CN106282234A - 携带人c基因型乙型肝炎病毒的表面抗原s基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种携带人C基因型乙型肝炎病毒的表面抗原S基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与其应用。是将人C基因型乙型肝炎病毒的表面抗原基因(HBV‑C S基因)插入已经剔除结构基因并带有启动子的腺相关病毒载体中获得的。该重组腺相关病毒载体可将其携带的HBV‑C S基因输送入单核细胞‑树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞，从而杀灭被HBV‑C病毒感染的细胞，可被用于制备抗HBV‑C病毒感染的药物。

Description

携带人C基因型乙型肝炎病毒的表面抗原S基因的重组腺相关 病毒载体及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种携带人C基因型乙型肝炎病毒的表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)基因(S基因)的重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其在制备抗人C基因型乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染性疾病的细胞免疫治疗药物中的应用。
背景技术
目前，全球约有3.5亿人患有慢性乙型病毒性肝炎(简称“乙肝”)，仅在中国，每年约有50多万人死于慢性乙型肝炎导致的肝脏损害和肝癌，每年因慢性乙肝(包括肝硬化、肝癌)直接经济损失约9000亿人民币。乙肝的治疗现状尚不能令人满意。对大多数慢性乙肝患者的治疗主要以护肝降酶药物为主，这类药物并无抗病毒作用，只是辅助药物。核苷类药物抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)复制的作用很强，故能很快缓解肝脏炎症，多数病人在数月内肝功能试验就能正常。但这类药物停药后大多数病人将复发，而且停药复发在少数病人可能导致灾难性的后果。干扰素治疗慢性乙肝能够持续抑制HBV复制，使炎症持续缓解，复发较少，抗病毒效果相当稳定。但达到这种治疗效果的患者较少，其疗效仍不理想。
目前，抗乙肝药物疗效不理想的主要原因之一是由于HBV DNA与患者的细胞染色体DNA整合，药物无法清除整合的HBV DNA。因此，为达到彻底清除HBV，达到治愈乙肝的目的，必须清除存在于细胞中的HBV。为达到该目的，彻底清除受HBV感染的细胞是最主要的手段。细胞免疫反应的效应细胞，即细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)可发挥这种作用。树突状细胞(Dedritic Cells，DC)是人体最重要、也是最主要的抗原提呈细胞。大量的研究已经证明无论在体内还是体外，DC细胞均可诱导或刺激产生具有抗病毒感染的细胞免疫反应，是靶向性细胞免疫治疗的最主要的技术之一。
1984年，美国Paul L.Hermonat证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗(Hermonat,P.L.,and Muzyczka,N.Use of adeno-associated virus as a mammalianDNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissueculture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。可将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，它是利用腺相关病毒I型(AAV-1)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。
腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(Samulski RJ,Srivastava A,Berns KI,Muzyczka N.Rescue of adeno-associated virus fromrecombinant plasmids:gene correction within the terminal repeats ofAAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(Lip)基因和病毒衣壳(包膜，Cap)基因(Hermonat PL,Labow MA,Wright R,Berns KI,Muzyczka N.Geneticsof adeno-associated virus:isolation and preliminary characterization ofadeno-associated virus type 2mutants.J Virol.51:329-339.Hermonat,P.L.,andMuzyczka,N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和复制蛋白(Rep)基因之间的p5启动子(Labow MA,Hermonat PL,BernsKI.Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type2genome.J Virol.160:251-257.)。
AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。AAV基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，结构基因包括与病毒复制有关的复制蛋白Rep基因和病毒衣壳(包膜)Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面的缺陷，因此需要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(RecombinantAdeno-associated Virus，rAAV)。结合具有不同治疗作用的外源性基因，rAAV的改造与选择需要特殊考虑。目前，尚无基于腺相关病毒携带HBV相关基因的对抗乙型肝炎病毒的细胞免疫治疗药物。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种携带人C基因型乙型肝炎病毒(简称“HBV-C”)的表面抗原基因(S基因)，简称“HBV-C S基因”，的重组腺相关病毒载体。
