KR20220133908A - 바이러스 역가를 결정하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 적절하게는 포유동물 세포 샘플로부터 생물학적 샘플의 바이러스 역가를 결정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에는 세포의 기계적 파괴를 사용한 다음 바이러스 역가를 결정하기 위한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)이 포함된다. 기계적 파괴 방법은 유리 비드의 사용을 적절하게 포함한다.

Description

바이러스 역가를 결정하는 방법
본 개시내용은 적절하게는 포유동물 세포 샘플로부터 생물학적 샘플의 바이러스 역가를 결정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에는 세포의 기계적 파괴를 사용한 다음 바이러스 역가를 결정하기 위한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)이 포함된다. 기계적 파괴 방법은 유리 비드의 사용을 적절하게 포함한다.
렌티바이러스(LV)는 세포 및 유전자 요법에서 가장 인기 있는 전달 수단 중 하나이다. 유사하게, 아데노 관련 바이러스(AAV)도 유전자 치료 매개체로서의 용도를 발견했다. 바이러스 벡터의 제조, 정제 및 응용 과정에서 정확한 감염 역가(infectious titer) 측정은 절대적으로 필요하다. 유세포 분석 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)과 같은 바이러스 역가를 측정하는 기존의 검정 방법에는 몇 가지 주요 단점이 있다. 이러한 검정의 경우, 감염 역가 측정을 위한 리포터 또는 특정 항체가 필요하다. 또한 qPCR 검정에서 프라이머, 프로브, 표준물질을 검정에 투입하기 전에 최적화해야 하는 번거로운 과정이 있다.
액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)은 표준 곡선을 사용하지 않고 관심 유전자의 절대 복제 수를 정량화하는 신뢰할 수 있는 최첨단 기술로 부상했다. LV의 RNA 게놈은 숙주 염색체에 통합되기 전에 먼저 cDNA로 역전사된다. 따라서 ddPCR을 사용하여 표적 세포의 염색체에 이식유전자의 통합 빈도를 측정함으로써 LV의 감염 역가를 결정할 수 있다. AAV 바이러스 벡터는 ddPCR을 사용하여 측정할 수도 있다. 그러나, ddPCR에 의해 바이러스 역가를 결정하는 현재 방법은 바이러스로 형질도입된 다수의 세포에서 염색체 DNA를 추출하는 것을 포함하는, 지루한 게놈 DNA 분리 과정으로 인해 속도가 제한적이다.
따라서 ddPCR 응용을 위한 샘플 준비 중에 게놈 DNA 추출을 제거하고 잠재적으로 오염될 수 있는 다양한 완충액 및 용액의 사용이 제거되는 고처리량 방법이 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 바이러스로 형질도입된 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플의 바이러스 형질도입된 세포를 기계적으로 파괴하는 단계; 파괴된 바이러스로 형질도입된 세포로부터 제거된 핵산 분자에 대해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 수행하는 단계; 및 바이러스 역가를 계산하는 단계를 포함한다.
추가 구현예에서, 생물학적 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 본질적으로: 바이러스로 형질도입된 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 유리 비드로 생물학적 샘플의 바이러스 형질도입된 세포를 기계적으로 파괴하는 단계; 파괴된 바이러스로 형질도입된 세포로부터 제거된 핵산 분자에 대해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 수행하는 단계; 및 바이러스 역가를 계산하는 단계를 포함한다.
도 1은 본 명세서에 기재된 바와 같은 3가지 방법 간의 렌티바이러스 역가 비교를 나타낸다.
청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는(comprising)"이라는 용어와 함께 사용될 때 "a" 또는 "an"이라는 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상(one or more)", "적어도 하나(least one)" 및 "하나 이상(one or more than one)"의 의미와도 일치한다.
본 출원 전체에서, 용어 "약(about)"은 값이 값을 결정하기 위해 사용되는 방법/장치에 대한 고유한 오차 변동을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다. 전형적으로, 이 용어는 상황에 따라 대략 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 미만의 가변성을 포함하는 것을 의미한다.
