KR20220047635A - 렌티바이러스 벡터의 생산을 위한 방법 및 작제물 - Google Patents

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영 신
아난디타 세스
빙난 구
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Abstract

본 개시는 렌티바이러스 벡터-생산 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 4개가 아닌 2개의 플라스미드를 이용하여, 필요한 패키징 요소를 제공하고 벡터를 세포로 전달하여, 현탁액-기반 세포를 포함하는 다수의 렌티바이러스 생산자 세포의 생산 및 다량의 렌티바이러스의 생산을 허용한다. 이러한 방법은 나중에 렌티바이러스를 생산하도록 유도되고 특정의 관심 유전자를 포함하도록 맞춤화될 수 있는 세포의 생산을 허용한다.

Description

렌티바이러스 벡터의 생산을 위한 방법 및 작제물
발명의 분야
본 개시는 렌티바이러스 벡터-생산 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 4개가 아닌 2개의 플라스미드를 활용하여, 필요한 패키징 요소를 제공하고 벡터를 세포로 전달하여, 현탁액-기반 세포를 포함하는 다수의 렌티바이러스 생산자 세포의 생산 및 다량의 렌티바이러스의 생산을 허용한다. 이러한 방법은 나중에 렌티바이러스를 생산하도록 유도될 수 있는 세포의 생산을 허용하고, 특정한 관심 유전자를 포함하도록 맞춤화될 수 있다.
발명의 배경
렌티바이러스 벡터는 유전자 및 세포 치료 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 전달 방법 중 하나이다. 렌티바이러스 벡터의 생산 과정에서, 상기 벡터의 생산에 필요한 서열을 여러 개의 상이한 플라스미드 또는 발현 카세트(expression cassettes)로 나누어 복제-적격 렌티바이러스(replication-competent lentiviruse)(RCL)의 유인을 최소화한다. 일반적으로, 3세대 렌티바이러스 생산 시스템은 다음을 발현하는 4개의 별개의 플라스미드 또는 발현 카세트를 활용한다:
1) 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 단백질;
2) 외피 단백질 (일반적으로 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G));
3) 비리온 단백질 (Rev) 단백질의 발현 HIV 조절자(regulator); 및
4) 관심 유전자 (GOI)를 함유하는 전달 벡터 (TV).
가장 일반적인 접근법에서, 상기 4개의 플라스미드를 일시적으로 세포 내로 형질감염시켜 렌티바이러스 벡터를 생성하는데, 이는 노동-집약적이고 비용이 많이 든다. 또한, 일시적 형질감염은 많은 양의 플라스미드 DNA를 필요로 하기 때문에 확장성에 제한이 있으며, 이는 또한 안전성에 대한 우려를 제기한다.
일시적 형질감염과 관련된 어려움을 극복하기 위해 필요한 것은, 상기 렌티바이러스 벡터 생산에 필요한 유전자 또는 서열의 전부 또는 대부분이 포유동물 세포의 염색체에 안정적으로 통합되어, 간단한 유도 방법으로 렌티바이러스 벡터를 생산할 수 있는 생산자 세포주 (PCL)의 제조 방법이다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하는 방법으로서, 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자의 발현의 렌티바이러스 조절자; 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및 제3 프로모터의 제어 하에 있는 둘 모두의 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자가 여기서, 상기 발현 카세트는 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부(transposon-specific inverted terminal repeat) (ITR)에 의해 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹(flanked)되는 단계를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 패키징 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계, 및 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 단리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
또한, 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 생산하는 방법으로서, 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자의 발현의 렌티바이러스 조절자; 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및 제3 프로모터의 제어 하에 있는 둘 모두의 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자, 여기서 상기 발현 카세트는 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 상기 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는 단계를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 패키징 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; 및 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전달 벡터, 여기서 상기 핵산 서열은 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 상기 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는 단계; 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 단리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라, 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하는 단계; 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전달 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; 상기 발현 카세트 및 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계; 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라, 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 생산하는 단계, 상기 발현 카세트 및 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계, 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
추가적인 구현예에서, 렌티바이러스 벡터를 사용한 치료 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 생산된 상기 렌티바이러스 벡터를 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
추가 구현예에서, 본원에는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 포유동물 세포가 제공되며, 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자의 발현의 렌티바이러스 조절자를 포함하는 상기 포유동물 세포에 염색체적으로 통합된 핵산 분자; 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및 둘 모두 제3 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자, 여기서 상기 핵산 서열은 상기 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)의 재조합으로 생성된 서열이 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는 단계를 포함한다.
또한, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 제4 프로모터 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열 포함하는 전달 벡터로 본원에 기재된 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; 상기 발현 카세트 및 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계; 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
추가 구현예에서, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 염색체적으로 통합된 핵산 서열의 생산을 유도하는 단계 및 본원에 기재된 상기 포유동물 세포의 관심 유전자를 암호화하는 상기 염색체적으로 통합된 핵산 서열; 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따른 패키징 플라스미드를 도시한다.
