CN111073899A - 一种编码人nadh脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。还公开了一种融合核酸，其包含所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸。进一步公开了一种重组表达载体，其包含上述核酸或融合核酸。还公开了一种转化体，其在宿主中导入上述核酸或融合核酸。公开了一种人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的制备方法，其包括以下步骤：(1)获得所述转化体；(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述人NADH脱氢酶亚单位4蛋白。本发明所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸表达量更高，因此可在线粒体中获得更多的人NADH脱氢酶亚单位4蛋白，能较好地治疗Leber遗传性视神经病变。

Description

一种编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy,LHON)是一种退行性视力障碍，通常表现为中央视力的双侧丧失。平均发病年龄在20岁中期，通常在数周至数月内没有疼痛，直到双眼视力恶化到0.1以下，严重影响患者的生活质量。LHON是由于线粒体基因突变引起的，与NADH泛醌氧化还原酶、即线粒体呼吸链的复合体I亚基的三个线粒体基因之一的突变有关。研究表明，影响ND1基因的G3460A突变、影响ND6基因的T14484C突变和影响ND4基因的G11778A突变被认为是LHON的主要原因，并且每种突变都具有永久性视力丧失的显著风险。所有这些都与视网膜神经节细胞的局灶性退化有关。

两个主要的LHON突变G3460A和T14484C导致患者血小板中分离的线粒体NADH脱氢酶活性降低80％。然而，从G11778A细胞中分离出的线粒体显示复合物I和呼吸链中大多数其他成分的活性接近正常。对中国LHON患者而言，G11778A位点突变患者占90％。在11778位点的突变，使人NADH脱氢酶亚单位4蛋白(ND4蛋白)的精氨酸转变成组氨酸，导致功能障碍、视神经损伤和Leber遗传性视神经病变，其发病率高、预后差。

LHON治疗的主要问题产生于将DNA输送到细胞器的障碍。现有技术CN 102634527B公开了一种重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的基因(ND4基因)及其表达载体构建方法，由COX10的编码28个氨基酸的肽链，引导ND4蛋白进入到线粒体中。CN 104450747 A公开了一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4(ND4)基因全长以及药剂。该基因其由CAG启动子序列、带COX10的线粒体定位序列的ND4的编码序列和UTR组成。将CN 102634527 B的药剂，或CN 104450747 A的含有CAG-Cox10-ND4的药剂注入眼玻璃体腔中，用于治疗Leber遗传性视神经病变，该等药剂能够在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞，该蛋白N前端的信号肽定向引导该蛋白进入线粒体，成熟的ND4蛋白发挥作用。但是，该技术还存在转染效率不高，治疗效果不佳的缺点。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是克服现有技术中NADH脱氢酶亚单位4蛋白转染效率不高、治疗效果不佳的技术缺陷，提供一种靶向性NADH脱氢酶亚单位4蛋白及其制备方法和应用。经研究发现，本发明优化的ND4基因序列，使ND4蛋白表达效率更高，有更多的ND4蛋白在患者视神经节细胞发挥生理作用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸，其全长为1380bp。在本发明中，所述编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸又称作ND4优化基因或ND4优化核酸。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种融合核酸，其包含所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸。

优选地，所述融合核酸在所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸为连接有线粒体靶向序列和/或UTR序列。本发明中，“融合核酸”指由两个或两个以上不同来源的核苷酸序列连接而成的核酸，或者由同一来源但其天然位置并不互相连接的两个或两个以上核苷酸序列连接而成的核酸。本发明的融合核酸所编码的蛋白称作融合蛋白，在本发明中即ND4优化蛋白。

优选地，当所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸连接了线粒体靶向序列时，所述线粒体靶向序列为如SEQ ID NO:2所示的COX10基因的线粒体靶向序列(简称COX10序列)，或如SEQ ID NO:3所示的OPA1序列；当所述的编码ND4蛋白的核酸连接了UTR序列时，所述UTR序列如SEQ ID NO:4所示。