本发明所提供的重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒(AAV)载体作为出发载体，将“HBV-C S基因”插入出发载体中，获得一种全新的rAAV载体，即携带“HBV-C S基因”的重组腺相关病毒载体，简称“HBV-C S重组腺相关病毒载体”或“AAV/HBV-C S”。
所述HBV-C S基因的核苷酸序列如图4所示。
所述的出发载体——腺相关病毒(AAV)载体是已经剔除腺相关病毒(AAV)结构基因Rep和Cap，并带有AAV的p5启动子(AAV p5)、巨噬细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子(CMVp)、猴空泡病毒40(Simian Vacuolating Virus40or Simian Virus 40，SV40)启动子(SV40p)和beta肌动蛋白启动子(β-actinp)中的任意一个启动子的AAV载体。
所述四种出发载体已由本专利申请的发明人成功构建，构建方法参见中国专利ZL201110125683.X。
本发明的第二个目的是提供上述HBV-C S重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)的构建方法。
本发明所提供的构建方法，是将HBV-C S基因插入已将腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除并带有启动子的腺相关病毒(AAV)载体中，得到携带人C基因型乙型肝炎病毒表面抗原S基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)。
在上述HBV-C S重组腺相关病毒载体的构建方法中，所述HBV-C S基因转录的启动子可以选用AAV的p5启动子(AAV p5)、巨噬细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子(CMVp)、猴空泡病毒40(Simian Vacuolating Virus 40or Simian Virus40，SV40)启动子(SV40p)和beta肌动蛋白启动子(β-actinp)中的任意一个。
本发明的第三个目的是提供与HBV-C S重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)相关的产品，包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒和被本发明重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系，所述细胞系为单核细胞-树突状细胞系。所述重组腺相关病毒载体中的相关基因—HBV-C S基因在单核细胞-树突状细胞系中在转录启动子的作用下获得表达，表达产物为人C基因型乙型肝炎病毒的表面抗原蛋白(HBsAg)。
所述与HBV-C S重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)相关的产品的制备方法，分别为：
携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒质粒的制备：将HBV-C S重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到HBV-C S重组腺相关病毒质粒；
携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒的制备：以HBV-C S重组腺相关病毒载体质粒和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞得到重组腺相关病毒，命名为AAV/HBV-C S病毒；
携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用重组腺相关病毒AAV/HBV-C S病毒分别或依次感染或转染单核细胞和/或树突状细胞，得到被本发明HBV-C S重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。
实际用途方面，本发明的第四个目的是提供一种抗HBV-C病毒感染的细胞免疫治疗的药物及其相关技术。
本发明所提供的药物的活性成分为上述HBV-C S重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-CS)或与本发明HBV-C S重组腺相关病毒载体相关的产品，包括AAV/HBV-C S质粒、AAV/HBV-CS病毒、被AAV/HBV-C S病毒感染或转染得到的单核细胞-树突状细胞。
以本发明的HBV-C S重组腺相关病毒为活性成分，可将HBV-C S重组腺相关病毒感染或转染单核细胞(Mo)，使HBV-C S基因导入单核细胞，并诱导产生树突状细胞(DC)，亦可将HBV-C S重组腺相关病毒感染或转染树突状细胞，使HBV-C S基因直接导入树突状细胞，表达人C基因型乙型肝炎病毒(HBV-C)的表面抗原(HBsAg)蛋白，从而能实现患者体外和体内免疫刺激，可用以治疗HBV-C病毒感染所导致的疾病，或以该表达人C基因型乙型肝炎病毒(HBV-C)的表面抗原(HBsAg)蛋白的树突状细胞刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)治疗HBV-C病毒感染所导致的疾病。
本发明所提供的药物可采用溶剂或粉剂等剂型。
所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
