JP2023126919A - バリアントカプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】バリアントカプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法を提供する。【解決手段】本開示は、改変カプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ビリオンであって、野生型AAVと比較して、より高い硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力を示し、そのためより高い網膜細胞の感染力を示し、また、異種核酸を含む、組換えAAV(rAAV)ビリオンを提供する。本開示は、個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。【選択図】図1
Description
視覚は、眼の裏側を覆う薄い層状構造の網膜にある細胞によって媒介される。網膜の裏にある光受容体は、光子の吸収に応答して、双極細胞、水平細胞、及びアマクリン細胞を含めた網膜内の二次及び三次ニューロンを通過する信号処理の流れを開始する。光受容体の下にある網膜色素上皮(RPE)細胞は、視覚サイクル経路を介して光子検出分子11-シスレチナールの再生を促進するため、この光受容体機能を促進するために不可欠である。網膜内層内の網膜神経節細胞(RGC)は、三次ニューロンからの視覚信号を受信し、この視覚信号を活動電位の形態で脳に伝える。
光受容体、RPE、双極細胞、及びその他の細胞における転写物を含めた網膜細胞内で発現される遺伝子変異は、視覚信号処理の破綻及び網膜変性をもたらす。網膜変性疾患の根底にある変異の多くは、光受容体及びRPE細胞の死をもたらす。
アデノ随伴ウイルス(AAV)はParvoviridae科Dependovirus属に属し、この科及び属のメンバーが複製を促進するにはアデノウイルスのようなヘルパーウイルスとの同時感染が必要であり、AAVはヘルパーの不在下では潜伏感染を確立する。ビリオンは25nmの正二十面体のカプシドから構成され、このカプシドは、2つのオープンリーディングフレーム:rep及びcapを有する4.7kbの1本鎖DNAゲノムを包含する。非構造的なrep遺伝子は、ウイルス複製に不可欠な4つの制御タンパク質をコードし、一方capは、集合して60-merのカプシドシェルを形成する3つの構造タンパク質(VP1~3)をコードする。このウイルスカプシドは、ウイルス形質導入の生物学的バリアの多く(細胞表面受容体結合、エンドサイトーシス、細胞内トラフィッキング、及び核内のアンパッケージングを含む)を克服するためのAAVベクターの能力を媒介する。
本開示は、改変カプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ビリオンであって、野生型AAVと比較して、より高い硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力を示し、そのためより高い網膜細胞の感染力を示し、また、異種核酸を含む、組換えAAV(rAAV)ビリオンを提供する。本開示は、個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。
「網膜細胞」という用語は、本明細書では、網膜を構成する任意の細胞タイプ、例えば、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容細胞(桿体及び錐体を含む)、ミュラーグリア細胞、星状細胞(例えば、網膜星状細胞)、ならびに網膜色素上皮を指すことができる。
「AAV」とはアデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)の省略形であり、このウイルス自体またはその派生物を指すために使用することができる。この用語は、別段の要求がある場合を除き、全てのサブタイプと、天然存在形態及び組換え形態の両方とを網羅する。「rAAV」という省略形は、組換えアデノ随伴ウイルス(recombinant adeno-associated virus)を指し、これは組換えAAVベクター(または「rAAVベクター」)とも呼ばれる。「AAV」という用語は、1型AAV(AAV-1)、2型AAV(AAV-2)、3型AAV(AAV-3)、4型AAV(AAV-4)、5型AAV(AAV-5)、6型AAV(AAV-6)、7型AAV(AAV-7)、8型AAV(AAV-8)、9型AAV(AAV-9)、10型AAV(AAV-10)、11型AAV(AAV-11)、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、及びヒツジAAVを含む。例えば、Mori et al.(2004) Virology 330:375を参照。「AAV」という用語は、キメラAAVも含む。「霊長類AAV」とは霊長類から単離されたAAVを指し、「非霊長類AAV」とは非霊長類哺乳類から単離されたAAVを指し、「ウシAAV」とはウシ哺乳類(例えば、乳牛)から単離されたAAVを指すなどとなる。
本明細書で使用する「rAAVベクター」は、AAV由来ではないポリヌクレオチド配列(すなわち、AAVに対し異種のポリヌクレオチド)、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための関心対象配列を含むAAVベクターを指す。概して、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの、概して2つの、AAV逆方向末端反復配列(ITR)と隣接している。rAAVベクターという用語は、rAAVベクター粒子及びrAAVベクタープラスミドの両方を包含する。
「AAVウイルス」または「AAVウイルス粒子」または「rAAVベクター粒子」とは、(典型的には野生型AAVの全てのカプシドタンパク質による)少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドrAAVベクターから構成されたウイルス粒子を指す。この粒子が異種ポリヌクレオチド(すなわち、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子)を含む場合、当該粒子は、典型的には「rAAVベクター粒子」または単に「rAAVベクター」と呼ばれる。したがって、rAAV粒子の産生は必然的にrAAVベクターの産生を含み、そのため、ベクターがrAAV粒子内に含まれる。
「パッケージング」とは、AAV粒子の集成及びカプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。
AAVの「rep」及び「cap」遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製及びカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。AAVのrep及びcapは、本明細書ではAAV「パッケージング遺伝子」と呼ばれる。
AAVのための「ヘルパーウイルス」とは、AAV(例えば、野生型AAV)が哺乳類細胞により複製及びパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。様々なこのようなヘルパーウイルスが当技術分野で知られており、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアのようなポックスウイルスがこれに含まれる。アデノウイルスは複数の異なるサブグループを包含するが、サブグループCの5型アデノウイルスが最も一般的に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳類、及びトリ由来の多数のアデノウイルスが知られており、ATCCのような寄託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)及びエプスタイン・バーウイルス(EBV)、ならびにサイトメガロウイルス(CMV)及び仮性狂犬病ウイルス(PRV)が挙げられ、これらもATCCのような寄託機関から入手可能である。
「ヘルパーウイルス機能(複数可)」とは、(本明細書に記載の他の複製及びパッケージング要件と共に)AAVの複製及びパッケージングを可能にする、ヘルパーウイルスゲノム内でコードされる機能(複数可)を指す。本明細書に記載されているように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または、例えば必須機能(複数可)をコードするポリヌクレオチド配列を途中で産生細胞に提供することによるものを含めた複数の方法で提供され得る。
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、当該ウイルス種が向性である細胞に送達が可能なポリヌクレオチド構成要素を含む、ウイルスまたはウイルス粒子である。この用語は、必ずしもウイルスの任意の複製能力を意味するとは限らない。本明細書で使用する「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子とは、標的細胞にアクセスできる、標的細胞に感染できる、及び標的細胞内で異種核酸を発現できるウイルスまたはウイルス粒子である。したがって、「感染力」とは、ウイルス粒子が標的細胞にアクセスする、標的細胞に感染する、及び標的細胞内で異種核酸を発現する能力を指す。感染力は、in vitro感染力を指す場合もin vivo感染力を指す場合もある。感染性ウイルス粒子を計数するアッセイは、本開示の他の箇所及び当技術分野で説明されている。ウイルス感染力は、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比として表現することができる。総ウイルス粒子は、ウイルスゲノム(vg)コピー数として表現することができる。ウイルス粒子が細胞内で異種核酸を発現する能力は、「形質導入」と呼ぶことができる。ウイルス粒子が細胞内で異種核酸を発現する能力は、複数の技法を用いてアッセイすることができ、このような技法としては、マーカー遺伝子の評価、例えば、(例えば、ウイルスが、GFPをコードするヌクレオチド配列を含む場合)緑色蛍光タンパク質(GFP)アッセイ(GFPは、ウイルス粒子に感染した細胞内で産生され、そして検出及び/または測定される)、あるいは産生されたタンパク質の測定(例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)による測定)が挙げられる。ウイルス感染力は、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比として表現することができる。感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比を決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Grainger et al.(2005) Mol.Ther.11:S337(TCID50感染力価アッセイを説明)、及びZolotukhin et al.(1999) Gene Ther.6:973を参照。
「複製可能」ウイルス(例えば、複製可能AAV)とは、感染性であり、かつ感染細胞内で(すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で)複製されることも可能である、表現型的に野生型のウイルスを指す。AAVの場合には、複製能は、概して、機能的なAAVパッケージング遺伝子の存在を必要とする。概して、本明細書に記載のrAAVベクターは、1つ以上のAAVパッケージング遺伝子が欠如しているために哺乳類細胞内(特に、ヒト細胞内)では複製不可能である。典型的には、このようなrAAVベクターは、AAVパッケージング遺伝子と入ってくるrAAVベクターとの間の組換えにより複製可能AAVが生成される可能性を最小化するため、任意のAAVパッケージング遺伝子配列が欠如している。多くの実施形態において、本明細書に記載のrAAVベクター調製物は、存在するとしても少量の複製可能AAV(rcAAV、別名RCA)を含有する(例えば、102 rAAV粒子当たり約1rcAAV未満、104 rAAV粒子当たり約1rcAAV未満、108 rAAV粒子当たり約1rcAAV未満、1012rAAV粒子当たり約1rcAAV未満、またはrcAAVが存在しない)調製物である。
「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらのアナログがこれに含まれる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログのような修飾ヌクレオチドを含むことができ、また非ヌクレオチド構成要素により遮断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集成の前に付与されても後に付与されてもよい。本明細書で使用するポリヌクレオチドとは、互換的に2本鎖及び1本鎖の分子を指す。別段の指定または要求がない限り、本明細書に記載されている、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、2本鎖形態と、2本鎖形態を形成することが知られているまたは予測される2つの相補的な1本鎖形態の各々との両方を包含する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する一定の「配列同一性」パーセントを有し、これは、アラインメントした場合に、2つの配列を比較すると、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが同じであることを意味する。配列類似性は、複数の異なる方式で決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、方法及びコンピュータープログラムを用いてアラインメントすることができ、コンピュータープログラムとしては、ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手可能なBLASTが挙げられる。もう1つのアラインメントアルゴリズムは、Oxford Molecular Group,Inc.の完全所有子会社Madison,Wisconsin,USAからGenetics Computing Group(GCG)パッケージで入手可能なFASTAである。その他のアラインメント技法は、Methods in Enzymology,vol.266:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),ed.Doolittle,Academic Press,Inc.(Harcourt Brace & Co.,San Diego,California,USAの一部門)で説明されている。特に関心対象となるものは、配列中のギャップを許容するアラインメントプログラムである。スミス・ウォーターマンは、配列アラインメントにおけるギャップを許容するアルゴリズムの1タイプである。Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)を参照。また、ニードルマン及びウンシュのアラインメント法を用いたGAPプログラムも、配列のアラインメントに利用することができる。J.Mol.Biol.48:443-453(1970)を参照。
関心対象は、スミス・ウォーターマンの局所ホモロジーアルゴリズム(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981))を用いて配列同一性を決定するBestFitプログラムである。ギャップ生成ペナルティーは、概して1~5、通常は2~4の範囲となり、多くの実施形態において3となる。ギャップ延長ペナルティーは、概して約0.01~0.20の範囲となり、多くの場合において0.10となる。当該プログラムは、比較対象となる入力された配列により決定されるデフォルトパラメーターを有する。配列同一性は、当該プログラムにより決定されるデフォルトパラメーターを用いて決定されることが好ましい。このプログラムは、Madison,Wisconsin,USA製のGenetics Computing Group(GCG)パッケージからも入手可能である。
もう1つの関心対象プログラムは、FastDBアルゴリズムである。FastDBは、Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,pp.127-149,1988,Alan R.Liss,Inc.で説明されている。配列同一性パーセントは、以下のパラメーターに基づいてFastDBにより計算される。
ミスマッチペナルティー:1.00、
ギャップペナルティー:1.00、
ギャップサイズペナルティー:0.33、及び
連結ペナルティー:30.0。
ミスマッチペナルティー:1.00、
ギャップペナルティー:1.00、
ギャップサイズペナルティー:0.33、及び
連結ペナルティー:30.0。
「遺伝子」とは、転写及び翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることが可能な少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用する「ガイドRNA」という用語は、i)ガイドRNA指向エンドヌクレアーゼ(例えば、クラス2 CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ、例えば、II型、V型、またはVI型CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ)に結合する「アクチベーター」ヌクレオチド配列、及びii)標的核酸とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む「ターゲッター」ヌクレオチド配列を含むRNAを指す。「アクチベーター」ヌクレオチド配列及び「ターゲッター」ヌクレオチド配列は、別々のRNA分子(例えば、「デュアルガイドRNA」)上にあってもよく、同じRNA分子(「シングルガイドRNA」)上にあってもよい。
「低分子干渉」または「短鎖干渉RNA」またはsiRNAは、目的遺伝子(「標的遺伝子」)に対し標的化されたヌクレオチドのRNAデュプレックスである。「RNAデュプレックス」とは、RNA分子の2つの領域間の相補的対合により形成された構造を指す。siRNAは、siRNAのデュプレックス部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に対し相補的である点において、遺伝子に対し「標的化」されている。一部の実施形態において、siRNAのデュプレックスの長さは、30ヌクレオチド未満である。一部の実施形態において、デュプレックスは、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、デュプレックスの長さは、19~25ヌクレオチド長である。siRNAのRNAデュプレックス部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。デュプレックス部分に加えて、ヘアピン構造は、デュプレックスを形成する2つの配列間に位置するループ部分を含有し得る。ループの長さは変動し得る。一部の実施形態において、ループは、5、6、7、8、9、10、11、12、または13ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、3′または5′オーバーハング部分も含有し得る。一部の実施形態において、オーバーハングは、0、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長の3′または5′オーバーハングである。
本明細書で使用する「マイクロRNA」という用語は、任意のタイプの干渉RNAを指し、限定されないが、内在的なマイクロRNA及び人工的なマイクロRNA(例えば、合成miRNA)がこれに含まれる。内在的なマイクロRNAは、ゲノム内で天然にコードされる、mRNAの生産的利用を調節可能な低分子RNAである。人工的なマイクロRNAは、内在的なマイクロRNA以外の、mRNAの活性を調節可能な任意のタイプのRNA配列であり得る。マイクロRNA配列は、これらの配列のいずれか1つ以上から構成されたRNA分子であり得る。マイクロRNA(または「miRNA」)は、Lim,et al.,2003,Genes & Development,17,991-1008、Lim et al.,2003,Science,299,1540、Lee and Ambrose,2001,Science,294,862、Lau et al.,2001,Science 294,858-861、Lagos-Quintana et al.,2002,Current Biology,12,735-739、Lagos-Quintana et al.,2001,Science,294,853-857、及びLagos-Quintana et al.,2003,RNA,9,175-179のような刊行物で説明されている。マイクロRNAの例としては、より大きなRNAの断片である任意のRNA、またはmiRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA、もしくは他の低分子非コードRNAである任意のRNAが挙げられる。例えば、米国特許出願第20050272923号、第20050266552号、第20050142581号、及び第20050075492号を参照。「マイクロRNA前駆体」(または「プレmiRNA」)とは、マイクロRNA配列が中に組み込まれたステムループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロRNA」(または「成熟miRNA」)には、マイクロRNA前駆体(「プレmiRNA」)から切断されたマイクロRNA、または合成された(例えば、実験室でセルフリー合成により合成された)マイクロRNAが含まれ、約19ヌクレオチド~約27ヌクレオチドの長さを有し、例えば、成熟マイクロRNAは、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、または27ntの長さを有する。成熟マイクロRNAは、標的mRNAに結合し、標的mRNAの翻訳を阻害することができる。
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」とは、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限またはライゲーションステップ、及び天然に見いだされるポリヌクレオチドとは異なるコンストラクトをもたらす他の手順の様々な組合せの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、元のポリヌクレオチドコンストラクトの複製物及び元のウイルスコンストラクトの後代をそれぞれ含む。
「調節エレメント」または「調節配列」とは、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含めたポリヌクレオチドの機能的制御に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。この制御は、プロセスの頻度、スピード、または特異性に影響を及ぼし得、また本質的に強化的でも阻害的でもあり得る。当技術分野で公知の調節エレメントとしては、例えば、プロモーター及びエンハンサーのような転写制御配列が挙げられる。プロモーターは、ある特定の条件下でRNAポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流(3′方向)に位置するコード領域の転写を開始することが可能なDNA領域である。
「作用的に結合した」または「作用可能に結合した」とは、期待される方式で作用することが許容される関係にある遺伝子エレメントの並列を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写を開始することを助ける場合、プロモーターはコード領域に対し作用可能に結合している。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在してもよい。
「発現ベクター」とは、関心対象ポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、意図された標的細胞内でタンパク質の発現をもたらすために使用される。また、発現ベクターは、コード領域に対し作用可能に結合して標的内のタンパク質発現を促進する調節エレメントも含む。調節エレメントと、調節エレメントが発現のために作用可能に結合している1つまたは複数の遺伝子との組合せは、「発現カセット」と呼ばれることがあり、多数の発現カセットが当技術分野で公知及び入手可能であり、または当技術分野で入手可能な構成要素から容易に構築することができる。
「異種」とは、比較対象の実体の残りのものとは遺伝子型的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技法により、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。ネイティブなコード配列から取り出され、天然には結合が見いだされないコード配列に作用可能に結合しているプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むrAAVは、天然存在の野生型AAVに通常は含まれない核酸を含むrAAVであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然存在の野生型AAVによって通常はコードされない遺伝子産物である。別の例として、カプシドタンパク質のGHループ内に挿入された異種ペプチドを含むバリアントAAVカプシドタンパク質は、天然存在の野生型AAVに通常は含まれないペプチドの挿入を含むバリアントAAVカプシドタンパク質である。
「遺伝子改変」及び「遺伝子修飾」(ならびにこれらの文法的バリアント)という用語は、本明細書では互換的に使用され、遺伝子エレメント(例えば、ポリヌクレオチド)が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指す。エレメントは、細胞に対し異種であってもよく、または細胞内に既に存在するエレメントの追加コピーもしくは改良バージョンであってもよい。遺伝子改変は、例えば、組換えプラスミドもしくは他のポリヌクレオチドを用いて、当技術分野で公知の任意のプロセス、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法を通じて細胞にトランスフェクションすることにより、またはポリヌクレオチド-リポソーム複合体に接触させることにより、もたらされ得る。また、遺伝子改変は、例えば、DNAまたはRNAのウイルスまたはウイルスベクターによる形質導入または感染によってももたらされ得る。概して、遺伝子エレメントは、細胞内の染色体またはミニ染色体に導入されるが、細胞及びその後代の表現型及び/または遺伝子型を変化させる任意の改変もこの用語に含まれる。
細胞のin vitro延長培養中に、遺伝子配列がその機能を実施するように利用可能である場合、細胞は、遺伝子配列で「安定的に」改変、形質導入、遺伝子修飾、または形質転換されたと言われる。概して、このような細胞は、改変された細胞の後代にも遺伝する遺伝子改変が導入されたという点において、「遺伝的に」改変(遺伝子修飾)されている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。また、これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、リン酸化、または標識構成要素とのコンジュゲートも含む。哺乳類対象に遺伝子産物を送達する文脈で論じられる場合、抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチドなどのようなポリペプチド及びポリペプチドのための組成物は、インタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持する、それぞれのインタクトなポリペプチド、またはその任意の断片もしくは遺伝子操作された派生物を指す。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、及び哺乳類対象への遺伝子産物送達で使用するための他のこのような核酸(レシピエント細胞への送達対象となる「導入遺伝子」と呼ばれ得る)への言及は、インタクトなポリペプチドまたは所望の生化学的機能を有する任意の断片もしくは遺伝子操作された派生物をコードするポリヌクレオチドを含む。
「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、または他の物質とは、物質または同様の物質が天然に存在するまたは最初に調製される場合に共に存在し得る他の構成要素の少なくとも一部を欠いた物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、原料混合物から当該物質を濃縮する精製技法を使用することにより調製することができる。濃縮は、絶対的尺度、例えば、溶液の体積当たりの重量に基づいて測定することができ、または原料混合物中に存在する第2の潜在的妨害物質に対して測定することもできる。本発明の実施形態の濃縮を高めることは、さらにより単離されているということである。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、一部の実施形態において、例えば、約80%~約90%の純度、少なくとも約90%の純度、少なくとも約95%の純度、少なくとも約98%の純度、または少なくとも約99%の純度、またはそれ以上の純度に精製される。
