CN114195859B - 一种适用于特异感染u251细胞的腺相关病毒突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种适用于特异感染U251细胞的腺相关病毒突变体。本发明利用AAV2/2的肽段突变文库，通过文库筛选获得可高效、特异感染U251的AAV血清型突变体。通过体外杀伤实验证实：本发明筛选得到的AAV血清型突变体能够特异性的感染和杀伤U251细胞，在体外研究胶质瘤发生发展的机理及胶质瘤治疗药物的开发方面有广泛的应用。

Description

一种适用于特异感染U251细胞的腺相关病毒突变体
技术领域
本发明病毒载体的包装及筛选，尤其涉及AAV突变体的包装及筛选。
背景技术
神经脑胶质细胞瘤(Glioma)是中枢神经系统常见的原发性恶性脑瘤，具有复发性高、 预后效果差、患者的死亡率高等特性，是目前最致命的肿瘤之一。目前对于胶质瘤还没有 特别有效的治疗策略，现有核心的治疗手段仍然是对瘤体进行常规的最大范围内切除手术， 以及放射治疗和化学治疗等。但由于脑胶质瘤恶性浸润性生长等特性，常规手术和化疗放 疗法只能极少地改善生活质量并略微延长一些患者的生存期，对于脑胶质瘤确诊后的五年 生存率并没有明显改善，且易复发。
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结 构的病毒，是目前被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗 研究中得到广泛应用。
U251人神经胶质细胞瘤细胞，该细胞系常被用作脑胶质瘤体外研究的工具模型，在此 细胞系上进行相关的机理研究和治疗效果检测。但此细胞转染效率不高，用腺相关病毒AAV 感染效率较低，且目前尚未有特异感染的血清型。现有的AAV血清型(AAV2/2)感染胶质 瘤细胞系(U251)效率低，且特异差，在相同的MOI(感染复数)下，对常用的工具细胞(293T 和NIH3T3)的感染效果更好。为了更好地在体外对胶质瘤细胞模型(U251)进行相关的研 究，并将腺相关病毒应用于胶质瘤的治疗中，我们利用AAV2/2的肽段突变文库，通过文库 筛选获得可高效、特异感染U251的AAV血清型突变体，为体外研究胶质瘤发生发展的机理 及胶质瘤治疗药物的开发提供了一种强大的工具。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，为了更好地在体外对胶质瘤细胞模型(U251)进行相关的研 究，并将腺相关病毒应用于胶质瘤的治疗中，本发明利用AAV2/2的肽段突变文库，通过文 库筛选获得可高效、特异感染U251的AAV血清型突变体，为体外研究胶质瘤发生发展的机 理及胶质瘤治疗药物的开发提供了一种强大的工具。
本发明公开了一种异源肽，其特征在于，所述异源肽为：
(a)氨基酸序列为ARLDITD或YHAFNIE所组成的多肽；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异源肽活 性的由(a)衍生出的多肽。
本发明还公开了定点突变的AAV2/2衣壳蛋白，其特征在于，所述衣壳蛋白氨基酸587～ 588之间被所述的异源肽插入。
本发明公开了AAV2/2血清型突变体，其特征在于，包括所述的衣壳蛋白。
本发明公开了一种核酸分子，其特征在于，编码所述的衣壳蛋白或所述的突变体。
本发明公开了一种核酸载体，其可操作地连接有所述的核酸分子。
本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，含有所述的核酸载体。
本发明提供了一种组合物或试剂盒，含有所述的衣壳蛋白或3所述的突变体或所述的 核酸分子或所述的核酸载体。
本发明还公开了所述的衣壳蛋白或所述的突变体或所述的核酸分子或所述的核酸载体 在用于制备治疗肿瘤的药物中的用途。进一步地，所述肿瘤为人神经胶质细胞瘤。
本发明公开了所述的突变体或所述的衣壳蛋白或所述的核酸分子或所述的核酸载体在 用于感染和/或杀伤U251细胞的用途。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
(1)本发明所述的AAV血清型突变体能够特异性地感染U251细胞，而野生对照组感染U251细胞的效果差，感染293T细胞的效果好；
(2)体外杀伤实验证明，本发明所述的AAV血清型突变体对U251有明显的杀伤，而对293T的杀伤则不明显，表明其能特异性感染U251细胞；
(3)体内杀伤实验证实，本发明所述的AAV血清型突变体对肿瘤的抑制作用较对照组 更加显著，具备被开发为抗肿瘤药物的前景。
附图说明
图1为实施例1中pAAV-short UBC-mScarlet-polyA-P40-AAV2-Cap-FLEX-SV40polyA 结构图；
图2为实施例2中文库病毒感染U251细胞的荧光图；
图3为突变血清型与AAV2病毒感染细胞的荧光图；
图4为突变血清型与AAV2病毒感染293T和U251的荧光图；
图5为突变血清型与AAV2病毒感染293T和U251的杀伤实验结果统计图；
图6突变血清型与AAV2病毒体内杀伤瘤体体积曲线图。
图7为本发明实施例3中穿梭载体pAAV-CAG-mCherry-WPRE载体图谱；
图8为本发明实施例4中pAAV-SV40增强子-hTERT-EGFP载体图谱；
