CN105177048B - 携带人乳头瘤病毒16型多点突变型E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明携带HPV‑16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法，是将具有致瘤性的HPV‑16的E7抗原基因多点突变为无致瘤性的E7抗原基因，再将该突变后基因插入已经剔除结构基因的腺相关病毒载体中而获得的。该重组腺相关病毒可将其携带的突变型HPV‑16 E7mm抗原基因输送入单核细胞‑树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被该组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL在体外和患者体内均可有效地抑制HPV‑16 E7阳性细胞的生长或者杀灭HPV‑16 E7阳性的细胞，且无致瘤性。本发明的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗HPV‑16感染及其相关的抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带人乳头瘤病毒16型(Human Papillomavirus Type 16，HPV-16)多点突变型E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其在制备抗HPV-16感染及其相关疾病(如由HPV-16感染导致的肿瘤)治疗药物中的应用。、其构建方法与其在制备抗HPV-16感染以及相关性疾病的药物中的应用。
背景技术
腺相关病毒(AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(Samulski RJ,Srivastava A,Berns KI,Muzyczka N.Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids:genecorrection within the terminal repeats of AAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(Lip)基因和包膜(Cap)基因(Hermonat PL,LabowMA,Wright R,Berns KI,Muzyczka N.Genetics of adeno-associated virus:isolationand preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants.JVirol.51:329-339.Hermonat,P.L.,and Muzyczka,N.Use of adeno-associated virusas a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance intomammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和复制蛋白(Rep)基因之间的p5启动子(Labow MA,Hermonat PL,Berns KI.Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome.J Virol.160:251-258.)。
AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。AAV基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括与病毒复制有关的Rep基因和病毒包膜(Cap)基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面的缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus，rAAV)。现有大量研究表明，将AAV基因组中的结构基因删除，可明显增加外源性基因的容量。此外，将具有治疗作用的外源性 基因插入rAAV中，可制备成具有感染性的rAAV病毒颗粒。
1984年，美国Paul L.Hermonat率先证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗(Hermonat,P.L.,and Muzyczka,N.Use of adeno-associated virus as a mammalianDNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissueculture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有10余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病有帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型(AAV-1)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。
人乳头瘤病毒(HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属。目前至少分离出130多种亚型。根据不同亚型，可分为高危型和低危型。其中对人类危害最大的是高危型，包括HPV-16、18、30、31、33、35、39与宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等恶性肿瘤密切相关。其中99％以上的宫颈癌是由高危型HPV引起的，而半数以上的宫颈癌是HPV-16所致。
HPV属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，具有致癌作用的E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6、E7编码的癌蛋白E6、E7蛋白分别与抑癌基因p53和Rb结合，引起细胞增殖失控，抑癌基因对DNA的损伤修复功能丧失，导致癌前病变及癌症的发生。
据2003-2004年来自美国的国家健康和营养研究课题的一个调查结果显示，14-59岁女性的HPV总感染率为26.8％。中国的HPV感染的流行情况尚未有正式报道，每年约有20万以上的宫颈癌新发现病例，发病率和死亡率有增加趋势，且宫颈癌发病年龄年轻化，可以推测HPV感染率不乐观。但目前尚无确切治愈HPV感染的方法，而现阶段的HPV疫苗有可能预防HPV-16和HPV-18感染，但对于已经感染的人群无效。为达到治愈目的，最理想的治疗是彻底清除受感染的细胞。而受感染的细胞均存在HPV-16 E7抗原。因此，HPV-16 E7抗原是细胞免疫治疗非常理想的靶子。但是，HPV-16E7抗原是一种致癌蛋白，在宫颈癌等恶性肿瘤的发生中发挥最主要作用之一。因此，在体内和体外用野生型HPV-16 E7抗原刺激免疫反应的发生，在安全性方面存在一定 风险。因此，必须除去野生HPV-16 E7抗原的致瘤性，消除该风险。
人树突状细胞(Dedritic Cells，DC)是人体最重要、也是最主要的抗原提呈细胞。大量的研究已经证明无论在体内还是体外，DC细胞均可诱导或刺激产生具有抗感染和抗肿瘤的细胞免疫反应。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种携带无致病性(即无致瘤性)的人乳头瘤病毒16型(HPV-16)突变型E7mm抗原基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体。
本发明所提供的重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒(AAV)载体中的腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除并带有AVV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、SV40病毒启动子和beta肌动蛋白启动子(β-actin)中的任意一个启动子的AVV载体作为出发载体，将多点突变型HPV-16 E7mm抗原基因插入出发载体中，获得全新的rAVV载体，即携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体(简称“E7mm重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16 E7mm)。
这里，多点突变型HPV-16 E7mm抗原基因是通过分子生物学技术，将HPV-16 E7抗原基因进行突变得到，即：将HPV-16(美国NCI基因库：KC935953)的E7抗原蛋白第58、91和94位中的两个或三个半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)通过将HPV-16 E7基因开放读码框nt175、nt271和nt280(序列表中位置，对应图3A-3D中nt736、nt832、nt841)中的两个或三个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，获得可以表达无致瘤性的多点突变型HPV-16 E7抗原基因(命名为HPV-16 E7mm基因)。