도 2는 본 발명의 구현예에 따른 전달 벡터를 도시한다.
도 3a 내지 3d는 본 발명의 구현예에 따른 패키징 및 전달 벡터로 형질감염된 HEK293T 세포를 도시한다.
도 4는 본원에 기재된 예시적인 세포주를 사용한 렌티바이러스 벡터의 생산을 도시한다.
도 5는 트랜스포자제(transposase)가 있거나 없는 PEI 및 리포펙타민 형질감염에 대한 렌티바이러스 역가를 도시한다.
도 6은 단일 세포 클론 DH4의 렌티바이러스 생산성 및 안정성을 도시한다.
도 7은 단일 세포 클론 ED8의 렌티바이러스 생산성 및 안정성을 도시한다.
도 8은 카피수 분석 결과를 도시한다.
도 9는 일시적 형질감염 및 생산자 세포주를 사용하여 생산된 렌티바이러스에 대한 효능 비교를 도시한다.
도 10은 시드 트레인(Seed Train) 배양의 일부 동안 항생제가 없는 렌티바이러스 PCL에 대한 예시적인 제조 흐름을 도시한다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 때 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.
본 출원에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 값을 결정하기 위해 사용되는 방법/장치에 오류의 고유 변동을 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 전형적으로, 상기 용어는 상황에 따라 대략 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 미만의 가변성을 포함하는 것을 의미한다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은, 대안만을 지칭하는 것으로 명시적으로 지시되지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되거나 대안은 상호 배타적이지만, 본 개시는 대안만을 지칭하는 정의 및 "및/또는"을 지지한다.
본 명세서 및 청구항(들)에서 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)" (및 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은, 포함하는의 임의의 형태), "갖는" (및 "갖는다(have)" "갖는다(has)"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는(including)" (및 "포함하다(includes)" 및 "포함하다(include)"와 같은 포함하는의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유하다(contains)" 및 "함유하다(contain)"와 같은 함유하는의 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방형이고, 추가, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본 발명의 임의의 방법, 시스템, 숙주 세포, 발현 벡터, 및/또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물, 시스템, 세포, 및/또는 핵산은 본원에 기재된 임의의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "핵산", "핵산 분자" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 공유 결합된 뉴클레오티드를 포함하는 중합체 화합물을 의미한다. 용어 "핵산"은 폴리리보핵산(polyribonucleic acid) (RNA) 및 폴리디옥시리보핵산(polydeoxyribonucleic acid) (DNA)을 포함하며, 이는 둘 모두 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 상보성 DNA (cDNA), 게놈 DNA, 플라스미드 또는 벡터 DNA, 및 합성 DNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. RNA는 mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, microRNA, miRNA, 또는 MIRNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 "유전자"는 폴리펩티드를 암호화하고, cDNA 및 게놈 DNA 핵산 분자를 포함하는 뉴클레오티드의 조립체(assembly)이다. "유전자"는 코딩 서열에 선행 (5' 비-코딩 서열)하고 후행 (3' 비-코딩 서열)하는 조절 서열로서 작용할 수 있는 핵산 단편을 또한 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전자는 다중 카피와 통합된다. 일부 구현예에서, 유전자는 미리 정의된 카피 수로 통합된다.
렌티바이러스 벡터 및 이의 생산
렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus) (HIV-1)에 기초한 잘 연구된 벡터 시스템이다. HIV-2 유인원 면역결핍 바이러스, 비-영장류 렌티바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 및 소 면역결핍 바이러스 등을 포함하는 다른 렌티바이러스 시스템 또한 유전자 전달 시스템으로서 개발되었다. 인간에서 HIV-1의 병원성 성질로 인한 안전성 문제에 따라 임상 및 연구 및 개발 목적에 사용하기 위해 가장 널리 사용되는 렌티바이러스 시스템은 다음을 나타내는 4-플라스미드 시스템에 기초한다:
1) 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 단백질
2) 외피 단백질 (일반적으로 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G))
3) 비리온 단백질 (Rev) 단백질의 발현의 HIV 조절자; 및
4) 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 전달 벡터 (TV)
전통적으로, 인간 배아 신장 세포 (예를 들어, HEK293) 와 같은 포유동물 세포는 부착 세포 배양물로서 4개의 플라스미드 각각으로 형질감염시킨 다음, 관심 유전자를 함유하는 바람직한 렌티바이러스가 생산된다. 일반적으로, 일시적으로 형질감염된 이러한 세포는 렌티바이러스를 생산할 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 일반적으로 면역결핍 및 신경 퇴행성 질환을 포함하는 요법 및 질환 치료를 위해 바람직한 세포로 도입되는 관심 유전자로 생산된다.