本明細書で使用する「処置」「処置すること」などの用語は、所望の薬理学的及び/または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に防止するという観点で予防的であってもよく、及び/または、疾患、もしくはその疾患に起因し得る有害作用を部分的もしくは完全に治癒するという観点で治療的であってもよい。本明細書で使用する「処置」は、哺乳類、特にヒトにおける任意の疾患処置を網羅し、(a)疾患の素因がある、または疾患にかかるリスクを有する可能性があるがまだ疾患を有すると診断されていない対象における疾患の発生を防止すること、(b)疾患を阻害すること、すなわちその発生を抑止すること、及び(c)疾患を緩和すること、すなわち、疾患の後退を引き起こすことを含む。
「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、限定されないが、ヒト及び非ヒト霊長類(サル及びヒトを含む)、哺乳類の競技用動物(例えば、ウマ、ラクダ等)、哺乳類の家畜(例えば、ヒツジ、ヤギ、乳牛等)、哺乳類のペット(イヌ、ネコ等)、ならびにげっ歯類(例えば、マウス、ラット等)を含めた哺乳類を指す。一部の場合において、個体はヒトである。
本発明についてさらに説明する前に、本発明が、説明する特定の実施形態に限定されず、当然ながらそれ自体が変動し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、このような用語が限定的であるようには意図されていないことも理解されたい。
値の範囲が示されている場合、その間に存在する各値(その範囲の上限と下限との間において、文脈による別段の明確な指示がない限り、下限の10分の1の単位まで)、及びその記述された値または間に存在する値は、本発明に含まれることを理解されたい。これらのより小さな範囲における上限及び下限は、その小さな範囲に独立的に含めることができ、これらは本発明にも包含され、記述範囲における任意の特定的に除外された制限を受ける。記述範囲が上限下限の一方または両方を含む場合、この含まれた上限下限の一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験を行う際には、本明細書に記載の方法及び材料に類似したまたは同等の、任意の方法及び材料を使用することもできるが、ここでは好ましい方法及び材料について説明する。本明細書で言及する全ての刊行物は、これらの刊行物の引用に関連した方法及び/または材料を開示及び説明するため、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の請求項で使用する単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の指示対象を含むことに注意されなければならない。したがって、例えば、「1つのrAAVビリオン」という言及には複数のこのようなビリオンが含まれ、「当該カプシドタンパク質」という言及には、1つ以上のバリアントカプシドタンパク質及び当業者に公知のその等価物への言及が含まれる、などとなる。さらに、請求項がいかなる任意選択の要素も除外するように立案され得ることにも留意されたい。そのため、本記載は、請求項の要素の列挙に関連して、「単に(solely)」、「~のみ(only)」のような排他的用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行的記載としての役目を果たすよう意図されている。
明快性のために別々の実施形態の文脈で記載されている本発明のあるいくつかの特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴は、別々に提供されても任意の好適な部分組合せで提供されてもよい。本発明に関係する実施形態における全ての組合せは、本発明によって明確に包含され、また、この全ての組合せは、あらゆる組合せが個別かつ明示的に開示されているかのごとく、本明細書で開示されている。加えて、様々な実施形態及びその要素における全ての部分組合せも、本発明によって明確に包含され、また、この全ての部分組合せは、あらゆるこのような組合せが個別かつ明示的に本明細書で開示されているかのごとく、本明細書で開示されている。
本明細書で論じられている刊行物は、単に本出願の出願日より前にそれらが開示されていたために提供されている。本明細書のいかなる内容も、本発明が先発明によってこのような刊行物に先行する権利を有しないことを承認するものとして解釈すべきではない。さらに、示される公開日は実際の公開日と異なる可能性があり、実際の公開日は各別に確認する必要があり得る。
本開示は、改変カプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ビリオンであって、野生型AAVと比較して、より高い硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力を示し、そのためより高い網膜細胞の感染力を示し、また、異種核酸を含む、組換えAAV(rAAV)ビリオンを提供する。本開示は、個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。また、本開示は、網膜細胞内に存在する標的核酸を修飾する方法も提供する。
本開示は、改変されたカプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ビリオンであって、野生型AAVと比較して、より高い網膜細胞の感染力を示し、また、異種核酸を含む、組換えAAV(rAAV)ビリオンを提供する。rAAVビリオンは、硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を示す。rAAVビリオンは、対応する網膜細胞向け野生型AAVの感染力と比較して、より高い網膜細胞の感染力を示す。網膜細胞は、光受容体(例えば、桿体、錐体)、網膜神経節細胞(RGC)、ミュラー細胞(ミュラーグリア細胞)、星状細胞(例えば、網膜星状細胞)、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮(RPE)細胞であり得る。本開示はさらに、個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法及び眼疾患を処置する方法を提供する。本開示は、改変カプシドタンパク質を有するrAAVビリオンであって、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節層、または網膜色素上皮に対する局在化の程度と比較して、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの1つ以上に対する少なくとも5倍の局在化の増大を示し、かつ異種核酸を含む、rAAVビリオンを提供する。
バリアントAAVカプシドポリペプチド
本開示は、バリアントAAVカプシドタンパク質を提供する。上述したように、本開示のバリアントAAVカプシドタンパク質は、野生型または他の参照AAVカプシドタンパク質との比較で改変されている。改変には、挿入及びスワップ(例えば、隣接したひと続きのアミノ酸を異なる隣接したひと続きのアミノ酸で置き換えること)が含まれる。
本開示は、バリアントAAVカプシドタンパク質を提供する。上述したように、本開示のバリアントAAVカプシドタンパク質は、野生型または他の参照AAVカプシドタンパク質との比較で改変されている。改変には、挿入及びスワップ(例えば、隣接したひと続きのアミノ酸を異なる隣接したひと続きのアミノ酸で置き換えること)が含まれる。
一部の場合において、本開示のバリアントAAVカプシドタンパク質は、親AAVカプシドタンパク質の表面アクセス可能(例えば、溶媒アクセス可能)部分内の挿入部位における5アミノ酸~20アミノ酸長の異種ペプチドの挿入を含み、これにより、バリアントカプシドタンパク質は、AAVビリオン内に存在するときに、特にAAVビリオンが硝子体内に注射されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の感染力の増大を付与する。したがって、本開示のバリアントAAVカプシドタンパク質は、AAVビリオン内に存在するときに、AAVビリオンにおける硝子体内液(「硝子体液」)と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を付与する。このようなバリアとしては、例えば、内境界膜(ILM)、網膜の細胞外マトリックス、網膜細胞自体の細胞膜、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮が挙げられる。一部の場合において、網膜細胞は、ミュラー細胞である。他の網膜細胞としては、アマクリン細胞、双極細胞、及び水平細胞が挙げられる。「約5アミノ酸~約20アミノ酸の挿入」は、本明細書では「ペプチド挿入」(例えば、異種ペプチド挿入)とも呼ばれる。「対応する親AAVカプシドタンパク質」とは、異種ペプチド挿入を伴わない同じAAV血清型のAAVカプシドタンパク質を指す。一部の場合において、バリアントAAVカプシドは、5アミノ酸~20アミノ酸(例えば、5~7、7~10、10~12、12~15、または15~20アミノ酸)長の単一の異種ペプチド挿入物を含む。
AAVカプシドにおける改変は、スワップ(例えば、隣接したひと続きのアミノ酸を異種ペプチドで置き換えること)である場合もある。したがって、置換えとは、隣接したひと続きのアミノ酸の代わりに異種ペプチドを挿入することである。一部の場合において、本開示のバリアントAAVカプシドタンパク質は、親AAVカプシドタンパク質の表面アクセス可能(例えば、溶媒アクセス可能)部分内のある部位において隣接したひと続きのアミノ酸を5アミノ酸~20アミノ酸長の異種ペプチドで置き換えることを含み、これにより、バリアントカプシドタンパク質は、AAVビリオン内に存在するときに、特にAAVビリオンが硝子体内に注射されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の感染力の増大を付与する。したがって、本開示のバリアントAAVカプシドタンパク質は、AAVビリオン内に存在するときに、AAVビリオンにおける硝子体内液(「硝子体液」)と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を付与する。このようなバリアとしては、例えば、ILM、網膜の細胞外マトリックス、網膜細胞自体の細胞膜、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮が挙げられる。一部の場合において、網膜細胞は、ミュラー細胞である。他の網膜細胞としては、アマクリン細胞、双極細胞、及び水平細胞が挙げられる。「約5アミノ酸~約20アミノ酸の置換え」は、本明細書では「ペプチドスワップ」(例えば、隣接したひと続きのアミノ酸を異種ペプチドで置き換えること)とも呼ばれる。「対応する親AAVカプシドタンパク質」とは、異種ペプチドを伴わない同じAAV血清型のAAVカプシドタンパク質を指す。一部の場合において、バリアントAAVカプシドは、5アミノ酸~20アミノ酸(例えば、5~7、7~10、10~12、12~15、または15~20アミノ酸)長の単一の異種ペプチド置換えを含む。
以下の説明の目的において、「挿入」とは、隣接したひと続きのアミノ酸の置換えを伴わない異種ペプチドの挿入及び隣接したひと続きのアミノ酸を置き換える異種ペプチドの挿入の両方を指す。
挿入部位は、AAVカプシドタンパク質のGHループまたはループIV内にあり、例えば、AAVカプシドタンパク質のGHループまたはループIVの溶媒アクセス可能部分にある。AAVカプシドタンパク質のGHループ/ループIVについては、例えば、van Vliet et al.(2006) Mol.Ther.14:809、Padron et al.(2005) J.Virol.79:5047、及びShen et al.(2007) Mol.Ther.15:1955を参照。例えば、挿入部位は、図6A~6Cに示されているように、AAVカプシドタンパク質のアミノ酸411~650内であり得る。例えば、挿入部位は、図5に示されているように、AAV2のアミノ酸570~611内、AAV1のアミノ酸571~612内、AAV5のアミノ酸560~601内、AAV6のアミノ酸571~612内、AAV7のアミノ酸572~613内、AAV8のアミノ酸573~614内、AAV9のアミノ酸571~612内、またはAAV10のアミノ酸573~614内であり得る。一部の場合において、挿入部位は、AAV2カプシドタンパク質のアミノ酸588と589との間、または異なる血清型のAAV内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、AAV2カプシドタンパク質のアミノ酸587と588との間、または異なる血清型のAAV内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、AAV2カプシドタンパク質のアミノ酸575と576との間、または異なる血清型のAAV内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、AAV2カプシドタンパク質のアミノ酸584と585との間、または異なる血清型のAAV内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、AAV2カプシドタンパク質のアミノ酸590と591との間、または異なる血清型のAAV内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、AAV4カプシドタンパク質のアミノ酸584と585との間、または異なる血清型のAAV内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、AAV5カプシドタンパク質のアミノ酸575と576との間、または異なる血清型のAAV内の対応する挿入部位である。一部の場合において、置換えの部位は、AAV2カプシドタンパク質のアミノ酸584と598との間、または異なる血清型のAAV内の対応する部位である。
一部の場合において、約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5~7、7~10、10~12、12~15、または15~20アミノ酸)長の異種ペプチドは、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、カプシドタンパク質のGHループまたはループIV内の挿入部位に挿入される。例えば、挿入部位は、AAV2のアミノ酸587と588との間、またはAAV2のアミノ酸588と589との間、または別のAAV血清型のカプシドサブユニットの対応する位置であり得る。挿入部位587/588はAAV2カプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5~7、7~10、10~12、12~15、または15~20アミノ酸)長の異種ペプチドは、AAV2以外のAAV血清型(例えば、AAV8、AAV9等)内の対応する部位に挿入されてもよい。当業者であれば、様々なAAV血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づき、任意の所与のAAV血清型のカプシドタンパク質において、どこがAAV2のアミノ酸587~588に対応する挿入部位であるかが分かる。様々なAAV血清型における、AAV2のカプシドタンパク質VP1のアミノ酸570~611(図4参照)に対応する配列を図5に示す。例えば、AAV1についてはGenBankアクセッション番号NP_049542、AAV4についてはGenBankアクセッション番号NP_044927、AAV5についてはGenBankアクセッション番号AAD13756、AAV6についてはGenBankアクセッション番号AAB95459、AAV7についてはGenBankアクセッション番号YP_077178、AAV8についてはGenBankアクセッション番号YP_077180、AAV9についてはGenBankアクセッション番号AAS99264、AAV10についてはGenBankアクセッション番号AAT46337、及びAAVrh10についてはGenBankアクセッション番号AAO88208を参照。祖先AAVカプシドに関しては、例えば、Santiago-Ortiz et al.(2015) Gene Ther.22:934を参照。
例えば、挿入部位は、AAV2のアミノ酸587と588との間、AAV1のアミノ酸590と591との間、AAV5のアミノ酸575と576との間、AAV6のアミノ酸590と591との間、AAV7のアミノ酸589と590との間、AAV8のアミノ酸590と591との間、AAV9のアミノ酸588と589との間、AAV10のアミノ酸588と589との間、またはAAV4のアミノ酸585と586との間であり得る。挿入部位は、図5に下線で示されている。アミノ酸ナンバリングは、図5に示すナンバリングに基づいている。
一部の場合において、主題カプシドタンパク質は、図6A~6Cに記載のアミノ酸配列に対し少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5~7、7~10、10~12、12~15、または15~20アミノ酸)長の異種ペプチドの挿入を有する、アミノ酸配列を含むGHループを含む。
一部の場合において、本開示のバリアントAAVカプシドタンパク質は、親AAVカプシドの表面アクセス可能(例えば、溶媒アクセス可能)部分内における連続したアミノ酸のセグメント(または配列)の置換え(または置換)を含み、これにより、バリアントカプシドタンパク質は、AAVビリオン内に存在するときに、特にAAVビリオンが硝子体内に注射されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の感染力の増大を付与する。したがって、配列置換を含む主題バリアントAAVカプシドタンパク質は、AAVビリオン内に存在するときに、AAVビリオンにおける硝子体液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を付与する。このようなバリアとしては、例えば、内境界膜、網膜の細胞外マトリックス、及び網膜細胞自体の細胞膜が挙げられる。「連続した約5アミノ酸~連続した約25アミノ酸の置換え」は、本明細書では「ループスワップ」(すなわち、異種ペプチド置換)とも呼ばれる。このような場合における「対応する親AAVカプシドタンパク質」とは、主題ループスワップを伴わない同じAAV血清型のAAVカプシドタンパク質を指す。一部の場合において、バリアントAAVカプシドは、隣接した5アミノ酸~隣接した25アミノ酸長、例えば、5~9、9~11、10~15、15~20、または20~25アミノ酸長の異種ペプチド置換を含む。
一部の場合において、約5アミノ酸~約25アミノ酸(例えば、5~9、9~10、10~15、15~20、または20~25アミノ酸)長の異種ペプチドは、対応する親AAVカプシドタンパク質内の相当数の連続したアミノ酸に対し置換される。一部の実施形態において、置換は、AAV2のアミノ酸588前後、または別のAAV血清型のカプシドサブユニットの対応する位置で開始し、AAV2のアミノ酸598前後、または別のAAV血清型のカプシドサブユニットの対応する位置で終了する。残基588~598はAAV2 VP1カプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。約5アミノ酸~約25アミノ酸長の異種ペプチドは、AAV2以外のAAV血清型(例えば、AAV8、AAV9等)内の対応する部位に置換されてもよい。当業者であれば、様々なAAV血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づき、任意の所与のAAV血清型のカプシドタンパク質において、どこがAAV2のアミノ酸588~598に対応する置換部位であるかが分かる。様々なAAV血清型における、AAV2のカプシドタンパク質VP1のアミノ酸588~598(図4参照)に対応するアミノ酸残基を図5に示す。例えば、AAV1についてはGenBankアクセッション番号NP_049542、AAV4についてはGenBankアクセッション番号NP_044927、AAV5についてはGenBankアクセッション番号AAD13756、AAV6についてはGenBankアクセッション番号AAB95459、AAV7についてはGenBankアクセッション番号YP_077178、AAV8についてはGenBankアクセッション番号YP_077180、AAV9についてはGenBankアクセッション番号AAS99264、AAV10についてはGenBankアクセッション番号AAT46337、及びAAVrh10についてはGenBankアクセッション番号AAO88208を参照。
一部の場合において、約5アミノ酸~約25アミノ酸(例えば、5~9、9~10、10~15、15~20、または20~25アミノ酸)長の異種ペプチドは、対応する親AAVカプシドタンパク質内の相当数の連続したアミノ酸に対し置換される。一部の実施形態において、置換は、AAV2のアミノ酸585前後、または別のAAV血清型のカプシドサブユニットの対応する位置で開始し、AAV2のアミノ酸598前後、または別のAAV血清型のカプシドサブユニットの対応する位置で終了する。残基585~598はAAV2 VP1カプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。約5アミノ酸~約25アミノ酸長の異種ペプチドは、AAV2以外のAAV血清型(例えば、AAV8、AAV9等)内の対応する部位に置換されてもよい。当業者であれば、様々なAAV血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づき、任意の所与のAAV血清型のカプシドタンパク質において、どこがAAV2のアミノ酸585~598に対応する置換部位であるかが分かる。様々なAAV血清型における、AAV2のカプシドタンパク質VP1のアミノ酸585~598(図4参照)に対応するアミノ酸残基を図5に示す。例えば、AAV1についてはGenBankアクセッション番号NP_049542、AAV4についてはGenBankアクセッション番号NP_044927、AAV5についてはGenBankアクセッション番号AAD13756、AAV6についてはGenBankアクセッション番号AAB95459、AAV7についてはGenBankアクセッション番号YP_077178、AAV8についてはGenBankアクセッション番号YP_077180、AAV9についてはGenBankアクセッション番号AAS99264、AAV10についてはGenBankアクセッション番号AAT46337、及びAAVrh10についてはGenBankアクセッション番号AAO88208を参照。
挿入/置換えペプチド
上述したように、約5アミノ酸~約20アミノ酸長の異種ペプチドは、AAVカプシドのGHループ内に挿入されるか、またはAAVカプシドのGHループ内の相当数の連続したアミノ酸を置き換える。簡潔さのため、「挿入ペプチド」という用語は、以下、親AAVカプシド内に挿入されるペプチド及び、AAVカプシドのGHループ内の隣接したアミノ酸のセグメントを置き換えるペプチドの両方を説明するために使用される。一部の場合において、挿入ペプチドは、5アミノ酸~20アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、7アミノ酸~15アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、9アミノ酸~15アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、9アミノ酸~12アミノ酸の長さを有する。挿入ペプチドは、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、または20アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、7アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、8アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、9アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、10アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、11アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、12アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、13アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、14アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、15アミノ酸の長さを有する。
上述したように、約5アミノ酸~約20アミノ酸長の異種ペプチドは、AAVカプシドのGHループ内に挿入されるか、またはAAVカプシドのGHループ内の相当数の連続したアミノ酸を置き換える。簡潔さのため、「挿入ペプチド」という用語は、以下、親AAVカプシド内に挿入されるペプチド及び、AAVカプシドのGHループ内の隣接したアミノ酸のセグメントを置き換えるペプチドの両方を説明するために使用される。一部の場合において、挿入ペプチドは、5アミノ酸~20アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、7アミノ酸~15アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、9アミノ酸~15アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、9アミノ酸~12アミノ酸の長さを有する。挿入ペプチドは、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、または20アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、7アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、8アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、9アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、10アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、11アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、12アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、13アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、14アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、15アミノ酸の長さを有する。
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式Iのペプチド:LA(L/N)(I/Q)(Q/E)(D/H)(S/V)(M/K)(R/N)A(配列番号136)である。
一部の場合において、式Iのペプチドは、(21)LALIQDSMRA(配列番号35)のアミノ酸配列を含む。一部の場合において、式Iのペプチドは、(22)LANQEHVKNA(配列番号2)のアミノ酸配列を含む。
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式IIのペプチド:TX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 GLX9 (配列番号137)である。式中、X1 が、G、V、またはSであり、X2 が、V、E、P、G、D、M、A、またはSであり、X3 が、M、V、Y、H、G、S、またはDであり、X4 が、R、D、S、G、V、Y、T、H、またはMであり、X5 が、S、L、G、T、Q、P、またはAであり、X6 が、T、A、S、M、D、Q、またはHであり、X7 が、N、G、S、L、M、P、G、またはAであり、X8 が、S、G、D、N、A、I、P、またはTであり、X9 が、SまたはNである。
