脂清除引起的改善CNS病理。在又進一步的態樣，本發明提供了用於用本揭露的表現匣治療個體的MLD的套組。 定義
如本文所用的「載體」是指包含有待在體外或在體內遞送至宿主細胞中的核酸的重組質體或病毒。
術語「多肽」和「蛋白質」可互換使用以指代胺基酸殘基的聚合物，並且不限於最小長度。胺基酸殘基的此類聚合物可以含有天然或非天然胺基酸殘基，並且包括但不限於胺基酸殘基的肽、寡肽、二聚體、三聚體和多聚體。所述定義涵蓋了全長蛋白質及其片段兩者。所述術語還包括多肽的表現後修飾，例如醣基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化等。此外，出於本揭露的目的，「多肽」是指包括對天然序列的修飾(如缺失、添加和取代，在本質上通常是保守的)的蛋白質，只要所述蛋白質保持期望的活性即可。這些修飾可能是故意而為的，如通過定點誘變，或者可能是偶然發生的，如通過產生蛋白質的宿主的突變或通過由於PCR擴增而引起的錯誤。
「重組病毒載體」是指包含一個或多個異源序列(即，不是病毒來源的核酸序列)的重組多核苷酸載體。在重組AAV載體的情況下，重組核酸側接至少一個，且在實施例中是兩個末端反向重複序列(ITR)。
「重組AAV載體(rAAV載體)」是指包含一個或多個異源序列(即，不是AAV來源的核酸序列)的多核苷酸載體，所述異源序列側接至少一個(且在實施例中兩個)AAV末端反向重複序列(ITR)。當此類rAAV載體存在於已經感染合適的輔助病毒(或所述輔助病毒表現合適的協助工具)並且正在表現AAV rep和cap基因產物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主細胞中時，所述rAAV載體可以被複製並包裝在感染性病毒顆粒中。當將rAAV載體摻入較大多核苷酸中(例如，在染色體中或在用於選殖或轉染的另一種載體如質體中)時，則rAAV載體可以被稱為「前載體(pro-vector)」，其可以通過在AAV包裝功能和合適協助工具的存在下複製和衣殼化被「挽救」。rAAV載體可以是多種形式中的任何一種，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質複合、包封在脂質體內、和衣殼化於病毒顆粒(特別是AAV顆粒)中。rAAV載體可以被包裝在AAV病毒衣殼中，以產生「重組腺相關病毒顆粒(rAAV顆粒)」。
「異源的」意指源自基因型不同於其所比較或其所引入或摻入的實體的其餘部分的實體。例如，通過基因工程技術引入不同細胞類型中的多核苷酸是異源多核苷酸(並且在表現時可以編碼異源多肽)。類似地，摻入病毒載體中的細胞序列(例如，基因或其部分)是相對於所述載體而言的異源核苷酸序列。
術語「轉基因」是指引入細胞並且能夠轉錄成RNA並且任選地在適當條件下轉譯和/或表現的多核苷酸。在多個態樣，它賦予其中引入它的細胞所希望的特性，或以其他方式導致所希望的治療或診斷結局。
「雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子」是指來源於雞β-肌動蛋白基因(例如，原雞( Gallus)β肌動蛋白，以GenBank Entrez Gene ID 396526表示)的多核苷酸序列。如本文所用，「雞β-肌動蛋白啟動子」可以指含有巨細胞病毒(CMV)早期增強子元件、雞β-肌動蛋白基因的啟動子和第一外顯子和內含子以及兔β-球蛋白基因的剪接受體的啟動子，如Miyazaki, J.等人 (1989) Gene79(2):269-77中所述的序列。如本文所用，術語「CAG啟動子」可以互換使用。如本文所用，術語「CMV早期增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子」可以互換使用。
如關於病毒滴度使用的術語「基因體顆粒(gp)」、「基因體當量」或「基因體拷貝」是指含重組AAV DNA基因體的病毒粒子的數量，與感染性或功能性無關。特定載體製劑中基因體顆粒的數量可以通過諸如本文實例中或例如Clark等人 (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039；Veldwijk等人 (2002) Mol. Ther., 6:272-278中所述的程式來測量。
如本文所用的術語「載體基因體(vg)」可以指包含一組載體(例如，病毒載體)的多核苷酸序列的一種或多種多核苷酸。載體基因體可以衣殼化於病毒顆粒中。根據特定的病毒載體，載體基因體可以包含單股DNA、雙股DNA或單股RNA或雙股RNA。載體基因體可以包含與特定病毒載體相關的內源序列和/或通過重組技術插入特定病毒載體中的任何異源序列。例如，重組AAV載體基因體可以包括側接啟動子的至少一個ITR序列、填充片段(stuffer)、感興趣序列(例如RNAi)和多腺苷酸化序列。完整的載體基因體可以包含載體的全組多核苷酸序列。在一些實施例中，病毒載體的核酸滴度可以按vg/mL測量。適用於測量此滴度的方法是本領域中已知的(例如，定量PCR)。
如關於病毒滴度使用的術語「感染單位(iu)」、「感染性顆粒」或「複製單位」是指感染性和複製型重組AAV載體顆粒的數量，如通過感染中心測定(也稱為複製中心測定)測量的，如例如McLaughlin等人 (1988) J. Virol., 62:1963-1973中所述。
如關於病毒滴度使用的術語「轉導單位(tu)」是指導致產生功能轉基因產物的感染性重組AAV載體顆粒的數量，如在功能測定中測量的，如本文實例中或例如Xiao等人 (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124中；或Fisher等人 (1996) J. Virol., 70:520-532(LFU測定)中所述。
「末端反向重複」或「ITR」序列是本領域中熟知的術語，並且是指在病毒基因體末端處發現的處於相反方向的相對較短的序列。
本領域中熟知的術語「AAV末端反向重複(ITR)」序列是存在於天然單股AAV基因體的兩個末端處的大約145個核苷酸的序列。ITR的最外側125個核苷酸可以以兩個交替方向中的任一個存在，導致不同AAV基因體之間以及單個AAV基因體的兩端之間的異質性。最外側的125個核苷酸也含有幾個自身互補的較短區域(指定為A、A'、B、B'、C、C'和D區)，允許在ITR的這個部分內發生股間鹼基配對。
「末端解股序列」或「trs」是AAV ITR的D區中在病毒DNA複製期間被AAV rep蛋白切割的序列。突變體末端解股序列難以被AAV rep蛋白切割。
「AAV協助工具」是指允許AAV被宿主細胞複製和包裝的功能。AAV協助工具可以按多種形式中的任一種提供，所述形式包括但不限於幫助AAV複製和包裝的輔助病毒或輔助病毒基因。其他AAV協助工具是本領域中已知的，如基因毒性劑。
AAV的「輔助病毒」是指允許AAV(其是缺陷型細小病毒)被宿主細胞複製和包裝的病毒。輔助病毒提供允許AAV複製的「協助工具」。已經鑒定了多種此類輔助病毒，包括腺病毒、皰疹病毒和痘病毒，如牛痘和桿狀病毒。腺病毒涵蓋多種不同子群，但子群C的5型腺病毒(Ad5)是最常用的。人、非人哺乳動物和鳥類來源的許多腺病毒是已知的，並且可從諸如ATCC的保藏機構獲得。也可從如ATCC等保藏機構獲得的皰疹家族病毒包括例如單純皰疹病毒(HSV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV)。用於複製AAV的腺病毒協助工具的例子包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4orf6功能。可從保藏機構獲得的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾( Autographa californica)核型多角體病毒。
如果感染性AAV顆粒與感染性輔助病毒顆粒的比率是至少約10 2: 1；至少約10 4: 1、至少約10 6: 1；或至少約10 8: 1或更多，則稱rAAV的製劑「基本上不含」輔助病毒。在一些實施例中，製劑也不含等效量的輔助病毒蛋白(即，如果上述輔助病毒顆粒雜質以受破壞形式存在，將由於這一水準的輔助病毒而存在蛋白質)。病毒和/或細胞蛋白污染通常可以在SDS凝膠上作為考馬斯染色條帶的存在而被觀察到(例如，出現不同於對應於AAV衣殼蛋白VPl、VP2和VP3的那些條帶的條帶)。
「有效量」是足以產生有益或期望結果的量，所述結果包括臨床結果(例如，症狀的改善、臨床終點的實現等)。有效量可以以一次或多次投予來投予。就疾病狀態而言，有效量是足以改善、穩定疾病或延遲疾病發展的量。
「個體」或「受試者」是哺乳動物。哺乳動物包括但不限於家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物(例如人和非人靈長類動物如猴)、兔和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)。在某些實施例中，個體或受試者是人。
如本文所用，「治療」是用於獲得有益的或期望的臨床結果的途徑。出於本揭露的目的，有益或期望的臨床結果包括但不限於以下：緩解症狀、減小疾病的程度、穩定疾病狀態(例如不惡化)、防止疾病擴散(例如，轉移)、延遲或減緩疾病進展、改善或緩和疾病狀態、以及緩解(無論是部分或是全部)，無論是可檢測的還是不可檢測的。「治療」還可以意指與如果沒有接受治療的預期的存活期相比，延長存活期。
如本文所用，術語「預防性治療」是指這樣的治療，其中已知或懷疑個體患有障礙或具有患上障礙的風險，但尚未展示出所述障礙的症狀或展示出所述障礙的微小症狀。可以在症狀發作之前治療經歷預防性治療的個體。
本文提及「約」某一值或參數時包括(並描述)涉及該值或參數本身的實施例。例如，提及「約X」的描述包括「X」的描述。
除非另外指示，否則如本文所用，冠詞的單數形式「一個/一種(a)」、「一種/一種(an)」和「所述(the)」包括複數指示物。
應理解，本文所述的公開文本的態樣和實施例包括「包含」態樣和實施例、「由態樣和實施例組成」和/或「基本上由態樣和實施例組成」。 表現匣
在一些實施例中，編碼ARSA多肽的轉基因經過密碼子優化。在一些實施例中，編碼ARSA多肽的轉基因針對在特定細胞(如真核細胞)中表現進行了密碼子優化。真核細胞可以是特定生物的那些或源自於特定生物，所述生物如哺乳動物，包括但不限於人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人靈長類動物。通常，密碼子優化是指通過用更頻繁或最常用於所述宿主細胞的基因中的密碼子替代天然序列的至少一個密碼子來修飾核酸序列以增強在感興趣宿主細胞中的表現，同時保持天然胺基酸序列的過程。各種物種表現出對特定胺基酸的某些密碼子的特別偏好。密碼子使用表很容易獲得，例如在「密碼子使用資料庫」中，並且這些表可以以多種方式修改(例如參見，Nakamura, Y.等人 (2000) Nucleic Acids Res.28:292)。還可獲得用於針對在特定宿主細胞中的表現對特定序列進行密碼子優化的電腦演算法，如Gene Forge(Aptagen；雅各斯區(Jacobus)，賓夕法尼亞州)、DNA2.0、GeneArt(GA)或Genscript(GS)以及與CpG含量的降低相結合的GS演算法。在一些實施例中，編碼ARSA多肽的轉基因使用GA演算法進行密碼子優化。在一些實施例中，編碼ARSA多肽的轉基因具有SEQ ID NO: 1的序列。
在一些實施例中，表現匣進一步包含內含子。用於本發明的各種內含子是本領域技術人員已知的，並且包括MVM內含子、F IX截短內含子1、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈SA、腺病毒SD/免疫球蛋白SA、SV40晚期SD/SA(19S/16S)和雜合腺病毒SD/IgG SA。(Wu等人2008, Kurachi等人, 1995，Choi等人2014，Wong等人, 1985，Yew等人 1997，Huang和Gorman (1990))。在一些實施例中，內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。在一些實施例中，內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合啟動子和內含子，其中去除所有ATG位點以最小化錯誤轉譯起始位點。在一些實施例中，內含子是MVM內含子、F IX截短內含子1、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈SA、腺病毒SD/免疫球蛋白SA、SV40晚期SD/SA(19S/16S)或雜合腺病毒SD/IgG SA。在一些實施例中，內含子是雞β-肌動蛋白(CBA)/兔β-球蛋白雜合內含子。
在一些實施例中，表現匣進一步包含多腺苷酸化訊號。在一些實施例中，多腺苷酸化訊號是牛生長激素多腺苷酸化訊號、SV40多腺苷酸化訊號或HSV TK pA。在一些實施例中，多腺苷酸化訊號是合成的多腺苷酸化訊號，如Levitt, N等人 (1989), Genes Develop. 3:1019-1025中所述。
在一些實施例中，表現匣包含填充核酸。在一些實施例中，填充核酸可以包含編碼報告多肽的序列。如本領域技術人員將理解的，填充核酸可以位於核酸內的多個區域中，並且可以由核酸內的連續序列(例如，在單個位置中的單個填充核酸)或多個序列(例如，在超過一個位置(例如2個位置、3個位置等)中的超過一個填充核酸)構成。在一些實施例中，填充核酸可以位於編碼ARSA多肽的轉基因的下游。在實施例中，填充核酸可以位於編碼ARSA多肽的轉基因的上游(例如，在啟動子與轉基因之間)。如本領域技術人員還將理解的，可以使用各種核酸作為填充核酸。在一些實施例中，填充核酸包含人α-1-抗胰蛋白酶(AAT)填充序列或C16 P1染色體16 P1殖株(人類C16)填充序列的全部或一部分。在一些實施例中，填充序列包含基因的全部或一部分。例如，填充序列包含人類AAT序列的一部分。本領域技術人員將理解，基因(例如人類AAT序列)的不同部分可以用作填充片段。例如，填充片段可以來自基因的5'端、基因的3'端、基因的中間部分、基因的非編碼部分(例如內含子)、基因的編碼區(例如外顯子)、或基因的非編碼部分和編碼部分的混合物。本領域技術人員還將理解，填充序列的全部或一部分可以用作填充序列。在一些實施例中，修飾填充序列以去除內部ATG密碼子。
在一些實施例中，表現匣被摻入載體中。在一些實施例中，表現匣被摻入病毒載體中。在一些實施例中，所述病毒載體是如本文所述的rAAV載體。 載體和病毒顆粒
在某些態樣，用於表現ARSA多肽(例如，野生型人類ARSA多肽)的表現匣被包含在載體中。在一些實施例中，本發明設想使用重組病毒基因體來引入編碼ARSA多肽的核酸序列，以包裝至病毒顆粒(例如下文描述的病毒顆粒)中。重組病毒基因體可以包括任何元件來建立ARSA多肽的表現，例如啟動子、ITR、核糖體結合元件、終止子、增強子、選擇標記、內含子、多聚A訊號和/或複製起點。下文更詳細地描述用於病毒顆粒的例示性病毒基因體元件和遞送方法。 非病毒遞送系統
常規的非病毒基因轉移方法也可以用於將核酸引入細胞或靶組織。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、裸露核酸和與遞送系統複合的核酸。例如，所述載體可以與脂質(例如陽離子或中性脂質)、脂質體、聚陽離子、奈米顆粒、或增強核酸細胞攝取的試劑複合。所述載體可以與適用於本文所述任何遞送方法的試劑複合。在一些實施例中，所述核酸包含一個或多個病毒ITR(例如AAV ITR)。 病毒顆粒
在一些實施例中，包含用於表現ARSA多肽(例如，野生型人類ARSA多肽)的表現匣的載體是重組病毒載體。重組病毒載體的一些例子包括AAV、慢病毒和腺病毒。在一態樣，病毒載體是重組腺相關病毒(rAAV)載體。在一些實施例中，用於表現ARSA多肽(例如，野生型人類ARSA多肽)的表現匣側接一個或多個AAV末端反向重複序列(ITR)序列。在一些實施例中，病毒顆粒是包含用於表現ARSA多肽的表現匣的重組AAV顆粒，所述表現匣側接一個或兩個ITR。在一些實施例中，用於表現ARSA多肽的表現匣側接兩個AAV ITR。
在一些實施例中，用於表現本揭露的ARSA多肽的表現匣可操作地連接在轉錄方向上的組分、控制序列(包括轉錄起始序列和終止序列)，從而形成表現匣。表現匣在5'端和3'端側接至少一個功能AAV ITR序列。「功能性AAV ITR序列」意指旨在用於挽救、複製和包裝AAV病毒粒子的ITR序列功能。參見Davidson等人, PNAS, 2000, 97(7)3428-32；Passini等人, J. Virol., 2003, 77(12):7034-40；和Pechan等人, Gene Ther., 2009, 16:10-16，將其全部通過引用以其整體併入本文。為了實施本發明的一些態樣，重組載體至少包含衣殼化所必需的所有AAV序列和用於rAAV感染的物理結構。用於本發明載體的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801中所述)，並且可以通過核苷酸的插入、缺失或取代而改變，或者AAV ITR可以源自幾種AAV血清型中的任一種。目前已知超過40種AAV血清型，並且仍在鑒定出新的血清型和現有血清型的變體。參見Gao等人, PNAS, 2002, 99(18): 11854-6；Gao等人, PNAS, 2003, 100(10):6081-6；和Bossis等人, J. Virol., 2003, 77(12):6799-810。
任何AAV血清型的使用都被視為在本發明的範圍內。在一些實施例中，rAAV載體是源自AAV血清型的載體，包括但不限於，AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAV.rh10、AAV11、AAV12、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV ITR等。在一些實施例中，AAV中的核酸包含AAV ITR的ITR，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV等。在某些實施例中，AAV ITR是AAV2 ITR。
在一些實施例中，載體可以包括填充核酸。在一些實施例中，填充核酸可以編碼綠色螢光蛋白(GFP)。在一些實施例中，填充核酸可以位於表現本揭露的ARSA多肽的表現匣的3'側。
在一些態樣，本發明提供了包含重組自身互補基因體的病毒顆粒。在一些實施例中，載體是自身互補載體。具有自身互補基因體的AAV病毒顆粒和使用自身互補的AAV基因體的方法描述在以下文獻中：美國專利號6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；和Wang Z.,等人, (2003) Gene Ther10:2105-2111，將其各自通過引用以其整體併入本文。包含自身互補基因體的rAAV將借助其部分互補的序列(例如，轉基因的互補編碼股和非編碼股)迅速形成雙股DNA分子。在一些實施例中，本發明提供了一種包含AAV基因體的AAV病毒顆粒，其中所述rAAV基因體包含第一異源多核苷酸序列(例如，本發明的ARSA多肽的編碼股)和第二異源多核苷酸序列(例如，本揭露的ARSA多肽的非編碼股或反義股)，其中所述第一異源多核苷酸序列可以與所述第二多核苷酸序列沿著其大部分或全部長度形成股間鹼基對。