更优选地，在所述融合核酸中，所述COX10序列、所述编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸、所述UTR序列由5’端至3’端依次排列。

最优选地，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO:5所示。具体地，所述融合核酸的核苷酸序列其全长为2889bp，自1bp至84bp位置为优化的COX10序列(共84bp)；85bp至1464bp位置为优化ND4基因，即所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸(共1380bp)，1465bp至2889bp位置为UTR序列(共1425bp)。COX10序列引导ND4蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能；UTR是非编码序列，设计在ND4蛋白的后面，其作用是稳定线粒体靶向序列和ND4的表达。其中，优化的COX10+ND4和未优化的COX10+ND4序列的同源性为76.16％。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体中含所述的核酸或所述的融合核酸。优选地，所述重组表达载体的骨架载体为AAV载体质粒pSNaV。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种转化体，即在宿主中导入所述的核酸或所述的融合核酸。

优选地，所述的宿主包含所述的重组表达载体。优选地，所述宿主为哺乳动物细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种转化体，其中所述的融合核酸整合在所述宿主的基因组上。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的制备方法，其包含以下步骤：

(1)获得所述的转化体；

(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述人NADH脱氢酶亚单位4蛋白。

本发明提供的编码ND4的核酸或融合核酸，可以体外或体内生产ND4蛋白或ND4融合蛋白，所述融合蛋白或者含所述融合蛋白的制剂可应用于制备治疗Leber遗传性视神经病变的药物。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：经优化的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸表达量更高，从而翻译出更多的ND4融合蛋白，而COX10序列可以准确地将ND4融合蛋白定位到线粒体内膜上，因此有更多的ND4蛋白转染到在线粒体中。将含有COX10-优化ND4融合核酸的药剂注入兔眼玻璃体腔中，该药剂在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞。优化ND4核酸编码比现有技术更多的ND4蛋白，其转染效率更高，能较好地治疗Leber遗传性视神经病变。

附图说明

图1为原COX10+ND4核酸与经优化的COX10+ND4核酸的核苷酸序列对比；

图2为PCR核酸电泳验证ND4和优化ND4基因克隆结果；

图3为rAAV2-ND4和rAAV2-优化ND4感染293T细胞荧光观察结果。

图4为以β-actin为内参蛋白，免疫印迹比较293T细胞rAAV2-优化ND4和rAAV2-ND4在蛋白水平上的表达量，其中泳道A为rAAV2-ND4，泳道B为rAAV2-优化ND4；

图5为以β-actin为内参蛋白，免疫印迹比较兔视神经细胞rAAV2-优化ND4和rAAV2-ND4在蛋白水平上的表达量，其中泳道A为rAAV2-优化ND4，泳道B为rAAV2-ND4；

图6为兔眼玻切镜下眼底拍照，其中A为注射rAAV2-ND4病毒，B为注射rAAV2-优化ND4病毒。

图7为兔眼HE切片镜检结果，其中A为注射rAAV2-ND4病毒，B为注射rAAV2-优化ND4病毒。

具体实施方式

以下是主要试剂和设备的信息：

PCR反应扩增仪：加拿大BBI公司

移液器：加拿大BBI公司

SW-CJ-1D洁净工作台：江苏苏洁净化设备厂

DK-8D型电热恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司

YXJ-2离心机：湘仪离心机仪器有限公司

凝胶成像系统：Gene Genius公司

TaqDNA聚合酶：生工生物工程(上海)有限公司

Marker：生工生物工程(上海)有限公司

6×DNA Loading Dye：生工生物工程(上海)有限公司

PCR产物纯化回收试剂盒：生工生物工程(上海)有限公司

KpnI/SalI酶：生工生物工程(上海)有限公司

Lipofectamine 2000试剂盒：美国Invitrogen公司

以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改和变化，在本发明权利要求及其等同物范围内的修改和变化均属于本发明保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1质粒的构建和重组腺相关病毒的制备

