CN110846392A

CN110846392A - 一种重组腺相关病毒或含其的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110846392A
Application number: CN201810948193.1A
Authority: CN
Inventors: 李斌
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co Ltd; Wuhan Neurophth Biotechnology Ltd Co
Priority date: 2018-08-20
Filing date: 2018-08-20
Publication date: 2020-02-28
Also published as: WO2020037938A1

Abstract

本发明公开了一种重组腺相关病毒或含其的试剂盒在制备诊断制品中的用途，其中，所述诊断制品用于筛查重组腺相关病毒基因治疗发生免疫反应几率。本发明用途安全，可有效判断患者发生免疫反应的几率。

Description

一种重组腺相关病毒或含其的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种重组腺相关病毒或含其的试剂盒及其应用。

背景技术

基因治疗是指将外源正常靶基因导入到靶细胞中，以纠正或补偿由于基因缺陷或异常导致的疾病，包括基因修正和基因替代，而基因载体的发展对基因治疗起了重要的推动作用。在众多载体中，病毒载体因具有长期基因表达和较高的感染效率而广泛应用于基因治疗中，尤其是具有显著优势的腺相关病毒载体。

腺相关病毒是基因治疗中应用最为广泛的载体之一，重组腺相关病毒(recombinant AAV，rAAV)或称重组腺相关病毒载体具有非致病性、低免疫原性、特异性位点整合以及稳定表达目的基因等特性，使其在众多病毒中脱颖而出成为其中的佼佼者。

基因治疗中，如果参加基因治疗的患者其血清中具有腺相关病毒的抗体，采用rAAV进行基因治疗时会引起免疫反应。此时该种患者不适合直接进行基因治疗，需要接受免疫治疗后才能进行基因治疗。然而，现有技术中缺乏一种鉴别患者是否适合直接进行基因治疗的方法。

发明内容

本发明解决的技术问题是为克服患者在重组腺相关病毒基因治疗过程中有发生免疫反应风险的缺陷，提供一种重组腺相关病毒或含其的试剂盒及其应用。

为解决以上技术问题，本发明的技术方案之一为：一种重组腺相关病毒或含其的试剂盒在制备诊断制品中的用途，其中所述诊断制品用于筛查重组腺相关病毒基因治疗发生免疫反应几率。

优选地，所述重组腺相关病毒含报告基因。

更优选地，所述报告基因为荧光蛋白，优选绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)、深红色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或橙色荧光蛋白。进一步更优选地，所述绿色荧光蛋白GFP为增强绿色荧光蛋白EGFP、Emerald、sfGFP、超折叠GFP或ZsGreen1珊瑚分离蛋白，所述红色荧光蛋白为mCherry、mPlum或mStrawberry，所述黄色荧光蛋白为ZsYellow1、mCitrine、mVenus或YPet，所述橙色荧光蛋白为mOrange、TagRFP、mKO或dTomato。

如本文所用的术语“重组”，作为对载体例如病毒以及序列例如重组多核苷酸和多肽的修饰时，意指所述载体或序列已经被以人工的方式操纵。重组病毒的具体示例是将其中通常不存在于野生型病毒基因组中的多核苷酸插入到病毒基因组内。在本发明中，重组腺相关病毒或重组腺相关病毒载体为将异源多核苷酸(例如报告基因)克隆到腺相关病毒序列内。虽然术语“重组”在本文中不总是参照病毒载体例如AAV病毒和载体序列以及多核苷酸和多肽使用，但是明确地包括病毒载体例如AAV、载体序列以及多核苷酸和多肽的重组形式。重组腺相关病毒衍生自野生型腺相关病毒，可以通过使用分子方法从病毒序列去除野生型基因，并用非天然核酸例如报告转基因替换。非天然序列例如报告转基因的导入因此将病毒载体定义为“重组”载体，在AAV的情形下，其可以称为“rAAV”。在本文中，术语“重组腺相关病毒”、“重组腺相关病毒载体”、“rAAV”或“重组AAV病毒”之间通常可以互换。