在一些實施例中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列通過促進股間鹼基配對的序列連接；例如髮夾DNA結構。髮夾結構在本領域中是已知的，例如在siRNA分子中。在一些實施例中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列通過突變ITR(例如，右ITR)連接。突變的ITR包含含有末端解股序列的D區的缺失。因此，在複製AAV病毒基因體時，rep蛋白將不會在突變的ITR處切割病毒基因體，並且因此，以5'至3'順序包含以下的重組病毒基因體將被包裝在病毒衣殼中：AAV ITR、包括調節序列的第一異源多核苷酸序列、突變的AAV ITR、與第一異源多核苷酸反向的第二異源多核苷酸和第三AAV ITR。
在一些實施例中，第一異源核酸序列和第二異源核酸序列通過突變的ITR(例如，右ITR)連接。在一些實施例中，ITR包含多核苷酸序列5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3'(SEQ ID NO:15)。突變的ITR包含含有末端解股序列的D區的缺失。因此，在複製AAV病毒基因體時，rep蛋白將不會在突變的ITR處切割病毒基因體，並且因此，以5'至3'順序包含以下的重組病毒基因體將被包裝在病毒衣殼中：AAV ITR、包括調節序列的第一異源多核苷酸序列、突變的AAV ITR、與第一異源多核苷酸反向的第二異源多核苷酸和第三AAV ITR。
在一些實施例中，載體被衣殼化在病毒顆粒中。在一些實施例中，病毒顆粒是包含重組AAV載體的重組AAV病毒顆粒。使用不同的AAV血清型優化特定靶細胞的轉導或靶向特定靶組織(例如，腦或脊髓)內的特定細胞類型。rAAV顆粒可以包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，在一些實施例中，rAAV顆粒可包含經修飾的AAV1999衣殼蛋白和至少一種AAV2 ITR，或其可包含經修飾的AAV1999衣殼蛋白和至少一種AAV1 ITR。本文提供了用於產生rAAV顆粒的AAV血清型的任何組合，如同每個組合都已在本文中明確說明一樣。
已知AAV(例如AAV9、AAV1999等)的衣殼包括三種衣殼蛋白：VP1、VP2和VP3。這些蛋白質含有大量重疊的胺基酸序列和獨特的N-末端序列。AAV9衣殼包括按二十面體對稱排列的60個亞基。AAV9包括VP1、VP2和VP3衣殼蛋白，比率為約5 : 5 : 50。AAV9的VP蛋白是基因體中編碼結構蛋白的開放閱讀框(命名為 cap)的產物，即VP1(約82 kDa)和VP2(約73 kDa)(它們是次要的衣殼蛋白)以及VP3(約61 kDa)(主要的衣殼蛋白)。由於使用了選擇性剪接和滲漏掃描(leaky scanning)兩者，因此當表現時，單獨的VP共用涵蓋整個VP3的C末端，而VP1和VP2是N末端VP3的延伸。VP1和VP2共用約73個胺基酸的區域，所述區域在VP1中延伸了另外的約137個胺基酸，命名為VP1唯一區域(VP1u)。參見Penzes等人, (2021), Journal of Virology 95(19)e0084321。在本文公開的經修飾的AAV9衣殼蛋白的一些實施例中，將靶向肽(例如SEQ ID NO: 10)摻入VP1中。在本文公開的經修飾的AAV9衣殼蛋白的一些實施例中，將靶向肽(例如SEQ ID NO: 10)摻入VP2中。在本文公開的經修飾的AAV9衣殼蛋白的一些實施例中，將靶向肽(例如SEQ ID NO: 10)摻入VP3中。在本文公開的經修飾的AAV9衣殼蛋白的一些實施例中，將靶向肽(例如SEQ ID NO: 10)摻入到VP1、VP2和VP3中。
在一些實施例中，本發明提供了用於CSF內投予ARSA多肽的rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含含有靶向肽的經修飾的AAV9衣殼蛋白，所述靶向肽將所述rAAV顆粒靶向到腦。在特定實施例中，在AAV9結構蛋白的殘基588後插入所述經修飾的AAV9衣殼的靶向肽。在一些實施例中，所述靶向肽具有SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，所述靶向肽在所述靶向肽的N末端和C末端側接連接子序列。在一些實施例中，N末端側的所述連接子序列具有序列AAA。在一些實施例中，C末端側的所述連接子序列是AS。在一些實施例中，AAV9衣殼結構蛋白的殘基588後插入的全序列具有SEQ ID NO: 11。
在一些實施例中，完整的經修飾的AAV9衣殼結構蛋白(VP1)具有SEQ ID NO: 12的序列。在一些實施例中，完整的經修飾的AAV9衣殼結構蛋白(VP1)與SEQ ID NO: 12至少90%(例如至少92%、至少95%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%或至少99.8%)相同，其中所述經修飾的AAV9結構衣殼包含SEQ ID NO: 10的靶向肽。
在一些實施例中，AAV9衣殼的經修飾的VP2衣殼具有SEQ ID NO: 13的序列。在一些實施例中，AAV9的經修飾的VP2衣殼具有與SEQ ID NO: 13至少90%(例如至少92%、至少95%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%或至少99.8%)相同的序列，其中所述經修飾的AAV9結構衣殼包含SEQ ID NO: 10的靶向肽。
在一些實施例中，AAV9衣殼的經修飾的VP3衣殼具有SEQ ID NO: 14的序列。在一些實施例中，AAV9的經修飾的VP3衣殼與SEQ ID NO: 14至少90%(例如至少92%、至少95%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.5%或至少99.8%)相同，其中所述經修飾的AAV9結構衣殼包含SEQ ID NO: 10的靶向肽。 AAV 顆粒的產生
在本領域中已知許多方法用於產生rAAV載體，包括轉染、穩定細胞株產生和感染性雜合病毒產生系統，所述系統包括腺病毒-AAV雜合體、皰疹病毒-AAV雜合體(Conway, JE等人, (1997) J. Virology71(11):8780-8789)和桿狀病毒-AAV雜合體(Urabe, M.等人, (2002) Human Gene Therapy13(16):1935-1943；Kotin, R. (2011) Hum Mol Genet.20(R1): R2-R6)。用於產生rAAV病毒顆粒的rAAV生產培養物都需要：1) 合適的宿主細胞；2) 合適的輔助病毒功能；3) AAV rep和cap基因和基因產物；4) 側接至少一個AAV ITR序列(例如，編碼ARSA多肽的AAV基因體)的核酸(如治療性核酸)；以及5) 支持rAAV產生的合適的培養基和培養基組分。在一些實施例中，合適的宿主細胞是靈長類動物宿主細胞。在一些實施例中，合適的宿主細胞是人源細胞株，如HeLa、A549、293或Perc.6細胞。在一些實施例中，合適的輔助病毒功能由野生型或突變體腺病毒(如溫度敏感性腺病毒)、皰疹病毒(HSV)、桿狀病毒或提供協助工具的質體構築體提供。在一些實施例中，AAV rep和cap基因產物可以來自任何AAV血清型。通常但不是必須的，AAV rep基因產物與rAAV載體基因體的ITR具有相同血清型，只要rep基因產物可以發揮複製和包裝rAAV基因體的作用即可。本領域中已知的合適的培養基可以用於產生rAAV載體。這些培養基包括但不限於Hyclone Laboratories和JRH生產的培養基，包括改良伊格爾培養基(MEM)；杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)；定制配製品，如美國專利號6,566,118描述的那些；以及如美國專利號6,723,551中描述的Sf-900 II SFM培養基，所述專利通過引用以其整體併入本文，特別是關於用於產生重組AAV載體的定制培養基配製品。在一些實施例中，AAV協助工具由腺病毒或HSV提供。在一些實施例中，AAV協助工具由桿狀病毒提供，並且宿主細胞是昆蟲細胞(例如，草地貪夜蛾( Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞)。
用於產生rAAV顆粒的一種方法是三重轉染方法。簡言之，可以將含rep基因和衣殼基因的質體連同輔助腺病毒質體一起轉染(例如利用磷酸鈣法)到細胞株(例如，HEK-293細胞)中，並可以收集並任選地純化病毒。因此，在一些實施例中，通過將編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸以及編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染到宿主細胞中來產生rAAV顆粒，其中將所述核酸轉染到所述宿主細胞生成能夠產生rAAV顆粒的宿主細胞。
在一些實施例中，rAAV顆粒可以通過生產細胞株方法產生(參見Martin等人, (2013) Human Gene Therapy Methods24:253-269；美國專利授予前公開號US2004/0224411；和Liu, X.L.等人 (1999) Gene Ther.6:293-299)。簡言之，可以用含有rep基因、衣殼基因和包含啟動子-異源核酸序列(例如，ARSA多肽)的載體基因體的質體穩定地轉染細胞株(例如，HeLa、293、A549或Perc.6細胞株)。可以篩選細胞株，以選擇用於rAAV產生的主要殖株(lead clone)，然後可以將其擴增至生產生物反應器，並且用輔助病毒(例如，腺病毒或HSV)感染，以啟動rAAV產生。隨後可以收穫病毒，可以使腺病毒失活(例如，通過加熱)和/或去除腺病毒，並且可以純化rAAV顆粒。因此，在一些實施例中，通過生產細胞株產生rAAV顆粒，所述生產細胞株包含編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸以及編碼AAV輔助病毒功能的核酸中的一種或多種。如本文所述，與三重轉染方法相比，所述生產細胞株方法對於產生具有過大基因體的rAAV顆粒而言可能是有利的。
在一些實施例中，編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因體的核酸穩定地維持在生產細胞株中。在一些實施例中，將編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因體的核酸在一個或多個質體上引入細胞株中以產生生產細胞株。在一些實施例中，將AAV rep、AAV cap和rAAV基因體在同一質體上引入細胞中。在其他實施例中，將AAV rep、AAV cap和rAAV基因體在不同質體上引入細胞中。在一些實施例中，用質體穩定地轉染的細胞株在所述細胞株的多次傳代(例如，5、10、20、30、40、50或超過50次細胞傳代)中維持所述質體。例如，所述一個或多個質體可以隨著細胞複製而複製，或者所述一個或多個質體可以整合到細胞基因體中。已經鑒定了使質體能夠在細胞(例如，人類細胞)中自主複製的多種序列(參見例如，Krysan, P.J.等人 (1989) Mol. Cell Biol.9:1026-1033)。在一些實施例中，所述一個或多個質體可以含有允許選擇維持所述質體的細胞的選擇標記(例如，抗生素抗性標記)。通常用於哺乳動物細胞的選擇標記包括但不限於殺稻瘟素、G418、潮黴素B、博萊黴素、嘌呤黴素及其衍生物。用於將核酸引入細胞中的方法在本領域中是已知的，並且包括但不限於病毒轉導、陽離子轉染(例如，使用陽離子聚合物如DEAE-葡聚糖或陽離子脂質如lipofectamine)、磷酸鈣轉染、顯微注射、粒子轟擊、電穿孔和奈米顆粒轉染(關於更多細節，參見例如，Kim, T.K.和Eberwine, J.H. (2010) Anal. Bioanal. Chem.397:3173-3178)。
在一些實施例中，編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因體的核酸穩定地整合到生產細胞株的基因體中。在一些實施例中，將編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因體的核酸在一個或多個質體上引入細胞株中以產生生產細胞株。在一些實施例中，將AAV rep、AAV cap和rAAV基因體在同一質體上引入細胞中。在其他實施例中，將AAV rep、AAV cap和rAAV基因體在不同質體上引入細胞中。在一些實施例中，所述一個或多個質體可以含有允許選擇維持所述質體的細胞的選擇標記(例如，抗生素抗性標記)。用於將核酸穩定地整合到多種宿主細胞株中的方法在本領域中是已知的。例如，重複選擇(例如，通過使用選擇標記)可以用於選擇已整合含有選擇標記(和AAV cap和rep基因和/或rAAV基因體)的核酸的細胞。在其他實施例中，可以將核酸以位點特異性方式整合到細胞株中以產生生產細胞株。幾種位點特異性重組系統是本領域已知的，如FLP/FRT(參見例如，O'Gorman, S.等人 (1991) Science251:1351-1355)、Cre/loxP(參見例如，Sauer, B.和Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5166-5170)以及phi C31-att(參見例如，Groth, A.C.等人 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5995-6000)。
在一些實施例中，生產細胞株源自靈長類動物細胞株(例如，非人靈長類動物細胞株，如Vero或FRhL-2細胞株)。在一些實施例中，細胞株源自人類細胞株。在一些實施例中，生產細胞株源自HeLa、293、A549或PERC.6®(Crucell)細胞。例如，在將編碼AAV rep和cap基因和/或過大的rAAV基因體的核酸引入和/或穩定維持/整合到細胞株中以產生生產細胞株之前，所述細胞株是HeLa、293、A549或PERC.6®(Crucell)細胞株或其衍生物。
在一些實施例中，生產細胞株適於在懸浮液中生長。如在本領域中已知的，錨定依賴性細胞通常不能在沒有基質(如微載劑珠)的情況下在懸浮液中生長。使細胞株適於在懸浮液中生長可以包括例如使用缺少鈣和鎂離子的培養基以防止結塊(和任選地消泡劑)，使用用滲矽化合物塗布的培養容器，使細胞株在具有攪拌槳的旋動培養中生長，並且在每次傳代時選擇培養物中(而不是在大塊中或在容器的側面上)的細胞。關於進一步的描述，參見例如，ATCC常見問題文件(可在www.atcc.org/Global/FAQs/9/1/Adapting%20a%20monolayer%20cell%20line%20to%20suspension-40.aspx處獲得)和其中引用的參考文獻。
在一些態樣，提供了用於產生本文公開的任何rAAV顆粒的方法，所述方法包括 (a) 在產生rAAV顆粒的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含 (i) 一種或多種AAV包裝基因，其中每種所述AAV包裝基因編碼AAV複製蛋白和/或衣殼化蛋白；(ii) rAAV前載體，其包含側接至少一個AAV ITR的編碼如本文所述的異源核酸的核酸，和 (iii) AAV協助工具；和 (b) 回收所述宿主細胞產生的所述rAAV顆粒。在一些實施例中，所述至少一個AAV ITR選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR等。例如，在一些實施例中，AAV血清型是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10或AAVrh10。在某些實施例中，AAV中的核酸包含AAV2 ITR。在一些實施例中，所述衣殼化蛋白選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV1999、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合體、牛AAV、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1血清型、AAV-XL32或AAV-XL32.1衣殼蛋白或其突變體。在一些實施例中，所述衣殼化蛋白是AAV8衣殼蛋白。在一些實施例中，rAAV顆粒包含AAV9衣殼和含有AAV2 ITR的重組基因體，以及編碼治療性轉基因/核酸的核酸(例如，用於表現ARSA多肽的表現匣)。在一些實施例中，rAAV顆粒包含AAV1999衣殼和含有AAV2 ITR的重組基因體，以及編碼治療性轉基因/核酸的核酸(例如，用於表現ARSA多肽的表現匣)。
本發明的合適的rAAV生產培養基可以補充有0.5%-20%(v/v或w/v)水準的血清或血清來源的重組蛋白。可替代地，如在本領域中已知的，rAAV載體可以在無血清條件下產生，所述無血清條件也可以稱為不含動物源產品的培養基。本領域普通技術人員可以理解，設計用於支持rAAV載體生產的商業培養基或定制培養基還可以補充有本領域中已知的一種或多種細胞培養組分，包括但不限於葡萄糖、維生素、胺基酸和/或生長因子，以便增加生產培養物中rAAV的滴度。
rAAV生產培養物可以在適用於所使用的特定宿主細胞的多種條件(寬溫度範圍、不同時間長度等)下生長。如本領域已知的，rAAV生產培養物包括附著依賴性培養物，其可以在合適的附著依賴性容器中培養，例如像，滾瓶、中空纖維過濾器、微載劑和填充床或流化床生物反應器。rAAV載體生產培養物還可以包括適應懸浮的宿主細胞，如HeLa、293和SF-9細胞，其可以以多種方式培養，包括例如旋轉燒瓶、攪拌罐生物反應器和一次性系統，如Wave袋系統。
本發明的rAAV載體顆粒可以通過裂解生產培養物的宿主細胞或通過從生產培養物中收穫用過的培養基而從rAAV生產培養物中收穫，條件是細胞在本領域中已知的引起rAAV顆粒從完整細胞釋放到培養基中的條件下培養，如美國專利號6,566,118中更全面地描述的。裂解細胞的合適方法也是本領域中已知的，並且包括例如多次冷凍/解凍循環、超聲處理、微流化和用化學品(諸如洗滌劑和/或蛋白酶)處理。
在進一步的實施例中，將rAAV顆粒純化。如本文所用的術語「純化的」包括rAAV顆粒的製劑，其缺少至少一些也可存在於rAAV顆粒天然存在或最初所製備的地方的其他組分。因此，例如，分離的rAAV顆粒可以使用純化技術使其從源混合物(諸如培養裂解物或生產培養上清液)富集而製備。能以多種方式測量富集情況，例如像根據溶液中存在的DNA酶抗性顆粒(DRP)或基因體拷貝(gc)的比例、或根據感染性，或者可以根據源混合物中存在的第二潛在干擾物質(如污染物，包括生產培養污染物或進程內污染物，包括輔助病毒、培養基組分等)來測量。