式IIのペプチド挿入物としては、限定されないが、(1)TGVMRSTNSGLN(配列番号6)、(2)TGEVDLAGGGLS(配列番号7)、(3)TSPYSGSSDGLS(配列番号8)、(4)TGGHDSSLDGLS(配列番号9)、(5)TGDGGTTMNGLS(配列番号98)、(6)TGGHGSAPDGLS(配列番号99)、(7)TGMHVTMMAGLN(配列番号100)、(8)TGASYLDNSGLS(配列番号101)、(9)TVVSTQAGIGLS(配列番号135)、(10)TGVMHSQASGLS(配列番号21)、(11)TGDGSPAAPGLS(配列番号22)、及び(12)TGSDMAHGTGLS(配列番号23)が挙げられる。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(1)TGVMRSTNSGLN(配列番号6)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(2)TGEVDLAGGGLS(配列番号7)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(3)TSPYSGSSDGLS(配列番号8)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(4)TGGHDSSLDGLS(配列番号9)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(5)TGDGGTTMNGLS(配列番号98)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(6)TGGHGSAPDGLS(配列番号99)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(7)TGMHVTMMAGLN(配列番号100)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(8)TGASYLDNSGLS(配列番号101)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(9)TVVSTQAGIGLS(配列番号20)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(10)TGVMHSQASGLS(配列番号21)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(11)TGDGSPAAPGLS(配列番号22)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(12)TGSDMAHGTGLS(配列番号23)である。
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式IIIのペプチド:TGX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 GLS(配列番号138)である。式中、X1 が、V、E、P、G、D、M、A、またはSであり、X2 が、M、V、Y、H、G、S、またはDであり、X3 が、R、D、S、G、V、Y、T、H、またはMであり、X4 が、S、L、G、T、Q、P、またはAであり、X5 が、T、A、S、M、D、Q、またはHであり、X6 が、N、G、S、L、M、P、G、またはAであり、X7 が、S、G、D、N、A、I、P、またはTである。
式IIIのペプチド挿入物としては、限定されないが、(2)TGEVDLAGGGLS(配列番号7)、(4)TGGHDSSLDGLS(配列番号9)、(5)TGDGGTTMNGLS(配列番号98)、(6)TGGHGSAPDGLS(配列番号99)、(8)TGASYLDNSGLS(配列番号101)、(10)TGVMHSQASGLS(配列番号21)、(11)TGDGSPAAPGLS(配列番号22)、及び(12)TGSDMAHGTGLS(配列番号23)が挙げられる。
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式IVのペプチド:X1 GX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 GLSPX9 TX10X11(配列番号139)である。式中、X1 が、TまたはNであり、X2 が、L、S、A、またはGであり、X3 が、DまたはVであり、X4 が、A、G、またはPであり、X5 が、TまたはDであり、X6 が、RまたはYであり、X7 が、D、T、またはGであり、X8 が、H、R、またはTであり、X9 が、VまたはAであり、X10が、GまたはWであり、X11が、TまたはAである。
式IVのペプチド挿入物としては、限定されないが、(13)TGLDATRDHGLSPVTGT(配列番号24)、(14)TGSDGTRDHGLSPVTWT(配列番号25)、(15)NGAVADYTRGLSPATGT(配列番号26)、及び(16)TGGDPTRGTGLSPVTGA(配列番号27)が挙げられる。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(13)TGLDATRDHGLSPVTGT(配列番号24)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(14)TGSDGTRDHGLSPVTWT(配列番号25)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(15)NGAVADYTRGLSPATGT(配列番号26)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(16)TGGDPTRGTGLSPVTGA(配列番号27)である。
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式Vのペプチド:TGX1 DX2 TRX3 X4 GLSPVTGT(配列番号140)のペプチドである。式中、X1 が、L、S、A、またはGであり、X2 が、A、G、またはPであり、X8 が、D、T、またはGであり、X4 が、H、R、またはTである。
式Vのペプチド挿入物としては、限定されないが、(13)TGLDATRDHGLSPVTGT(配列番号24)、(14)TGSDGTRDHGLSPVTWT(配列番号25)、及び(16)TGGDPTRGTGLSPVTGA(配列番号27)が挙げられる。
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式VIのペプチド:LQX1 X2 X3 RX4 X5 X6 X7 X8 X9 VNX10Q(配列番号141)である。式中、X1 が、KまたはRであり、X2 が、N、G、またはAであり、X3 が、A、V、N、またはDであり、X4 が、P、I、またはQであり、X5 が、A、P、またはVであり、X6 が、S、T、またはGであり、X7 が、TまたはVであり、X8 が、E、L、A、またはVであり、X9 が、S、E、D、またはVであり、X10が、F、G、T、またはCである。
式VIのペプチドとしては、限定されないが、(17)LQKNARPASTESVNFQ(配列番号28)、(18)LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号29)、(19)LQRGNRPVTTADVNTQ(配列番号30)、及び(20)LQKADRQPGVVVVNCQ(配列番号31)が挙げられる。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(17)LQKNARPASTESVNFQ(配列番号28)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(18)LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号29)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(19)LQRGNRPVTTADVNTQ(配列番号30)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(20)LQKADRQPGVVVVNCQ(配列番号31)である。
上述したペプチド挿入物のいずれも、AAVカプシドポリペプチドのGHループ内の同じ数の隣接したアミノ酸を置き換えることができる。例えば、一部の場合において、式VIのペプチド:LQX1 X2 X3 RX4 X5 X6 X7 X8 X9 VNX10Q(配列番号141)(式中、X1 が、KまたはRであり、X2 が、N、G、またはAであり、X3 が、A、V、N、またはDであり、X4 が、P、I、またはQであり、X5 が、A、P、またはVであり、X6 が、S、T、またはGであり、X7 が、TまたはVであり、X8 が、E、L、A、またはVであり、X9 が、S、E、D、またはVであり、X10が、F、G、T、またはCである)は、AAVカプシドポリペプチドのGHループ内の隣接したひと続きの5アミノ酸~20アミノ酸を置き換える。言い換えれば、一部の場合において、「挿入ペプチド」は、AAVカプシドポリペプチドのGHループ内に存在する内在的なペプチド(例えば、隣接したひと続きの5アミノ酸~20アミノ酸)を置き換えて、GHループ内に異種ペプチドを含むバリアントAAVカプシドをもたらす。一部の場合において、「挿入ペプチド」は、挿入ペプチドと同じ長さの内在的な隣接したひと続きのアミノ酸を置き換える。したがって、例えば「挿入ペプチド」が16アミノ酸長を有するとき、一部の場合において、内在的な隣接したひと続きの16アミノ酸は、この挿入ペプチドで置き換えられる。
式VIのペプチドとしては、限定されないが、(17)LQKNARPASTESVNFQ(配列番号28)、(18)LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号29)、(19)LQRGNRPVTTADVNTQ(配列番号30)、及び(20)LQKADRQPGVVVVNCQ(配列番号31)が挙げられる。一部の場合において、AAVカプシドのGHループ内の内在的なアミノ酸配列を置き換えるペプチドは、(17)LQKNARPASTESVNFQ(配列番号28)である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、(18)LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号29)である。一部の場合において、AAVカプシドのGHループ内の内在的なアミノ酸配列を置き換えるペプチドは、(19)LQRGNRPVTTADVNTQ(配列番号30)である。一部の場合において、AAVカプシドのGHループ内の内在的なアミノ酸配列を置き換えるペプチドは、(20)LQKADRQPGVVVVNCQ(配列番号31)である。
一部の場合において、式I~VIのいずれか1つのペプチド挿入物はさらに、ペプチドのN末端に1つまたは2つのリンカーアミノ酸を、及び/またはペプチドのC末端に1つ以上のアミノ酸を含む。例えば、一部の場合において、ペプチド挿入物は、Thr-Gly-[式I~VIのいずれか1つのペプチド]-Gly-Leu-Ser(配列番号142)を含む。別の例として、一部の場合において、ペプチド挿入物は、Leu-Ala-[式I~VIのいずれか1つのペプチド]-Ala(配列番号143)を含む。別の例として、一部の場合において、ペプチド挿入物は、Leu-Gln-[式I~VIのいずれか1つのペプチド]-Glnを含む。一部の場合において、ペプチド挿入物は、いかなるリンカーアミノ酸も含まない。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンカプシドは、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入以外には、他のいかなるアミノ酸の置換、挿入、または欠失も含まない。他の実施形態において、主題rAAVビリオンカプシドは、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入に加えて、親AAVカプシドタンパク質との比較で1~約25アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。例えば、一部の実施形態において、主題rAAVビリオンカプシドは、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入に加えて、親AAVカプシドタンパク質との比較で1~約5、約5~約10、約10~約15、約15~約20、または約20~約25アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。ある特定の実施形態において、親AAVカプシドタンパク質との比較で1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸)の欠失は、ペプチド挿入の部位で生じる。
一部の場合において、本開示のバリアントAAVカプシドポリペプチドは、アミノ酸置換:Y273F、Y444F、Y500F、及びY730Fのうちの1つ、2つ、3つ、または4つを含まない。
一部の場合において、本開示のバリアントAAVカプシドポリペプチドは、上述した挿入ペプチドに加えて、アミノ酸置換:Y273F、Y444F、Y500F、及びY730Fのうちの1つ、2つ、3つ、または4つを含む。
一部の場合において、本開示のバリアントrAAVカプシドポリペプチドは、キメラカプシドであり、例えば、カプシドは、第1のAAV血清型のAAVカプシドの一部分と第2の血清型のAAVカプシドの一部分とを含み、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入を含む。
組換えAAVビリオン
本開示は、i)本開示のバリアントAAVカプシドポリペプチドと、ii)異種ポリペプチド(すなわち、非AAVポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えAAV(rAAV)ビリオンを提供する。
本開示は、i)本開示のバリアントAAVカプシドポリペプチドと、ii)異種ポリペプチド(すなわち、非AAVポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えAAV(rAAV)ビリオンを提供する。
一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、図4に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入とを含む。一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、図4に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、図4に示されるアミノ酸配列との対比でアミノ酸587と588との間、または対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で対応する部位における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入とを含む。
一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、図4に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入とを含む。一部の場合において、主題rAAVビリオンは、図4に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、図4に示されるアミノ酸配列との対比でアミノ酸585と598との間、または対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で対応する部位における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入とを含む。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、図5に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むGHループを含むカプシドタンパク質と、太字及び下線で示されたアミノ酸間における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入とを含む。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、図6A~6Cに示されるアミノ酸配列のいずれか1つに対し少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、アミノ酸587と588との間、または別のAAV遺伝子型との対比で対応する部位における約5アミノ酸~約20アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸、例えば、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、または12アミノ酸)の挿入とを含む。一部の場合において、対応する挿入部位は、図6Bで太字テキスト及び下線で示されている部位である。
本開示のrAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の網膜細胞の感染力の増大を示す。
所与のrAAVビリオンが網膜細胞の感染力の増大を示すかどうかは、rAAVビリオンの硝子体内投与の後に、網膜細胞におけるrAAVビリオンによりコードされる異種遺伝子産物の発現を検出することにより決定することができる。例えば、a)上述したペプチド挿入物またはペプチド置換えを含む本開示のバリアントカプシドと、b)異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む、本開示のrAAVビリオンは、硝子体内に投与されたときに、a)ペプチド挿入物もペプチド置換えも含まない対照AAVカプシドと、b)異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む、対照rAAVビリオンが、硝子体内に投与されたときにもたらす網膜細胞における遺伝子産物レベルよりも、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超である網膜細胞における異種遺伝子産物レベルをもたらす。
所与のrAAVビリオンが網膜細胞の感染力の増大を示すかどうかは、網膜細胞におけるrAAVビリオンによりコードされる治療用遺伝子産物の治療効果を評価することにより決定することができる。治療効果としては、例えば、a)視覚機能(例えば、視野、視力)の喪失速度の低下、b)視覚機能の改善(例えば、視野または視力の改善)、c)光に対する敏感性(すなわち、羞明)の低下、眼球振とうの低下等が挙げられ得る。例えば、a)上述したペプチド挿入物またはペプチド置換えを含む本開示のバリアントカプシドと、b)異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む、本開示のrAAVビリオンは、硝子体内に投与されたときに、a)ペプチド挿入物もペプチド置換えも含まない対照AAVカプシドと、b)治療用異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む、対照rAAVビリオンが、硝子体内に投与されたときにもたらす網膜細胞における治療効果よりも、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超である網膜細胞における治療効果をもたらす。視覚機能の試験は当技術分野において公知であり、任意のこのような試験が、本開示のrAAVビリオンが網膜細胞の感染力の増大を示すかどうかを決定するために使用することができる。
本開示のrAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質(すなわち、挿入ペプチドも置換えペプチドも伴わないAAVカプシドタンパク質)を含む対照AAVビリオンの能力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の、硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を示す。
一部の場合において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の網膜細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる光受容体(桿体または錐体)細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超増大した光受容体細胞の感染力を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオンによる光受容体(桿体または錐体)細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の光受容体細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによるRGCの感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のRGCの感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオンによるRGCの感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のRGCの感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによるRPE細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のRPE細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオン細胞によるRPE細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のRPE細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによるミュラー細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のミュラー細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオン細胞によるミュラー細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のミュラー細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる双極細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の双極細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオン細胞による双極細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の双極細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによるアマクリン細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のアマクリン細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオン細胞によるアマクリン細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のアマクリン細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる水平細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の水平細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオン細胞による水平細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の水平細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜星状細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の網膜星状細胞の感染力の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオンによる網膜星状細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の網膜星状細胞の感染力の増大を示す。
一部の場合において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンにおける網膜細胞外マトリックス(ECM)を横断する能力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の網膜ECMを横断する能力の増大を示す。
一部の場合において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオンにおける網膜細胞外マトリックス(ECM)を横断する能力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のECMを横断する能力の増大を示す。
一部の場合において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンにおける内境界膜(ILM)を横断する能力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のILMを横断する能力の増大を示す。
一部の場合において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオンにおけるILMを横断する能力と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のILMを横断する能力の増大を示す。
主題rAAVビリオンは、ILMを横断することができ、また、ミュラー細胞、アマクリン細胞等を含めた細胞層を通過して、光受容体細胞及びまたはRPE細胞に到達することもできる。例えば、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、ILMを横断することができ、また、ミュラー細胞、アマクリン細胞等を含めた細胞層を通過して、光受容体細胞及びまたはRPE細胞に到達することもできる。
一部の場合において、主題rAAVビリオンは、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節層、または網膜色素上皮に対する局在化の程度と比較して、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの1つ以上に対する少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の局在化の増大を示す。
一部の場合において、主題rAAVビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによるILMを越えた局在化の程度と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のILMを越えた局在化の増大を示す。例えば、一部の場合において、主題rAAVビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる網膜色素上皮(RPE)層に対する局在化の程度と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のRPEに対する局在化の増大を示す。別の例として、一部の場合において、主題rAAVビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる光受容体(PR)層に対する局在化と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超のPR層に対する局在化の増大を示す。別の例として、一部の場合において、主題rAAVビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる内顆粒層に対する局在化の程度と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の内顆粒層に対する局在化の増大を示す。別の例として、一部の場合において、主題rAAVビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる外顆粒層に対する局在化の程度と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の外顆粒層に対する局在化の増大を示す。別の例として、一部の場合において、主題rAAVビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる神経節細胞層に対する局在化と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の神経節細胞層に対する局在化の増大を示す。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、網膜細胞に選択的に感染し、例えば、主題rAAVビリオンは、非網膜細胞(例えば、眼以外の細胞)に対し10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、または50倍超の特異性で網膜細胞に感染する。例えば、一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、網膜細胞に選択的に感染し、例えば、主題rAAVビリオンは、非網膜細胞(例えば、眼以外の細胞)に対し10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、または50倍超の特異性で光受容体細胞に感染する。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、光受容体細胞に選択的に感染し、例えば、主題rAAVビリオンは、眼内に存在する非光受容体細胞(例えば、網膜神経節細胞、ミュラー細胞等)に対し10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、または50倍超の特異性で光受容体細胞に感染する。
