KR20240014102A - 레버 유전성 시신경병증의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

레버 유전성 시신경병증의 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

미토콘드리아 표적화 서열; 미토콘드리아 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 미토콘드리아 단백질 코딩 서열; 및 3'UTR 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에 개시된다. 또한, 재조합 핵산을 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 약제학적 조성물을 사용한 레버 유전성 시신경병증 (LHON)의 치료 방법이 개시된다.

Description

레버 유전성 시신경병증의 치료를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LEBER'S HEREDITARY OPTIC NEUROPATHY}
상호-참조
본 출원은 2018년 7월 9일 출원된 PCT 출원 번호 PCT/CN2018/095023; 2018년 9월 4일 출원된 PCT 출원 번호 PCT/CN2018/103937; 2018년 6월 29일 출원된 중국 출원 번호 CN201810703168.7 및 CN201810702492.7; 2018년 11월 2일 출원된 PCT 출원 번호 PCT/CN2018/113799; 2018년 10월 22일 출원된 중국 출원 번호 CN201811230856.2; 2018년 11월 30일 출원된 PCT 출원 번호 PCT/CN2018/118662; 2018년 10월 19일 출원된 중국 출원 번호 CN201811221305.X; 2019년 1월 4일 출원된 PCT 출원 번호 PCT/CN2019/070461; 2018년 8월 20일 출원된 중국 출원 번호 CN201810948193.1의 이익을 청구하며; 이들 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2019년 6월 30일 생성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 207298476_1.txt이며 크기가 304,914 바이트이다.
레버 유전성 시신경병증(LHON)은 중심 시력의 급성 또는 아급성 손실을 초래하는 미토콘드리아 유전되는 (모체로부터 자손으로 전염되는) 망막 신경절 세포 (RGC) 및 그의 축색돌기의 퇴행이며; 이는 주로 젊은 성인 남성에게 영향을 준다. LHON은, 이것이 주로 (핵이 아닌) 미토콘드리아 게놈의 돌연변이에 기인하며 난자만이 미토콘드리아를 배아에 기여함에 따라, 단지 모체를 통해 전염된다. LHON은 통상적으로 3개의 병원성 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 점 돌연변이 중 하나에 기인한다. 이들 돌연변이는 미토콘드리아에서 산화적 인산화 사슬의 복합체 I의 NADH 데히드로게나제 서브유닛-4 단백질 (ND4), NADH 데히드로게나제 서브유닛-1 단백질 (ND1) 및 NADH 데히드로게나제 서브유닛-6 단백질 (ND6) 서브유닛 유전자에서 각각 하기 뉴클레오티드 위치에 존재한다: 11778 G에서 A로 (G11778A), 3460 G에서 A로 (G3460A), 또한 14484 T에서 C로 (T14484C). 각각의 돌연변이는 시력의 영구 손실의 상당한 위험을 갖는 것으로 믿어진다. 이는 전형적으로, 양안 시력이 0.1 미만으로 저하될 때까지, 통증 없이 수주 내지 수개월 내에 진행되고, 이는 환자의 삶의 질에 심각하게 영향을 준다. 2종의 LHON 돌연변이체, G3460A 및 T14484C는 환자의 혈소판 단리된 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 활성을 80%만큼 감소시킨다. 중국 LHON 환자의 90 퍼센트가 G11778A 돌연변이를 갖는다. G11778A 돌연변이는 ND4 단백질에서 아르기닌을 히스티딘으로 변화시키고, 이는 LHON 환자에서 기능장애 및 시신경 손상을 초래한다.
보다 높은 트랜스펙션 효율 및 치료 효능을 갖는 LHON의 치료를 위한 조성물 및 방법의 개발이 필요하다.
LHON의 치료를 위한 재조합 핵산, 약제학적 조성물, 및 방법이 본원에 개시된다. 하나의 양태에서, 미토콘드리아 표적화 서열; 서열 번호: 7, 8, 10, 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 미토콘드리아 단백질 코딩 서열; 및 3'UTR 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에 개시된다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 129-159로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 2에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 3에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 4에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 5에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 7 또는 8에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 10에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 12에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 111-125로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열 번호: 17-20, 23-24, 27-28, 31-34, 37-38, 41-42, 45-48, 51-52, 55-56, 59-62, 65-66, 69-70, 73-76, 79-80, 및 83-84로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 서열 번호: 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 미토콘드리아 표적화 서열; 미토콘드리아 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 미토콘드리아 단백질 코딩 서열; 및 3'UTR 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에 개시된다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 2에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 3에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 4에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 5에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 데히드로게나제 4 (ND4), NADH 데히드로게나제 6 (ND6), NADH 데히드로게나제 1 (ND1), 및 이들의 변종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 데히드로게나제 4 (ND4), 또는 그의 변종을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열 번호: 160에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 펩티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 6, 7, 또는 8에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 데히드로게나제 6 (ND6), 또는 그의 변종을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열 번호: 161에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 9 또는 10에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 데히드로게나제 1 (ND1), 또는 그의 변종을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열 번호: 162에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 11 또는 12에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3'에 위치한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 hsACO2, hsATP5B, hsAK2, hsALDH2, hsCOX10, hsUQCRFS1, hsNDUFV1, hsNDUFV2, hsSOD2, hsCOX6c, hsIRP1, hsMRPS12, hsATP5J2, rnSOD2, 및 hsOXA1L로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 111-125로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 3'UTR 핵산 서열의 5'에 위치한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3'에 위치한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열 번호: 29-84로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 미토콘드리아 표적화 서열; 서열 번호: 7, 8, 10, 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 미토콘드리아 단백질 코딩 서열; 및 3'UTR 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에 개시된다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 hsCOX10, hsCOX8, scRPM2, lcSirt5, tbNDUS7, ncQCR2, hsATP5G2, hsLACTB, spilv1, gmCOX2, crATP6, hsOPA1, hsSDHD, hsADCK3, osP0644B06.24-2, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) ATP9 (ncATP9), hsGHITM, hsNDUFAB1, hsATP5G3, crATP6 _hsADCK3, ncATP9_ncATP9, zmLOC100282174, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9, zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6 _hsATP5G3, zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3, ncATP9_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6 _hsATP5G3, crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3, hsADCK3_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9, 및 ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 129-159로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 2 또는 3에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 4에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 5에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 7 또는 8에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 10에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 12에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3'에 위치한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 hsACO2, hsATP5B, hsAK2, hsALDH2, hsCOX10, hsUQCRFS1, hsNDUFV1, hsNDUFV2, hsSOD2, hsCOX6c, hsIRP1, hsMRPS12, hsATP5J2, rnSOD2, 및 hsOXA1L로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 111-125로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 3'UTR 핵산 서열의 5'에 위치한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3'에 위치한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열 번호: 17-20, 23-24, 27-28, 31-34, 37-38, 41-42, 45-48, 51-52, 55-56, 59-62, 65-66, 69-70, 73-76, 79-80, 및 83-84로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 서열 번호: 2, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 미토콘드리아 표적화 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 2에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 3에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 4에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 미토콘드리아 단백질 코딩 서열을 추가로 포함하며, 여기서 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 미토콘드리아 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 데히드로게나제 4 (ND4), NADH 데히드로게나제 6 (ND6), NADH 데히드로게나제 1 (ND1), 및 이들의 변종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 데히드로게나제 4 (ND4), 또는 그의 변종을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열 번호: 160에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 펩티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 6, 7, 또는 8에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 데히드로게나제 6 (ND6), 또는 그의 변종을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열 번호: 161에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 9 또는 10에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 데히드로게나제 1 (ND1), 또는 그의 변종을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열 번호: 162에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 11 또는 12에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 3'UTR 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3'에 위치한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 hsACO2, hsATP5B, hsAK2, hsALDH2, hsCOX10, hsUQCRFS1, hsNDUFV1, hsNDUFV2, hsSOD2, hsCOX6c, hsIRP1, hsMRPS12, hsATP5J2, rnSOD2, 및 hsOXA1L로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 111-125로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 3'UTR 핵산 서열의 5'에 위치한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3'에 위치한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열 번호: 29-70로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열을 포함하며, 여기서 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 미토콘드리아 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 7, 8, 10, 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 재조합 핵산이 본원에 개시된다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 미토콘드리아 표적화 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 hsCOX10, hsCOX8, scRPM2, lcSirt5, tbNDUS7, ncQCR2, hsATP5G2, hsLACTB, spilv1, gmCOX2, crATP6, hsOPA1, hsSDHD, hsADCK3, osP0644B06.24-2, 뉴로스포라 크라사 ATP9 (ncATP9), hsGHITM, hsNDUFAB1, hsATP5G3, crATP6 _hsADCK3, ncATP9_ncATP9, zmLOC100282174, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9, zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6 _hsATP5G3, zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3, ncATP9_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6 _hsATP5G3, crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3, hsADCK3_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9, 및 ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 129-159로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 2에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 3에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 4에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열 번호: 5에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 7 또는 8에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 10에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열은 서열 번호: 12에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 3'UTR 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3'에 위치한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 hsACO2, hsATP5B, hsAK2, hsALDH2, hsCOX10, hsUQCRFS1, hsNDUFV1, hsNDUFV2, hsSOD2, hsCOX6c, hsIRP1, hsMRPS12, hsATP5J2, rnSOD2, 및 hsOXA1L로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 111-125로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 3'UTR 핵산 서열의 5'에 위치한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3'에 위치한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열 번호: 17-20, 23-24, 27-28, 31-34, 37-38, 41-42, 45-48, 51-52, 55-56, 59-62, 65-66, 69-70, 73-76, 79-80, 및 83-84로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 벡터가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 경우에, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, 및 AAV16 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터이다. 일부 경우에, rAAV 벡터는 rAAV2 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 임의의 재조합 핵산을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV)를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 그의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 본원에 개시된 바이러스 벡터 및 그의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 바이러스 벡터는 본원에 개시된 임의의 재조합 핵산을 포함하는 것인 약제학적 조성물이 또한 개시된다. 본원에 개시된 임의의 재조합 핵산을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV); 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 재조합 핵산은 서열 번호: 15에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물이 또한 개시된다.
일부 경우에, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 인산염 완충 식염수 (PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 모노히드로클로라이드 일수화물, 폴리소르베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 인산염 완충 식염수 (PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 모노히드로클로라이드 일수화물, 폴리소르베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 폴록사머 188을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 0.0001%-0.01% 폴록사머 188을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 0.001% 폴록사머 188을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 하나 이상의 염을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 염은 NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, 및 KH2PO4를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 염은 80 mM NaCl, 5 mM NaH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 및 5 mM KH2PO4를 포함한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 6-8의 pH를 갖는다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 7.2-7.4의 pH를 갖는다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 7.3의 pH를 갖는다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 적어도 1.0 × 1010 vg/mL의 바이러스 역가를 갖는다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 적어도 5.0 × 1010 vg/mL의 바이러스 역가를 갖는다.
일부 경우에, 약제학적 조성물은 5회의 동결/해동 사이클에 적용되고, 약제학적 조성물은 5회의 동결/해동 사이클 전의 바이러스 역가에 비해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 바이러스 역가를 보유한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은, 레버 유전성 시신경병증을 갖는 환자에게 투여시, 재조합 핵산이 없는 유사 약제학적 조성물에 비해 더 높은 시력의 평균 회복을 생성한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은, 레버 유전성 시신경병증을 갖는 환자에게 투여시, 서열 번호: 15에 기재된 바와 같은 재조합 핵산을 포함하는 유사 약제학적 조성물에 비해 더 높은 시력의 평균 회복을 생성한다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 임의의 약제학적 조성물을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 눈 장애의 치료 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 눈 장애는 레버 유전성 시신경병증 (LHON)이다. 일부 경우에, 방법은 약제학적 조성물을 환자의 한쪽 또는 양쪽 눈에 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 안내 또는 유리체내 주사를 통해 투여된다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 유리체내 주사를 통해 투여된다. 일부 경우에는, 약 0.01-0.1 mL의 약제학적 조성물이 유리체내 주사를 통해 투여된다. 일부 경우에는, 약 0.05 mL의 약제학적 조성물이 유리체내 주사를 통해 투여된다.
일부 경우에, 방법은 메틸프레드니솔론을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 약제학적 조성물의 유리체내 주사 전에 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 경구 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 약제학적 조성물의 유리체내 주사 전에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 매일 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 매일 투여된다. 일부 경우에는, 약 32 mg/60 kg 메틸프레드니솔론의 일일 투여량이 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 약제학적 조성물의 유리체내 주사 후에 투여된다. 일부 경우에, 방법은 크레아틴 인산염 나트륨을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 크레아틴 인산염 나트륨은 정맥내 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 정맥내 또는 경구 투여된다. 일부 경우에, 방법은 적어도 하루동안 메틸프레드니솔론을 정맥내 투여한 후, 적어도 일주일 동안 메틸프레드니솔론을 경구 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 약 3일 동안 메틸프레드니솔론을 정맥내 투여한 후, 적어도 약 6주 동안 메틸프레드니솔론을 경구 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 약 80 mg/60 kg의 일일 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 경우에, 약제학적 조성물의 투여는 재조합 핵산이 없는 유사 약제학적 조성물에 비해 더 높은 시력의 평균 회복을 생성한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물의 투여는 서열 번호: 15에 기재된 바와 같은 재조합 핵산을 포함하는 유사 약제학적 조성물에 비해 더 높은 시력의 평균 회복을 생성한다.
참조문헌의 포함
본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은, 각각의 개별적 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원이 구체적 및 개별적으로 참조로 포함된다고 지시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은, 보다 높은 트랜스펙션 효율 및 치료 효능을 갖는 LHON의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 상세히 기재된다. 본 발명의 특징 및 이점의 보다 나은 이해는, 본 발명의 원리를 활용하는 예시적 구현예를 기재하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 얻어질 것이며, 도면은 하기와 같다:
도 1은 ND4 (레인 A) 및 최적화된 ND4 (레인 B) 유전자 클로닝 결과의 PCR 핵산 전기영동 확인을 나타낸다.
도 2는 rAAV2-opt_ND4 (좌측 흑색 컬럼)와 rAAV2-ND4 (우측 흑색 컬럼) 사이의 qPCR을 사용한 상대적 발현 수준 비교를 나타낸다. β-액틴은 내부 기준 유전자 (백색 컬럼)이다.
도 3은 rAAV2-opt_ND4 (좌측 흑색 컬럼)와 rAAV2-ND4 (우측 흑색 컬럼) 사이의 면역블롯팅을 사용한 상대적 발현 수준 비교를 나타낸다. β-액틴은 내부 기준 유전자 (백색 컬럼)이다.
도 4는 각각 rAAV2-opt_ND4 (우측) 및 rAAV2-ND4 (좌측)가 주사된 토끼에 대한 안저부(fundus) 사진 결과를 나타낸다.
도 5는 rAAV2-최적화된 ND4 주사 전 (좌측)과 후 (우측)의 환자에 대한 안저부 사진 결과를 나타낸다.
도 6은 rAAV2-ND4 (좌측) 및 rAAV2-opt_ND4* (우측)의 EGFP 발현 수준을 나타낸다.
도 7은 293T 세포에서의 ND4 발현: rAAV2-ND4 (좌측) 및 rAAV2-opt_ND4* (우측)를 나타낸다.
도 8은 293T 세포에서의 상대적 ND4 발현: rAAV2-ND4 (좌측) 및 rAAV2-opt_ND4* (우측)를 나타낸다.
도 9는 토끼 시신경 세포에서의 ND4 발현: rAAV2-ND4 (좌측) 및 rAAV2-opt_ND4* (우측)를 나타낸다.
도 10은 토끼 시신경 세포에서의 상대적 ND4 발현: rAAV2-ND4 (좌측) 및 rAAV2-opt_ND4* (우측)를 나타낸다.
도 11은 rAAV2-ND4 (좌측) 및 rAAV2-opt_ND4* (우측)에 대한 안저부 사진 결과를 나타낸다.
도 12는 rAAV2-ND4 (좌측) 및 rAAV2-opt_ND4* (우측)에 대한 현미경 검사 (HE 염색) 결과를 나타낸다.
도 13은 각각 rAAV2-ND6 (A), rAAV-GFP (B) 및 PBS가 주사된 토끼에 대한 안저부 사진 결과를 나타낸다.
도 14는 각각 rAAV2-opt_ND6 (A), rAAV2-ND6 (B), rAAV-EGFP (C)가 주사된 토끼에 대한 안저부 사진 결과를 나타낸다.
도 15는 토끼 시신경 세포에서의 상대적 ND6 발현: rAAV2-opt_ND6 (A), rAAV2-ND6 (B), 및 rAAV-EGFP (C)를 나타낸다.
도 16은 웨스턴 블롯에 의한 상대적 ND6 발현: rAAV2-opt_ND6 (A), rAAV2-ND6 (B), 및 rAAV-EGFP (C)를 나타낸다.
도 17은 토끼 시신경 세포에서의 상대적 ND1 발현: rAAV2-opt_ND1 (A), rAAV2-ND1 (B), 및 rAAV-EGFP (C)를 나타낸다.
도 18은 웨스턴 블롯에 의한 상대적 ND1 발현: rAAV2-opt_ND1 (A), rAAV2-ND1 (B), 및 rAAV-EGFP (C)를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 당업계의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본원에서의 제제 또는 단위 용량의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 이제 일부 방법 및 물질을 기재한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 또는 고려되는 기술은 표준 방법론이다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한적인 것은 아니다.
본원에서, 또한 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "및", 및 "the"는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"의 언급은 복수의 이러한 작용제를 포함하고, "염"의 언급은 하나 이상의 염 (또는 복수의 염)의 언급 및 당업자에게 공지된 그의 동등물을 포함하며, 기타 등등이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "또는"은 접속적 또는 이접적일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 임의의 구현예는 임의의 다른 구현예와 조합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 일부 본 발명의 구현예는 수치 범위를 고려한다. 범위가 존재하는 경우, 범위는 범위 종점을 포함한다. 추가로, 범위 내의 모든 하위범위 및 값은 이것이 명시적으로 기재되는 것과 같이 존재한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 수치 및 그의 문법적 동등어 언급과 관련하여 용어 "약" 및 그의 문법적 동등어는 그 값으로부터의 플러스 또는 마이너스 10%의 값의 범위, 예컨대 그 값으로부터의 플러스 또는 마이너스 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, "약 10"의 양은 9 내지 11의 양을 포함한다.
용어 "포함하는" (및 관련 용어, 예컨대 "포함하다" 또는 "갖는" 또는 "포함한")은, 다른 특정 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 물질 조성물, 조성물, 방법, 또는 공정 등의 구현예가 기재된 특징으로 "이루어질 수 있음" 또는 "본질적으로 이루어질 수 있음"을 배제하도록 의도되지 않는다.