1.1质粒制备：获取人的ND4核苷酸序列后(美国国家生物技术信息中心参考序列：yp_003024035.1)，本发明优化了COX10的编码序列(如SEQ ID NO：2所示)且改变了线粒体ND4核苷酸序列为核编码序列并进行优化(如SEQ ID NO：1所示，在本发明中简称优化ND4基因/核酸)，优化的COX10+ND4和未优化的COX10+ND4序列的同源性为76.16％。并在优化ND4基因的3’端连接UTR序列(如SEQ ID NO：4所示)，其融合基因(或称融合核酸)的序列如SEQID NO:5所示，由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。通过PCR扩增全长基因(图2)，通过EcoRI/SalI酶切在融合基因上形成粘性末端，并将融合基因嵌入有EcoRI/SalI酶切位点的腺相关病毒载体pSNaV，即pSNaV/rAAV2/2-优化ND4(以下简称为pAAV2-优化ND4)。重组子的筛选和鉴定步骤同CN 102634527 B，简述如下：取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照Biomiga说明书，使用EcoRI/SalI酶切鉴定。对照pSNaV/rAAV2/2-ND4(以下简称为pAAV2-ND4)制备参见CN 102634527B。

1.2细胞转染：转染前一天，将HEK293细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×10⁷个/mL细胞，培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染pAAV2-ND4和pAAV2-优化ND4(具体转染步骤参见CN 102634527 B实施例1)。转染48h后，收取细胞。

1.3重组腺相关病毒的收集、浓缩与纯化：

1.3.1病毒的收集：1)准备干冰乙醇浴(或液氮)和37℃水浴；2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中；3)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml PBS重悬；4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次，冻和融各10分钟，每次融解后稍加震荡。

1.3.2病毒的浓缩：1)10,000g离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中；2)用0.45μm滤器过滤除杂质；3)加入各1/2体积的1MNaCl、10％PEG8000溶液，混合均匀，4℃过夜；4)12,000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22μm滤器过滤除菌；5)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖，颠倒几次以充分混合。在37℃孵育30分钟；6)用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的rAAV2病毒。

1.3.3病毒的纯化：1)向病毒浓缩液中添加固体CsCl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372)；2)将样品加入到超速离心管中，用预先配好的1.41g/ml CsCl溶液将离心管剩余空间填满；3)在175,000g下离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有rAAV2颗粒的组分；4)重复上述过程一次。将病毒装入100kDa的透析袋，4℃透析脱盐过夜。

至此，获得浓缩和纯化的重组腺相关病毒rAAV2-ND4和rAAV2-优化ND4。

如本领域技术人员所知，除COX10以外，OPA1(序列如SEQ ID NO:3所示)也可与本发明的优化ND4基因融合，线粒体靶向序列OPA1可将优化ND4基因表达的蛋白带入到线粒体内膜上，从而实现蛋白的线粒体靶向表达。

实施例2rAAV2感染293T实验

将冻存的293T细胞复苏后进行传代培养，长满至T75培养瓶的90％左右，胰酶消化细胞，取细胞沉淀，使用DMEM完全培养基重悬细胞密度为5×10⁴个/mL。使用96孔板种植细胞，每孔加入100μL细胞悬液，约5000个/孔。37℃、5％CO₂环境下培养至细胞长满至孔板的50％左右，按照MOI＝10⁴分别加入病毒液rAAV2-ND4-EGFP和rAAV2-优化ND4-EGFP(2×10¹⁰vg/0.02uL)以及0.02uL PBS，48h后进行荧光显微镜观察及RT-PCR检测和免疫印迹。

48h后进行荧光显微镜观察如图3，荧光照相显示，EGFP成功地被表达，表明以rAAV为载体，携带EGFP基因转染293T细胞内可以正常表达，证明rAAV2-ND4-EGFP和rAAV2-优化ND4-EGFP重组基因可以表达。

实施例3兔眼玻璃体腔注射rAAV2实验

取12只兔子平分为3组，分别用病毒液rAAV2-ND4和rAAV2-优化ND4(1×10¹⁰vg/0.05mL)和PBS在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射后进行裂隙灯、眼底照相检查和HE染色，注射30天，各组分别进行RT-PCR检测和免疫印迹。