用药方式可为：先分离出患者体内的单核细胞，在体外将此药感染或转染患者的单核细胞(Mo)，体外诱导单核细胞成为具有抗原提呈功能的树突状细胞(DC)。此药亦可感染或转染树突状细胞，但有可能导致树突状细胞对抗原的摄取或加工能力较差，从而导致疗效不佳。所获得的树突状细胞可回输患者体内，达到治疗目的。或将表达人C基因型乙型肝炎病毒(HBV-C)的表面抗原(HBsAg)的成熟的树突状细胞(DC)所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输患者，以取得更佳的疗效，达到抗HBV-C病毒感染的目的。
上述药物的用量一般为DC：1-5×108(个细胞)/每次，二周一次，疗程通常为6次治疗。剂量和疗程可根据实际情况调整。
为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂、靶向、核苷类以及化疗等药物等进行组合应用。
利用本发明能杀灭患者体内被HBV-C病毒感染的细胞。包括以下操作：
1)将患者体内自然产生的单核细胞(Mo)被重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)感染或转染，再将单核细胞诱导成为树突状细胞(DC)；或，先将单核细胞诱导成为树突状细胞(DC)，再将树突状细胞被重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)感染或转染；或，将所述树突状细胞(DC)被重组腺相关病毒载体相关的产品处理；各自得到处理后的细胞；
2)将步骤1)得到的DC输入患者体内中，激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该CTL杀灭被HBV-C病毒感染的细胞；或，将未被处理的T淋巴细胞与步骤1)得到的DC混合培养形成HBV-C HBsAg抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，再将该CTL输入患者体内杀灭被HBV-C病毒感染的细胞；或，将混合培养形成的HBV-C HBsAg抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和步骤1)得到的DC细胞输入患者体内中，杀灭被HBV-C病毒感染的细胞。
杀灭被HBV-C病毒感染的细胞的方法可具体应用到临床治疗中，包括给予一个患者回输具有HBV-C HBsAg抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该细胞由来源于患者或他人的自然产生的T淋巴细胞与来源于该患者的单核细胞-树突状细胞混合培养产生的。在混合培养之前，这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)相关的产品处理；
或者，给予一个患者回输来源于患者或他人的单核细胞-树突状细胞。在回输之前，这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)相关的产品处理；
再或者，给予一个肿瘤患者回输上述来源于患者的T淋巴细胞和来源于该患者或他人的自然产生的单核细胞-树突状细胞。在回输之前，这些T淋巴细胞已经被本发明携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)感染或者转染的单核细胞-树突状细胞相关的产品处理；这些单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)感染或者转染。
本发明提供了一种携带人C基因型乙型肝炎病毒的表面抗原S基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)及其构建方法。本发明的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)可将其携带的HBV-C S基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，此细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。体外实验和初步的临床试验的结果证明，被本发明的AAV/HBV-C S病毒感染的单核细胞-树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外或患者体内可有效地杀灭被HBV-C病毒感染的细胞。因而，本发明携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)或与本发明重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-CS)相关的产品可被用于制备抗HBV-C病毒感染的药物，本发明在HBV-C的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为无AAV结构基因(Rep和Cap)并携带四种不同启动子和HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体AAV/HBV-C S的结构示意图
图2为通过高保真PCR获得的HBV-C S基因的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果
图3为重组腺相关病毒载体AAV/HBV-C S的酶切鉴定结果
图4为重组腺相关病毒载体AAV/HBV-C S中HBV-C S基因的序列测定结果与基因库中HBV-C S基因的序列比较结果
图5为携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒的制备方法流程图
图6为携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒感染乙肝患者的单核细胞为基础的杀灭HBV-C HBsAg抗原阳性细胞的实验流程
图7为携带四种不同启动子(p5、CMVp、SV40p和β-actinp)和HBV-C S基因的AAV/HBV-C S重组腺相关病毒感染树突状细胞的前体细胞－单核细胞的效率的流式细胞技术检测结果
图8为携带CMVp启动子和HBV-C S基因的AAV/CMVp/HBV-C S病毒感染的DC表达CD80和CD86水平的流式细胞技术检测结果
图9为分别携带CMVp启动子和β-actinp启动子的重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平的流式细胞技术检测结果