용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 또는 이들의 대상이 될 포유류를 지칭한다. 용어 "포유류"는 그의 표준 의미를 갖도록 의도되고, 예를 들어, 인간, 개, 고양이, 양, 및 소를 포함한다. 본원에 기재된 방법은 인간 치료법 및 수의학 적용 둘 다에서 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본원에 개시된 적어도 하나의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 그러한 투여를 필요로 하는 포유류 대상체, 특히 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 이는 (i) 질환, 예컨대 암의 임상적 증상의 발달을 저지시키는 것, (ii) 질환, 예컨대 암의 임상적 증상의 퇴화를 일으키는 것, 및/또는 (iii) 질환, 예컨대 암의 발병을 막기 위한 예방적 치료를 포함한다.
본원에 기재된 화학적 엔티니(entity)의 "치료 유효량"이라는 용어는, 인간 또는 비-인간 대상체에게 투여시, 증상의 개선, 질환 진행의 지연, 또는 질환의 방지와 같은 치료적 이익을 제공하기에 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
핵산 및 폴리펩티드 서열
표 1은 본원에 개시된 모든 핵산 및 폴리펩티드 서열을 개시한다. 제1 컬럼은 각각의 서열의 서열 번호를 나타낸다. 제2 컬럼은 핵산 또는 폴리펩티드 작제물을 기재한 것이다. 예를 들어, 작제물 COX10-ND6-3'UTR은 COX10 (서열 번호: 1), ND6 (서열 번호: 9), 및 3'UTR (서열 번호: 13)의 핵산 서열을 조합한 핵산이다 (5'로부터 3'까지, 핵산 서열 사이의 링커 없음).
표 1 - 핵산 및 폴리펩티드 서열 및 서열 번호
아데노-관련 바이러스 (AAV)
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 작은 바이러스이다. 본원에 개시된 조성물은 먼저 아데노-관련 바이러스 (AAV) 게놈 또는 그의 유도체를 포함한다.
AAV 게놈은 AAV 바이러스 입자의 생성을 위해 필요한 기능을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 이들 기능은 숙주 세포에서 AAV에 대한 복제 및 패키징 사이클에서 작업하는 것들, 예컨대 AAV 게놈을 AAV 바이러스 입자로 캡시드화하는 것을 포함한다. 자연 발생 AAV 바이러스는 복제-결핍성이고, 복제 및 패키징 사이클의 완료를 위해 트랜스에서 헬퍼 기능의 제공에 의존한다. 따라서, 본 발명의 벡터의 AAV 게놈은 전형적으로 복제-결핍성이다.
AAV 게놈은 포지티브 또는 네가티브-센스의 단일-가닥 형태, 또는 대안적으로 이중-가닥 형태일 수 있다. 이중-가닥 형태의 사용은 표적 세포에서의 DNA 복제 단계의 우회를 가능하게 하고, 따라서 트랜스진 발현을 가속화시킬 수 있다.
AAV 게놈은 AAV의 임의의 자연 유래 혈청형 또는 단리물 또는 글레이드로부터 유래될 수 있다. 따라서, AAV 게놈은 자연 발생 AAV 바이러스의 전체 게놈일 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 자연에서 발생하는 AAV 바이러스는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다.
통상적으로, AAV 바이러스는 이들의 혈청형과 관련하여 언급된다. 혈청형은 캡시드 표면 항원의 발현의 그의 프로파일로 인해 그를 다른 변종 아종과 구별하기 위해 사용될 수 있는 독특한 반응성을 갖는 AAV의 변종 아종에 상응한다. 전형적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 대해 특이적인 중화 항체와 효율적으로 교차-반응하지 않는다. AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, 및 AAV16, 또한 재조합 혈청형, 예컨대 Rec2 및 Rec3 (최근 영장류 뇌로부터 동정됨)을 포함한다.
본 발명에서의 사용을 위한 AAV의 바람직한 혈청형은 AAV2이다. 본 발명에서의 사용을 위한 특히 중요한 다른 혈청형은, 망막 색소 상피와 같은 눈에서의 조직을 효율적으로 형질도입하는 AAV4, AAV5 및 AAV8을 포함한다. 사용되는 AAV의 혈청형은 AAV4가 아닌 AAV 혈청형일 수 있다. AAV 혈청형의 검토는 Choi 등, Curr Gene Ther. 2005; 5(3); 299-310 및 Wu 등, Molecular Therapy. 2006; 14(3), 316-327에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위한 ITR 서열, rep 또는 cap 유전자를 포함한 AAV 게놈 또는 AAV 게놈의 요소의 서열은 AAV 전체 게놈 서열에 대한 하기 수탁 번호로부터 유래될 수 있다: 아데노-관련 바이러스 1 NC_002077, AF063497; 아데노-관련 바이러스 2 NC_001401; 아데노-관련 바이러스 3 NC_001729; 아데노-관련 바이러스 3B NC_001863; 아데노-관련 바이러스 4 NC_001829; 아데노-관련 바이러스 5 Y18065, AF085716; 아데노-관련 바이러스 6 NC_001862; 조류(Avian) AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; 조류 AAV 균주 DA-1 NC_006263, AY629583; 소(Bovine) AAV NC_005889, AY388617.
AAV 바이러스는 또한 클레이드 또는 클론과 관련하여 언급될 수 있다. 이는 자연 유래 AAV 바이러스의 계통발생 관계, 또한 전형적으로 공통의 조상으로 거슬러 올라갈 수 있고 이들의 모든 자손을 포함하는 AAV 바이러스의 계통발생 그룹을 나타낸다. 추가로, AAV 바이러스는 특정 단리물, 즉 자연에서 나타나는 특정 AAV 바이러스의 유전적 단리물과 관련하여 언급될 수 있다. 용어 유전적 단리물은 다른 자연 발생 AAV 바이러스와 제한된 유전적 혼합을 거치고, 이로써 유전적 수준에서 인식가능하게 뚜렷한 집단을 정의하는 AAV 바이러스의 집단을 나타낸다.
본 발명에서 사용될 수 있는 AAV의 클레이드 및 단리물의 예는 하기를 포함한다: 클레이드 A: AAV1 NC_002077, AF063497, AAV6 NC_001862, Hu. 48 AY530611, Hu 43 AY530606, Hu 44 AY530607, Hu 46 AY530609; 클레이드 B: Hu. 19 AY530584, Hu. 20 AY530586, Hu 23 AY530589, Hu22 AY530588, Hu24 AY530590, Hu21 AY530587, Hu27 AY530592, Hu28 AY530593, Hu 29 AY530594, Hu63 AY530624, Hu64 AY530625, Hu13 AY530578, Hu56 AY530618, Hu57 AY530619, Hu49 AY530612, Hu58 AY530620, Hu34 AY530598, Hu35 AY530599, AAV2 NC_001401, Hu45 AY530608, Hu47 AY530610, Hu51 AY530613, Hu52 AY530614, Hu T41 AY695378, Hu S17 AY695376, Hu T88 AY695375, Hu T71 AY695374, Hu T70 AY695373, Hu T40 AY695372, Hu T32 AY695371, Hu T17 AY695370, Hu LG15 AY695377; 클레이드 C: Hu9 AY530629, Hu10 AY530576, Hu11 AY530577, Hu53 AY530615, Hu55 AY530617, Hu54 AY530616, Hu7 AY530628, Hu18 AY530583, Hu15 AY530580, Hu16 AY530581, Hu25 AY530591, Hu60 AY530622, Ch5 AY243021, Hu3 AY530595, Hu1 AY530575, Hu4 AY530602 Hu2, AY530585, Hu61 AY530623; 클레이드 D: Rh62 AY530573, Rh48 AY530561, Rh54 AY530567, Rh55 AY530568, Cy2 AY243020, AAV7 AF513851, Rh35 AY243000, Rh37 AY242998, Rh36 AY242999, Cy6 AY243016, Cy4 AY243018, Cy3 AY243019, Cy5 AY243017, Rh13 AY243013; 클레이드 E: Rh38 AY530558, Hu66 AY530626, Hu42 AY530605, Hu67 AY530627, Hu40 AY530603, Hu41 AY530604, Hu37 AY530600, Rh40 AY530559, Rh2 AY243007, Bb1 AY243023, Bb2 AY243022, Rh10 AY243015, Hu17 AY530582, Hu6 AY530621, Rh25 AY530557, Pi2 AY530554, Pi1 AY530553, Pi3 AY530555, Rh57 AY530569, Rh50 AY530563, Rh49 AY530562, Hu39 AY530601, Rh58 AY530570, Rh61 AY530572, Rh52 AY530565, Rh53 AY530566, Rh51 AY530564, Rh64 AY530574, Rh43 AY530560, AAV8 AF513852, Rh8 AY242997, Rh1 AY530556; 클레이드 F: Hu14 (AAV9) AY530579, Hu31 AY530596, Hu32 AY530597, 클론 단리물 AAV5 Y18065, AF085716, AAV 3 NC_001729, AAV 3B NC_001863, AAV4 NC_001829, Rh34 AY243001, Rh33 AY243002, Rh32 AY243003.
당업자는 그들의 통상적 일반 지식에 기초하여 본 발명에서의 사용을 위한 AAV의 적절한 혈청형, 글레이드, 클론 또는 단리물을 선택할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드는 유전된 색각 결함의 성공적인 교정에 의해 입증되는 바와 같이 효율적으로 영장류 원뿔체 광수용체를 형질도입하는 것으로 나타났다 (Mancuso 등, Nature 2009, 461:784-7).
그러나, 본 발명은 또한 아직 동정되거나 특성화되지 않은 것일 수 있는 다른 혈청형의 AAV 게놈의 사용을 포함함을 이해하여야 한다. AAV 혈청형은 AAV 바이러스의 감염 (또는 향성(tropism))의 조직 특이성을 결정한다. 따라서, 본 발명에 따라 환자에게 투여되는 AAV 바이러스에서의 사용을 위해 바람직한 AAV 혈청형은 LHON에서 눈 안의 표적 세포의 감염의 높은 효율성 또는 그에 대한 자연적 향성을 갖는 것들이다. 따라서, 환자에게 투여되는 AAV 바이러스에서의 사용을 위한 AAV 혈청형은 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 세포를 감염시키는 것들일 수 있다.
전형적으로, AAV의 자연 유래 혈청형 또는 단리물 또는 글레이드의 AAV 게놈은 적어도 하나의 역위 말단 반복 서열 (ITR)을 포함한다. ITR 서열은 복제의 기능적 원점을 제공하도록 시스로 작용하고, 세포의 게놈으로부터의 벡터의 통합 및 절제를 가능하게 한다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 ITR 서열은 ND4, ND6, 또는 ND1 또는 그의 변종을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹한다. 바람직한 ITR 서열은 AAV2, 및 그의 변종의 것들이다. AAV 게놈은 전형적으로 또한, AAV 바이러스 입자에 대한 패키징 기능을 인코딩하는 패키징 유전자, 예컨대 rep 및/또는 cap 유전자를 포함한다. rep 유전자는 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 이들의 변종 중 하나 이상을 인코딩한다. cap 유전자는 하나 이상의 캡시드 단백질, 예컨대 VP1, VP2 및 VP3 또는 이들의 변종을 인코딩한다. 이들 단백질은 AAV 바이러스 입자의 캡시드를 구성한다. 캡시드 변종은 하기에서 논의된다.
프로모터는 패키징 유전자 각각에 작동가능하게 연결될 것이다. 이러한 프로모터의 구체적 예는 p5, p19 및 p40 프로모터를 포함한다 (Laughlin 등, 1979, PNAS, 76:5567-5571). 예를 들어, p5 및 p19 프로모터는 일반적으로 rep 유전자의 발현을 위해 사용되며, p40 프로모터는 일반적으로 cap 유전자의 발현에 사용된다.
따라서, 상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 벡터에서 사용되는 AAV 게놈은 자연 발생 AAV 바이러스의 전체 게놈일 수 있다. 예를 들어, 전체 AAV 게놈을 포함하는 벡터를 사용하여 시험관내에서 AAV 바이러스를 제조할 수 있다. 그러나, 이러한 벡터는 원칙적으로 환자에게 투여될 수 있지만, 이는 실용상 거의 수행되지 않을 것이다. 바람직하게는 AAV 게놈은 환자에 대한 투여를 위해 유도체화될 것이다. 이러한 유도체화는 당업계에서 표준이고, 본 발명은 AAV 게놈의 임의의 공지된 유도체, 및 당업계에 공지된 가술 적용에 의해 생성될 수 있는 유도체의 사용을 포함한다. AAV 게놈 및 AAV 캡시드의 유도체화는 Coura 및 Nardi (Virology Journal, 2007, 4:99), 및 상기에 언급된 최(Choi) 등 및 우(Wu) 등의 문헌에서 검토되어 있다.
AAV 게놈의 유도체는 생체내에서 본 발명의 벡터로부터의 ND4, ND6, 또는 ND1 트랜스진의 발현을 가능하게 하는 AAV 게놈의 임의의 절단된(truncated) 또는 수정된 형태를 포함한다. 전형적으로, 최소 바이러스 서열을 포함하면서도 상기 기능을 보유하도록 AAV 게놈을 상당히 절단할 수 있다. 이는 야생형 바이러스를 갖는 벡터의 재조합의 위험을 감소시키기 위해, 또한 표적 세포에서 바이러스 유전자 단백질의 존재에 의해 세포 면역 반응을 촉발시키는 것을 막기 위해 안전성의 이유로 바람직하다.
전형적으로, 유도체는 적어도 하나의 역위 말단 반복 서열 (ITR), 바람직하게는 하나 초과의 ITR, 예컨대 2개의 ITR 또는 그 초과를 포함할 것이다. ITR 중 하나 이상이 상이한 혈청형을 갖는 AAV 게놈으로부터 유래될 수 있거나, 키메라 또는 돌연변이 ITR일 수 있다. 바람직한 돌연변이 ITR은 trs (말단 분해 부위)의 결실을 갖는 것이다. 이 결실은 게놈의 연속된 복제가 코딩 및 상보적 서열 둘 다를 함유하는 단일-가닥 게놈, 즉 자가-상보적 AAV 게놈을 생성할 수 있게 한다. 이는 표적 세포에서 DNA 복제의 우회를 가능하게 하고, 따라서 가속화된 트랜스진 발현을 가능하게 한다.
하나 이상의 ITR은 바람직하게는 양 말단에서 ND4, ND6, ND1, 또는 그의 변종을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹할 것이다. 하나 이상의 ITR의 포함은, 예를 들어 숙주 세포 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 단일-가닥 벡터 DNA의 이중-가닥 DNA로의 전환에 따른, 숙주 세포의 핵에서의 본 발명의 벡터의 콘카테머(concatamer) 형성을 보조하기 위해 바람직하다. 이러한 에피솜 콘카테머의 형성은 숙주 세포의 수명 동안 벡터 작제물을 보호하고, 이로써 생체내에서 트랜스진의 연장된 발현을 가능하게 한다.
바람직한 구현예에서, ITR 요소는 유도체에서 네이티브 AAV 게놈으로부터 보유되는 유일한 서열일 것이다. 따라서, 유도체는 바람직하게는 네이티브 게놈의 rep 및/또는 cap 유전자 및 네이티브 게놈의 임의의 다른 서열을 포함하지 않을 것이다. 이는 상기에 기재된 이유로, 또한 벡터의 숙주 세포 게놈으로의 통합 가능성을 감소시키기 위해 바람직하다. 추가로, AAV 게놈의 크기 감소는 트랜스진에 추가로 벡터 내의 다른 서열 요소 (예컨대 조절 요소)의 혼입에서의 증가된 유연성을 가능하게 한다.
따라서, AAV2 게놈과 관련하여, 본 발명의 유도체에서 하기 부분이 제거될 수 있다: 하나의 역위 말단 반복 (ITR) 서열, 복제 (rep) 및 캡시드 (cap) 유전자 (주의: 야생형 AAV 게놈에서의 rep 유전자가 LHON에서 영향받은 인간 유전자, ND4, ND6, 또는 ND1와 혼동되어선 안됨). 그러나, 시험관내 구현예를 포함한 일부 구현예에서, 유도체는 추가로 AAV 게놈의 하나 이상의 rep 및/또는 cap 유전자 또는 다른 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 자연 발생 AAV 바이러스는 인간 염색체 19 상의 특정 자리에서 높은 빈도수로 통합되고, 경미한 빈도수의 랜덤 통합을 나타내고, 그에 따라 벡터에서의 통합 능력의 보유는 치료적 셋팅에서 용인될 수 있다.
유도체 게놈이 캡시드 단백질, 즉 VP1, VP2 및/또는 VP3을 인코딩하는 유전자를 포함하는 경우, 상기 유도체는 하나 이상의 자연 발생 AAV 바이러스의 키메라, 셔플링(shuffling)된 또는 캡시드-수정된 유도체일 수 있다. 특히, 본 발명은 동일한 벡터 내의 AAV의 상이한 혈청형, 클레이드, 클론, 또는 단리물로부터의 캡시드 단백질 서열의 제공, 즉 위형화(pseudotyping)을 포함한다.
키메라, 셔플링된 또는 캡시드-수정된 유도체는 전형적으로 바이러스 벡터에 대한 하나 이상의 요망되는 기능성을 제공하기 위해 선택될 것이다. 따라서, 이들 유도체는 유전자 전달의 증가된 효율, 감소된 면역원성 (체액성 또는 세포성), 변경된 향성 범위 및/또는 AAV2의 것과 같은 자연 발생 AAV 게놈을 포함하는 AAV 바이러스 벡터에 비해 특정 세포 유형의 개선된 표적화를 나타낼 수 있다. 유전자 전달의 증가된 효율은 세포 표면에서의 개선된 수용체 또는 공동-수용체 결합, 개선된 내재화, 세포 내에서의, 또한 핵 내로의 개선된 트래픽킹(trafficking), 바이러스 입자의 개선된 언코팅(uncoating) 및 단일-가닥 게놈의 이중-가닥 형태로의 개선된 전환에 의해 달성될 수 있다. 증가된 효율은 또한, 벡터 용량이 이를 필요로 하지 않는 조직으로의 투여에 의해 희석되지 않도록 하는, 특정 세포 집단의 변경된 향성 범위 또는 표적화와 관련될 수 있다.
키메라 캡시드 단백질은 자연 발생 AAV 혈청형의 둘 이상의 캡시드 코딩 서열 사이의 재조합에 의해 생성된 것들을 포함한다. 이는 예를 들어 마커 레스큐 접근에 의해 수행될 수 있고, 여기서는 하나의 혈청형의 비-감염성 캡시드 서열이 상이한 혈청형의 캡시드 서열과 공동트랜스펙션되고, 요망되는 특성을 갖는 캡시드 서열에 대한 선택을 위해 지향 선택이 사용된다. 상이한 혈청형의 캡시드 서열은 세포 내의 상동 재조합에 의해 변경되어 신규한 키메라 캡시드 단백질을 생성할 수 있다.
키메라 캡시드 단백질은 또한, 둘 이상의 캡시드 단백질 사이, 예를 들어 상이한 혈청형의 둘 이상의 캡시드 단백질 사이의 특정 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특정 아미노산 잔기의 전달을 위해 캡시드 단백질 서열을 조작함으로써 생성된 것들을 포함한다.