实施例4RT-PCR检测ND4的表达

分别提取转染rAAV2-ND4和rAAV2-优化-ND4的293T细胞及兔视神经细胞的RNA、反转录，利用TRIZOL试剂盒提取总RNA并反转录合成cDNA模板。用NCBI的保守结构域分析软件分析ND4的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物：

β-actin-S：CGAGATCGTGCGGGACAT(序列如SEQ ID NO:6所示)；

β-actin-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC(序列如SEQ ID NO:7所示)；

ND4-S：GCCAACAGCAACTACGAGC(序列如SEQ ID NO:8所示)；

ND4-A：TGATGTTGCTCCAGCTGAAG(序列如SEQ ID NO:9所示)；

优化ND4-S：GCCTGACCCTGATCCTGAAC(序列如SEQ ID NO:10所示)

优化ND4-A：GTGCGCTCGTAGTTGCTGTT(序列如SEQ ID NO:11所示)

荧光定量PCR的反应体系和反应程序：

在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH₂O 8μL、引物各1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因β-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。

按照95℃预变性10min，94℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做融解曲线分析。

采用相对定量方法研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以β-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值，计算相对表达，293T细胞rAAV2-ND4组和rAAV2-优化ND4组比对照组的表达量分别提高为89.99倍和108.21倍，两组比较有显著性差异(p＜0.05)；兔视神经细胞rAAV2-ND4组和rAAV2-优化ND4组比对照组的相对表达量分别为75.29倍和78.21倍，两组比较无显著性差异(p＞0.05)。

实施例5免疫印迹检测ND4的表达

分别提取转染rAAV2-ND4和rAAV2-优化-ND4的293T细胞及兔神经细胞的ND4蛋白，然后进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，点转移到聚偏氟膜上(Bio-Rad,Her-cules,CA,USA)，用于免疫检测，以β-actin为内参基因，用自动图像分析仪器(Li-Cor；Lincoln,NE,USA)对薄膜上条带进行观察分析，各蛋白带的积分光密度用归一化法积分，得到相同的样本对应的光学密度值，统计分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。

ND4蛋白表达分析293T细胞rAAV2-ND4组的平均表达值0.36，而rAAV2-优化ND4组的平均表达值是1.65，两组比较有显著性差异(p＜0.01，图4)。兔视神经细胞rAAV2-ND4组的平均表达值0.16，而rAAV2-优化ND4组的平均表达值是0.48，两组比较有显著性差异(p＜0.01，图5)。rAAV2-优化ND4组的蛋白水平上表达明显比未优化组提高，这表明，在转染效率方面rAAV2-优化ND4组的转染效率更高。

实施例6兔子眼压和眼底照相

2组兔子分别于术后1、3、7、30天进行裂隙灯、眼压的检查。所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示参见图6，其中图6A为注射rAAV2-ND4的眼底照相结果，图6B为注射rAAV2-优化ND4的眼底照相结果。由图可见，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症，是安全的。

实施例7兔子眼球HE切片

2组兔子分别于术后7天、30天进行眼压和眼底照相后摘取眼球，用眼球固定液固定，脱水后进行石蜡包埋，病理切片机沿着视神经方向纵切。进一步脱水后先后用苏木素和伊红染液染色，再次脱水封片。显微镜镜检结果参见图7，其中图7A为注射rAAV2-ND4的HE染色结果，图7B为注射rAAV2-优化ND4的HE染色结果。由图可见，所有兔子的视网膜神经节纤维层未受损，神经节细胞未见减少。表明正规标准的玻璃体腔注射没有产生视网膜毒性和神经损伤，是安全的。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 一种编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用