由于HPV-16 E7mm基因的免疫原性未受影响，因此可将其插入腺相关病毒载体AVV中(该载体带有AVV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、SV40病毒启动子和beta肌动蛋白启动子(β-actin)中的任意一个)，获得携带HPV-16E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体，统称“E7mm重组腺相关病毒载体”并统一命名为AAV/HPV-16 E7mm。
具体的，结合序列表，具有nt175(58aa)、271(91aa)两个突变位点的多点突变型HPV-16 E7mm基因命名为HPV-16 E7mm21，其与HPV-16 E7抗原基因核苷酸序列的比较列于图3A(斜体部分nt736、832为突变)，HPV-16 E7抗原基因核苷酸序列如序列表中序列1所示，HPV-16 E7mm21基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；具有nt175(58aa)、nt280(94aa)两个突变位点的多点突变型HPV-16 E7mm基因命名为HPV-16E7mm22，其与HPV-16 E7抗原基因核苷酸序列的比较列于图3B(斜体部分nt736、841为突变)，HPV-16 E7mm22基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；具有nt 271(91aa)、nt280(94aa)两个突变位点的多点突变型HPV-16 E7mm基因命名为HPV-16 E7mm23，其 与HPV-16 E7抗原基因核苷酸序列的比较列于图3C(斜体部分nt832、841为突变)，HPV-16 E7mm23基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示；具有nt175(58aa)、271(91aa)、nt280(94aa)三个突变位点的多点突变型HPV-16 E7mm基因可命名为HPV-16 E7mm3，其与HPV-16 E7抗原基因核苷酸序列的比较列于图3D(斜体部分nt 736、832、841为突变)，HPV-16 E7mm3基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示。HPV-16 E7mm21、HPV-16E7mm22、HPV-16 E7mm23和HPV-16 E7mm3，统称为多点突变型HPV-16 E7mm抗原基因(简称HPV-16 E7mm基因)。
利用以上设计，也可将野生型HPV-16 E7抗原基因插入上述腺相关病毒载体中，获得携带野生型HPV-16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载体，统称为“E7重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16 E7，HPV-16 E7基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。但由于野生型HPV-16 E7抗原具有致瘤性，故本发明不推荐用于临床实践，仅用于研究。
本发明的第二个目的是提供上述AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 E7mm重组腺相关病毒载体的构建方法。该方法是使用常规的基因重组的方法，先将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除，再用前述HPV-16 E7基因或其突变型基因HPV-16 E7mm取代该剔除基因，得到重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7或AAV/HPV-16E7mm。
本发明所提供的构建方法，包括以下步骤：
1)使用常规的分子生物学技术方法，先获得HPV-16 E7抗原基因，再将其进行突变，即将HPV-16 E7抗原的第58、91和94位中的两个或三个半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)，详细过程为将HPV-16 E7基因开放读码框nt175、nt271和nt280的两个或三个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，得到具有两个或三个突变位点的多点突变型HPV-16 E7抗原基因，统一命名为HPV-16 E7mm；
2)分别将多点突变型HPV-16 E7mm抗原基因或野生型HPV-16 E7抗原基因插入已将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，分别得到携带多点突变型HPV-16E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16 E7mm)或携带HPV-16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16 E7)。
上述载体中E7mm或E7抗原基因转录的启动子可以选用AAV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子(β-actin)和SV40病毒早期启动子中的任意一个。
携带多点突变型HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7mm包括以下四种：
一、将E7抗原蛋白的第58和91位半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)，详细过程为将HPV-16 E7基因开放读码框nt175和nt271两个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt175-177和nt271-273)改变为编码甘氨酸的ggc，得到具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm21，再分别将多点突变型HPV-16 E7mm21抗原基因插入已经将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，得到携带多点突变型HPV-16 E7mm21抗原基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/HPV-16 E7mm21；
二、将E7抗原蛋白的第58和94位半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)，详细过程为将HPV-16 E7基因开放读码框nt175和nt280两个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码第58位半胱氨酸的tgc(nt175-177)改变为编码甘氨酸的ggc，将编码第94位半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm22，再分别将多点突变型HPV-16 E7mm22抗原基因插入已经将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，得到携带多点突变型HPV-16 E7mm22抗原基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/HPV-16 E7mm22；
三、将E7抗原蛋白的第91和94位半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)，详细过程为将HPV-16 E7基因开放读码框nt271和nt280两个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码第91位半胱氨酸的tgc(nt271-273)改变为编码甘氨酸的ggc，将编码第94位半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm23，再分别将多点突变型HPV-16 E7mm23抗原基因插入已经将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，得到携带多点突变型HPV-16 E7mm23抗原基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/HPV-16 E7mm23；