图10为AAV/HBV-C S重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HBV-C HBsAg阳性细胞和阴性细胞的51Cr(铬-51)的杀伤率检测结果
具体实施方式
本发明旨在提出一种基于腺相关病毒携带外源性基因的抗HBV病毒感染的细胞免疫治疗药物。
发明人意识到，对于一种基因治疗药物，关键之处在于特定外源性基因的确定以及rAAV的设计与选择。
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。长的为负链，短的为正链。负链含3200个碱基，正链的长度可变。HBV基因组中4个开放读码框(ORF)均位于负链，其中的S区可分为S基因和前S基因二部分。S基因编码的226个氨基酸组成的主要表面蛋白，就是乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)，其具有较强的免疫原性。迄今为止，HBV可以分为A-H共8个基因型。HBV基因型分型依据全基因序列核苷酸同源性≥92％或S基因序列核苷酸同源性≥96％的标准，将不同病毒株分为不同基因型。不同的基因型的S基因编码的氨基酸存在一定的差异，例如C基因型与B基因型的HBsAg存在10％左右的差异。发明人发现HBsAg在氨基酸的差异导致这两种基因型的HBsAg所诱导的细胞免疫反应有所不同。例如HBV C基因型编码的HBsAg诱导产生的人细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)攻击HBV B基因型感染的肝细胞的能力较弱。
基于分析考虑，发明人在本发明提出的抗HBV病毒感染的细胞免疫治疗药物中明确：外源性基因为人C基因型乙型肝炎病毒(简称“HBV-C”)的表面抗原基因(S基因)，简称“HBV-C S基因”；重组腺相关病毒载体的出发载体选择发明人之前成功构建的已经剔除腺相关病毒(AAV)结构基因Rep和Cap，并带有AAV的p5启动子(AAV p5)、巨噬细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子(CMVp)、猴空泡病毒40(Simian Vacuolating Virus 40orSimian Virus 40，SV40)启动子(SV40p)和beta肌动蛋白启动子(β-actinp)中的任意一个启动子的AAV载体。
以下对本发明做详细描述。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物合成及DNA序列测定均由美国Life Technology公司完成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的范围不限于下述的实施例。
实施例1、重组腺相关病毒载体AAV/HBV-C S的构建和鉴定
一、材料及其来源：
A.出发载体：为四种分别具有不同启动子的AAV 2型两端完整的重复末端片断(TR)序列,并在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的序列片段[CGGCGCTGG，目的是提高重组AAV病毒(rAAV)的稳定性以及提高病毒的复制效率]，且无任何AAV结构基因(Rep和Cap)的rAAV载体。该四种携带不同启动子的rAAV载体中的启动子分别是AAV p5启动子(AAV p5)、巨噬细胞病毒(CMV)启动子(CMVp)、SV40病毒早期启动子(SV40p)以及人β-肌动蛋白(β-actin)启动子(β-actinp)。该四种rAAV载体由本专利申请的发明人刘勇等构建(构建过程参见中国专利ZL201110125683.X)。
B.HBV-C DNA阳性血清：来源于HBV-C病毒感染的慢性乙肝患者的血清。
C.HBV-C S基因的PCR扩增引物：根据美国基因库中公开发表的HBV-C S基因(美国NCI基因库：AJ748098.1)的核苷酸序列进行设计，筛选确定上游引物：5’-gaatatggagagcacctca-3’，下游引物：5’-tggttttagcagggtttaaa-3’。此外，分别在上、下游引物的5’末端连接限制性内切酶EcoR V和Sal I的由6个核苷酸组成的碱基识别序列，以及3个碱基保护序列(GCC)。采用该对引物，通过PCR可扩增产生长度为720bp的HBV-C S基因。
用下述方法分别构建本发明携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体AAV/HBV-CS(如图1所示)，具体过程包括以下步骤：
二、重组腺相关病毒载体的构建
A.获取HBV-C S基因
采用酚/氯仿DNA抽提法提取DNA，方法为：取3mL HBV-C DNA阳性血清,与等体积的饱和酚剧烈混匀，低温高速离心后，取上清液，再与等体积的氯仿剧烈混匀，低温高速离心,获取上清液后，用75％乙醇洗涤2次，再加入无水乙醇，离心沉淀，沉淀物即为DNA，用去离子水溶解沉淀物，将DNA浓度调至100ng/μL。以2μL DNA溶液为模板，在前述PCR扩增引物的引导下PCR扩增HBV-C S基因，PCR扩增条件为：先94℃4分钟；再94℃30秒，60℃35秒，72℃45秒，共30个循环；最后72℃8分钟，反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2(泳道1：DNA Marker；泳道2：阴性对照；泳道3：HBV-C S基因)所示，出现一条长度为720bp的特异性条带，与预期结果相符。
B.构建rAAV载体
将获得的HBV-C S基因插入分别携带启动子AAV p5、CMVp、SV40p或β-actinp的四种rAAV载体中。方法为：首先进行限制性内切酶切反应，然后进行连接反应，其中，酶切反应体系为：100ng rAAV载体质粒、50ng HBV-C S基因、10U限制性内切酶EcoR V和Sal I(购自美国Promega公司)、2.5μL 10×缓冲液C以及19.5μL去离子水，酶切反应条件为：在37℃下水浴4小时；连接反应体系为：20ng酶切后的rAAV载体质粒、10ng HBV-C S基因、5U T4DNA连接酶(购自美国Promega公司)、1.5μL 10×T4DNA连接缓冲液以及11.5μL去离子水，连接反应条件为：4℃反应8小时，最后得到分别携带AAV p5、CMVp、SV40p或β-actinp启动子及HBV-C S基因的四种重组腺相关病毒载体(分别命名为AAV/p5/HBV-C S、AAV/CMVp/HBV-C S、AAV/SV40p/HBV-C S和AAV/β-actinp/HBV-C S，统一命名为AAV/HBV-C S)。