청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은 대안(alternatives) 만을 언급하거나 대안이 상호 배타적임을 명시적으로 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용되지만, 본 개시내용은 단지 대안으로 그리고 "및/또는"을 지칭하는 정의를 나타낸다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"(및 "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"와 같은 포함의 임의의 형태), "가지는(having)"(및 "가진다(have)" 및 "가진다(has)"와 같은 갖음의 임의의 형태), "포함하는(including)"(및 "포함한다(includes)" 및 "포함한다(include)"와 같은 포함의 임의의 형태) 또는 "함유하는(containing)"(및 "함유한다(contains)" 및 "함유한다(contain)"와 같은 함유의 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방형이며, 추가, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본 발명의 임의의 방법, 시스템, 숙주 세포, 발현 벡터 및/또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물, 시스템, 세포 및/또는 핵산을 사용하여 본원에 기재된 임의의 방법을 달성할 수 있다.
본원에 사용된 "핵산", "핵산 분자" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 공유 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 중합체 화합물을 의미한다. "핵산"이라는 용어는 폴리리보핵산(RNA) 및 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하며, 둘 다 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA에는 상보적 DNA(cDNA), 게놈 DNA, 플라스미드 또는 벡터 DNA, 합성 DNA가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. RNA는 mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, microRNA, miRNA 또는 MIRNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "유전자"는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드의 어셈블리를 말하며, cDNA 및 게놈 DNA 핵산 분자를 포함한다. "유전자"는 또한 코딩 서열 앞(5' 비코딩 서열) 및 뒤(3' 비코딩 서열) 조절 서열로서 작용할 수 있는 핵산 단편을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전자는 다수의 카피와 통합된다. 일부 구현예에서, 유전자는 미리 정의된 복제 수로 통합된다.
바이러스 역가를 결정하는 방법
예시적인 구현예에서, 생물학적 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 사용된 "바이러스 역가"는 일반적으로 밀리리터(mL)당 바이러스 입자, 형질도입 단위 또는 감염 입자로 표현되는, 주어진 부피에서 바이러스 양의 수치적 표현을 지칭한다. 따라서, 바이러스 역가를 결정하는 본원에 기술된 방법은 단순히 정성적 측정이 아니라 바이러스 입자의 실제 수를 결정한다는 점에서 정량적이다.
본원에 사용된 "생물학적 샘플"은 바이러스 벡터를 함유할 수 있는 세포 또는 조직의 용액 또는 현탁액, 또는 재구성 전에 건조된 용액 또는 현탁액을 지칭한다. 적합하게는, 생물학적 샘플은 적어도 하나의 바이러스 형질도입된 세포를 함유하는 세포 용액이다.
본원에 사용된 "바이러스로 형질도입된 세포"는 바이러스 벡터가 일시적으로 삽입된(게놈에 통합되지 않고 삽입됨) 또는 게놈적으로 통합된(세포의 게놈으로 삽입된) 세포이다. 본원에 사용된 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 핵산 분자가 세포에서 부착된 핵산 분자의 복제 및/또는 발현을 야기하기 위해 부착될 수 있는 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 코스미드와 같은 복제물이다. "벡터"는 에피솜(예를 들어, 플라스미드) 및 비-에피솜 벡터를 포함한다. 용어 "벡터"는 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 핵산 분자를 세포 내로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 수단 모두를 포함한다. 벡터라는 용어는 합성 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 형질감염, 형질도입, 세포 융합 및 리포펙션을 포함하나 이에 제한되지 않는 잘 알려진 방법에 의해 원하는 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 프로모터를 비롯한 다양한 조절 요소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "형질도입"은 벡터를 포함하는 외인성 핵산 분자를 세포로 도입하는 것을 의미하며, 형질감염(예: 지질 또는 중합체 기반 담체의 사용, 기계적 형질감염, 전기천공법) 및 바이러스 형질도입을 포함한다. "형질감염된" 세포는 세포 내부의 외인성 핵산 분자를 포함하고 "형질전환된" 세포는 세포 내의 외인성 핵산 분자가 세포에서 표현형 변화를 유도하는 세포이다. 형질감염된 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 DNA에 통합될 수 있고/있거나 세포에 의해 일시적으로 또는 장기간 동안 염색체외(일시적으로)에 유지될 수 있다. 외인성 핵산 분자 또는 단편을 발현하는 숙주 세포 또는 유기체는 "재조합", "형질전환된" 또는 "유전자이식" 유기체로 지칭된다. 다수의 형질감염 기술이 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Graham 등, Virology, 52:456 (1973); Sambrook 등, Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989); Davis 등, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); 및 Chu 등, Gene 13:197 (1981)을 참조하며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 적합하게는, 포유동물 세포의 하나 이상의 벡터로의 형질감염 은 핵산을 숙주 세포의 게놈 DNA에 통합하기 위해 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 다양한 지질 및 중합체를 포함하는 다른 적합한 제제와 같은 형질감염제를 이용한다.