四、将E7抗原蛋白的第58、91和94位半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)，详细过程为将HPV-16 E7基因开放读码框nt175、nt271和nt280三个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码第58、91位半胱氨酸的tgc(nt175-177和nt271-273)改变为编码甘氨酸的ggc，将编码第94位半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到具有三个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm3，再分别将多点突变型HPV-16 E7mm3抗原基因插入已经将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，得到携带多点突变型HPV-16 E7mm3抗原基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/HPV-16 E7mm3。
本发明还一目的是提供与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7mm和重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7相关的产品，包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被本发明重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系，所述细胞系包括单核细胞 (Monocytes，Mo)和树突状细胞系(Dendritic cells，DC)。所述重组腺相关病毒载体中的相关基因—HPV-16 E7mm抗原基因或HPV-16 E7抗原基因可在单核细胞或树突状细胞中在上述转录启动子的作用下获得表达。
所述与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 E7mm相关的产品的制备方法，分别为：
重组腺相关病毒载体质粒的制备：将重组腺相关病毒载体DNA－AAV/HPV-16 E7或AAV/HPV-16 E7mm分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到AAV/HPV-16 E7质粒和AAV/HPV-16 E7mm质粒。
重组腺相关病毒的制备：以所述重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16 E7质粒或AAV/HPV-16 E7mm和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞得到AAV病毒，分别命名为AAV/HPV-16 E7病毒和AAV/HPV-16 E7mm病毒。
重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用所述重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7病毒或AAV/HPV-16 E7mm病毒分别或依次感染或转染单核细胞(Mo)、树突状细胞(DC)或淋巴细胞得到。
实际用途方面，本发明的另一个目的是提供一种抗HPV-16感染以及由HPV-16感染导致的恶性肿瘤的细胞免疫治疗的药物及其相关技术。
所述药物的活性成分为上述携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16 E7mm)或与本发明携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品(由于野生型HPV-16 E7抗原存在致瘤性，故不考虑其药用)。
以本发明的E7mm重组腺相关病毒为载体，将HPV-16突变型E7mm抗原基因导入单核细胞，并诱导产生树突状细胞，亦可直接导入树突状细胞，表达E7mm抗原蛋白，以达到患者体外和体内免疫刺激的目的，用以治疗HPV-16感染以及相关恶性肿瘤，或以该树突状细胞刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)治疗HPV-16感染以及相关恶性肿瘤。
所述由HPV-16感染导致的恶性肿瘤包括HPV-16 E7抗原阳性的宫颈乳头瘤病变、宫颈癌、男性生殖器Bowen’s病、巨大尖锐湿疣、阴茎癌、肛门癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌以及乳腺癌等。
本发明所提供的药物可采用溶剂或粉剂等剂型。
所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
用药方式可为先分离出患者体内的单核细胞(Mo)，再将此药感染或转染Mo后，体外诱导Mo成为具有抗原提呈功能的树突状细胞(DC)。此药亦可感染或转染DC，但有可能导致DC对抗原的摄取或加工能力较差，从而导致疗效不佳。所获得的DC可回输患者体内，达到治疗目的。或将表达HPV-16突变型E7mm抗原的成熟的DC所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输患者，以取得更佳的疗效。
上述药物的用量一般为DC：1-5×106/每次，CTL:1-5×108/每次，每月2次，疗程通常为3个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。
为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂、靶向和化疗药物等进行组合治疗。
本发明还提供了一种杀灭HPV-16感染细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细胞的方法。
该方法可包括以下步骤：
1)将从患者体内分离的单核细胞(Mo)，或分离出的Mo被诱导成为的树突状细胞(DC),被携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16 E7mm)感染或转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理，各自得到处理后的细胞；
2)将步骤1)中处理后的DC输入患者体内中，以激活患者体内的免疫反应，达到杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细胞的目的；或将未被处理的T淋巴细胞与所述处理后的DC混合培养，刺激产生HPV-16 E7抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，再将该抗原特异性CTL输入患者体内，杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细胞；或将被处理的CTL和被处理的DC输入患者体内中，杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细胞。
所述杀灭恶性肿瘤的方法可具体应用到临床治疗中，包括给予一个患者回输HPV-16 E7抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，该细胞由来源于患者自然产生的T淋巴细胞与来源于该患者的单核细胞-树突状细胞混合培养产生的。在混合培养之前，这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理；
或者，给予一个肿瘤患者回输来源于患者的单核细胞-树突状细胞。在回输之前，这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理；
再或者，给予一个恶性肿瘤患者回输上述来源于患者的T淋巴细胞和来源于该患者的自然产生的单核细胞-树突状细胞。在回输之前，这些T淋巴细胞已经被本发明携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染的单核细胞-树突状细 胞相关的产品处理。这些单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染。
本发明的重组腺相关病毒(rAAV)载体可将其携带的HPV-16 E7mm抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，携带带有HPV-16 E7mm抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地杀灭HPV-16E7抗原阳性的肿瘤细胞或HPV-16感染的细胞，而且无致病性(即无致瘤性)。因而，本发明的rAAV载体或与本发明rAAV载体相关的产品可被用于制备抗肿瘤药物。本发明在肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7或突变型E7mm基因的重组腺相关病毒载体的结构示意图。
图2通过多聚酶链反应(PCR)从宫颈癌组织中获得长度为297bp的HPV-16 E7DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图3A-图3D四种多点突变型HPV-16 E7mm基因序列与HPV-16 E7基因序列比对结果。
图4构建的AAV/HPV-16 E7mm载体的酶切分析结果。
图5重组腺相关病毒rAAV的制备方法流程图。
图6四种重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7mm病毒)和AAV/HPV-16 E7病毒感染原代宫颈上皮细胞的致瘤性观察结果。