在一些實施例中，將rAAV生產培養收穫物澄清以除去宿主細胞碎片。在一些實施例中，通過經由一系列深度過濾器過濾來澄清生產培養收穫物，所述深度過濾器包括例如DOHC級Millipore Millistak+ HC Pod過濾器、A1HC級Millipore Millistak+ HC Pod過濾器和0.2 µm Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC親水膜過濾器。澄清也可以通過本領域中已知的多種其他標準技術來實現，如離心或通過本領域中已知的0.2 µm或更大孔徑的任何醋酸纖維素過濾器過濾。
在一些實施例中，用Benzonase®進一步處理rAAV生產培養收穫物以消化生產培養物中存在的任何高分子量DNA。在一些實施例中，Benzonase®消化在本領域中已知的標準條件下進行，所述標準條件包括例如1-2.5單位/ml的Benzonase®的終濃度，在範圍從環境溫度至37ºC的溫度下持續30分鐘至幾小時的時間段。
可以使用以下一個或多個純化步驟分離或純化rAAV顆粒：平衡離心；流過式陰離子交換過濾；用於濃縮rAAV顆粒的切向流過濾(TFF)；通過磷灰石層析捕獲rAAV；輔助病毒的熱滅活；通過疏水相互作用層析捕獲rAAV；通過尺寸排阻層析(SEC)進行緩衝液交換；奈米過濾；以及通過陰離子交換層析、陽離子交換層析或親和層析捕獲rAAV。這些步驟可以單獨使用，以各種組合使用，或者以不同順序使用。在一些實施例中，所述方法以如下所述的順序包括所有步驟。純化rAAV顆粒的方法見於例如以下文獻中：Xiao等人, (1998) Journal of Virology 72:2224-2232；美國專利號6,989,264和8,137,948；以及WO 2010/148143。 治療方法
本揭露的某些態樣涉及在有需要的個體中治療MLD和/或增加ARSA多肽水準的方法。在一些實施例中，本發明提供了通過投予有效量的表現本揭露的ARSA多肽的表現匣(例如，在rAAV顆粒中遞送的表現匣)來治療MLD的方法。在一些實施例中，所述ARSA多肽是野生型ARSA多肽。用於表現ARSA多肽的表現匣(例如，在rAAV顆粒中遞送的表現匣)可以通過各種途徑投予。在一些實施例中，所述投予包括直接脊髓注射和/或腦內投予。在一些實施例中，所述投予是在選自以下的部位：大腦、髓質、腦橋、小腦、顱內腔、腦周圍的腦膜、硬膜、蛛網膜、軟膜、腦周圍的蛛網膜下腔的腦脊液(CSF)、小腦的小腦深核、大腦的腦室系統、蛛網膜下腔、紋狀體、皮質、隔膜、丘腦、下丘腦和腦實質。在一些實施例中，所述投予包括腦室內注射到至少一個大腦側腦室中。在一些實施例中，所述投予包括在頸椎、胸椎和/或腰椎區域鞘內注射。在一些實施例中，所述投予包括紋狀體內注射。在一些實施例中，所述投予包括丘腦內注射。
根據治療目標，投予有效量的rAAV(在一些實施例中呈顆粒形式)。例如，在低百分比的轉導可以實現所希望的治療效果的情況下，則治療的目標通常是達到或超過此轉導水準。在一些情況下，這種轉導水準可以通過轉導僅約1%至5%的所期望組織類型的靶細胞，在一些實施例中至少約20%的所期望組織類型的細胞，在一些實施例中至少約50%，在一些實施例中至少約80%，在一些實施例中至少約95%，在一些實施例中至少約99%的所期望組織類型的細胞來實現。rAAV組合物可以通過在同一程式期間或者間隔數天、數週、數月或數年的一次或多次投予來投予。可以使用本文所述的任何投予途徑中的一種或多種。在一些實施例中，可以使用多種載體來治療人。
在上述態樣的一些實施例中，將rAAV經由直接注射到脊髓中、經由鞘內注射、或經由腦池內注射來投予。在一些實施例中，將rAAV投予於脊髓或腦大池的多於一個位置。在一些實施例中，將rAAV投予於脊髓的多於一個位置。在一些實施例中，將rAAV投予於脊髓的腰蛛網膜下腔、胸蛛網膜下腔和頸蛛網膜下腔的一處或多處。在一些實施例中，將rAAV投予腦大池。
鑒定由AAV病毒顆粒轉導的細胞的方法是本領域已知的；例如，免疫組織化學或使用標記如增強型綠色螢光蛋白可以用於檢測病毒顆粒的轉導；例如包含具有一個或多個胺基酸取代的rAAV衣殼的病毒顆粒。
在一些實施例中，同時或依序地將有效量的rAAV顆粒投予於多於一個位置。在其他實施例中，多於一次(例如重複)地將有效量的rAAV顆粒投予於單個位置。在一些實施例中，rAAV病毒顆粒的多次注射間隔不超過一小時、兩小時、三小時、四小時、五小時、六小時、九小時、十二小時或24小時。
在一些實施例中，本發明提供了一種用於通過投予有效量的包含編碼本揭露的ARSA多肽的重組病毒載體的醫藥組合物來治療患有MLD的人的方法。在一些實施例中，所述醫藥組合物包含一種或多種醫藥上可接受的賦形劑。
在一些實施例中，所述方法包括投予有效量的包含編碼本揭露的ARSA多肽的重組病毒載體的醫藥組合物，以治療有需要的個體的MLD。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5 × 10 12、6 × 10 12、7 × 10 12、8 × 10 12、9 × 10 12、10 × 10 12、11 × 10 12、15 × 10 12、20 × 10 12、25 × 10 12、30 × 10 12或50 × 10 12個基因體拷貝/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度約為以下中的任一者：5 × 10 12至6 × 10 12、6 × 10 12至7 × 10 12、7 × 10 12至8 × 10 12、8 × 10 12至9 × 10 12、9 × 10 12至10 × 10 12、10 × 10 12至11 × 10 12、11 × 10 12至15 × 10 12、15 × 10 12至20 × 10 12、20 × 10 12至25 × 10 12、25 × 10 12至30 × 10 12、30 × 10 12至50 × 10 12或50 × 10 12至100 × 10 12個基因體拷貝/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度約為以下中的任一者：5 × 10 12至10 × 10 12、10 × 10 12至25 × 10 12或25 × 10 12至50 × 10 12個基因體拷貝/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5 × 10 9、6 × 10 9、7 × 10 9、8 × 10 9、9 × 10 9、10 × 10 9、11 × 10 9、15 × 10 9、20 × 10 9、25 × 10 9、30 × 10 9或50 × 10 9個轉導單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度約為以下中的任一者：5 × 10 9至6 × 10 9、6 × 10 9至7 × 10 9、7 × 10 9至8 × 10 9、8 × 10 9至9 × 10 9、9 × 10 9至10 × 10 9、10 × 10 9至11 × 10 9、11 × 10 9至15 × 10 9、15 × 10 9至20 × 10 9、20 × 10 9至25 × 10 9、25 × 10 9至30 × 10 9、30 × 10 9至50 × 10 9或50 × 10 9至100 × 10 9個轉導單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度約為以下中的任一者：5 × 10 9至10 × 10 9、10 × 10 9至15 × 10 9、15 × 10 9至25 × 10 9或25 × 10 9至50 × 10 9個轉導單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5 × 10 10、6 × 10 10、7 × 10 10、8 × 10 10、9 × 10 10、10 × 10 10、11 × 10 10、15 × 10 10、20 × 10 10、25 × 10 10、30 × 10 10、40 × 10 10或50 × 10 10個感染單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5 × 10 10至6 × 10 10、6 × 10 10至7 × 10 10、7 × 10 10至8 × 10 10、8 × 10 10至9 × 10 10、9 × 10 10至10 × 10 10、10 × 10 10至11 × 10 10、11 × 10 10至15 × 10 10、15 × 10 10至20 × 10 10、20 × 10 10至25 × 10 10、25 × 10 10至30 × 10 10、30 × 10 10至40 × 10 10、40 × 10 10至50 × 10 10或50 × 10 10至100 × 10 10個感染單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒(例如，rAAV顆粒)的病毒滴度至少約為以下中的任一者：5 × 10 10至10 × 10 10、10 × 10 10至15 × 10 10、15 × 10 10至25 × 10 10或25 × 10 10至50 × 10 10個感染單位/mL。在一些實施例中，病毒顆粒是rAAV顆粒。在一些實施例中，rAAV顆粒包含AAV1999衣殼蛋白。
在一些實施例中，投予於個體的病毒顆粒的劑量至少約為以下中的任一者：1 × 10 8至約6 × 10 13個基因體拷貝/kg體重。在一些實施例中，投予於個體的病毒顆粒的劑量約為以下中的任一者：1 × 10 8至約6 × 10 13個基因體拷貝/kg體重。在一些實施例中，投予於個體的病毒顆粒的劑量約為以下中的任一者：1 × 10 10、2 × 10 10、3 × 10 10、4 × 10 10、5 × 10 10、6 × 10 10、7 × 10 10、8 × 10 10、9 × 10 10、1 × 10 11、2 × 10 11、3 × 10 11、4 × 10 11、5 × 10 11、6 × 10 11、7 × 10 11、8 × 10 11、9 × 10 11、1 × 10 12、2 × 10 12、13× 10 12、4 × 10 12、5 × 10 12、6 × 10 12、7 × 10 12、8 × 10 12、9 × 10 12或1 × 10 13個基因體拷貝/kg體重。
在一些實施例中，投予於個體的病毒顆粒的總量至少約為以下中的任一者：1 × 10 9至約1 × 10 14個基因體拷貝。在一些實施例中，投予於個體的病毒顆粒的總量約為以下中的任一者：1 × 10 9至約1 × 10 14個基因體拷貝。在一些實施例中，投予於個體的病毒顆粒的總量約為以下中的任一者：1 × 10 11、2 × 10 11、3 × 10 11、4 × 10 11、5 × 10 11、6 × 10 11、7 × 10 11、8 × 10 11、9 × 10 11、1 × 10 12、2 × 10 12、3 × 10 12、4 × 10 12、5 × 10 12、6 × 10 12、7 × 10 12、8 × 10 12、9 × 10 12、1 × 10 13、2 × 10 13、13× 10 13、4 × 10 13、5 × 10 13、6 × 10 13、7 × 10 13、8 × 10 13、9 × 10 13或1 × 10 14個基因體拷貝。
本發明的組合物(例如，包含編碼本揭露的ARSA多肽的載體的重組病毒顆粒)可以單獨使用或與用於治療MLD的一種或多種另外的治療劑組合使用。依序投予之間的間隔可以是按至少(或，可替代地，少於)分鐘、小時或天來表示。
根據治療目標，投予有效量的rAAV(在一些實施例中呈顆粒形式)。例如，在低百分比的轉導可以實現所希望的治療效果的情況下，則治療的目標通常是達到或超過此轉導水準。在一些情況下，此轉導水準可以通過轉導僅約1%至5%的靶細胞，在一些實施例中至少約20%的希望組織類型的細胞，在一些實施例中至少約50%，在一些實施例中至少約80%，在一些實施例中至少約95%，在一些實施例中至少約99%的希望組織類型的細胞來實現。rAAV組合物可以通過在同一程式期間或者間隔數天、數週、數月或數年的一次或多次投予來投予。在一些實施例中，可以使用多個載體來治療哺乳動物(例如，人)。
在一些實施例中，本揭露的rAAV組合物可以用於投予於人類。在一些實施例中，本揭露的rAAV組合物可以用於兒科投予。在一些實施例中，將有效量的rAAV(在一些實施例中為顆粒形式)投予於年齡小於一個月、小於兩個月、小於三個月、小於四個月、小於五個月、小於六個月、小於七個月、小於八個月、小於九個月、小於十個月、小於十一個月、小於一歲、小於13個月、小於14個月、小於15個月、小於16個月、小於17個月、小於18個月、小於19個月、小於20個月、小於21個月、小於22個月、小於兩歲、小於三歲、小於五歲或小於七歲的患者。
在一些實施例中，本揭露的rAAV組合物可以用於投予青年。在一些實施例中，將有效量的rAAV(在一些實施例中為顆粒形式)投予於小於12歲、小於13歲、小於14歲、小於15歲、小於16歲、小於17歲、小於18歲、小於19歲、小於20歲、小於21歲、小於22歲、小於23歲、小於24歲或小於25歲的患者。 套組或製品
如本文所述的表現匣(例如，用於表現ARSA多肽(如野生型人類ARSA多肽)的表現匣)、rAAV載體、顆粒和/或醫藥組合物可以含於套組或製品內，例如，所述套組或製品設計為用於如本文所述的本發明方法之一中。
通常，所述系統包括適用於本發明方法的套管、一個或多個注射器(例如，1、2、3、4或更多)和一種或多種流體(例如，1、2、3、4或更多)。
注射器可以是任何合適的注射器，只要它能夠連接至用於遞送流體的套管。在一些實施例中，所述系統具有一個注射器。在一些實施例中，所述系統具有兩個注射器。在一些實施例中，所述系統具有三個注射器。在一些實施例中，所述系統具有四個或更多個注射器。適用於本發明方法的流體包括本文所述的流體，例如，各自包含有效量的如本文所述的一種或多種載體的一種或多種流體，以及包含一種或多種治療劑的一種或多種流體。
在一些實施例中，套組包含單一流體(例如，包含有效量載體的醫藥上可接受的流體)。在一些實施例中，套組包含2種流體。在一些實施例中，套組包含3種流體。在一些實施例中，套組包含4種或更多種流體。流體可以包括稀釋劑、緩衝液、賦形劑或本文所述或本領域已知的適用於遞送、稀釋、穩定、緩衝或以其他方式運輸本揭露的表現ARSA多肽的表現匣或rAAV載體組合物的任何其他液體。在一些實施例中，套組包含一種或多種緩衝液，例如pH緩衝水溶液。緩衝液的例子可以包括但不限於磷酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、HEPES和其他有機酸緩衝液。
在一些實施例中，套組包含容器。合適的容器可以包括例如小瓶、袋、注射器和瓶子。容器可以由一種或多種材料(如玻璃、金屬或塑膠)製成。在一些實施例中，將容器用於容納本揭露的rAAV組合物。在一些實施例中，容器還可以容納流體和/或其他治療劑。
在一些實施例中，套組包含另外的治療劑與本揭露的rAAV組合物。在一些實施例中，rAAV組合物和另外的治療劑可以混合。在一些實施例中，rAAV組合物和另外的治療劑可以保持分離。在一些實施例中，rAAV組合物和另外的治療劑可以在同一容器中。在一些實施例中，rAAV組合物和另外的治療劑可以在不同容器中。在一些實施例中，rAAV組合物和另外的治療劑可以同時投予。在一些實施例中，rAAV組合物和另外的治療劑可以在同一天投予。在一些實施例中，rAAV組合物可以在投予另外的治療劑的一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、兩週、三週、四週、兩個月、三個月、四個月、五個月或六個月內投予。
在一些實施例中，套組包含在AAV投予之前短暫抑制免疫系統的治療劑。在一些實施例中，在注射病毒之前不久和之後不久，短暫抑制患者免疫，以抑制T細胞對AAV顆粒的反應(例如，參見Ferreira等人, Hum. Gene Ther. 25:180-188, 2014)。在一些實施例中，套組進一步提供了環孢黴素、黴酚酸酯和/或甲潑尼龍。
本發明的rAAV顆粒和/或組合物還可以被包裝到包括使用說明的套組中。在一些實施例中，套組進一步包含用於遞送(例如，本文所述的任何類型的腸胃外投予)rAAV顆粒組合物的裝置。在一些實施例中，使用說明包括根據本文所述的方法之一的說明。在一些實施例中，所述說明被印刷在與容器一起提供(例如，附著到容器)的標籤上。在一些實施例中，使用說明包括用於向個體(例如人類)投予有效量的rAAV顆粒，例如用於治療個體的MLD的說明。 實例
通過參考以下實例將更全面地理解本發明。然而，它們不應被解讀為限制本發明的範圍。應理解，本文描述的實例和實施例僅用於說明目的，並且根據它們進行的各種修改或改變將為本領域技術人員知曉，並且應包括在本申請的精神和範圍內以及所附實施例的範圍內。 通用方法 組織勻漿
在冷藏的Omni珠勻漿器(ruptor)中，在1.4 mm陶瓷珠勻漿管中，通過添加冷的10 mM Tris 1 mM EDTA緩衝液將組織勻漿 - 20秒循環，4.7次振盪/秒。勻漿後，製備等分試樣用於後續測定。 用於硫酸酯酶活性的組織增溶
向勻漿的組織中，添加Nonidet P-40至0.1%終濃度，使其在軌道搖床上在4ºC下溶解1.5小時，然後以18,000 x g離心20分鐘。移出上清液並將其轉移到冰上的Eppendorf管中。 BCA 測定
通過使用10 ul稀釋於水中的上清液通過BCA(二辛可寧酸)測定(Thermo Scientific 23227)確定總蛋白濃度。通過在562 nm處的吸光度，通過二辛可寧酸(BCA)對亞銅陽離子(Cu 1+)進行比色檢測。使用Molecular Devices SpectraMax 340PC-384與SoftMax Pro 5.4.4版軟體讀取96孔微量滴定板。 硫酸酯酶活性
使用硫酸酯酶活性測定來測定十微升澄清上清液的總硫酸酯酶活性，所述測定從4-硝基鄰苯二酚硫酸鹽(PNCS)基質水解4-硝基鄰苯二酚(PNC)。(Abcam Ab204731)。通過樣品的水解的4-硝基鄰苯二酚(PNC)相對於PNC標準曲線確定活性，並且在515 nm處讀取吸光度。將硫酸酯酶活性報告為mU/mg(nmol/min/mg)。使用Molecular Devices SpectraMax 340PC-384與SoftMax Pro 5.4.4版軟體讀取96孔微量滴定板。 脂質萃取
用20-100X萃取溶液(5 mM甲酸銨，在乙腈 : 甲醇(70 : 30)中的0.2%甲酸，補充有10 ng/ml C17-硫苷脂)萃取組織勻漿(或流體)的等分試樣。劇烈混合10 min後，將樣品靜置5 min，並且再次快速渦旋(30 s)。將所有樣品在4ºC下以8,400 rpm離心10 min。將上清液的等分試樣(200 uL)轉移到失活的Q-sert小瓶中進行LC-MS分析。