一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのAAVビリオン細胞による光受容体細胞の感染力と比較して、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超の光受容体細胞の感染力の増大を示す。
遺伝子産物
本開示のrAAVビリオンは、1つ以上の遺伝子産物(1つ以上の異種遺伝子産物)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。一部の場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドである。一部の場合において、遺伝子産物は、RNAである。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、異種核酸遺伝子産物及び異種ポリペプチド遺伝子産物の両方をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物がRNAである場合、一部の場合において、RNA遺伝子産物は、ポリペプチドをコードする。遺伝子産物がRNAである場合、一部の場合において、RNA遺伝子産物は、ポリペプチドをコードしない。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、1つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、2つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が2つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、2つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターに対し作用可能に結合している。単一の異種核酸が2つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、2つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、2つの異なるプロモーターに対し作用可能に結合している。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、3つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が3つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、3つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターに対し作用可能に結合している。単一の異種核酸が3つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、3つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、2つまたは3つの異なるプロモーターに対し作用可能に結合している。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、2つの異種核酸であって、各々が1つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、2つの異種核酸を含む。
本開示のrAAVビリオンは、1つ以上の遺伝子産物(1つ以上の異種遺伝子産物)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。一部の場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドである。一部の場合において、遺伝子産物は、RNAである。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、異種核酸遺伝子産物及び異種ポリペプチド遺伝子産物の両方をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物がRNAである場合、一部の場合において、RNA遺伝子産物は、ポリペプチドをコードする。遺伝子産物がRNAである場合、一部の場合において、RNA遺伝子産物は、ポリペプチドをコードしない。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、1つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、2つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が2つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、2つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターに対し作用可能に結合している。単一の異種核酸が2つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、2つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、2つの異なるプロモーターに対し作用可能に結合している。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、3つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が3つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、3つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターに対し作用可能に結合している。単一の異種核酸が3つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、3つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、2つまたは3つの異なるプロモーターに対し作用可能に結合している。一部の場合において、本開示のrAAVビリオンは、2つの異種核酸であって、各々が1つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、2つの異種核酸を含む。
一部の場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドをコードするRNAである。一部の場合において、遺伝子産物は、干渉RNAである。一部の場合において、遺伝子産物は、アプタマーである。一部の場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドである。一部の場合において、遺伝子産物は、治療用ポリペプチド、例えば、臨床的利益をもたらすポリペプチドである。一部の実施形態において、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、遺伝子産物は、標的核酸の修飾をもたらすRNAガイドエンドヌクレアーゼである。一部の場合において、遺伝子産物は、i)標的核酸の修飾をもたらすRNAガイドエンドヌクレアーゼ、及びii)標的核酸内の標的配列に結合する第1のセグメントと、RNAガイドエンドヌクレアーゼに結合する第2のセグメントとを含む、ガイドRNAである。一部の場合において、遺伝子産物は、i)標的核酸の修飾をもたらすRNAガイドエンドヌクレアーゼ、ii)標的核酸内の第1の標的配列に結合する第1のセグメントと、RNAガイドエンドヌクレアーゼに結合する第2のセグメントとを含む、第1のガイドRNA、及びiii)標的核酸内の第2の標的配列に結合する第1のセグメントと、RNAガイドエンドヌクレアーゼに結合する第2のセグメントとを含む、第1のガイドRNAである。
干渉RNA
遺伝子産物が干渉RNA(RNAi)である場合、好適なRNAiとしては、細胞におけるアポトーシス因子または血管新生因子のレベルを低下させるRNAiが挙げられる。例えば、RNAiは、細胞におけるアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを低減するshRNAまたはsiRNAであり得る。遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書では「アポトーシス促進遺伝子」と呼ばれ、このような遺伝子の産物(mRNA、タンパク質)は、「アポトーシス促進遺伝子産物」と呼ばれる。アポトーシス促進遺伝子産物としては、例えば、Bax、Bid、Bak、及びBad遺伝子産物が挙げられる。例えば、米国特許第7,846,730号を参照。
遺伝子産物が干渉RNA(RNAi)である場合、好適なRNAiとしては、細胞におけるアポトーシス因子または血管新生因子のレベルを低下させるRNAiが挙げられる。例えば、RNAiは、細胞におけるアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを低減するshRNAまたはsiRNAであり得る。遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書では「アポトーシス促進遺伝子」と呼ばれ、このような遺伝子の産物(mRNA、タンパク質)は、「アポトーシス促進遺伝子産物」と呼ばれる。アポトーシス促進遺伝子産物としては、例えば、Bax、Bid、Bak、及びBad遺伝子産物が挙げられる。例えば、米国特許第7,846,730号を参照。
また、干渉RNAは、血管新生産物、例えば、血管内皮増殖因子(VEGF)(例えば、Cand5、例えば、米国特許公開第2011/0143400号、米国特許公開第2008/0188437号、及びReich et al.(2003) Mol.Vis.9:210を参照)、VEGF受容体1(VEGFR1)(例えば、Sirna-027、例えば、Kaiser et al.(2010) Am.J.Ophthalmol.150:33、及びShen et al.(2006) Gene Ther.13:225を参照)、またはVEGF受容体2(VEGFR2)(Kou et al.(2005) Biochem.44:15064)に対するものでもあり得る。米国特許第6,649,596号、第6,399,586号、第5,661,135号、第5,639,872号、及び第5,639,736号、ならびに米国特許第7,947,659号及び第7,919,473号も参照。
アプタマー
遺伝子産物がアプタマーである場合、例示的な関心対象アプタマーとしては、VEGFに対するアプタマーが挙げられる。例えば、Ng et al.(2006) Nat.Rev.Drug Discovery 5:123、及びLee et al.(2005) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:18902を参照。例えば、VEGFアプタマーは、ヌクレオチド配列5′-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3′(配列番号3)を含むことができる。また、血小板由来成長因子(PDGF)特異的アプタマー(例えば、E10030)も使用に好適である。例えば、Ni and Hui(2009) Ophthalmologica 223:401、及びAkiyama et al.(2006) J.Cell Physiol.207:407を参照。
遺伝子産物がアプタマーである場合、例示的な関心対象アプタマーとしては、VEGFに対するアプタマーが挙げられる。例えば、Ng et al.(2006) Nat.Rev.Drug Discovery 5:123、及びLee et al.(2005) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:18902を参照。例えば、VEGFアプタマーは、ヌクレオチド配列5′-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3′(配列番号3)を含むことができる。また、血小板由来成長因子(PDGF)特異的アプタマー(例えば、E10030)も使用に好適である。例えば、Ni and Hui(2009) Ophthalmologica 223:401、及びAkiyama et al.(2006) J.Cell Physiol.207:407を参照。
ポリペプチド
遺伝子産物がポリペプチドである場合、一部の場合において、ポリペプチドは、網膜細胞の機能、例えば、桿体または錐体光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞の機能を強化するポリペプチドである。例示的なポリペプチドとしては、神経保護ポリペプチド(グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、ニューロトロフィン4(NT4)、神経成長因子(NGF)、及びニュールツリン(NTN))、抗血管新生ポリペプチド(例えば、可溶性VEGF受容体、VEGF結合抗体、VEGF結合抗体断片(例えば、1本鎖抗VEGF抗体)、エンドスタチン、タムスタチン、アンジオスタチン、可溶性Fltポリペプチド(Lai et al.(2005) Mol.Ther.12:659)、可溶性Fltポリペプチドを含むFc融合タンパク質(例えば、Pechan et al.(2009) Gene Ther.16:10を参照)、色素上皮由来因子(PEDF)、可溶性Tie-2受容体等)、組織メタロプロテアーゼ阻害物質3(TIMP-3)、光応答性オプシン、例えば、ロドプシン、抗アポトーシスポリペプチド(例えば、Bcl-2、Bcl-Xl、XIAP)などが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、限定されないが、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子2、ニュールツリン(NTN)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン4(NT4)、脳由来神経栄養因子(BDNF、例えば、図7Bに示されているアミノ酸配列(配列番号11)の隣接したひと続きの約200アミノ酸~247アミノ酸に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)、上皮成長因子、ロドプシン、X連鎖アポトーシス阻害物質、及びソニックヘッジホッグが挙げられる。
遺伝子産物がポリペプチドである場合、一部の場合において、ポリペプチドは、網膜細胞の機能、例えば、桿体または錐体光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞の機能を強化するポリペプチドである。例示的なポリペプチドとしては、神経保護ポリペプチド(グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、ニューロトロフィン4(NT4)、神経成長因子(NGF)、及びニュールツリン(NTN))、抗血管新生ポリペプチド(例えば、可溶性VEGF受容体、VEGF結合抗体、VEGF結合抗体断片(例えば、1本鎖抗VEGF抗体)、エンドスタチン、タムスタチン、アンジオスタチン、可溶性Fltポリペプチド(Lai et al.(2005) Mol.Ther.12:659)、可溶性Fltポリペプチドを含むFc融合タンパク質(例えば、Pechan et al.(2009) Gene Ther.16:10を参照)、色素上皮由来因子(PEDF)、可溶性Tie-2受容体等)、組織メタロプロテアーゼ阻害物質3(TIMP-3)、光応答性オプシン、例えば、ロドプシン、抗アポトーシスポリペプチド(例えば、Bcl-2、Bcl-Xl、XIAP)などが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、限定されないが、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子2、ニュールツリン(NTN)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン4(NT4)、脳由来神経栄養因子(BDNF、例えば、図7Bに示されているアミノ酸配列(配列番号11)の隣接したひと続きの約200アミノ酸~247アミノ酸に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)、上皮成長因子、ロドプシン、X連鎖アポトーシス阻害物質、及びソニックヘッジホッグが挙げられる。
好適な光応答性オプシンとしては、例えば、米国特許公開第2007/0261127号(例えば、チャネルロドプシン2、ChR2、Chop2)、米国特許公開第2001/0086421号、米国特許公開第2010/0015095号、米国特許公開第2016/0002302号、米国特許公開第2013/0347137号、米国特許公開第2013/0019325号、及びDiester et al.(2011) Nat.Neurosci.14:387で説明されている光応答性オプシンが挙げられる。Thyagarajan et al.(2010) J Neurosci.30(26):8745-8758、Lagali et al.(2008) Nat Neurosci.11(6):667-675、Doroudchi et al.(2011) Mol Ther.19(7):1220-1229、Henriksen et al.(2014) J.Ophthalmic Vis.Res.9:374、Tomita et al.(2014) Mol.Ther.22:1434を参照。
好適なポリペプチドとしては、光ゲートイオンチャネルポリペプチドが挙げられる。例えば、Gaub et al.(2014) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:E5574を参照。例えば、好適なポリペプチドは、光ゲートイオンチャネル型グルタメート受容体(LiGluR)である。光異化性化合物の存在下での網膜神経節細胞及びON双極細胞におけるLiGluRの発現は、細胞を光応答性にする。LiGluRは、L439C置換を含む。Caporale et al.(2011) Mol Ther.19:1212-1219、Volgraf et al.(2006) Nat Chem Biol.2:47-52、及びGorostiza et al.(2007) Proc Natl Acad Sci USA.104:10865-10870を参照。光異化性化合物としては、例えば、460nmにおけるピーク効率を有するマレイミド-アゾベンゼン-グルタメート0(MAG0460 )が挙げられる。MAG0460 は、以下の構造を有する。
また、好適なポリペプチドとしては、レチノスキシン(例えば、図7Aに示されているアミノ酸配列(配列番号10)の隣接したひと続きの約200アミノ酸~224アミノ酸に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)も挙げられる。好適なポリペプチドとしては、例えば、網膜色素変性GTPアーゼ制御物質(RPGR)相互作用タンパク質1(例えば、GenBankアクセッション番号Q96KN7、Q9EPQ2、及びQ9GLM3を参照)(例えば、図7Fに示されているアミノ酸配列(配列番号15)の隣接したひと続きの約1150アミノ酸~約1200アミノ酸、または約1200アミノ酸~1286アミノ酸に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)、ペリフェリン2(Prph2)(例えば、GenBankアクセッション番号NP_000313(例えば、図7Dに示されているアミノ酸配列(配列番号13)の隣接したひと続きの約300アミノ酸~346アミノ酸に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)、及びTravis et al.(1991) Genomics 10:733を参照)、ペリフェリン(例えば、図7Eに示されているアミノ酸配列(配列番号14)の隣接したひと続きの約400アミノ酸~約470アミノ酸に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)、網膜色素上皮特異的タンパク質(RPE65)(例えば、図7Cに示されているアミノ酸配列(配列番号12)の隣接したひと続きの約200アミノ酸~247アミノ酸に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)(例えば、GenBank AAC39660、及びMorimura et al.(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:3088を参照)、桿体由来錐体生存因子(RdCVF)(例えば、図7H、7I、及び7Jのうちのいずれか1つに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)、Rabエスコートタンパク質1(REP1)(例えば、図7Gに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)、網膜色素変性GTPアーゼ制御物質(RPGR)(例えば、図7S~7Vのうちの1つに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド)などが挙げられる。例えば、一部の場合において、好適なRPGRポリペプチドは、図7Sに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の例として、一部の場合において、好適なRPGRポリペプチドは、図7Tに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、一部の場合において、好適なRPGRポリペプチドは、図7Uに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、一部の場合において、好適なRPGRポリペプチドは、図7Vに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
また、好適なポリペプチドとしては、欠陥があるか欠損している場合にコロイデレミアを引き起こすポリペプチドであるCHM(コロイデレミア(Rabエスコートタンパク質1(REP1)))(例えば、Donnelly et al.(1994) Hum.Mol.Genet.3:1017、及びvan Bokhoven et al.(1994) Hum.Mol.Genet.3:1041を参照)、ならびに、欠陥があるか欠損している場合にレーバー先天黒内障及び網膜色素変性を引き起こすポリペプチドであるCrumbsホモログ1(CRB1)(例えば、den Hollander et al.(1999) Nat.Genet.23:217、及びGenBankアクセッション番号CAM23328を参照)も挙げられる。例えば、好適なREP1ポリペプチドは、図7Gに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
好適なポリペプチドとしては、桿体cGMP特異的3′,5′-環状ホスホジエステラーゼサブユニットアルファ(PDE6α)、桿体cGMP特異的3′,5′-環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム1(PDE6βアイソフォーム1)、桿体cGMP特異的3′,5′-環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム2(PDE6βアイソフォーム2)、桿体cGMP特異的3′,5′-環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム3(PDE6βアイソフォーム3)が挙げられる。例えば、好適なPDE6αポリペプチドは、図7Kに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なPDE6β6アイソフォーム1ポリペプチドは、図7Lに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なPDE6β6アイソフォーム2ポリペプチドは、図7Mに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なPDE6β6ポリアイソフォームペプチドは、図7Nに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
また、好適なポリペプチドとしては、欠陥があるか欠損している場合に1色覚をもたらすポリペプチドも挙げられ、このようなポリペプチドとしては、例えば、錐体光受容体cGMPゲートチャネルサブユニットアルファ(CNGA3)(例えば、GenBankアクセッション番号NP_001289、及びBooij et al.(2011) Ophthalmology 118:160-167を参照)、錐体光受容体cGMPゲートカチオンチャネルベータサブユニット(CNGB3)(例えば、Kohl et al.(2005) Eur J Hum Genet.13(3):302を参照)、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)、アルファ形質導入活性ポリペプチド2(GNAT2)(ACHM4)、ならびに、欠損があるか欠損している場合に様々な形態の色覚異常をもたらすポリペプチド(例えば、L-オプシン、M-オプシン、及びS-オプシン)が挙げられる。Mancuso et al.(2009) Nature 461(7265):784-787を参照。
例えば、好適なCNGA3(別称ACHM2)アイソフォーム1ポリペプチドは、図7Oに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なCNGA3(別称ACHM2)アイソフォーム2ポリペプチドは、図7Pに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
別の例として、好適なCNGB3(別称ACHM3)ポリペプチドは、図7Qに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、GNAT2(別称ACHM4)は、図7Rに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
部位特異的エンドヌクレアーゼ
一部の場合において、関心対象遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、このエンドヌクレアーゼは網膜疾患に関連するアレルをノックアウトする。例えば、野生型であるときに、優性アレルが、網膜の構造タンパク質である及び/または正常な網膜機能をもたらす遺伝子の欠陥コピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠陥アレルに対し標的化され、欠陥アレルをノックアウトすることができる。一部の場合において、部位特異的エンドヌクレアーゼは、RNAガイドエンドヌクレアーゼである。
一部の場合において、関心対象遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、このエンドヌクレアーゼは網膜疾患に関連するアレルをノックアウトする。例えば、野生型であるときに、優性アレルが、網膜の構造タンパク質である及び/または正常な網膜機能をもたらす遺伝子の欠陥コピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠陥アレルに対し標的化され、欠陥アレルをノックアウトすることができる。一部の場合において、部位特異的エンドヌクレアーゼは、RNAガイドエンドヌクレアーゼである。
部位特異的ヌクレアーゼは、欠陥アレルをノックアウトすることに加えて、欠陥アレルによりコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーDNAを伴った相同的組換えを刺激するために使用することもできる。したがって、例えば、主題rAAVビリオンは、欠陥アレルをノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼと、欠陥アレルの機能的コピーとを共に送達するために使用して、それにより、機能的網膜タンパク質(例えば、機能的レチノスキシン、機能的RPE65、機能的ペリフェリン等)の産生をもたらすことができる。例えば、Li et al.(2011) Nature 475:217を参照。一部の実施形態において、主題rAAVビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列と、機能的網膜タンパク質をコードする、欠陥アレルの機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列とを含む。機能的網膜タンパク質としては、例えば、レチノスキシン、RPE65、網膜色素変性GTPアーゼ制御物質(RGPR)相互作用タンパク質1、ペリフェリン、ペリフェリン2、RdCVFなどが挙げられる。