图9为本发明实施例4中pAAV-SV40增强子-hTERT-TK载体图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例 范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品 说明书选择。
突变位点的选择：AAV2/2衣壳蛋白氨基酸587～588之间。
我们突变的位点是基于AAV2/2的血清型，野生型AAV2/2衣壳蛋白序列来自的NCBI号 为：NC_001401。
实施例1肽段突变体文库制备
1.1化学合成AAV2/2-7mer-NNS以下两个片段：
5'GGTCTCGCCTCCAGAGAGGCAACNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSAGACAAGCAGCTACCGGGAGACC3' (SEQ ID NO:1)
5'GGTCTCCCGGTAGCTGCTTGTCTSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNGTTGCCTCTCTGGAGGCGAGACC3' (SEQ ID NO:2)
1.2将合成的AAV2/2-7mer-NNS正链与反链引物各加10μL(引物的终浓度为10mM)采用退火的方式来获得AAV2/2-7mer-NNS模板。退火程序为：95℃，5min；95℃，1min；92min，1min；4℃，60min。其中，第二步和第三步，每个循环降3℃，一共25个循环。
1.3将质粒pAAV-short UBC-mScarlet-polyA-P40-AAV2-Cap-FLEX-SV40 polyA(其结 构和插入位点如图1所示)用BsaI进行单酶切，酶切体系(50uL)如表1所示。
表1
Figure BDA0003403880770000041
55℃酶切4h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用刀片将大片段切下并进行回收 纯化；
1.4将1.3步得到的纯化的酶切产物和1.2步得到的AAV2/2-7mer-NNS核苷酸序列采 用T4 DNA ligase进行连接。连接采用Takara的T4 DNA连接酶，10μL反应体系如表2 所示，4℃过夜酶连。
表2
Figure BDA0003403880770000042
1.5将10μL酶连产物加入到50μL文库专用电转感受态细胞(购自Lucigen公司)中，混匀放置后转入已预冷的电极杯当中，使用伯乐公司的电转仪进行电转，电转完，向 里面加入1mL在37℃预热的SOC液体培养基，随后37℃复苏1小时后，进行离心涂布。
1.6重复步骤1.4-1.5,直到克隆数量达到5*10^11。
实施例2文库病毒包装及筛选
2.1AAV肽段突变体文库病毒包装：按照每皿1.5*10^7个293AAV包装细胞接种到15cm 的细胞培养皿中，培养18-24h，当细胞贴壁后即可开始转染。采用PEI转染试剂将含有AAV2/2-7mer-NNS插入片段的pAAV-short UBC-mScarlet-polyA-P40-AAV2-Cap-FLEX-SV40polyA–insertion表达载体文库，包装质粒，辅助质粒转入到293AAV细胞中，转染72h 后，于荧光显微镜下计数AAV-293细胞中载体文库细胞的比例，以确定病毒包装效率。待 病毒包装完成后，用枪头反复吹打细胞，使所有细胞从培养皿上完全脱落下来，收集所有 细胞样品。
2.2病毒的纯化：将收集到的细胞样品在-80℃和37℃进行反复的冻融，离心，收集细 胞上清，用0.45μm的PVDF滤器去除细胞碎片，随后，再采用AAV纯化试剂盒对收集的 重组AAV病毒进行纯化来获取重组AAV病毒。
2.3重组AAV病毒滴度的测定：取20μL浓缩病毒液，加1μL RNase-free DNase， 混匀，37℃，孵育30min，10000rpm离心10min，取20μL上清加80μL稀释Buffer 至另一个无菌管中，混匀，100℃金属浴反应10min。自然冷却至室温，加入3μL蛋白酶 K，37℃孵育60min，100℃金属浴反应10min，冷却至室温。将上述样品稀释后用做模板， 采用实时定量PCR检测法测定重组AAV病毒滴度。qPCR反应体系及反应条件为：95℃，10min； 95℃，30s；60℃，30s，35个循环。
2.4AAV病毒感染U251细胞：
2.4.1细胞铺板：将U251细胞按40％汇合度接种到10cm细胞皿中，以每皿5x106细胞 进行铺板，铺多个细胞培养皿。
2.4.2病毒感染：用pAAV-short UBC-mScarlet-polyA-P40-AAV2-Cap-FLEX-SV40polyA–insertion表达载体文库病毒感染U251细胞。
2.4.3感染后48～72h的荧光图片如图2所示，从图中可以看到红光所占比例极少，只 有少数细胞能感染上。
2.5收集感染后的细胞，利用流式细胞分选仪进行荧光分选，选取红色荧光亮度在前 5％的细胞作为筛选的目的细胞进行收集。分选收集后的细胞铺入细胞皿中，进行扩增后收 集细胞；
2.6将收集到的细胞抽提基因组后进行PCR扩增，PCR产物高通量测序。
扩增引物：
AAV2-F：AACCAATCCCGTGGCTACGGAGC(载体上的正向引物)(SEQ ID NO:3)
AAV2-R：CCAGACCATGCCTGGAAGAACGC(载体上的反向引物)(SEQ ID NO:4)
加入接头和index序列的高通量测序使用引物使用如下:
NGS-AAV2-F：TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAAACCAATCCCGTGGCTACGGAGC(SEQ ID NO:5)
NGS-AAV2-R1：
GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGCGAGTAATCCAGACCATGCCTGGAAGAACGC(SEQ ID NO:6)
NGS-AAV2-R2：
GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGTCTCCGGACCAGACCAT GCCTGGAAGAACGC(SEQ ID NO:7)
NGS-AAV2-R3：
GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAATGAGCGCCAGACCATGCCT GGAAGAACGC(SEQ ID NO:8)
预期获得的测序序列为：
AACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACNNSNNSNNSNNSN NSNNSNNSAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGG(SEQID NO:9)
分析高通量测序结果，将出现频率高的突变体分别命名为AAV2/2-MTxx；如01号肽段 则为：AAV2/2-MT01。
实施例3AAV2/2突变体的筛选和验证
3.1 AAV2/2突变体的构建
以天然血清型AAV2/2为载体，在587-588为氨基酸处插入候选突变体AAV2/2-MTxx等 片段，获得新的血清型载体AAV2/2-MTxx等，根据高通量的结果，构建了40多个突变体。
3.2使用穿梭载体pAAV-CAG-mCherry-WPRE，分别以AAV2/2-MTxx等作为血清型载体包 装获得各种突变血清型的AAV病毒。
图7为穿梭载体pAAV-CAG-mCherry-WPRE载体图谱
3.3使用WPRE引物对以上病毒进行病毒滴度测定，并使用考染确认病毒VP1、VP2、VP3 表达情况。
3.4将pAAV-CAG-mCherry-WPRE的AAV2/2-MTxx等病毒，以MOI(感染复数)1*105分别 感染293T、NIH3T3和U251细胞，感染72h的荧光图如图3所示，其中AAV2-MT06和AAV2-MT08 效果最好。如图3所示，AAV2-MT06和AAV2-MT08相对于AAV2对照组(AAV2 WT)感染293T和NIH3T3细胞效果差，但在目标细胞U251中则具备很好的感染效果，说明AAV2-MT06和AAV2-MT08血清型能特异的感染U251细胞。
AAV2-MT06和AAV2-MT08的突变肽段序列为ARLDITD(SEQ ID NO:10)或YHAFNIE(SEQ ID NO:11)
实施例4AAV2/2突变体的体外杀伤实验
本实施例公开了基于AAV2 WT、AAV2-MT06、AAV2-MT08血清型的pAAV-SV40增强子-hTERT-TK-GCV系统在体外杀伤实验。
使用AAV2 WT、AAV2-MT06、AAV2-MT08作为血清型包装腺相关病毒载体pAAV-SV40增 强子-hTERT-EGFP和pAAV-SV40增强子-hTERT-TK，分别感染293T和U251细胞72h后，加入GCV药物处理，72h后采用CTG法检测细胞活性，评估不同血清型AAV2 WT、AAV2-MT06、AAV2-MT08包装的AAV2-SV40增强子-hTERT-TK-GCV系统对体外培养细胞的杀伤作用。
图8为pAAV-SV40增强子-hTERT-EGFP载体图谱，图9为pAAV-SV40增强子-hTERT-TK载体图谱
腺相关病毒载体pAAV-SV40增强子-hTERT-EGFP感染U251细胞72h的图如图4所示，AAV2-MT06和AAV2-MT08相对于AAV2对照组(AAV2 WT)感染293T细胞效果差，但能较好 的感染U251细胞。
经过计算，细胞杀伤试验的结果如图5所示，pAAV-SV40增强子-hTERT-TK组，AAV2/2 野生型(对照组)对293T和U251细胞都有一定的杀伤，且在293T细胞的存活率更低，杀 伤率更高；而AAV2-MT06和AAV2-MT08对U251有明显的杀伤，存活率分别为17.8％和28％； 而对293T的杀伤则不明显，存活率更高，存活率分别为85.9％和78.7％。说明AAV2-MT06 和AAV2-MT08血清型能特异的感染U251细胞。
实施例5 AAV2/2突变体的体内杀伤实验
本实施例公开了基于AAV2 WT、AAV2-MT06、AAV2-MT08血清型的pAAV-SV40增强子-hTERT-TK-GCV系统在体内肿瘤动物模型中杀伤实验。
皮下接种U251细胞成瘤，制作裸小鼠CDX模型；待瘤体长出后进行扦插传代，传代至 第三代，稳定瘤体后，将AAV2 WT、AAV2-MT06、AAV2-MT08作为血清型包装腺相关病毒载体pAAV-SV40增强子-hTERT-TK的病毒，瘤内注射，三天后腹腔注射GCV,每天一次，连续 注射14天，自病毒注射后开始，每周两次使用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤的体积， 描绘肿瘤的生长曲线；瘤体体积计算公式：肿瘤体积＝长径*短径*短径*0.5；对照组(生 理盐水)和实验组(AAV2/2WT、AAV2-MT06、AAV2-MT08)的U251皮下成瘤模型中的瘤体变化 曲线如图6所示，结果显示，AAV2 WT、AAV2-MT06、AAV2-MT08组均对瘤体有一定的抑制， AAV2-MT06和AAV2-MT08抑制效果更显著。