优选地，所述重组腺相关病毒为携带GFP标签的腺相关病毒载体rAVV2，其亦可称为rAVV2-GFP。所述重组腺相关病毒载体还可以衍生自包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh74或Rh10载体，或任何前述AAV腺相关病毒的杂合体或嵌合体。

优选地，将离体血清、所述重组腺相关病毒与哺乳动物细胞共培养36-60小时，优选48小时；所述哺乳动物细胞优选HEK293细胞，更优选293T细胞。

优选地，所述筛查使用流式细胞术分析或RT-PCR分析。

本发明中所述的“正常表达”，在荧光定量PCR中指相对表达量为0.2≤表达量<0.6，在流式细胞检测中指表达量为20％≤表达量<40％；本发明中所述的“高表达”，在荧光定量PCR中指相对表达量为0.6≤表达量≤1，在流式细胞检测中指表达量为40％≤表达量≤50％；本发明中所述的“低表达”，在荧光定量PCR中指相对表达量低于0.2，在流式细胞检测中指表达量低于20％；本发明中所述的“不表达”，即未测得报告基因的表达量，或本领域技术人员的常规理解。

因此，更优选地，当所述筛查使用流式细胞术分析时，筛查的标准为：当报告基因表达量≥20％，优选≥40％时，患者在基因治疗时发生免疫反应的几率较低，因此其可直接进行基因治疗；当报告基因表达量＜20％或不表达时，患者在基因治疗时发生免疫反应的几率较高，因此患者不能直接进行基因治疗；当所述筛查使用RT-PCR分析时，筛查的标准为：当报告基因相对表达值≥0.2，优选≥0.6时，由于患者在基因治疗时发生免疫反应的几率较低，因此其可直接进行基因治疗；当报告基因表达量＜0.2或不表达时，患者在基因治疗时发生免疫反应的几率较高，因此其不能直接进行基因治疗。

优选地，所述基因治疗的基因为Leber遗传性视神经病变相关的基因。在一个实施方案中，所述Leber遗传性视神经病变相关的基因为NADH脱氢酶亚单位1、4或6基因。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：首次提供了重组腺相关病毒或含其的试剂盒在制备诊断制品中的用途，其中所述诊断制品用于筛查重组腺相关病毒基因治疗发生免疫反应几率。本发明还首次建立了筛查标准，即当所述筛查使用流式细胞术分析时，筛查的标准为：当报告基因表达量≥20％，患者发生免疫反应的几率较低；当所述筛查使用RT-PCR分析时，筛查的标准为：当报告基因相对表达值≥0.2时，患者发生免疫反应的几率较低。该用途在Leber遗传性视神经病变中得到了验证。本发明建立的标准应用广泛，效果显著，有很强的临床应用价值。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实验材料：rAAV2-GFP(广州派真生物技术有限公司)和患者血清(长期保存-80℃，短期保存-20℃，4度解冻)，293T细胞，胎牛血清(巴西Gibco)，DMEM高糖培养基(Gibco，巴西)，双抗(10000单位青霉素链霉素双抗溶液Gibco)，EDTA，PBS，24孔板，流式管，大培养瓶，巴士吸管，枪头枪头盒及移液枪(1ml、5ml、10ml)，封口膜，50ml离心管，酒精灯，酒精，2ml、4ml EP管，高温灭菌设备，离心机(湖南湘仪TGL-16M)，生物安全柜(Thermo 1300系列A2)，流式细胞仪(贝克曼库尔特Cyto FLEX S)

本发明中，以绿色荧光蛋白为报告基因，用rAAV2-GFP转染不同血清(抗体)浓度培养的293T细胞，利用RT-PCR或流式细胞仪分选观察其感染效率，比较rAAV2对各型细胞的感染效率，探讨腺相关病毒对各类型细胞的亲和力，进一步为腺相关病毒用于基因治疗提供理论和实验依据。本发明的方法可用于筛选腺相关病毒免疫反应较小的患者，从而有效避免重组腺相关病毒基因治疗免疫反应的发生。