셔플링된 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한 DNA 셔플링 또는 에러-유발(error-prone) PCR에 의해 생성될 수 있다. 하이브리드 AAV 캡시드 유전자는 관련 AAV 유전자의 서열, 예를 들어 다수의 상이한 혈청형의 캡시드 단백질을 코딩하는 것들을 랜덤 단편화하고, 이어서 단편을 자가-프라이밍 폴리머라제 반응에서 후속 재어셈블링함으로써 생성될 수 있고, 이는 또한 서열 상동성의 영역에서의 교차를 일으킬 수 있다. 여러 혈청형의 캡시드 유전자의 셔플링에 의해 이러한 방식으로 생성된 하이브리드 AAV 유전자의 라이브러리를 스크리닝하여 요망되는 기능성을 갖는 바이러스 클론을 동정할 수 있다. 유사하게, 에러 유발 PCR을 사용하여 AAV 캡시드 유전자를 랜덤 돌연변이시켜 변종의 다양한 라이브러리를 생성하고, 이어서 이를 요망되는 특성에 대해 선택할 수 있다.
캡시드 유전자의 서열은 또한 네이티브 야생형 서열에 대하여 특정 결실, 치환 또는 삽입을 도입하도록 유전적으로 수정될 수 있다. 특히, 캡시드 유전자는 캡시드 코딩 서열의 개방 판독 프레임 내의, 또는 캡시드 코딩 서열의 N- 및/또는 C-말단에서의 비관련 단백질 또는 펩티드의 서열의 삽입에 의해 수정될 수 있다.
비관련 단백질 또는 펩티드는 유리하게는, 특정 세포 유형에 대한 리간드로서 작용하고, 이로써 표적 세포에 대한 개선된 결합을 부여하는 또는 특정 세포 집단에 대한 벡터의 표적화의 특이성을 개선시키는 것일 수 있다. 일례는 망막 색소 상피에서의 흡수를 차단하고 이로써 주변 망막 조직의 형질도입을 향상시키기 위한 RGD 펩티드의 사용을 포함할 수 있다 (Cronin 등, 2008 ARVO Abstract: D1048). 비관련 단백질은 또한, 생성 과정의 부분으로서의 바이러스 입자의 정제를 보조하는 것, 즉 에피토프 또는 친화성 택일 수 있다. 삽입 자리는 전형적으로, 바이러스 입자의 다른 기능, 예를 들어 바이러스 입자의 내재화, 트래픽킹을 방해하지 않도록 선택될 것이다. 당업자는 그들의 통상적 일반 지식에 기초하여 적합한 삽입 자리를 동정할 수 있다. 특정 자리는 상기에 언급된 최(Choi) 등의 문헌에 개시되어 있다.
본 발명은 추가로, 네이티브 AAV 게놈의 것과 상이한 순서 및 구성의 AAV 게놈의 서열 제공을 포함한다. 본 발명은 또한, 또 다른 바이러스로부터의 서열로의 또는 하나 초과의 바이러스로부터의 서열로 구성된 키메라 유전자로의 하나 이상의 AAV 서열 또는 유전자의 대체를 포함한다. 이러한 키메라 유전자는 상이한 바이러스 종의 둘 이상의 관련 바이러스 단백질로부터의 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 벡터는 AAV 게놈 또는 그의 유도체 및 ND4, ND6, ND1 또는 그의 변종을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열의 형태를 취한다.
의심의 여지를 없애기 위해, 본 발명은 또한, 본 발명의 벡터를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공한다. 본 발명의 AAV 입자는, 하나의 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 게놈 또는 유도체가 상이한 혈청형의 캡시드 내에 패키징된 것인 캡시드전환 형태를 포함한다. 본 발명의 AAV 입자는 또한, 둘 이상의 상이한 혈청형으로부터의 수정되지 않은 캡시드 단백질의 혼합물이 바이러스 엔벨로프를 구성하는 것인 모자이크 형태를 포함한다. AAV 입자는 또한 캡시드 표면에 흡착된 리간드를 갖는 화학적으로 수정된 형태를 포함한다. 예를 들어, 이러한 리간드는 특정 세포 표면 수용체의 표적화를 위한 항체를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 벡터 또는 AAV 바이러스 입자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
재조합 핵산 서열
또한, NADH 데히드로게나제 서브유닛-4 (ND4), NADH 데히드로게나제 서브유닛-1 (ND1) 및 NADH 데히드로게나제 서브유닛-6 (ND6) 폴리펩티드 또는 그의 변종을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 서열이 본원에 개시된다.
ND4에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 6에 나타나 있고, 이는 서열 번호: 160에 나타낸 단백질을 인코딩한다. ND4에 대한 추가의 핵산 서열은 서열 번호: 7 및 8이다. ND6에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 9에 나타나 있고, 이는 서열 번호: 161에 나타낸 단백질을 코딩한다. ND6에 대한 추가의 핵산 서열은 서열 번호: 10이다. ND1에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 11에 나타나 있고, 이는 서열 번호: 162에 나타낸 단백질을 코딩한다. ND1에 대한 추가의 핵산 서열은 서열 번호: 12이다.
서열 번호: 160, 161, 또는 162 중 임의의 하나의 변종은 기능적 ND4, ND6, 또는 ND1 폴리펩티드를 인코딩하는 그의 절단물, 돌연변이체 또는 상동체, 및 그의 임의의 전사 변종을 포함할 수 있다. 본원에서 언급된 임의의 상동체는 전형적으로 ND4, ND6, 또는 ND1의 관련 영역과 적어도 70% 상동성을 갖고, 폴리펩티드 결핍을 기능적으로 보상할 수 있다.
상동성은 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어 UWGCG 패키지는 상동성 계산에 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램 (예를 들어 그의 디폴트 셋팅에서 사용됨)을 제공한다 (Devereux et at (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395). 예를 들어 Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et at (1990) J Mol Biol 215:403-10에 기재된 바와 같이, PILEUP 및 BLAST 알고리즘을 사용하여 상동성 또는 라인 업 서열을 계산할 수 있다 (전형적으로 그의 디폴트 셋팅에서 사용됨). BLAST 분석 수행을 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용가능하다.
바람직한 구현예에서, 재조합 핵산 서열은, 적어도 20, 바람직하게는 적어도 30, 예를 들어 적어도 40, 60, 100, 200, 300, 400개 이상의 연속 아미노산에 걸쳐, 또는 심지어 재조합 핵산의 전체 서열에 걸쳐 ND4, ND6, 또는 ND1 (서열 번호: 160, 161, 또는 162)의 관련 영역과 적어도 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 95%, 97%, 99%, 99.5%, 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 관련 영역은 ND4, ND6, 또는 ND1의 기능적 활성을 제공하는 영역일 것이다.
대안적으로, 또한 바람직하게는 재조합 핵산 서열은 그의 전체 서열에 걸쳐 전장 ND4, ND6, 또는 ND1 (서열 번호: 160, 161, 또는 162)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 95%, 97%, 99%, 99.5%, 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 전형적으로 재조합 핵산 서열은 ND4, ND6, 또는 ND1 (서열 번호: 160, 161, 또는 162)의 관련 영역과 적어도 2, 5, 10, 20, 40, 50 또는 60개 또는 그 미만의 돌연변이 (이들 각각 치환, 삽입 또는 결실일 수 있음)에 의해 상이하다.
재조합 핵산 ND4, ND6, 또는 ND1 폴리펩티드는 상기에 언급된 서열의 길이 중 임의의 것에 걸쳐 특정 백분율 상동성 값 중 임의의 것 (즉, 이는 적어도 70%, 80% 또는 90%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 95%, 97%, 99% 동일성일 수 있음)과 동일한 서열 번호: 160, 161, 또는 162의 특정 영역과의 백분율 동일성을 가질 수 있다.
ND4, ND6, 또는 ND1 (서열 번호: 160, 161, 또는 162)의 변종은 또한 절단물을 포함한다. 변종이 여전히 기능적인 한 임의의 절단물이 사용될 수 있다. 절단물은 전형적으로, 단백질 활성을 위해 비-필수적인 및/또는 폴딩된 단백질의 구조형태(conformation), 특히 활성 자리의 폴딩에 영향을 주지 않는 서열을 제거하기 위해 이루어질 것이다. 적절한 절단물은 N- 또는 C-말단으로부터의 다양한 길이의 서열의 체계적 절단에 의해 일상적으로 동정될 수 있다. 바람직한 절단물은 N-말단이고, 이는 촉매적 도메인을 제외한 모든 다른 서열을 제거할 수 있다.
ND4, ND6, 또는 ND1 (서열 번호: 160, 161, 또는 162)의 변종은 ND4, ND6, 또는 ND1 (서열 번호: 160, 161, 또는 162)의 특정 영역에 대하여, 하나 이상의, 예를 들어, 2, 3, 4, 5 내지 10개, 10 내지 20개, 20 내지 40개 이상의 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 돌연변이체를 추가로 포함한다. 결실 및 삽입은 바람직하게는 하기에 기재되는 바와 같이 촉매적 도메인의 외부에서 이루어진다. 치환은 또한 전형적으로, 프로테아제 활성을 위해 비-필수적인 및/또는 폴딩된 단백질의 구조형태에 영향을 주지 않는 영역에서 이루어진다.
치환은 바람직하게는, 아미노산을 유사한 화학적 구조, 유사한 화학적 특성 또는 유사한 측쇄 부피의 다른 아미노산으로 대체하는 하나 이상의 보존적 변화를 도입한다. 도입된 아미노산은 이들이 대체하는 아미노산과 유사한 극성, 친수성, 소수성, 염기성, 산성, 중성 또는 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 변화는 기존 방향족 또는 지방족 아미노산 대신에 방향족 또는 지방족인 또 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변화는 당업계에 널리 공지되어 있고, 아미노산의 특성에 따라 선택될 수 있다.
유사하게, ND4, ND6, 또는 ND1 (서열 번호: 6, 9, 또는 11)의 폴리뉴클레오티드 서열의 바람직한 변종은 ND4, ND6, 또는 ND1 (서열 번호: 6, 9, 또는 11)의 관련 영역과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는 변종은 그의 전체 서열에 걸쳐 전장 ND4, ND6, 또는 ND1 (서열 번호: 6, 9, 또는 11)과 이들 수준의 상동성을 나타낸다.
미토콘드리아 표적화 서열 (MTS) 및 3 프라임 비번역 영역 (3'UTR)을 사용하여 미토콘드리아에 대하여 단백질 또는 mRNA를 표적화할 수 있다. MTS의 전하, 길이, 및 구조가 미토콘드리아에 대한 단백질 유입에 있어 중요할 수 있다. 특정 3'UTR은 미토콘드리아 표면에 대한 mRNA 국소화를 구동시키고 그에 따라 미토콘드리아에 대한 동시번역 단백질 유입을 용이하게 할 수 있다.
미토콘드리아 표적화 서열에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 hsCOX10, hsCOX8, scRPM2, lcSirt5, tbNDUS7, ncQCR2, hsATP5G2, hsLACTB, spilv1, gmCOX2, crATP6, hsOPA1, hsSDHD, hsADCK3, osP0644B06.24-2, 뉴로스포라 크라사 ATP9 (ncATP9), hsGHITM, hsNDUFAB1, hsATP5G3, crATP6 _hsADCK3, ncATP9_ncATP9, zmLOC100282174, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9, zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6 _hsATP5G3, zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3, ncATP9_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6 _hsATP5G3, crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3, hsADCK3_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9, 및 ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9 (서열 번호에 대하여 표 1 참조)로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일례에서, 폴리뉴클레오티드 서열, COX10 (서열 번호: 1, 2, 또는 3)은 미토콘드리아 표적화 서열, MTS-COX10 (서열 번호: 126)을 인코딩할 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오티드 서열, COX8 (서열 번호: 4)은 미토콘드리아 표적화 서열, MTS-COX8 (서열 번호: 127)을 인코딩할 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오티드 서열, OPA1 (서열 번호: 5)은 미토콘드리아 표적화 서열, MTS-OPA1 (서열 번호: 128)을 인코딩할 수 있다.
3'UTR 핵산 서열은 hsACO2 (서열 번호: 111), hsATP5B (서열 번호: 112), hsAK2 (서열 번호: 113), hsALDH2 (서열 번호: 114), hsCOX10 (서열 번호: 115), hsUQCRFS1 (서열 번호: 116), hsNDUFV1 (서열 번호: 117), hsNDUFV2 (서열 번호: 118), hsSOD2 (서열 번호: 119), hsCOX6c (서열 번호: 120), hsIRP1 (서열 번호: 121), hsMRPS12 (서열 번호: 122), hsATP5J2 (서열 번호: 123), rnSOD2 (서열 번호: 124), 및 hsOXA1L (서열 번호: 125)로부터 선택될 수 있다. 3'UTR 핵산 서열은 또한, 본원에 열거된 임의의 3'UTR 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 상동성을 갖는 변종일 수 있다. 예를 들어, 3'UTR 핵산 서열은 서열 번호: 13 또는 14일 수 있다.
또한, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 코딩 서열, 및 3'UTR 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 서열이 본원에 개시된다. 예를 들어, 재조합 핵산 서열은 서열 번호: 15-84로부터 선택될 수 있다. 재조합 핵산 서열은 또한, 본원에 열거된 임의의 재조합 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또한 보다 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 상동성을 갖는 변종일 수 있다.
프로모터 및 조절 서열
본 발명의 벡터는 또한 시험관내에서 또는 생체내에서 개시된 트랜스진의 발현을 가능하게 하는 요소를 포함한다. 따라서, 벡터는 전형적으로 ND4, ND6, 또는 ND1 트랜스진 또는 그의 변종을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함한다.
임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 프로모터 서열은 임의의 숙주 세포 배경에서 구성적으로 활성, 즉 작동성일 수 있거나, 대안적으로 특정 숙주 세포 환경에서만 활성이고, 그에 따라 특정 세포 유형에서의 트랜스진의 표적화된 발현을 가능하게 할 수 있다. 프로모터는 또 다른 인자, 예를 들어 숙주 세포 내에 존재하는 인자의 존재에 반응하는 유도성 발현을 나타낼 수 있다. 어떤 경우에도, 벡터가 치료를 위해 투여되는 경우, 프로모터는 망막 세포 배경에서 기능적이어야 한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 트랜스진이 단지 망막 세포 집단에서 발현될 수 있게 하기 위해 망막-세포 특이적 발현을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은 망막-세포 특이적일 수 있고, 예를 들어 단지 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 세포로 국한될 수 있다.
ND4, ND6, 또는 ND1 트랜스진에 대한 바람직한 프로모터는, 임의로 시토메갈로바이러스 (CME) 인핸서 요소와 조합된, 치킨 베타-액틴 (CBA) 프로모터를 포함한다. 일부 경우에, ND4, ND6, 또는 ND1 트랜스진에 대한 바람직한 프로모터는 CAG 프로모터를 포함한다. 특히 바람직한 프로모터는 하이브리드 CBA/CAG 프로모터, 예를 들어 rAVE 발현 카세트에서 사용되는 프로모터이다. 망막 특이적 유전자 발현을 유도하는 인간 서열에 기초한 프로모터의 예는 간상체 및 추상체에 대한 로돕신 키나제 (Allocca 등, 2007, J Viol 81:11372-80), 단지 추상체에 대한 PR2.1 (Mancuso 등 2009, Nature) 및/또는 망막 색소 상피에 대한 RPE65 (Bainbridge 등, 2008, N Eng J Med)를 포함한다.
본 발명의 벡터는 또한 전사-전 또는 전사-후 작용할 수 있는 하나 이상의 추가의 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 네이티브 ND4, ND6, 또는 ND1 유전자좌의 부분일 수 있거나 비상동(heterologous) 조절 서열일 수 있다. 본 발명의 벡터는 네이티브 ND4, ND6, 또는 ND1 전사로부터의 5'UTR 또는 3'UTR의 부분을 포함할 수 있다.
조절 서열은 트랜스진의 발현을 용이하게 하는, 즉 전사의 발현을 증가시키거나 mRNA의 핵 유출을 개선시키거나 그의 안정성을 향상시키도록 작용하는 임의의 서열이다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 인핸서 요소, 후조절 요소 및 폴리아데닐화 자리를 포함한다. 바람직한 폴리아데닐화 자리는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호이다. 본 발명의 벡터와 관련하여, 이러한 조절 서열은 시스-작용성일 것이다. 그러나, 본 발명은 또한, 추가의 유전적 작제물 상에 위치하는 트랜스-작용 조절 서열의 사용을 포함한다.
본 발명의 벡터에서의 사용을 위해 바람직한 후조절 요소는 우드척 간염 후조절 요소 (WPRE) 또는 그의 변종이다. 본 발명의 벡터에서 사용될 수 있는 또 다른 조절 서열은 스캐폴드-부착 영역 (SAR)이다. 추가의 조절 서열은 당업자에 의해 이들의 통상적 일반 지식에 기초하여 선택될 수 있다.
벡터의 제조
본 발명의 벡터는 유전자 요법을 위한 벡터의 제공에 대하여 당업계에 공지된 표준 수단에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 잘 확립된 공개적 도메인 트랜스펙션, 패키징 및 정제 방법을 적합한 벡터 조제물의 제조에 사용할 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 벡터는 ND4, ND6, 또는 ND1 또는 그의 변종을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 추가로 자연 발생 AAV 바이러스의 전체 게놈을 포함할 수 있다. 그러나, 통상적으로 유도체화된 게놈, 예를 들어 적어도 하나의 역위 말단 반복 서열 (ITR)을 갖는, 그러나 rep 또는 cap과 같은 임의의 AAV 유전자를 갖지 않을 수 있는 유도체가 사용될 것이다.
이러한 구현예에서, 유도체화된 게놈의 AAV 바이러스 입자로의 어셈블리를 제공하기 위해, AAV 및/또는 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 추가의 유전적 작제물이 유도체화된 게놈과 조합되어 숙주 세포에 제공될 것이다. 이들 추가의 작제물은 전형적으로 구조적 AAV 캡시드 단백질, 즉 cap, VP1, VP2, VP3을 인코딩하는 유전자, 및 rep과 같은 AAV 수명 주기를 위해 필요한 다른 기능을 인코딩하는 유전자를 함유할 것이다. 추가의 작제물 상에 제공되는 구조적 캡시드 단백질의 선택은 패키징된 바이러스 벡터의 혈청형을 결정할 것이다.
본 발명에서의 사용을 위한 특히 바람직한 패키징된 바이러스 벡터는 AAV5 또는 AAV8 캡시드 단백질과 조합된 AAV2의 유도체화된 게놈을 포함한다. 이 패키징된 바이러스 벡터는 전형적으로 하나 이상의 AAV2 ITR을 포함한다.
상기에 언급된 바와 같이, AAV 바이러스는 복제 능력이 없고, 따라서 AAV 복제를 가능하게 하도록 하나 이상의 추가의 작제물에 헬퍼 바이러스 기능, 바람직하게는 아데노바이러스 헬퍼 기능이 전형적으로 제공될 것이다.
