CN111088286B - 一种重组腺相关病毒载体的构建和制备及其应用价值 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体的构建和制备及其应用价值。本发明是通过将具有致瘤性的HPV‑16 E6抗原基因突变为无致瘤性的E6抗原基因，再将该突变基因插入已经剔除结构基因的腺相关病毒载体中而获得的。该重组腺相关病毒可用于将其携带的突变型HPV‑16 E6抗原基因输送入单核细胞‑树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被该重组腺相关病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞可有效地杀灭HPV‑16 E6阳性细胞和肿瘤细胞，且无致瘤性。本发明的重组腺相关病毒载体及其相关产品还可被用抗HPV‑16感染及其相关的靶向性细胞免疫治疗。

Description

一种重组腺相关病毒载体的构建和制备及其应用价值
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种携带人乳头瘤病毒16型的突变型E6抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建和制备及其应用价值。
背景技术
腺相关病毒(AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(Samulski RJ,Srivastava A,Berns KI,Muzyczka N.Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids:genecorrection within the terminal repeats of AAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(Lip)基因和包膜(Cap)基因(Hermonat PL,LabowMA,Wright R,Berns KI,Muzyczka N.Genetics of adeno-associated virus:isolationand preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants.JVirol.51:329-339.Hermonat,P.L.,and Muzyczka,N.Use of adeno-associated virusas a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance intomammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和复制蛋白(Rep)基因之间的p5启动子(Labow MA,Hermonat PL,Berns KI.Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome.J Virol.160:251-258.)。
AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。AAV基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括与病毒复制有关的复制蛋白Rep基因和病毒衣壳(包膜)Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面的缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)。现有大量研究表明，将AAV基因组中的结构基因删除，可明显增加外源性基因的容量。此外，将具有外源性基因插入rAAV中，可制备成具有感染性的rAAV病毒颗粒。
人乳头瘤病毒(HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属。目前至少分离出130多种亚型。根据不同亚型，可分为高危型和低危型。其中对人类危害最大的是高危型，包括HPV-16、18、30、31、33、35、39与宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等恶性肿瘤密切相关。其主要发病机理之一是高危型HPV的E6基因编码的蛋白与抑癌基因p53的表达蛋白结合，引起细胞增殖失控，使抑癌基因对DNA的损伤修复功能丧失所致。
高危型HPV因为具有致瘤作用对人类的健康危害最大，而且以高危型HPV-16为主。一些地区宫颈癌组织中HPV16检出率可高达77.6％～82.6％。目前尚无确切治愈HPV感染的方法。为达到治愈目的，最理想的治疗是彻底清除受感染的细胞。受HPV-16感染的细胞均存在HPV-16E6抗原，而且该抗原具有较强的免疫原性。因此，HPV-16E6抗原是细胞免疫治疗非常理想的靶子。
人树突状细胞(Dedritic Cells，DC)是人体最重要、也是最主要的抗原提呈细胞。大量的研究已经证明无论在体内还是体外，受抗原刺激的DC细胞可诱导产生具有抗原特异性的细胞免疫反应。利用DC这一特性，可在体外诱导产生具有HPV-16E6抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)，裂解该抗原阳性的靶细胞，从而达到清除受HPV-16感染细胞的目的。由于HPV-16E6抗原是致癌蛋白，在宫颈癌等恶性肿瘤的发生中发挥最主要作用。因此，在体内和体外用野生型HPV-16E6抗原刺激免疫反应的发生，在安全性方面存在一定风险。所以，在实际应用中，必须除去HPV-16E6抗原的致瘤性，但又必须保留该抗原的免疫原性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的突变型E6抗原基因(E6m)的重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建和制备方法与应用价值。本发明提供的重组腺相关病毒载体，是一种携带无致瘤性的人乳头瘤病毒16型突变型E6抗原基因的重组腺相关病毒载体，该重组载体具有构建方便，安全性高，可以完全去除HPV-16E6抗原的致瘤性，并其表达的突变型E6抗原的免疫原性为受到影响。