实施例1rAAV2-GFP的制备

用携带GFP标签的腺相关病毒rAAV2-GFP转染HEK 293细胞(293T细胞)，包装rAAV2型腺相关病毒；将腺相关病毒浓缩、纯化；随后进行滴度的测定，产品由广州派真生物技术有限公司定制。具体步骤为：转染前一天，将293T细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×10⁷个/mL细胞，培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜；转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。转染48h后，收取细胞，将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次后进行分离、浓缩和纯化得到重组腺相关病毒rAAV2-GFP。

实施例2细胞复苏和培养

简言之，其实验主要包括以下步骤：

1.高温灭菌。

2.紫外线消毒至少30min。

3.细胞培养：冻存好的293T细胞进行复苏(详见操作步骤)。

4.细胞传代：生长至大约3-5天大培养瓶细胞长满后，将其传至24孔板上。具体请参见下述内容。

高温灭菌：枪头(1ml，5ml，10ml)，EP管放置于饭盒。烘干后要用时进行紫外消毒。一般灭菌后可保存12小时，较为安全不会导致细胞污染。

紫外消毒：枪头，EP管，枪，酒精灯，记号笔，胎牛血清，高糖，双抗，EDTA，PBS，24孔板，大培养瓶，巴士吸管，50ml离心管，酒精灯

1:9配液或1:4配液，放至4℃保存，其中

1:9配液：5ml胎牛血清，45ml高糖培养基，0.5ml或1ml双抗加至50ml离心管后混匀；1:4配液：10ml胎牛血清，40ml高糖培养基，0.5ml或1ml青链霉素混合液(10000单位青霉素和10000μg链霉素/每毫升，Gibco)加至50ml离心管后混匀。

细胞培养：

①将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，1～2min。

②迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒，然后放置在4℃冰浴上，用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀。

③小心开启瓶盖，把细胞转入含有消毒后的离心管内，加10倍体积的DMEM高糖培养基，离心1000rmp，5min。弃上清，加入培养基重悬。转至4mL培养基的培养瓶中，然后把培养瓶移至培养箱，让细胞贴壁。

④细胞贴壁后，小心移弃培养基，主要是去掉DMSO(悬浮生长细胞要通过离心沉淀除去DMSO)、死细胞及其碎片，加5mL新鲜培养基继续培养。

⑤细胞培养24h后，更换新鲜培养基，继续培养直到形成单层，便可以传代。

细胞换液：

2～3天换一次液。将培养瓶中废液用10ml枪吸出后，加5ml PBS，倒掉，反复三次后加入新配置好的培养基20ml左右。

细胞传代：

培养瓶传代：细胞长满成圆形时传代。将培养瓶中废液用10ml枪吸出后，加5mlPBS，倒掉，洗涤三次后加入EDTA 5ml，放至恒温箱3min迅速加入培养基20ml，用10ml枪反复吹打至细胞均匀悬浮，吸取10ml转至另一培养瓶，后将两培养瓶定基至20ml。

24孔板传代：将培养瓶中废液用10ml枪吸出后，加5ml PBS，倒掉，洗涤三次后加入EDTA 5ml，放至恒温箱3min迅速加入培养基50ml，用10ml枪反复吹打至细胞均匀悬浮。吸取2ml至每孔后将培养瓶定基至20ml，培养瓶和24孔板放置培养箱继续培养。