본 발명은 렌티바이러스의 개선된 생산 방법으로서, 현탁액에서 성장할 수 있는 렌티바이러스 생산 세포주를 제조하는 방법을 포함하여 렌티바이러스의 생산량을 크게 증가시킬 수 있는 방법을 제공한다.
렌티바이러스-생산 세포주
구현예에서, 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에서 사용된 "렌티바이러스 패키징 벡터-함유 세포"는, 렌티바이러스 벡터를 생성하는데 필요한 요소를 함유하지만, 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 바람직한 관심 유전자가 결여되고, 이의 게놈 내로 통합되는, 세포를 지칭한다. 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 세포는 나중에 예를 들어, 바람직한 관심 유전자를 함유하는 전달 벡터로 형질감염시킬 수 있고, 이어서 상기 관심 유전자의 최종 전달을 위해 상기 바람직한 렌티바이러스를 생산하도록 유도될 수 있다.
적합하게는, 본원에 기재된 다양한 방법을 사용하여 생산될 수 있는 상기 세포는 포유동물 세포 및 세포주 또는 배양물이다. 본원에서 사용된 용어 "포유동물 세포"는 인간 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포 등과 같은 포유류 목의 임의의 구성원으로부터의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 마우스 세포, 인간 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, CHOK1 세포, CHO-DXB11 세포, CHO-DG44 세포, 모든 변이체를 포함하는 CHOK1SV 세포 (예를 들어, POTELLIGENT®, Lonza, Slough, UK), 모든 변이체를 포함하는 CHOK1SV GS-KO (글루타민 신테타제 녹아웃) 세포 (예를 들어, XCEED™, Lonza, Slough, UK) 이다. 예시적인 인간 세포는 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 예컨대 HEK293, HeLa 세포, 또는 HT1080 세포를 포함한다.
포유동물 세포는 부착 배양물 또는 현탁 배양물일 수 있는 포유동물 세포 배양물을 포함한다. 부착 배양물은 기질 표면, 예를 들어 플라스틱 플레이트, 접시 또는 다른 적합한 세포 배양 성장 플랫폼을 지칭하며, 고정(anchorage) 의존적일 수 있다. 현탁 배양물은 예를 들어, 배양 플라스크 또는 대형 현탁 통에서 유지될 수 있는 세포를 지칭하며, 이는 가스 및 영양소 교환을 위한 넓은 표면 면적을 허용한다. 현탁 세포 배양물은 종종 적절한 혼합을 제공하기 위해 교반(stirring) 또는 교반(agitation) 메커니즘을 활용한다. 세포를 현탁 상태로 유지하기 위한 배지 및 조건은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 현탁 세포 배양물은 인간 HEK293 클론 세포를 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 상기 방법은 발현 카세트를 포함하는 패키징 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용된, "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본원에 기재된 핵산 분자의 복제 및/또는 발현을 가져오기 위해 부착될 수 있는 예컨대, 플라스미드, 파지, 바이러스, 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다. "벡터"는 에피솜 (예를 들어, 플라스미드) 및 비-에피솜 벡터를 포함한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 내, 또는 생체 외로 세포에 핵산 분자를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 수단 모두를 포함한다. 용어 벡터는 합성 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 형질감염, 형질도입, 세포 융합, 및 리포펙션(lipofection)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 잘 알려진 방법에 의해 바람직한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 벡터는 프로모터를 포함하는 다양한 조절 요소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "형질감염"은 세포에 벡터를 포함하는, 외인성 핵산 분자의 도입을 의미한다. "형질감염된" 세포는 세포 내부에 외인성 핵산 분자를 포함하고, "형질전환된" 세포는 세포 내의 외인성 핵산 분자가 세포에서 표현형(phenotypic) 변화를 유도하는 세포이다. 상기 형질감염된 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 DNA로 통합될 수 있고/있거나 세포에 의해 일시적으로 또는 연장된 기간 동안 염색체 외로 유지될 수 있다. 외인성 핵산 분자 또는 단편을 발현하는 숙주 세포 또는 유기체는 "재조합", "형질전환된" 또는 "유전자이식(transgenic)" 유기체로 지칭된다. 다수의 형질감염 기술이 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Graham et al., Virology, 52:456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); and Chu et al., Gene 13:197 (1981) 참조. 적합하게는, 본원에 기재된 하나 이상의 벡터를 갖는 포유동물 세포의 형질감염은 숙주 세포의 게놈 DNA에 핵산을 통합하기 위해, 예컨대 폴리에틸레니민 (PEI) 또는 다양한 지질 및 중합체를 포함하는 다른 적합한 제제와 같은 형질감염제를 활용한다.