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种携带HPV-16突变型E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体，所述HPV-16E6m抗原基因的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示，是将HPV-16E6m基因插入出发载体，即腺相关病毒(AAV)载体中的已经被删除的腺相关病毒结构基因Rep和Cap的位置，并带有巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子，获得全新的重组腺相关病毒载体(rAAV)，即携带HPV-16E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体(简称“E6m重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E6m)。
我们的研究已证明HPV E6蛋白氨基酸序列中的特定位置的半胱氨酸改变为甘氨酸，即可消除E6蛋白的致瘤性，由于多个点突变的E6基因再次基因突变返祖的可能性远远小于一个点突变的E6基因的返祖几率，所以我们对E6基因进行三次点突变。这里，多点突变型HPV-16E6抗原基因是通过分子生物学技术，逐次将HPV-16E6抗原基因进行点突变得到。即：将HPV-16(Genebank：NC_001526.4)的E6抗原蛋白第113、118和143位的半胱氨酸(C)改变为甘氨酸(G)。通过将HPV-16E6基因开放读码框nt7461，nt7476和nt7551(图2)中胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即TGT(nt7461-7463，nt7476-7478和nt7551-7553)改变为GGT，获得可以表达无致瘤性的多点突变的HPV-16E6抗原基因(命名为HPV-16E6m基因)。
将HPV-16E6m基因插入腺相关病毒载体AVV中(该载体带巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子，获得携带HPV-16E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/HPV-16E6m。利用以上设计，也可将野生型HPV-16E6抗原基因插入上述腺相关病毒载体中，获得携带野生型HPV-16E6抗原基因的重组腺相关病毒载体，统称为“E6重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E6。但由于野生型HPV-16E6抗原具有致瘤性，故本发明不推荐用于临床实践，仅用于研究。
本发明还提供了一种构建所述重组腺相关病毒载体的方法，包括如下步骤：
S1、将HPV-16E6抗原的第113位进行一次点突变，将半胱氨酸突变为甘氨酸，即将HPV-16E6抗原基因开放读码框nt7461位的胸腺嘧啶替换为鸟嘌呤，得具有一个的单点突变型HPV-16E6抗原基因；
S2、将步骤S1所得具有一个的单点突变型HPV-16E6抗原的第118位进行第二次点突变，同样将半胱氨酸改变为甘氨酸，即将HPV-16E6基因开放读码框nt7476位的胸腺嘧啶替换为鸟嘌呤，得具有二个的点突变型的HPV-16E6抗原基因；
S3、将步骤S2所得具有二个的点突变型的HPV-16E6抗原的第143位进行点突变，将半胱氨酸改变为甘氨酸，即将HPV-16E6基因开放读码框nt7551位的胸腺嘧啶替换为鸟嘌呤，得HPV-16E6m；
S4将步骤S3所得HPV-16E6m抗原基因插入已将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，即得。
优选地，所述步骤S1中所述HPV-16E6抗原的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2所示；步骤S1中所述具有一个的单点突变型HPV-16E6抗原基因的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3所示。
优选地，步骤S2中所述具有二个的点突变型的HPV-16E6抗原基因的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种重组腺相关病毒质粒，其制备方法为：将重组腺相关病毒载体DNA－AAV/HPV-16E6m导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到AAV/HPV-16E6m质粒。
本发明还提供了一种具有感染性的重组腺相关病毒颗粒，其制备方法为：以所述重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16E6m质粒和pHelper质粒按1：1的比例混合，共转染AAV-HEK293细胞得到具有感染性的AAV病毒颗粒，命名为AAV/HPV-16E6m病毒。
本发明的另一目的是提供二种细胞系，其制备方法为：一种为用所述重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m病毒感染或转染单核细胞(Mo)-树突状细胞(DC)系得到。另一种为由所述DC激活的具有HPV16 E6抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes；CTL)。
获得此二种细胞系的方式为先分离出患者体内的单核细胞(Mo)，再将此药感染Mo后，体外诱导Mo成为具有抗原提呈功能的树突状细胞(DC)。此药亦可感染DC，但有可能导致DC对抗原的摄取或加工能力较差，从而导致疗效不佳。所获得的DC可回输患者体内，达到激活细胞免疫，即CTL反应。或在体外将表达HPV-16E6m抗原的成熟的DC所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输患者。
本发明还提供了一种AAV/HPV-16E6m病毒载体的应用，即裂解(杀伤)HPV-16E6抗原阳性的细胞的方法，包括如下步骤：
1)首先从患者体内分离外周血单个核细胞(PBMC)，再分离后，分别获得单核细胞(Mo)和淋巴细胞。以AAV/HPV-16E6m病毒载体感染或转染Mo后，在体外被诱导成为的树突状细胞(DC)，获得处理后的DC；