<130> P180113618C

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ND4优化

<400> 1

atgctgaagc tgatcgtgcc caccatcatg ctgctgcccc tgacctggct gagcaagaag 60

cacatgatct ggatcaacac caccacccac agcctgatca tcagcatcat ccccctgctg 120

ttcttcaacc agatcaacaa caacctgttc agctgcagcc ccaccttcag cagcgacccc 180

ctgaccaccc ccctgctgat gctgaccacc tggctgctgc ccctgaccat catggccagc 240

cagcgccacc tgagcagcga gcccctgagc cgcaagaagc tgtacctgag catgctgatc 300

agcctgcaga tcagcctgat catgaccttc accgccaccg agctgatcat gttctacatc 360

ttcttcgaga ccaccctgat ccccaccctg gccatcatca cccgctgggg caaccagccc 420

gagcgcctga acgccggcac ctacttcctg ttctacaccc tggtgggcag cctgcccctg 480

ctgatcgccc tgatctacac ccacaacacc ctgggcagcc tgaacatcct gctgctgacc 540

ctgaccgccc aggagctgag caacagctgg gccaacaacc tgatgtggct ggcctacacc 600

atggccttca tggtgaagat gcccctgtac ggcctgcacc tgtggctgcc caaggcccac 660

gtggaggccc ccatcgccgg cagcatggtg ctggccgccg tgctgctgaa gctgggcggc 720

tacggcatga tgcgcctgac cctgatcctg aaccccctga ccaagcacat ggcctacccc 780

ttcctggtgc tgagcctgtg gggcatgatc atgaccagca gcatctgcct gcgccagacc 840

gacctgaaga gcctgatcgc ctacagcagc atcagccaca tggccctggt ggtgaccgcc 900

atcctgatcc agaccccctg gagcttcacc ggcgccgtga tcctgatgat cgcccacggc 960

ctgaccagca gcctgctgtt ctgcctggcc aacagcaact acgagcgcac ccacagccgc 1020

atcatgatcc tgagccaggg cctgcagacc ctgctgcccc tgatggcctt ctggtggctg 1080

ctggccagcc tggccaacct ggccctgccc cccaccatca acctgctggg cgagctgagc 1140

gtgctggtga ccaccttcag ctggagcaac atcaccctgc tgctgaccgg cctgaacatg 1200

ctggtgaccg ccctgtacag cctgtacatg ttcaccacca cccagtgggg cagcctgacc 1260

caccacatca acaacatgaa gcccagcttc acccgcgaga acaccctgat gttcatgcac 1320

ctgagcccca tcctgctgct gagcctgaac cccgacatca tcaccggctt cagcagctaa 1380

<210> 2

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX10

<400> 2

atggccgcca gcccccacac cctgagcagc cgcctgctga ccggctgcgt gggcggcagc 60

gtgtggtacc tggagcgccg cacc 84

<210> 3

<211> 266

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OPA1

<400> 3

gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60

tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120

cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180

acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240

cgactacgtc gggccgctgt ggcctg 266

<210> 4

<211> 1425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3‘UTR

<400> 4

gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60

tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120

tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180

agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240

ttttatacat ctctcctcca accccaccct ctattctgtt tcttcctcct cacatggggg 300

tacacataca cagcttcctc ttttggttcc atccttacca ccacaccaca cgcacactcc 360

acatgcccag cagagtggca cttggtggcc agaaagtgtg agcctcatga tctgctgtct 420

gtagttctgt gagctcaggt ccctcaaagg cctcggagca cccccttcct tgtgactgag 480

ccagggcctg catttttggt tttccccacc ccacacattc tcaaccatag tccttctaac 540

aataccaata gctaggaccc ggctgctgtg cactgggact ggggattcca catgtttgcc 600

ttgggagtct caagctggac tgccagcccc tgtcctccct tcacccccat tgcgtatgag 660

catttcagaa ctccaaggag tcacaggcat ctttatagtt cacgttaaca tatagacact 720

gttggaagca gttccttcta aaagggtagc cctggactta ataccagccg gatacctctg 780

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atatctcctg aattcagaaa ttagcctcca catgtgcaat ggctttaaga gccagaagca 1020