본원에서 사용된 "패키징 벡터"는 렌티바이러스 벡터를 생산하고 최종 렌티바이러스에서 관심 유전자를 "패키징"하는 데 필요한 구성요소를 함유하는 벡터를 지칭한다. 상기 패키징 벡터는 벡터의 별개의 구성요소를 지칭하는 발현 카세트를 포함하며, 형질감염된 세포에 삽입되어 궁극적으로 이에 의해 발현될 하나 이상의 유전자 및 조절 서열을 포함한다.
적합하게는, 상기 패키징 벡터에 사용되는 상기 발현 카세트는 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자의 발현의 렌티바이러스 조절자; 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및 제3 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 단일 프로모터는 각각의 REV, ENV, GAG 및 POL 유전자의 발현을 제어할 수 있거나, 하나의 프로모터는 GAG 및 POL의 발현을 제어할 수 있고, 제2 프로모터는 REV 및 ENV의 발현을 제어할 수 있다. 다른 조합 또한 가능하며 본원에 포함된다.
상기 비리온 단백질 (REV)의 발현의 렌티바이러스 조절자는 후기 유전자 발현을 촉진하는 RNA-결합 단백질이다. 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 스플라이싱되지 않은(unspliced) 또는 단일 스플라이싱된(spliced) mRNA를 핵에서 세포질로 수송하는 것 또한 중요하다.
상기 렌티바이러스 외피 (ENV) 유전자, 적합하게는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 유전자는 세포 프로테아제(cellular protease)에 의해 표면 (SU) 외피 당단백질 gp120 및 막횡단(transmembrane) (TM) 당단백질 gp41로 절단되는 폴리단백질 전구체를 암호화한다.
GAG는 스플라이싱되지 않은 mRNA에서 번역된 폴리단백질을 암호화하고, 이는 이어서 바이러스 프로테아제 (PR)에 의해 매트릭스 단백질, 캡시드 및 뉴클레오캡시드 단백질로 절단된다. 상기 렌티바이러스 폴리머라제 (POL)는 GAG mRNA 번역시 리보솜 프레임시프팅(ribosomal frameshifting)의 결과로서 GAG-POL 폴리단백질로 발현되며, 효소 단백질 역전사효소, 프로테아제 및 인테그라제(integrase)를 암호화한다. 이러한 3개의 단백질은 비리온 내의 바이러스 게놈과 연관된다. 적합하게는 상기 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고, 상기 POL 유전자는 HIV POL 유전자이다.
적합한 구현예에서, 상기 발현 카세트는 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 5' 및 3' 단부 둘 모두에서 플랭킹된다. 본원에서 상세히 기재되는 바와 같이, 상기 발현 카세트의 표적 세포의 게놈으로의 특이적 통합을 허용하는 트랜스포존 ITR (상응하는 트랜스포자제와 함께)의 사용이다.
상기 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하는 방법은 세포의 게놈으로 바람직한 핵산 (즉, 발현 카세트)의 통합을 허용하기 위해 형질감염된 포유동물 세포를 배양한 후, 상기 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 세포의 성장 및 세포의 게놈으로의 작제물의 통합을 촉진하기 위한 다양한 세포 배양 배지, 적절한 기체 농도/교환 및 온도 제어의 사용을 포함한다.
상기 바람직한 세포를 단리하는 방법은 체, 필터 장치, 세포-선택 장치 및 분류, 세포 계수 등의 사용을 포함하는 다양한 여과 기술을 포함한다.
본원에 언급된 바와 같이, 상기 발현 카세트의 각각의 구성요소는 상기 프로모터의 제어 하에 있다. 본원에서 사용된 "제어 하에 있는"은 "프로모터", "프로모터 서열" 또는 "프로모터 영역"에 의해 조절되는 유전자를 지칭하며, 이는 RNA 폴리머라제에 결합하고 다운스트림(downstream) 코딩 또는 비-코딩 유전자 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역/서열을 지칭한다. 다시 말해서, 상기 프로모터 및 상기 유전자는 작동 가능한 조합이거나 작동 가능하게 연결된다. 본원에서 언급된 용어 "작동 가능한 조합으로", "작동 가능한 순서로" 및 "작동 가능하게 연결된"은 주어진 유전자의 전사 및/또는 바람직한 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 프로모터가 생산되는 방식으로 핵산 서열들의 연결을 지칭한다. 용어는 또한, 기능성 단백질이 생산되는 방식으로 아미노산 서열의 연결을 지칭한다.