图7AAV/HPV-16 E7mm病毒感染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭HPV-16 E7抗原阳性细胞的实验流程。
图8四种重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7mm病毒)感染外周血单个核细胞的效率检测结果。
图9重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7mm3病毒和AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC表达CD80和CD86水平的流式细胞技术检测结果。
图10重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7mm3病毒和AAV/HPV-16 E7病毒分别感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平的流式细胞技术检测结果。
图11A AAV/HPV-16 E7mm21感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16 E7阳性细胞和阴性细胞的51Cr(铬-51)杀伤实验结果。
图11B AAV/HPV-16 E7mm22感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16 E7阳性细胞 和阴性细胞的51Cr(铬-51)杀伤实验结果。
图11C AAV/HPV-16 E7mm23感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16 E7阳性细胞和阴性细胞的51Cr(铬-51)杀伤实验结果。
图11D AAV/HPV-16 E7mm3感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16 E7阳性细胞和阴性细胞的51Cr(铬-51)杀伤实验结果。
图12A 5例宫颈癌患者经重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7mm3病毒)感染的DC所诱导的CTL治疗后血清鳞状细胞癌抗原(SCC)水平的变化情况。
图12B 5例宫颈癌患者经重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7mm3病毒)感染的DC所诱导的CTL治疗后血清角质蛋白19抗原(CK19)水平的变化情况。
图13 2例肛门癌患者经重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7mm3病毒)感染的DC所诱导的CTL治疗后血清角质蛋白19抗原(CK19)水平的变化情况。
图14 4例阴茎癌患者经重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7mm3病毒)感染的DC所诱导的CTL治疗后血清癌胚抗原(CEA)水平的变化情况。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
所用引物合成及DNA序列测定均由美国Life Technology公司完成。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、构建重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 E7mm
一、材料及其来源：
A.四种腺相关病毒(AAV)载体：即分别为具有AAV p5启动子的pAAV/p5、具有巨 噬细胞病毒(CMV)启动子的pAAV/CMVp、具有SV40病毒早期启动子的pAAV/SV40p和具有人β-肌动蛋白(β-actin)启动子的pAAV/β-actinp。已知的腺相关病毒载体具有p5启动子，为提高目的基因的转录水平，可将重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个，该四种AAV载体仅启动子不同，其余的基因结构完全相同，即具有AAV 2型两端完整的重复末端片段(TR)序列，并在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入有9个核苷酸片段(CTGCGCTGG，目的是提高重组AAV病毒(rAAV)的稳定性以及提高病毒的复制效率)、且无任何AAV结构基因(Rep和Cap)。该四种AAV载体由本专利申请的发明人成功构建(构建方法参见中国专利ZL201110125683.X)。
B.人宫颈癌组织：实验所用来源于手术切除的宫颈癌癌组织，免疫组化证实HPV-16抗原阳性。
C.基因扩增核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的HPV-16 E7基因序列(美国NCI基因库：KC935953)设计，上游引物：5’-ATGCATGGAGATACA-3’，下游引物：5’-TTATTGTTTCTGAGAA-3’。
二、构建携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7或突变型E7mm基因的重组腺相关病毒载体
用下述方法分别构建本发明携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7或突变型E7mm基因的重组腺相关病毒载体，其结构示意图如图1(图中“插入的外源性基因”分别为人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7或四种具有二个或三个点突变的HPV-16 E7mm抗原基因，启动子分别为AAV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒早期启动子中的任意一个)所示，具体过程包括以下步骤：
A.获取HPV-16 E7 DNA，具体方法为：采用DNAzol试剂(美国Life Technology公司生产)并按说明书进行操作：首先将HPV-16 E7抗原阳性的宫颈癌组织反复碾磨后，加入10mL DNAzol，离心获取上清液后，用75％乙醇洗涤2次，再加入无水乙醇，离心，将沉淀物用去离子水溶解，将DNA浓度调至100ng/μL。以2μL DNA溶液为模板，在上游引物5’-ATGCATGGAGATACA-3’和下游引物5’-TTATTGTTTCTGAGAA-3’的引导下PCR扩增HPV-16 E7DNA。PCR扩增条件为：先94℃ 4分钟；再94℃ 30秒，60℃ 35秒，72℃ 50秒，共30个循环；最后72℃ 8分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，出现一条长度为297bp与预期结果一致的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到长度为297bp HPV-16E7。进行DNA序列测定，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，进一步证明PCR扩增 的HPV-16 E7基因序列正确。
B.获取具有两个点突变的HPV-16 E7mm DNA，具体方法为：为获取具有两个点突变的E7mm基因，均采用基因点突变试剂盒(美国Strategeng公司)，按照其试剂盒说明书进行操作，共获取三个具有两个点突变的HPV-16 E7mm DNA：
(1)HPV-16 E7mm21:先将HPV-16 E7基因(美国NCI基因库：KC935953)开放读码框nt175胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt175-177)改变为编码甘氨酸的ggc，再将HPV-16 E7基因开放读码框nt271位胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt271-273)改变为编码甘氨酸的ggc，得到第一个具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm21。完成后，进行DNA序列测定，基因序列如序列表中序列2所示，HPV-16 E7mm21基因序列与HPV-16 E7基因序列的比对结果如图3A所示(图中斜体部分nt736、832为突变)，图中显示野生型HPV-16 E7序列nt736-nt738,nt832-nt834的核苷酸序列均为TGC，编码半胱氨酸，而获得的HPV-16 E7mm21基因经DNA测序，结果表明该二个三联密码子均改变为GGC，编码甘氨酸，证明基因突变成功。
(2)HPV-16 E7mm22:先将HPV-16 E7基因(美国NCI基因库：KC935953)开放读码框nt175胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt175-177)改变为编码甘氨酸的ggc，再将HPV-16 E7基因开放读码框nt280胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到第二个具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm22。完成后，进行DNA序列测定，基因序列如序列表中序列3所示，HPV-16 E7mm22基因序列与HPV-16 E7基因序列的比对结果如图3B所示(图中斜体部分nt736、841为突变)，图中显示野生型HPV-16 E7序列nt736-nt738,nt841-nt843的核苷酸序列分别为TGC和TGT，均编码半胱氨酸，而获得的HPV-16 E7mm22基因经DNA测序，结果表明该二个三联密码子分别改变为GGC和GGT，编码甘氨酸，证明基因突变成功。