상기 추가의 작제물 모두는 숙주 세포에서 플라스미드 또는 다른 에피솜 요소로서 제공될 수 있거나, 대안적으로 하나 이상의 작제물이 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.
이들 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 아데노-관련 바이러스 (AAV) 게놈 또는 그의 유도체 및 ND4, ND6, 또는 ND1 또는 그의 변종을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포에서 제공하고, 복제 및 AAV 바이러스 입자로의 벡터의 어셈블리를 위한 수단을 제공하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은, AAV 및/또는 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 하나 이상의 추가의 유전적 작제물와 함께, ND4, ND6, 또는 ND1 또는 그의 변종을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 AAV 게놈의 유도체를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 포함한다. 전형적으로, AAV 게놈의 유도체는 적어도 하나의 ITR을 포함한다. 임의로, 상기 방법은 어셈블링된 바이러스 입자의 정제 단계를 추가로 포함한다. 추가로, 상기 방법은 치료적 사용을 위한 바이러스 입자의 제제화 단계를 포함할 수 있다.
치료 방법 및 의료적 용도
상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도, 본 발명의 벡터를 사용하여 LHON의 기초가 되는 세포 기능장애를 해결할 수 있음을 입증하였다. 특히, 이들은 벡터의 사용이 LHON과 관련된 결함을 교정할 수 있음을 보여주었다. 이는 그에 의해 질환의 퇴행 과정이 치료되거나 저지되거나 완화되거나 방지될 수 있는 수단을 제공한다.
따라서, 본 발명은, 치료 유효량의 본 발명의 벡터를 환자에게 직접적 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서의 LHON의 치료 또는 방지 방법을 제공한다. 따라서, LHON이 이로써 환자에서 치료되거나 방지된다.
관련 양태에서, 본 발명은, 본 발명의 벡터를 환자에게 직접적 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 투여하는 것에 의한 LHON의 치료 또는 방지 방법에서의 본 발명의 벡터의 용도를 제공한다. 추가로, 본 발명은, 직접적 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의한 LHON의 치료 또는 방지를 위한 의약 제조에서의 본 발명의 벡터의 용도를 제공한다.
모든 이들 구현예에서, 본 발명의 벡터는 LHON의 하나 이상의 증상의 발병을 막기 위해 투여될 수 있다. 환자는 무증상일 수 있다. 대상체는 질환에 대한 소인을 가질 수 있다. 방법 또는 용도는, 대상체가 LHON의 발달 위험에 있는지 또는 이를 갖는지의 여부를 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 예방 유효량의 벡터가 이러한 대상체에게 투여된다. 예방 유효량은 질환의 하나 이상의 증상의 발병을 막는 양이다.
대안적으로, 상기 벡터는 질환의 증상이 대상체에서 나타나면, 즉 질환의 기존 증상을 치유하기 위해 투여될 수 있다. 치료 유효량의 길항제가 이러한 대상체에게 투여된다. 치료 유효량은 질환의 하나 이상의 증상을 개선시키기에 효과적인 양이다. 이러한 양은 또한 LHON과 관련된 주변 시력의 일부 손실을 저지시키거나 늦추거나 역전시킬 수 있다. 이러한 양은 또한 LHON의 발병을 저지시키거나 늦추거나 역전시킬 수 있다.
전형적인 단일 용량은 형질도입을 필요로 하는 남아있는 망막 조직의 양에 따라 1010　내지 1012개 게놈 입자이다. 게놈 입자는 본원에서 서열 특이적 방법 (예컨대 실시간 PCR)으로 정량화될 수 있는 단일 가닥 DNA 분자를 함유하는 AAV 캡시드로서 정의된다. 그 용량은 단일 용량으로서 제공될 수 있지만, 타안에 대해 또는 벡터가 어떠한 이유로든 (예컨대 수술 합병증) 망막의 정확한 영역을 표적화하지 않았을 수 있는 경우에 반복될 수 있다. 치료는 바람직하게는 각각의 눈에 대한 단일 영구 치료이지만, 예를 들어 향후 몇년 내의 및/또는 상이한 AAV 혈청형을 사용한 반복 주사가 고려될 수 있다.
본 발명은 또한, 직접적 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의한 본 발명의 AAV 벡터의 투여 후 환자로부터 얻어진 망막 세포에서 생체외 활성을 측정하는 것을 포함하는, 상기 환자에서의 LHON의 치료 또는 방지를 모니터링하는 방법을 제공한다. 이 방법은 치료 효능의 결정을 가능하게 할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 벡터는 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다. 이들 조성물은, 벡터에 추가로, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 즉 여기서는 직접적 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 전형적으로 액체 형태이다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물 또는 식물유, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수, 염화마그네슘, 덱스트로스 또는 다른 사카라이드 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제, 예컨대 플루로닉산 (PF68) 0.001%가 사용될 수 있다.
고통 부위에서의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 수용액 형태일 것이다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트 링거 주사액을 사용하여, 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 산화방지제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다.
지연 방출을 위해, 벡터는 당업계에 공지된 방법에 따라 느린 방출을 위해 제제화된 약제학적 조성물 중에, 예컨대 생체적합성 중합체로부터 형성된 마이크로캡슐 내에 또는 리포솜 담체 시스템 내에 포함될 수 있다.
샘플
본원에 기재된 방법에서의 사용에 적합한 샘플은 대상체로부터의 핵산 샘플일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "핵산 샘플"은 RNA 또는 DNA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서는, "폴리펩티드 샘플" (예: 펩티드 또는 단백질, 또는 이로부터의 단편)을 사용하여, 유전적 변종의 결과인 아미노산 변화가 일어난 정보를 확인할 수 있다. 핵산 및 폴리펩티드는 혈액, 타액, 소변, 구강 내벽의 점막 스크레이핑, 거담제, 혈청, 눈물, 피부, 조직, 또는 모발을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 샘플로부터 추출될 수 있다. 핵산 샘플은 핵산 정보에 대해 검정될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산 정보"는, 핵산 서열 자체, 핵산 서열에서의 유전적 변형의 존재/부재, 핵산 서열에 따라 달라지는 물리적 특성 (예: Tm), 및 핵산의 양 (예: mRNA 카피의 수)을 포함한다. "핵산"은 DNA, RNA, 인공적 뉴클레오티드를 포함한 DNA, 또는 인공적 뉴클레오티드를 포함한 RNA 중 임의의 하나를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "정제된 핵산"은 cDNA, 게놈 핵산의 단편, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)을 사용하여 생성된 핵산, 게놈 핵산의 제한 효소 처리에 의해 형성된 핵산, 재조합 핵산, 및 화학적으로 합성된 핵산 분자를 포함한다. "재조합" 핵산 분자는 서열의 2개의 다른 방식으로 분리된 세그먼트의 인공적 조합에 의해, 예를 들어 화학적 합성에 의해 또는 유전적 조작 기술에 의한 핵산의 단리된 세그먼트의 조종에 의해 형성된 핵산 분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드"는, 천연 공급원으로부터 단리된 것이든, 재조합 기술에 의해 생성된 것이든, 화학적으로 합성된 것이든, 단백질, 단백질의 단편, 및 펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 하나 이상의 수정, 예컨대 번역-후 수정 (예: 글리코실화, 인산화 등) 또는 임의의 다른 수정 (예: 페길화(pegylation) 등)을 가질 수 있다. 폴리펩티드는 하나 이상의 비-천연-발생 아미노산 (예: 측쇄 수정을 갖는 아미노산 등)을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어 세포 라인을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 핵산이 얻어질 수 있는 예시적 세포 유형은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 혈액 세포, 예컨대 B 림프구, T 림프구, 백혈구, 적혈구, 대식세포, 또는 호중구; 근육 세포, 예컨대 골격 세포, 평활근 세포 또는 심근 세포; 생식 세포, 예컨대 정자 또는 난자; 상피 세포; 결합 조직 세포, 예컨대 지방세포, 연골세포; 섬유아세포 또는 골아세포; 뉴런; 성상세포; 간질 세포; 기관 특이적 세포, 예컨대 신장 세포, 췌장 세포, 간 세포, 또는 케라티노사이트; 줄기 세포; 또는 이로부터 발달하는 임의의 세포. 핵산이 얻어질 수 있는 세포는 혈액 세포 또는 하기를 포함하는 특정 유형의 혈액 세포: 예를 들어, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포로부터 유래되는 세포, 예컨대 적혈구, B 림프구, T 림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식세포, 또는 혈소판일 수 있다. 일반적으로, 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 또는 만능 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유형의 줄기 세포가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 샘플은 RNA 또는 DNA 단리에 대해 프로세싱될 수 있고, 예를 들어, 세포 또는 조직 샘플 내의 RNA 또는 DNA가 핵산 샘플의 다른 성분으로부터 분리될 수 있다. 세포는, 표준 기술을 사용하여, 예를 들어, 세포 샘플의 원심분리 및 예를 들어 완충 용액, 예를 들어 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 펠릿화된 세포의 재현탁에 의해, 핵산 샘플로부터 수확될 수 있다. 일부 구현예에서는, 세포 현탁액을 원심분리하여 세포 펠릿을 얻은 후, 세포를 용균시켜 DNA를 추출할 수 있다. 일부 구현예에서는, 핵산 샘플을 농축시키고/거나 정제하여 DNA를 단리할 수 있다. 임의의 부류의 추가의 프로세싱에 적용된 것들을 포함한, 대상체로부터 얻어진 모든 핵산 샘플이 대상체로부터 얻어진 것으로 고려된다. 일부 구현예에서는, 당업계에 공지된 표준 기술 및 키트를 사용하여 핵산 샘플로부터 RNA 또는 DNA를 추출할 수 있고, 이는 예를 들어 페놀 추출, QIAAMP® 조직 키트 (Qiagen, 미국 캘리포니아주 챗스워스), WIZARD® 게놈 DNA 정제 키트 (Promega), 또는 아카이빙(archiving)을 위한 잘 적합화된 고도로 안정적인 DNA의 정제를 가능하게 할 수 있는 Puregene 화학을 사용한 Qiagen Autopure 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 대립유전자의 동일성 결정 또는 카피 수의 결정은, 대상체로부터 RNA 및/또는 DNA를 포함하는 핵산 샘플을 얻고/거나 동일성, 카피 수, 하나 이상의 유전적 변형의 존재 또는 부재 및 핵산 샘플로부터 유래된 게놈 DNA (즉, 대상체의 게놈) 내의 이들의 염색체 위치를 평가하는 것을 포함할 수 있으나 이것이 반드시 필요한 것은 아니다.
결정을 수행하는 개인 또는 조직이 실제로 대상체로부터의 핵산 샘플의 물리적 분석을 수행할 필요는 없다. 일부 구현예에서, 방법은 제3자에 의해 핵산 샘플의 분석에 의해 얻어진 정보를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 하나 초과의 장소에서 수행되는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 샘플을 제1 장소, 예컨대 의료 제공 기관에서 또는 자가-시험 키트의 경우에는 대상체의 가정에서 대상체로부터 얻을 수 있다. 핵산 샘플을 동일한 또는 제2 장소에서, 예를 들어, 실험실 또는 다른 시험 시설에서 분석할 수 있다.
핵산
본원에 기재된 핵산 및 폴리펩티드가 본 개시내용의 방법 및 키트에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서는, 본원에 기재된 핵산 및 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 앱타머가 본 개시내용의 방법 및 키트에서 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산은, 단일형이든 중합체이든, 자연 발생이든 비-자연 발생이든, 이중-가닥이든 단일-가닥이든, 코딩, 예를 들어 번역 유전자이든 비-코딩, 예를 들어 조절 영역이든, 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보뉴클레오티드 (RNA), 또는 이들의 임의의 단편, 유도체, 모방체 또는 상보물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 서열, 게놈 서열, 상보적 DNA (cDNA), 안티센스 핵산, DNA 영역, 프로브, 프라이머, 유전자, 조절 영역, 인트론, 엑손, 개방-판독 프레임, 결합 자리, 표적 핵산 및 대립유전자-특이적 핵산을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로브"는, 핵산의 상보성에 기초한 하이브리드화 반응을 사용한 시험편에서의 핵산의 검사를 위한 핵산 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "하이브리드"는, DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA 등을 포함한, 상기 언급된 핵산 중 임의의 하나 사이에, 동일한 유형 내에, 또는 상이한 유형에 걸쳐 형성된 이중 가닥을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된" 핵산은, 통상적으로 (게놈 서열에서와 같이) 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 핵산으로부터 분리되고/거나 (예를 들어 RNA 라이브러리에서와 같이) 다른 전사된 서열로부터 완전히 또는 부분적으로 정제된 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 단리된 핵산은, 그것이 자연 발생된 복잡한 세포 환경, 또는 재조합 기술에 의해 생성시 배양 배지, 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질에 대하여 실질적으로 단리될 수 있다. 일부 예에서, 단리된 물질은 조성물, 예를 들어, 다른 물질, 완충 시스템 또는 시약 혼합물을 함유하는 미정제(crude) 추출물의 부분을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 물질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 또는 컬럼 크로마토그래피 (예: HPLC)에 의해 필수적 균질성으로 정제될 수 있다. 게놈 DNA (gDNA)에 대하여, 용어 "단리된"은 또한, 게놈 DNA가 자연적으로 회합되는 염색체로부터 분리된 핵산을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 단리된 핵산 분자는, 핵산 분자가 유래되는 세포의 gDNA에서 핵산 분자를 플랭킹하는 약 250 kb, 200 kb, 150 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 25 kb, 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
핵산은 다른 코딩 또는 조절 서열에 융합될 수 있고, 이는 단리된 것으로 고려될 수 있다. 예를 들어, 벡터 내에 함유된 재조합 DNA는 본원에서 사용되는 바와 같은 "단리된"의 정의 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산은 비상동 숙주 세포 또는 비상동 유기체 내의 재조합 DNA 분자, 뿐만 아니라 용액 중의 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 DNA 분자를 포함할 수 있다. 단리된 핵산은 또한 본 개시내용의 DNA 분자의 생체내 및 시험관내 RNA 전사물을 포함한다. 단리된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 또는 재조합 수단에 의해 합성될 수 있다. 이러한 단리된 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 인코딩된 폴리펩티드의 제조에서, 상동 서열 (예: 다른 포유류 종으로부터의 것)의 단리를 위해, 유전자 맵핑 (예: 염색체와의 계내 하이브리드화에 의한 것)을 위해, 또는 노던 블롯 분석 또는 본원에 개시된 다른 하이브리드화 기술 등에 의해, 조직 (예: 인간 조직) 내의 유전자의 발현 검출을 위해 유용할 수 있다. 본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대하여, 선택적 하이브리드화에 대한 것과 같은 고 엄격성 하이브리드화 조건 하에 하이브리드화되는 핵산 서열에 관한 것이다. 이러한 핵산 서열은 대립유전자- 또는 서열-특이적 하이브리드화 (예: 고 엄격성 조건 하)에 의해 검출 및/또는 단리될 수 있다. 핵산 하이브리드화에 대한 엄격성 조건 및 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. 등, John Wiley & Sons, (1998), 및 Kraus, M. 및 Aaronson, S., Methods Enzymol., 200:546-556 (1991) 참조, 이들의 전체 교시내용은 본원에 참조로 포함됨).
둘 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 "동일성" 또는 "퍼센트 동일성"의 계산은, 최적 비교를 위해 서열을 정렬시킴으로써 결정될 수 있다 (예를 들어, 제1 서열의 서열 내에 갭이 도입될 수 있음). 이어서, 상응하는 위치의 뉴클레오티드를 비교하고, 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 예를 들어, 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은, 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
일부 구현예에서, 비교 목적을 위해 정렬되는 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이다. 두 서열의 실제 비교는 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 수학적 알고리즘의 비-제한적 예는 Karlin, S. 및 Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90- 5873-5877 (1993)에 기재되어 있다. 이러한 알고리즘은 Altschul, S. 등, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)에 기재된 바와 같이 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된다. BLAST 및 갭트(Gapped) BLAST 프로그램 활용시, 각각의 프로그램 (예: NBLAST)의 임의의 관련 파라미터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교에 대한 파라미터는 스코어= 100, 워드 길이= 12로 셋팅될 수 있거나, 또는 달라질 수 있다 (예: W=5 또는 W=20). 다른 예는 마이어 앤 밀러(Myers and Miller)의 알고리즘, CABIOS (1989), ADVANCE, ADAM, BLAT, 및 FASTA를 포함한다. 일부 구현예에서, 두 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은, 예를 들어, GCG 소프트웨어 패키지 (Accelrys, 영국 캠브릿지) 내의 GAP 프로그램을 사용하여 달성될 수 있다.
"프로브" 또는 "프라이머"는 염기-특이적 방식으로 핵산 분자의 상보적 가닥에 대해 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 프로브는, 표적 서열의 증폭을 위한 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 및 리가제 사슬 반응 (LCR)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법을 사용한 템플레이트-지향 DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있는 프라이머를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드는 핵산 서열의 세그먼트 또는 단편, 또는 그의 상보물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 세그먼트는 5 내지 10,000개 연속 염기일 수 있고, 5, 10, 12, 15, 20, 또는 25개 뉴클레오티드 내지 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 또는 10,000개 뉴클레오티드의 범위일 수 있다. DNA 및 RNA에 추가로, 프로브 및 프라이머는 Nielsen, P. 등, Science 254: 1497-1500 (1991)에 기재된 바와 같이 폴리펩티드 핵산 (PNA)을 포함할 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 핵산 분자의 적어도 약 15, 전형적으로 약 20-25, 또한 특정 구현예에서 약 40, 50, 60 또는 75개의 연속 뉴클레오티드에 대해 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열의 영역을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한, 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지거는 핵산에 대하여 선택적으로 하이브리드화될 수 있는 단편 또는 부분을 함유하며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 유전적 변형물에 함유된 적어도 하나의 다형성(polymorphism) 또는 다형성 대립유전자 또는 동일한 위치에 위치하는 야생형 뉴클레오티드, 또는 그의 상보물을 포함할 수 있는 것인, 단리된 핵산, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머를 제공한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 연속 뉴클레오티드 서열 또는 연속 뉴클레오티드 서열의 상보물과 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 또는 적어도 95% 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 프로브는, 본원에 기재된 유전적 변형을 함유하는 병태 (예: LHON)와 관련된 유전자의 상보적 영역과 하이브리드화될 수 있는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 개시내용의 핵산 단편은 본원에 기재된 것들과 같은 검정에서 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다.