본 개시의 일부 실시예에서, 상기 프로모터 서열은 전사 개시 부위를 포함하고, 업스트림(upstream)으로 연장되어 배경 위에서 검출 가능한 수준에서 전사를 개시하는 데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터 서열은 전사 개시 부위, 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인을 포함한다. 진핵생물(eukaryotic) 프로모터는 항상 그런 것은 아니지만, 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 함유할 것이다. 유도성 프로모터를 포함하는 다양한 프로모터는 예를 들어, 본 개시의 숙주 세포 또는 벡터에서 유전자 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 누출 프로모터(leaky promoter)가 아니며, 즉, 상기 프로모터는 본원에 기재된 임의의 유전자 생성물을 구성적으로 발현하지 않는다. 다른 구현예에서 본원에 기재된 바와 같이, 상기 프로모터는 구성적 프로모터이고, 이는 외부 조절의 영향과 무관하게 mRNA 합성을 개시한다.
적합하게는, 상기 발현 카세트에서 다양한 유전자의 전사를 제어하기 위해 사용되는 상기 프로모터는 탈억제성(derepressible) 프로모터이다. 본원에서, "탈억제성 프로모터"는 기능적 프로모터 및 상기 기능적 프로모터의 억제를 유발하기 위해 억제자 요소(repressor element)에 결합할 수 있는 추가 요소 또는 서열을 포함하는 구조를 지칭한다. "억제"는 프로모터에 의한 다운스트림 코딩 또는 비-코딩 유전자 서열의 전사의 개시의 감소 또는 억제를 지칭한다. "억제자 요소"는 프로모터 (또는 프로모터 근처)에 결합하여 상기 프로모터의 활성을 감소시키거나 억제하는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 억제자 요소는 상기 억제자 요소의 기질 또는 결합 파트너와 상호작용할 수 있고, 그리하여 상기 억제자 요소는 입체형태(conformation) 변화를 겪는다. 상기 억제자 요소의 이러한 입체형태 변화는 상기 프로모터를 감소시키거나 억제하는 상기 억제자 요소의 능력을 빼앗아, 상기 프로모터의 "탈억제"를 초래하여, 상기 프로모터가 전사의 개시를 진행할 수 있도록 한다. "기능적 프로모터"는 상기 억제자 요소의 작용 부재로, 전사를 개시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 다양한 기능적 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, PCMV, PH1, P19, P5, P40 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자의 프로모터 (예를 들어, E1A, E1B, E2A, E4Orf6, 및 VA) 를 포함한다.
탈억제성 프로모터로서 사용될 수 있는 예시적인 억제자 요소 및 이의 상응하는 결합 파트너는 당업계에 공지되어 있으며, 큐메이트 유전자-스위치 시스템(cumate gene-switch systems) (CuO 작동자(operator), CymR 억제자 및 큐메이트 결합 파트너) (예를 들어, 문헌 Mullick et al., “cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells,” BMC Biotechnology 6:43 (1-18) (2006) 참조, 이의 개시는 본원에 기재된 탈억제성 프로모터 시스템의 개시를 포함하여, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 및 본원에 기재된 TetO/TetR 시스템 (예를 들어, 문헌 Yao et al., “Tetracycline Repressor, tetR, rather than the tetR-Mammalian Cell Transcription Factor Fusion Derivatives, Regulates Inducible Gene Expression in Mammalian Cells,” Human Gene Therapy 9:1939-1950 (1998) 참조, 이의 개시는 본원에 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)과 같은 시스템을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 상기 탈억제성 프로모터는 기능적 프로모터 및 하나의 두 개의 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO 또는 TetO2)을 포함한다. 적합하게는, 상기 발현 카세트는 테트라사이클린 억제자 단백질을 포함하는 제1, 제2 및 제3 탈억제성 프로모터의 억제자 요소를 추가로 암호화한다.
본 발명의 구현예에 따른 예시적인 패키징 플라스미드를 예시하는, 탈억제성 프로모터 시스템을 도시하는 개략도가 도 1에 제공된다. TetO 서열을 포함하는 CMV 프로모터를 포함하는 탈억제성 프로모터 (CMV-TO)가 주목된다. CMV-TO 탈억제성 프로모터는 REV, VSV-G 및 GAG-POL 유전자에 작동 가능하게 연결된 것으로 예시되어 있으며; 이는, 즉, 적합한 구현예서, 상기 제1, 제2 및 제3 프로모터는 모두 탈억제성 프로모터일 수 있다. 또한, 다른 프로모터 시스템인 hPGK 프로모터의 제어 하에 있는 TetR 억제자 요소가 예시된다.