2)将步骤1)所得处理后的DC输入患者体内中，以激活患者体内的免疫反应，达到杀灭HPV-16E6抗原阳性细胞的目的；或将未被处理的T淋巴细胞与所述处理后的DC混合培养，刺激产生HPV-16E6抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，再将该抗原特异性CTL输入患者体内，杀灭HPV-16E6抗原阳性的细胞；或将被处理的毒性T淋巴细胞和被处理的DC输入患者体内中，杀灭HPV-16E6抗原阳性的细胞。
所述裂解(杀灭)HPV-16E6抗原阳性的细胞的方法可具体应用到细胞免疫治疗中，包括给予一个患者回输HPV-16E6抗原特异性CTL，该细胞由来源于患者自然产生的T淋巴细胞与来源于该患者的单核细胞-树突状细胞混合培养产生的。在混合培养之前，这些单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体感染；
或者，给予一个患者回输来源于患者的单核细胞-树突状细胞。在回输之前，这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体感染；
再或者，给予一个患者回输上述来源于患者的T淋巴细胞和来源于该患者的自然产生的单核细胞-树突状细胞。在回输之前，这些T淋巴细胞已经被本发明携带HPV-16E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体感染的单核细胞-树突状细胞处理。这些单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染。
我们的研究已证明HPV E6蛋白氨基酸序列中的特定位置的半胱氨酸改变为甘氨酸，即可消除E6蛋白的致瘤性，由于多个点突变的E6基因再次基因突变返祖的可能性远远小于一个点突变的E6基因的返祖几率，所以我们对E6基因进行三次点突变。这里，多点突变型HPV-16E6抗原基因是通过分子生物学技术，逐次将HPV-16E6抗原基因进行点突变得到。即：将HPV-16(Genebank：NC_001526.4)的E6抗原蛋白第113、118和143位的半胱氨酸(C)改变为甘氨酸(G)。通过将HPV-16E6基因开放读码框基因全长的nt7461，nt7476和nt7551(图2)中胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即TGT(nt7461-7463，nt7476-7478和nt7551-7553)改变为GGT，获得可以表达无致瘤性的多点突变的HPV-16E6抗原基因(命名为HPV-16E6m基因)。将多点突变的HPV-16E6抗原基因(即HPV-16E6m基因)与HPV-16E6抗原基因进行比对，比对结果见图3，nt419、nt434以及nt509位(Sbjct)的胸腺嘧啶(T)被替换为鸟嘌呤(G)[突变型E6基因的nt337、nt352以及nt427(Query)]。即获得HPV-16突变型E6m。
将HPV-16E6m基因插入腺相关病毒载体AVV中(该载体带巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子，获得携带HPV-16E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/HPV-16E6m。利用以上设计，也可将野生型HPV-16E6抗原基因插入上述腺相关病毒载体中，获得携带野生型HPV-16E6抗原基因的重组腺相关病毒载体，统称为“E6重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E6。但由于野生型HPV-16E6抗原具有致瘤性，故本发明不推荐用于临床实践，仅用于研究。
以本发明的HPV-16E6m重组腺相关病毒为载体，将HPV-16E6m抗原基因导入单核细胞，并诱导产生树突状细胞，亦可直接导入树突状细胞，表达E6m抗原蛋白，以达到患者体外和体内免疫刺激的目的，用以杀灭HPV-16E6抗原阳性的细胞，或以该树突状细胞刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)杀灭HPV-16E6抗原阳性的细胞。
所述由HPV-16感染导致的恶性肿瘤包括HPV-16E6抗原阳性的宫颈乳头瘤病变、宫颈癌、食管癌、结肠癌、膀胱移行细胞癌、支气管癌、阴茎癌、肛门癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌以及乳腺癌等。
本发明的重组腺相关病毒(rAAV)载体可将其携带的HPV-16E6m抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，携带HPV-16E6m抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突状细胞所诱导的细胞毒性T淋巴细胞可有效地杀灭HPV-16E6抗原阳性的细胞，而且无致病性(即无致瘤性)风险。因而，本发明的rAAV载体或与本发明rAAV载体相关的产品具有临床实践的价值。具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
与现有技术相比，本发明提供的重组腺相关病毒载体具有以下优点：
(1)本发明提供的重组腺相关病毒载体，其感染的树突状细胞所诱导的细胞毒性T淋巴细胞可有效地杀灭(裂解)HPV-16E6抗原阳性的细胞，而且无致病性(即无致瘤性)风险；
(2)本发明提供的重组腺相关病毒载体，可以应用于抗HPV-16感染的靶向性细胞免疫治疗；
(3)本发明提供的重组腺相关病毒载体，在临床应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
附图说明
图1为携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E6m基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E6m)的结构示意图；
图2为通过聚合酶链式反应(PCR)获得长度为510bp的目的基因HPV-16E6DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图3为突变型HPV-16E6m基因序列与野生型HPV-16E6基因序列比对结果；