C.将获得的四种重组腺相关病毒载体AAV/HBV-C S分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(美国Invitrogen公司)，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到AAV/HBV-C S质粒。
三、重组腺相关病毒载体的鉴定
A.限制性内切酶酶切鉴定
将获得的四种AAV/HBV-C S质粒进行酶切鉴定，反应体系和反应条件如上所述，结果均如图3(泳道1：DNA Marker；泳道2：EcoR V；泳道3：空白；泳道4：Sal I；泳道5：EcoR V+Sal I)所示，经EcoR V和Sal I酶切获得了720bp的DNA条带，与预期结果相符，表明HBV-C S基因成功插入载体，且位置正确。
B.DNA序列分析
将四种AAV/HBV-C S载体中HBV-C S基因的序列测定结果与基因库中HBV-C S基因的序列进行比较，结果如图4所示，表明99％的核苷酸同源(图4中差异之处用加粗斜体表示)，进一步证明获得了HBV-C S基因序列及插入位置均正确的重组腺相关病毒载体AAV/HBV-C S。
实施例2、HBV-C S重组腺相关病毒的制备及病毒滴度测定
一、材料及其来源：
A.实施例1获得的携带HBV-C S基因及四种不同启动子的重组腺相关病毒质粒(AAV/p5/HBV-C S质粒、AAV/CMVp/HBV-C S质粒、AAV/SV40p/HBV-C S质粒和AAV/β-actinp/HBV-C S质粒，统称AAV/HBV-C S质粒)。
B.含AAV的Rep基因和Lip/Cap基因的辅助质粒pHelper：由本专利申请的发明人刘勇等人构建(Liu,Y.,Chiriva-Internati,M.,Grizzi,F.Salati,E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapid induction of cytotoxic T cell response againstcervical cancer cells by human papillomavirus type 16E7antigen gene deliveryinto human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer GeneTherapy 8:948-957.)。
C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAV-HEK293细胞：由本专利申请的发明人刘勇等人建立(Liu,Y.,Chiriva-Internati,M.,Grizzi,F.Salati,E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapid induction ofcytotoxic T cell response against cervical cancer cells by humanpapillomavirus type 16E7antigen gene delivery into human dendritic cells byan adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)。
D.脂质体转染试剂Lipofectin：购自美国Life Technology公司。
E.DMEM培养基和胎牛血清(或小牛血清)：购自美国Cellgro公司。
F.PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒：购自瑞士Roche公司。
G.DNA拷贝数标准：分别为1012拷贝数(copies)/μL至108(copies)/μL，购自美国Promega公司。
二、制备HBV-C S重组腺相关病毒(AAV/HBV-C S病毒)
如图5所示，用下述方法制备HBV-C S重组腺相关病毒。以制备一盘10.0cm细胞培养皿的病毒为例，当AAV-HEK293细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70％时，进行如下操作：
A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将1.0μg AAV/HBV-C S质粒，1.0μgpHelper质粒，4.0μl Lipofectin和50.0μl含5％(V/V)胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培养基混匀，室温静置20分钟。
B.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于37℃、5％CO2恒温二氧化碳细胞培养箱中培养。
C.72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。
D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即AAV/HBV-C S病毒液。
E.将收集的病毒液过滤除菌，分别得到AAV/p5/HBV-C S病毒、AAV/CMVp/HBV-C S病毒、AAV/SV40p/HBV-C S病毒和AAV/β-actinp/HBV-C S病毒，统称AAV/HBV-C S病毒。
三、重组腺相关病毒(AAV/HBV-C S病毒)的病毒滴度测定
采用常规的斑点杂交法，对步骤一获得的AAV/HBV-C S病毒进行病毒滴度测定，具体方法包括以下步骤：
A.采用常规的酚/氯仿提取法，提取AAV/HBV-C S病毒DNA。
B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的AAV/HBV-C S病毒DNA，并加入DNA拷贝数标准，抽真空。
C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。