테트라사이클린 억제자 단백질 (TetR - 상기 TetO 서열에 대한 상기 억제자 요소)이 상기 TetO 서열에 결합하면, 상기 CMV 프로모터가 억제된다. 즉, 이러한 프로모터에서 전사가 거의 또는 전혀 발생하지 않는다. TetR에 대한 결합 파트너 (적합하게는 독시사이클린 (Dox))의 결합시, 상기 TetR 단백질은 입체형태를 변화하고, 상기 TetO 서열로부터 방출되며, 상기 기능적 프로모터는 자연스럽게, 이의 정상 전사 과정을 시작한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 발현 카세트는 억제자 요소, 적합하게는 테트라사이클린 억제자 단백질을 암호화하는 서열 다음에 크루펠-관련 박스(Kruppel-associated box) (KRAB) 서열을 추가로 포함할 수 있다. KRAB 서열 (대략 75개 아미노산)은 인간 아연(zinc) 핑거 단백질 10으로부터의 전사 억제 도메인이고, 억제자 요소, 적합하게는 TetR 억제자 요소의 증가된 조절을 제공한다. KRAB 도메인은 DNA-결합 도메인에 의해 주형 DNA에 연결될 때 전사 억제자로서 기능한다. 또한, 5' 및 3' ITR 트랜스포존 서열의 예시적인 위치가 예시되어 있다. 언급된 바와 같이, 상기 ITR 서열은 상기 발현 카세트 전체가 관심 세포에 트랜스포즈(transposed)되어, 바람직한 유전자 모두가 상기 숙주 게놈에 삽입되도록 위치한다.
예시적인 구현예에서, 상기 발현 카세트는 카세트의 세포의 게놈으로의 적절한 통합을 결정하기 위한 하나 이상의 리포터 유전자를 추가로 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, "리포터 유전자"는 그 발현이 용이하게 확인되고 측정될 수 있는 세포에 표현형을 부여하는 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 리포터 유전자는 선발 유전자를 포함한다. 본원에서 언급되는 바와 같이, 용어 "선발 유전자"는 필수 영양소 외에는 결여된 배지에서 성장하는 능력을 부여하는 효소 활성을 암호화하는 유전자의 사용을 지칭하며; 또한, 선발 유전자는 상기 선발 유전자가 발현되는 세포에 항생제 또는 약물에 대한 내성을 부여할 수 있다. 선발 유전자는 숙주 세포에 특정 표현형을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 숙주세포가 선별 배지에서 성장하기 위해 선발 유전자를 발현해야 하는 경우, 상기 유전자는 양성 선발 유전자라고 한다. 선발 유전자는 또한 특정 유전자 함유 숙주 세포를 피해 선발하기 위해 사용될 수 있고; 이러한 방식으로 사용되는 선발 유전자는 음성 선발 유전자로 지칭된다. 예시적인 구현예에서, 선발 유전자는 억제자 단백질에 이어 KRAB 서열의 다운스트림, 및 또한 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site) (IRES) 서열의 다운스트림에 위치한다. 예시적인 구현예에서, 선발 유전자는, 예를 들어, 겐타마이신, 티미딘 키나제, 암피실린, 퓨로마이신, 및/또는 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함하는 항생제 내성 유전자이다.
본원에 상세히 기재된 바와 같이, 상기 트랜스포존-특이적 ITR의 사용은 증가된 특이성, 빈도 및 안정성을 갖는 표적 세포의 게놈에 상기 발현 카세트의 삽입을 허용하는 것으로 결정되었다. 예시적인 구현예에서, 상기 트랜스포존-특이적 ITR은 레피돕테란(Lepidopteran) 트랜스포존 (PIGGYBAC®)ITR이다.
트랜스포존 요소 (트랜스포존)는 세포의 게놈 주위를 이동할 수 있으며, 형질전환 유기체의 생산을 위한 유전자를 삽입하는데 유용하다. 상기 레피돕테란 트랜스포존 PIGGYBAC®은 다양한 종의 게놈 내에서 이동할 수 있으며, 유전자 형질도입 벡터에 유용하다. 상기 트랜스포존 구조는 내부 반복부 (IR), 스페이서 및 양 단부의 말단 반복부 (TR) 및 트랜스포자제을 암호화하는 단일 개방 판독 프레임으로 구성된 복잡한 반복 배치를 포함한다.
레피돕테란 트랜스포존 요소 PIGGYBAC®는 본래 자발적인 바큘로바이러스(baculovirus) 플라크 형태 돌연변이체 내의 삽입을 방해하는 유전자로 TN-368 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포 배양물로부터 단리되었다. PIGGYBAC®는 5' 13-bp TR (말단 반복부) 및 19-bp IR (내부 반복부) 사이에 3-bp 스페이서가 있고, 3' TR 및 IR 사이에 31-bp 스페이서가 있는 비대칭 말단 반복부 구조를 가지는 2475 bp 짧은 역위 반복부 요소이다. 단일 2.1 kb 개방 판독 프레임은 기능적 트랜스포자제를 암호화한다 (Cary et al., 1989; Fraser et al., 1983, 1995; Elick et al., 1996a; Lobo et al., 1999; Handler et al., 1998). PIGGYBAC®는 고유한 잘라 붙이기(cut-and-paste mechanism) 메커니즘을 통해 트랜스포즈되고, 삽입시 중복되는 5' TAA 3' 표적 부위에 단독으로 삽입하고, 풋프린트(footprint)를 남기지 않고 정확하게 절단한다 (Elick et al., 1996b; Fraser et al., 1996; Wang and Fraser 1993).