在相同的萃取溶液中使用具有C16、C18、C24和C24 : 1鏈長的硫苷脂(Matreya)和C18 2R-OH硫苷脂和溶血硫苷脂(Avanti)製備標準曲線(線性範圍0.03-1000 ng/mL，2x連續稀釋液)。 硫苷脂的 LC-MS 分析
將Waters Acquity UPLC系統(麻塞諸塞州米爾福德)與Qtrap 6500質譜儀系統(麻塞諸塞州弗雷明漢)偶聯，所述質譜儀系統配備有以負離子模式運行的ESI源，參數如下：氣簾氣25.0；離子噴霧電壓-4.5 kV；溫度500ºC；離子源氣體：50和70；去簇電位-80 V；入口電位-10 V；碰撞能量-155 V；和碰撞室出口電位-15 V。
在Waters Acquity UPLC BEH Amide(1.7 µ，2.1 x 100 mm，P/N：186004801)上分離硫苷脂種類。將自動進樣器和柱溫箱分別維持在10ºC和20ºC。移動相由溶劑A和溶劑B組成，溶劑A：在95 : 5乙腈 : 水中的5 mM甲酸銨，溶劑B：在90 : 10甲醇 : 水中的5 mM甲酸銨。
梯度程式在0% B處開始並保持2 min，遵循從0% B至100% B的線性曲線。在100% B再維持1 min後，使其在0% B再平衡。將所有硫苷脂種類相對於C17-硫苷脂的內標歸一化，並且通過相應標準硫苷脂的標準曲線加以計算。 硝基藍髓鞘染色
將切片轉移到12孔板上，並在自由浮動切片中進行所有步驟。將切片在搖床上在TBA中洗滌2 x 1 min。在硝基藍溶液(Sigma目錄號N5374)中培育1小時，並且在搖床上在TBA中沖洗2 x 5 min。將切片在DAB染色劑(Sigma套組目錄號D4293)中培育1小時，並且在RO水中沖洗2 x 1。將切片在PBS中沖洗1 min，封固於PBS中並風乾載玻片。用中性紅溶液對比染色2 min，在RO水中洗滌2 x 2。將載破片在95%試劑醇中沖洗1 min，在100%試劑醇中沖洗2 x 2 min，在二甲苯中沖洗2 x 2 min，使用Acrytol封固介質沖洗蓋玻片。 GFP ELISA
使用來自Abcam的GFP SimpleStep ELISA®套組(ab171581)完成GFP蛋白的測量。必須閱讀與每個套組批次一起提供的方案插頁(protocol insert)，因為一些試劑濃度會隨著不同批次而變化，尤其是標準品。
在開始之前，將所有套組組分平衡至室溫(18ºC -25ºC)至少30分鐘。將蛋白質加工的組織勻漿的等分試樣在冰上解凍。按照套組說明書，新鮮製備試劑和工作標準品。將樣品稀釋於完全細胞萃取緩衝液中如下：灰質1 : 5，脊髓1 : 5，心臟：1 : 5，肝臟1 : 20。將稀釋的樣品和標準品添加到適當的孔中，然後將抗體混合物添加到每個孔中。將板密封，在室溫下培育1小時，以400 RPM搖動。將孔用洗滌緩衝液洗滌3次，並且確保完全去除液體。將TMB溶液添加到每個孔中，並且在室溫下在黑暗中培育10分鐘，以400 RPM搖動。在TMB培育後迅速將停止溶液添加到每個孔中，並且在平板搖床上混合1分鐘。使用Softmax軟體在SpectraMax板讀取器(Molecular Devices)上在450 nm下讀取板。 FLAG IHC
將NHP腦FFPE載玻片在EDTA溶液(pH9.0)中在90ºC下處理20分鐘用於抗原修復，隨後用3%過氧化氫封閉5分鐘。然後在室溫下將載玻片與在抗體稀釋液(Cell Signaling #8112)中以1 : 200稀釋的Flag DDK抗體(Abcam ab205606)一起培育一小時，然後與抗兔HRP(Abcam ab6721)二抗一起培育。通過在室溫下將載玻片在DAB溶液中培育3分鐘來實現 Flag DDK訊號的顯色，然後將載破片用蘇木精對比染色以進行核染色。 GFP IHC
將NHP腦FFPE載玻片在EDTA溶液(pH9.0)中在90ºC下處理20分鐘用於抗原修復，隨後用3%過氧化氫封閉10分鐘，然後在室溫下用5%馬血清封閉45分鐘。然後在室溫下將載玻片與在抗體稀釋液(Cell Signaling #8112)中以1 : 500稀釋的GFP抗體(ThermoFisher A-11122)一起培育一小時，然後與抗兔HRP(Abcam ab6721)二抗一起培育。通過在室溫下將載玻片在DAB溶液中培育3分鐘來實現 GFP訊號的顯色，並且將載破片用蘇木精對比染色以進行核染色。 交叉校正分析
將相鄰的5 µm FFPE切片處理用於ARSA IHC和DAPI或WPRE ISH和DAPI。然後縫合單獨拼塊以獲得IHC和ISH圖像兩者的矢狀切面。然後將這些圖像用變換矩陣(旋轉和平移參數)整體疊合(register)以對齊IHC和ISH圖像。然後使用DAPI局部疊合矢狀切面內的單獨拼塊，以確保單獨IHC與ISH拼塊之間的良好對齊。在每個拼塊中，通過在整個矢狀切面上憑經驗確定的閾值參數來估計IHC陽性細胞和ISH陽性細胞。在ISH的情況下，IHC陽性細胞必須與核具有至少20%重疊才能算作真正的ISH訊號。對於IHC圖像，使用無ARSA染色的陰性對照來確定閾值參數。估計每個拼塊的交叉校正因子，即IHC陽性細胞與ISH陽性細胞的比率，並表示為熱圖。 單核定序
核分離：對於核分離，將解剖的腦轉移到微量離心管中，在乾冰和乙醇的漿液中快速冷凍，並在-800 C下儲存直至使用。為了分離核，將冷凍的小鼠腦放入1 ml Dounce勻漿器(Wheaton)中的含有0.1% Triton-100(Sigma-Aldrich)、1 mM DTT(Sigma-Aldrich)和0.2 U/ul RNA酶抑制劑(Sigma-Aldrich)的核裂解緩衝液中。使用Dounce寬鬆研棒擊打10下，然後使用緊密研棒擊打10下來將組織勻漿，並且在冰上培育15 min。將所得勻漿通過30 µm細胞過濾器(Miltenyi Biotech)，並且以500 x g離心5 min以使核沈澱。將核重懸於含有1 x PBS(Thermo Fisher)、1%無核酸酶BSA(Sigma-Aldrich)、1 mM DTT(Sigma-Aldrich)和0.2 U/ul RNA酶抑制劑(Sigma-Aldrich)的緩衝液中。將與PE(EMD Millipore)綴合的小鼠抗NeuN以1 : 500的稀釋度添加到製劑中，並且將樣品在40ºC下培育30 min。然後將樣品以500 x g離心5 min以使核沈澱，並且將沈澱物重懸於1 x PBS、1% BSA、1 mM DTT和0.2 U/ul RNA酶抑制劑中。以0.1 ug/ml的濃度添加DAPI。使用100 µm噴嘴在Influx-83(BD Biosciences)上進行單個核分選。將核針對DAPI和NeuN訊號(PE)設門。 文庫製備和 NovaSeq 定序
根據Chromium單細胞3'基因表現V3.1套組的10xGenomics方案製備文庫。簡言之，分選後立即將核與90% NeuN-核和10% NeuN+核混合。在10X Genomics基因表現套組(10xGenomics)中進行GEM生成步驟。在GEM生成後，將樣品保持在-20ºC用於進一步的步驟。從cDNA擴增、文庫構建到文庫定序，將所有樣品一起處理。cDNA和文庫的量化對於所有樣品都是可靠的。在illumine Novaseq 6000上對文庫進行定序。以約50K讀段/核的中位深度對文庫進行定序。通過Cell Ranger V5生成UMI計數矩陣。
數據預處理：將生成的計數矩陣與核條碼和基因標籤一起載入到Partek Flow上。對於品質控制(QC)，根據小提琴圖的檢查，按照標準方案對核進行過濾。詳細的截止值為250 ＜ nFeature_RNA ＜ 6000和nCount_RNA ＜ 30000。線粒體蛋白編碼基因＜ 2%。品質過濾後，保留總計147313個核用於進一步分析。 載體基因體評估
HT gDNA分離：根據製造商的方案「QIAamp® 96 DNA QIAcube® HT Handbook」，使用QIAmp 96 DNA QIAcube HT套組(目錄號51331)從50 ul NHP組織勻漿中分離gDNA。首先將組織勻漿在56ºC下用蛋白酶K處理過夜，然後將其轉移到S塊並且將樣品放入QIAcube HT儀器中，用QIAcube HT Prep Mange Softer ware進行gDNA分離。然後用NANODROP 8000(Thermo Fisher Scientific)測量gDNA濃度。
經由QIAcuty的dPCR：經由QIAGEN製造的QIAcuty用dPCR確定載體基因體。將從NHP組織分離的7 ug gDNA和5 ul的反應預混液(其含有1x探針PCR預混液(Master Mix)(目錄號250103)；1x引物探針混合物1(BGH)和混合物2(管家基因)；0.25U的HindIII限制性內切酶)在標準PCR板中混合，然後將其轉移到奈米板中。總反應體積為12 ul/孔。然後將奈米板放入QIAcuity儀器中，並且使用製造商建議的循環進行dPCR。通過softer ware自動分析每個樣品和每個基因的DNA拷貝。然後將每個細胞的載體基因體計算為：2XBGH拷貝除管家基因拷貝。 實例 1. 使用兩種不同表現匣的 ARSA 體內表現
將載體有效載荷設計為表現由組成型嵌合CMV-雞ß-肌動蛋白(CBA)啟動子驅動的人密碼子優化的芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因(SEQ ID NO: 2)。通過添加土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)進一步增強了轉基因表現。SEQ ID NO: 3示出了用於rAAV包裝的質體的代表性全DNA序列，包括5' AAV2 ITR(SEQ ID NO: 4)和3' AAV2 ITR(SEQ ID NO: 5)、CMV增強子元件(SEQ ID NO: 6)、雞ß-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO: 7)和WPRE元件(SEQ ID NO: 8)。用於rAAV顆粒產生的特定質體的圖譜的示意圖示於 圖 17中。所述質體的特定元件列於表1中。
表 1.從5'ITR至3'ITR的序列注釋
序列編號 注釋
1 - 145 AAV2 5' ITR
173-553 CMV增強子元件
554-873 雞β-肌動蛋白啟動子
874-924 外顯子1雞β-肌動蛋白
925-1799 內含子1雞β-肌動蛋白
1808-1848 內含子2兔β珠蛋白
1849-1902 外顯子3兔β珠蛋白
1914-3443 密碼子優化的人類ARSA
3446-4030 WPRE元件
4043-4245 多聚A訊號序列；牛生長激素基因多腺苷酸化序列
4253-4397 flip方向的AAV2 3 ITR元件
向出生後第二天的ARSA -/-小鼠靜脈內投予(雙側眶後注射)PBS或表現具有或沒有WPRE元件的人類ARSA的AAV9(2e11 VG；2e14 VG/kg)rAAV病毒顆粒。兩種表現匣圖示於 圖 1A中。 圖 1B示出了在投予病毒顆粒後，在前腦、中腦和後腦中hARSA表現的蛋白質印跡分析。將所述表現水準與ARSA -/-小鼠和表現正常水準ARSA的小鼠(即，WT小鼠)中的表現水準進行比較。
如 圖 1B所示，在投予包含兩種表現匣的病毒顆粒後，表現水準增加。相對於沒有WPRE元件的表現匣，在表現匣中包括WPRE元件增加ARSA的表現水準。
接下來，使用LC-MS測量C24-ST水準。將ST水準相對於組織重量歸一化。 圖 1C示出了在投予包含兩種表現匣的病毒顆粒後，前腦、中腦和後腦中的CST水準。誤差棒表示平均值與標準差。單因素方差分析與圖基多重比較檢定。* p＜ 0.05；** p＜ 0.01；*** p＜ 0.001；**** p＜ 0.0001。ELN：20200205-188、20200305-152、20200205-006。相對於ARSA -/-小鼠中的C24-ST水準，在將包含沒有WPRE元件的表現匣的AAV9顆粒投予於ARSA -/-小鼠後，C24-ST水準顯著降低。在將包含具有WPRE元件的表現匣的AAV9顆粒投予於ARSA -/-小鼠後，觀察到C24-ST水準甚至進一步降低。 實例 2. 用 AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE 用劑的 ARSA -/- 小鼠中的硫酸酯酶活性的評價
[0170]對晚期(13個月)ARSA -/-小鼠用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE用劑(1.97e11 VG/動物)。作為對照，向年齡匹配的WT和ARSA -/-小鼠注射配製緩衝液。用劑後三個月，對小鼠實施安樂死，並且收集腦、脊髓和肝臟。使用硫酸酯酶活性測定套組(ab204731)測量ARSA介導的硫酸酯酶活性；將資料相對於通過BCA測定測量的總蛋白質歸一化。誤差棒表示平均值與標準差。雙因素方差分析與圖基多重比較檢定。* p＜ 0.05；** p＜ 0.01；*** p＜ 0.001；**** p＜ 0.0001。ELN：20201205-001、20210225-107、20210211-117。如 圖 2所示，AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的晚期MLD(ARSA -/-)小鼠在腦、脊髓和肝臟中顯示ARSA介導的硫酸酯酶活性增加。 實例 3. 用 AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE 用劑的 ARSA -/- 小鼠中的硫苷脂的評價
MLD患者的硫苷脂沈積是毒性和神經元死亡的主要驅動因素。短鏈脂肪酸(C16、C18)主要在神經元和星形膠質細胞中累積，而長鏈脂肪酸硫苷脂(C24：1、C24)在髓鞘形成細胞中累積。溶血硫苷脂，硫苷脂的脫醯化形式，在MLD患者的所有組織中累積。
對晚期(13個月) ARSA -/-(ARSA KO)小鼠用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE用劑。作為對照，向年齡匹配的WT和ARSA -/-注射配製緩衝液。用劑後三個月，對小鼠實施安樂死，並且收集腦和脊髓。使用LC-MS測量硫苷脂水準。將資料相對於組織重量歸一化：從ng/mL(50 μL)轉換為μg/g。誤差棒表示平均值與標準差。雙因素方差分析與圖基多重比較檢定。
在用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE用劑的ARSA -/-小鼠中，使用LC-MS以及腦和脊髓樣品兩者測量的硫苷脂水準顯示所有硫苷脂亞型水準顯著降低( 圖 3)。 實例 4. 用 AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE 用劑的 ARSA -/- 小鼠中的髓鞘形成的評價
MLD患者在白質束中展現出髓鞘形成顯著損失。為了解決基因療法對晚期(13個月)ARSA -/-小鼠的影響，對小鼠用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE用劑。作為對照，向年齡匹配的WT和ARSA -/-注射配製緩衝液。用劑後三個月，將匹配的矢狀腦半球用硝基藍染色，並且專門在胼胝體中進行訊號強度量化。誤差棒表示平均值與標準差。單因素方差分析與圖基多重比較檢定。相對於對照，AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的晚期MLD(ARSA -/-)小鼠顯示出改善的胼胝體髓鞘形成( 圖 4)。 實例 5. 用 AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE 用劑的 ARSA -/- 小鼠中的髓鞘形成少突膠質細胞和成熟少突膠質細胞的數量的評價
對晚期(13個月) MLD ARSA -/-小鼠用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE用劑。作為對照，向年齡匹配的WT和ARSA -/-小鼠注射配製緩衝液。收集腦半球進行快速冷凍；解剖出小腦、腦幹和嗅球。處理腦的其餘部分用於單核RNAseq，以測量不同細胞類型的相對豐度。誤差棒表示平均值與標準差。雙因素方差分析與圖基多重比較。 圖 5表明，與未處理的ARSA -/-小鼠相比，AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的ARSA -/-小鼠顯示少突膠質細胞計數的正常化。 實例 6.  ARSA 蛋白交叉校正研究
對晚期(13個月)ARSA -/-用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE用劑。用劑後十三個月，對匹配的矢狀腦半切片進行ARSA-mRNA原位雜交(ISH)和ARSA-蛋白免疫組織化學(IHC)。對切片進行成像並且分析訊號覆蓋。( 圖 6A)處理來自小鼠腦的相鄰矢狀切片進行WPRE ISH或ARSA IHC，用DAPI進行核染色。然後將矢狀切片作為單獨1024x1024圖元拼塊加以分析。在每個拼塊中，通過在整個矢狀圖像上憑經驗確定的閾值參數確定ISH陽性細胞和IHC陽性細胞。交叉校正因子(即IHC+ 細胞與ISH+ 細胞的比率)表示為熱圖，其中高度交叉校正拼塊以紅色陰影示出(圖 6B)。將每個拼塊的ISH+細胞計數與IHC+細胞計數繪製為散點圖，其中y = x線以紅色顯示。在y = x線上方的拼塊指示交叉校正的細胞。在晚期神經病變小鼠中，與受感染的細胞相比，10倍高的細胞被交叉校正，突出顯示了通過此策略實現的廣泛交叉校正。 實例 7. 處於早期 (6 個月 ) 神經病變階段的 MLD 小鼠 ( Arsa -/-) 中導致 MLD 相關病理逆轉的 AAV.rh10-h ARSA-WPRE 介導的基因置換的評價
對早期(6個月) ARSA -/-小鼠用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE用劑。作為對照，向年齡匹配的WT和ARSA -/-小鼠注射配製緩衝液。用劑後四個月，通過針對人類ARSA的IHC，在矢狀腦切片中觀察到廣泛的ARSA表現( 圖 7A)。在相同的動物中，腦、脊髓、DRG和肝臟顯示ARSA活性顯著增加( 圖 7B)。因此，AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的早期MLD(ARSA -/-)小鼠在腦、脊髓、DRG和肝臟中顯示廣泛的CNS人類ARSA表現和增加的ARSA介導的硫酸酯酶活性。 實例 8. 處於早期 (6 個月 ) 神經病變階段的 MLD 小鼠 ( Arsa -/-) 中 AAV.rh10-h ARSA-WPRE 介導的基因置換中的硫苷脂水準的評價