상기에 기재된 것들과 같은 본 개시내용의 핵산은 당업자에게 널리 공지된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 동정 및 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA는 증폭될 수 있고/거나 라벨링 (예: 방사선라벨링, 형광 라벨링)되고 스크리닝을 위한 프로브로서 사용될 수 있고, 이는 예를 들어 유기체로부터 유래된 cDNA 라이브러리이다. cDNA는 mRNA로부터 유래될 수 있고 적합한 벡터 내에 함유될 수 있다. 예를 들어, 상응하는 클론은 생체내 절제에 따라 얻어진 단리된 DNA일 수 있고, 클로닝된 삽입물을 업계-인식 방법에 의해 한쪽 또는 양쪽 배향으로 시퀀싱하여 적절한 분자량의 폴리펩티드를 인코딩하는 정확한 판독 프레임을 동정할 수 있다. 이들 또는 유사한 방법을 사용하여, 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 단리하고, 시퀀싱하고 추가로 특성화할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 다형성, 변형, 또는 돌연변이, 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 단일 뉴클레오티드 변형 (SNV), 카피 수 변형 (CNV), 예를 들어, 삽입, 결실, 반전, 및 전좌를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 유사체, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄메틸 포스포네이트, 2-0-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 변형된 핵산, 예를 들어, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 탄수화물, 지질, 폴리펩티드 또는 다른 물질과 조합된 핵산, 또는 펩티드 핵산 (PNA), 예를 들어, 크로마틴, 리보솜, 및 트랜스크립토솜(transcriptosome)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 핵산은 다양한 구조의 핵산, 예를 들어, A DNA, B DNA, Z형 DNA, siRNA, tRNA, 및 리보자임을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은, 예를 들어, 참조 서열에 비해 하나 이상의 서열 차이, 예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환을 갖는, 자연적으로 또는 비-자연적으로 다형성일 수 있다. 일부 구현예에서, 참조 서열은 공개적으로 이용가능한 정보, 예를 들어, U.C. 산타 크루즈 인간 게놈 브라우저 게이트웨이 (genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) 또는 NCBI 웹사이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에 기초할 수 있다. 일부 구현예에서, 참조 서열은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 참조 핵산의 시퀀싱에 의해, 본 개시내용의 실무자에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 프로브는 본원에 기재된 바와 같은 대립유전자, SNP, SNV, 또는 CNV에 대해 하이브리드화될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로브는 본원에 기재된 바와 같은 LHON과 관련된 또 다른 마커 서열에 결합할 수 있다.
당업자는, 특정 대립유전자가 시험 핵산 샘플로부터의 게놈 서열에 존재하는 경우에만 서열 특이적 하이브리드화가 일어날 수 있도록 프로브를 디자인하는 방법을 알 것이다. 본 개시내용은 또한, 특정 유전적 변형을 유전형 분석하기 위한 상업적으로 이용가능한 기술 및 방법을 포함한 임의의 편리한 유전형 분석 방법을 사용하여 실행하도록 축소될 수 있다.
또한 대조군 프로브, 예를 들어, 보다 덜 가변적인 서열, 예를 들어, 염색체의 동원체와 관련된 반복 DNA에 결합하는 프로브가 사용될 수 있고, 이는 대조군으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로브는 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, 프로브는, 예를 들어, 화학적으로 또는 시험관내에서 합성될 수 있거나, 표준 기술을 통해 염색체 또는 게놈 DNA로부터 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 사용될 수 있는 DNA의 공급원은 게놈 DNA, 클로닝된 DNA 서열, 숙주의 정상적 염색체 상보물과 함께 인간 염색체 중 하나 또는 하나의 일부를 함유하는 체세포 하이브리드, 및 유동 세포계측법 또는 현미해부에 의해 정제된 염색체를 포함한다. 관심 영역이 클로닝을 통해, 또는 PCR을 사용한 자리-특이적 증폭에 의해 단리될 수 있다.
하나 이상의 핵산, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머는 또한, 예를 들어 직접 라벨링에 의해, 검출가능한 라벨을 포함하도록 라벨링될 수 있다. 검출가능 라벨은 물리적, 화학적, 또는 생물학적 방법에 의해 검출이 가능한 임의의 라벨, 예를 들어 방사성 라벨, 예컨대 32P 또는 3H, 형광 라벨, 예컨대 FITC, 발색단 라벨, 친화성-리간드 라벨, 효소 라벨, 예컨대 알칼리 포스파타제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 또는 I2 갈락토시다제, 효소 공동인자 라벨, 햅텐 컨쥬게이트 라벨, 예컨대 디곡시게닌 또는 디니트로페닐, 라만 신호 생성 라벨, 자성 라벨, 스핀 라벨, 에피토프 라벨, 예컨대 FLAG 또는 HA 에피토프, 발광성 라벨, 중원자 라벨, 나노입자 라벨, 전기화학적 라벨, 광 산란 라벨, 구형 쉘 라벨, 반도체 나노결정 라벨, 예컨대 양자점 (미국 특허 번호 6,207,392에 기재됨), 및 당업자에게 공지된 임의의 다른 신호 생성 라벨로 라벨링된 프로브를 포함할 수 있으며, 여기서 라벨은 프로브가 2차 검출 분자와 함께 또는 이것 없이 가시화될 수 있게 할 수 있다. 뉴클레오티드는 표준 기술, 예를 들어, 닉 번역, 랜덤 프라이밍, 및 PCR 라벨링에 의해 프로브 내로 직접 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "신호"는, 형광, 방사능, 화학발광 등을 포함한 적절한 수단에 의해 적합하게 검출가능 및 측정가능한 신호를 포함한다.
검출에 유용한 라벨 모이어티의 비-제한적 예는, 적합한 효소, 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제; 예를 들어, 토끼 IgG 및 항-토끼 IgG를 포함한 항원/항체 복합체, 스트렙타비딘/비오틴 또는 아비딘/비오틴 등의 복합체를 형성할 수 있는 결합 쌍의 구성원; 형광단, 예컨대 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 테트라메틸 로다민, 에오신, 녹색 형광 단백질, 에리트로신, 쿠마린, 메틸 쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스캐이드 블루, 텍사스 레드, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 피코에리트린, 유로퓸 및 테르븀을 포함한 것들과 같은 형광 란타나이드 복합체, 시아닌 염료 패밀리 구성원, 예컨대 Cy3 및 Cy5, 분자 비콘 및 그의 형광 유도체, 뿐만 아니라, 예를 들어, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz (Editor), Plenum Pub Corp, 2nd edition (July 1999) and the 6th Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P. Hoagland에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 다른 것들; 루미놀 등의 발광성 물질; 광 산란 또는 플라스몬 공명 물질, 예컨대 금 또는 은 입자 또는 양자점; 또는 14C, 123I, 124I, 125I, Tc99m, 32P, 33P, 35S 또는 3H를 포함한 방사성 물질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 라벨, 예를 들어, 백본 라벨이 또한 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다. 백본 라벨은 서열 독립적 방식으로 핵산에 결합하는 핵산 염색을 포함한다. 비-제한적 예는 개재 염료, 예컨대 페난트리딘 및 아크리딘 (예: 에티듐 브로마이드, 프로피듐 아이오다이드, 헥시듐 아이오다이드, 디히드로에티듐, 에티듐 호모다이머-1 및 -2, 에티듐 모노아지드, 및 ACMA); 일부 작은 홈 결합제, 예컨대 인돌 및 이미다졸 (예: Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 및 DAPI); 및 기타 핵산 염색, 예컨대 아크리딘 오렌지 (또한 개재가 가능함), 7-AAD, 액티노마이신 D, LDS751, 및 히드록시스틸바미딘을 포함한다. 상기 언급된 모든 핵산 염색은 Molecular Probes, Inc. 등의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 핵산 염색의 또한 다른 예는 Molecular Probes로부터의 하기 염료를 포함한다: 시아닌 염료, 예컨대 SYTOX 블루, SYTOX 그린, SYTOX 오렌지, POPO-1, POPO-3, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, JOJO-1, LOLO-1, BOBO-1, BOBO-3, PO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-1, BO-PRO-3, TO-PRO-1, TO-PRO-3, TO-PRO-5, JO-PRO-1, LO-PRO-1, YO-PRO-1, YO-PRO-3, 피코그린(PicoGreen), 올리그린(OliGreen), 리보그린(RiboGreen), SYBR 골드, SYBR 그린 I, SYBR 그린 II, SYBR DX, SYTO-40, -41, -42, -43, -44, -45 (청색), SYTO-13, -16, -24, -21, -23, -12, -11, -20, -22, -15, -14, -25 (녹색), SYTO-81, -80, -82, -83, -84, -85 (오렌지색), SYTO-64, -17, -59, -61, -62, -60, -63 (적색).
일부 구현예에서, 상이한 색의 형광단이 선택될 수 있고, 이는, 예를 들어, 7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산 (AMCA), 5-(및-6)-카르복시-X-로다민, 리사민 로다민 B, 5-(및-6)-카르복시플루오레세인, 플루오레세인-5-이소티오시아네이트 (FITC), 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복실산, 테트라메틸로다민-5-(및-6)-이소티오시아네이트, 5-(및-6)-카르복시테트라메틸로다민, 7-히드록시쿠마린-3-카르복실산, 6-[플루오레세인 5-(및-6)-카르복사미도]헥산산, N-(4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a 디아자-3-인다센프로피온산, 에오신-5-이소티오시아네이트, 에리트로신-5- 이소티오시아네이트, TRITC, 로다민, 테트라메틸로다민, R-피코에리트린, Cy-3, Cy-5, Cy-7, 텍사스 레드, Phar-Red, 알로피코시아닌 (APC), 및 CASCADETM 블루 아세틸아지드이고, 이에 따라 세트 내에 있거나 세트 내에 있지 않은 각각의 프로브가 뚜렷하게 시각화될 수 있다. 일부 구현예에서, 형광 라벨링된 프로브는 형광 현미경 및 각각의 형광단에 대한 적절한 필터로, 또는 다수의 형광단을 관찰하기 위한 이중 또는 삼중 대역-통과 필터 세트에 의해 볼 수 있다. 일부 구현예에서는, 유동 세포계측법 등의 기술을 사용하여 프로브의 하이브리드화 패턴을 검사할 수 있다.
다른 구현예에서, 프로브는 간접적으로, 예를 들어 비오틴 또는 디곡시게닌으로 라벨링되거나, 32P 및/또는 3H 등의 방사성 동위원소로 라벨링될 수 있다. 비-제한적 예로서, 비오틴으로 간접적으로 라벨링된 프로브는 검출가능 마커에 컨쥬게이션된 아비딘에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 아비딘은 알칼리 포스파타제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제 등의 효소 마커에 컨쥬게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 효소 마커는 효소에 대한 기질 및/또는 촉매를 사용하여 비색 반응을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 알칼리 포스파타제에 대한 촉매가 사용될 수 있고, 이는 예를 들어 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 및 니트로 블루 테트라졸륨이다. 일부 구현예에서, 호스래디쉬 퍼옥시다제에 대한 촉매, 예를 들어, 디아미노벤조에이트가 사용될 수 있다.
제제, 투여 경로, 및 유효 용량
본 개시내용의 또한 또 다른 양태는 본 개시내용의 작용제 또는 작용제의 조합을 포함하는 약제학적 조성물에 대한 제제, 투여 경로 및 유효 용량에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물을 사용하여 상기에 기재된 바와 같은 병태 (예: LHON)를 치료할 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 경구 (협측 및 설하 포함), 직장, 비강, 국소, 경피 패치, 폐, 질, 좌제, 또는 비경구 (안내, 유리체내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피내, 복강내, 피하 및 정맥내) 투여에 적합한 것들을 포함한 또는 에어로졸화, 흡입 또는 취입에 의한 투여에 적합한 형태의 약제학적 제제로서 투여될 수 있다. 약물 전달 시스템에 대한 일반적 정보는 Ansel 등, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999)에서 찾아볼 수 있다.
다양한 구현예에서, 약제학적 조성물은 담체 및 부형제 (완충제, 탄수화물, 만니톨, 폴리펩티드, 아미노산, 산화방지제, 정균제, 킬레이팅제, 현탁제, 증점제 및/또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 물, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함한 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등, 식염수, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액, 착향제, 착색제, 점착제거제 및 다른 허용가능한 첨가제, 아주반트, 또는 결합제, 생리적 조건에 근접하기 위한 다른 약제학적으로 허용가능한 보조제 성분, 예컨대 pH 완충제, 긴장성 조정제, 유화제, 습윤제 등을 포함한다. 부형제의 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지 우유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조제물은 보존제를 실질적으로 갖지 않는다. 다른 구현예에서, 약제학적 조제물은 적어도 하나의 보존제를 함유할 수 있다. 제약 투여 형태에 대한 일반적 방법론은 Ansel 등, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott, Williams, & Wilkins, Baltimore Md. (1999)에 나타나 있다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체를 사용하여 본 개시내용의 조성물을 투여할 수 있지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.
화합물은 또한 널리 공지된 기술을 사용하여 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다. 생분해성 마이크로스피어가 또한 본 개시내용의 약제학적 조성물에 대한 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로스피어는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,897,268, 5,075,109, 5,928,647, 5,811,128, 5,820,883, 5,853,763, 5,814,344 및 5,942,252에 개시되어 있다.
상기 화합물은 리포솜 또는 마이크로스피어 (또는 마이크로입자)로 투여될 수 있다. 대상체에 대한 투여를 위한 리포솜 및 마이크로스피어의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 4,789,734는, 리포솜 내의 생물학적 물질의 캡슐화 방법을 기재한다. 필수적으로, 물질을 수용액 중에 용해시키고, 적절한 인지질 및 지질을, 또한 필요한 경우 계면활성제와 함께 첨가하고, 물질을 필요에 따라 투석 또는 음파처리한다. 공지된 방법의 검토는 G. Gregoriadis, Chapter 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 2.sup.87-341 (Academic Press, 1979)에 의해 제공된다.
중합체 또는 폴리펩티드로 형성된 마이크로스피어가 당업자에게 널리 공지되어 있고, 위장관을 통해 직접 혈류로의 통과에 대해 맞춤화될 수 있다. 대안적으로, 화합물은 혼입될 수 있고, 마이크로스피어, 또는 마이크로스피어의 복합체는 수일 내지 수개월의 시간 기간에 걸친 느린 방출을 위해 임플란팅될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,906,474, 4,925,673 및 3,625,214, 및 Jein, TIPS 19:155-157 (1998)을 참조하며, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
약물의 농도는 조정될 수 있고, 용액의 pH는 완충될 수 있고, 등장성은 안내 또는 유리체내 주사와 상용성이 되도록 조정될 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 적합한 비히클 중에서 멸균 용액 또는 현탁액으로서 제제화될 수 있다. 약제학적 조성물은 종래의 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그 자체로의 사용을 위해 패키징되거나, 동결건조될 수 있고, 동결건조된 조제물은 투여 전에 멸균 용액과 조합된다. 적합한 제제 및 추가의 담체는 Remington "The Science and Practice of Pharmacy" (20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD)에 기재되어 있고, 그의 교시 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
작용제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 작용제와 또는 하나 이상의 다른 형태와 조합되어 제공될 수 있다. 예를 들어, 제제는 하나 이상의 작용제를, 각각의 작용제의 상대적 효력 및 의도된 지시에 따라, 특정 비율로 포함할 수 있다. 예를 들어, 2개의 상이한 숙주 표적을 표적화하기 위한 조성물에서, 또한 효력이 유사한 경우, 약 1:1 비율의 작용제가 사용될 수 있다. 두 형태가 동일한 투여량 단위, 예를 들어 하나의 크림, 좌제, 정제, 캡슐, 에어로졸 스프레이, 또는 음료 중에 용해시킬 분말의 패킷 내에서 함께 제제화될 수 있거나; 또는 각각의 형태가 별도의 단위, 예를 들어 2개의 크림, 2개의 좌제, 2개의 정제, 2개의 캡슐, 정제 및 정제 용해를 위한 액체, 2개의 에어로졸 스프레이, 또는 분말 및 분말 용해를 위한 액체의 패킷 내에서 제제화될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 개시내용에서 사용되는 작용제의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 것이 아닌 염을 의미한다.
전형적인 염은, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등과 같은 무기 이온의 것들이다. 이러한 염은 염산, 브로민화수소산, 인산, 질산, 황산, 메탄술폰산, p 톨루엔술폰산, 아세트산, 푸마르산, 숙신산, 락트산, 만델산, 말산, 시트르산, 타르타르산 또는 말레산 등의 무기 또는 유기 산과의 염을 포함한다. 추가로, 작용제(들)가 카르복실 기 또는 다른 산성 기를 함유하는 경우, 이는 무기 또는 유기 염기와의 약제학적으로 허용가능한 부가 염으로 전환될 수 있다. 적합한 염기의 예는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 시클로헥실아민, 디시클로헥실-아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 등을 포함한다.
약제학적으로 허용가능한 에스테르 또는 아미드는 본 개시내용에서 사용되는 작용제의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 것이 아닌 것들을 지칭한다. 전형적인 에스테르는 에틸, 메틸, 이소부틸, 에틸렌 글리콜 등을 포함한다. 전형적인 아미드는 비치환된 아미드, 알킬 아미드, 디알킬 아미드 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 작용제는, 예를 들어 상기에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 다른 화합물, 형태, 및/또는 작용제와 조합하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 활성제를 갖는 약제학적 조성물은 특정 몰비를 포함하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 약 99:1 내지 약 1:99의 제1 활성제 대 다른 활성제의 몰비가 사용될 수 있다. 구현예의 일부 서브세트에서, 제1 활성제: 다른 활성제의 몰비의 범위는 약 80:20 내지 약 20:80; 약 75:25 내지 약 25:75, 약 70:30 내지 약 30:70, 약 66:33 내지 약 33:66, 약 60:40 내지 약 40:60; 약 50:50; 및 약 90:10 내지 약 10:90으로부터 선택된다. 제1 활성제: 다른 활성제의 몰비는 약 1:9일 수 있고, 일부 구현예에서 약 1:1일 수 있다. 두 작용제, 형태 및/또는 화합물이 동일한 투여량 단위, 예를 들어 하나의 크림, 좌제, 정제, 캡슐, 또는 음료 중에 용해시킬 분말의 패킷 내에서 함께 제제화될 수 있거나; 또는 각각의 작용제, 형태 및/또는 화합물이 별도의 단위, 예를 들어 2개의 크림, 좌제, 정제, 2개의 캡슐, 정제 및 정제 용해를 위한 액체, 에어로졸 스프레이, 또는 분말 및 분말 용해를 위한 액체의 패킷 내에서 제제화될 수 있다.
필요시 또는 바람직한 경우, 작용제 및/또는 작용제의 조합을 또한 다른 작용제와 투여할 수 있다. 본 개시내용의 작용제 및/또는 작용제의 조합과 공동-투여될 수 있는 작용제의 선택은, 적어도 부분적으로, 치료되는 병태에 따라 달라질 수 있다.
작용제(들) (또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 아미드)는 그 자체로 또는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있고, 여기서 활성제(들)는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와의 혼합체 또는 혼합물로 존재한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 약제학적 조성물은 대상체에 대한 투여를 위해 제조된 임의의 조성물일 수 있다. 본 개시내용에 따른 사용을 위한 약제학적 조성물은, 예를 들어 투여될 수 있는 조제물로의 활성제의 프로세싱을 용이하게 하는 부형제, 희석제, 및/또는 보조제를 포함하는, 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체를 사용하여 종래의 방식으로 제제화될 수 있다. 적당한 제제는 적어도 부분적으로 선택된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 본 개시내용에서 유용한 작용제(들), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 아미드는, 흡입에 의한 것 뿐만 아니라 경구, 협측, 국소, 직장, 경피, 경점막, 피하, 정맥내, 안내, 유리체내, 및 근육내 적용을 포함한 많은 투여 경로 또는 방식을 사용하여 대상체에게 전달될 수 있다.