图4为重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E6m DNA的酶切分析结果；
图5为重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E6m病毒的滴度测定结果；
图6为重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m病毒和AAV/HPV-16E6病毒感染原代宫颈上皮细胞的致瘤性观察结果；
图7为重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m病毒感染外周血单个核细胞的效率检测结果；
图8为重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m病毒感染的DC表达CD80和CD86水平的流式细胞技术检测结果；
图9为重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m病毒感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平的流式细胞技术检测结果；
图10为重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m病毒感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16E6阳性细胞的51Cr(铬-51)杀伤实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
实施例1构建重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E6m
一、材料及其来源：
A.腺相关病毒载体：具有巨噬细胞病毒(CMV)启动子以及AAV 2型两端完整的重复末端片段(TR)序列，并在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入有9个核苷酸片段(CTGCGCTGG，目的是提高重组AAV病毒(rAAV)的稳定性以及提高病毒的复制效率)。由于无AAV结构基因(Rep和Cap)，该AAV载体已经失去整合于染色体的功能。该AV载体由本专利申请的发明人成功构建(构建方法参见中国专利ZL201110125683.X)。
B.人HPV-16E6抗原阳性组织：实验所用来源于手术切除的宫颈癌癌组织，免疫组化证实HPV-16E6抗原阳性。
C.基因扩增的核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的HPV-16E6基因序列(Genebank：NC_001526.4)设计，上游引物：
5’-ATAGATCTAGCAGACATTTTATGCACC-3’(nt7113—nt7131)，下游引物：
5’-ATCTCGAGCATGATTACAGCTGGGTT-3’(nt7606—nt7589)。上、下游的5’末端开始均为二个保护碱基“AT”，随后分别为限制性内切酶Bgl II(AGATCT)和Xho I(CTCGAG)所识别的核苷酸序列。
二、构建携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E6或突变型E6m基因的重组腺相关病毒载体
用下述方法构建本发明携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)突变型E6m基因的重组腺相关病毒载体。其结构示意图如图1所示(携带HPV-16野生型E6基因的重组腺相关病毒载体的方法相同)。具体过程包括以下步骤：
A.获取HPV-16E6 DNA，具体方法为：采用DNAzol试剂(美国Life Technology公司生产)并按说明书进行操作：首先将HPV-16E6抗原阳性的宫颈癌组织反复碾磨后，加入10mLDNAzol，离心获取上清液后，用75％乙醇洗涤2次，再加入无水乙醇，离心，将沉淀物用去离子水溶解，将DNA浓度调至100ng/μL。以2μL DNA溶液为模板，在上游引物：5’-ATAGATCTAGCAGACATTTTATGCACC-3’，下游引物：5’-ATCTCGAGCATGATTACAGC TGGGTT-3’的引导下，PCR扩增HPV-16E6DNA。PCR扩增条件为：先94℃4分钟；再94℃30秒，60℃35秒，72℃50秒，共30个循环；最后72℃8分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，出现一条长度为510bp与预期结果一致的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到长度为510bp HPV-16E6。进行DNA序列测定，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示，证明PCR扩增的HPV-16E6基因序列正确。
B.获得突变型HPV-16E6m DNA。具体方法为：为获得具有三个点突变的E6m基因，均采用基因点突变试剂盒(美国Strategeng公司)，按照其试剂盒说明书进行操作。将HPV-16E6基因(序列1)的nt357的胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的TGT(nt357-359)改变为编码甘氨酸的GGT，得到一个具有一个突变位点的HPV-16E6抗原基因。完成后，进行DNA序列测定，基因序列如序列表中的序列2所示。
在获得一个点突变HPV-16E6抗原基因的基础上，按上述方法进行再一次突变。即将该基因(序列1)nt372胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，将编码半胱氨酸的TGT(nt372-374)改变为编码甘氨酸的GGT，得到一个具有二个突变位点的HPV-16E6抗原基因。完成后，进行DNA序列测定，基因序列如序列表中的序列3所示。
在获得该二个点突变HPV-16E6抗原基因的基础上，采用上述方法进行再一次突变。即将该基因(序列1)nt447胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，将编码半胱氨酸的TGT(nt447-449)改变为编码甘氨酸的GGT，得到一个具有三个突变位点的HPV-16E6抗原基因，被命名为HPV-16E6m。完成后，进行DNA序列测定，基因序列如序列表中的序列4所示。突变型HPV-16E6m基因序列与野生型HPV-16E6基因序列比对结果如图3所示。