(3)HPV-16 E7mm23:先将HPV-16 E7基因(美国NCI基因库：KC935953)开放读码框nt271位胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt271-273)改变为编码甘氨酸的ggc，再将HPV-16 E7基因开放读码框nt280位胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到第三个具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm23。完成后，进行DNA序列测定，基因序列如序列表中序列4所示，HPV-16 E7mm23基因序列与HPV-16 E7基因序列的比对结果如图3C所示(图中斜体部分nt832、841为突变)，图中显示野生型HPV-16 E7序列nt832-nt834，nt841-nt843的核苷酸序列分别为TGC和TGT， 编码半胱氨酸，而获得的HPV-16 E7mm23基因经DNA测序，结果表明该二个三联密码子分别改变为为GGC和GGT，编码甘氨酸，证明基因突变成功。
C.获取三个点突变的HPV-16 E7mm3DNA，具体方法为：以上述获得的具有两个点突变的HPV-16 E7mm21DNA作为模板，再将该DNA的核苷酸序列nt280位的胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将tgt(nt280-282)改变为ggt，得到具有三个突变位点的HPV-16E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm3。完成后，进行DNA序列测定，基因序列如序列表中序列5所示，HPV-16E7mm3基因序列与HPV-16 E7基因序列的比对结果如图3D所示(图中斜体部分nt736、832、841为突变)，图中显示野生型HPV-16 E7序列nt736-nt738,nt832-nt834，nt841-nt843核苷酸序列分别为TGC，TGC和TGT，均编码半胱氨酸，而获得的HPV-16 E7mm3基因经DNA测序，结果表明该三个三联密码子分别改变为GGC,GGC和GGT，均编码甘氨酸，证明基因突变成功。
D.获得重组腺相关病毒载体rAAV/HPV-16 E7和rAAV/HPV-16 E7mm：采用DNA连接技术，分别将上述获得的HPV-16 E7片段或四个HPV-16 E7mm DNA片段之一(3个两点突变，1个三点突变)插入pAAV/p5、pAAV/CMVp、pAAV/SV40p和pAAV/β-actinp这四种rAAV载体中的一个中。为插入该基因片段，首先进行酶切反应，然后进行连接反应。其中，酶切反应体系为：100ng质粒和50ng HPV-16 E7或E7mm DNA片段；10U限制性内切酶BamH I和Sal I(购自美国Promega公司)，2.5μl 10×缓冲液C以及19.5μl去离子水；反应条件为：在37℃下水浴4小时；
连接反应体系为：50ng酶切后的质粒，50ng HPV-16 E7或HPV-16 E7mm DNA片段，10IU T4DNA连接酶(购自美国Promega公司)，1.5μl 10×T4DNA连接缓冲液以及11.5μl去离子水；反应条件为：4℃，8小时。最后分别得到携带有p5启动子、CMV启动子、SV40早期启动子或β蛋白(β-actin)启动子和HPV-16 E7mm基因或HPV-16E7基因的重组腺相关病毒载体，分别对应四种启动子的携带HPV-16 E7mm基因(包含HPV-16 E7m21、HPV-16 E7m22、HPV-16 E7m23和HPV-16 E7m3中的一种)的重组腺相关病毒载体统称为AAV/HPV-16 E7mm，分别对应四种启动子的携带HPV-16 E7基因的重组腺相关病毒载体统称为AAV/HPV-16 E7。
D.获得重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 E7mm：分别将连接后的AAV/HPV-16 E7mm和AAV/HPV-16 E7转化基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(美国Invitrogen公司)，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，分别得到AAV/HPV-16 E7mm质粒和AAV/HPV-16E7质粒。
F.质粒检测：将获得的AAV/HPV-16 E7mm质粒和AAV/HPV-16 E7质粒以限制性内 切酶BamH I和Sal I(购自美国Promega公司)进行酶切分析，以鉴定是否构建成功。酶切反应条件和方法如上述(二.C)。对构建的AAV/HPV-16 E7mm和AAV/HPV-16 E7载体进行的酶切分析。酶切分析的结果如图4所示(以AAV/CMVp/HPV-16 E7mm、AAV/SV40p/HPV-16 E7mm、AAV/β-actinp/HPV-16 E7mm为例，泳道1-4、5-8、9-12分别为携带CMV启动子、SV40早期启动子以及β-actin启动子的AAV/HPV-16 E7m21、AAV/HPV-16 E7m22、AAV/HPV-16 E7m23和AAV/HPV-16E7mm3)。分析结果表明携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的E7或多点突变型E7mm基因的重组腺相关病毒载体构建成功。
实施例2、重组腺相关病毒(rAAV)的制备及病毒滴度测定
材料及其来源：
A.实施例1构建的携带HPV-16 E7mm和HPV-16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16 E7mm和AAV/HPV-16 E7)。
B.含AAV的Rep基因和Cap基因的辅助质粒pHelper：由本专利申请的发明人刘勇等人构建成功(Liu,Y.,Santin AD.,Mane M.,Chiriva-Internati,M.,Parham GP.,RavaggiA.,and Hermonat,P.L.Transduction and Utility of the Granulocyte-MacrophageColony-Stimulating Factor Gene into Monocytes and Dendritic Cells by Adeno-Associated Virus.Journal of Interferon and Cytokine Research.20:21–30.2000)。
C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAV-HEK293细胞：由由本专利申请的发明人刘勇等人建立(Liu,Y.,Santin AD.,Mane M.,Chiriva-Internati,M.,Parham GP.,Ravaggi A.,and Hermonat,P.L.Transduction andUtility of the Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Gene intoMonocytes and Dendritic Cells by Adeno-Associated Virus.Journal of Interferonand Cytokine Research.20:21–30.2000)。
D.脂质体转染试剂Lipofectin：购自美国Life Technology公司。
E.DMEM培养基和胎牛血清(或小牛血清)：购自美国Cellgro公司。
F.PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒：购自瑞士Roche公司。
G.DNA拷贝数标准：分别为1012拷贝数(copies)/μL至106(copies)/μL，购自美国Promega公司。
一、重组腺相关病毒(rAAV)的制备
图5显示携带HPV-16 E7mm突变基因的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7mm)以及携带HPV-E7基因的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7)的制备方法流程图。如图5所示， 用下述方法制备重组腺相关病毒(rAAV)，以制备一盘10.0cm细胞培养皿的病毒为例，当AAV-HEK293细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70％时，进行如下操作：