D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，探针为实施例1步骤C中获得的HBV-C S DNA。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下检测PCR扩增产物，结果出现720bp的阳性条带，表明探针标记成功。
E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对各种AAV/HBV-C S病毒颗粒DNA进行DNA杂交。
结果四种重组腺相关病毒滴度在1011-1012拷贝(copies)/mL范围内，表明获得的AAV/HBV-C S病毒的病毒滴度较高，可以用于研究和临床实践。
实施例3、HBV-C S基因导入单核细胞-树突状细胞系为基础的杀灭受HBV感染的细胞实验
一、材料及其来源：
A.AAV/HBV-C S病毒：实施例2获得的AAV/p5/HBV-C S病毒、AAV/CMVp/HBV-C S病毒、AAV/SV40p/HBV-C S病毒和AAV/β-actinp/HBV-C S病毒，统称AAV/HBV-C S病毒。
B.AIM-V细胞培养基：购自美国Life Technology公司。
C.细胞因子：集落细胞刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素2，4购自美国R&D公司。
D.原代HBV-C HBsAg阳性肝上皮细胞：由本专利申请的发明人刘勇等人使用已有技术从HBV-C感染的慢性乙肝患者的肝脏组织中分离获得，已经证实其为HBsAg阳性。
E.原代HBV-C HBsAg阳性肝癌上皮细胞：由本专利申请的发明人刘勇等人使用已有技术从HBV-C感染的原发性肝癌患者的肝脏肿瘤组织组织中分离获得，已经证实其为HBsAg阳性。
F.HBV-C HBsAg阴性的细胞：由本专利申请的发明人刘勇等使用已有技术从人的正常组织中分离获得或从美国组织细胞保存中心(ATCC)获得。包括肺、乳腺、肝脏和肾脏上皮细胞。
G.原代HBV B基因型(HBV-B)的HBsAg阳性肝上皮细胞：由本专利申请的发明人刘勇等人使用已有技术从HBV-B感染的慢性乙肝患者的肝脏组织中分离获得，已经证实其为HBsAg阳性。
H.原代HBV-B的HBsAg阳性肝癌上皮细胞：由本专利申请的发明人刘勇等人使用已有技术从HBV-B感染的原发性肝癌患者的肝脏肿瘤组织组织中分离获得，已经证实其为HBsAg阳性。
二、杀灭受HBV感染的细胞实验
如图6所示，以本发明AAV/HBV-C S病毒感染患者单核细胞为基础的杀灭HBV-CHbsAg抗原阳性的细胞实验过程包括以下步骤：
A.取肝炎患者约80mL-120外周血，采用淋巴细胞分离液，按常规方法获取外周血单个核细胞(PBMC)，也可采用血细胞分离仪分离PBMC，再与AIM-V培养基混匀后，加入细胞培养瓶，置于37℃、5％CO2恒温二氧化碳培养箱中培养2小时。
B.除去悬浮细胞，保留贴壁细胞(单核细胞)。悬浮细胞即外周血淋巴细胞，将其与AIM-V培养基混匀后，继续培养备用。
C.加入AAV/HBV-C S病毒，加入量约为100MOI，同时再加入GM-CSF(600IU/mL)，继续培养4小时。
D.除去旧培养基，补充含GM-CSF和IL-4(600IU/mL)的AIM-V培养基，继续培养。
E.培养5天后，收获成熟的树突状细胞(DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混合，在AIM-V培养基中加入IL-2(10IU/mL)，继续培养。
F.培养至7-9天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进行检测。
二、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测
A.AAV/HBV-C S病毒感染外周血单个核细胞的效率检测
采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对HBV-C HBsAg特异性荧光抗体(购自美国BD公司)标记步骤一获得的被本发明AAV/HBV-C S感染的单核细胞或未成熟的DC，再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。其中，AAV/HBV-C S感染外周血单个核细胞的效率检测结果如图7所示，分别携带四种不同启动子(p5、CMVp、SV40p和β-actinp)和HBV-C S基因的AAV/HBV-C S病毒感染外周血单核细胞的效率均在90％左右，即约90％的外周血单个核细胞可被AAV/HBV-C S病毒感染，证明本发明的AAV/HBV-C S病毒具有较高的感染效率。
B.树突状细胞(DC)的CD分子水平的检测
树突状细胞(DC)表达CD80和CD86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法，即分别采用荧光标记的针对这二种CD分子的抗体(购自美国BD公司)对步骤一获得的DC表达CD80和CD86的水平进行检测。其中，携带CMVp启动子和HBV-C S基因的AAV/CMVp/HBV-C S病毒感染的DC表达CD80和CD86水平的检测结果如图8所示(以携带CMVp启动子的重组腺相关病毒为代表)，检测结果表明DC可获得高水平表达CD80(68.3％)和CD86(80.1％)，表明本发明携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒感染外周血单核细胞后，诱导的DC的激发细胞免疫反应的功能强大。
C.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的γ干扰素(IFN-γ)水平的检测