C.构建重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E6m：采用DNA连接技术，分别将上述获得的HPV-16E6m DNA片段插入AAV载体中。为插入该基因片段，首先进行酶切反应，然后进行连接反应。其中，酶切反应体系为：100ng质粒和50ng HPV-16E6或E6m DNA片段；10U限制性内切酶Bgl II和Xho I(购自美国Promega公司)，2.5μl 10×缓冲液以及19.5μl去离子水；反应条件为：在37℃下水浴4小时；
连接反应体系为：50ng酶切后的质粒，50ng HPV-16E6或HPV-16E6m DNA片段，10IUT4 DNA连接酶(购自美国Promega公司)，1.5μl 10×T4 DNA连接缓冲液以及11.5μl去离子水；反应条件为：4℃，8小时。
D.筛选重组腺相关病毒载体质粒：将上述连接后的质粒DNA转化基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(美国Invitrogen公司)，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化。
E.鉴定携带或HPV-16E6m的重组腺相关病毒载体(AAV/或HPV-16E6m):将上述纯化后的质粒进行酶切反应，所用限制性内切酶为gl II和Xho I，具体过程与上述C部分相同。酶切反应结束后，酶切产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，在约500bp位置处出现DNA条带，即证明DNA连接反应成功，如图4所示。随后，对质粒进行PCR检测，具体过程与上述A部分相同。PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现长度为510bp特异性DNA条带，即可证明AAV/或HPV-16E6m构建成功，获得AAV/或HPV-16E6m载体DNA。
实施例2重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m的制备及病毒滴度测定材料及其来源：
A.实施例1构建的携带HPV-16E6m基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E6m)。
B.含AAV的Rep基因和Cap基因的辅助质粒pHelper：由本专利申请的发明人刘勇等人构建成功(Liu,Y.,Santin AD.,Mane M.,Chiriva-Internati,M.,Parham GP.,RavaggiA.,and Hermonat,P.L.Transduction and Utility of the Granulocyte-MacrophageColony-Stimulating Factor Gene into Monocytes and Dendritic Cells by Adeno-Associated Virus.Journal of Interferon and Cytokine Research.20:21–30.2000)。
C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAV-HEK293细胞：由本专利申请的发明人刘勇等人建立(Liu,Y.,Santin AD.,Mane M.,Chiriva-Internati,M.,Parham GP.,Ravaggi A.,and Hermonat,P.L.Transduction andUtility of the Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Gene intoMonocytes and Dendritic Cells by Adeno-Associated Virus.Journal of Interferonand Cytokine Research.20:21–30.2000)。
D.脂质体转染试剂Lipofectin：购自美国Life Technology公司。
E.DMEM培养基和胎牛血清：购自美国Cellgro公司。
F.PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒：购自瑞士Roche公司。
G.DNA拷贝数标准：分别为1014拷贝数(copies)/μL至108拷贝数(copies)/μL，购自美国Promega公司。
一、重组腺相关病毒(rAAV)的制备
用下述方法制备重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m(rAAV)，以制备一盘10.0cm细胞培养皿的病毒为例，当AAV-HEK293细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70％时，进行如下操作：
A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将1.0μg rAAV载体、1.0μg pHelper质粒、4.0μL Lipofectin和50.0μL含5％胎牛血清的DMEM培养基混匀，室温静置20分钟。
B.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于二氧化碳细胞培养箱中培养。
C.72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。
D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即rAAV病毒液。
E.将收集的rAAV病毒液过滤除菌。
二、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒滴度测定
采用常规的斑点杂交法，对步骤一获得的rAAV病毒进行病毒滴度测定，具体方法包括以下步骤：
A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒DNA。
B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的rAAV病毒DNA，并加入DNA拷贝数标准，抽真空。