A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将1.0μg rAAV、1.0μg pHelper质粒、4.0μL Lipofectin和50.0μL含5％胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培养基混匀，室温静置20分钟。
B.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于二氧化碳细胞培养箱中培养。
C.72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。
D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即rAAV病毒液。
E.将收集的rAAV病毒液过滤除菌。
二、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒滴度测定
采用常规的斑点杂交法，对步骤一获得的rAAV病毒进行病毒滴度测定，具体方法包括以下步骤：
A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒颗粒DNA。
B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的rAAV病毒颗粒DNA，并加入DNA拷贝数标准，抽真空。
C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。
D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，所用的DNA探针为针对HPV-16 E7基因的特异性探针，为实施例1步骤C中获得的HPV16-E7 DNA。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下检测PCR扩增产物，结果出现阳性条带，表明探针标记成功。
E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对各种rAAV病毒颗粒DNA进行DNA杂交。
实验结果所有rAAV病毒(四种AAV/HPV-16 E7mm病毒和一种AAV/HPV-16 E7病毒)滴度为1011-1014拷贝/mL，表明获得的rAAV的病毒滴度较高，完全可以用于研究和临床实践。
实施例3、重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7mm病毒和AAV/HPV-16 E7病毒感染原代宫颈上皮细胞的致瘤性观察
材料及其来源：
A.rAAV病毒：实施例2获得的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7mm病毒和AAV/HPV-16E7病毒)。
B.Keratinocyte-SCF细胞培养基：购自美国Life Technology公司。
C.原代宫颈上皮细胞：由用常规方法从正常的宫颈上皮组织中分离获得。
致瘤性观察实验
将原代宫颈上皮细胞在放入10.0cm细胞培养皿中，立即加入10mLKeratinocyte-SCF细胞培养基，置二氧化碳培养箱中在37℃下培养。待细胞完全贴壁后，取出培养皿，将去除7mL培养液后，按照100MOI剂量分别加入重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7mm病毒或AAV/HPV-16 E7病毒，重置于二氧化碳培养箱。8小时后，取出培养皿，去除培养液，加入10mL新鲜的Keratinocyte-SCF细胞培养基，重置于二氧化碳培养箱中在37℃下培养。每2天更换培养基。每天定时观察细胞形态变化2次。直至细胞出现瘤变。
图6示出了四种重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7mm(均以携带CMV启动子的rAAV为代表)和AAV/HPV-16 E7感染原代宫颈上皮细胞的致瘤性观察结果。实验结果显示，被AAV/HPV-16 E7mm病毒感染的细胞仍保持细胞正常状态，未发生瘤变，表明无致瘤性，而被AAV/HPV-16 E7病毒感染的细胞发生明显瘤变，具有致瘤性。结果表明该rAAV均在细胞中表达，但HPV-16 E7抗原蛋白导致细胞瘤变，而HPV-16 E7mm抗原蛋白不导致细胞瘤变。
实施例4、肿瘤抗原导入单个核细胞-树突状细胞系的杀灭肿瘤实验
材料及其来源：
A.rAAV病毒：实施例2方法制备得到的AAV/HPV-16 E7mm病毒和AAV/HPV-16 E7病毒。
B.AIM-V细胞培养基：购自美国Life Technology公司。
C.细胞因子：集落细胞刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素2、4、7购自美国R&D公司。
D.HPV-16 E7阳性的细胞：从肿瘤组织中分离获得或从美国组织细胞保存中心(ATCC)获得，恶性肿瘤包括宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、阴茎癌细胞、肛门癌细胞和口腔癌细胞。
E.HPV-16 E7阴性的细胞：从人的正常组织中分离获得或从美国组织细胞保存中心(ATCC)获得，包括肺、乳腺、肝脏和肾脏上皮细胞。
一、杀灭肿瘤实验
图7显示AAV/HPV-16 E7mm感染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭HPV-16 E7抗原阳性细胞的实验流程。如图7所示，将本发明的携带HPV-16 E7或HPV-16 E7mm抗原 基因的rAAV病毒(AAV/HPV-16 E7病毒或AAV/HPV-16 E7mm病毒)感染患者单核细胞为基础的杀灭HPV-16E7抗原阳性的细胞实验的整个过程包括以下步骤：
A.取肿瘤患者50-150mL外周血，用血细胞分离仪(或淋巴细胞分离液)按常规方法获取外周血单个核细胞(PBMC)，与AIM-V培养基混匀后，加入细胞培养瓶，置于恒温二氧化碳培养箱中在37℃下培养2小时。
B.除去悬浮细胞，保留贴壁细胞(单核细胞)。悬浮细胞即外周血淋巴细胞，将其与AIM-V培养基混匀后，继续培养备用。
C.加入rAAV病毒，加入量约为100MOI，同时再加入GM-CSF(600IU/mL)，继续培养4小时。
D.除去旧培养基，补充含GM-CSF和IL-4(600IU/mL)的AIM-V培养基，继续培养。
E.培养5天后，收获成熟的树突状细胞(DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混合，在AIM-V培养基中加入IL-2(10IU/mL)以及IL-7(200IU/mL)，继续培养。
F.培养至7-9天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进行检测。
二、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测
A.rAAV感染外周血单个核细胞的效率检测
采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对HPV-16 E7特异性荧光抗体(购自美国BD公司)标记步骤一获得的被本发明rAAV感染的单个核细胞(PBMC)或未成熟的树突状细胞(DC)，再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。其中，rAAV感染单核细胞(Mo)的效率检测结果如图8所示，四种多突变型AAV/HPV-16 E7mm病毒(分别以携带CMVp启动子、SV40病毒早期启动子SV40p、AAV p5启动子以及人beta肌动蛋白启动子β-actin启动子的rAVV为代表)感染外周血单核细胞的效率均约为90％，即约百分之九十的外周血单核细胞可被rAAV病毒感染，证明本发明的rAAV具有较高的感染效率。
B.树突状细胞(DC)的CD分子水平的检测
DC表达CD80和CD86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法，即分别采用荧光标记的针对这二种CD分子的抗体(购自美国BD公司)对步骤一获得的DC表达CD80和CD86的水平进行检测。AAV/HPV-16 E7mm病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC表达CD80和CD86水平的检测结果如图9所示(以带CMV启动子的rAAV为代表均可获得高水平表达的CD80和CD86，提示DC的功能较强)，表明被感染的DC所表达的CD分子水平较高，证明本发明携带HPV-16 E7或HPV-16 E7mm抗原基因的rAAV感染的单核细胞所诱导的DC的激发细胞免疫反应的功能强大。
C.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的γ干扰素(IFN-γ)水平的检测