序列表
<110> 和元生物技术（上海）股份有限公司
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<130> L21110700F
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtctcgcct ccagagaggc aacnnsnnsn nsnnsnnsnn snnsagacaa gcagctaccg 60
ggagacc 67
<210> 2
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtctcccgg tagctgcttg tctsnnsnns nnsnnsnnsn nsnngttgcc tctctggagg 60
cgagacc 67
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaccaatccc gtggctacgg agc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccagaccatg cctggaagaa cgc 23
<210> 5
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttactatgcc gctggtggct ctagatgtga gaaagggatg tgctgcgaga aggctagaaa 60
ccaatcccgt ggctacggag c 81
<210> 6
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttcgtcttc tgccgtatgc tctacactga cctcaagtct gcacacgaga aggctagcga 60
gtaatccaga ccatgcctgg aagaacgc 88
<210> 7
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttcgtcttc tgccgtatgc tctacactga cctcaagtct gcacacgaga aggctagtct 60
ccggaccaga ccatgcctgg aagaacgc 88
<210> 8
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttcgtcttc tgccgtatgc tctacactga cctcaagtct gcacacgaga aggctagaat 60
gagcgccaga ccatgcctgg aagaacgc 88
<210> 9
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct accaacctcc agagaggcaa 60
cnnsnnsnns nnsnnsnnsn nsagacaagc agctaccgca gatgtcaaca cacaaggcgt 120
tcttccaggc atggtctgg 139
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Arg Leu Asp Ile Thr Asp
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Tyr His Ala Phe Asn Ile Glu
1 5

Claims (8)

1.一种插入异源肽的AAV2/2血清型衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述异源肽为：
氨基酸序列为ARLDITD或YHAFNIE所组成的多肽；
所述衣壳蛋白氨基酸587～588之间被所述的异源肽插入。
2.AAV2/2血清型突变体，其特征在于，包括权利要求1所述的衣壳蛋白突变体。
3.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的衣壳蛋白突变体或权利要求2所述的AAV2/2血清型突变体。
4.核酸载体，其可操作地连接有权利要求3所述的核酸分子。
5.宿主细胞，其特征在于，含有权利要求4所述的核酸载体。
6.组合物或试剂盒，含有权利要求1所述的衣壳蛋白突变体、权利要求2所述的AAV2/2血清型突变体、权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的核酸载体。
7.权利要求1所述的衣壳蛋白突变体、权利要求2所述的AAV2/2血清型突变体、权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的核酸载体在制备用于治疗人神经胶质细胞瘤的药物中的用途。
8.权利要求1所述的衣壳蛋白突变体、权利要求2所述的AAV2/2血清型突变体、权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的核酸载体在用于感染和/或杀伤U251细胞的用途，所述用途属于非诊断和治疗目的的。
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