gggttctggg aattttgcaa gttacctgtg gccaggtgtg gtctcggtta ccaaatacgg 1080

ttacctgcag ctttttagtc ctttgtgctc ccacgggtct acagagtccc atctgcccaa 1140

aggtcttgaa gcttgacagg atgttttcga ttactcagtc tcccagggca ctactggtcc 1200

gtaggattcg attggtcggg gtaggagagt taaacaacat ttaaacagag ttctctcaaa 1260

aatgtctaaa gggattgtag gtagataaca tccaatcact gtttgcactt atctgaaatc 1320

ttccctcttg gctgccccca ggtatttact gtggagaaca ttgcatagga atgtctggaa 1380

aaagcttcta caacttgtta cagccttcac atttgtagaa gcttt 1425

<210> 5

<211> 2889

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ND4融合核酸

<400> 5

atggccgcca gcccccacac cctgagcagc cgcctgctga ccggctgcgt gggcggcagc 60

gtgtggtacc tggagcgccg caccatgctg aagctgatcg tgcccaccat catgctgctg 120

cccctgacct ggctgagcaa gaagcacatg atctggatca acaccaccac ccacagcctg 180

atcatcagca tcatccccct gctgttcttc aaccagatca acaacaacct gttcagctgc 240

agccccacct tcagcagcga ccccctgacc acccccctgc tgatgctgac cacctggctg 300

ctgcccctga ccatcatggc cagccagcgc cacctgagca gcgagcccct gagccgcaag 360

aagctgtacc tgagcatgct gatcagcctg cagatcagcc tgatcatgac cttcaccgcc 420

accgagctga tcatgttcta catcttcttc gagaccaccc tgatccccac cctggccatc 480

atcacccgct ggggcaacca gcccgagcgc ctgaacgccg gcacctactt cctgttctac 540

accctggtgg gcagcctgcc cctgctgatc gccctgatct acacccacaa caccctgggc 600

agcctgaaca tcctgctgct gaccctgacc gcccaggagc tgagcaacag ctgggccaac 660

aacctgatgt ggctggccta caccatggcc ttcatggtga agatgcccct gtacggcctg 720

cacctgtggc tgcccaaggc ccacgtggag gcccccatcg ccggcagcat ggtgctggcc 780

gccgtgctgc tgaagctggg cggctacggc atgatgcgcc tgaccctgat cctgaacccc 840

ctgaccaagc acatggccta ccccttcctg gtgctgagcc tgtggggcat gatcatgacc 900

agcagcatct gcctgcgcca gaccgacctg aagagcctga tcgcctacag cagcatcagc 960

cacatggccc tggtggtgac cgccatcctg atccagaccc cctggagctt caccggcgcc 1020

gtgatcctga tgatcgccca cggcctgacc agcagcctgc tgttctgcct ggccaacagc 1080

aactacgagc gcacccacag ccgcatcatg atcctgagcc agggcctgca gaccctgctg 1140

cccctgatgg ccttctggtg gctgctggcc agcctggcca acctggccct gccccccacc 1200

atcaacctgc tgggcgagct gagcgtgctg gtgaccacct tcagctggag caacatcacc 1260

ctgctgctga ccggcctgaa catgctggtg accgccctgt acagcctgta catgttcacc 1320

accacccagt ggggcagcct gacccaccac atcaacaaca tgaagcccag cttcacccgc 1380

gagaacaccc tgatgttcat gcacctgagc cccatcctgc tgctgagcct gaaccccgac 1440

atcatcaccg gcttcagcag ctaagagcac tgggacgccc accgcccctt tccctccgct 1500

gccaggcgag catgttgtgg taattctgga acacaagaag agaaattgct gggtttagaa 1560

caagattata aacgaattcg gtgctcagtg atcacttgac agtttttttt ttttttaaat 1620

attacccaaa atgctcccca aataagaaat gcatcagctc agtcagtgaa tacaaaaaag 1680

gaattatttt tccctttgag ggtcttttat acatctctcc tccaacccca ccctctattc 1740

tgtttcttcc tcctcacatg ggggtacaca tacacagctt cctcttttgg ttccatcctt 1800

accaccacac cacacgcaca ctccacatgc ccagcagagt ggcacttggt ggccagaaag 1860

tgtgagcctc atgatctgct gtctgtagtt ctgtgagctc aggtccctca aaggcctcgg 1920

agcaccccct tccttgtgac tgagccaggg cctgcatttt tggttttccc caccccacac 1980