본원에 기재된 상기 플라스미드 및 상기 발현 카세트에 사용될 수 있는 예시적인 레피돕테란 트랜스포존 (PIGGYBAC®) ITR은 미국 특허 번호 제7,105,343호에 개시된 것을 포함하며, 이의 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
적합한 구현예에서, 상기 포유동물 세포를 패키징 벡터로 형질감염시키는 것은 트랜스포존-특이적 ITR을 인식하는 상기 트랜스포자제의 존재 하에 일어난다. 이러한 트랜스포자제는 상기 발현 카세트를 표적 포유동물 세포의 세포 게놈으로 트랜스포지션(transposition)시키는 것을 용이하게 한다. 트랜스포자제는 활성 효소로서, 또는 mRNA 또는 cDNA를 포함하는 상기 트랜스포자제를 암호화하는 핵산 서열로서 세포에 제공될 수 있다. 구현예에서, 상기 트랜스포자제는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포자제 mRNA 또는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포즈 cDNA이다. 본원에 기재된 바와 같이, 상기 레피돕테란 트랜스포존 (PIGGYBAC®) ITR 및 상응하는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포자제를 활용하는 트랜스포지션의 빈도는 적합하게는 적어도 약 10-4이다.
추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 생산하는 방법을 본원에서 제공한다. 본원에서 사용된 "렌티바이러스 벡터-생산 세포"는 상기 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해 필요한 요소뿐만 아니라 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 바람직한 관심 유전자를 이의 게놈에 통합하여 함유하는 세포를 지칭한다. 렌티바이러스 벡터-생산 세포는 나중에 관심 유전자의 궁극적인 전달을 위해 바람직한 렌티바이러스를 생산하도록 유도될 수 있다.
렌티바이러스 벡터-생산 세포, 및 특히 포유동물 세포를 생산하는 방법으로서, 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자 발현의 렌티바이러스 조절자; 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및 제3 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 패키징 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 상기 발현 카세트는 표적 세포로의 높은 트랜스포지션이 용이하도록 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)가 5' 및 3' 단부(ends) 둘 모두에 적합하게 플랭킹된다.
상기 방법은 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전달 벡터로 포유동물 세포를 절단(transecting)하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 발현 카세트와 마찬가지로, 상기 관심 유전자를 암호화하는 상기 핵산 서열은 또한 증가된 트랜스포지션에 대한 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 5' 및 3' 단부 둘 모두에 적합하게 플랭킹된다. 구현예에서, 상기 전달 벡터 및 상기 패키징 벡터 둘 모두는 동시에 형질감염되고; 다른 구현예에서, 상기 전달 벡터 또는 상기 패키징 벡터는 먼저 형질감염될 수 있고, 상기 다른 벡터는 나중에 형질감염된다.
형질감염된 후, 상기 포유동물 세포를 배양하고, 상기 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 단리한다.
상기 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 세포에서와 마찬가지로, 본원에서 제조된 렌티바이러스 벡터-생산 세포는 렌티바이러스 벡터를 생산하는데 활용될 수 있는 바람직한 시간 이전에 적합하게 저장된다. 적합한 저장 기술 및 특성은 당업계에 공지되어 있고, 세포의 냉장 또는 동결뿐만 아니라 벡터 생산의 유도 전에 세포를 현탁된 상태로 유지하는 다른 방법을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 적합하게는 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물, 구현예에서 현탁 배양물이다. 예시적인 세포는 HEK293T 세포를 포함한다.
상기 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 세포에서와 같이, 상기 발현 벡터의 유전자는 HIV GAG 유전자인 GAG 유전자 및 HIV POL 유전자인 POL 유전자를 적합하게 포함한다. 적합하게는, 상기 렌티바이러스 외피 유전자는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 유전자이다.
상기 렌티바이러스 벡터-생산 세포에서 사용하기 위한 예시적인 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 탈억제성 프로모터를 포함하며, 적합하게는 상기 발현 카세트는 제1, 제2 및 제3 탈억제성 프로모터의 억제자 요소를 추가로 암호화한다. 구현예에서, 상기 탈억제성 프로모터는 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질이다. 트랜스포존-특이적 ITR을 포함하는 상기 발현 카세트의 추가적인 특성은 본원에 기재된다.