CTL的功能及其杀伤肿瘤细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤A类似的方法检测被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平。DC与外周血淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用传统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，所用抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体(购自美国BD公司)，最后利用流式细胞仪检测结果。其中，被AAV/HPV-16 E7mm3病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平如图10所示(以带CMV启动子的rAAV为代表)，被携带CMV启动子的AAV/HPV-16 E7mm3病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的CTL表达高水平的IFN-γ。表明被本发明AAV/HPV-16 E7mm或AAV/HPV-16 E7感染的DC所诱导的CTL杀伤靶细胞的活性较强(功能强大)。
上述B和C实验结果亦证明AAV/HPV-16 E7mm与携带野生型E7抗原基因的rAAV/HPV-16 E7的功能相当，能够发动有效的细胞免疫反应，即不仅能够有效刺激DC功能，而且也能够导致CTL的产生。
D.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞试验
混合培养结束后，将步骤一中被AAV/HPV-16 E7mm病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞按20:1(淋巴细胞:肿瘤细胞)分别与宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、阴茎癌细胞、肛门癌细胞和口腔癌细胞混合后，采用传统的51Cr(铬-51)杀伤试验，检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性。其中肿瘤细胞杀伤率统计结果如图11A-11D(以带CMV启动子的AAV/HPV-16 E7mm病毒为例，纵坐标表示杀伤率)所示，被本发明AAV/HPV-16 E7mm病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的CTL能够更有效地裂解(杀伤)HPV-16感染的上皮细胞和HPV-16 E7阳性的癌细胞，杀伤率为40％-70％左右。
以HPV-16 E7阴性的肺(lung)、乳腺(breast)、肝(liver)、肾(k-cells)的细胞为对照，再用上述相同的方法检测步骤一中被AAV/HPV-16 E7mm病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的特异性。其中，被rAAV感染的DC所诱导的CTL的肿瘤细胞杀伤特异性检测结果同样见图11A-11D(以带CMV启动子的AAV/HPV-16E7mm病毒为例，纵坐标表示杀伤率)所示，被本发明AAV/HPV-16E7mm病毒或rAAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的CTL对肺(lung)、乳腺(breast)、肝(liver)及肾(k-cells)细胞无杀伤作用，证明被本发明AAV/HPV-16 E7mm或AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的CTL具有抗原特异性，即对抗原阴性的细胞无杀伤作用。
上述检测结果表明，被本发明携带突变型HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/HPV-16 E7mm病毒)感染的DC(统称为rAAV-DC)所诱导的CTL对HPV-16 E7 阳性的细胞具有强大的杀伤(裂解)效果，具有较好的疗效，与野生型HPV-16 E7抗原诱导的CTL的杀伤功能无区别，而且无致瘤性，可用于制备抗肿瘤药物。
实施例5、HPV-16 E7抗原阳性的肿瘤治疗的临床实验
应用重组腺相关病毒-树突状细胞技术，即实施例4中被本发明的AAV/HPV-16 E7病毒或AAV/HPV-16 E7mm3病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输5例宫颈癌、2例肛门癌和4例阴茎癌患者。所有患者已经被证实其癌组织为HPV-16 E7阳性。输注量为2×108-5×108。治疗疗程：通常为6个月，每月2次，病情改善后可减为每月1-2次，进一步可减为每1-3月治疗一次。
治疗结果总结如表1、2、3所示(B:血清肿瘤标志物减少或消失。Q:病人生活质量改善。如疼痛减轻或消失，食欲增加等等。C:CT or PET-CT显示癌症病灶或转移病灶明显减小或消失。)，不良反应：未观察到严重不良反应及毒性反应。
图12B和图12A显示了5例经AAV/HPV-16 E7mm3感染的DC所诱导的CTL治疗后血清CK19(cyfra21-1,正常值<3.3ng/ml)和SCC水平(正常值<5.0ng/ml)的变化情况(纵坐标表示浓度，ng/mL)。经治疗后，宫颈癌患者的血清角蛋白19抗原(CK19，cyfra21-1，正常值<3.3ng/mL)和鳞状细胞癌抗原(SSC，正常值<5.0ng/mL)明显下降，甚至恢复正常。
图13显示了2例肛门癌经AAV/HPV-16 E7mm21感染的DC所诱导的CTL治疗后血清CK19(cyfra21-1,正常值<3.3ng/ml)的变化情况(纵坐标表示浓度，ng/mL)。肛门癌患者经AAV/HPV-16 E7mm3病毒感染的DC所诱导的CTL治疗后血清中CK19抗原水平(cyfra21-1，正常值<3.3ng/mL)下降，提示治疗有效。
图14显示了4例阴茎癌经AAV/HPV-16 E7mm3感染的DC所诱导的CTL治疗后血清癌胚抗原(CEA,正常值<5.0ng/ml)的变化情况(纵坐标表示浓度，ng/mL)。阴茎癌患者经AAV/HPV-16 E7mm3病毒感染的DC所诱导的CTL治疗后血清癌胚抗原(CEA，正常值<5.0ng/mL)经治疗后血清中CEA水平均下降，提示治疗有效。
实验结果表明经治疗后患者的血清角肿瘤标志物(肿瘤相关抗原)均出现明显下降，甚至恢复正常。临床实验结果进一步证明，被本发明的rAAV感染的DC(统称为rAAV-DC)所诱导的CTL在患者体内能够发挥一定的疗效，可有效地抑制HPV-16 E7阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，且安全性较高，可用于制备抗HPV-16感染和抗HPV-16 E7阳性肿瘤药物。
表1 用AAV/HPV-16 E7mm3病毒-树突状细胞技术(rAAV-DC)
治疗宫颈癌患者的疗效的统计结果
| 编号 | 临床分期 | rAAV-DC治疗疗程(月) | 治疗后已存活时间(月) | 治疗效果 |
| 1 | III | 7 | 10 | B,Q,C |
| 2 | III | 6 | 9 | B,Q |
| 3 | III | 9 | 9 | B,Q |
| 4 | IV | 9 | 12 | Q,C |
| 5 | IV | 12 | 15 | B,Q |
| 总计 | III-IV | 43 | 55 |
表2 用AAV/HPV-16 E7mm3病毒-树突状细胞技术(rAAV-DC)
治疗肛门癌患者的疗效的统计结果
| 编号 | 临床分期 | rAAV-DC治疗疗程(月) | 治疗后已存活时间(月) | 治疗效果 |
| 1 | III | 6 | 12 | B,Q,C |
| 2 | IV | 8 | 10 | B,Q |
| 总计 | III-IV | 14 | 22 |
表3 用AAV/HPV-16 E7mm3病毒-树突状细胞技术(rAAV-DC)
治疗阴茎癌患者的疗效的统计结果
| 编号 | 临床分期 | rAAV-DC治疗疗程(月) | 治疗后已存活时间(月) | 治疗效果 |
| 1 | II | 9 | 12 | B,Q,C |
| 2 | III | 6 | 10 | B,Q,C |
| 3 | IV | 12 | 15 | B,Q,C |
| 4 | IV | 3 | 6 | B,Q |
| 总计 | III-IV | 47 | 55 |
工业应用性
实验证明，被本发明HPV-16 E7mm重组腺相关病毒rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地抑制HPV16感染的细胞以及与其相关的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。因而，本发明的HPV-16 E7mm重组腺相关病毒载体或与本发明HPV-16 E7mm重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗HPV-16感染的细胞及其相关的抗肿瘤药物，在临床治疗和应用中具有重要意义。
Claims (7)
1.一种携带人乳头瘤病毒16型(HPV-16)突变型E7mm抗原基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体，是将腺相关病毒(AAV)载体中的腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除并带有AVV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、SV40病毒启动子和beta肌动蛋白启动子(β-actin)中的任意一个启动子的AVV载体作为出发载体，将多点突变型HPV-16 E7mm抗原基因插入出发载体中，获得全新的rAVV载体，即携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体；所述多点突变型HPV-16 E7mm抗原基因为以下之一：