바이러스 역가를 결정하는 방법은 바이러스로 형질도입된 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 것을 포함한다. 생물학적 샘플은 실험실 설정, 대규모 배치 프로세스 또는 기타 적절한 설정에서 얻을 수 있으며 본원에 기술된 대로 준비된 다음 측정되는 샘플뿐만 아니라 다른 설정 또는 영역에서 준비되고, 저장되고 잠재적으로 출하되고(shipped) 그 다음 본원에서 기술된 방법을 사용하여 측정되는 생물학적 샘플도 포함된다.
방법은 생물학적 샘플의 바이러스 형질도입된 세포를 기계적으로 파괴하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "기계적으로 파괴하는" 또는 "기계적으로 파괴하는"은 생물학적 샘플에 힘을 가하는 것을 의미하며, 이는 샘플에 고유하지 않고 그 안에 함유된 세포를 파괴하거나 용해하는 데 효율적이다. 기계적 파괴 기술의 예로는 유리 비드를 사용한 파괴, 초음파 처리(초음파 수조뿐만 아니라 초음파 처리 팁/프로브 또는 초음파 팁/프로브 사용 포함), 고전력 볼텍싱(vortexing) 또는 혼합, 유리 또는 플라스틱 플레이트를 통한 전단력 적용, 그라인딩, 블렌딩, 기계적 균질화기 등의 사용을 포함한다.
적합한 구현예에서, 기계적 파괴는 유리 비드와의 파괴를 통해 발생한다. 이러한 방법에서, 바이러스로 형질도입된 세포를 포함하는 생물학적 샘플은 유리 비드 용액과 접촉되고, 약 1분 동안 볼텍싱된 다음, 각각 약 1분 동안 3-5회 추가로 볼텍싱된다. 추가 시간 및 와류 반복 횟수도 사용할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 유리 비드는 COLE-PARMER®(Vernon Hills, IL)로부터의 실리카 비드를 포함하고, 적합하게는 약 100 μm 내지 1 mm, 더 적합하게는 약 100 μm, 약 500 μm, 또는 약 1mm 비드를 갖는다. 지르코늄 비드와 같은 다른 재료 비드도 사용할 수 있다. 생물학적 샘플에 사용하기 전에, 유리 비드를 산성 용액(예: HCl)에 적절하게 담그고 탈이온수로 잘 헹군 다음 150℃ 이상에서 12-24시간 동안 구워 완전히 건조시킨다. 그런 다음 사용하기 전에 비드를 4℃ 또는 얼음 위에서 약 30분 이상 식혀서 완전히 냉각시킨다. 사전 처리된 비드를 구입하고 적절하게는 뉴클레아제가 없는 경우에는 산 세척 및 열처리도 제거할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 방법은 생물학적 샘플의 바이러스 형질도입된 세포를 세제 또는 용해 완충액으로 용해시키는 것을 적절하게 배제한다. 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 세제 및 용해 완충액의 사용은 필요하지 않으며, 이를 제거함으로써 비용, 샘플 준비 및 분석 시간을 모두 줄일 수 있고, 부산물, 원치 않는 잔해 또는 박테리아로 인한 오염뿐만 아니라 완충액에서 잠재적인 뉴클레아제를 감소시키거나 제거할 수 있다.