使用に好適な部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、メガヌクレアーゼ、及び転写活性化因子用エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)が挙げられ、このような部位特異的エンドヌクレアーゼは非天然存在であり、特定の遺伝子を標的化するように修飾される。このような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置をカットするように操作することができ、次に非相同末端結合が、いくつかのヌクレオチドを挿入または欠失しながら破損を修復することができる。次に、このような部位特異的ヌクレアーゼ(「インデル」とも呼ばれる)は、フレームからタンパク質を放出し、遺伝子を有効にノックアウトする。例えば、米国特許公開第2011/0301073号を参照。好適な部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、操作されたメガヌクレアーゼ及び再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。好適なエンドヌクレアーゼとしては、I-Tevlヌクレアーゼが挙げられる。好適なメガヌクレアーゼとしては、I-Sce1(例えば、Bellaiche et al.(1999) Genetics 152:1037を参照)、及びI-Cre1(Heath et al.(1997) Nature Structural Biology 4:468)が挙げられる。
RNAガイドエンドヌクレアーゼ
一部の場合において、遺伝子産物は、RNAガイドエンドヌクレアーゼである。一部の場合において、遺伝子産物は、RNAガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むRNAである。一部の場合において、遺伝子産物は、ガイドRNA、例えば、シングルガイドRNAである。一部の場合において、遺伝子産物は、1)ガイドRNA、及び2)RNAガイドエンドヌクレアーゼである。ガイドRNAは、a)RNAガイドエンドヌクレアーゼに結合するタンパク質結合領域、及びb)標的核酸に結合する領域を含み得る。RNAガイドエンドヌクレアーゼは、本明細書では「ゲノム編集ヌクレアーゼ」とも呼ばれる。
一部の場合において、遺伝子産物は、RNAガイドエンドヌクレアーゼである。一部の場合において、遺伝子産物は、RNAガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むRNAである。一部の場合において、遺伝子産物は、ガイドRNA、例えば、シングルガイドRNAである。一部の場合において、遺伝子産物は、1)ガイドRNA、及び2)RNAガイドエンドヌクレアーゼである。ガイドRNAは、a)RNAガイドエンドヌクレアーゼに結合するタンパク質結合領域、及びb)標的核酸に結合する領域を含み得る。RNAガイドエンドヌクレアーゼは、本明細書では「ゲノム編集ヌクレアーゼ」とも呼ばれる。
好適なゲノム編集ヌクレアーゼの例は、CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ(例えば、II型、V型、またはVI型CRISPR/Casエンドヌクレアーゼのようなクラス2 CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ)である。好適なゲノム編集ヌクレアーゼは、CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ(例えば、II型、V型、またはVI型CRISPR/Casエンドヌクレアーゼのようなクラス2 CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ)である。一部の場合において、ゲノム標的化組成物は、クラス2 CRISPR/Casエンドヌクレアーゼを含む。一部の場合において、ゲノム標的化組成物は、クラス2 II型CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9タンパク質)を含む。一部の場合において、ゲノム標的化組成物は、クラス2 V型CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ(例えば、Cpf1タンパク質、C2c1タンパク質、またはC2c3タンパク質)を含む。一部の場合において、ゲノム標的化組成物は、クラス2 VI型CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ(例えば、C2c2タンパク質(Cas13aタンパク質とも呼ばれる))を含む。CasXタンパク質も、使用に好適である。CasYタンパク質も、使用に好適である。
一部の場合において、ゲノム編集ヌクレアーゼは、異種ポリペプチド(「融合パートナー」とも呼ばれる)と融合している融合タンパク質である。一部の場合において、ゲノム編集ヌクレアーゼは、細胞内局在化をもたらすアミノ酸配列(融合パートナー)と融合しており、すなわち、融合パートナーは、細胞内局在化配列である(例えば、核を標的とする1つ以上の核局在化信号(NLS)、2つ以上のNLS、3つ以上のNLS等)。
一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、II型CRISPR/Casエンドヌクレアーゼである。一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、Cas9ポリペプチドである。Cas9タンパク質は、Cas9ガイドRNAのタンパク質結合セグメントとの会合により、標的核酸配列(例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等)内の標的部位に導かれる(例えば、標的部位で安定化される)。一部の場合において、好適なCas9ポリペプチドは、図3Aに示されているStreptococcus pyogenes Cas9に対し少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または99%超のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合において、本開示の組成物または方法で使用されるCas9ポリペプチドは、Staphylococcus aureus Cas9(saCas9)ポリペプチドである。一部の場合において、saCas9ポリペプチドは、図3に示されているアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の場合において、好適なCas9ポリペプチドは、ハイフィデリティー(HF)Cas9ポリペプチドである。Kleinstiver et al.(2016) Nature 529:490を参照。例えば、図3Aに示されているアミノ酸配列のアミノ酸N497、R661、Q695、及びQ926は、例えば、アラニンで置換される。例えば、HF Cas9ポリペプチドは、図3Aに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸N497、R661、Q695、及びQ926が、例えば、アラニンで置換される、アミノ酸配列を含み得る。
一部の場合において、好適なCas9ポリペプチドは、改変されたPAM特異性を示す。例えば、Kleinstiver et al.(2015) Nature 523:481を参照。
一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、V型 CRISPR/Casエンドヌクレアーゼである。一部の場合において、V型 CRISPR/Casエンドヌクレアーゼは、Cpf1タンパク質である。一部の場合において、Cpf1タンパク質は、図3Cに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも90%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、CasXまたはCasYポリペプチドである。CasX及びCasYポリペプチドは、Burstein et al.(2017) Nature 542:237で説明されている。
酵素的に不活性なRNAガイドエンドヌクレアーゼ
酵素活性が低減したRNAガイドエンドヌクレアーゼも使用に好適である。このようなRNAガイドエンドヌクレアーゼは、「死んだ」RNAガイドエンドヌクレアーゼと呼ばれる。例えば、実質的にエンドヌクレアーゼ活性を示さず、ただしガイドRNAと複合体化している場合は依然として標的核酸に結合するような、ある特定のアミノ酸置換を含むCas9ポリペプチドは、「死んだ」Cas9または「dCas9」と呼ばれる。一部の場合において、「死んだ」Cas9タンパク質は、2本鎖標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する能力が低減している。例えば、「ヌクレアーゼ欠陥」Cas9は、機能するRuvCドメインが欠如し(すなわち、2本鎖標的DNAの非相補鎖を切断しない)、かつ機能するHNHドメインが欠如している(すなわち、2本鎖標的DNAの相補鎖を切断しない)。非限定的な例として、一部の場合において、ヌクレアーゼ欠陥Cas9タンパク質は、配列番号15の残基D10及びH840(またはCas9のホモログの対応する残基)に対応するアミノ酸位置に変異を有し、当該ポリペプチドが、標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方の切断能力が低減する(例えば、切断しない)ようにする。このようなCas9タンパク質は、標的核酸(例えば、1本鎖または2本鎖の標的核酸)を切断する能力が低減しているが、標的核酸に結合する能力を保持する。(例えばRuvC及びHNHドメインの触媒ドメインにおける、例えば1つ以上の変異により)標的核酸を切断することができないCas9タンパク質は、「ヌクレアーゼ欠陥Cas9」、「死んだCas9」、または単に「dCas9」と呼ばれる。他の残基も上記の効果を達成する(例えば、どれか1つの他のヌクレアーゼ部分を不活性化する)ように変異させることができる。非限定的な例として、Streptococcus pyogenes Cas9の残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、及び/またはA987(あるいはCas9ホモログの対応するアミノ酸)を改変する(すなわち、置換する)ことができる。一部の場合において、Streptococcus pyogenes Cas9のD10、E762、H840、N854、N863、及びD986のうちの2つ以上(またはCas9ホモログの対応するアミノ酸)が置換される。一部の場合において、Streptococcus pyogenes Cas9のD10及びN863(またはCas9ホモログの対応するアミノ酸)がAlaで置換される。また、アラニン置換以外の変異も好適である。
酵素活性が低減したRNAガイドエンドヌクレアーゼも使用に好適である。このようなRNAガイドエンドヌクレアーゼは、「死んだ」RNAガイドエンドヌクレアーゼと呼ばれる。例えば、実質的にエンドヌクレアーゼ活性を示さず、ただしガイドRNAと複合体化している場合は依然として標的核酸に結合するような、ある特定のアミノ酸置換を含むCas9ポリペプチドは、「死んだ」Cas9または「dCas9」と呼ばれる。一部の場合において、「死んだ」Cas9タンパク質は、2本鎖標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する能力が低減している。例えば、「ヌクレアーゼ欠陥」Cas9は、機能するRuvCドメインが欠如し(すなわち、2本鎖標的DNAの非相補鎖を切断しない)、かつ機能するHNHドメインが欠如している(すなわち、2本鎖標的DNAの相補鎖を切断しない)。非限定的な例として、一部の場合において、ヌクレアーゼ欠陥Cas9タンパク質は、配列番号15の残基D10及びH840(またはCas9のホモログの対応する残基)に対応するアミノ酸位置に変異を有し、当該ポリペプチドが、標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方の切断能力が低減する(例えば、切断しない)ようにする。このようなCas9タンパク質は、標的核酸(例えば、1本鎖または2本鎖の標的核酸)を切断する能力が低減しているが、標的核酸に結合する能力を保持する。(例えばRuvC及びHNHドメインの触媒ドメインにおける、例えば1つ以上の変異により)標的核酸を切断することができないCas9タンパク質は、「ヌクレアーゼ欠陥Cas9」、「死んだCas9」、または単に「dCas9」と呼ばれる。他の残基も上記の効果を達成する(例えば、どれか1つの他のヌクレアーゼ部分を不活性化する)ように変異させることができる。非限定的な例として、Streptococcus pyogenes Cas9の残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、及び/またはA987(あるいはCas9ホモログの対応するアミノ酸)を改変する(すなわち、置換する)ことができる。一部の場合において、Streptococcus pyogenes Cas9のD10、E762、H840、N854、N863、及びD986のうちの2つ以上(またはCas9ホモログの対応するアミノ酸)が置換される。一部の場合において、Streptococcus pyogenes Cas9のD10及びN863(またはCas9ホモログの対応するアミノ酸)がAlaで置換される。また、アラニン置換以外の変異も好適である。
一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、Cas9相乗的活性化媒介物質(Cas9-SAM)として知られるRNAガイドエンドヌクレアーゼ(及び対応するガイドRNA)である。Cas9-SAMシステムのRNAガイドエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)は、転写活性化ドメイン(好適な転写活性化ドメインとしては、例えば、VP64、p65、MyoD1、HSF1、RTA、及びSET7/9が挙げられる)または転写抑制ドメイン(好適な転写抑制ドメインとしては、例えば、KRABドメイン、NuEドメイン、NcoRドメイン、SIDドメイン、及びSID4Xドメインが挙げられる)と融合している「死んだ」Cas9である。Cas9-SAMシステムのガイドRNAは、転写活性化ドメイン(例えば、VP64、p65、MyoD1、HSF1、RTA、またはSET7/9)または転写抑制ドメイン(例えば、KRABドメイン、NuEドメイン、NcoRドメイン、SIDドメイン、またはSID4Xドメイン)と融合しているアダプタータンパク質に結合するループを含む。例えば、一部の場合において、ガイドRNAは、sgRNAの1つまたは2つのループに挿入されたMS2 RNAアプタマーを含むシングルガイドRNAであり、dCas9は、VP64に融合しているdCas9を含む融合ポリペプチドであり、アダプター/機能的タンパク質は、i)MS2、ii)p65、及びiii)HSF1を含む融合ポリペプチドである。例えば、米国特許公開第2016/0355797号を参照。
また、a)死んだRNAガイドエンドヌクレアーゼ、及びb)異種融合ポリペプチドを含むキメラポリペプチドも、使用に好適である。好適な異種融合ポリペプチドの例としては、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性、DNA切断活性、DNA組込み活性、または核酸結合活性が挙げられる。
ガイドRNA
クラス2 CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9タンパク質、V型またはVI型CRISPR/Casタンパク質、Cpf1タンパク質等)に結合し、複合体を標的核酸内の特定の位置に標的化する核酸は、本明細書では「ガイドRNA」または「CRISPR/Casガイド核酸」または「CRISPR/CasガイドRNA」と呼ばれる。ガードRNAは、標的核酸の配列に相補的なヌクレオチド配列であるガイド配列(本明細書では標的化配列とも呼ばれる)を含む標的化セグメントを含めることにより、複合体(RNP複合体)に標的特異性をもたらす。
クラス2 CRISPR/Casエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9タンパク質、V型またはVI型CRISPR/Casタンパク質、Cpf1タンパク質等)に結合し、複合体を標的核酸内の特定の位置に標的化する核酸は、本明細書では「ガイドRNA」または「CRISPR/Casガイド核酸」または「CRISPR/CasガイドRNA」と呼ばれる。ガードRNAは、標的核酸の配列に相補的なヌクレオチド配列であるガイド配列(本明細書では標的化配列とも呼ばれる)を含む標的化セグメントを含めることにより、複合体(RNP複合体)に標的特異性をもたらす。
一部の場合において、ガイドRNAは、2つの別々の核酸分子:「アクチベーター」及び「ターゲッター」を含み、本明細書では「デュアルガイドRNA」、「二重分子ガイドRNA」、「2分子ガイドRNA」、または「dgRNA」と呼ばれる。一部の場合において、ガイドRNAは1つの分子であり(例えば、一部のクラス2 CRISPR/Casタンパク質については、対応するガイドRNAは単一の分子であり、ある場合において、アクチベーター及びターゲッターは、例えば介在ヌクレオチドを介して、互いに共有結合している)、このガイドRNAは、「シングルガイドRNA」、「単一分子ガイドRNA」、「1分子ガイドRNA」、または単に「sgRNA」と呼ばれる。
遺伝子産物がRNAガイドエンドヌクレアーゼ、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼ及びガイドRNAの両方である場合、遺伝子産物は、標的核酸を修飾することができる。一部の場合において、例えば、標的核酸が、欠陥アレル内に有害な変異(例えば、網膜細胞標的核酸内の有害な変異)を含む場合、RNAガイドエンドヌクレアーゼ/ガイドRNA複合体は、有害な変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナー核酸(例えば、欠陥アレルによりコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするヌクレオチド配列を含むドナー核酸)と共に、例えば、相同組換え修復(HDR)を介して、有害な変異を修正するために使用することができる。
一部の場合において、遺伝子産物は、RNAガイドエンドヌクレアーゼ、及び2つの別々のsgRNAであり、この2つの別々のsgRNAは、非相同末端結合(NHEJ)を介して標的核酸の欠失をもたらす。
一部の場合において、遺伝子産物は、i)RNAガイドエンドヌクレアーゼ、及びii)1つのガイドRNAである。一部の場合において、ガイドRNAは、単一分子(または「シングルガイド」)ガイドRNA(「sgRNA」)である。一部の場合において、ガイドRNAは、デュアル分子(または「デュアルガイド」)ガイドRNA(「dgRNA」)である。
一部の場合において、遺伝子産物は、i)RNAガイドエンドヌクレアーゼ、及びii)2つの別々のsgRNAであり、この2つの別々のsgRNAは、非相同末端結合(NHEJ)を介して標的核酸の欠失をもたらす。一部の場合において、ガイドRNAは、sgRNAである。一部の場合において、ガイドRNAは、dgRNAである。
一部の場合において、遺伝子産物は、i)Cpf1ポリペプチド、及びii)ガイドRNA前駆体であり、このような場合において、当該前駆体は、Cpf1ポリペプチドにより切断されて2つ以上のガイドRNAを生成し得る。
本開示は、個体内の網膜細胞内の標的核酸において、有害な変異を含む場合にこの標的核酸を修飾する方法であって、個体に(例えば、眼内、硝子体内等の投与により)本開示のrAAVビリオンを投与することを含み、rAAVビリオンが、i)RNAガイドエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9エンドヌクレアーゼ)をコードするヌクレオチド配列、ii)標的核酸に対し相補的なヌクレオチド配列を含むsgRNAをコードするヌクレオチド配列、及びiii)有害な変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナーDNA鋳型をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、方法を提供する。rAAVビリオンの投与は、HDRによる標的核酸における有害な変異の修正をもたらす。
本開示は、個体内の網膜細胞内の標的核酸において、有害な変異を含む場合にこの標的核酸を修飾する方法であって、個体に(例えば、眼内、硝子体内等の投与により)本開示のrAAVビリオンを投与することを含み、rAAVビリオンが、i)RNAガイドエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9エンドヌクレアーゼ)をコードするヌクレオチド配列、ii)標的核酸内の第1の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第1のsgRNAをコードするヌクレオチド配列、及びiii)標的核酸内の第2の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第2のsgRNAをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、方法を提供する。rAAVビリオンの投与は、NHEJによる標的核酸における有害な変異の切除をもたらす。
制御配列
一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、転写調節エレメントに対し作用可能に結合している。例えば、一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに対し作用可能に結合している。他の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導的プロモーターに対し作用可能に結合している。一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞タイプ特異的制御エレメントに対し作用可能に結合している。例えば、一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、網膜細胞特異的プロモーターに対し作用可能に結合している。例えば、一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的制御エレメント(例えば、光受容体特異的プロモーター)に対し作用可能に結合しており、この制御エレメントは、例えば、光受容体細胞内での作用可能に結合した遺伝子の選択的発現を付与する制御エレメントである。好適な光受容体特異的制御エレメントとしては、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター(Young et al.(2003) Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076)、ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーターNicoud et al.(2007) J.Gene Med.9:1015)、網膜色素変性遺伝子プロモーター(Nicoud et al.(2007)上記参照)、光受容体間レチノイド結合タンパク質(IRBP)遺伝子エンハンサー(Nicoud et al.(2007)上記参照)、IRBP遺伝子プロモーター(Yokoyama et al.(1992) Exp Eye Res.55:225)が挙げられる。
一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、転写調節エレメントに対し作用可能に結合している。例えば、一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに対し作用可能に結合している。他の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導的プロモーターに対し作用可能に結合している。一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞タイプ特異的制御エレメントに対し作用可能に結合している。例えば、一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、網膜細胞特異的プロモーターに対し作用可能に結合している。例えば、一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的制御エレメント(例えば、光受容体特異的プロモーター)に対し作用可能に結合しており、この制御エレメントは、例えば、光受容体細胞内での作用可能に結合した遺伝子の選択的発現を付与する制御エレメントである。好適な光受容体特異的制御エレメントとしては、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター(Young et al.(2003) Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076)、ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーターNicoud et al.(2007) J.Gene Med.9:1015)、網膜色素変性遺伝子プロモーター(Nicoud et al.(2007)上記参照)、光受容体間レチノイド結合タンパク質(IRBP)遺伝子エンハンサー(Nicoud et al.(2007)上記参照)、IRBP遺伝子プロモーター(Yokoyama et al.(1992) Exp Eye Res.55:225)が挙げられる。
薬学的組成物
本開示は、a)以下に説明する主題rAAVビリオン、及びb)薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはバッファーを含む薬学的組成物を提供する。一部の実施形態において、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはバッファーは、ヒトにおける使用に好適である。
本開示は、a)以下に説明する主題rAAVビリオン、及びb)薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはバッファーを含む薬学的組成物を提供する。一部の実施形態において、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはバッファーは、ヒトにおける使用に好適である。
このような賦形剤、担体、希釈剤、及びバッファーとしては、過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的作用物質が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤としては、限定されないが、水、食塩水、グリセロール、及びエタノールのような液体が挙げられる。薬学的に許容される塩、例えば、無機酸塩(例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など)、及び有機酸塩(例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など)がこれに含まれてもよい。加えて、湿潤剤及び乳化剤、pH緩衝物質などのような補助物質がこのようなビヒクル中に存在してもよい。幅広い種類の薬学的に許容される賦形剤が当技術分野において公知であり、これらを本明細書で詳細に論じる必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice of Pharmacy,”20th edition,Lippincott,Williams,& Wilkins、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999) H.C.Ansel et al.,eds.,7th ed.,Lippincott,Williams,& Wilkins、及びHandbook of Pharmaceutical Excipients(2000) A.H.Kibbe et al.,eds.,3rd ed.Amer.Pharmaceutical Assoc.を含めた様々な刊行物で十分に説明されている。
遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法及び処置方法
本開示は、遺伝子産物を個体内の網膜細胞に送達する方法であって、個体に上述したrAAVビリオンを投与することを含む、方法を提供する。遺伝子産物は、上述したように、ポリペプチドまたは干渉RNA(例えば、shRNA、siRNAなど)、アプタマー、または部位特異的エンドヌクレアーゼ(例えば、RNAガイドエンドヌクレアーゼ)であり得る。遺伝子産物を網膜細胞に送達することは、網膜疾患の処置をもたらし得る。網膜細胞は、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞であり得る。一部の場合において、網膜細胞は、光受容体細胞、例えば、桿体または錐体細胞である。
本開示は、遺伝子産物を個体内の網膜細胞に送達する方法であって、個体に上述したrAAVビリオンを投与することを含む、方法を提供する。遺伝子産物は、上述したように、ポリペプチドまたは干渉RNA(例えば、shRNA、siRNAなど)、アプタマー、または部位特異的エンドヌクレアーゼ(例えば、RNAガイドエンドヌクレアーゼ)であり得る。遺伝子産物を網膜細胞に送達することは、網膜疾患の処置をもたらし得る。網膜細胞は、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞であり得る。一部の場合において、網膜細胞は、光受容体細胞、例えば、桿体または錐体細胞である。