對早期(6個月) ARSA -/-小鼠用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE用劑。作為對照，向年齡匹配的WT和ARSA -/-小鼠注射配製緩衝液。用劑後四個月，對動物實施安樂死，並且收集 ( A) 腦和脊髓、( B) 肝臟、( C) 血漿和 ( D) CSF。使用LC-MS測量硫苷脂水準。將資料相對於組織重量歸一化：從ng/mL(50 μL)轉換為μg/g。流體：將資料轉換為(30 μL)ng/mL至ng/mL和ng/mL(5 μL)至ng/uL。 圖 8A- 圖 8D示出了腦( 圖 8A)、肝臟( 圖 8B)、血漿( 圖 8C)和CSF( 圖 8D)中的硫苷脂水準。投予AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE後，腦、脊髓、肝臟、血漿和CSF中的硫苷脂水準顯著增加。 實例 9 ：使用非人靈長類動物 (NHP) 的研究 - 硫酸酯酶活性
對AAVrh.10呈血清陰性的食蟹猴(雄性，模里西斯猴2歲，2-3 Kg)使用插入腰椎區域的帶埠的鞘內導管在頸椎1-2節處用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE鞘內用劑。在特倫德倫伯臥位以0.125 mL/min的兩次2.5 mL輸注向動物用劑，間隔大約六小時。投予兩種劑量：7.5e12 VG/NHP(以1e11 VG/腦克)和2.75e13 VG/NHP(以3.3e11 VG/腦克)。用劑後29天，對動物實施安樂死，並且評估樣品的ARSA活性：從腦環切59個組織，來自脊髓的7個組織環切樣品。在腦和脊髓中觀察到顯著增加的硫酸酯酶活性，在低劑量和高劑量下腦中分別有59%和86%的環切樣品顯示出活性相對於背景增加至少10%( 圖 9A)。這超出了我們的目標標準，即50%環切樣品的活性增加＞ 10%。類似地，在以低劑量和高劑量處理的NHP的脊髓中分別觀察到硫酸酯酶活性增加25%和32%( 圖 9B)。通過針對FLAG抗體的IHC，在處理的NHP的腦中觀察到廣泛的ARSA生物分佈( 圖 9C)。我們的結果表明，AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE介導的基因置換是在中樞神經系統(CNS)和周圍神經系統(PNS)中實現廣泛和治療水準的ARSA的可行方法。 實例 10 ：使用非人靈長類動物 (NHP) 的研究 - 在投予包含 AAV1999 或 AAV.rh10 的顆粒後的比較轉基因表現水準
對AAVrh10和AAV1999(具有SEQ ID NO. 12的VP1；具有SEQ ID NO. 13的VP2；和具有SEQ ID NO: 14的VP3)呈血清陰性的食蟹猴(雄性，模里西斯猴2歲，2-3 kg)使用插入腰椎區域的帶埠的鞘內導管在頸椎1-2節處鞘內用劑。在特倫德倫伯臥位以0.125 mL/min的兩次2.5 mL輸注向動物用劑，間隔約6小時。以2.75e13 VG/NHP(以3.3e11 VG/腦克)投予一劑AAV1999/rh10/Myo-CBA-eGFP。用劑後兩週，對動物實施安樂死，並且通過ELISA評估樣品的綠色螢光蛋白(GFP)表現。
代表16個不同腦區的總共41個腦環切樣品(灰質)顯示出與AAVrh.10相比，來自AAV1999的顯著更高的GFP表現( 圖 10A)。在所有樣品中，與AAVrh.10處理的NHP相比，AAV1999處理的NHP的腦中GFP表現高93%-123%( 圖 10B)。這由熱圖證明，在熱圖中與AAVrh10處理的NHP相比，AAV1999處理的NHP的41個環切樣品中有38個(對三個NHP取平均值)顯示GFP表現最少增加10%( 圖 11)。AAV1999處理的NHP中，用eGFP的抗體染色的代表性匹配的腦切片顯示穩健表現，這表明與AAVrh10相比更優越的生物分佈( 圖 12)。此外，在脊髓和DRG中，與AAVrh.10處理的NHP相比，AAV1999處理的NHP中的GFP表現分別高79%和22%。 圖 13示出了NHP的脊髓和DRG中的GFP表現。與AAVrh10-GFP處理的NHP相比，心臟和肝臟中的AAV1999-GFP表現較低( 圖 14)。
與AAVrh.10相比，AAV1999載體基因體載量在腦中為十分之一，在脊髓中為三分之一( 圖 15A)。這在GFP表現(y軸)與組織載體基因體(x軸)之間的相關性的「左移」中是顯而易見的，其中AAV1999的相關性(紅色)左移，表明載體的蛋白表現更高且組織劑量更低(約10倍)( 圖 16)。此外，與AAVrh.10相比，DRG、肝臟、心臟、肺和腎臟也顯示出較低的AAV1999載體基因體( 圖 15B)。脾臟是所測試的組織中唯一顯示與AAVrh.10相比更高的AAV1999載體基因體的組織( 圖 15B)。這些結果表明，AAV1999優於AAVrh.10，並且在更低劑量下提供了更廣泛的生物分佈和更高的轉基因表現。 實例 11 ： 使用 AAV1999-ARSA 在神經病變前 Arsa KO 小鼠模型中的長期藥理學、功效和持久性研究
本研究設計為在 ArsaKO小鼠模型中評價AAV1999-ARSA的長期藥理學和功效。研究設計總結於表2中。對兩個月齡的 ArsaKO小鼠以1.6e11 VG/小鼠(3.3e11 VG/gm腦重)用AAV1999-ARSA(批號VP091321)用劑(雙側ICV注射；4 uL/半球)。作為對照，對年齡匹配的WT和 ArsaKO小鼠用配製緩衝液用劑。用劑後13個月對小鼠實施安樂死並且收集樣品。 表 2 ­ 在 Arsa KO 小鼠 (2 個月 -15 個月 ) 中的長期藥理學、功效和持久性研究
組 數量 / 性別 基因型 測試物品 劑量 用劑方案 時間點、樣品收集、分析
1 12 (6M, 6F) WT 配製緩衝液 N/A 雙側ICV，每側4 ul ● 用劑年齡：2個月 ● 屍檢年齡：15個月(壽命13個月) ● 腦、脊髓、DRG、坐骨神經、肝臟、CSF和血漿
2 12 (6M, 6F) ARSA -/- 配製緩衝液 N/A
3 12 (6M, 6F) ARSA -/- AAV1999-ARSA(批號VP091321) 1.6e11VG (3.3e11 VG/克腦重)
在AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠的腦和脊髓中觀察到穩健 hARSAmRNA表現( 圖 18)。使用硫酸酯酶活性測定套組(Abcam，ab204731)測量硫酸酯酶活性。用AAV1999-ARSA用劑的 ArsaKO小鼠的腦、脊髓、DRG和坐骨神經中顯示出正常(等效於WT)水準的硫酸酯酶活性( 圖 19)。在處理的小鼠的肝臟中觀察到相對於WT硫酸酯酶活性水準可測量的增加( 圖 19)。MLD患者的硫苷脂沈積是毒性和神經元死亡的主要驅動因素。在患者中，溶血硫苷脂(lyso-ST)(硫苷脂的脫醯化形式)在所有組織中累積，並且是MLD相關病理學的特徵標誌。在AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠中，腦和脊髓中的lyso-ST水準恢復到正常(與WT相似)( 圖 20)。在DRG、坐骨神經和肝臟中也觀察到lyso-ST水準的顯著降低，而在來自處理的動物的血漿和CSF中總硫苷脂水準顯著降低( 圖 20)。由於腦和脊髓中的硫苷脂清除，AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠在腦和脊髓中顯示出神經炎性標記( Gfap和 Aif1)和 Lamp1表現(溶酶體健康的標記)的顯著改善( 圖 21)。此外，與緩衝液處理的 ArsaKO小鼠相比，在AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠中觀察到血漿Nf-L水準的顯著降低( 圖 22)。
MLD患者經常出現聽力損傷。聽覺腦幹反應(ABR)測試提供了關於內耳(耳蝸)和聽覺中樞通路的功能資訊。ABR反映了耳蝸神經節神經元和中樞聽覺通路的核兩者對聲音刺激的電回應(Zhou等人, 2006；Burkard等人, 2007)。經由放置在麻醉的動物頭皮上的電極記錄ABR。ABR閾值是指可以產生可識別的電響應波的最低聲壓級(SPL)。 ArsaKO顯示聽力隨著時間的推移出現進行性惡化，這在用AAV1999-ARSA處理後發生逆轉( 圖 23)。早在用劑後4個月(測試的最早用劑後時間)觀察到表型的部分逆轉( 圖 23)。
在所有 ArsaKO小鼠的腦中(通常在腦幹和/或小腦中)觀察到空泡形成和神經變性。在處理的小鼠中，10隻小鼠中僅有4隻檢測到組織學變化，並且嚴重程度低於 ArsaKO小鼠( 圖 24A)。所有 ArsaKO小鼠在脊髓中顯示出微小嚴重程度的空泡形成，而在WT小鼠或AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠中未檢測到變化( 圖 24B)。最後，在任何組(除了KO+AAV組的10隻動物中的1隻以外)的DRG中均未檢測到病理變化( 圖 24C)。因此，將 ArsaKO小鼠用AAV1999-ARSA處理顯著最小化和/或阻止了腦中的MLD相關病理，並且阻止了脊髓中的MLD相關病理。 實例 12 ：使用 AAV1999 ，在神經病變早期 ARSA KO 小鼠模型中的縱向藥理學、功效和持久性研究
本研究設計為在6個月的時間段內在 ArsaKO模型中評價MLD相關病理表型和生化表型的靶接合和逆轉。選擇早期神經病變階段(用劑時為6個月)作為其與靶向患者群體最相關的階段。研究設計總結於表3中。對六個月齡的 ArsaKO小鼠以5e10 VG/小鼠(1e11 VG/gm腦重)的劑量用AAV1999-ARSA(批號VP091321)用劑(雙側ICV注射；4 uL/半球)。對對照年齡匹配的WT和 ArsaKO小鼠用配製緩衝液用劑。用劑後1、2、3和6個月對小鼠實施安樂死並且收集樣品。 表 3 ­ ArsaKO 小鼠中的縱向藥理學、功效和持久性研究
組 數量和性別 基因型 測試物品 劑量 用劑方案 時間點、樣品收集、分析
1 32 (16M, 16F) WT 配製緩衝液 N/A 雙側ICV，每側4 ul ● 用劑年齡：6個月 ● 屍檢年齡：7個月(壽命1個月)、8個月(壽命2個月)、9個月(壽命3個月)、12個月(壽命6個月) ● 腦、脊髓、DRG、坐骨神經、肝臟、CSF和血漿
2 32 (16M, 16F) Arsa -/- 配製緩衝液 N/A
3 32 (16M, 16F) Arsa -/- AAV1999-ARSA (批號VP091321) 5e10VG (1e11 VG/克腦重)
在用劑後6個月時間段內，腦中的AAV1999-ARSA載體基因體暴露保持一致( 圖 25A)。這轉化為隨著時間的推移持續存在的ARSA介導的硫酸酯酶活性( 圖 25B)，截至用劑後1個月達到硫酸酯酶活性峰值( 圖 25C)。在每個時間點，處理的小鼠顯示出溶血硫苷脂、C16-硫苷脂和C18-硫苷脂的顯著降低( 圖 26A- 圖 26C)。重要的是，清除是進行性的，硫酸酯水準(尤其是Lyso-ST)截至用劑後6個月恢復正常( 圖 26D- 圖 26F)。此外，在AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠中，CSF和血漿中的總硫苷脂水準顯著降低( 圖 27)。最終，與KO+FB組相比，截至用AAV1999-ARSA用劑後6個月，血漿Nf-L水準的初始增加降低( 圖 28)。
在腦幹和/或小腦核中觀察到 ArsaKO小鼠的腦中神經元和嗜中性粒細胞變化。值得注意的是，早在用劑後2個月，在用AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠中觀察到這些變化的發生率和嚴重程度的降低( 圖 29A- 圖 29B)。一些AAV1999-ARSA處理的小鼠的腦(通常在海馬附近)具有微小嚴重程度的單個核細胞的局灶性或多灶性、血管周圍浸潤( 圖 29C)。在每組1-2隻動物中，主要是海馬CA3區的神經元也存在微小變性/壞死( 圖 29D)。
一些AAV1999-ARSA處理的小鼠的背根神經節具有通常微小嚴重程度的神經膠質細胞和/或單個核細胞的細胞性的局灶性或多灶性增加( 圖 30A)，其中一些處理的 ArsaKO小鼠顯示神經軸突的微小變性( 圖 30B- 圖 30C)。在所有組的動物的脊髓中均觀察到顯微發現，並且這被認為是隨機的或偶然的( 圖 30D)。大多數 ArsaKO小鼠顯示坐骨神經中的組織學變化(非常微小的或微小的軸突變性)，其中在AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠中發生率和嚴重程度偶爾增加到微小/輕度或者輕度( 圖 30E)。WT小鼠的坐骨神經也具有偶發軸突變性的罕見的、非常微小的背景( 圖 30E)。在肝臟中沒有記錄測試物品特異性發現。
綜合這些資料表明， ArsaKO小鼠中AAV1999-ARSA介導的基因置換是耐受良好的，並且在雄性和雌性小鼠兩者中均以相同的程度逆轉的MLD相關表型。 實例 13 ： 評價 AAV1999-ARSA 的 NHP 藥理學和劑量範圍發現研究
簡言之，通過單次直接腦大池(ICM)輸注對AAV1999中和抗體呈血清陰性的目的育種的(purpose bred)、未經處理的雄性/雌性食蟹猴(柬埔寨猴2-3歲，2.6-3.1 kg)NHP用劑。用劑期間將動物置於特倫德倫伯臥位。用劑範例涉及以0.125 ml/min單次2.5 mL輸注AAV1999-ARSA(批號VP050322)，然後用配製緩衝液進行250 ul沖洗。用劑後五週，對動物實施安樂死，並且評估樣品的載體生物分佈(dPCR)和 hARSAmRNA(RTdPCR)，伴隨安全性評估。樣品代表來自腦的64個環切樣品，代表19個不同的灰質區和7個不同的白質區、具有相鄰DRG、周圍神經和內臟器官的8個脊髓節段。研究設計描述於表4中。
表 4 ­ 研究 CRL.2021-5613 ： NHP 劑量範圍發現研究
組 測試物品 劑量 /gm 腦重 劑量 / 動物 用劑方案 動物數量 時間點、樣品收集、分析
1 AAV1999-ARSA 1e10 VG 7.5e11 VG RoA：置於特倫德倫伯臥位的動物的ICM 用劑參數：以0.125 mL/min的2.5 ml，250 ul沖洗 5 (M/F) 壽命：35天 屍檢時腦、脊髓、DRG、周圍神經、內臟器官 CSF (研究前和屍檢時) 血漿：研究前，用劑後天數：2、4、7、14，和屍檢時 神經病學/行為評估(用劑前、用劑後7天和5週)
2 3.3e10 VG 2.5e12 VG 5 (M/F)
3 1e11 VG 7.5e12 VG 5 (M/F)
4 3.3e11 VG 2.5e13 VG 5 (M/F)
5 配製緩衝液 n/a n/a 3 (M/F)
在用ICM用劑的NHP腦中，在灰質區(19個獨特腦區)和白質區(7個獨特腦區)兩者中，均觀察到AAV1999-ARSA載體生物分佈的劑量依賴性增加( 圖 31)。AAV1999-ARSA處理還導致在兩個最高劑量(7.5e12VG(1e11 VG/gm腦重)和2.5e13VG(3.3e11 VG/gm腦重))下的hARSA mRNA( 圖 32)和蛋白質( 圖 33)水準的廣泛劑量依賴性增加。在DRG和脊髓中，沿脊髓頭-尾軸觀察到均勻的劑量依賴性載體生物分佈和hARSA表現( 圖 34)。在內臟器官中，肝臟、脾臟和頸淋巴結顯示出載體生物分佈的劑量依賴性增加( 圖 35)。
為了探索AAV1999-ARSA的投予是否導致NHP腦中有意義的人類ARSA表現，我們評估了AAV來源的人類ARSA蛋白的水準，並且將其與以下進行了比較：1) 內源性食蟹猴cyARSA蛋白(在相同樣品內測量19個腦區中的hARSA/cyARSA)和2) 在年齡為3歲與8歲之間的7名健康人器官供體的腦中(12個腦區中)測量的人類ARSA蛋白。在1e11 VG/gm和3.3e11 VG/gm腦重的劑量下，全腦平均人類ARSA蛋白水準為天然cyARSA的約63%和約546%( 圖 36)。此外，在1e11 VG/gm和3.3e11 VG/gm腦重的劑量下，全腦平均人類ARSA蛋白水準是來自健康對照器官供體的人類ARSA蛋白水準的約51%和約416%( 圖 37)。因此，在1e11和3.3e11 VG/gm腦重下，NHP中的AAV1999-ARSA處理導致CNS中有治療意義的ARSA蛋白表現。
與用劑前測試相比，在任一用劑組中，在用劑後第1週或第5週(屍檢)，在NHP中未觀察到臨床徵兆(功能或行為缺陷)( 圖 38)。CM內輸注的耐受良好；如所預期，ICM程式解釋了CSF Nf-L水準的顯著增加，以及與配製緩衝液處理的NHP相比，在AAV1999-ARSA處理的NHP中觀察到的進一步增加( 圖 39A)。然而，未觀察到劑量依賴性增加( 圖 39A)。在任何劑量中，在用AAV1999-ARSA處理的NHP中均未觀察到血漿細胞介素濃度的顯著變化( 圖 39B)，並且在以兩種高劑量用AAV1999-ARSA處理的NHP中，通過IFN-γ ELISpot沒有記錄對AAV1999衣殼或hARSA蛋白的細胞介導的免疫反應( 圖 39C)。此外，屍檢時，在任何動物中均未記錄與測試專案相關的重大發現。
在來自1e10 VG/gm腦重的大多數動物中，腦脊液變化由有核細胞計數(主要是單個核細胞)的微小的非劑量相關的增加組成。此外，在載體投予後5週，在≥ 3.3e10 VG/gm腦重下，大多數動物中白蛋白和/或總蛋白有所增加。在3.3e10或3.3e11 VG/gm腦重下的一些單獨動物具有可變數的形態上與神經物質相容的嗜鹼性至嗜酸性的顆粒狀物質。這些變化與在來自中樞神經系統的各個切片中記錄的神經元變性和單個核細胞浸潤相關。
在第7天，在≥ 1e10 VG/gm腦重的大多數雄性和1e11 VG/gm腦重的少量散在性雌性中，血液學變化由網織紅細胞計數的短暫輕度增加組成，且在少量個體中伴隨紅細胞品質參數的微小降低。在3.3e10 VG/gm腦重的一些雄性和雌性中，存在繼發於嗜中性粒細胞、淋巴細胞和/或單核細胞計數增加的白細胞計數增加，在投予3.3e11 VG/gm腦重的一些動物中(主要在雄性中)也有記錄。沒有記錄對凝血或臨床化學的與測試物品相關的影響。
主要測試物品影響由以下構成：神經元變性(影響腦、腰椎脊髓和DRG)、神經膠質細胞反應增加(小腦和脊髓)、神經纖維變性(影響脊髓的白質和周圍神經的神經纖維)以及影響腦(小腦)、DRG和脊髓的單個核細胞浸潤(包括血管周圍分佈)( 圖 40- 圖 42)。在任何劑量下，在內臟器官(心臟、肝臟、膽囊、脾臟、胰腺、腎上腺、肺、骨骼、胸骨/骨髓、卵巢、十二指腸、睾丸、附睾、胸腺、眼睛、子宮宮頸、腎臟)中均未觀察到測試物品相關發現。在最低劑量(1e10 VG/gm腦重)與最高劑量(3.3e11 VG/gm腦重)之間，對於一些位置的一些變化，如神經元變性(在最高劑量下，小腦、腰椎DRG)、神經膠質增生(大腦皮質、小腦，但不在脊髓中)以及對於單個核細胞浸潤(在最高劑量下，在大腦皮質中和腰椎DRG中)，記錄到劑量反應( 圖 40- 圖 42)。