바이러스로 형질도입된 세포의 기계적 파괴에 이어, 파괴된 세포로부터 제거된 핵산 분자에 대해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)이 수행된다. 본원에 사용된 바와 같이, 핵산 분자는 용해 또는 파괴되는 세포의 작용에 의해 단순히 파괴된 세포로부터 "제거"된다. 적절하게는, DNA를 포함하는 핵산 분자를 파괴된 세포로부터 분리하기 위해 추가 작업이 필요하지 않으며 조 용해물(파괴물)을 ddPCR 검정에 직접 적용한다. 본원에 기술된 바와 같이, ddPCR은 물-오일 에멀젼 액적 기술을 기반으로 하는 디지털 PCR을 수행한다. 샘플은 20,000개의 액적으로 분할되고 각 개별 액적에서 템플릿 분자(DNA)의 PCR 증폭이 발생한다. ddPCR 기술은 대부분의 표준 TaqMan 프로브 기반 검정에 사용되는 것과 유사한 시약 및 워크플로를 사용한다. 예시적인 ddPCR 분석 키트 및 검정은 예를 들어 BIO- RAD® (Hercules, CA) 에서 쉽게 입수할 수 있다. 구현예에서, ddPCR 전에 세포를 계수하는 추가 단계가 포함될 수 있다. 바이러스 역가를 결정하기 위해 ddPCR을 수행하는 방법은 예를 들어 Dobnik 등, "Accurate Quantification and Characterization of Adeno-Associated Viral Vectors," Frontiers in Microbiology 10: Article 1570 (2019); 및 Abachin 등, "Comparison of reverse-transcriptase qPCR and droplet digital PCR for the quantification of dengue virus nucleic acid," Biologicals 52:49-54 (2018)에서 찾아볼 수 있으며, 각각의 개시내용은 특히 본원에 개시된 ddPCR 방법에 대해 본 명세서에 참조로 포함된다.
그 다음 ddPCR 분석을 기반으로 바이러스 역가가 계산된다. 바이러스 역가의 계산은 ddPCR 분석 및 결과 출력에서 쉽게 수행된다. ddPCR로부터 감염성 바이러스 역가는 공식 TU/mL = F x C x D/V를 사용하여 계산될 수 있으며, 여기서 TU/mL는 형질도입 단위/mL이고, F는 형질도입된 세포의 분획이고, C는 형질도입 시 검정에 투입된 세포 수이고, D는 바이러스 접종물의 희석 배수이고, V는 검정에 투입된 바이러스 접종물의 부피(mL)이다.
예를 들어, 접종 시 1,000개의 세포가 접종된 분석에서 세포의 20%가 형질도입된 것으로 확인되었다고 가정한다. 바이러스를 분석에 넣기 전에 100배 희석 하고 0.1mL를 분석에 넣었습니다. 그런 다음 TU/mL = 20 x 0.01 x 1,000 x 100 / 0.1 = 2.0E+05이다. 형질도입된 세포의 분획(F)을 찾기 위해 ddPCR 결과에서 측정된 염색체에 통합된 바이러스 게놈의 총 카피 수를 수확 시점의 총 세포 수로 나눕니다.
본원에 기재된 바와 같이, 적합하게는 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스로 형질도입된 세포는 포유동물 세포이다. 본원에 사용된 용어 "포유류 세포"는 예를 들어 인간 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포 등과 같은 포유류 목의 임의의 구성원으로부터의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 마우스 세포, 인간 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHOK1 세포, CHO-DXB11 세포, CHO-DG44 세포, 모든 변이체를 포함하는 CHOK1SV 세포 (예: POTELLIGENT®, Lonza, Slough, UK), 모든 변이체를 포함하는 CHOK1SV GS-KO (글루타민 합성효소 녹아웃) 세포 (예: XCEED™ Lonza, Slough, UK)이다. 예시적인 인간 세포는 HEK293, HeLa 세포 또는 HT1080 세포와 같은 인간 배아 신장(HEK) 세포를 포함한다.