本開示は、網膜細胞内の標的核酸を修飾する方法であって、網膜細胞を、1)ガイドRNAに結合するRNAガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む本開示のrAAVビリオン、及び2)ガイドRNAに接触させることを含む、方法を提供する。本開示は、網膜細胞内の標的核酸を修飾する方法であって、網膜細胞を、i)ガイドRNAに結合するRNAガイドエンドヌクレアーゼと、ii)ガイドRNAとをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、本開示のrAAVビリオンに接触させることを含む、方法を提供する。一部の場合において、本方法は、網膜細胞をドナーDNA鋳型に接触させることを含む。一部の場合において、RNAガイドエンドヌクレアーゼは、Cas9ポリペプチドである。一部の場合において、ガイドRNAは、シングルガイドRNAである。
本開示は、眼疾患(例えば、網膜疾患)を処置する方法であって、当該処置を必要とする個体に、有効量の、上述した主題rAAVビリオンを投与することを含む、方法を提供する。主題rAAVビリオンは、眼内注射を介して、例えば、硝子体内注射、網膜下注射、脈絡膜上注射、または他の任意の好都合な投与の様式もしくは経路により、投与することができる。他の好都合な投与の様式または経路としては、例えば、静脈内、鼻腔内等が挙げられる。
「治療有効量」は、実験及び/または臨床試験を通じて決定され得る比較的広い範囲内に入る。例えば、in vivo注射、すなわち、眼内への直接注射については、治療有効用量は、約106 ~約1015のrAAVビリオン程度、例えば、約108 ~約1012のrAAVビリオンとなる。例えば、in vivo注射、すなわち、眼内への直接注射については、治療有効用量は、約106 ウイルスゲノム(vg)~約1015vgのrAAVビリオン程度、例えば、約108 vg~約1012vgとなる。in vitro形質導入については、細胞に送達されるrAAVビリオンの有効量は、約108 ~約1013のrAAVビリオン程度となる。例えば、in vitro形質導入については、細胞に送達されるrAAVビリオンの有効量は、約108 ~約1013vgのrAAVビリオン程度となる。別の例として、in vitro形質導入については、細胞に送達されるrAAVビリオンの有効量は、約10vg/細胞~約104 vg/細胞のrAAVビリオン程度となる。他の有効薬用量も、当業者により、用量反応曲線を確立する通常の試験を通じて容易に確立することができる。
一部の実施形態において、所望の遺伝子発現レベルを達成するために、2回以上の投与(例えば、2、3、4回、またはそれ以上の投与)が用いられ得る。一部の場合において、2回以上の投与は、様々な間隔で、例えば、1日に1回、1週間に1回、1ヵ月に2回、1ヵ月に1回、3ヵ月に1回、6ヵ月に1回、1年に1回等、投与される。一部の場合において、複数回投与は、1ヵ月~2ヵ月、2ヵ月~4ヵ月、4ヵ月~8ヵ月、8ヵ月~12ヵ月、1年~2年、2年~5年、または5年以上の間隔で、投与される。
主題方法を用いて処置することができる眼疾患としては、限定されないが、急性黄斑性神経網膜症、ベーチェット症候群、脈絡膜血管新生、糖尿病性ぶどう膜炎、ヒストプラズマ症、黄斑変性、例えば、急性黄斑変性、非滲出性加齢性黄斑変性、及び滲出性加齢性黄斑変性、浮腫、例えば、黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、多巣性脈絡膜炎、後部眼球の部位または位置に影響を及ぼす眼球損傷、眼球腫瘍、網膜障害、例えば、網膜中心静脈閉塞、糖尿病性網膜症(増殖性糖尿病性網膜症を含む)、増殖性硝子体網膜症(PVR)、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜炎網膜疾患、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田症候群、びまん性ぶどう膜炎(uveal diffusion)、眼球レーザー処置により引き起こされるまたは影響される後部眼球状態、光線力学的治療により引き起こされるまたは影響される後部眼球状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞、前部虚血性視神経症、非網膜症糖尿病性網膜機能不全、網膜分離、網膜色素変性、緑内障、アッシャー症候群、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病(黄色斑眼底)、遺伝性黄斑変性、脈絡網膜変性、レーバー先天黒内障、先天性非進行性夜盲症、コロイデレミア、バルデー・ビートル症候群、黄斑性毛細血管拡張、レーバー遺伝性視神経萎縮症、未熟児網膜症、色覚障害(1色覚、1型2色覚、2型3色覚、及び3型2色覚を含む)、ならびにビエッティ結晶性ジストロフィーが挙げられる。
本開示は、網膜疾患を処置する方法を提供する。本方法は、概して、本開示のrAAVビリオン、または本開示のrAAVビリオンを含む組成物を、投与を必要とする個体の眼に投与することに関係する。網膜疾患の処置を評価するための非限定的な方法としては、機能的変化の測定、例えば、視力の変化の測定(例えば、BCVA)、視野の測定(例えば、視野測定)、明暗に対する電気生理学的応答性の測定(例えば、ERG、VEP)、色覚の測定、及び/またはコントラスト感度の測定、解剖学的及び/または写真的尺度(例えば、OCT、眼底写真、及び/または自己蛍光)を用いた解剖学的構造または健康状態の変化の測定、ならびに眼球運動性(例えば、眼球振とう、固視選好、及び安定性)の測定が挙げられる。
例えば、当業者は、rAAVビリオンの有効量を、1つ以上のパラメーター(例えば、視力、視野、明暗に対する電気生理学的応答性、色覚、コントラスト感度、解剖学的構造、網膜の健康状態及び脈管構造、眼球運動性、固視選好、及び安定性)に及ぼす効果を試験することにより、容易に決定することができると考えられる。一部の場合において、有効量の、本開示のrAAVビリオンの投与は、網膜機能、解剖学的完全性、または網膜の健康状態の喪失速度の低下、例えば、2倍、3倍、4倍、もしくは5倍、またはそれ以上の喪失速度の低下、よって疾患の進行速度の低下、例えば、10倍またはそれ以上の喪失速度の低下、よって疾患の進行速度の低下をもたらす。一部の場合において、有効量の、本開示のrAAVビリオンの投与は、網膜機能の増加、網膜の解剖学的構造もしくは健康状態の改善、及び/または眼球運動性の安定化、例えば、2倍、3倍、4倍、もしくは5倍、またはそれ以上の網膜機能、網膜の解剖学的構造もしくは健康状態、及び/または軌道の安定性の改善、例えば、10倍の網膜機能、網膜の解剖学的構造もしくは健康状態、及び/または軌道の安定性の改善をもたらす。
核酸及び宿主細胞
本開示は、上述した主題バリアントアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸であって、バリアントAAVカプシドタンパク質が、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸の挿入を含み、またはバリアントAAVカプシドタンパク質が、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸の約5アミノ酸~約20アミノ酸の異種ペプチドによる置換えを含み、バリアントカプシドタンパク質が、AAVビリオン内に存在するときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の感染力の増大をもたらす、単離された核酸を提供する。主題の単離された核酸は、AAVベクター、例えば、組換えAAVベクターであり得る。
本開示は、上述した主題バリアントアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸であって、バリアントAAVカプシドタンパク質が、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸の挿入を含み、またはバリアントAAVカプシドタンパク質が、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸の約5アミノ酸~約20アミノ酸の異種ペプチドによる置換えを含み、バリアントカプシドタンパク質が、AAVビリオン内に存在するときに、対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の感染力の増大をもたらす、単離された核酸を提供する。主題の単離された核酸は、AAVベクター、例えば、組換えAAVベクターであり得る。
挿入ペプチド
主題核酸によりコードされるバリアントAAVカプシドタンパク質は、約5アミノ酸~約20アミノ酸長の挿入ペプチドを有し、これはAAVカプシドのGHループ内に挿入される。挿入ペプチドは、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、または20アミノ酸の長さを有する。好適な挿入ペプチドは、上述した通りである。好適な挿入ペプチドとしては、上述したように、式I~VIのいずれか1つのペプチドが挙げられる。挿入ペプチドの親AAVカプシド内への挿入は、一部の場合において、GHループまたはループIV内の内在的なひと続きの約5アミノ酸~約20アミノ酸を置き換える。したがって、一部の場合において、主題核酸によりコードされるバリアントAAVカプシドタンパク質は、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸の約5アミノ酸~約20アミノ酸の異種ペプチドによる置換えを含み、好適な異種ペプチドとしては、上述したように、式I~VIのいずれか1つのペプチドが挙げられる。
主題核酸によりコードされるバリアントAAVカプシドタンパク質は、約5アミノ酸~約20アミノ酸長の挿入ペプチドを有し、これはAAVカプシドのGHループ内に挿入される。挿入ペプチドは、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、または20アミノ酸の長さを有する。好適な挿入ペプチドは、上述した通りである。好適な挿入ペプチドとしては、上述したように、式I~VIのいずれか1つのペプチドが挙げられる。挿入ペプチドの親AAVカプシド内への挿入は、一部の場合において、GHループまたはループIV内の内在的なひと続きの約5アミノ酸~約20アミノ酸を置き換える。したがって、一部の場合において、主題核酸によりコードされるバリアントAAVカプシドタンパク質は、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、GHループまたはループIV内における約5アミノ酸~約20アミノ酸の約5アミノ酸~約20アミノ酸の異種ペプチドによる置換えを含み、好適な異種ペプチドとしては、上述したように、式I~VIのいずれか1つのペプチドが挙げられる。
主題組換えAAVベクターは、上述したように、主題組換えAAVビリオンの生成に使用することができる。したがって、本開示は、好適な細胞に導入されたときに主題組換えAAVビリオンの産生をもたらすことができる、組換えAAVベクターを提供する。
本発明はさらに、主題核酸を含む宿主細胞、例えば、単離された(遺伝子修飾された)宿主細胞を提供する。主題宿主細胞は、単離された細胞、例えば、in vitro培養物中の細胞であり得る。主題宿主細胞は、後述するように、主題rAAVビリオンの産生に有用である。主題宿主細胞が主題rAAVビリオンの産生に使用される場合、主題宿主細胞は「パッケージング細胞」と呼ばれる。一部の実施形態において、主題宿主細胞は、主題核酸を用いて安定的に遺伝子修飾される。他の実施形態において、主題宿主細胞は、主題核酸を用いて一過性に遺伝子修飾される。
主題核酸は、確立した技法を用いて、宿主細胞に安定的または一過性に導入され、このような技法としては、限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム媒介トランスフェクションなどが挙げられる。安定した形質転換のため、概して、主題核酸はさらに、選択マーカー、例えば、いくつかの周知の選択マーカー(例えば、ネオマイシン抵抗性など)のいずれかを含む。
主題宿主細胞は、主題核酸を様々な細胞、例えば、哺乳類細胞(例えば、マウス細胞、及び霊長類細胞(例えば、ヒト細胞))のいずれかに導入することにより、生成される。好適な哺乳類細胞としては、限定されないが、初代細胞及び細胞株が挙げられ、好適な細胞株としては、限定されないが、293細胞、293T細胞、COS細胞、HeLa細胞、Vero細胞、3T3線維芽細胞、C3H10T1/2線維芽細胞、CHO細胞などが挙げられる。好適な宿主細胞の非限定的な例としては、例えば、HeLa細胞(例えば、American Type Culture Collection(ATCC) No.CCL-2)、CHO細胞(例えば、ATCC No.CRL9618、CCL61、CRL9096)、293細胞(例えば、ATCC No.CRL-1573)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例えば、ATCC No.CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例えば、ATCC No.CCL10)、PC12細胞(ATCC No.CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC No.CRL1651)、RAT1細胞、マウスL細胞(ATCC No.CCLI.3)、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞(ATCC No.CRL1573)、HLHepG2細胞などが挙げられる。また、主題宿主細胞は、バキュロウイルスを用いて、AAVを産生するSf9細胞のような昆虫細胞に感染させて作成することもできる(例えば、米国特許第7,271,002号、米国特許出願第12/297,958号を参照)。
一部の実施形態において、主題遺伝子修飾宿主細胞は、バリアントAAVカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、1つ以上のAAV repタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態において、主題宿主細胞はさらに、rAAVベクターを含む。rAAVビリオンは、主題宿主細胞を用いて生成することができる。rAAVビリオンを生成する方法は、例えば、米国特許公開第2005/0053922号及び米国特許公開第2009/0202490号で説明されている。
本開示の非限定的態様の例
上述した本発明の主題における態様(実施形態を含む)は、単体であっても、1つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせても、有益であり得る。上記の説明を限定することなく、以下に、1~63の番号が付された、本開示のある特定の非限定的な態様を示す。当業者には明らかであるように、個別に番号が付された態様の各々が使用されても、先または後にある個々に番号が付された態様のいずれかと組み合わされてもよい。これは、全てのこのような態様の組合せを支持するように意図され、以下に明示的に示される態様の組合せに限定されない。
上述した本発明の主題における態様(実施形態を含む)は、単体であっても、1つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせても、有益であり得る。上記の説明を限定することなく、以下に、1~63の番号が付された、本開示のある特定の非限定的な態様を示す。当業者には明らかであるように、個別に番号が付された態様の各々が使用されても、先または後にある個々に番号が付された態様のいずれかと組み合わされてもよい。これは、全てのこのような態様の組合せを支持するように意図され、以下に明示的に示される態様の組合せに限定されない。
1.組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ビリオンであって、a)式I~VIのいずれか1つの異種ペプチドの挿入を含み、対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、前記網膜細胞の感染力の増大を付与する、バリアントAAVカプシドタンパク質と、b)異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、rAAVビリオン。
2.前記対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様1に記載のrAAVビリオン。
3.前記対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも10倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様1に記載のrAAVビリオン。
4.前記異種ペプチドの挿入が、前記親AAVカプシドタンパク質の隣接したひと続きの5アミノ酸~20アミノ酸を置き換える、態様1に記載のrAAVビリオン。
5.挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸570及びアミノ酸611に対応するアミノ酸の間であるか、または別のAAV血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、態様1に記載のrAAVビリオン。
2.前記対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様1に記載のrAAVビリオン。
3.前記対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも10倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様1に記載のrAAVビリオン。
4.前記異種ペプチドの挿入が、前記親AAVカプシドタンパク質の隣接したひと続きの5アミノ酸~20アミノ酸を置き換える、態様1に記載のrAAVビリオン。
5.挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸570及びアミノ酸611に対応するアミノ酸の間であるか、または別のAAV血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、態様1に記載のrAAVビリオン。
6.挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸587及びアミノ酸588に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のAAV血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、または、挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸585及びアミノ酸598に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のAAV血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、態様4に記載のrAAVビリオン。
7.前記異種遺伝子産物は、干渉RNAまたはアプタマーである、態様1~6のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
8.前記異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様1~6のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
9.前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様8に記載のrAAVビリオン。
10.前記ポリペプチドは、II型CRISPR/Casポリペプチド、V型CRISPR/Casポリペプチド、またはVI型CRISPR/Casポリペプチドから選択されるRNAガイドエンドヌクレアーゼである、態様8に記載のrAAVビリオン。
7.前記異種遺伝子産物は、干渉RNAまたはアプタマーである、態様1~6のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
8.前記異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様1~6のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
9.前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様8に記載のrAAVビリオン。
10.前記ポリペプチドは、II型CRISPR/Casポリペプチド、V型CRISPR/Casポリペプチド、またはVI型CRISPR/Casポリペプチドから選択されるRNAガイドエンドヌクレアーゼである、態様8に記載のrAAVビリオン。
11.前記RNAガイドエンドヌクレアーゼは、酵素的に不活性なII型CRISPR/Casポリペプチドである、態様10に記載のrAAVビリオン。
12.前記異種遺伝子産物は、RNAガイドエンドヌクレアーゼ及びガイドRNAである、態様10に記載のrAAVビリオン。
13.前記異種ペプチドは、式I:LA(L/N)(I/Q)(Q/E)(D/H)(S/V)(M/K)(R/N)A(配列番号136)のペプチドである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
14.前記異種ペプチドは、(21)LALIQDSMRA(配列番号35)または(22)LANQEHVKNA(配列番号2)を含む、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
15.前記異種ペプチドは、式II:TX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 GLX9 (配列番号137)のペプチドであって、式中、X1 が、G、V、またはSであり、X2 が、V、E、P、G、D、M、A、またはSであり、X3 が、M、V、Y、H、G、S、またはDであり、X4 が、R、D、S、G、V、Y、T、H、またはMであり、X5 が、S、L、G、T、Q、P、またはAであり、X6 が、T、A、S、M、D、Q、またはHであり、X7 が、N、G、S、L、M、P、G、またはAであり、X8 が、S、G、D、N、A、I、P、またはTであり、X9 が、SまたはNである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
12.前記異種遺伝子産物は、RNAガイドエンドヌクレアーゼ及びガイドRNAである、態様10に記載のrAAVビリオン。
13.前記異種ペプチドは、式I:LA(L/N)(I/Q)(Q/E)(D/H)(S/V)(M/K)(R/N)A(配列番号136)のペプチドである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
14.前記異種ペプチドは、(21)LALIQDSMRA(配列番号35)または(22)LANQEHVKNA(配列番号2)を含む、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
15.前記異種ペプチドは、式II:TX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 GLX9 (配列番号137)のペプチドであって、式中、X1 が、G、V、またはSであり、X2 が、V、E、P、G、D、M、A、またはSであり、X3 が、M、V、Y、H、G、S、またはDであり、X4 が、R、D、S、G、V、Y、T、H、またはMであり、X5 が、S、L、G、T、Q、P、またはAであり、X6 が、T、A、S、M、D、Q、またはHであり、X7 が、N、G、S、L、M、P、G、またはAであり、X8 が、S、G、D、N、A、I、P、またはTであり、X9 が、SまたはNである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
16.前記異種ペプチドは、(1)TGVMRSTNSGLN(配列番号6)、(2)TGEVDLAGGGLS(配列番号7)、(3)TSPYSGSSDGLS(配列番号8)、(4)TGGHDSSLDGLS(配列番号9)、(5)TGDGGTTMNGLS(配列番号98)、(6)TGGHGSAPDGLS(配列番号99)、(7)TGMHVTMMAGLN(配列番号100)、(8)TGASYLDNSGLS(配列番号101)、(9)TVVSTQAGIGLS(配列番号20)、(10)TGVMHSQASGLS(配列番号21)、(11)TGDGSPAAPGLS(配列番号22)、または(12)TGSDMAHGTGLS(配列番号23)を含む、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
17.前記異種ペプチドは、式III:TGX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 GLS(配列番号138)のペプチドであって、式中、X1 が、V、E、P、G、D、M、A、またはSであり、X2 が、M、V、Y、H、G、S、またはDであり、X3 が、R、D、S、G、V、Y、T、H、またはMであり、X4 が、S、L、G、T、Q、P、またはAであり、X5 が、T、A、S、M、D、Q、またはHであり、X6 が、N、G、S、L、M、P、G、またはAであり、X7 が、S、G、D、N、A、I、P、またはTである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
18.前記異種ペプチドは、(2)TGEVDLAGGGLS(配列番号7)、(4)TGGHDSSLDGLS(配列番号9)、(5)TGDGGTTMNGLS(配列番号98)、(6)TGGHGSAPDGLS(配列番号99)、(8)TGASYLDNSGLS(配列番号101)、(10)TGVMHSQASGLS(配列番号21)、(11)TGDGSPAAPGLS(配列番号22)、または(12)TGSDMAHGTGLS(配列番号23)を含む、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
19.前記異種ペプチドは、式IV:X1 GX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 GLSPX9 TX10X11(配列番号139)のペプチドであって、式中、X1 が、TまたはNであり、X2 が、L、S、A、またはGであり、X3 が、DまたはVであり、X4 が、A、G、またはPであり、X5 が、TまたはDであり、X6 が、RまたはYであり、X7 が、D、T、またはGであり、X8 が、H、R、またはTであり、X9 が、VまたはAであり、X10が、GまたはWであり、X11が、TまたはAである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
20.前記異種ペプチドは、(13)TGLDATRDHGLSPVTGT(配列番号24)、(14)TGSDGTRDHGLSPVTWT(配列番号25)、(15)NGAVADYTRGLSPATGT(配列番号26)、または(16)TGGDPTRGTGLSPVTGA(配列番号27)を含む、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
17.前記異種ペプチドは、式III:TGX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 GLS(配列番号138)のペプチドであって、式中、X1 が、V、E、P、G、D、M、A、またはSであり、X2 が、M、V、Y、H、G、S、またはDであり、X3 が、R、D、S、G、V、Y、T、H、またはMであり、X4 が、S、L、G、T、Q、P、またはAであり、X5 が、T、A、S、M、D、Q、またはHであり、X6 が、N、G、S、L、M、P、G、またはAであり、X7 が、S、G、D、N、A、I、P、またはTである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
18.前記異種ペプチドは、(2)TGEVDLAGGGLS(配列番号7)、(4)TGGHDSSLDGLS(配列番号9)、(5)TGDGGTTMNGLS(配列番号98)、(6)TGGHGSAPDGLS(配列番号99)、(8)TGASYLDNSGLS(配列番号101)、(10)TGVMHSQASGLS(配列番号21)、(11)TGDGSPAAPGLS(配列番号22)、または(12)TGSDMAHGTGLS(配列番号23)を含む、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
19.前記異種ペプチドは、式IV:X1 GX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 GLSPX9 TX10X11(配列番号139)のペプチドであって、式中、X1 が、TまたはNであり、X2 が、L、S、A、またはGであり、X3 が、DまたはVであり、X4 が、A、G、またはPであり、X5 が、TまたはDであり、X6 が、RまたはYであり、X7 が、D、T、またはGであり、X8 が、H、R、またはTであり、X9 が、VまたはAであり、X10が、GまたはWであり、X11が、TまたはAである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
20.前記異種ペプチドは、(13)TGLDATRDHGLSPVTGT(配列番号24)、(14)TGSDGTRDHGLSPVTWT(配列番号25)、(15)NGAVADYTRGLSPATGT(配列番号26)、または(16)TGGDPTRGTGLSPVTGA(配列番号27)を含む、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