總之，在1e10、3.3e10、1e11和3.3e11 VG/gm腦重的用劑水平下，在食蟹猴(雄性和雌性兩者)中，通過直接腦大池(ICM)內單次投予AAV1999-ARSA的耐受良好，並且認為1e11和3.3e11 VG/gm腦重是有效劑量。 序列 ARSA 多肽序列 密碼子優化的 ARSA DNA 序列 ( 人類 )ATGAGCATGGGAGCCCCTAGATCTCTGCTGCTGGCTCTTGCTGCTGGACTGGCTGTGGCCAGACCTCCTAACATCGTGCTGATCTTCGCCGACGATCTCGGCTATGGCGATCTGGGCTGTTACGGACACCCTAGCAGCACCACACCTAACCTGGATCAACTGGCTGCCGGCGGACTGAGATTCACCGATTTCTACGTGCCCGTGTCTCTGTGCACACCTAGTAGAGCTGCTCTGCTGACAGGCAGACTGCCAGTGCGGATGGGAATGTATCCTGGCGTGCTGGTTCCTAGCAGTAGAGGCGGACTGCCTCTGGAAGAAGTGACAGTTGCTGAAGTGCTGGCCGCCAGAGGCTATCTGACTGGAATGGCCGGAAAATGGCACCTCGGAGTTGGACCTGAAGGCGCTTTTCTGCCTCCTCACCAGGGCTTCCACAGATTTCTGGGCATCCCTTACAGCCACGATCAGGGCCCTTGCCAGAACCTGACCTGCTTTCCTCCTGCCACACCTTGTGATGGCGGCTGTGATCAGGGACTCGTGCCTATTCCTCTGCTGGCCAATCTGAGCGTGGAAGCTCAACCTCCTTGGCTGCCTGGCCTGGAAGCCAGATATATGGCCTTCGCTCACGACCTGATGGCCGACGCTCAGAGACAGGACAGACCATTCTTCCTGTACTACGCCAGCCACCACACACACTACCCTCAGTTCTCTGGCCAGTCCTTCGCCGAGAGATCTGGCAGAGGCCCTTTTGGCGATAGCCTGATGGAACTGGATGCCGCCGTGGGAACACTGATGACAGCCATTGGAGATCTGGGCCTGCTGGAAGAGACACTGGTCATCTTCACCGCCGACAACGGCCCCGAGACAATGAGAATGAGCAGAGGCGGCTGTAGCGGCCTGCTGAGATGTGGCAAGGGAACAACATACGAAGGCGGCGTCAGAGAGCCTGCTCTGGCTTTTTGGCCTGGACATATTGCCCCTGGCGTGACACACGAACTGGCCTCTTCTCTGGATCTGCTGCCTACACTGGCTGCTTTGGCTGGCGCTCCTCTGCCTAATGTGACCCTGGATGGCTTCGATCTGTCTCCACTGCTGCTCGGAACAGGCAAGAGCCCTAGACAGAGCCTGTTCTTCTACCCTAGCTACCCCGATGAAGTGCGGGGAGTGTTTGCCGTGCGGACAGGCAAGTACAAGGCCCACTTTTTTACCCAAGGCAGCGCCCACAGCGATACCACAGCTGATCCTGCTTGTCACGCCTCTAGCAGCCTGACAGCTCATGAACCACCTCTGCTGTACGACCTGTCTAAGGACCCCGGCGAGAACTATAATCTGCTTGGCGGAGTTGCCGGCGCTACACCTGAAGTTCTGCAGGCTCTGAAACAGCTCCAGCTGCTGAAAGCCCAGCTGGACGCTGCTGTGACATTTGGACCTTCTCAGGTGGCAAGAGGCGAGGACCCTGCTCTGCAGATTTGTTGTCACCCTGGCTGTACCCCTAGACCTGCCTGCTGTCACTGTCCTGATCCTCACGCTTGA(SEQ ID NO:2)   用於 rAAV 包裝的質體的全 DNA 序列； ARSA 的編碼序列加底線TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTACGTACAATTGGGATCCCGGACCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTACGTACCACC ATGAGCATGGGAGCCCCTAGATCTCTGCTGCTGGCTCTTGCTGCTGGACTGGCTGTGGCCAGACCTCCTAACATCGTGCTGATCTTCGCCGACGATCTCGGCTATGGCGATCTGGGCTGTTACGGACACCCTAGCAGCACCACACCTAACCTGGATCAACTGGCTGCCGGCGGACTGAGATTCACCGATTTCTACGTGCCCGTGTCTCTGTGCACACCTAGTAGAGCTGCTCTGCTGACAGGCAGACTGCCAGTGCGGATGGGAATGTATCCTGGCGTGCTGGTTCCTAGCAGTAGAGGCGGACTGCCTCTGGAAGAAGTGACAGTTGCTGAAGTGCTGGCCGCCAGAGGCTATCTGACTGGAATGGCCGGAAAATGGCACCTCGGAGTTGGACCTGAAGGCGCTTTTCTGCCTCCTCACCAGGGCTTCCACAGATTTCTGGGCATCCCTTACAGCCACGATCAGGGCCCTTGCCAGAACCTGACCTGCTTTCCTCCTGCCACACCTTGTGATGGCGGCTGTGATCAGGGACTCGTGCCTATTCCTCTGCTGGCCAATCTGAGCGTGGAAGCTCAACCTCCTTGGCTGCCTGGCCTGGAAGCCAGATATATGGCCTTCGCTCACGACCTGATGGCCGACGCTCAGAGACAGGACAGACCATTCTTCCTGTACTACGCCAGCCACCACACACACTACCCTCAGTTCTCTGGCCAGTCCTTCGCCGAGAGATCTGGCAGAGGCCCTTTTGGCGATAGCCTGATGGAACTGGATGCCGCCGTGGGAACACTGATGACAGCCATTGGAGATCTGGGCCTGCTGGAAGAGACACTGGTCATCTTCACCGCCGACAACGGCCCCGAGACAATGAGAATGAGCAGAGGCGGCTGTAGCGGCCTGCTGAGATGTGGCAAGGGAACAACATACGAAGGCGGCGTCAGAGAGCCTGCTCTGGCTTTTTGGCCTGGACATATTGCCCCTGGCGTGACACACGAACTGGCCTCTTCTCTGGATCTGCTGCCTACACTGGCTGCTTTGGCTGGCGCTCCTCTGCCTAATGTGACCCTGGATGGCTTCGATCTGTCTCCACTGCTGCTCGGAACAGGCAAGAGCCCTAGACAGAGCCTGTTCTTCTACCCTAGCTACCCCGATGAAGTGCGGGGAGTGTTTGCCGTGCGGACAGGCAAGTACAAGGCCCACTTTTTTACCCAAGGCAGCGCCCACAGCGATACCACAGCTGATCCTGCTTGTCACGCCTCTAGCAGCCTGACAGCTCATGAACCACCTCTGCTGTACGACCTGTCTAAGGACCCCGGCGAGAACTATAATCTGCTTGGCGGAGTTGCCGGCGCTACACCTGAAGTTCTGCAGGCTCTGAAACAGCTCCAGCTGCTGAAAGCCCAGCTGGACGCTGCTGTGACATTTGGACCTTCTCAGGTGGCAAGAGGCGAGGACCCTGCTCTGCAGATTTGTTGTCACCCTGGCTGTACCCCTAGACCTGCCTGCTGTCACTGTCCTGATCCTCACGCTTGAGATTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGATCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTCGAAATTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAATCGCGACGGCCGACGTCTTTGTTACAACTTACTATATATATGCACACATATATATATATTTGGGTATATTGGGGGGGTTCTAATTTAAGAAATGCATAATTGGCTATAGACAGACAGTTGTCAGAACTTGGCAATGGGTACGTGCAGGTTCATTATACCAAGTCTACTTGTAGTTGTTCAAAATGTATCATAATACAAGGCCGGGCGAGGTCGTCACGCCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCTAAGGCAGGAGGATTGCTTGAGGTCAGGAGTTTGTGACCAGCCTGGGCAACAGAGCAAGACCCTGTCTCCAAAAAGAAAAAAAATAATTTTTTACAAAATAAAAACAAAATGTATCATCAGACGAAATTAAATAAGAGGCAATTCATTGTAATGACAACTTTTCCCAGCTTGACATTTAACAAAAAGTCTAAGTCCTCTTAATTCATATTTAATGATCAAATATCAAATACTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCGATCCTGGCTCACTGCAAGCTCCGCCTCCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGATTACAGACATGCGCCACCACGCCCGGCTAATTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCTCCATGTTGGTCAGGCTGGTCTTGAATTTCCCACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCAGCCTCACAAAGCAGTAGCTGGGACTACAGGCACCCACCACCACACTTGGTTAATTCTTTTGTATTTTTTTTGTAAAGACGGGATTTCACCATGTTAGCCAGGATGGTCTCGATCTCCTGATCTCATGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCCCGCCCGGCCATCAAATACTAATTCTTAAATGGTAAGGACCCACTATTCAGAACCTGTATCCTTATCACTAATATGCAAATATTTATTGAATACTTACTATGTCATGCATACTAGAGAGAGTTAGATAAATTTGATACAGCTACCCTCACAGAACTTACAGTGTAATAGATGGCATGACATGTACATGAGTAACTGTGAACAGTGTTAAATTGCTATTTAAAAAAAAAGACGGCTGGGCGCTGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGCAAGTTGATCGCTCGAGGTCAAGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACGTGGTAAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAAAAAATTAGCCAGGCATGGTGGCACAGGCCTGTAATCCCAGCTACTAGGGAGGCTGAGACATGGAGAACTGCTTGAATCCAGGAGGCAGAGGTTACAGTGAGCCGAGATCATACCACTACACTCCAGCCTGAGTGACAGAGCGAGACTCCTGTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATACAGGTTAAGTGTTATGGTAGTTGAAGAGAGAACTCAAACTCTGTCTCAGAAGCCTCACTTGCATGTGGACCACTGATATGAAATAATATAAATAGGTATAATTCAATAAATAGGAACTTCAGTTTTAATCATCCCAAACACCAAAACTTCCTATCAAACAGGTCCAATAAACTCAATCTCTATAAGAGCTAGACAGAAATCTACTTGGTGGCCTATAATCTTATTAGCCCTTACTTGTCCCATCTGATATTAATTAACCCCATCTAATATGGATTAGTTAACAATCCAGTGGCTGCTTTGACAGGAACAGTTGGAGAGAGTTGGGGATTGCAACATATTCAATTATACAAAAATGCATTCAGCATCTACCTTGATTAAGGCAGTGTGCAACAGAATTTGCAGGAGAGTAAAAGAATGATTATAAATTTACAACCCTTAAAGAGCTATAGCTGGGCGTGGTGGCTCATGCCTGTAAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATCACCTGAGGCCAGAAGTTCAAGACCAGCCTAGCCAACATGGCGAAACCCTGTCTCTACAAAAAATACAAAAATTAGCCGGGTGTGGTGGCACGTGCCTGTAGTCCCAGTTACTTGGGAGGCCGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCTAGGAGGTGGAGGCTGCAGTGAGCCGAGATTGTGCCACTGCACTCCACTTCAGCCTGGGCGACAAGAGCAAGACTCCGTCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCTAAAATCTAGTGGGAAAGGCATATATACATACAACTAACTGTATAGCATAATAAAGCTCATAATCTGTAACAAAATCTAATTCGACAAGCCCAGAAACTTGTGATTTACCAAAAACAGTTATATATACACAAAAAGTAAACCTAGAACCCAAAGTTACCCAGCACCAATGATTCTCTCCCTAAGCAGTATCAAGTTTAAAGCAGTGATTACATTCTACTGCCTAGATTGTAAACTGAGTAAAGGAGACCAGCACCTTTCTGCTACTGAACTAGCACAGCCGTGTAAACCAACAAGGCAATGGCAGTGCCCAACTTTCTGTATGAATATAAGTTACATCTGTTTTATTATTTGTGACTTGGTGTTGCATGTGGTTATTATCAACACCTTCTGAAAGAACAACTACCTGCTCAGGCTGCCATAACAAAATACCACAGACTGAGTGACTTAACAGAAACTTATTTCTCACAGTTTTGGAGGCTGGGAAGTCCAAAATTAAGCTAACTGCAAGGTAGGTTTCAATCTCAGGCCTCTTCTTTGGCTTGAAGGTCTTCTAACTGTGTGCTCACATGACCTCTTCTAACAAGCTCTCTGGTGTCTCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTGAGACAGAGTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTACAGTGGCACAATCTGGGCTCACTGCAACCTCCAACTCCCGGGTTCAAGTGATTCTCATGCCTCACCCTCCCGAGTAGCTTGGATGACAGGAGCCCGCTACCACACCCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGTGTTTCACTACATTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCGTGATCCACCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCCACTGCGCCCGTCCTGGTGTCTTTTCATATAAGGGCACTAATCCAATCAGACCTGGGCCCAACCCTCCCGACTTCTTCTAACTGTAATTACCTTCCAAAGGCCCTGTCTCCAAATACCATCACACTGGGGGTTAGGACTTCAAAAAAGGTATGGGGGGGGTGTGGGAGGACATAAATGCTCAGTCCATAACAAGCACCCAACATAAAAATGGCTAGAACAGATCACAAAAAAAAGGTCCTGTATGGCTTTGGGGAAGGGCTCAACCCCAAAATATCTGAAAGCTCTGGAGGGGCCTAGAAGTGGTAAATGAATGAAAACGTGGTTACTCTCCCGATCTGCCTTTCCCAAATATGGCCATTCTTGGCTGAATCAGAAATCAAAGGACAGGTTATTAATTACTAGCTCTAAGTTACTTACCATTTGCTGAGACAGTTCAGAAATCTGACTGCATCTCCTCAGGGATCTAGAACACAGTTCTCAAATTCTAACTTACTTGTGATATACTTGTGAATGATAAAAATCGCTACAGGTACTTTTATTAATCTGAAAGAGTATTGAGAAATTACCTTTCATTCTGACTTTTGTCTGGAATGAAAATCAATACTTTTGCTATATTCCATTACTGAAATAATTTTACTTTCCAGTAAAACTGGCATTATAATTTTTTTTAATTTTTAAAACTTCATAATTTTTTGCCAGACTGACCCATGTAAACATACAAATTACTAATAATTATGCACGTCACATCTGTAATAATGGCCTTCATGTAAACATTTTTGTGGTTTACACATAAAATCTCTAATTACAAAGCTATATTATCTAAAATTACAGTAAGCAAGAAAATTAATCCAAGCTAAGACAATACTTGCAACATCAATTCATCATCTGTGACAAGGACTGCTTAAGTCTCTTTGTGGTTGACGTCATTAATTAACTGGCCTCATGGGCCTTCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAACATGGTCATAGCTGTTTCCTTGCGTATTGGGCGCTCTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGAACCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGGCCGCTACAGGGCGCTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGTTTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGACGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCTAGGCGCGCCAACGCGT(SEQ ID NO:3) 加底線，密碼子優化的ARSA DNA序列(人) 5' AAV2 ITR DNA 序列TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO:4)   