포유동물 세포는 부착 배양물 또는 현탁 배양물일 수 있는 포유동물 세포 배양물을 포함한다. 부착성 배양물은 기질 표면, 예를 들어 플라스틱 플레이트, 접시 또는 기타 적절한 세포 배양물 성장 플랫폼에서 성장하는 세포를 말하며 앵커리지(anchorage)에 따라 달라질 수 있다. 현탁 배양은 가스 및 영양소 교환을 위한 넓은 표면적을 허용하는, 예를 들어 배양 플라스크 또는 대형 현탁 수조(vat)에서 유지될 수 있는 세포를 의미한다. 현탁액 세포 배양은 종종 적절한 혼합을 제공하기 위해 교반(stirring) 또는 교반(agitation) 메커니즘을 사용한다. 세포를 현탁액에 유지하기 위한 배지 및 조건은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 현탁 세포 배양은 인간 HEK293 클론 세포를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 제공된 방법을 사용하여 결정될 수 있는 예시적인 바이러스 벡터 역가는 렌티바이러스 바이러스 역가 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 바이러스 역가 뿐만 아니라 다른 바이러스 벡터 역가를 포함한다.
렌티바이러스 벡터(LV)는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1)를 기반으로 하는 잘 연구된 벡터 시스템이다. HIV-2 유인원 면역결핍 바이러스, 비영장류 렌티바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 소 면역결핍 바이러스 등을 포함한 다른 렌티바이러스 시스템도 유전자 전달 시스템으로 개발되었다. 임상 및 연구 개발 목적으로 가장 널리 사용되는 렌티바이러스 시스템은 다음을 나타내는 4개 플라스미드 시스템을 기반으로 한다:
1) 렌티바이러스 그룹 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 중합효소(POL) 단백질
2) 외피(Envelope) 단백질(보통 수포성 체세포염 바이러스 당단백질(VSV-G))
3) 비리온 단백질 (Rev) 단백질 발현의 HIV 조절인자; 및
4) 관심 유전자(GOI)를 포함하는 전달 벡터(TV)
렌티바이러스 벡터는 일반적으로 면역결핍 및 신경퇴행성 질환을 비롯한 요법 및 질환 치료를 위해 원하는 세포에 도입되는 관심 유전자로 생산된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아데노 관련 바이러스(AAV)"는 파보바이러스(Parvoviridae) 과(family) 및 디펜도파보바이러스(Dependoparvovirus) 속(genus)의 단일 가닥 DNA를 함유하는 작은 크기의 복제-결함 비외피성 바이러스를 지칭한다. 지금까지 10개 초과의 아데노 관련 바이러스 혈청형이 확인되었으며 혈청형 AAV2가 가장 잘 특성화되었다. AAV 혈청형의 다른 비제한적 예는 ANC80, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 및 AAV11이다. 이러한 혈청형 외에도 AAV 유사형(pseudotype)이 개발되었다. AAV 유사형은 제1 혈청형의 캡시드 및 제2 혈청형의 게놈을 함유한다(예를 들어, 유사형 AAV2/5는 혈청형 AAV2의 게놈 및 AAV5의 캡시드를 갖는 AAV에 상응할 것이다).
본원에 언급된 바와 같이, 용어 "아데노바이러스"는 아데노바이러스과의 이중 가닥 DNA를 함유하는 20면체(icosahedral) 뉴클레오캡시드를 갖는 외피가 없는 바이러스를 지칭한다. 50개 초과의 아데노바이러스 아형이 인간에서 분리되었으며 많은 추가 아형이 다른 포유류와 조류에서 분리되었다. 조류. 예를 들어, Ishibashi 등, "Adenoviruses of animals," In The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, N.Y., pp. 497-562 (1984); Strauss, "Adenovirus infections in humans," In The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, N.Y., pp. 451-596 (1984)를 참조한다. 이들 아형은 아데노바이러스과에 속하며, 현재 두 가지 속 즉, 마스타데노바이러스(Mastadenovirus)와 아비아데노바이러스(Aviadenovirus)로 나뉜다. 모든 아데노바이러스는 형태학적으로 그리고 구조적으로 유사하다. 그러나 인간에서 아데노바이러스는 다양한 면역학적 특성을 나타내므로 혈청형으로 나뉜다. 아데노바이러스의 두 가지 인간 혈청형, 즉 AV2 및 AV5가 집중적으로 연구되어 아데노바이러스에 대한 대부분의 일반 정보가 제공되었다.