attctcaacc atagtccttc taacaatacc aatagctagg acccggctgc tgtgcactgg 2040

gactggggat tccacatgtt tgccttggga gtctcaagct ggactgccag cccctgtcct 2100

cccttcaccc ccattgcgta tgagcatttc agaactccaa ggagtcacag gcatctttat 2160

agttcacgtt aacatataga cactgttgga agcagttcct tctaaaaggg tagccctgga 2220

cttaatacca gccggatacc tctggccccc accccattac tgtacctctg gagtcactac 2280

tgtgggtcgc cactcctctg ctacacagca cggctttttc aaggctgtat tgagaaggga 2340

agttaggaag aagggtgtgc tgggctaacc agcccacaga gctcacattc ctgtcccttg 2400

ggtgaaaaat acatgtccat cctgatatct cctgaattca gaaattagcc tccacatgtg 2460

caatggcttt aagagccaga agcagggttc tgggaatttt gcaagttacc tgtggccagg 2520

tgtggtctcg gttaccaaat acggttacct gcagcttttt agtcctttgt gctcccacgg 2580

gtctacagag tcccatctgc ccaaaggtct tgaagcttga caggatgttt tcgattactc 2640

agtctcccag ggcactactg gtccgtagga ttcgattggt cggggtagga gagttaaaca 2700

acatttaaac agagttctct caaaaatgtc taaagggatt gtaggtagat aacatccaat 2760

cactgtttgc acttatctga aatcttccct cttggctgcc cccaggtatt tactgtggag 2820

aacattgcat aggaatgtct ggaaaaagct tctacaactt gttacagcct tcacatttgt 2880

agaagcttt 2889

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 兔-actin-S引物

<400> 6

cgagatcgtg cgggacat 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 兔-actin-A引物

<400> 7

caggaaggag ggctggaac 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H-ND4-S

<400> 8

gccaacagca actacgagc 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H-ND4-A引物

<400> 9

tgatgttgct ccagctgaag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 优化ND4-S

<400> 10

gcctgaccct gatcctgaac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 优化ND4-A

<400> 11

gtgcgctcgt agttgctgtt 20

Claims (10)

1.一种编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸包含如权利要求1所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸。

3.如权利要求2所述的融合核酸，其特征在于，所述融合核酸在所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸上连接了线粒体靶向序列和/或UTR序列。

4.如权利要求3所述的融合核酸，其特征在于，当所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸连接了线粒体靶向序列时，所述线粒体靶向序列为如SEQ ID NO:2所示的COX10序列，或如SEQ ID NO:3所示的OPA1序列；当所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸连接了UTR序列时，所述UTR序列如SEQ ID NO:4所示。

5.如权利要求4所述的融合核酸，其特征在于，在所述融合核酸中，所述COX10序列、所述编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸、所述UTR序列由5’端至3’端依次排列；优选地，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO:5所示。

6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含如权利要求1所述的核酸或如权利要求2～5任一项所述的融合核酸；优选地，所述重组表达载体的骨架载体为AAV载体质粒pSNaV。

7.一种转化体，其特征在于，在宿主中导入如权利要求1所述的核酸或如权利要求2～5任一项所述的融合核酸。

8.如权利要求7所述的转化体，其特征在于，所述的宿主包含如权利要求6所述的重组表达载体；优选地，所述宿主为哺乳动物细胞；更优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。

9.如权利要求7所述的转化体，其特征在于，所述的融合核酸整合在所述宿主的基因组上。

10.一种人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

(1)获得如权利要求7～9所述的转化体；

(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述人NADH脱氢酶亚单位4蛋白。

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