21.前記異種ペプチドは、式V:TGX1 DX2 TRX3 X4 GLSPVTGT(配列番号140)のペプチドであって、式中、X1 が、L、S、A、またはGであり、X2 が、A、G、またはPであり、X8 が、D、T、またはGであり、X4 が、H、R、またはTである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
22.前記異種ペプチドは、式VI:LQX1 X2 X3 RX4 X5 X6 X7 X8 X9 VNX10Q(配列番号141)のペプチドであって、式中、X1 が、KまたはRであり、X2 が、N、G、またはAであり、X3 が、A、V、N、またはDであり、X4 が、P、I、またはQであり、X5 が、A、P、またはVであり、X6 が、S、T、またはGであり、X7 が、TまたはVであり、X8 が、E、L、A、またはVであり、X9 が、S、E、D、またはVであり、X10が、F、G、T、またはCである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
23.前記異種ペプチドは、(17)LQKNARPASTESVNFQ(配列番号28)、(18)LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号29)、(19)LQRGNRPVTTADVNTQ(配列番号30)、または(20)LQKADRQPGVVVVNCQ(配列番号31)を含む、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
24.a)態様1~23のいずれか1つに記載の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンと、b)薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
25.体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、前記個体に、請求項1~23のいずれか1項に記載のrAAVビリオンまたは請求項24に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
22.前記異種ペプチドは、式VI:LQX1 X2 X3 RX4 X5 X6 X7 X8 X9 VNX10Q(配列番号141)のペプチドであって、式中、X1 が、KまたはRであり、X2 が、N、G、またはAであり、X3 が、A、V、N、またはDであり、X4 が、P、I、またはQであり、X5 が、A、P、またはVであり、X6 が、S、T、またはGであり、X7 が、TまたはVであり、X8 が、E、L、A、またはVであり、X9 が、S、E、D、またはVであり、X10が、F、G、T、またはCである、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
23.前記異種ペプチドは、(17)LQKNARPASTESVNFQ(配列番号28)、(18)LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号29)、(19)LQRGNRPVTTADVNTQ(配列番号30)、または(20)LQKADRQPGVVVVNCQ(配列番号31)を含む、態様1~12のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
24.a)態様1~23のいずれか1つに記載の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンと、b)薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
25.体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、前記個体に、請求項1~23のいずれか1項に記載のrAAVビリオンまたは請求項24に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
26.前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様25に記載の方法。
27.前記遺伝子産物は、短鎖干渉RNAまたはアプタマーである、態様25に記載の方法。
28.前記ポリペプチドは、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様26に記載の方法。
29.前記ポリペプチドは、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子2、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮成長因子、ロドプシン、X連鎖アポトーシス阻害物質、レチノスキシン、RPE65、網膜色素変性GTPアーゼ相互作用タンパク質1、ペリフェリン、ペリフェリン-2、ロドプシン、RdCVF、網膜色素変性GTPアーゼ制御物質(RPGR)、またはソニックヘッジホッグである、態様26に記載の方法。
30.前記ポリペプチドは、RNAガイドエンドヌクレアーゼである、態様26に記載の方法。
27.前記遺伝子産物は、短鎖干渉RNAまたはアプタマーである、態様25に記載の方法。
28.前記ポリペプチドは、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様26に記載の方法。
29.前記ポリペプチドは、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子2、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮成長因子、ロドプシン、X連鎖アポトーシス阻害物質、レチノスキシン、RPE65、網膜色素変性GTPアーゼ相互作用タンパク質1、ペリフェリン、ペリフェリン-2、ロドプシン、RdCVF、網膜色素変性GTPアーゼ制御物質(RPGR)、またはソニックヘッジホッグである、態様26に記載の方法。
30.前記ポリペプチドは、RNAガイドエンドヌクレアーゼである、態様26に記載の方法。
31.眼疾患を処置する方法であって、処置を必要とする個体に対して、態様1~23のいずれか1つに記載のrAAVビリオンまたは態様24に記載の薬学的組成物を有効量で投与することを含む、方法。
32.投与は、眼内注射によるものである、態様31に記載の方法。
33.投与は、硝子体内注射または脈絡膜上注射によるものである、態様31に記載の方法。
34.前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性、黄斑変性、網膜分離、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、1色覚、または色覚異常である、態様31~33のいずれか1つに記載の方法。
35.バリアントアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記バリアントAAVカプシドタンパク質が、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、カプシドタンパク質GHループ内の約5アミノ酸~約20アミノ酸の挿入を含み、バリアントカプシドタンパク質が、AAVビリオン内に存在するときに、網膜細胞のAAVビリオンの感染力の増大をもたらし、アミノ酸の挿入が、ネイティブAAVカプシドのGHループ内であり、この挿入は、式I~VIのいずれか1つのペプチドである、核酸。
32.投与は、眼内注射によるものである、態様31に記載の方法。
33.投与は、硝子体内注射または脈絡膜上注射によるものである、態様31に記載の方法。
34.前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性、黄斑変性、網膜分離、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、1色覚、または色覚異常である、態様31~33のいずれか1つに記載の方法。
35.バリアントアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記バリアントAAVカプシドタンパク質が、対応する親AAVカプシドタンパク質との対比で、カプシドタンパク質GHループ内の約5アミノ酸~約20アミノ酸の挿入を含み、バリアントカプシドタンパク質が、AAVビリオン内に存在するときに、網膜細胞のAAVビリオンの感染力の増大をもたらし、アミノ酸の挿入が、ネイティブAAVカプシドのGHループ内であり、この挿入は、式I~VIのいずれか1つのペプチドである、核酸。
36.挿入部位は、AAV2のアミノ酸587とアミノ酸588との間、AAV2のアミノ酸585とアミノ酸598との間、AAV1のアミノ酸590とアミノ酸591との間、AAV5のアミノ酸575とアミノ酸576との間、AAV6のアミノ酸590とアミノ酸591との間、AAV7のアミノ酸589とアミノ酸590との間、AAV8のアミノ酸590とアミノ酸591との間、AAV9のアミノ酸588とアミノ酸589との間、またはAAV10のアミノ酸588とアミノ酸589との間である、態様35に記載の核酸。
37.態様35または態様36に記載の核酸を含む、単離された遺伝子修飾宿主細胞。
38.約5アミノ酸~約20アミノ酸の挿入を含むバリアントアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質であって、アミノ酸の挿入が、ネイティブAAVカプシドのGHループ内であり、この挿入は、式I~VIのいずれか1つのペプチドである、バリアントAAVカプシドタンパク質。
39.a)式VIの異種ペプチドの挿入を含み、対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、前記網膜細胞の感染力の増大を付与する、バリアントAAVカプシドタンパク質と、b)異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、rAAVビリオン。
40.前記対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様39に記載のrAAVビリオン。
37.態様35または態様36に記載の核酸を含む、単離された遺伝子修飾宿主細胞。
38.約5アミノ酸~約20アミノ酸の挿入を含むバリアントアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質であって、アミノ酸の挿入が、ネイティブAAVカプシドのGHループ内であり、この挿入は、式I~VIのいずれか1つのペプチドである、バリアントAAVカプシドタンパク質。
39.a)式VIの異種ペプチドの挿入を含み、対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、前記網膜細胞の感染力の増大を付与する、バリアントAAVカプシドタンパク質と、b)異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、rAAVビリオン。
40.前記対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも5倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様39に記載のrAAVビリオン。
41.前記対応する親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも10倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様39に記載のrAAVビリオン。
42.前記異種ペプチドの挿入が、前記親AAVカプシドタンパク質の隣接したひと続きの5アミノ酸~20アミノ酸を置き換える、態様39~41のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
43.挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸570及びアミノ酸611に対応するアミノ酸の間であるか、または別のAAV血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、態様39~42のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
44.挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸587及びアミノ酸588に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のAAV血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、または、挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸585及びアミノ酸598に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のAAV血清型の前記カプシドタンパク質における対応する位置である、態様43に記載のrAAVビリオン。
45.前記異種遺伝子産物は、干渉RNAである、態様39~44のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
42.前記異種ペプチドの挿入が、前記親AAVカプシドタンパク質の隣接したひと続きの5アミノ酸~20アミノ酸を置き換える、態様39~41のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
43.挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸570及びアミノ酸611に対応するアミノ酸の間であるか、または別のAAV血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、態様39~42のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
44.挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸587及びアミノ酸588に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のAAV血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、または、挿入部位が、AAV2のVP1のアミノ酸585及びアミノ酸598に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のAAV血清型の前記カプシドタンパク質における対応する位置である、態様43に記載のrAAVビリオン。
45.前記異種遺伝子産物は、干渉RNAである、態様39~44のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
46.前記異種遺伝子産物は、アプタマーである、態様39~44のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
47.前記異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様39~44のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
48.前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様47に記載のrAAVビリオン。
49.前記ポリペプチドは、II型CRISPR/Casポリペプチド、V型CRISPR/Casポリペプチド、またはVI型CRISPR/Casポリペプチドから選択されるRNAガイドエンドヌクレアーゼである、態様47に記載のrAAVビリオン。
50.前記RNAガイドエンドヌクレアーゼは、酵素的に不活性なII型CRISPR/Casポリペプチドである、態様49に記載のrAAVビリオン。
47.前記異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様39~44のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
48.前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様47に記載のrAAVビリオン。
49.前記ポリペプチドは、II型CRISPR/Casポリペプチド、V型CRISPR/Casポリペプチド、またはVI型CRISPR/Casポリペプチドから選択されるRNAガイドエンドヌクレアーゼである、態様47に記載のrAAVビリオン。
50.前記RNAガイドエンドヌクレアーゼは、酵素的に不活性なII型CRISPR/Casポリペプチドである、態様49に記載のrAAVビリオン。
51.前記異種遺伝子産物は、RNAガイドエンドヌクレアーゼ及びガイドRNAである、態様39~44のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
52.前記異種ペプチドは、(17)LQKNARPASTESVNFQ(配列番号28)、(18)LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号29)、(19)LQRGNRPVTTADVNTQ(配列番号30)、または(20)LQKADRQPGVVVVNCQ(配列番号31)を含む、態様39~51のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
53.a)態様39~52のいずれか1つに記載のrAAVビリオンと、b)薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
54.個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、前記個体に、態様39~52のいずれか1つに記載のrAAVビリオンまたは態様53に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
55.前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様54に記載の方法。
52.前記異種ペプチドは、(17)LQKNARPASTESVNFQ(配列番号28)、(18)LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号29)、(19)LQRGNRPVTTADVNTQ(配列番号30)、または(20)LQKADRQPGVVVVNCQ(配列番号31)を含む、態様39~51のいずれか1つに記載のrAAVビリオン。
53.a)態様39~52のいずれか1つに記載のrAAVビリオンと、b)薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
54.個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、前記個体に、態様39~52のいずれか1つに記載のrAAVビリオンまたは態様53に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
55.前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様54に記載の方法。
56.前記遺伝子産物は、短鎖干渉RNAまたはアプタマーである、態様54に記載の方法。
57.前記ポリペプチドは、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様55に記載の方法。
58.前記ポリペプチドは、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子2、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮成長因子、ロドプシン、X連鎖アポトーシス阻害物質、レチノスキシン、RPE65、網膜色素変性GTPアーゼ相互作用タンパク質1、ペリフェリン、ペリフェリン-2、ロドプシン、RdCVF、網膜色素変性GTPアーゼ制御物質(RPGR)、またはソニックヘッジホッグである、態様57に記載の方法。
59.前記ポリペプチドは、RNAガイドエンドヌクレアーゼである、態様55に記載の方法。
60.眼疾患を処置する方法であって、処置を必要とする個体に対して、態様39~52のいずれか1つに記載の組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ビリオンまたは態様53に記載の薬学的組成物を有効量で投与することを含む、方法。
57.前記ポリペプチドは、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様55に記載の方法。
58.前記ポリペプチドは、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子2、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮成長因子、ロドプシン、X連鎖アポトーシス阻害物質、レチノスキシン、RPE65、網膜色素変性GTPアーゼ相互作用タンパク質1、ペリフェリン、ペリフェリン-2、ロドプシン、RdCVF、網膜色素変性GTPアーゼ制御物質(RPGR)、またはソニックヘッジホッグである、態様57に記載の方法。
59.前記ポリペプチドは、RNAガイドエンドヌクレアーゼである、態様55に記載の方法。
60.眼疾患を処置する方法であって、処置を必要とする個体に対して、態様39~52のいずれか1つに記載の組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ビリオンまたは態様53に記載の薬学的組成物を有効量で投与することを含む、方法。
61.投与は、眼内注射によるものである、態様60に記載の方法。
62.投与は、硝子体内注射または脈絡膜上注射によるものである、態様60に記載の方法。
63.前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性、黄斑変性、網膜分離、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、1色覚、または色覚異常である、態様60~62のいずれか1つに記載の方法。
62.投与は、硝子体内注射または脈絡膜上注射によるものである、態様60に記載の方法。
63.前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性、黄斑変性、網膜分離、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、1色覚、または色覚異常である、態様60~62のいずれか1つに記載の方法。
以下の実施例は、本発明を作成及び使用する方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供するために示され、発明者らが発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、また、以下の実験が実施された全ての実験であること、または以下の実験の他に実験が実施されていないことを表すようにも意図されていない。使用する数字(例えば、量、温度等)については正確さを保証するように努力が払われているが、ある程度の実験的誤差及び偏差は考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧前後である。標準的な省略形が使用され得る。例えば、bpは塩基対(複数可)、kbはキロベース(複数可)、plはピコリットル(複数可)、sまたはsecは秒(複数可)、minは分(複数可)、hまたはhrは時間(複数可)、aaはアミノ酸(複数可)、kbはキロベース(複数可)、bpは塩基対(複数可)、ntはヌクレオチド(複数可)、i.m.は筋肉内(に)、i.p.は腹腔内(に)、s.c.は皮下(に)などである。
実施例1:バリアントAAVカプシドを含むAAVビリオン
定向進化アプローチを通じて、複数のAAVカプシドのバリアントを導出した。バリアントAAVカプシドを含むAAVビリオンは、例えば、硝子体内注射を介し投与されたときに、霊長類網膜に感染する。霊長類は、高明瞭度の視覚のための中心窩を有し、ヒトの網膜疾患にとっての重要な前臨床モデルである。
定向進化アプローチを通じて、複数のAAVカプシドのバリアントを導出した。バリアントAAVカプシドを含むAAVビリオンは、例えば、硝子体内注射を介し投与されたときに、霊長類網膜に感染する。霊長類は、高明瞭度の視覚のための中心窩を有し、ヒトの網膜疾患にとっての重要な前臨床モデルである。
AAVパッケージング
バリアントAAVカプシドを含むAAVビリオンを、スクリーニングにより同定した。このスクリーニングのために、1)およそアミノ酸588に7merペプチド挿入を含有し、5′LAリンカー及び3′Aリンカーで囲まれているAAV2ベースの7merペプチドディスプレイライブラリー、2)およそアミノ酸584に7merペプチド挿入を伴い、5′TGリンカー及び3′GLSリンカーを有するAAV4ベースの7merペプチドディスプレイライブラリー、3)およそアミノ酸575に7merペプチド挿入を伴い、5′TGリンカー及び3′GLSリンカーを有するAAV5ベースの7merペプチドディスプレイライブラリー、4)およそアミノ酸591の位置に7merペプチドディスプレイライブラリーを含有する、5′TGリンカー及び3′GLSリンカーを有する祖先AAV配列(Santiago-Ortiz et al.,2015)ベースのライブラリー、ならびに5)およそアミノ酸588の表面露出位置にセミランダムな変異を有するAAV2ベースのライブラリー(Koerber,Jang,& Schaffer,2008)の5つのライブラリーを使用した:。ウイルスのパッケージングは、Koerber et al.(2008)(上記参照)、Fowler et al.Nat Protoc 9,2267-2284(2014)で過去に説明されているように、各ウイルスゲノムが、そのゲノムがコードするカプシドタンパク質シェル内に包まれるように行った。そのため、選択を通じた機能的改善は、ウイルスカプシド内に含まれたゲノム配列に関連づけられ得る。簡潔に述べると、HEK293T細胞の三重の一過性トランスフェクションによりAAVベクターを産生し、イオジキサノール密度遠心処理を介して精製し、Amicon濾過によりバッファーをPBSに交換した。DNアーゼ抵抗性のウイルスゲノム力価を、BioRad iCyclerを用いた定量的リアルタイムPCRにより測定した。このライブラリーから、in vivoの反復スクリーニング選択プロセスを使用して、硝子体から霊長類網膜に感染する能力を有するバリアントを同定した(図1)。霊長類の眼に、各ラウンドにおいて約250μLの1×1013~1×1014vg/mLの力価のウイルスを注射した。注射から3週間後、眼を摘出し、網膜の中心及び周辺領域から網膜パンチを採取した(図1)。様々な網膜層からのDNAをアッセイし、カプシド挿入物を同定した。各ラウンドの注射の後、採取細胞から、プライマーHindIII_F1及びNotI_R1、AscI_R1、またはSpeI_R1(リバースプライマーは固有のAAV骨格に対し特異的)を用いてPCRによりカプシド配列を回収して、ライブラリーのグループの分離を維持した。次に、PCRアンプリコンを消化させ、再クローニングして骨格にした。RPE細胞を網膜細胞から分離し、組織を凍結した。クリオスタット上で網膜細胞を包埋及び薄切りして、外顆粒層内の光受容体を単離した。次に、単離した光受容体またはRPEからDNAを収集し、cap遺伝子をPCR増幅した。回収したcap遺伝子を次のAAVパッケージングに使用した。
バリアントAAVカプシドを含むAAVビリオンを、スクリーニングにより同定した。このスクリーニングのために、1)およそアミノ酸588に7merペプチド挿入を含有し、5′LAリンカー及び3′Aリンカーで囲まれているAAV2ベースの7merペプチドディスプレイライブラリー、2)およそアミノ酸584に7merペプチド挿入を伴い、5′TGリンカー及び3′GLSリンカーを有するAAV4ベースの7merペプチドディスプレイライブラリー、3)およそアミノ酸575に7merペプチド挿入を伴い、5′TGリンカー及び3′GLSリンカーを有するAAV5ベースの7merペプチドディスプレイライブラリー、4)およそアミノ酸591の位置に7merペプチドディスプレイライブラリーを含有する、5′TGリンカー及び3′GLSリンカーを有する祖先AAV配列(Santiago-Ortiz et al.,2015)ベースのライブラリー、ならびに5)およそアミノ酸588の表面露出位置にセミランダムな変異を有するAAV2ベースのライブラリー(Koerber,Jang,& Schaffer,2008)の5つのライブラリーを使用した:。ウイルスのパッケージングは、Koerber et al.(2008)(上記参照)、Fowler et al.Nat Protoc 9,2267-2284(2014)で過去に説明されているように、各ウイルスゲノムが、そのゲノムがコードするカプシドタンパク質シェル内に包まれるように行った。そのため、選択を通じた機能的改善は、ウイルスカプシド内に含まれたゲノム配列に関連づけられ得る。簡潔に述べると、HEK293T細胞の三重の一過性トランスフェクションによりAAVベクターを産生し、イオジキサノール密度遠心処理を介して精製し、Amicon濾過によりバッファーをPBSに交換した。DNアーゼ抵抗性のウイルスゲノム力価を、BioRad iCyclerを用いた定量的リアルタイムPCRにより測定した。このライブラリーから、in vivoの反復スクリーニング選択プロセスを使用して、硝子体から霊長類網膜に感染する能力を有するバリアントを同定した(図1)。霊長類の眼に、各ラウンドにおいて約250μLの1×1013~1×1014vg/mLの力価のウイルスを注射した。注射から3週間後、眼を摘出し、網膜の中心及び周辺領域から網膜パンチを採取した(図1)。様々な網膜層からのDNAをアッセイし、カプシド挿入物を同定した。各ラウンドの注射の後、採取細胞から、プライマーHindIII_F1及びNotI_R1、AscI_R1、またはSpeI_R1(リバースプライマーは固有のAAV骨格に対し特異的)を用いてPCRによりカプシド配列を回収して、ライブラリーのグループの分離を維持した。次に、PCRアンプリコンを消化させ、再クローニングして骨格にした。RPE細胞を網膜細胞から分離し、組織を凍結した。クリオスタット上で網膜細胞を包埋及び薄切りして、外顆粒層内の光受容体を単離した。次に、単離した光受容体またはRPEからDNAを収集し、cap遺伝子をPCR増幅した。回収したcap遺伝子を次のAAVパッケージングに使用した。