추가 구현예에서, 생물학적 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 본질적으로 바이러스로 형질도입된 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 유리 비드로 생물학적 샘플의 바이러스로 형질도입된 세포를 기계적으로 파괴하는 단계; 파괴된 바이러스로 형질도입된 세포로부터 제거된 핵산 분자에 대해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 수행하는 단계; 및 바이러스 역가를 계산하는 단계로 구성된다.
인용된 단계로 "본질적으로 이루어진" 본원에 기재된 방법은 용해 완충액, 세제, 또는 세제 단계 또는 용해 단계를 사용하는 단계를 제외하고, 이러한 단계는 본질적으로 인용된 단계로 구성된 방법에 대한 물질적 변경으로 간주되고 따라서 이러한 방법에서 구체적으로 제외된다. 적합하게는, 컬럼 정제 단계는 또한 본질적으로 인용된 단계로 구성된 방법에서 제외된다.
본원에 기술된 방법을 사용하여 측정할 수 있는 바이러스로 형질도입된 세포를 생산하는 방법은 교반 탱크, 에어리프트, 섬유, 극세사, 중공사, 세라믹 매트릭스, 유동층, 고정층 및/또는 분출층(spouted bed) 생물반응기를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 반응기(들)에서 생산될 수 있다. 본원에 사용된 "반응기"는 발효기 또는 발효 유닛, 또는 임의의 다른 반응 용기를 포함할 수 있고 용어 "반응기"는 "발효기"와 상호교환적으로 사용된다. 발효기 또는 발효라는 용어는 미생물 및 포유류 배양물을 모두 나타낸다. 예를 들어, 일부 측면에서, 예시적인 생물반응기 유닛은 다음 중 하나 이상 또는 모두를 수행할 수 있다: 영양소 및/또는 탄소원의 공급, 적합한 가스(예: 산소)의 주입, 발효의 유입구 및 유출구 흐름 또는 세포 배양 배지, 기체 및 액체상 분리, 온도 유지, 산소 및 CO2 수준 유지, pH 수준 유지, 교반(agitation)(예: 교반(stirring)) 및/또는 세척/멸균. 발효 유닛과 같은 예시적인 반응기 유닛은 유닛 내에 다중 반응기를 포함할 수 있으며, 예를 들어 유닛은 각 유닛에서 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 이상의 생물 반응기를 가질 수 있고/있거나 시설(facility)은 시설 내에 단일 또는 다중 반응기가 있는 다중 유닛을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 생물반응기는 배치(batch), 반 유가(semi fed-batch), 유가, 관류 및/또는 연속 발효 공정에 적합할 수 있다. 임의의 적합한 반응기 직경을 사용할 수 있다. 구현예에서, 생물반응기는 약 100mL 내지 약 50,000L의 부피를 가질 수 있다. 비제한적인 예는 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터, 및/또는 50,000 리터의 부피를 포함한다. 또한, 적합한 반응기는 다용도, 일회용(single-use), 일회용(disposable) 또는 비일회용일 수 있고 스테인리스 강(예: 316L 또는 임의의 다른 적합한 스테인리스강) 및 Inconel, 플라스틱 및/또는 유리와 같은 금속 합금을 비롯한 임의의 적합한 재료로 형성될 수 있다.
추가적인 예시적인 구현예
구현예 1은 생물학적 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법으로서, 바이러스로 형질도입된 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플의 바이러스 형질도입된 세포를 기계적으로 파괴하는 단계; 파괴된 바이러스로 형질도입된 세포로부터 제거된 핵산 분자에 대해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 수행하는 단계; 및 바이러스 역가를 계산하는 단계를 포함한다.
구현예 2는 구현예 1의 방법을 포함하며, 여기서 상기 방법은 세제 또는 용해 완충제로 바이러스 형질도입된 세포를 용해시키는 것을 포함하지 않는다.