일부 구현예에서는, 예를 들어, 큰 친유성 모이어티의 존재로 인해, 작용제를 용액으로 만들기 위해 오일 또는 비-수성 용매 오일 또는 비-수성 용매가 사용될 수 있다. 대안적으로, 에멀젼, 현탁액, 또는 다른 조제물, 예를 들어 리포솜 조제물이 사용될 수 있다. 리포솜 조제물과 관련하여, 병태 치료를 위한 리포솜의 제조를 위한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 Bangham 등, J. Mol. Biol. 23: 238-252 (1965) 및 Szoka 등, Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 4194-4198 (1978)을 참조한다. 특정 작용 자리로 이들 조성물을 지향시키기 위해 리포솜에 리간드가 부착될 수 있다. 본 개시내용의 작용제는 또한 특정 대상체 집단에서의 가용화, 투여, 및/또는 순응을 용이하게 하기 위해 식품, 예를 들어 크림 치즈, 버터, 샐러드 드레싱, 또는 아이스크림으로 통합될 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 비경구 투여 (예: 주사, 예를 들어, 안내 또는 유리체내 주사에 의한)를 위해 제제화될 수 있고, 앰풀, 예비-충전 시린지, 작은 부피의 주입물 내에서 또는 첨가된 보존제와 함께 다용량 용기 내에서 단위 용량으로 존재할 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액, 또는 유성 또는 수성 비히클 내의 에멀젼, 예를 들어, 수성 폴리에틸렌 글리콜 중의 용액 등의 형태를 가질 수 있다.
주사가능 제제의 경우, 비히클은 수용액 또는 유성 현탁액, 또는 에멀젼과, 참깨유, 옥수수유, 면실유, 또는 땅콩유, 뿐만 아니라 엘릭시르, 만니톨, 덱스트로스, 또는 멸균 수용액, 및 유사한 제약 비히클을 포함한, 적합한 것으로 당업계에 공지된 것들로부터 선택될 수 있다. 제제는 또한, 폴리(락틱-코-글리콜)산 등의 생체적합성, 생분해성인 중합체 조성물을 포함할 수 있다. 이들 물질은 약물이 로딩된, 또한 우수한 지속 방출 성능을 제공하기 위해 추가로 코팅되거나 유도체화된 마이크로 또는 나노스피어로 제조될 수 있다. 안구주위 또는 안내 주사에 적합한 비히클은, 예를 들어, 주사 등급 물, 리포솜 및 친유성 물질에 적합한 비히클 중의 치료제의 현탁액을 포함한다. 안구주위 또는 안내 주사를 위한 다른 비히클은 당업계에 널리 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 인간에 대한 정맥내 투여를 위해 적합화된 약제학적 조성물로서 일상적 절차에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 통증 완화를 위해 국소 마취제, 예컨대 리도카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은, 예를 들어 활성제의 양을 지시하는 앰풀 또는 사쉐 등의 기밀 밀봉된 용기 내의 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서, 단위 투여 형태 중에서 함께 혼합되어 또는 별도로 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 이는 멸균 제약 등급 물 또는 식염수를 함유하는 주입병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀이 제공될 수 있다.
투여가 주사에 의해 수행되는 경우, 활성 화합물은 수용액 중에서, 구체적으로 생리적으로 상용성인 완충제, 예컨대 행크스(Hanks) 용액, 링거액, 또는 생리 식염 완충제 중에서 제제화될 수 있다. 용액은 제제 작용제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 화합물은, 사용 전에, 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 무발열원 물과의 구성을 위한 분말 형태로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 아주반트 또는 펩티드에 의해 자극되는 면역 반응 향상을 위해 첨가되는 임의의 다른 물질을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 펩티드에 대한 면역 반응을 억제하는 물질을 포함한다. 제제화 방법은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Co., Easton P에 개시된 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 눈 장애는 본 개시내용의 작용제 또는 작용제의 조합을 포함하는 안과용 용액, 현탁액, 연고 또는 삽입물로 효과적으로 치료될 수 있다. 점안액은 멸균 수용액, 예컨대 생리 식염수, 완충액 중에 활성 성분을 용해시킴으로써, 또는 사용 전에 용해되도록 분말 조성물을 조합함으로써 제조될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같은 다른 비히클이 선택될 수 있고, 이는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 밸런스 염 용액, 식염수, 수용성 폴리에테르, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐, 예컨대 폴리비닐 알콜 및 포비돈, 셀룰로스 유도체, 예컨대 메틸셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 석유 유도체, 예컨대 미네랄 오일 및 백색 바셀린, 동물 지방, 예컨대 라놀린, 아크릴산의 중합체, 예컨대 카르복시폴리메틸렌 겔, 식물 지방, 예컨대 땅콩유 및 폴리사카라이드, 예컨대 덱스트란, 및 글리코사미노글리칸, 예컨대 나트륨 히알루로네이트. 요망되는 경우, 점안액에서 통상적으로 사용되는 첨가제가 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제는 등장화제 (예: 염화나트륨 등), 완충제 (예: 붕산, 나트륨 일수소 인산염, 나트륨 이수소 인산염 등), 보존제 (예: 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로부탄올 등), 증점제 (예: 사카라이드, 예컨대 락토스, 만니톨, 말토스 등; 예: 히알루론산 또는 그의 염, 예컨대 나트륨 히알루로네이트, 칼륨 히알루로네이트 등; 예: 무코폴리사카라이드, 예컨대 콘드로이틴 술페이트 등; 예: 나트륨 폴리아크릴레이트, 카르복시비닐 중합체, 가교 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 히드록시 프로필 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시 프로필 셀룰로스 또는 당업자에게 공지된 다른 작용제)를 포함한다.
본 발명의 조성물의 성분의 용해도는 조성물 중의 계면활성제 또는 다른 적절한 공용매에 의해 향상될 수 있다. 이러한 공용매는 폴리소르베이트 20, 60, 및 80, 플루로닉(Pluronic) F68, F-84 및 P-103, 시클로덱스트린, 또는 당업자에게 공지된 다른 제제를 포함한다. 이러한 공용매는 약 0.01 중량% 내지 2 중량%의 수준으로 사용될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 다용량 형태로 패키징될 수 있다. 사용 동안 미생물 오염을 막기 위해 보존제가 바람직할 수 있다. 적합한 보존제는 하기를 포함한다: 벤즈알코늄 클로라이드, 티메로살, 클로로부탄올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 페닐에틸 알콜, 에데테이트 이나트륨, 소르브산, Onamer M, 또는 당업자에게 공지된 다른 작용제. 선행 기술 안과용 생성물에서, 이러한 보존제는 0.004% 내지 0.02%의 수준으로 사용될 수 있다. 본 출원의 조성물에서, 보존제, 바람직하게는 벤즈알코늄 클로라이드는, 0.001% 내지 0.01% 미만, 예를 들어 0.001% 내지 0.008%, 바람직하게는 약 0.005 중량%의 수준으로 사용될 수 있다. 본 개시내용의 조성물을 미생물 공격으로부터 보존하기 위해 0.005%의 벤즈알코늄 클로라이드 농도가 충분할 수 있음이 확인되었다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제는 현탁액보다는 가용성 형태로 전달되고, 이는 작용 부위로의 보다 빠르고 정량적인 흡수를 가능하게 한다. 일반적으로, 젤리, 크림, 로션, 좌제 및 연고 등의 제제는 본 개시내용의 작용제로의 보다 연장된 노출을 갖는 영역을 제공할 수 있으며, 용액 중의 제제, 예를 들어 스프레이는 보다 즉각적인 단기간 노출을 제공한다.
추가로, 본 개시내용의 화합물은 국소, 안내, 안구주위, 또는 전신 투여를 위한 삽입물 상의, 그 안의 또는 그에 부착된 지속 방출 제제에서의 사용을 위해 생체적합성 중합체에 탈착가능하게 부착될 수 있음이 고려된다. 생체적합성 중합체로부터의 제어 방출을 수용성 중합체와 함께 활용하여 점적가능(instillable) 제제를 형성할 수도 있다. 예를 들어, PLGA 마이크로스피어 또는 나노스피어 등의 생체적합성 중합체로부터의 제어 방출이 지연 방출 투여를 위한 안내 임플란테이션 또는 주사에 적합한 제제에서 활용될 수 있고, 또한 임의의 적합한 생분해성 및 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다.
실시예
하기 예시적 구현예는 본 발명을 추가로 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하도록 의도되며, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지는 않음을 이해하여야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 예를 들어 sambrook 등, molecular cloning: a laboratory manual (New York: cold spring harbor laboratory press, 1989)에 개시된 방법 및 조건 또는 제조업자에 의해 권고되는 조건이 하기 실시예에서 사용될 수 있다.
실시예 1 - ND4 플라스미드 및 바이러스 제조
1.1 플라스미드 제조
인간 ND4에 대한 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 6)을 미국 국립 생물공학 정보 센터(US National Center for Biotechnology Information) 참조 서열 yp_003024035.1에 기초하여 얻었다. 비-최적화된 미토콘드리아 표적화 서열 COX10에 대한 서열은 서열 번호: 1이다. 전사 효율 및 번역 효율을 향상시키기 위해 하기 서열에 대한 최적화된 서열: 미토콘드리아 표적화 서열 COX10 (opt_COX10, 서열 번호: 2) 및 인간 ND4의 코딩 서열 (opt_ND4, 서열 번호: 7)을 디자인하였다. 비-최적화된 COX10-ND4와 약 75.89% 상동성을 갖는 최적화된 COX10-ND4 서열에 3 프라임 비번역 영역 (즉, 3'UTR, 서열 번호: 13)을 후속시켜 재조합 핵산, opt_COX10-opt_ND4-3'UTR (서열 번호: 31에 나타냄)을 형성하였다.
합성된 재조합 핵산, opt_COX10-opt_ND4-3'UTR을 PCR 증폭에 의해 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터 내로 혼입하였다 (도 1). opt_COX10-opt_ND4-3'UTR을 EcoRI/SalI 제한 효소에 의해 절단하여 응집성 말단을 형성하고, 이어서 pSNaV 벡터와 같은 EcoRI/SalI 제한 자리를 갖는 AAV 벡터 내로 내포시켜 pSNaV/rAAV2/2-ND4 플라스미드 (즉, pAAV2-최적화된 ND4 플라스미드)를 생성하였다. pAAV2-opt_ND4 플라스미드를 비-최적화된 pAAV2-ND4 플라스미드와 비교하였다.
레콘(recon) 스크리닝 및 동정 단계는 CN102634527B와 유사하였다: 플라스미드를 37℃에서 LB 플레이트 내에서 배양하였다. 청색 콜로니 및 백색 콜로니가 나타났고, 여기서 백색 콜로니가 재조합 클론이었다. 백색 콜로니를 선택하고, 100 mg/L 앰피실린-함유 LB 배양 배지에 첨가하고, 37℃에서 200 rpm으로 8시간 동안 배양하고, 이어서 Biomiga 플라스미드 추출 프로토콜에 기초하여 배양된 박테리아 배지로부터 플라스미드를 추출하였다. EcoRI/SalI 제한 효소를 사용하여 플라스미드의 동정을 확인하였다.
1.2 세포 트랜스펙션
트랜스펙션 하루 전에, HEK293 세포를 225 cm2 세포 배양병에 접종하였다: 3.0 × 107개 세포/mL의 접종 밀도, 10% 소혈청을 갖는 둘베코 수정 이글 배지 (DMEM)의 배양 배지, 37℃에서, 5% CO2 인큐베이터 내에서, 밤새. 트랜스펙션 당일에 배양 배지를 10% 소혈청을 갖는 신선한 DMEM으로 교체하였다.
세포가 80-90%까지 성장한 후, 배양 배지를 폐기하고, PlasmidTrans (VGTC) 트랜스펙션 키트를 사용하여, 세포를 pAAV2-ND4 및 pAAV2-opt_ND4 플라스미드로 트랜스펙션시킨다. 상세한 트랜스펙션 프로토콜은 CN102634527B 실시예 1에 기재되어 있다. 세포를 트랜스펙션 후 48 h에 수집하였다.
1.3 재조합 아데노-관련 바이러스의 수집, 농축 및 정제
바이러스 수집: 1) 드라이 아이스 에탄올 배쓰 (또는 액체 질소) 및 37℃ 수조를 준비하고; 2) 배지와 함께 트랜스펙션된 세포를 15 ml 원심분리 튜브 내에서 수집하고; 3) 세포를 1000 rpm/min으로 3분 동안 원심분리하고; 세포 및 상청액을 분리하고; 상청액을 별도로 저장하고; 세포를 1 mL의 PBS 중에 재현탁시키고; 4) 세포 현탁액을 드라이 아이스-에탄올 배쓰와 37℃ 수조 사이에 반복적으로 전달하고, 각각 10분 동안 4회 동결 해동시키고, 각각의 해동 후 약하게 진탕시켰다.
바이러스 농축: 1) 세포 잔사를 10,000 g 원심분리로 제거하고; 원심분리 상청액을 새로운 원심분리 튜브로 전달하고; 2) 0.45 μm 필터로의 여과에 의해 불순물을 제거하고; 3) 각각 1/2 부피의 1M NaCl 및 10% PEG 8000 용액을 샘플 중에 첨가하고, 균일하게 혼합하고, 4℃에서 밤새 저장하고; 4) 2 h 동안 12,000 rpm 원심분리 후 상청액을 폐기하고; 바이러스 침전물을 적절한 양의 PBS 용액 중에 완전히 용해시킨 후, 샘플을 0.22 μm 필터로 멸균시키고; 5) 벤조나제 뉴클레아제를 첨가하여 잔류 플라스미드 DNA를 제거하였다 (50 U/ml의 최종 농도). 튜브를 수회 뒤집어 철저히 혼합하고, 이어서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고; 6) 샘플을 0.45 μm 여과 헤드로 여과하였고; 여액이 농축된 rAAV2 바이러스이다.
바이러스 정제 : 1) CsCl을 1.41 g/ml의 밀도까지 농축된 바이러스 용액에 첨가하고 (1.372의 굴절률); 2) 샘플을 원심분리 튜브 내에 첨가하고, 튜브를 예비-제조된 1.41 g/ml CsCl 용액으로 충전시키고; 3) 175,000 g로 24시간 동안 원심분리하여 밀도 구배를 형성하였다. 상이한 밀도의 샘플의 순차적 수집을 수행하였다. 풍부화된 rAAV2 입자를 수집하고; 4) 과정을 1회 더 반복하였다. 바이러스를 100 kDa 투석 백에 로딩하고, 4℃에서 밤새 투석/탈염하였다. 농축 및 정제된 재조합 아데노-관련 바이러스는 rAAV2-ND4 및 rAAV2-최적화된 ND4였다.
유사하게, 다른 미토콘드리아 표적화 서열 (MTS), 예컨대 OPA1 (서열 번호: 5)을 사용하여 상기 실시예에서의 COX10을 대체하고 재조합 플라스미드로 AAV를 생성할 수 있다.
실시예 2 - 토끼 눈에서의 rAAV2의 유리체내 주사
12마리의 토끼를 2개 그룹으로 분할하였다: rAAV2-ND4 및 rAAV2-최적화된 ND4. 바이러스 용액 (1 × 1010 vg/0.05 mL)을 편평부(pars plana)에서 각막 연부 3 mm 외부로부터 유리체강 내로 천공투입하였다. 유리체내 주사 후, 세극등 검사 및 안저부 사진 검사를 사용하여 눈을 검사하였다. 30일 동안 주사. 각각의 그룹에서 각각 RT-PCR 검출 및 면역블롯팅을 수행하였다.
실시예 3 - ND4의 발현에 대한 실시간 PCR
TRIZOL 총 RNA 추출 키트를 사용하여 트랜스펙션된 rAAV2-ND4 및 rAAV2-최적화된 ND4 토끼 시신경 세포로부터의 RNA를 추출하였다. cDNA 템플레이트를 추출된 RNA의 역전사에 의해 합성하였다.
NCBI 보존 구조 도메인 분석 소프트웨어를 사용하여 ND4의 보존적 구조를 분석하여, 디자인된 프라이머 증폭 단편이 비-보존 영역에 위치함을 확인하고; 이어서 프라이머를 형광 정량 PCR 프라이머 디자인 원리에 따라 디자인하였다:
β-액틴-S：CGAGATCGTGCGGGACAT (서열 번호: 85)；
β-액틴-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC (서열 번호: 86);
ND4-S：CTGCCTACGACAAACAGAC (서열 번호: 87);
ND4-A：AGTGCGTTCGTAGTTTGAG (서열 번호: 88);
형광 정량 PCR 반응 및 프로토콜: 형광 정량 PCR을 실시간 PCR 검출 시스템에서 측정하였다. 0.2 ml PCR 반응 튜브 내에서, SYBR 그린 믹스 12.5 μl, ddH2O 8 μl, 1 μl의 각각의 프라이머, 및 cDNA 샘플 2.5 μl를 25 μl의 전체 부피까지 첨가하였다. 각각의 샘플을 표적 유전자의 증폭 및 참조 유전자 β-액틴의 증폭을 위해 사용하고, 각각의 증폭을 3회 반복하였다. 공통의 시약을 함께 첨가하고, 이어서 별도로 분할하여 취급 변동을 최소화하였다. 형광 정량 PCR을 수행하였다: 95℃에서 1 초동안 예비-변성, 94℃에서 15 초동안 변성, 55℃에서 15 초동안 어닐링, 72℃에서 45 초동안 확장. 총 40 사이클의 증폭 반응을 수행하고, 형광 신호 획득을 각각의 사이클의 확장기에서 수행하였다. 반응 후, 94℃ 내지 55℃ 용융 곡선 분석을 수행하였다. 유전자 발현 수준의 상대적 정량 방법 연구를 채택하여 내부 기준 유전자로서 베타-액틴과의 차이를 사용하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, rAAV2-ND4 및 rAAV2-최적화된 ND4의 상대적 발현 수준 (mRNA 수준)은 각각 0.42 ± 0.23 및 0.57 ± 0.62였다 (p < 0.05, 도 2). 결과는 예상외로, 최적화된 ND4 (opt_ND4, 서열 번호: 7) 코딩 핵산 서열 및 상응하는 재조합 핵산 (opt_COX10-opt_ND4-3'UTR, 서열 번호: 31)이 놀랍게도 전사 효율을 증가시켜, rAAV2-최적화된 ND4의 발현을 약 36%만큼 증가시켰음을 보여준다. 결과는 rAAV2-최적화된 ND4의 전사 효율이 현저히 더 높음을 보여주었다.