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能及其杀伤靶细胞(受HBV感染的细胞)的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤A类似的方法检测被本发明的AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平。DC与外周血淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用常规的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，所用抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体(购自美国BD公司)，最后利用流式细胞仪检测结果。检测结果如图9所示，以分别携带CMVp启动子和β-actinp启动子的重组腺相关病毒为代表，被此二种rAAV感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平均较高。表明被本发明的携带HBV-C S基因的r重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL杀伤靶细胞(受HBV感染的细胞)的功能强大。
D.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤靶细胞试验
混合培养结束后，将步骤一中被AAV/HBV-C S病毒感染的树突状细胞(DC)所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)按20:1(淋巴细胞:靶细胞)分别与HBV-C HBsAg阳性或阴性或HBV B基因型(HBV-B)HBsAg阳性的细胞混合后，采用传统的51Cr(铬-51)杀伤试验，检测CTL杀伤细胞的活性。被AAV/HBV-C S毒感染的DC所诱导的CTL对细胞杀伤率统计结果如图10所示(纵坐标表示杀伤率)，被本发明的AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL能够有效地裂解(杀伤)HBV-C HbsAg抗原阳性细胞(HBV-C HbsAg阳性的肝细胞和肝癌细胞，如图10中左边第1-2列)，杀伤率为50％-60％范围内。
以HBV-C HBsAg阴性细胞为对照，再用上述相同的方法检测步骤一中被AAV/HBV-CS病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤细胞的特异性。被AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL对细胞杀伤率统计结果如图10所示(纵坐标表示杀伤率)，被本发明的AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL对HBV-C HBsAg阴性细胞(肾、肺、乳腺、肝细胞，如图10中右边四列))无杀伤作用，证明被本发明的AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL具有抗原特异性，即对HBV-C HBsAg抗原阴性的细胞无杀伤作用。
此外，还以HBV B基因型(HBV-B)的HBsAg阳性的肝上皮细胞和肝癌细胞为对照，再用上述相同的方法检测步骤一中被AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL杀伤HBV-BHBsAg阳性细胞的情况。被AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL对细胞杀伤率统计结果如图10所示(纵坐标表示杀伤率)。被本发明的AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL对HBV-B HBsAg抗原阳性细胞(HBV-B HbsAg阳性的肝细胞和肝癌细胞，如图10中左边第3-4列)杀伤作用较低，杀伤率为15％-20％范围内，表明被本发明的AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL对非C基因型的HBV HBsAg阳性细胞的杀伤作用较低，即该杀伤作用具有HBV基因型的特异性，具有较强的抗原特异性。
上述检测结果表明，被本发明的携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL对HBV-C HBsAg阳性细胞具有强大的杀伤(裂解)效果，可用于制备抗HBV-C病毒感染的药物。
实施例4、靶向性抗HBV-C HBsAg阳性的乙型肝炎细胞免疫治疗的初步临床实验
应用重组腺相关病毒-树突状细胞技术，即实施例3中被本发明的携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒感染的树突状细胞(DC)所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)回输15例慢性乙型肝炎患者，所有患者已经被证实为HBV C基因型感染，且血清HBsAg和HBV-DNA阳性。CTL输注量约为2×108(个细胞)/每次，二周一次，共6次。疗程结束后，检测患者的血清HBsAg和HBV-DNA，以判断疗效。治疗过程中未观察到严重不良反应及毒性反应。
4个月后的治疗结果如下：
(1)血清HBsAg和HBV-DNA转阴：1例；
(2)血清HBsAg滴度下降≥50％和HBV-DNA转阴：5例；
(3)血清HBsAg下降<50％和HBV-DNA转阴：4例；
(4)血清HBsAg下降≥50％和HBV-DNA仍为阳性：2例；
(5)血清HBsAg下降<50％和HBV-DNA仍为阳性：3例。
初步的临床试验结果进一步证明，被本发明的AAV/HBV-C S病毒感染的DC所诱导的CTL在患者体内能够发挥一定疗效，通过杀灭(裂解)被C基因型HBV(HBV-C)感染的细胞，从而杀灭C基因型HBV，且安全性较高，可用于制备抗C基因型HBV感染的药物。
工业应用性
本发明提出了分别携带四种不同启动子(AAV p5、CMVp、SV40p和β-actinp)和HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)以及重组腺相关病毒(AAV/HBV-C S病毒)，实验证明，被AAV/HBV-C S病毒感染的树突状细胞(DC)所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体内、外均可有效地通过裂解C基因型HBV(HBV-C)病毒感染的细胞，从而达到杀灭C基因型HBV病毒的目的。因而，本发明的四种不同启动子(AAV p5、CMVp、SV40p和β-actinp)和HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)及其相关的产品可被用于制备抗C基因型HBV(HBV-C)病毒感染的药物，有应用价值。