구체예 3은 구체예 1 또는 2의 방법을 포함하며, 여기서 기계적으로 파괴하는 것은 유리 비드에 의한 파괴를 포함한다.
구체예 4는 구체예 1 또는 2의 방법을 포함하며, 여기서 기계적으로 파괴하는 것은 초음파 처리를 포함한다.
구현예 5는 구현예 1-4 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스로 형질도입된 세포는 포유동물 세포이다.
예 6은 구체예 5의 방법을 포함하며, 여기서 포유동물 세포는 인간 세포이다.
구현예 7은 구현예 6의 방법을 포함하며, 여기서 인간 세포는 인간 배아 신장(HEK) 세포이다.
구현예 8은 구현예 7의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스 역가는 아데노-연관 바이러스(AAV) 바이러스 역가이다.
구현예 9는 구현예 7의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스 역가는 렌티바이러스 바이러스 역가이다.
구현예 10은 구현예 5의 방법을 포함하며, 여기서 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
구현예 11은 구현예 10의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스 역가는 아데노-연관 바이러스(AAV) 바이러스 역가이다.
구현예 12는 구현예 10의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스 역가는 렌티바이러스 바이러스 역가이다.
구체예 13은 생물학적 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법으로서, 본질적으로 다음으로 구성된다: 바이러스로 형질도입된 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 획득하는 단계; 유리 비드로 생물학적 샘플의 바이러스 형질도입된 세포를 기계적으로 파괴하는 단계; 파괴된 바이러스로 형질도입된 세포로부터 제거된 핵산 분자에 대해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 수행하는 단계; 및 바이러스 역가를 계산하는 단계를 포함한다.
구현예 14는 구현예 13의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스 형질도입된 세포는 포유동물 세포이다.
구체예 15는 구체예 14의 방법을 포함하며, 여기서 포유동물 세포는 인간 세포이다.
구현예 16은 구현예 15의 방법을 포함하며, 여기서 인간 세포는 인간 배아 신장(HEK) 세포이다.
구현예 17은 구현예 16의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스 역가는 아데노-연관 바이러스(AAV) 바이러스 역가이다.
구현예 18은 구현예 16의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스 역가는 렌티바이러스 바이러스 역가이다.
구현예 19는 구현예 14의 방법을 포함하며, 여기서 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
구현예 20은 구현예 19의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스 역가는 아데노-연관 바이러스(AAV) 바이러스 역가이다.
구현예 21은 구현예 19의 방법을 포함하며, 여기서 바이러스 역가는 렌티바이러스 바이러스 역가이다.
실시예
실시예 1: 바이러스 역가 결정을 위한 고처리량 포맷
일반적으로 세제 매개 세포 용해 및 이후 DNA의 컬럼 정제를 포함하는 지루한 DNA 추출 과정을 피하기 위해, 유리 비드를 사용하여 세포를 기계적으로 파괴한다.
녹색 형광 단백질인 GFP를 인코딩하는 렌티바이러스(LV)로 형질도입된 세포로부터 제조된 조 용해물을 ddPCR 검정에 직접 적용했다. 이 접근 방식을 기존 방법과 비교하고 검증하기 위해 Qiagen의 상용 키트(QIAamp DNA Blood Mini Kit)를 사용하여 LV 형질도입된 세포에서 DNA도 분리하였다. LV의 긴 말단 반복부(LTR) 영역과 숙주의 베타-액틴 서열에 특이적인 프라이머-프로브 세트를 사용하여 표적 서열을 증폭시켰다. 감염 역가를 계산하기 위해, 다음 세 가지 방법을 비교했다:
1. ddPCR을 위한 샘플 DNA는 Qiagen 키트를 사용하여 분리되었다. 상응하는 샘플의 세포 수는 LV 역가가 보정된 것을 기반으로 동일한 샘플의 베타-액틴의 복제 수로부터 계산되었다.