실시예 4 - ND4 발현의 면역블롯팅 검출
ND4 단백질을 각각 rAAV2-최적화된 ND4 및 rAAV2-ND4에 의해 트랜스펙션된 토끼 신경 세포로부터 정제하였다. 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후, 면역 검출을 위해 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 (Bio-Rad, HER-hercules, 미국 캘리포니아주)으로 전달하였다. β-액틴을 내부 기준 유전자로서 사용하였다. 필름 스트립을 자동 이미지 분석 기기 (Li-Cor; 미국 네브래스카주 링컨)에서 관찰하고, 적분 정규화 방법으로 단백질 밴드의 적분된 광학 밀도를 사용하여 분석하여, 광학 밀도 값에 상응하는 동일한 샘플을 얻었다. 통계 분석 소프트웨어 SPSS 19.0을 데이터 분석에 사용하였다.
결과를 도 3에 나타내었다. rAAV2-최적화된 ND4 (좌측 흑색 컬럼) 및 rAAV2-ND4에 대한 ND4의 평균 상대적 단백질 발현 수준은 각각 0.32 ± 0.11 및 0.68 ± 0.20이었다 (p < 0.01, 도 3). 결과는 예상외로, 최적화된 ND4 코딩 핵산 서열 (opt_ND4, 서열 번호: 7) 및 상응하는 재조합 핵산 (opt_COX10-opt_ND4-3'UTR, 서열 번호: 31)이 놀랍게도 번역 효율을 증가시켜, rAAV2-최적화된 ND4의 발현을 약 112%만큼 증가시켰음을 보여준다. 결과는 rAAV2-최적화된 ND4의 전사 효율이 또한 현저히 더 높음을 보여주었다.
실시예 5 - 토끼 안내압 및 안저 사진
수술 후 1, 3, 7, 및 30일에 토끼의 2개 그룹 모두에 대하여 세극등 검사 및 안내압 측정을 수행하였다. 명백한 비정상, 결막 울혈, 분비, 또는 안구내염이 관찰되지 않았고, 안내압이 모든 토끼에서 상승되지 않았다.
안저부 사진 결과를 도 4에 나타내었다. 토끼의 시신경 및 망막 혈관에 대한 명백한 손상 또는 합병증이 없고, 이는 표준 유리체내 주사가 뚜렷한 염증 반응 또는 다른 합병증 없이 안전함을 나타낸다.
실시예 6 - 인간 임상 실험
2개 그룹의 환자를 시험하였다: 1) 대조군으로서, 2011년과 2012년 사이에, 9명의 환자가 단일 눈에 1 × 1010 vg/0.05 mL rAAV2-ND4의 유리체내 주사를 수용하였고; 2) 실험군으로서, 2017년과 2018년 1월 사이에, 20명의 환자가 단일 눈에 1 × 1010 vg/0.05 mL rAAV2-최적화된 ND4의 유리체내 주사를 수용하였다. 통계 분석 SPSS 19.0을 사용하여 임상 실험 결과를 분석하였다.
2개 그룹의 비교가 표 2에 나타나 있다. 가장 빠른 시각 개선 시간은 실험군에서 1개월이었고, 이는 3개월의 대조군보다 현저히 빨랐고 (p < 0.01); 실험군에 대한 시력의 최적 회복은 1.0이었고, 이는 0.8의 대조군보다 명백히 더 높았고 (p < 0.01); 실험군에서의 시력의 평균 회복은 0.582 ± 0.086이었고, 이는 0.344 ± 0.062의 대조군보다 명백히 더 높았다 (p < 0.01). 안저부 사진 결과를 도 5에 나타내었다. 실험군 및 대조군에서 환자의 시신경 및 망막 혈관에 대한 명백한 손상 또는 합병증이 없고, 이는 rAAV2-최적화된 ND4 및 rAAV2-ND4의 유리체내 주사의 안전성을 나타낸다.
표 2: LHON 유전자 요법에서 rAAV2-최적화된 ND4 및 rAAV2-ND4의 비교
실시예 7 - 미토콘드리아 표적화 서열로서의 OPA1
실시예 1-6에서의 재조합 핵산의 COX10 및 3'UTR 서열 (opt_COX10-opt_ND4-3'UTR, 서열 번호: 31)을 각각 또 다른 미토콘드리아 표적화 서열, OPA1 (서열 번호: 5) 및 또 다른 3'UTR 서열, 3'UTR* (서열 번호: 14)로 대체하여, 새로운 재조합 핵산, OPA1-opt_ND4-3'UTR* (서열 번호: 74)을 생성하였다.
실험 방법은 실시예 1-6과 동일하였고, 여기서는 재조합 핵산 opt_COX10-opt_ND4-3'UTR (서열 번호: 31)을 OPA1-opt_ND4-3'UTR* (서열 번호: 74)로 대체하였다. 최적화된 ND4 서열은, 비-최적화된 ND4 (COX10-ND4-3'UTR, 서열 번호: 15)와 비교시 현저히 개선된 전사 및 번역 효율, 발현 수준, 뿐만 아니라 LHON 치료에 있어 보다 높은 효능 및 안전성을 가짐이 확인되었다.
실시예 8 - 최적화된 ND4 서열 opt_ND4 *
핵산, opt_COX10*-opt_ND4*-3'UTR (서열 번호: 47)을 사용하여 실시예 1-6에서의 유사한 실험 방법을 수행하였다. 실시예 1에서와 유사한 절차를 따라, 형광 단백질, EGFP로 태깅된 바이러스를 rAAV2-ND4-EGFP 및 rAAV2-opt_ND4*-EGFP로서 제조하였다.
동결된 293T 세포를 소생시키고, 약 90%까지 T75 플라스크에서 성장시켰다. 세포를 침전시키고, DMEM 완전 배지 중에 5 × 104개 세포/mL의 세포 밀도로 재현탁시켰다. 세포를 재현탁시켰다. 약 100 μl의 세포 현탁액 (약 5000개 세포)을 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 배양하고 37℃ 및 5% CO2 하에 50%까지 성장시켰다. 약 0.02 μl PBS를 각각 2 × 1010 vg/0.02 μl의 바이러스 rAAV2-ND4-EGFP 및 rAAV2-opt_ND4*-EGFP와 혼합하였다. 48시간 후, 형광 현미경분석 및 RT-PCR 검출 및 면역블롯팅 실험을 수행하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, EGFP가 성공적으로 발현되었고, 이는 EGFP 유전자를 갖는 rAAV가 293T 세포에서 성공적으로 트랜스펙션되었고, rAAV2-ND4-EGFP 및 rAAV2-opt_ND4*-EGFP가 성공적으로 발현되었음을 나타낸다.
하기 프라이머를 사용하여 실시예 3과 유사한 실시간 PCR 시험을 수행하였다:
β-액틴-S：CGAGATCGTGCGGGACAT (서열 번호: 85);
β-액틴-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC (서열 번호: 86);
ND4-S: GCCAACAGCAACTACGAGC (서열 번호: 107);
ND4-A: TGATGTTGCTCCAGCTGAAG (서열 번호: 108);
결과는 예상외로, 최적화된 ND4* (opt_ND4, 서열 번호: 8) 코딩 핵산 서열 및 상응하는 재조합 핵산 (opt_COX10*-opt_ND4*-3'UTR, 서열 번호: 47)이 놀랍게도 전사 효율을 증가시켜, rAAV2-opt_ND4의 발현을 약 20%만큼 증가시켰음을 보여준다. 결과는 rAAV2-opt_ND4의 전사 효율이 현저히 더 높음을 보여주었다.
도 7은 293T 세포에서의 ND4 발현을 나타낸다. rAAV2-ND4에 대한 ND4 단백질의 평균 발현은 0.36이며, rAAV2-opt_ND4*에 대한 ND4 단백질의 평균 발현은 1.65이고, 이는 rAAV2-ND4 그룹에 비해 약 4.6배 더 높은 것이다 (p < 0.01) (도 8 참조).
도 9는 토끼 시신경 세포에서의 ND4 발현을 나타낸다. rAAV2-ND4에 대한 ND4 단백질의 평균 발현은 0.16이며, rAAV2-opt_ND4*에 대한 ND4 단백질의 평균 발현은 0.48이고, 이는 rAAV2-ND4 그룹에 비해 약 3배 더 높은 것이다 (p < 0.01) (도 10 참조).
1, 3, 7, 및 30일에 토끼의 2개 그룹 모두에 대하여 세극등 검사 및 안내압 측정을 수행하였다. 명백한 비정상, 결막 울혈, 분비, 또는 안구내염이 관찰되지 않았고, 안내압이 모든 토끼에서 상승되지 않았다.
rAAV2-ND4 및 rAAV2-opt_ND4*에 대한 안저부 사진 결과를 도 11에 나타내었다. 토끼의 시신경 및 망막 혈관에 대한 명백한 손상 또는 합병증이 없고, 이는 표준 유리체내 주사가 뚜렷한 염증 반응 또는 다른 합병증 없이 안전함을 나타낸다.
세극등 검사 및 안내압 측정 후 2개 토끼 그룹 모두로부터의 안구를 제거하였다. 안구를 고정시키고, 파라핀을 사용하여 탈수시켰다. 시신경의 방향을 따라 조직을 병리학적으로 절개하였다. 추가의 탈수 후, 헤마톡실린 및 에오신을 사용하여 조직 샘플을 염색하였다. 현미경 검사 결과는 도 12를 참조한다. HE 염색 결과에서 나타난 바와 같이, 토끼 망막 신경절 섬유 층이 손상되지 않았고, 신경절 세포의 수가 감소하지 않았으며, 이는 유리체내 주사가 망막 독성 또는 신경 손상을 생성하지 않고, 안전하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
실험 방법은 실시예 8과 동일하였고, 여기서는 재조합 핵산 opt_COX10*-opt_ND4*-3'UTR (서열 번호: 47)을 OPA1-opt_ND4*-3'UTR* (서열 번호: 76)로 대체하였다. 최적화된 ND4 서열은, 비-최적화된 ND4 (COX10-ND4-3'UTR, 서열 번호: 15)와 비교시 현저히 개선된 전사 및 번역 효율, 발현 수준, 뿐만 아니라 LHON 치료에 있어 보다 높은 효능 및 안전성을 가짐이 확인되었다.
실시예 9 - ND6 서열
COX10 (서열 번호: 1), ND6 (서열 번호: 9), 및 3'UTR (서열 번호: 13)의 조합 (5'에서 3'으로)인, 핵산, COX10-ND6-3'UTR (서열 번호: 21)을 사용하여 실시예 1-6에서의 유사한 실험 방법을 수행하였다.
COX10-ND6-3'UTR (서열 번호: 21)에 대한 플라스미드 스크리닝에서 하기 프라이머를 사용하였다:
ND6-F: ATGATGTATGCTTTGTTTCTG (서열 번호: 89),
ND6-R: CTAATTCCCCCGAGCAATCTC (서열 번호: 90),
트랜스펙션 및 스크리닝된 바이러스 rAAV2-ND6은 2.0 × 1011 vg/mL의 바이러스 역가를 가졌다. 실시예 5와 유사하게, 수술 후 1, 7, 및 30일에 토끼의 3개 그룹 (A: rAAV2-ND6; B: rAAV-GFP; C: PBS)에 대하여 세극등 검사 및 안내압 측정을 수행하였다(도 13). 명백한 비정상, 결막 울혈, 분비, 또는 안구내염이 관찰되지 않았고, 안내압이 모든 토끼에서 상승되지 않았다.
하기 프라이머를 사용하여 실시예 3과 유사한 실시간 PCR 시험을 수행하였다:
β-액틴-S：CGAGATCGTGCGGGACAT (서열 번호: 85)；
β-액틴-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC (서열 번호: 86);
ND6-S: AGTGTGGGTTTAGTAATG (서열 번호: 91);
ND4-A: TGCCTCAGGATACTCCTC (서열 번호: 92);
결과는 rAAV2-ND6 및 대조군 (PBS)에 대한 ND6의 발현이 각각 0.59 ± 0.06 및 0.41 ± 0.03이었음을 보여준다. 결과는 rAAV2-ND6의 전사 효율이 대조군보다 높음을 보여주었다 (p<0.01).
실시예 10 - 최적화된 opt_ND6 서열
opt_COX10* (서열 번호: 3), opt_ND6 (서열 번호: 10), 및 3'UTR (서열 번호: 13)의 조합 (5'에서 3'으로)인, 핵산, opt_COX10*-opt_ND6-3'UTR (서열 번호: 51)을 사용하여 실시예 1-6에서의 유사한 실험 방법을 수행하였다.
토끼의 3개 그룹에 주사하였다: A: 1010 vg/50 μl의 rAAV2-opt_ND6, B: 1010 vg/50 μl의 rAAV2-ND6 (실시예 9), 및 C: 1010 vg/50 μl의 rAAV2-EGFP. 도 14는 각각 rAAV2-opt_ND6 (A), rAAV2-ND6 (B), rAAV-EGFP (C)가 주사된 토끼에 대한 안저부 사진 결과를 나타낸다. 명백한 비정상, 결막 울혈, 분비, 또는 안구내염이 관찰되지 않았고, 안내압이 모든 토끼에서 상승되지 않았다.
하기 프라이머를 사용하여 실시예 3과 유사한 실시간 PCR 시험을 수행하였다:
β-액틴-F：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT (서열 번호: 93)；
β-액틴-R：GCTGTCACCTTCACCGTTCC (서열 번호: 94);
ND6-F: GGGTTTTCTTCTAAGCCTTCTCC (서열 번호: 95);
ND6-R: CCATCATACTCTTTCACCCACAG (서열 번호: 96);
opt_ND6-F: CGCCTGCTGACCGGCTGCGT (서열 번호: 97);
opt_ND6-R: CCAGGCCTCGGGGTACTCCT (서열 번호: 98);
도 15에 나타낸 바와 같이, rAAV2-opt_ND6 (A) 및 rAAV2-ND6 (B) 둘 다 대조군 (C)에 비해 더 높은 (p<0.05) 상대적 ND6 발현 수준을 가졌다. rAAV2-opt_ND6 (A)은 rAAV2-ND6 (B)에 비해 약간 더 높은 상대적 ND6 발현 수준을 가졌다. 도 16의 웨스턴 블롯에서 나타난 바와 같이, rAAV2-opt_ND6 (A)은 rAAV2-ND6 (B)에 비해 3배 초과로 더 높은 상대적 ND6 발현 수준을 가졌다.
실험 방법은 실시예 8과 동일하였고, 여기서는 재조합 핵산, COX10-ND6-3'UTR (서열 번호: 21) 및 opt_COX10*-opt_ND6-3'UTR (서열 번호: 51)을 OPA1-ND6-3'UTR (서열 번호: 77) 및 OPA1-opt_ND6-3'UTR (서열 번호: 79)로 대체하였다. 최적화된 ND6 서열은 현저히 개선된 전사 및 번역 효율, 발현 수준, 뿐만 아니라 LHON 치료에 있어 보다 높은 효능 및 안전성을 가짐이 확인되었다.
실시예 11 - ND1 및 opt_ND1 서열
COX10 (서열 번호: 1), ND1 (서열 번호: 11), 및 3'UTR (서열 번호: 13)의 조합 (5'에서 3'으로)인 rAAV2-ND1, COX10-ND1-3'UTR (서열 번호: 25); 또한 opt_COX10* (서열 번호: 3), opt_ND1 (서열 번호: 12), 및 3'UTR (서열 번호: 13)의 조합 (5'에서 3'으로)인 rAAV2-opt_ND1, opt_COX10*-opt_ND1-3'UTR (서열 번호: 55)을 사용하여 실시예 1-6에서의 유사한 실험 방법을 수행하였다.
COX10-ND1-3'UTR (서열 번호: 25)에 대한 플라스미드 스크리닝에서 하기 프라이머를 사용하였다:
ND1-F: ATGGCCGCATCTCCGCACACT (서열 번호: 99),
ND1-R: TTAGGTTTGAGGGGGAATGCT (서열 번호: 100),
opt_COX10*-opt_ND1-3'UTR (서열 번호: 55)에 대한 플라스미드 스크리닝에서 하기 프라이머를 사용하였다:
ND1-F: AACCTCAACCTAGGCCTCCTA (서열 번호: 101),
ND1-R: TGGCAGGAGTAACCAGAGGTG (서열 번호: 102),
토끼의 3개 그룹에 주사하였다: A: 1010 vg/50 μl의 rAAV2-opt_ND1, B: 1010 vg/50 μl의 rAAV2-ND1 (실시예 9), 및 C: 1010 vg/50 μl의 rAAV2-EGFP. 명백한 비정상, 결막 울혈, 분비, 또는 안구내염이 관찰되지 않았고, 안내압이 모든 토끼에서 상승되지 않았다.
하기 프라이머를 사용하여 실시예 3과 유사한 실시간 PCR 시험을 수행하였다:
ND1-F: AGGAGGCTCTGTCTGGTATCTTG (서열 번호: 103);
ND1-R: TTTTAGGGGCTCTTTGGTGAA (서열 번호: 104);
opt_ND1-F: GCCGCCTGCTGACCGGCTGCGT (서열 번호: 105);
opt_ND1-R: TGATGTACAGGGTGATGGTGCTGG (서열 번호: 106);
도 17에 나타낸 바와 같이, rAAV2-opt_ND1 (A) 및 rAAV2-ND1 (B) 둘 다 대조군 (C)에 비해 더 높은 (p<0.05) 상대적 ND1 발현 수준을 가졌다. 도 18의 웨스턴 블롯에서 나타난 바와 같이, rAAV2-opt_ND1 (A)은 rAAV2-ND1 (B)에 비해 2배 초과로 더 높은 상대적 ND6 발현 수준을 가졌다.
실험 방법은 실시예 8과 동일하였고, 여기서는 재조합 핵산, COX10-ND1-3'UTR (서열 번호: 25) 및 opt_COX10*-opt_ND1-3'UTR (서열 번호: 55)을 OPA1-ND1-3'UTR (서열 번호: 81) 및 OPA1-opt_ND1-3'UTR (서열 번호: 83)로 대체하였다. 최적화된 ND1 서열은 현저히 개선된 전사 및 번역 효율, 발현 수준, 뿐만 아니라 LHON 치료에 있어 보다 높은 효능 및 안전성을 가짐이 확인되었다.
실시예 12 - 다른 융합 단백질
서열 번호: 15-84에 기재된 바와 같은 다른 융합 단백질을 사용하여 실시예 1-6에서의 유사한 실험 방법을 수행할 수 있다. 또한 유사한 결과가 달성될 것으로 예상된다.
실시예 13 - 제제 개발
AAV2 바이러스 샘플을 사용하여 상이한 AAV 제제를 스크리닝하였다. StepOnePlus 실시간 PCR 시스템을 사용하여 상이한 AAV 제제의 안정성을 평가하였다. 동결/해동 사이클 조건 하에 각각의 제제의 바이러스 역가를 측정하였다.