flip 方向的 3' AAV2 ITR DNA 序列AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA(SEQ ID NO:5)   CMV 增強子元件 DNA 序列 (GenBank ： K03104.1)GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG(SEQ ID NO:6) 雞 - 肌動蛋白啟動子 DNA 序列TCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCC(SEQ ID NO:7) WPRE 元件 DNA 序列TTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:8)   AAV9 衣殼胺基酸序列 (VP1)         靶向肽胺基酸序列KGGGFHG(SEQ ID NO:10)   側接連接子的靶向肽 - 胺基酸序列AAAKGGGFHGAS(SEQ ID NO:11) AAV1999 衣殼胺基酸序列 (VP1) AAV1999 衣殼胺基酸序列 (VP2)Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Ala Ala Lys Gly Gly Gly Phe His Gly Ala Ser Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu    (SEQ ID NO:13) AAV1999 衣殼胺基酸序列 (VP3)Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Ala Ala Lys Gly Gly Gly Phe His Gly Ala Ser Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu    (SEQ ID NO:14) 載體的全 DNA 序列； ARSA 的編碼序列加底線TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTACGTACAATTGGGATCCCGGACCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTACGTACCACC ATGAGCATGGGAGCCCCTAGATCTCTGCTGCTGGCTCTTGCTGCTGGACTGGCTGTGGCCAGACCTCCTAACATCGTGCTGATCTTCGCCGACGATCTCGGCTATGGCGATCTGGGCTGTTACGGACACCCTAGCAGCACCACACCTAACCTGGATCAACTGGCTGCCGGCGGACTGAGATTCACCGATTTCTACGTGCCCGTGTCTCTGTGCACACCTAGTAGAGCTGCTCTGCTGACAGGCAGACTGCCAGTGCGGATGGGAATGTATCCTGGCGTGCTGGTTCCTAGCAGTAGAGGCGGACTGCCTCTGGAAGAAGTGACAGTTGCTGAAGTGCTGGCCGCCAGAGGCTATCTGACTGGAATGGCCGGAAAATGGCACCTCGGAGTTGGACCTGAAGGCGCTTTTCTGCCTCCTCACCAGGGCTTCCACAGATTTCTGGGCATCCCTTACAGCCACGATCAGGGCCCTTGCCAGAACCTGACCTGCTTTCCTCCTGCCACACCTTGTGATGGCGGCTGTGATCAGGGACTCGTGCCTATTCCTCTGCTGGCCAATCTGAGCGTGGAAGCTCAACCTCCTTGGCTGCCTGGCCTGGAAGCCAGATATATGGCCTTCGCTCACGACCTGATGGCCGACGCTCAGAGACAGGACAGACCATTCTTCCTGTACTACGCCAGCCACCACACACACTACCCTCAGTTCTCTGGCCAGTCCTTCGCCGAGAGATCTGGCAGAGGCCCTTTTGGCGATAGCCTGATGGAACTGGATGCCGCCGTGGGAACACTGATGACAGCCATTGGAGATCTGGGCCTGCTGGAAGAGACACTGGTCATCTTCACCGCCGACAACGGCCCCGAGACAATGAGAATGAGCAGAGGCGGCTGTAGCGGCCTGCTGAGATGTGGCAAGGGAACAACATACGAAGGCGGCGTCAGAGAGCCTGCTCTGGCTTTTTGGCCTGGACATATTGCCCCTGGCGTGACACACGAACTGGCCTCTTCTCTGGATCTGCTGCCTACACTGGCTGCTTTGGCTGGCGCTCCTCTGCCTAATGTGACCCTGGATGGCTTCGATCTGTCTCCACTGCTGCTCGGAACAGGCAAGAGCCCTAGACAGAGCCTGTTCTTCTACCCTAGCTACCCCGATGAAGTGCGGGGAGTGTTTGCCGTGCGGACAGGCAAGTACAAGGCCCACTTTTTTACCCAAGGCAGCGCCCACAGCGATACCACAGCTGATCCTGCTTGTCACGCCTCTAGCAGCCTGACAGCTCATGAACCACCTCTGCTGTACGACCTGTCTAAGGACCCCGGCGAGAACTATAATCTGCTTGGCGGAGTTGCCGGCGCTACACCTGAAGTTCTGCAGGCTCTGAAACAGCTCCAGCTGCTGAAAGCCCAGCTGGACGCTGCTGTGACATTTGGACCTTCTCAGGTGGCAAGAGGCGAGGACCCTGCTCTGCAGATTTGTTGTCACCCTGGCTGTACCCCTAGACCTGCCTGCTGTCACTGTCCTGATCCTCACGCTTGAGATTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGATCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTCGAAATTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA(SEQ ID NO:16) 加底線，密碼子優化的ARSA DNA序列(人)
圖 1A- 圖 1C示出了在MLD(ARSA -/-)的小鼠模型中使用包含兩種不同表現匣的病毒顆粒的體內ARSA表現增加，所述表現匣驅動更好地清除有毒的硫苷脂沈積物(C24-ST)。 圖 1A示出了在所述病毒顆粒中使用的表現匣，一個具有WPRE元件，一個沒有WPRE元件。 圖 1B示出了在向小鼠雙側眼眶後注射所述病毒顆粒後ARSA的表現水準。 圖 1C示出了在向小鼠雙側眼眶後注射所述病毒顆粒後的C24-ST水準。
圖 2表明，AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的晚期MLD(ARSA -/-)小鼠顯示在腦、脊髓和肝臟中ARSA介導的硫酸酯酶活性增加。
圖 3描繪了，AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的晚期MLD(ARSA -/-)小鼠顯示在用劑後3個月腦和脊髓中的硫苷脂水準顯著降低。
圖 4示出了在AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的晚期MLD(ARSA -/-)小鼠的腦中測量的胼胝體髓鞘形成有所改善。
圖 5示出了在AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的晚期MLD(ARSA -/-)小鼠的腦中觀察到髓鞘形成少突膠質細胞和成熟少突膠質細胞數量增加。
圖 6A- 圖 6B示出了在AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的晚期MLD(ARSA -/-)小鼠的腦中ARSA蛋白交叉校正的程度。 圖 6A示出了在投予AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE後三個月後，匹配的矢狀腦半切面的訊號覆蓋。 圖 6B示出了交叉校正因子的熱圖。
圖 7A- 圖 7B表明，AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的早期MLD(ARSA -/-)小鼠在腦、脊髓、背根節(DRG)和肝臟中顯示廣泛的CNS人類ARSA(hARSA)表現和ARSA介導的硫酸酯酶活性增加。 圖 7A表明，用劑後四個月，通過針對人類ARSA的IHC，在矢狀腦切片中觀察到廣泛的ARSA表現。 圖 7B表明，在用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE處理的動物中，腦、脊髓、DRG和肝臟表現出ARSA活性的顯著增加。
圖 8A- 圖 8D示出了在對早期(6個月)ARSA -/-小鼠用AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE用劑後，腦( 圖 8A)、肝臟( 圖 8B)、血漿( 圖 8C)和CSF( 圖 8D)中的硫苷脂水準。投予AAV.rh10-CBA-ARSA-WPRE後，腦、脊髓、肝臟、血漿和CSF中的硫苷脂水準顯著增加。
圖 9A- 圖 9C表明，在低劑量和高劑量的病毒顆粒下，用AAV.rh10-ARSA-FLAG-WPRE投予處理導致非人靈長類動物(NHP)的腦和脊髓中的硫酸酯酶活性顯著增加。 圖 9A示出了腦中的硫酸酯酶活性。 圖 9B示出了脊髓中的硫酸酯酶活性。 圖 9C示出了投予病毒顆粒後的代表性腦切片。
圖 10A和 圖 10B表明，與AAVrh.10相比，衣殼AAV1999在NHP的腦和脊髓中顯示出更高的轉基因表現。 圖 10A示出了投予rAAV顆粒後綠色螢光蛋白(GFP)的表現水準。 圖 10B表明，在所有樣品中，與AAVrh.10處理的NHP相比，AAV1999處理的NHP的腦中GFP表現高93%-123%。
圖 11示出了向NHP投予AAV1999或AAVrh.10後腦中GFP表現的熱圖。
圖 12示出了用eGFP的抗體染色的代表性匹配的腦切片顯示AAV1999處理的NHP中的穩健表現，這表明與AAVrh10相比更優越的生物分佈( 圖 12)。
圖 13示出了在投予包含AAV1999-GFP的顆粒後，NHP的脊髓和DRG中的GFP表現。
圖 14示出了在處理的NHP中，心臟和肝臟中的AAV1999-GFP表現與AAVrh10-GFP相比更低。
圖 15A- 圖 15B示出了在投予AAVrh10-GFP顆粒或AAV1999-GFP顆粒之後，AAVrh10和AAV1999載體基因體在各種組織中的載量。 圖 15A示出了載體基因體在腦、脊髓和DRG中的載量。AAV1999的載體基因體在腦、脊髓和DRG中的載量低於AAVrh10。 圖 15B示出了在投予AAVrh10-GFP或AAV1999-GFP後，載體基因體在肝臟、心臟、肺、腎臟和脾臟中的載量。
圖 16示出了在GFP表現(y軸)與組織載體基因體(x軸)之間的相關性的左移，其中AAV1999的相關性(紅色)左移，表明與AAVrh.10相比，載體的蛋白表現更高且組織劑量更低(約10分之一)。
圖 17示出了用於rAAV顆粒產生的特定質體的載體圖。
圖 18表明，用AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠示出了持續的hARSA mRNA表現。用劑後十三個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死，並且收集腦和脊髓樣品。進行RTdPCR以量化h ARSAmRNA表現，並且將其相對於小鼠 Hprt基因歸一化。每個數據點代表單個動物。FB = 配製緩衝液。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。*＜ 0.05；**＜ 0.01；***＜ 0.001；****＜ 0.0001。WT+FB：用配製緩衝液用劑的野生型小鼠；KO+FB：用配製緩衝液用劑的 ArsaKO小鼠；KO+AAV：用AAV1999-ARSA用劑的 ArsaKO小鼠。
圖 19表明，AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠示出了隨著時間的推移持續的ARSA介導的硫酸酯酶活性。用劑後十三個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死，並且收集腦、脊髓、DRG、坐骨神經、肝臟和血漿樣品。使用硫酸酯酶活性測定測量ARSA介導的硫酸酯酶活性；將資料相對於通過BCA測定測量的總蛋白質歸一化。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。*＜ 0.05；**＜ 0.01；***＜ 0.001；****＜ 0.0001。
圖 20表明，AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠示出了腦和脊髓中溶血硫苷脂水準的顯著改善。用劑後十三個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死，並且收集腦、脊髓、DRG、坐骨神經、肝臟、血漿和CSF樣品。使用LC-MS測量硫苷脂水準。將資料相對於組織重量歸一化：從ng/mL(50 μL)轉換為μg/g。將資料從(30 ul)ng/ml轉換為ng/ml(血漿)，以及從ng/ml(5 ul)轉換為ng/ul(CSF)。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。*＜ 0.05；**＜ 0.01；***＜ 0.001；****＜ 0.0001。
圖 21表明，用AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠示出了關鍵發炎標記表現的顯著改善。用劑後十三個月，對Arsa KO小鼠實施安樂死，並且收集腦和脊髓樣品。進行RTdPCR以量化 Gfap 、 Aif1(Iba1的基因)和 Lamp1水準，相對於小鼠 Hprt基因歸一化。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。*＜ 0.05；**＜ 0.01；***＜ 0.001；****＜ 0.0001。
圖 22表明，將 ArsaKO小鼠用AAV1999-hARSA處理長期顯著降低血漿Nf-L水準(用劑後13個月)。用劑後十三個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死，並且收集血漿樣品。通過Quanterix平臺測量Nf-L水準。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。*＜ 0.05；**＜ 0.01；***＜ 0.001；****＜ 0.0001。
圖 23表明， ArsaKO小鼠示出了聽力隨著時間的推移出現進行性惡化；用AAV1999-ARSA處理阻止聽覺表型的進展：在用劑後4、7、10和13個月，經由放置在麻醉動物頭皮上的電極記錄ABR測量結果。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：雙因素方差分析與圖基多重比較檢定。星號表示KO+FB組相比於KO+AAV組。*= KO+FB相比於KO+AAV；*＜ 0.05；**＜ 0.01；***＜ 0.001；****＜0.0001。
圖 24A- 圖 24C表明，AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠顯示腦和脊髓中MLD相關病理的顯著逆轉：用劑後十三個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死，並且收集腦( 圖 24A)、脊髓( 圖 24B)和DRG( 圖 24C)樣品用於組織病理學評估。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。*＜ 0.05；**＜ 0.01；***＜ 0.001；****＜ 0.0001。
圖 25A- 圖 25C表明，AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠示出了隨著時間的推移持續的ARSA介導的硫酸酯酶活性。用劑後一個月、二個月、三個月和六個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死並且收集腦樣品( 圖 25A)。進行數位PCR(dPCR)以量化每個組織中的AAV1999-ARSA載體水準並且相對於 Rab1a基因歸一化。( 圖 25B和 圖 25C)使用硫酸酯酶活性測定套組(ab204731)測量ARSA介導的硫酸酯酶活性；將資料相對於通過BCA測定測量的總蛋白質歸一化。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：雙因素方差分析與圖基多重比較檢定。
圖 26A- 圖 26F表明，AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠示出了硫苷脂亞型隨著時間的推移的進行性清除。用劑後一個月、二個月、三個月和六個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死並且收集腦樣品。使用LC-MS測量( 圖 26A)溶血硫苷脂、( 圖 26B)C16-硫苷脂亞型和( 圖 26C)C18-硫苷脂亞型。將資料相對於組織重量歸一化：從ng/mL(50 μL)轉換為μg/g。( 圖 26D- 圖 26F)為了闡明硫苷脂清除的進行性性質，對於( 圖 26D)溶血硫苷脂、( 圖 26E)C16-硫苷脂亞型和( 圖 26F)C18-硫苷脂亞型，資料呈現為KO+AAV動物中剩餘的ST相對於KO+FB動物中剩餘的平均ST的百分比。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：雙因素方差分析與圖基多重比較檢定。*＜ 0.05；**＜ 0.01；***＜ 0.001；****＜ 0.0001。
圖 27表明，在用AAV1999-ARSA處理後， ArsaKO小鼠的CSF和血漿中的總硫苷脂水準示出了顯著降低。用劑後一個月、二個月、三個月和六個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死並且收集CSF和血漿樣品。使用LC-MS測量硫苷脂水準。將資料從(30 ul)ng/ml轉換為ng/ml(血漿)，以及從ng/ml(5 ul)轉換為ng/ul(CSF)。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：雙因素方差分析與圖基多重比較檢定。