2. ddPCR을 위한 샘플 DNA는 Qiagen 키트를 사용하여 분리되었다. RNase A는 임의의 세포 RNA를 제거하기 위해 분리 절차 중에 포함되었다. 상응하는 샘플의 세포 수는 LV 역가가 보정된 것에 기초하여 동일한 샘플의 DNA 양으로부터 계산되었다.
3. 유리 비드를 사용하여 세포를 파괴하여 조 세포 용해물을 제조하고 ddPCR에 직접 적용하였다. LV 역가를 보정하는 것을 기반으로 ViCell을 사용하여 해당 샘플의 세포 수를 세포 파괴 전에 직접 계산하였다.
6-웰 배양 플레이트의 세포를 LV-GFP로 형질도입하고 위의 세 가지 다른 방법으로 처리하였다. 각 방법에 대해 ddPCR을 위한 3개의 샘플을 준비하였다. 이들 샘플로부터의 LV 역가를 계산하고 형질도입 단위(TU)/mL로서 도 1에 제시한다. 아래의 표 1은 통계적 분석을 통해 그 결과를 요약한 것이다.
표 1: 바이러스 역가 계산 요약
Figure pct00001
세 가지 다른 방법에서 계산된 감염성 LV 역가는 테스트한 3개의 샘플에 대해 서로 비슷하며, 이는 비드 파괴에 의해 준비된 조 세포 용해물이 직접 ddPCR 적용에 충분함을 나타낸다. 또한 세 번째 방법(비드 파괴 - 세포 수)의 변동 계수(CV)가 다른 방법보다 현저히 작아(8.2%) 더 일관되고 재현 가능함을 나타낸다.
본 명세서에 기술된 방법 및 응용에 대한 다른 적절한 수정 및 개조가 임의의 실시예의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
특정 실시예가 본원에 예시되고 설명되었지만, 청구범위는 설명되고 도시된 부품의 특정 형태 또는 배열로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에는 예시적인 실시예가 개시되어 있으며, 특정한 용어가 사용되었지만, 이들은 단지 일반적이고 설명적인 의미로 사용되며 제한을 위한 것은 아니다. 상기 교시에 비추어 실시예의 수정 및 변형이 가능하다. 따라서 실시예는 구체적으로 설명된 것과는 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 여기에 참조로 포함된다.

Claims (21)

  1. 생물학적 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법으로서,
    a. 바이러스로 형질도입된 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 획득하는 단계;
    b. 상기 생물학적 샘플의 바이러스 형질도입된 세포를 기계적으로 파괴하는 단계;
    c. 상기 파괴된 바이러스로 형질도입된 세포로부터 제거된 핵산 분자에 대해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 수행하는 단계; 및
    d. 바이러스 역가를 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스로 형질도입된 세포를 세제 또는 용해 완충액으로 용해시키는 단계를 포함하지 않는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기계적으로 파괴하는 단계가 유리 비드에 의한 파괴를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기계적으로 파괴하는 단계가 초음파 처리를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스로 형질도입된 세포가 포유동물 세포인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 인간 세포인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인간 세포가 인간 배아 신장(HEK) 세포인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 아데노-연관 바이러스(AAV) 바이러스 역가인, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 렌티바이러스 바이러스 역가인, 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 아데노-연관 바이러스(AAV) 바이러스 역가인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 렌티바이러스 바이러스 역가인, 방법.
  13. 본질적으로 다음으로 구성된 생물학적 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법:
    a. 바이러스로 형질도입된 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 획득하는 단계;
    b. 유리 비드로 생물학적 샘플의 바이러스로 형질도입된 세포를 기계적으로 파괴하는 단계;
    c. 상기 파괴된 바이러스로 형질도입된 세포로부터 제거된 핵산 분자에 대해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 수행하는 단계; 및
    d. 바이러스 역가를 계산하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 바이러스로 형질도입된 세포가 포유동물 세포인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 인간 세포인, 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 인간 세포가 인간 배아 신장(HEK) 세포인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 아데노-연관 바이러스(AAV) 바이러스 역가인, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 렌티바이러스 바이러스 역가인, 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 아데노-연관 바이러스(AAV) 바이러스 역가인, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 렌티바이러스 바이러스 역가인, 방법.
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