实施例3细胞与重组腺相关病毒共培养

患者血清收集

取患者全血2ml，离心机分离血清，取血清分装于两试管内置于-20℃冰箱冷冻室(或-80℃冰箱)储藏备用。剩余全血装于一试管中备用，做好病人信息标记。

血清、重组腺相关病毒和细胞共培养

1.在实施例2中的293T细胞培养至24孔板上的细胞长满(大约2-3天)后开始配药。

2.配药(重组腺相关病毒稀释液)：1960μl的DMEM高糖培养基中加入rAAV2-GFP 40μl(4ml EP管)。

血清稀释液：按以下配置；

1:20组：300μl患者血清+300μl培养基+300μl上述的病毒稀释液；

1:60组：100μl患者血清+500μl培养基+300μl上述的病毒稀释液；

对照组：600μl培养基+300μl上述的病毒稀释液。

药物配置完成后将EP管封口放在4℃中。

3.弃掉24孔板内的废培养基，每孔加入新培养基1.7ml。

4.加药，将步骤2中1:20组、1:60组、对照组的配药各300μl加入到步骤3的24孔板上的细胞中，每组重复3次实验；

5.转染：将24孔板放置培养箱继续培养48h。

实施例4基因表达量的RT-PCR分析

1.用primer premier 5设计引物：

β-actin-F：cct aga agc att tgc ggt

β-actin-R：gag cta cga gct gcc tga

GFP-F：aca agt tca gcg tgt ccg

GFP-R：ctc gtt ggg gtc ttt gct

2.提取RNA、反转录

利用TRIZOL试剂盒提取实施例3、步骤5中获得细胞的总RNA，并反转录合成cDNA模板。

3.荧光定量PCR的反应体系和反应程序

在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH₂O 8μL、一对引物各1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。

表1用荧光定量PCR检测患者GFP相对表达值

本发明中，相对表达量＝(GFP表达量/β-actin)*100％，GFP基因表达量与内参基因表达量一致为1。GFP表达量筛选标准：高表达为0.6≤表达量≤1，正常表达为0.2≤表达量<0.6，低表达为0.2以下。GFP高表达和正常表达说明此患者体液不免疫rAAV2，或者发生的免疫反应较小，可以直接进行基因治疗。GFP低表达说明此患者曾经感染过rAAV2腺相关病毒，体内存在抗rAAV2抗体，采用rAAV进行基因治疗会引起免疫反应，因此需要接受免疫治疗后才能进行基因治疗。

实施例5基因表达量的流式细胞术检测

1.将实施例3中24孔板内的培养基用移液枪吸出1ml丢弃，余下的培养基用来吹打细胞，反复吹打至所有细胞都悬浮在培养基后将培养基转至流式管。

2.流式细胞仪检测：首次上机还需设置空白管，即准备一个没有经过转染过程细胞组，不加上述药物，同样的转至流式管上机，目的是看细胞本身的GFP表达量的基础值。

3.流式细胞仪检测时，设定对照组感染效率为50％，记录上机后的数据。结果参见表2。

表2患者A的GFP表达量分析

表3患者B的GFP表达量分析

表4患者C的GFP表达量分析

表5患者D的GFP表达量分析

表6患者E的GFP表达量分析

GFP表达量筛选标准：高表达为40％≤表达量≤50％，正常表达为20％≤表达量＜40％，低表达为20％以下。GFP高表达和正常表达说明此患者体液不免疫rAAV2，可以直接进行基因治疗，GFP低表达说明此患者曾经感染过rAAV2腺相关病毒，体内存在抗rAAV2抗体，采用rAAV进行基因治疗会引起免疫反应，因此需要接受免疫治疗后才能进行基因治疗。

结论：上述表格中，患者A、B、C和D检测的GFP表达量均高于20％(如表2-5所示)，说明患者体液不免疫rAAV2，或者发生的免疫反应较小，可以进行基因治疗，尤其是D患者GFP表达量高于40％，说明患者处于进行基因治疗的理想状态。患者E检测的GFP表达量低于对照组GFP表达平均值20％(如表6所示)，说明此患者曾经感染过rAAV2腺相关病毒，体内存在抗rAAV2抗体，采用rAAV2进行基因治疗会引起免疫反应，因此需要接受免疫治疗后才能进行基因治疗。