C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。
D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，所用的DNA探针为针对HPV-16E6基因的特异性探针，即实施例1步骤C中获得的HPV-16E6 DNA。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下检测PCR扩增产物，结果出现阳性条带，表明探针标记成功。E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对各种rAAV病毒颗粒DNA进行DNA杂交。
实验结果所有rAAV病毒(AAV/HPV-16E6病毒或AAV/HPV-16E6m病毒)滴度为约1010拷贝/ml，表明获得的rAAV的病毒滴度较高(如图5所示)。
实施例3重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6病毒和AAV/HPV-16E6m病毒感染原代宫颈上皮细胞的致瘤性观察
材料及其来源：
A.rAAV病毒：实施例2获得的重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m病毒。同理，可获得AAV/HPV-16E6病毒
B.Keratinocyte-SCF细胞培养基：购自美国Life Technology公司。
C.原代宫颈上皮细胞：从组织中分离获得，已经证明无HPV存在。
致瘤性观察实验
将原代宫颈上皮细胞在含10mL Keratinocyte-SCF细胞培养基的10.0cm细胞培养皿中，置二氧化碳培养箱中在37℃下培养。待细胞完全贴壁后，取出培养皿，去除7mL培养液后，按照100MOI剂量分别加入重组腺相关病毒AAV/HPV-16E6m病毒或AAV/HPV-16E6病毒，重置于二氧化碳培养箱。8小时后，取出培养皿，去除培养液，加入10mL新鲜的Keratinocyte-SCF细胞培养基，重置于二氧化碳培养箱中在37℃下培养。每2天更换培养基。每天定时观察细胞形态变化2次。直至细胞出现瘤变。
实验结果显示，被AAV/HPV-16E6m病毒感染的细胞仍保持细胞正常状态，未发生瘤变，表明无致瘤性，而被AAV/HPV-16E6病毒感染的细胞出现瘤变，具有致瘤性。如图6所示。
实施例4HPV-16E6抗原导入单个核细胞-树突状细胞系的杀灭HPV-16E6抗原阳性细胞实验
材料及其来源：
A.AV/HPV-16E6m病毒：实施例2方法制备得到。同理，可获得AAV/HPV-16E6病毒。
B.AIM-V细胞培养基：购自美国Life Technology公司。
C.细胞因子：集落细胞刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素2、4、7购自美国R&D公司。
D.HPV-16E6抗原阳性的细胞：从组织中分离获得或从美国组织细胞保存中心(ATCC)获得，包括宫颈癌细胞和原代宫颈上皮细胞。
E.HPV-16E6抗原阴性的细胞：从人的正常组织中分离获得或从美国组织细胞保存中心(ATCC)获得，包括原代宫颈，乳腺以及肾脏上皮细胞。
一、杀灭HPV-16E6抗原阳性细胞实验
将本发明的AAV/HPV-16E6病毒或AAV/HPV-16E6m病毒感染患者单核细胞为基础的杀灭HPV-16E6抗原阳性的细胞实验的整个过程包括以下步骤：
A.取50-150mL人外周血，按常规方法获取外周血单个核细胞(PBMC)，与AIM-V培养基混匀后，加入细胞培养瓶或培养皿，置于恒温二氧化碳培养箱中在37℃下培养2小时。
B.除去悬浮细胞，保留贴壁细胞(单核细胞)。悬浮细胞即外周血淋巴细胞，将其与AIM-V培养基混匀后，继续培养备用。
C.加入rAAV病毒，加入量约为100MOI，同时再加入GM-CSF(600IU/mL)，继续培养4小时。
D.除去旧培养基，补充含GM-CSF和IL-4(600IU/mL)的AIM-V培养基，继续培养。
E.培养5天后，收获成熟的树突状细胞(DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混合，在AIM-V培养基中加入IL-2(10IU/mL)以及IL-7(200IU/mL)，继续培养。F.培养至7-9天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进行检测。
二、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测
A.AAV/HPV-16E6m感染外周血单个核细胞的效率检测
采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对HPV-16E6抗原的特异性荧光抗体(购自美国BD公司)标记上述获得的被本发明AAV/HPV-16E6m感染的单核细胞，再进行流式细胞仪检测HPV-16E6m抗原蛋白阳性的单核细胞—树突状细胞(Mo--DC)的数量。检测结果如图7所示,其阳性率为约89.8％，不仅证明本发明的AAV/HPV-16E6m具有较高的感染效率，也有较高的E6抗原刺激DC效率。B.树突状细胞(DC)的CD分子水平的检测
DC表达CD80和CD86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法，即分别采用荧光标记的针对这二种CD分子的抗体(购自美国BD公司)对上述获得的DC表达CD80和CD86的水平进行检测。检测结果如图8所示，表明本发明携带HPV-16E6m的rAAV感染的细胞所诱导的DC的激发细胞免疫反应的功能强大。
C.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的γ干扰素(IFN-γ)水平的检测
CTL杀伤HPV-16E6抗原阳性细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。DC与外周血淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用传统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，再进行流式细胞仪检测，所用抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体(购自美国BD公司)，被AAV/HPV-16E6m病毒感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平如图9所示，其表达高水平的IFN-γ。提示被本发明AAV/HPV-16E6m感染的DC所诱导的CTL杀伤靶细胞的活性较强。