図1は、霊長類網膜AAVバリアントの発生に使用する定向進化法の示している。ペプチドディスプレイライブラリーを作成し、AAVベクターにパッケージングし、硝子体内注射を介して霊長類の眼に注射した。反復的な選択ラウンドを使用して、ベクターのプールからAAVバリアントをポジティブ選択した。3選択ラウンドの次にエラープローンPCRを行い、その次に追加の選択ラウンドを行った。
選択ラウンドからのAAVライブラリーのディープシークエンシング
5選択ラウンドの次に、Illuminaディープシークエンシングを使用して、AAVバリアントのライブラリー内の相対的提示率がラウンドにわたって増大するバリアントを同定した。ウイルスライブラリー内の提示率増大は、ポジティブ選択と、硝子体から霊長類網膜に感染する能力とを示す。7mer挿入またはループスワップ変異部位を含有する約75~85塩基対領域を、採取DNAからPCR増幅した。プライマーは、複数の選択ラウンドからのアンプリコンのマルチプレクシングを可能にする固有のバーコードを含有するIlluminaアダプター配列を含んだ。Illumina HiSeq 2500上での100サイクルのシングルリードランにより、PCRアンプリコンを精製しシークエンシングした。DNA配列をアミノ酸配列に翻訳し、固有の7mer挿入配列を含有するリードをカウントするためのカスタムPythonコードを書いた。リードカウントを、ランにおけるリード総数により正規化した。Python及びPandasを使用して、定向進化の動態を解析し、プロットを作成した。
5選択ラウンドの次に、Illuminaディープシークエンシングを使用して、AAVバリアントのライブラリー内の相対的提示率がラウンドにわたって増大するバリアントを同定した。ウイルスライブラリー内の提示率増大は、ポジティブ選択と、硝子体から霊長類網膜に感染する能力とを示す。7mer挿入またはループスワップ変異部位を含有する約75~85塩基対領域を、採取DNAからPCR増幅した。プライマーは、複数の選択ラウンドからのアンプリコンのマルチプレクシングを可能にする固有のバーコードを含有するIlluminaアダプター配列を含んだ。Illumina HiSeq 2500上での100サイクルのシングルリードランにより、PCRアンプリコンを精製しシークエンシングした。DNA配列をアミノ酸配列に翻訳し、固有の7mer挿入配列を含有するリードをカウントするためのカスタムPythonコードを書いた。リードカウントを、ランにおけるリード総数により正規化した。Python及びPandasを使用して、定向進化の動態を解析し、プロットを作成した。
ディープシークエンシング解析
ライブラリー当たり約1×107 のバリアントからトップバリアントを選択した。パフォーマンスが最高のバリアントは、最初のプラスミドライブラリーとの対比で、最終の選択ラウンドで倍数増大が最も大きいバリアントとして選んだ(最終ラウンドのリード数(ラウンドにおけるリード総数を基準に正規化)/ライブラリー内のリード数(ラウンドにおけるリード総数を基準に正規化))。プラスミドライブラリーのシークエンシングで出現しないバリアントの解析を可能にするため、各個別バリアントに対する正規化の前にシュードカウント1を加えた。Fowler et al.(2014)上記参照。ペプチド挿入のアミノ酸配列を図2に示す。
ライブラリー当たり約1×107 のバリアントからトップバリアントを選択した。パフォーマンスが最高のバリアントは、最初のプラスミドライブラリーとの対比で、最終の選択ラウンドで倍数増大が最も大きいバリアントとして選んだ(最終ラウンドのリード数(ラウンドにおけるリード総数を基準に正規化)/ライブラリー内のリード数(ラウンドにおけるリード総数を基準に正規化))。プラスミドライブラリーのシークエンシングで出現しないバリアントの解析を可能にするため、各個別バリアントに対する正規化の前にシュードカウント1を加えた。Fowler et al.(2014)上記参照。ペプチド挿入のアミノ酸配列を図2に示す。
このアプローチを通じて生成したバリアントにより、硝子体内注射を用いた霊長類網膜における非侵襲的な汎網膜遺伝子治療戦略が可能になる。このようなAAVベクターは、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、桿体錐体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、1色覚、X連鎖性網膜分離、CRB1、オプトジェネティック治療、栄養及び生存因子(例えば、GDNF、BDNF、FGF、RdCVF、RdCVFL、XIAP)、及びsFLTのような血管新生のブロッカーの発現を含めた、網膜変性疾患のための遺伝子増強治療に使用され得る。また、このようなベクターは、網膜疾患における遺伝子修正または追加モデル作成のためのCRISPR/Cas9のような遺伝子編集ツールの送達にも使用され得る。
参考文献
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実施例2:GFPバーコードライブラリーの構築及びシークエンシングの方法
GFPバーコードライブラリーの構築
eGFPを駆動する自己相補的CAGプロモーターを含有するAAV ITRコンストラクトの後に、固有の25bp DNAバーコードをクローニングした(CAG-GFP-バーコード-pA)。個別のバリアントを、異なるバーコードを含有するコンストラクトと別々にパッケージングした。次に、バリアントを力価一致させ等しい比率で混合し、その後にマウス、イヌ、及び霊長類に注射した。
GFPバーコードライブラリーの構築
eGFPを駆動する自己相補的CAGプロモーターを含有するAAV ITRコンストラクトの後に、固有の25bp DNAバーコードをクローニングした(CAG-GFP-バーコード-pA)。個別のバリアントを、異なるバーコードを含有するコンストラクトと別々にパッケージングした。次に、バリアントを力価一致させ等しい比率で混合し、その後にマウス、イヌ、及び霊長類に注射した。
GFPバーコードライブラリーのディープシークエンシング
バーコードを、イヌまたは霊長類の網膜組織から採取したDNAまたはcDNA(Superscript III逆転写酵素を用いてmRNAから作成)から直接的にPCR増幅した。網膜全体にわたる区域から、及びONLまたはRPEから、試料を収集した。プライマーは、GFPバーコード周辺の約50bpの領域を増幅し、複数の試料のマルチプレクシングを可能にするIlluminaアダプター配列及びセカンダリーバーコードを含有した。MiSeq上での100サイクルのシングルリードランにより、PCRアンプリコンを精製しシークエンシングした。リードカウントを、ランにおけるリード総数により正規化した。Pythonで書いたカスタムコードを用いてバーコード存在量の解析を実施し、次にPandasでプロットを作成した。注射したライブラリーに対する総ライブラリーの倍数増大(回収試料における合計%/注射したライブラリーにおける合計%)に基づいて、パフォーマンスが最高のバリアントを選択した。n=1の霊長類に対し解析を実施した。
バーコードを、イヌまたは霊長類の網膜組織から採取したDNAまたはcDNA(Superscript III逆転写酵素を用いてmRNAから作成)から直接的にPCR増幅した。網膜全体にわたる区域から、及びONLまたはRPEから、試料を収集した。プライマーは、GFPバーコード周辺の約50bpの領域を増幅し、複数の試料のマルチプレクシングを可能にするIlluminaアダプター配列及びセカンダリーバーコードを含有した。MiSeq上での100サイクルのシングルリードランにより、PCRアンプリコンを精製しシークエンシングした。リードカウントを、ランにおけるリード総数により正規化した。Pythonで書いたカスタムコードを用いてバーコード存在量の解析を実施し、次にPandasでプロットを作成した。注射したライブラリーに対する総ライブラリーの倍数増大(回収試料における合計%/注射したライブラリーにおける合計%)に基づいて、パフォーマンスが最高のバリアントを選択した。n=1の霊長類に対し解析を実施した。
図9は表1を示し、図10は表2を示している。
表1は、GFPバーコードライブラリー注射後に光受容体から回収した霊長類由来バリアント及び対照のランキングを示している。表2は、GFPバーコードライブラリー注射後にRPE細胞から回収した霊長類由来バリアント及び対照のランキングを示している。ライブラリーは、固有のDNAバーコードと融合しているGFPと共にパッケージングされた個別のバリアントを含有した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、網膜内の特定の細胞タイプから回収したDNAからバーコードを増幅した。表1及び表2の「領域」とは、DNAを回収した領域を示す。各バリアントのリードの倍数増大は、(各固有バリアントに対応する)回収細胞内の各固有バーコードに対するリード数を、注射したライブラリーにおける各バリアントに対するリード数で割ることにより算出した。この表は、網膜内の複数の位置にわたる倍数増大の平均を示す。バリアントを、バーコードの倍数増大によりランク付けした。
図11は、霊長類網膜におけるGFPバーコードライブラリーのGFP発現を示している。プールされたGFPバーコードライブラリー(全ての試験対象ウイルスを含有)の硝子体内注射からもたらされるGFP発現は、主に網膜外層に位置し、AAV24YFの発現よりも網膜外層に向けられる向性を伴った。
実施例3
霊長類試験
4~10歳のカニクイザルを全ての試験で使用し、硝子体内注射を行った。フルオロフォア発現のために使用したサルに、免疫抑制のため、毎日シクロスポリンの皮下注射を6mg/kgの用量にて投与し、150~200ng/mlのターゲット範囲内の血中トラフレベルに基づいて調整した。注射から3週間後、自己蛍光設定を伴って、2つの網膜から共焦点走査型レーザー検視鏡画像(Spectralis HRA、Heidelberg Engineering)を取得した。これにより、有効なtdTomato及びGFPの視覚化がもたらされる。組織診断のため、サルを安楽死させ、両方の網膜を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、共焦点顕微鏡法により組織を調べた。本実験の結びにあたり、安楽死は、American Veterinary Medical AssociationのPanel on Euthanasiaが推奨するように、静脈内の過量のペントバルビタールナトリウム(75mg kg-1)を投与することにより達成した。次に、霊長類網膜の小片を30%スクロース中で調製し、OCT培地に包埋し、瞬間冷凍し、ネイティブフルオロフォア発現の共焦点顕微鏡イメージング用に20μmに薄切りした。標識用の抗体は、抗GFP(A11122、Thermo、1:250)、抗ビメンチン(Dako、1:1000)、ピーナツアグルチニン(PNA)(Molecular Probes、1:200)、及び抗錐体アレスチン(7G6、1:50)とした。手順は、ARVO Statement for the Use of Animals及びOffice of Laboratory Animal Care at the University of Rochesterのガイドラインに従って行った。
霊長類試験
4~10歳のカニクイザルを全ての試験で使用し、硝子体内注射を行った。フルオロフォア発現のために使用したサルに、免疫抑制のため、毎日シクロスポリンの皮下注射を6mg/kgの用量にて投与し、150~200ng/mlのターゲット範囲内の血中トラフレベルに基づいて調整した。注射から3週間後、自己蛍光設定を伴って、2つの網膜から共焦点走査型レーザー検視鏡画像(Spectralis HRA、Heidelberg Engineering)を取得した。これにより、有効なtdTomato及びGFPの視覚化がもたらされる。組織診断のため、サルを安楽死させ、両方の網膜を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、共焦点顕微鏡法により組織を調べた。本実験の結びにあたり、安楽死は、American Veterinary Medical AssociationのPanel on Euthanasiaが推奨するように、静脈内の過量のペントバルビタールナトリウム(75mg kg-1)を投与することにより達成した。次に、霊長類網膜の小片を30%スクロース中で調製し、OCT培地に包埋し、瞬間冷凍し、ネイティブフルオロフォア発現の共焦点顕微鏡イメージング用に20μmに薄切りした。標識用の抗体は、抗GFP(A11122、Thermo、1:250)、抗ビメンチン(Dako、1:1000)、ピーナツアグルチニン(PNA)(Molecular Probes、1:200)、及び抗錐体アレスチン(7G6、1:50)とした。手順は、ARVO Statement for the Use of Animals及びOffice of Laboratory Animal Care at the University of Rochesterのガイドラインに従って行った。
結果
霊長類網膜におけるAAVの定向進化
非ヒト霊長類は、ヒトに最も密接に関係し、網膜の解剖学的構造がヒトのものに類似しているため、イヌに加えて、ヒトの治療開発にとってクリティカルな前臨床モデルである。詳細には、霊長類は、中心窩を有する唯一の大型動物モデルである。中心窩は、読書のような日常活動にとって最も重要であり、生活の質に対しクリティカルであり、多数の網膜変性で喪失する、網膜における特化された高明瞭度区域である。イヌの試験で観察された種特異性は、霊長類網膜における定向進化というさらなる道筋を追求する動機を発明者らに与えた。EP2、EP5、EP6、EP8、EP9、EP-祖先、AAV2-7mer、祖先-7mer(Santiago-Ortiz et al.Gene Ther 22,934-946(2015))、及びループスワップ(Koerber et al.Mol Ther 17,2088-2095(2009))の9つのライブラリーをパッケージングし、霊長類スクリーニングに含めた。経時的な5選択ラウンド(ラウンド3の後に1ラウンドのエラープローンPCRを実施)のためにライブラリーを注射し、採取し、再パッケージングした。AAV cap遺伝子をONLからPCR増幅し、同時に上を覆うRPEからもPCR増幅した。EPライブラリーからのバリアントが網膜組織から回収されなかったため、EPライブラリーはラウンド3で中止した。ラウンド4で、別々のPCRアニーリング部位及び制限部位により他のライブラリーから単離した別々の骨格を用いて、追加ライブラリー(AAV4-7mer及びAAV5-7mer)を選択に追加した
霊長類網膜におけるAAVの定向進化
非ヒト霊長類は、ヒトに最も密接に関係し、網膜の解剖学的構造がヒトのものに類似しているため、イヌに加えて、ヒトの治療開発にとってクリティカルな前臨床モデルである。詳細には、霊長類は、中心窩を有する唯一の大型動物モデルである。中心窩は、読書のような日常活動にとって最も重要であり、生活の質に対しクリティカルであり、多数の網膜変性で喪失する、網膜における特化された高明瞭度区域である。イヌの試験で観察された種特異性は、霊長類網膜における定向進化というさらなる道筋を追求する動機を発明者らに与えた。EP2、EP5、EP6、EP8、EP9、EP-祖先、AAV2-7mer、祖先-7mer(Santiago-Ortiz et al.Gene Ther 22,934-946(2015))、及びループスワップ(Koerber et al.Mol Ther 17,2088-2095(2009))の9つのライブラリーをパッケージングし、霊長類スクリーニングに含めた。経時的な5選択ラウンド(ラウンド3の後に1ラウンドのエラープローンPCRを実施)のためにライブラリーを注射し、採取し、再パッケージングした。AAV cap遺伝子をONLからPCR増幅し、同時に上を覆うRPEからもPCR増幅した。EPライブラリーからのバリアントが網膜組織から回収されなかったため、EPライブラリーはラウンド3で中止した。ラウンド4で、別々のPCRアニーリング部位及び制限部位により他のライブラリーから単離した別々の骨格を用いて、追加ライブラリー(AAV4-7mer及びAAV5-7mer)を選択に追加した
ディープシークエンシングにより、イヌのスクリーニングからの観察と同様、ライブラリーは約106 ~約107 の個別バリアントを含有し、これらは6選択ラウンドにわたって約104 ~約105 のバリアントに収束することが明らかになった。これは、サンガーシークエンシングを通じては観察することが不可能な多様性である(図12A)。イヌのスクリーニングで観察されたように、解析した各ライブラリーにおいて、初期のプラスミドライブラリー内のごく一部のライブラリーメンバーが過剰に提示された(図12B)。選択ラウンドにわたる高スループットシークエンシングからの結果の解析により、各ライブラリーについて、選択ラウンド中に顕著に出現が増大したバリアントのサブセットが明らかになった(図12C)。
霊長類網膜におけるセカンダリーバーコードGFPライブラリーのスクリーニング
これら5つのライブラリー(図12C)から16個のバリアントを選択して、対照としてのAAV2、AAV2-4YF+TV、AAV4、及びAAV5と共に、これらをGFPバーコードライブラリーに対するセカンダリー選択ラウンドに含めた。この新たなライブラリーを霊長類の両眼に注射し、注射から3週間後、網膜全体にわたる諸位置から生検を収集した(12D)。GFPバーコードライブラリーの注射からもたらされたGFP発現は、主に光受容体に、さらに一部の網膜内層細胞にも見いだされた。これは、より強力な網膜内層発現をもたらしたAAV2または7m8からシフトしている向性である(図12E)。
これら5つのライブラリー(図12C)から16個のバリアントを選択して、対照としてのAAV2、AAV2-4YF+TV、AAV4、及びAAV5と共に、これらをGFPバーコードライブラリーに対するセカンダリー選択ラウンドに含めた。この新たなライブラリーを霊長類の両眼に注射し、注射から3週間後、網膜全体にわたる諸位置から生検を収集した(12D)。GFPバーコードライブラリーの注射からもたらされたGFP発現は、主に光受容体に、さらに一部の網膜内層細胞にも見いだされた。これは、より強力な網膜内層発現をもたらしたAAV2または7m8からシフトしている向性である(図12E)。
図12A-12Fは、霊長類網膜におけるAAVの定向進化を示している。(A)バリアントライブラリーのディープシークエンシングにより、選択ラウンドにわたるバリアントの収束が明らかになった。(B)評価した各ライブラリーにおいて、少ない割合のバリアントがプラスミドライブラリーで過剰に提示されている。(C)スキャッタープロットは、霊長類網膜に注射した各ライブラリーの最終選択ラウンドにおける個別のバリアントの挙動を示している。元のライブラリーで過剰に提示されたバリアントは、青色に着色されている。最終選択ラウンドで提示率の倍数増大が最も大きかったバリアントは、マゼンタで示されている。元のライブラリーで過剰に提示され、かつ選択ラウンドにわたって顕著に提示率が増大したバリアントは、オレンジ色に着色されている。(D)霊長類網膜のマップは、選択ラウンド及びGFPバーコードライブラリーのために収集された試料の分布を示している。バリアントの色分けは、図2と同じである。(E)バーコードライブラリーからもたらされたGFP発現により、発現が、選択されたバリアントでは網膜外層向性にシフトしていることが明らかになった。(F)霊長類網膜外層におけるGFPバーコードライブラリー注射の結果を示している。バリアントのリストは、パフォーマンス最高(上)から最低(下)のベクターの順に並べられており、付された値はバリアントが他のベクターと競合した程度を示し、AAVライブラリーにおける合計%/回収ライブラリーにおける合計%として表現されている。
トップパフォーマンスの霊長類バリアントの検証
網膜外層におけるベクターのパフォーマンスの定量化により、AAV2ベースのバリアントは他の血清型ベースのウイルスよりもパフォーマンスが優れていることが明らかになった。あるベクター、ループスワップバリアントAAV2、およそ588-LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号116)は、他のバリアントよりもパフォーマンスが優れていたが、より低いウイルス力価(約5×1011vg/mL)をもたらした。
網膜外層におけるベクターのパフォーマンスの定量化により、AAV2ベースのバリアントは他の血清型ベースのウイルスよりもパフォーマンスが優れていることが明らかになった。あるベクター、ループスワップバリアントAAV2、およそ588-LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号116)は、他のバリアントよりもパフォーマンスが優れていたが、より低いウイルス力価(約5×1011vg/mL)をもたらした。
そのため、GFPバーコードスクリーニングからのランキング2位のバリアントであり、高い力価(約5×1013vg/mL)でパッケージングされたAAV2-LALIQDSMRA(配列番号117、NHP#9と命名)を、網膜内層の神経節細胞及び網膜外層の錐体に対象を絞る第1ラウンドの検証試験に選択した。錐体光受容体は、成人の黄斑変性(AMD)に関与する。黄斑変性は、先進国において2040年までに全世界で2億8,800万人が発症すると予測されている失明の最も一般的な原因であるため、錐体光受容体は網膜遺伝子治療の一次標的である。NHP#9を、RGC内でtdTomatoを駆動するSNCGプロモーター及び錐体内でGFPの発現を駆動するpR1.7プロモーターと共にパッケージングした。この両方のコンストラクトをコードするベクターを、等しい比率(約1.5×1012vg/コンストラクト/眼)で混合し、カニクイザルに硝子体内注射した。先に説明したバリアント、7m8(Dalkara et al.(2013)上記参照)を、等しい力価の同じコンストラクトと共にパッケージングし、反対側の眼の硝子体に注射した。NHP#9を注射した眼において、tdTomatoレポーターのRGCでの発現は、網膜全体にわたり神経節細胞に効率的に感染した7m8と比べて低かったが、中心窩錐体での発現は、7m8との対比で大きく増大した。これは、網膜内層から網膜外層内の光受容体に向性がシフトしたことを示すものである。ddCT法を用いて実施したqRT-PCRにより、GFP発現が7m8との対比で11.71(10.37~13.22)倍増大したことが明らかになった。平坦にマウントした網膜から収集した画像に対し、Imarisソフトウェアを用いて実施した標識細胞のカウントからも、形質導入された神経節細胞の数の実質的な低下と、NHP#9に標的化された錐体の数の増大とが確認された。
次に、GFPバーコードスクリーニングからのランキングトップのバリアントであるループスワップバリアント、およそ588-LQRGVRIPSVLEVNGQ(配列番号118、NHP#26と命名)についても、産生されたウイルス粒子は少数であったが、検証試験を行った。約5×1010個の粒子のNHP#26-scCAG-eGFPを、カニクイザルの片眼に硝子体内注射した。注射した粒子数は少なかったが、中心窩内及び網膜全体にわたる効率的なGFP発現が観察された(図13G)。7m8、NHP#9(図13A)、及び他の天然存在の血清型で観察された中心窩のスポット状及び輪状の発現パターンとは対照的に、NHP#26の眼底イメージングは、小窩の中央に円盤状のGFP発現をもたらした(図13G)。平坦にマウントした網膜の共焦点イメージングからは、非常に少数のGFP陽性の神経節細胞軸索と共に、中心窩周辺のこの円盤状の発現パターンが確認された(図13H)。GFP発現の点状領域は、網膜血管の周囲でしばしば最も強く(図13I)、網膜全体にわたり位置していた。網膜から作製したクリオスタット切片のイメージングからは、GFP+神経節細胞軸索の欠如によって示されるように神経節細胞でのGFP発現が少ない一方で、ミュラー細胞、内顆粒層内のさらなる細胞、網膜全体にわたる中心窩錐体及び桿体において高レベルのGFP発現が見いだされたことが確認された(図13J~13Q)。
図13A-13Qは、霊長類網膜における進化したAAVの検証を示している。(A~F)7m8及びバリアントNHP#9にパッケージングされた約1.5×1012個のSCNG-tdTomato粒子及び約1.5のpR1.7-eGFPの霊長類網膜への同時注射を行った。7m8の硝子体内注射(A、C、E)は、ロバストな神経節細胞でのtdTomato発現及び中心窩錐体でのGFP発現をもたらした。これに対し、等しい数のNHP#9粒子の注射は、7m8との対比で、神経節細胞での発現低減及び錐体でのGFPの発現増大をもたらした(B、D、F)。(G)5×1010個のNHP#26-scCAG-GFP粒子を注射した後の霊長類網膜における眼底イメージングは、小窩の中央における円盤状のGFP発現と、網膜全体にわたる点状のGFP発現パターンとをもたらした。(H)平坦にマウントした中心窩におけるネイティブGFP発現の共焦点イメージングを示している。(I)血管アーケードの外部区域におけるネイティブGFP発現の共焦点イメージングを示している。(J)中心窩を貫通したクリオスタット切片におけるネイティブGFP発現の共焦点イメージングを示している。(K)血管アーケードの外側の下網膜におけるネイティブGFP発現は、神経節細胞ではわずかなGFP発現を示すに過ぎないが、ミュラー細胞及び網膜外層内の光受容体では高レベルの発現を示している。RPEでは自己蛍光も観察された。(L)クリオスタット切片における抗GFP標識により、光受容体でのGFP発現(外節から明白)、ミュラー細胞でのGFP発現(網膜に広がるプロセスから明白)、及び水平プロセスを伴った内顆粒層内の細胞(介在ニューロンである可能性がある)でのGFP発現が明らかになった。(M)中心窩切片における抗GFP標識により、さらなるトランスフェクション錐体、ミュラーグリア、及び介在ニューロンが明らかになっている。(N)抗錐体アレスチン及び抗GFPによる同時標識により、視神経乳頭に隣接して作成した切片において、桿体光受容体でのGFP発現、及び内顆粒層内の細胞でのGFP発現が明らかになっている。(O)低発現区域における抗錐体アレスチン及び抗GFP抗体による同時標識により、内顆粒層細胞でのGFP発現が明らかになっている。(P、Q)血管アーケードの外側から収集したクリオスタット切片からの共焦点画像のモンタージュは、内顆粒層及び網膜外層での効率的なGFP発現を示している。
本発明について、その具体的な実施形態を参照しながら説明してきたが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされてもよく、かつ等価物が代用されてもよいことを理解するはずである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセスステップ(1つまたは複数)は、本発明の目的、趣旨、及び範囲に適合するように多くの修正が施されてもよい。このような修正は全て、添付の請求項の範囲内であるように意図されている。
相互参照
本出願は、2017年6月30日に出願された米国仮特許出願第62/527,871号及び2017年7月20日に出願された同第62/535,042号の恩典を主張し、これらの出願の全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2017年6月30日に出願された米国仮特許出願第62/527,871号及び2017年7月20日に出願された同第62/535,042号の恩典を主張し、これらの出願の全体が参照により本明細書に組み入れられる。
連邦政府の助成による研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所の認可を受けた助成金番号1R01EY022975-01A1の下、政府支援によって行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所の認可を受けた助成金番号1R01EY022975-01A1の下、政府支援によって行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
Claims (1)
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ビリオンであって、
a)式I~VIのいずれか1つの異種ペプチドの挿入を含み、対応する親AAVカプシドタンパク質を含む対照AAVビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、前記網膜細胞の感染力の増大を付与する、バリアントAAVカプシドタンパク質と、
b)異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸と
を含む、rAAVビリオン。
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