圖 28示出了，與KO+FB組相比，截至用AAV1999-ARSA用劑後6個月，血漿Nf-L水準的初始增加降低。用劑後一個月、二個月、三個月和六個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死，並且收集血漿樣品。通過Quanterix平臺測量Nf-L水準。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。*＜ 0.05；**＜ 0.01；***＜ 0.001；****＜ 0.0001。
圖 29A- 圖 29D表明，微小嚴重程度的顯微發現發現於AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠的腦中。用劑後一個月、二個月、三個月和六個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死，並且收集腦樣品用於組織病理學分析。每個數據點代表單個動物；將發現根據( 圖 29A)腦幹和小腦變性、( 圖 29B)空泡形成、( 圖 29C)浸潤和( 圖 29D)海馬變性的發生率和嚴重程度分類。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：雙因素方差分析與圖基多重比較檢定。
圖 30A- 圖 30E表明，AAV1999-ARSA處理的 ArsaKO小鼠在DRG和周圍神經中顯示出微小至輕度的發現。用劑後一個月、二個月、三個月和六個月，對 ArsaKO小鼠實施安樂死，並且收集DRG( 圖 30A- 圖 30C)、脊髓( 圖 30D)和坐骨神經( 圖 30E)用於組織病理學分析。每個數據點代表單個動物。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：雙因素方差分析與圖基多重比較檢定。
圖 31示出了NHP腦中的廣泛分佈的劑量依賴性AAV1999-ARSA載體生物分佈。AAV1999-ARSA用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集樣品。將腦切成對半，將其中一個半球快速冷凍；從每個半球中收集64個組織環切樣品(punch)，它們代表灰質(47個環切樣品)和白質(17個環切樣品)。進行數位PCR(dPCR)以量化每個組織環切樣品中的AAV1999載體濃度並且將其相對於TUBB1基因內含子歸一化。每個數據點表示該組織環切樣品的VG/細胞暴露，其為( 左)該組中所有NHP的平均值，或者( 右)按單獨腦區來呈現。誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。對每個NHP用劑。
圖 32示出了在NHP的19個灰質腦區中廣泛分佈的劑量依賴性hARSA mRNA表現。用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集樣品。將腦切成對半，將其中一個半球快速冷凍；從每個半球中收集47個組織環切樣品，它們代表19個灰質區。進行反轉錄數位PCR(RTdPCR)以量化h ARSAmRNA表現，並將其相對於食蟹猴(Macaca fascicularis)次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1(HPRT)基因歸一化。每個數據點表示該組織環切樣品中歸一化的h ARSA表現，其為(左)該組中所有NHP的平均值，或者(右)按單獨腦區來呈現。左：代表中值的散點圖；右：誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。
圖 33A- 圖 33C示出了在NHP的19個灰質腦區中廣泛分佈的劑量依賴性hARSA蛋白表現。AAV1999-ARSA用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集樣品。將腦切成對半，將其中一個半球快速冷凍；從每個半球中收集30個組織環切樣品，它們代表灰質。進行LC-MS以量化人類ARSA蛋白水準。每個數據點代表該組織環切樣品中人類ARSA的量，其為該組中三隻動物的平均值，呈現為( 圖 33A)該組中所有NHP的平均值，( 圖 33B)按每個單獨腦區來呈現，或者( 圖 33C)呈現為與那些環切樣品中的載體基因體的相關性。誤差棒表示平均值與標準誤差。來自1e10 VG/gm(7.5e11 VG)和3.3e10 VG/gm(2.5e12 VG)的資料低於檢測限並且已被排除。左：代表中值的散點圖；右：誤差棒表示平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與圖基多重比較檢定。
圖 34A- 圖 34B示出了沿脊髓頭-尾軸均勻的劑量依賴性AAV1999載體生物分佈以及hARSA mRNA表現。AAV1999-ARSA用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集樣品。將八個具有相鄰DRG的脊髓節段快速冷凍並進行DNA/RNA分離，所述脊髓節段各有兩個來自頸椎、上胸椎、下胸椎和腰椎。( 圖 34A)進行數位PCR(dPCR)以量化AAV1999載體濃度並且將其相對於TUBB1基因內含子歸一化。( 圖 34B)進行RTdPCR以量化h ARSAmRNA表現，並且將其相對於內源HPRT基因歸一化。每個數據點代表該樣品的減去背景的VG/細胞暴露或歸一化的h ARSA表現，其為該組中的所有NHP取平均值。誤差棒表示平均值與標準誤差。
圖 35示出了內臟器官和周圍神經的AAV1999-ARSA載體生物分佈。用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集來自內臟器官的樣品。進行數位PCR(dPCR)以量化每個組織環切樣品中的AAV1999載體濃度並且將其相對於TUBB1基因內含子歸一化。每個數據點代表該組織環切樣品的VG/細胞暴露，其為該組中的所有NHP取平均值。誤差棒表示平均值與標準誤差。
圖 36示出了NHP腦中可能符合在1e11和3.3e11 VG/gm腦重劑量下的治療閾值的人類ARSA蛋白表現。AAV1999-ARSA用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集樣品。將腦切成對半，將其中一個半球快速冷凍；從每個半球中收集30個組織環切樣品，它們代表灰質。進行LC-MS以量化人和內源性食蟹猴cyARSA蛋白水準，並且將其呈現為百分比(huARSA/cyARSA)。每個數據點表示為該組織環切樣品中hARSA與食蟹猴cyARSA蛋白的比率，其為該組中三隻動物的平均值，呈現為( 左)該組中所有NHP的平均值，或者( 右)按每個單獨腦區來呈現。誤差棒表示平均值與標準誤差。
圖 37A- 圖 37B示出了AAV1999-ARSA有效劑量是在治療上有意義的。 圖 37A示出了進行LC-MS以量化來自7名健康3-8歲器官供體的12個腦區中的人類ARSA蛋白水準。組織是從NIH腦庫獲得的。 圖 37B示出了用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集樣品。將腦切成對半，將其中一個半球快速冷凍；從每個半球中收集30個組織環切樣品，它們代表灰質。進行LC-MS以量化人類ARSA蛋白水準。呈現每組的平均ARSA蛋白。發起者呈現了NHP中人類ARSA的百分比，可與健康器官供體腦中的人類ARSA相關。誤差棒表示平均值與標準誤差。
圖 38表明，在任一用劑組中，在AAV1999-ARSA用劑後第1週或第5週(屍檢)的NHP中未觀察到臨床徵兆(功能或行為缺陷)。在用劑前、用劑後第7天和屍檢前(用劑後第5週)，對NHP的35個功能和行為參數進行了測試。將發現評分為「在正常範圍內」或「異常臨床發現」。下方的圖是屍檢時的發現。由CRL獸醫進行功能和行為評估。
圖 39A- 圖 39C表明，CM內注射的AAV1999-ARSA耐受良好，導致預期的Nf-L升高；AAV1999-ARSA既沒有觸發先天性免疫反應也沒有觸發細胞介導的免疫反應。如 圖 39A所示，用劑前和屍檢時，收集CSF，並且通過Quanterix平臺分析Nf-L水準。每個數據點代表該樣品中的Nf-L水準，其為該組中所有NHP的平均值。如 圖 39B所示，在用劑前和用劑後第2天、第-4天、第7天、第14天以及屍檢時分離血漿。使用Luminex測定來確定IL-1b、IL-1RA、IL-6、IL-10、IL-12/23(p40)、IL-15、IL-18、IFN-g、TNF-a、G-CSF、MCP-1、MIP-1b、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-13和IL-17A的濃度。每個數據點代表該樣品中的細胞介素濃度，其為該組中所有NHP的平均值。如 圖 39C所示，使從1e11和3.3e11 VG/gm腦重用劑組的動物分離的PBMC經歷IFN-γ ELISpot。誤差棒代表平均值與標準誤差；統計：單因素方差分析與*圖基和 #鄧尼特多重比較檢定。
圖 40表明，AAV1999-ARSA處理的NHP在四種劑量中顯示出腦中至多輕度的顯微發現。用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集樣品。將腦切成對半，固定其中一個半球用於組織病理學評估。每個數據點代表顯微發現的發生率和嚴重程度，其為該用劑組中所有動物的平均值，以單個核細胞浸潤、神經元或神經纖維變性以及神經膠質增生的類別進行測量。誤差棒表示平均值與標準誤差。
圖 41A- 圖 41B示出了AAV1999-ARSA處理的NHP顯示在NHP的脊髓、橈神經和股神經中至多中度的顯微發現；坐骨神經中的顯著發現。用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集樣品用於組織病理學評估。每個數據點代表顯微發現的發生率和嚴重程度，其為該用劑組中所有動物的平均值，以單個核細胞浸潤、神經元或神經纖維變性以及神經膠質增生的類別進行測量。誤差棒表示平均值與標準誤差。
圖 42A- 圖 42B示出了AAV1999-ARSA處理的NHP顯示當對沿著脊髓頭-尾軸的8個節段取平均值時，DRG中至多輕度的發現。用劑後五週，對NHP實施安樂死，並且收集樣品用於組織病理學評估。在左圖中，每個數據點代表顯微發現的平均發生率和嚴重程度，其為該用劑組的所有動物中8個脊柱節段的DRG的平均值。在右圖中，每個數據點代表每個DRG的顯微發現的發生率和嚴重程度，其為該用劑組中所有動物的平均值。測量的類別是( 圖 42A)變性和壞死以及( 圖 42B)單個核細胞浸潤。誤差棒表示平均值與標準誤差。
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Claims (49)

  1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，所述rAAV顆粒包含 (1) 含有用於表現芳基硫酸酯酶A(ARSA)多肽的表現匣的rAAV載體，其中所述表現匣包含與啟動子和任選地增強子可操作地連接的編碼所述ARSA多肽的基因，和 (2) 含有具有SEQ ID NO: 10的靶向肽的經修飾的AAV9衣殼蛋白。
  2. 如請求項1所述的rAAV顆粒，其中所述ARSA多肽包含SEQ ID NO: 1。
  3. 如請求項1或請求項2所述的rAAV顆粒，其中所述靶向肽在其N末端和C末端側接連接子序列。
  4. 如請求項3所述的rAAV顆粒，其中所組合的靶向肽和連接子序列包含SEQ ID NO: 11。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的rAAV顆粒，其中經修飾的衣殼蛋白具有與SEQ ID NO: 12至少98.5%相同的序列。
  6. 如請求項5所述的rAAV顆粒，其中所述經修飾的衣殼蛋白包含含有SEQ ID NO: 12的序列。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述表現匣包含SEQ ID NO: 2的密碼子優化的ARSA基因。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV載體包含SEQ ID NO: 4的5' AAV2 ITR和SEQ ID NO: 5的3' AAV2 ITR。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述表現匣包含含有SEQ ID NO: 6的CMV增強子元件。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述表現匣包含含有SEQ ID NO: 7的雞β-肌動蛋白啟動子。
  11. 如請求項1-10中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV載體進一步包含WPRE元件。
  12. 如請求項11所述的rAAV顆粒，其中所述WPRE元件包含SEQ ID NO: 8的序列。
  13. 如請求項1-12中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV載體包含SEQ ID NO: 16的序列。
  14. 一種治療有需要的人類患者的異染性白質失養症(MLD)的方法，其包括向所述患者的腦脊液(CSF)投予包含有效量的如請求項1-13中任一項所述的重組腺相關病毒(rAAV)病毒顆粒的組合物。
  15. 如請求項14所述的方法，其中將所述組合物經由腦室內(ICV)投予直接投予至所述患者的CSF。
  16. 如請求項14所述的方法，其中將所述組合物經由直接腦大池(dCM)投予直接投予至所述患者的CSF。
  17. 如請求項14所述的方法，其中將所述組合物用鞘內微導管(IT-CM)直接投予至所述患者的CSF。
  18. 如請求項14-17中任一項所述的方法，其中將所述組合物在所述患者的一生中僅投予一次。
  19. 如請求項14-17中任一項所述的方法，其中將所述組合物每年僅向所述患者投予一次。
  20. 如請求項14-19中任一項所述的方法，其中所述投予使所述患者的ARSA活性增加至少5%。
  21. 如請求項14-19中任一項所述的方法，其中所述投予使所述患者的ARSA活性增加至少10%。
  22. 如請求項14-19中任一項所述的方法，其中所述投予使所述患者的ARSA活性增加至少20%。
  23. 如請求項14-19中任一項所述的方法，其中所述投予使所述患者的ARSA活性增加至少30%。
  24. 如請求項14-19中任一項所述的方法，其中所述投予使所述患者的ARSA活性增加至少50%。
  25. 一種增加有需要的個體的ARSA的表現和/或活性的方法，其包括向所述患者的腦脊液(CSF)投予包含有效量的如請求項1-13中任一項所述的重組腺相關病毒(rAAV)病毒顆粒的組合物。
  26. 一種質體，其包含SEQ ID NO: 3。
  27. 一種密碼子優化的人類ARSA序列，人類ARSA其包含SEQ ID NO: 2。
  28. 一種表現匣，其包含含有SEQ ID NO: 2的密碼子優化的人類ARSA序列。
  29. 如請求項28所述的表現匣，其進一步包含含有SEQ ID NO: 7的雞β-肌動蛋白啟動子。
  30. 如請求項28或請求項29所述的表現匣，其進一步包含含有SEQ ID NO: 6的CMV增強子元件。
  31. 一種載體，其包含如請求項27-30中任一項所述的表現匣。
  32. 如請求項31所述的載體，其進一步包含含有SEQ ID NO: 8的WPRE元件。
  33. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1-13中任一項所述的rAAV顆粒。
  34. 一種套組，其包含如請求項33所述的醫藥組合物。
  35. 一種用於治療MLD的重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其包含 (1) 含有用於表現芳基硫酸酯酶A(ARSA)多肽的表現匣的rAAV載體，其中所述表現匣包含與啟動子和任選地增強子可操作地連接的編碼所述ARSA多肽的基因，和 (2) 含有具有SEQ ID NO: 10的靶向肽的經修飾的AAV9衣殼蛋白。
  36. 如請求項35所述的rAAV顆粒，其中所述ARSA多肽包含SEQ ID NO: 1。
  37. 如請求項35或請求項36所述的rAAV顆粒，其中所述靶向肽在其N末端和C末端側接連接子序列。
  38. 如請求項37所述的rAAV顆粒，其中所組合的靶向肽和連接子序列包含SEQ ID NO: 11。
  39. 如請求項35-38中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述經修飾的AAV9衣殼蛋白是經修飾的VP3衣殼蛋白。
  40. 如請求項35-38中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述經修飾的VP3衣殼蛋白具有與SEQ ID NO: 12至少98.5%相同的序列。
  41. 如請求項40所述的rAAV顆粒，其中經修飾的VP3衣殼蛋白包含含有SEQ ID NO: 12的序列。
  42. 如請求項35-38中任一項所述的rAAV顆粒，其中VP1、VP2和VP3衣殼蛋白是未經修飾的AAV9衣殼蛋白。
  43. 如請求項35-42中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述表現匣包含SEQ ID NO: 2的密碼子優化的ARSA基因。
  44. 如請求項35-43中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV載體包含SEQ ID NO: 4的5' AAV2 ITR和SEQ ID NO: 5的3' AAV2 ITR。
  45. 如請求項35-44中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述表現匣包含含有SEQ ID NO: 6的CMV增強子元件。
  46. 如請求項35-45中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述表現匣包含含有SEQ ID NO: 7的雞β-肌動蛋白啟動子。
  47. 如請求項35-46中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV載體進一步包含WPRE元件。
  48. 如請求項47所述的rAAV顆粒，其中所述WPRE元件具有包含SEQ ID NO: 8的序列。
  49. 如請求項35-48中任一項所述的rAAV顆粒，其中所述rAAV載體具有包含SEQ ID NO: 16的序列。
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