上述B和C实验结果亦证明AAV/HPV-16E6m能够发动有效的细胞免疫反应，即不仅能够有效刺激DC功能，而且也能够导致CTL的产生。
D.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤HPV-16E6抗原阳性细胞试验
混合培养结束后，将AAV/HPV-16E6m病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)按20:1(淋巴细胞:肿瘤细胞)分别与HPV-16E6抗原阳性的宫颈癌细胞和原代宫颈上皮细混合后，采用传统的51Cr(铬-51)杀伤试验，检测CTL杀伤HPV-16E6抗原阳性的细胞的活性。其中靶细胞杀伤率统计结果如图10(横坐标表示杀伤率)所示，被本发明AAV/HPV-16E6m病毒感染的DC所诱导的CTL能有效地裂解(杀伤)HPV-16E6阳性的宫颈上皮细胞和宫颈癌细胞，杀伤率为约52％-68％。携带野生型HPV-16E6基因的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16E6)感染的DC所诱导的CTL裂解(杀伤)HPV-16E6阳性的宫颈上皮细胞和肿瘤细胞的杀伤率为约55％-66％。上述二者的杀伤率无显著性差异(p>0.05)，说明AAV/HPV-16E6m与AAV/HPV-16E6病毒感染的DC所诱导的CTL裂解HPV-16E6抗原阳性的靶细胞的能力相当。
分别以HPV-16E6抗原阴性的原代宫颈上皮细胞，乳腺上皮细胞和肾脏上皮细胞为对照，再用上述相同的方法检测被AAV/HPV-16E6m病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞杀伤细胞的特异性。CTL细胞杀伤能力检测结果同样见图10(横坐标表示杀伤率)所示，被本发明AAV/HPV-16E6m病毒感染的DC所诱导的CTL对HPV-16阴性的细胞无杀伤作用，证明被本发明AAV/HPV-16E6m病毒感染的DC所诱导的CTL具有抗原特异性。
此外，分别将HLA-I抗体(MHC Class I)封闭HPV-16E6抗原阳性的宫颈癌细胞和原代宫颈上皮细胞4小时后，再进行上述51Cr(铬-51)杀伤试验，其杀伤率大幅度下降，分别为约6％-8％(p<0.01)。该结果表明该杀伤作用具有MHC Class I限制性，符合CTL杀伤靶细胞的特性。
上述检测结果表明，被本发明携带突变型HPV-16E6m抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16E6m病毒)感染的DC所诱导的CTL对HPV-16E6阳性的细胞具有明显的特异性杀伤(裂解)效果，可取代携带野生型HPV-16E6抗原基因的重组腺相关病毒，而且无致瘤性，可用于临床实践。
序列表
<110> 广东拓谱康生物科技有限公司
<120> 一种重组腺相关病毒载体的构建和制备及其应用价值
<130> 2021/8/20
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 477
<212> DNA
<213> HPV-16突变型E6m抗原基因(HPV-16 mutant E6m antigen gene)
<400> 1
atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60
cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120
aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180
tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240
agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300
aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaacggtc aaaagccact gggtcctgaa 360
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420
ggtcgaggta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 491
<210> 2
<211> 477
<212> DNA
<213> HPV-16E6抗原的核苷酸序列(Nucleotide sequence of HPV-16E6antigen)
<400> 2
atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60
cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120
aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180
tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240
agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300
aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420
ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 491
<210> 3
<211> 477
<212> DNA
<213> 具有一个的单点突变型HPV-16E6抗原基因(Has a single point mutantHPV-16E6 antigen gene)
<400> 3
atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60
cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120
aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180
tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240
agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300
aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaacggtc aaaagccact gtgtcctgaa 360
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420
ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 491
<210> 4
<211> 477
<212> DNA
<213> 具有二个的点突变型的HPV-16E6抗原基因(HPV-16E6 antigen gene withtwo point mutations)
<400> 4
atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60
cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120
aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180
tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240
agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300
aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaacggtc aaaagccact gggtcctgaa 360
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420
ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 491

Claims (5)

1.一种携带人乳头瘤病毒16型突变型E6抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述HPV-16突变型E6m抗原基因的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示；所述的重组腺相关病毒载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将HPV-16E6抗原的第113位进行一次点突变，将半胱氨酸突变为甘氨酸，即将HPV-16E6抗原基因开放读码框nt7461位的胸腺嘧啶替换为鸟嘌呤，得具有一个的单点突变型HPV-16E6抗原基因；
S2、将步骤S1所得具有一个的单点突变型HPV-16E6抗原的第118位进行第二次点突变，同样将半胱氨酸改变为甘氨酸，即将HPV-16E6基因开放读码框nt7476位的胸腺嘧啶替换为鸟嘌呤，得具有二个的点突变型的HPV-16E6抗原基因；
S3、将步骤S2所得具有二个的点突变型的HPV-16E6抗原的第143位进行点突变，将半胱氨酸改变为甘氨酸，即将HPV-16E6基因开放读码框nt7551位的胸腺嘧啶替换为鸟嘌呤，得HPV-16E6m；
S4将步骤S3所得HPV-16E6m抗原基因插入已将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，即得；步骤S1中所述HPV-16E6抗原的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2所示；步骤S1中所述具有一个的单点突变型HPV-16E6抗原基因的核苷酸序列信息如SEQ IDNO.3所示；步骤S2中所述具有二个的点突变型的HPV-16E6抗原基因的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.4所示。
2.一种重组腺相关病毒质粒，其特征在于，包含如权利要求1所述的携带HPV-16突变型E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体。
3.一种具有感染性的重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，包含如权利要求1所述的携带HPV-16突变型E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体。
4.一种细胞系，其特征在于，包含如权利要求1所述的携带HPV-16突变型E6m抗原基因的重组腺相关病毒载体。
5.如权利要求4所述的细胞系，其特征在于，包括单核细胞、树突状细胞及其诱导的针对HPV-16E6抗原的细胞毒性T淋巴细胞。
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GR01 Patent grant
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Denomination of invention: Construction, preparation and application of a recombinant adeno-associated virus vector

Effective date of registration: 20221028

Granted publication date: 20211022

Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch

Pledgor: GUANGDONG TOPHEALTH BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2022980019862

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