实施例6基因表达的临床验证

GFP表达量和基因治疗的关系为发明人首次发现，之前的现有技术中未有相关的报道，本领域也未建立具体表达量和基因治疗效果关系的标准。在临床中，发明人意外地发现，GFP表达量低于20％的受试者在接受基因治疗中引发了免疫反应，出于安全的考虑，在本实施例中，未进一步纳入临床验证。且在临床中，较少发现表达量大于50％的受试者，因此本实施例的目的是验证表达量介于20％和50％间的受试者。在临床中，发明人发现在20-50％的表达量区间，基因治疗效果与表达量有一定的关系，表达量低于40％的受试者其基因治疗的效果略低于表达量在40％及以上的受试者。因此制定了以上低表达、正常表达和高表达的标准，并进行以下验证。治疗前，筛查受试者重组腺相关病毒基因治疗的免疫反应，受试者按GFP表达量分组如下：高表达为40％≤表达量≤50％，即为A组，正常表达为20％≤表达量＜40％，即为B组。

本研究受试者符合Leber遗传性视神经病变诊断标准，并且通过基因测序确定为11778位点突变，即NADH脱氢酶亚单位4蛋白的精氨酸转变成组氨酸，导致功能障碍、视神经损伤和Leber遗传性视神经病变，其发病率高、预后差(参见中国专利CN 102634527 B)。受试者年龄在10—65岁，男女不限，本研究所用临床级rAAV2-ND4剂型(四川大学生物治疗国家重点实验室)为注射剂，剂量1×10¹⁰vg/0.05ml，给药途径为腔内注射，局麻下玻璃体腔注药0.05ml，单次给药，临床观察3个月，观察疗效，国际视力提高标准指南显示，视力提高0.3logMAR(15个字母)即显著提高，提高0.2logMAR(10个字母)为提高。提高0.1logMAR(5个字母)以下为未提高。视力提高0.2logMAR即为有效。

结果见表7。由结果可知，A组的疗效优于B组，其差异具有统计学差异(P＜0.05)。

表7A组与B组比较疗效比较

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分而不是全部实施例，本领域技术人员可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种重组腺相关病毒或含其的试剂盒在制备诊断制品中的用途，其特征在于，所述诊断制品用于筛查重组腺相关病毒基因治疗发生免疫反应几率。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重组腺相关病毒含报告基因。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述报告基因为荧光蛋白，优选绿色荧光蛋白GFP、深红色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或橙色荧光蛋白。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述绿色荧光蛋白GFP为增强绿色荧光蛋白EGFP、Emerald、sfGFP、超折叠GFP或ZsGreen1珊瑚分离蛋白，所述红色荧光蛋白为mCherry、mPlum或mStrawberry，所述黄色荧光蛋白为ZsYellow1、mCitrine、mVenus或YPet，所述橙色荧光蛋白为mOrange、TagRFP、mKO或dTomato。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重组腺相关病毒为rAAV2。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，将离体血清、所述重组腺相关病毒与哺乳动物细胞共培养36-60小时，优选48小时；所述哺乳动物细胞优选HEK293细胞，更优选293T细胞。

7.如权利要求1的用途，其特征在于，所述筛查为使用流式细胞术分析或RT-PCR分析。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，当所述筛查使用流式细胞术分析时，筛查的标准为：当报告基因表达量≥20％，优选≥40％时，患者发生免疫反应的几率较低；当所述筛查使用RT-PCR分析时，筛查的标准为：当报告基因相对表达值≥0.2，优选≥0.6时，患者发生免疫反应的几率较低。

9.如权利要求1-8任一项所述的用途，其特征在于，所述基因治疗的基因为Leber遗传性视神经病变相关的基因。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述Leber遗传性视神经病变相关的基因为NADH脱氢酶亚单位1、4或6基因。