具有nt175(58aa)、nt280(94aa)两个突变位点的多点突变型基因，命名为HPV-16E7mm22，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；
具有nt271(91aa)、nt280(94aa)两个突变位点的多点突变型基因，命名为HPV-16E7mm23，其核苷酸序列如序列表中序列4所示；
具有nt175(58aa)、nt271(91aa)、nt280(94aa)三个突变位点的多点突变型基因，命名为HPV-16 E7mm3，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；
所述腺相关病毒载体为剔除腺相关病毒(AAV)结构基因Rep和Cap的腺相关病毒载体，其携带的启动子为p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、人beta肌动蛋白启动子(β-actin)或SV40病毒早期启动子中的任意一个。
2.一种构建权利要求1所述重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：
1)将HPV-16 E7抗原的第58、91和94位的半胱氨酸(G)中两个或三个改变为甘氨酸(C)，即将HPV-16 E7基因开放读码框nt175、nt271、nt280中的两个或三个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，得到具有两个或三个突变位点的多点突变型HPV-16 E7抗原基因，统一命名为HPV-16 E7mm；
2)分别将多点突变型HPV-16 E7mm抗原基因插入已将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，分别得到携带多点突变型HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16 E7mm)或携带HPV-16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16E7)；所述腺相关病毒载体携带的启动子为p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、人beta肌动蛋白启动子(β-actin)或SV40病毒早期启动子中的任意一个。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)具体过程如以下任一所述：
一、将E7抗原蛋白的第58和94位半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)，详细过程为将HPV-16E7基因开放读码框nt175和nt280两个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt175-177)和tgt(nt280-282)分别改变为编码甘氨酸的ggc和ggt，得到具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm22；得到的携带两点突变型HPV-16 E7mm22抗原基因的重组腺相关病毒载体命名为AAV/HPV-16 E7mm22；
二、将E7抗原蛋白的第91和94位半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)，详细过程为将HPV-16E7基因开放读码框nt271和nt280两个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt271-273)和tgt(nt280-282)分别改变为编码甘氨酸的ggc和ggt，得到具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm23；得到的携带两点突变型HPV-16 E7mm23抗原基因的重组腺相关病毒载体命名为AAV/HPV-16 E7mm23；
三、将E7抗原蛋白的第58、91和94位半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)，详细过程为将HPV-16 E7基因开放读码框nt175、271和280三个胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt175-177和nt271-273)和tgt(nt280-282)分别改变为编码甘氨酸的ggc和ggt，得到具有三个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7mm3；得到的携带三点突变型HPV-16 E7mm3抗原基因的重组腺相关病毒载体命名为AAV/HPV-16 E7mm3。
4.与权利要求1所述重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7mm和重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7相关的产品，包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被所述重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系，细胞系包括单核细胞和树突状细胞。
5.制备权利要求4所述与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 E7mm相关产品的方法，分别为：重组腺相关病毒载体质粒的制备：将重组腺相关病毒载体DNA－AAV/HPV-16 E7或AAV/HPV-16 E7mm分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到AAV/HPV-16 E7质粒和AAV/HPV-16 E7mm质粒；
重组腺相关病毒的制备：以所述重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16 E7质粒或AAV/HPV-16 E7mm和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞得到AAV病毒，分别命名为AAV/HPV-16E7病毒和AAV/HPV-16 E7mm病毒；
重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用所述重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7病毒或AAV/HPV-16 E7mm病毒分别或依次感染或转染单核细胞(Mo)、树突状细胞(DC)或淋巴细胞得到。
6.一种抗HPV-16感染以及由HPV-16感染导致的恶性肿瘤的细胞免疫治疗药物，其活性成分为权利要求1所述或权利要求2方法制备得到的携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HPV-16 E7mm)，权利要求4所述或权利要求5的方法制备得到的与携带HPV-16 E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括AAV/HPV-16 E7mm质粒、AAV/HPV-16 E7mm病毒、被HPV-16 E7mm重组腺相关病毒分别或依次感染或转染得到的单核细胞(Mo)或树突状细胞(DC)。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：所述由HPV-16感染导致的恶性肿瘤为HPV-16 E7抗原阳性的宫颈乳头瘤病变、宫颈癌、男性生殖器Bowen’s病、巨大尖锐湿疣、阴茎癌、肛门癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌以及乳腺癌等。
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Denomination of invention: Recombinant adeno-associated virus vector carrying human papillomavirus type 16 multipoint mutant E7mmantigen gene and its construction method and application Effective date of registration: 20221028 Granted publication date: 20180202 Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: GUANGDONG TOPHEALTH BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022980019862 |