Claims (10)

1.一种携带人C基因型乙型肝炎病毒表面抗原S基因的重组腺相关病毒载体,其特征是：将人C基因型的乙型肝炎病毒(HBV-C)的表面抗原基因(S基因)，简写为HBV-C S基因，插入已剔除腺相关病毒结构基因Rep和Cap并带有启动子的腺相关病毒载体(rAAV载体)中，构建成为携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体(命名为AAV/HBV-C S)。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述rAAV载体中启动子为AAV的p5启动子(AAV p5)、巨噬细胞病毒启动子(CMVp)、猴空泡病毒40启动子(SV40p)和beta肌动蛋白启动子(β-actinp)中的任意一个。
3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：为以下中之一种：
携带AAV p5启动子及HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/p5/HBV-C S；
携带CMVp启动子及HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/CMVp/HBV-C S；
携带SV40p启动子及HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/SV40p/HBV-C S；和
携带β-actinp启动子及HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/β-actinp/HBV-C S。
4.构建权利要求1或2或3所述重组腺相关病毒载体的方法，首先获得HBV-CS基因，然后将该基因插入所述rAAV载体中，得到携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体AAV/HBV-CS。
5.与权利要求1或2或3所述或权利要求4所述方法制备得到的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒载体质粒(AAV/HBV-CS质粒)、携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒(AAV/HBV-C S病毒)或被携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒感染或转染的单核细胞-树突状细胞系。
6.权利要求5所述重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，分别为：
AAV/HBV-C S质粒的制备：在权利要求4所述方法后增加步骤：将连接后的DNA－AAV/HBV-C S导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到重组腺相关病毒载体质粒，命名为AAV/HBV-C S质粒；
AAV/HBV-C S病毒的制备：以所述AAV/HBV-C S质粒和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞(宿主细胞)得到重组腺相关病毒，命名为AAV/HBV-C S病毒；
携带HBV-C S基因的重组腺相关病毒感染或转染的细胞系的制备：用所述AAV/HBV-C S病毒分别或依次感染或转染单核细胞-树突状细胞系。
7.权利要求1或2或3所述重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)或权利要求4方法制备得到的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)在制备抗C基因型HBV感染药物中的应用。
8.权利要求5所述重组腺相关病毒载体相关的产品或权利要求6方法制备得到的AAV/HBV-C S质粒、AAV/HBV-C S病毒、被AAV/HBV-C S分别或依次感染或转染得到的单核细胞-树突状细胞系在制备抗C基因型HBV感染药物中的应用。
9.一种抗C基因型HBV感染的细胞免疫治疗的药物，其活性成分为权利要求1或2或3所述的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)或权利要求5所述重组腺相关病毒载体相关的产品，包括AAV/HBV-C S质粒、AAV/HBV-C S病毒、被AAV/HBV-C S病毒感染或转染得到的单核细胞-树突状细胞。
10.一种杀灭被C基因型HBV感染的细胞的方法，包括以下步骤：
1)将患者体内自然产生的单核细胞(Mo)被权利要求1或2或3所述的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)感染或转染，再将单核细胞诱导成为树突状细胞(DC)；或，
先将单核细胞诱导成为树突状细胞(DC)，再将树突状细胞被权利要求1或2或3所述的重组腺相关病毒载体(AAV/HBV-C S)感染或转染；或，
将所述树突状细胞(DC)被权利要求5所述重组腺相关病毒载体相关的产品处理；各自得到处理后的细胞；
2)将步骤1)得到的DC输入患者体内中，激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该CTL杀灭被HBV-C病毒感染的细胞；或，
将未被处理的T淋巴细胞与步骤1)得到的DC混合培养形成HBV-C HBsAg抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，再将该CTL输入患者体内杀灭被HBV-C病毒感染的细胞；或，
将混合培养形成的HBV-C HBsAg抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和步骤1)得到的DC细胞输入患者体内中，杀灭被HBV-C病毒感染的细胞。
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