첫번째로, 3종의 상이한 제제를 1, 2, 3, 4, 및 5회의 동결/해동 사이클 하에 시험하였고, 바이러스 역가를 측정하고, 표 3에 요약하였다. 시험된 3종의 제제는 하기와 같았다: A: 인산염 완충 식염수 (PBS); B: 1% α,α-트레할로스 탈수화물, 1% L-히스티딘 모노히드로클로라이드 일수화물, 및 1% 폴리소르베이트 20; 및 C: 180 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 및 0.001% 폴록사머 188, pH 7.3. 표 3에 나타낸 바와 같이, 제제 C는 5회의 동결/해동 사이클 후에 최저 상대 표준 편차 (RSD)를 갖고, 이는 AAV 제제로서 우수한 안정성을 나타낸다.
표 3 - 제제 A, B, 및 C의 바이러스 역가
표 3에 나타낸 바와 같이, 제제 C는 5개 동결/해동 사이클 후에 최저 상대 표준 편차 (RSD)를 갖고, 이는 AAV 제제로서 우수한 안정성을 나타낸다.
두번째로, 3종의 상이한 제제의 또 다른 그룹을 1, 2, 3, 4, 및 5개 동결/해동 사이클 하에 시험하였고, 바이러스 역가를 측정하고, 표 4에 요약하였다. 시험된 3종의 제제는 하기와 같았다: D: 인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.2-7.4; E: PBS 및 0.001% 폴록사머 188, pH 7.2-7.4; 및 F: 80 mM NaCl, 5 mM NaH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 5 mM KH2PO4 및 0.001% 폴록사머 188, 7.2-7.4.
표 4 - 제제 D, E, 및 F의 바이러스 역가
표 4에 나타낸 바와 같이, 제제 F는 5개 동결/해동 사이클 후에 최저 상대 표준 편차 (RSD)를 갖고, 이는 AAV 제제로서 우수한 안정성을 나타낸다. 전체적으로, 제제 F는 또한 모든 시험된 제제 중에서 최저 RSD를 갖고, 차후 개발을 위한 AAV 제제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예를 본원에서 나타내고 기재하였지만, 이러한 구현예는 단지 예로서 제공되는 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 이제 수많은 변형, 변화, 및 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 나타날 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 청구범위가 본 발명의 범위를 정의하고, 이로써 이들 청구범위의 범위 내의 방법 및 구조 및 그의 등가물이 포함됨이 의도된다.
<110> WUHAN NEUROPHTH BIOLOGICAL TECHNOLOGY LIMITED COMPANY <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LEBER'S HEREDITARY OPTIC NEUROPATHY <130> WNBT-002/03WO 336356-2007 <150> PCT/CN2019/070461 <151> 2019-01-04 <150> PCT/CN2018/113799 <151> 2018-11-30 <150> PCT/CN2018/118662 <151> 2018-11-02 <150> CN 201811230856.2 <151> 2018-10-22 <150> CN 201811221305.X <151> 2018-10-19 <150> PCT/CN2018/103937 <151> 2018-09-04 <150> CN 201810948193.1 <151> 2018-08-20 <150> PCT/CN2018/095023 <151> 2018-07-09 <150> CN 201810703168.7 <151> 2018-06-29 <150> CN 201810702492.7 <151> 2018-06-29 <160> 162 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 84 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60 gtctggtatc ttgaaagaag aact 84 <210> 2 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> opt_COX10 <400> 2 atggccgcct ctccacacac actgagtagc agactgctga ccggctgtgt tggcggctct 60 gtgtggtatc tggaacggcg gaca 84 <210> 3 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> opt_COX10* <400> 3 atggccgcca gcccccacac cctgagcagc cgcctgctga ccggctgcgt gggcggcagc 60 gtgtggtacc tggagcgccg cacc 84 <210> 4 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX8 <400> 4 atgtccgtcc tgacgcgcct gctgctgcgg ggcttgacac ggctcggctc ggcggctcca 60 gtgcggcgcg ccagaatcca ttcgttg 87 <210> 5 <211> 266 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60 tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120 cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180 acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240 cgactacgtc gggccgctgt ggcctg 266 <210> 6 <211> 1380 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgctaaaac taatcgtccc aacaattatg ttactaccac tgacatggct ttccaaaaaa 60 cacatgattt ggatcaacac aaccacccac agcctaatta ttagcatcat ccctctacta 120 ttttttaacc aaatcaacaa caacctattt agctgttccc caaccttttc ctccgacccc 180 ctaacaaccc ccctcctaat gctaactacc tggctcctac ccctcacaat catggcaagc 240 caacgccact tatccagtga accactatca cgaaaaaaac tctacctctc tatgctaatc 300 tccctacaaa tctccttaat tatgacattc acagccacag aactaatcat gttttatatc 360 ttcttcgaaa ccacacttat ccccaccttg gctatcatca cccgatgggg caaccagcca 420 gaacgcctga acgcaggcac atacttccta ttctacaccc tagtaggctc ccttccccta 480 ctcatcgcac taatttacac tcacaacacc ctaggctcac taaacattct actactcact 540 ctcactgccc aagaactatc aaactcctgg gccaacaact taatgtggct agcttacaca 600 atggctttta tggtaaagat gcctctttac ggactccact tatggctccc taaagcccat 660 gtcgaagccc ccatcgctgg gtcaatggta cttgccgcag tactcttaaa actaggcggc 720 tatggtatga tgcgcctcac actcattctc aaccccctga caaaacacat ggcctacccc 780 ttccttgtac tatccctatg gggcatgatt atgacaagct ccatctgcct acgacaaaca 840 gacctaaaat cgctcattgc atactcttca atcagccaca tggccctcgt agtaacagcc 900 attctcatcc aaaccccctg gagcttcacc ggcgcagtca ttctcatgat cgcccacggg 960 cttacatcct cattactatt ctgcctagca aactcaaact acgaacgcac tcacagtcgc 1020 atcatgatcc tctctcaagg acttcaaact ctactcccac taatggcttt ttggtggctt 1080 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480 ctgattgccc tgatctacac ccacaacacc ctgggctccc tgaacatcct gctgctgaca 540 ctgacagccc aagagctgag caacagctgg gccaacaatc tgatgtggct ggcctacaca 600 atggccttca tggtcaagat gcccctgtac ggcctgcacc tgtggctgcc taaagctcat 660 gtggaagccc ctatcgccgg ctctatggtg ctggctgcag tgctgctgaa actcggcggc 720 tacggcatga tgcggctgac cctgattctg aatcccctga ccaagcacat ggcctatcca 780 tttctggtgc tgagcctgtg gggcatgatt atgaccagca gcatctgcct gcggcagacc 840 gatctgaagt ccctgatcgc ctacagctcc atcagccaca tggccctggt ggtcaccgcc 900 atcctgattc agaccccttg gagctttaca ggcgccgtga tcctgatgat tgcccacggc 960 ctgacaagca gcctgctgtt ttgtctggcc aacagcaact acgagcggac ccacagcaga 1020 atcatgatcc tgtctcaggg cctgcagacc ctcctgcctc ttatggcttt ttggtggctg 1080 ctggcctctc tggccaatct ggcactgcct cctaccatca atctgctggg cgagctgagc 1140 gtgctggtca ccacattcag ctggtccaat atcaccctgc tgctcaccgg cctgaacatg 1200 ctggttacag ccctgtactc cctgtacatg ttcaccacca cacagtgggg aagcctgaca 1260 caccacatca acaatatgaa gcccagcttc acccgcgaga acaccctgat gttcatgcat 1320 ctgagcccca 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<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 tcttggaata taaagaattt cttcaggttg aattacctag aagtttgtca ctgacttgtg 60 ttcctgaact atgacacatg aatatgtggg ctaagaaata gttcctcttg ataaataaac 120 aattaacaaa tactttggac agtaagtctt tctcagttct taatgataat gcagggcact 180 tactagcata agaattggtt tgggatttaa ctgtttatga agctaacttg atttccgtgt 240 tttgttaaaa tttcattgtt ctagcacatc tttaactgtg atagtt 286 <210> 121 <211> 721 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 gagacgtgca cttggtcgtg cgcccaggga ggaagccgca ccaccagcca gcgcaggccc 60 tggtggagag gcctccctgg ctgcctctgg gaggggtgct gccttgtaga tggagcaagt 120 gagcactgag ggtctggtgc caatcctgta ggcacaaaac cagaagtttc tacattctct 180 atttttgtta atcatcttct ctttttccag aatttggaag ctagaatggt gggaatgtca 240 gtagtgccag aaagagagaa ccaagcttgt ctttaaagtt actgatcaca ggacgttgct 300 ttttcactgt ttcctattaa tcttcagctg aacacaagca aaccttctca ggaggtgtct 360 cctaccctct tattgttcct cttacgctct gctcaatgaa accttcctct tgagggtcat 420 tttcctttct gtattaatta taccagtgtt aagtgacata gataagaact ttgcacactt 480 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Lys Val Ala Arg Pro 755 760 765 Ala Val Arg Val Ala Gln Val Ser Lys Arg Thr Ile Gln Thr Gly Ser 770 775 780 Pro Leu Gln Thr Leu Lys Arg Thr Gln Met Thr Ser Ile Val Asn Ala 785 790 795 800 Thr Thr Arg Gln Ala Phe Gln Lys Arg Ala 805 810 <210> 160 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Met Leu Lys Leu Ile Val Pro Thr Ile Met Leu Leu Pro Leu Thr Trp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Lys His Met Ile Trp Ile Asn Thr Thr Thr His Ser Leu 20 25 30 Ile Ile Ser Ile Ile Pro Leu Leu Phe Phe Asn Gln Ile Asn Asn Asn 35 40 45 Leu Phe Ser Cys Ser Pro Thr Phe Ser Ser Asp Pro Leu Thr Thr Pro 50 55 60 Leu Leu Met Leu Thr Thr Trp Leu Leu Pro Leu Thr Ile Met Ala Ser 65 70 75 80 Gln Arg His Leu Ser Ser Glu Pro Leu Ser Arg Lys Lys Leu Tyr Leu 85 90 95 Ser Met Leu Ile Ser Leu Gln Ile Ser Leu Ile Met Thr Phe Thr Ala 100 105 110 Thr Glu Leu Ile Met Phe Tyr Ile Phe Phe Glu Thr Thr Leu Ile Pro 115 120 125 Thr Leu Ala Ile Ile Thr Arg Trp Gly Asn Gln Pro Glu Arg Leu Asn 130 135 140 Ala Gly Thr Tyr Phe Leu Phe Tyr Thr Leu Val Gly Ser Leu Pro Leu 145 150 155 160 Leu Ile Ala Leu Ile Tyr Thr His Asn Thr Leu Gly Ser Leu Asn Ile 165 170 175 Leu Leu Leu Thr Leu Thr Ala Gln Glu Leu Ser Asn Ser Trp Ala Asn 180 185 190 Asn Leu Met Trp Leu Ala Tyr Thr Met Ala Phe Met Val Lys Met Pro 195 200 205 Leu Tyr Gly Leu His Leu Trp Leu Pro Lys Ala His Val Glu Ala Pro 210 215 220 Ile Ala Gly Ser Met Val Leu Ala Ala Val Leu Leu Lys Leu Gly Gly 225 230 235 240 Tyr Gly Met Met Arg Leu Thr Leu Ile Leu Asn Pro Leu Thr Lys His 245 250 255 Met Ala Tyr Pro Phe Leu Val Leu Ser Leu Trp Gly Met Ile Met Thr 260 265 270 Ser Ser Ile Cys Leu Arg Gln Thr Asp Leu Lys Ser Leu Ile Ala Tyr 275 280 285 Ser Ser Ile Ser His Met Ala Leu Val Val Thr Ala Ile Leu Ile Gln 290 295 300 Thr Pro Trp Ser Phe Thr Gly Ala Val Ile Leu Met Ile Ala His Gly 305 310 315 320 Leu Thr Ser Ser Leu Leu Phe Cys Leu Ala Asn Ser Asn Tyr Glu Arg 325 330 335 Thr His Ser Arg Ile Met Ile Leu Ser Gln Gly Leu Gln Thr Leu Leu 340 345 350 Pro Leu Met Ala Phe Trp Trp Leu Leu Ala Ser Leu Ala Asn Leu Ala 355 360 365 Leu Pro Pro Thr Ile Asn Leu Leu Gly Glu Leu Ser Val Leu Val Thr 370 375 380 Thr Phe Ser Trp Ser Asn Ile Thr Leu Leu Leu Thr Gly Leu Asn Met 385 390 395 400 Leu Val Thr Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Met Phe Thr Thr Thr Gln Trp 405 410 415 Gly Ser Leu Thr His His Ile Asn Asn Met Lys Pro Ser Phe Thr Arg 420 425 430 Glu Asn Thr Leu Met Phe Met His Leu Ser Pro Ile Leu Leu Leu Ser 435 440 445 Leu Asn Pro Asp Ile Ile Thr Gly Phe Ser Ser 450 455 <210> 161 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Met Met Tyr Ala Leu Phe Leu Leu Ser Val Gly Leu Val Met Gly Phe 1 5 10 15 Val Gly Phe Ser Ser Lys Pro Ser Pro Ile Tyr Gly Gly Leu Val Leu 20 25 30 Ile Val Ser Gly Val Val Gly Cys Val Ile Ile Leu Asn Phe Gly Gly 35 40 45 Gly Tyr Met Gly Leu Met Val Phe Leu Ile Tyr Leu Gly Gly Met Met 50 55 60 Val Val Phe Gly Tyr Thr Thr Ala Met Ala Ile Glu Glu Tyr Pro Glu 65 70 75 80 Ala Trp Gly Ser Gly Val Glu Val Leu Val Ser Val Leu Val Gly Leu 85 90 95 Ala Met Glu Val Gly Leu Val Leu Trp Val Lys Glu Tyr Asp Gly Val 100 105 110 Val Val Val Val Asn Phe Asn Ser Val Gly Ser Trp Met Ile Tyr Glu 115 120 125 Gly Glu Gly Ser Gly Leu Ile Arg Glu Asp Pro Ile Gly Ala Gly Ala 130 135 140 Leu Tyr Asp Tyr Gly Arg Trp Leu Val Val Val Thr Gly Trp Thr Leu 145 150 155 160 Phe Val Gly Val Tyr Ile Val Ile Glu Ile Ala Arg Gly Asn 165 170 <210> 162 <211> 316 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Met Ala Asn Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ile Leu Ile Ala Met Ala 1 5 10 15 Phe Leu Met Leu Thr Glu Arg Lys Ile Leu Gly Tyr Met Gln Leu Arg 20 25 30 Lys Gly Pro Asn Val Val Gly Pro Tyr Gly Leu Leu Gln Pro Phe Ala 35 40 45 Asp Ala Ile Lys Leu Phe Thr Lys Glu Pro Leu Lys Pro Ala Thr Ser 50 55 60 Thr Ile Thr Leu Tyr Ile Thr Ala Pro Thr Leu Ala Leu Thr Ile Ala 65 70 75 80 Leu Leu Leu Trp Thr Pro Leu Pro Met Pro Asn Pro Leu Val Asn Leu 85 90 95 Asn Leu Gly Leu Leu Phe Ile Leu Ala Thr Ser Ser Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Ser Ile Leu Trp Ser Gly Trp Ala Ser Asn Ser Asn Tyr Ala Leu Ile 115 120 125 Gly Ala Leu Arg Ala Val Ala Gln Thr Ile Ser Tyr Glu Val Thr Leu 130 135 140 Ala Ile Ile Leu Leu Ser Thr Leu Leu Met Ser Gly Ser Phe Asn Leu 145 150 155 160 Ser Thr Leu Ile Thr Thr Gln Glu His Leu Trp Leu Leu Leu Pro Ser 165 170 175 Trp Pro Leu Ala Met Met Trp Phe Ile Ser Thr Leu Ala Glu Thr Asn 180 185 190 Arg Thr Pro Phe Asp Leu Ala Glu Gly Glu Ser Glu Leu Val Ser Gly 195 200 205 Phe Asn Ile Glu Tyr Ala Ala Gly Pro Phe Ala Leu Phe Phe Met Ala 210 215 220 Glu Tyr Thr Asn Ile Ile Met Met Asn Thr Leu Thr Thr Thr Ile Phe 225 230 235 240 Leu Gly Thr Thr Tyr Asp Ala Leu Ser Pro Glu Leu Tyr Thr Thr Tyr 245 250 255 Phe Val Thr Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ser Leu Phe Leu Trp Ile Arg 260 265 270 Thr Ala Tyr Pro Arg Phe Arg Tyr Asp Gln Leu Met His Leu Leu Trp 275 280 285 Lys Asn Phe Leu Pro Leu Thr Leu Ala Leu Leu Met Trp Tyr Val Ser 290 295 300 Met Pro Ile Thr Ile Ser Ser Ile Pro Pro Gln Thr 305 310 315

Claims (25)

  1. 서열 번호: 15에 기재된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV); 및
    인산염 완충 식염수 (PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 모노히드로클로라이드 일수화물, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 부형제
    를 포함하는 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제가 폴록사머 188을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제가 0.0001% 내지 0.01% 폴록사머 188을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제가 0.001% 폴록사머 188을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제가 하나 이상의 염을 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 염이 NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, 또는 KH2PO4를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 하나 이상의 염이 NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, 및 KH2PO4를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 염이 80 mM NaCl, 5 mM NaH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 및 5 mM KH2PO4를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 6 내지 8의 pH를 갖는 것인, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 7.2 내지 7.4의 pH를 갖는 것인, 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 7.3의 pH를 갖는 것인, 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 적어도 1.0 × 1010 vg/mL의 바이러스 역가를 갖는 것인, 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 적어도 5.0 × 1010 vg/mL의 바이러스 역가를 갖는 것인, 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 5회의 동결/해동 사이클에 적용될 때, 상기 약제학적 조성물이 5회의 동결/해동 사이클 전의 바이러스 역가에 비해 적어도 60%의 바이러스 역가를 보유하는 것인, 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 레버 유전성 시신경병증을 갖는 환자에게 투여될 때 상기 재조합 핵산을 갖지 않는 유사 약제학적 조성물에 비해 더 높은 시력의 평균 회복을 생성하는 것인, 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 환자에서 레버 유전성 시신경병증(LHON)을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 유리체내 주사를 통해 투여하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 유리체내 주사를 통해 투여하기 위해 약 0.01 내지 0.1 mL의 상기 약제학적 조성물을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 유리체내 주사를 통해 투여하기 위해 약 0.05 mL의 상기 약제학적 조성물을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  20. 제16항에 있어서, 메틸프레드니솔론이 상기 환자에게 투여하기 위해 병용되는 것인, 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 메틸프레드니솔론이 정맥내 투여 또는 경구 투여하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 메틸프레드니솔론이 상기 약제학적 조성물의 투여 전에 적어도 2일 동안 매일 투여하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
  23. 제16항에 있어서, 크레아틴 인산염 나트륨이 상기 환자에게 투여하기 위해 병용되는 것인, 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 크레아틴 인산염 나트륨이 정맥내 투여하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
  25. 제16항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 상기 투여가 상기 재조합 핵산이 없는 유사 약제학적 조성물에 비해 더 높은 시력의 평균 회복을 생성하는 것인, 약제학적 조성물.
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