적합한 구현예에서, 상기 렌티바이러스 벡터에 함유되어야 하는 관심 유전자는 치료적 관심 유전자이다. 본원에서 언급되는 바와 같이, 용어 "관심 유전자" 또는 "GOI"는 이종 유전자를 설명하는데 사용된다. 본원에서 언급된 바와 같이, 용어 "이종 유전자" 또는 "HG"는, 코딩 서열 또는 제어 서열과 같은 핵산 서열에 관련하여, 일반적으로 함께 결합되지 않고/않거나 일반적으로 특정 세포와 연합되지 않는 핵산 서열, 예를 들어 유전자를 나타낸다. 일부 구현예에서, 이종 유전자는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 작제물 (예를 들어, 천연 유전자와 상이한 코돈(codons)을 갖는 합성 서열)이다. 대립유전자 변이(allelic mutations) 또는 자연 발생 돌연변이 사건은 본원에서 사용되는 이종 DNA를 발생시키지 않는다.
본원에서 언급되는 바와 같이, 용어 "치료적 관심 유전자"는 임의의 기능적으로 관련된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 본 개시의 치료적 관심 유전자는 치료-표적 세포 게놈으로부터 결함(defective) 또는 결손(missing)이 있는 단백질을 암호화하거나 바람직한 생물학적 또는 치료적 효과 (예를 들어, 항바이러스 기능)를 갖는 비-천연 단백질을 암호화하는 임의의 바람직한 유전자를 포함할 수 있거나, 상기 서열은 안티센스 또는 리보자임 기능을 갖는 분자에 상응할 수 있다. 적합한 치료적 관심 유전자의 대표적인 (비제한적인) 예는 AIDS, 암, 신경 질환, 심혈관 질환, 고콜레스테롤혈증과 같은 장애; 다양한 빈혈, 지중해 빈혈(thalassemias) 및 혈우병을 포함한 다양한 혈액 장애; 낭포성 섬유증, 고셔병(Gaucher's Disease), 아데노신 탈아미노효소(adenosine deaminase) (ADA) 결핍, 폐기종 등과 같은 유전적 결함을 포함하는, 염증성 질환, 자가면역, 만성 및 감염성 질환의 치료에 사용되는 것을 포함한다. 암 및 바이러스 질환에 대한 안티센스 요법에 유용한 여러 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA의 번역 개시 부위 (AUG 코돈) 주변의 서열에 상보적인 짧은 올리고뉴클레오티드)가 당업계에 기재되어 있으며, 또한 적합한 치료적 관심 유전자의 예이다.
도 2는 관심 유전자 (예시적인 목적을 위한 향상된 녹색 형광 단백질)를 포함하는 예시적인 전달 벡터를 도시한다. 상기 관심 유전자는 이 경우에는 CMV 프로모터인, 적합하게는 구성적 프로모터인 상기 프로모터의 제어 하에 있다. 또한, 5' 및 3' ITR 트랜스포존 서열에 대한 예시적인 위치가 예시되어 있다. 언급된 바와 같이, 상기 ITR 서열은 관심 유전자 및 프로모터를 함유하는 핵산 전체가 관심 세포로 트랜스포즈되도록 위치하여, 바람직한 유전자 모두가 숙주 게놈에 삽입되도록 한다. 지시된 바와 같이, 상기 예시적인 전달 벡터는 이 경우에는 블레오마이신(bleomycin) 내성 유전자인, 상기 관심 유전자의 다운스트림인 선발 유전자 또한 포함한다. 상기 전달 벡터의 추가적인 요소는 도 2에 도시되어 있다.
추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하거나 제공한 다음, 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전달 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 세포 게놈에 상기 관심 유전자를 도입한 후, 상기 발현 카세트 생산 및 상기 관심 유전자를 암호화하는 상기 핵산의 생산을 유도한다. 이어서, 상기 세포를 배양하고, 최종적으로 상기 관심 유전자를 함유하는 상기 렌티바이러스 벡터를 수확한다.
또 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법은 적합하게는 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 생산하거나 제공하는 단계를 포함한다. 상기 발현 카세트 생산 및 상기 관심 유전자를 암호화하는 상기 핵산의 생산을 유도한다. 이어서, 상기 세포를 배양하고, 최종적으로 상기 관심 유전자를 함유하는 상기 렌티바이러스 벡터를 수확한다.
본원에 기재된 상기 세포를 사용하여 상기 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법은, 이것이 단순히 상기 렌티바이러스 패키징 벡터를 함유하든지, 또는 상기 세포 게놈에 통합된 상기 관심 유전자를 또한 함유하든지 간에, 상기 유도가 시작되는 시기 및 상기 유도가 일어나는 조건을 제어할 뿐만 아니라, 대량의 렌티바이러스 벡터의 생성을 위한 메커니즘을 제공한다. 유도는 상기 억제자 요소와 상호작용하는 화학물질 또는 제제의 도입을 적합하게 포함하여, 상기 탈억제성 프로모터를 탈억제하고, 상기 렌티바이러스 벡터의 패키징 구성요소의 생산을 허용한다.
본원에 기재된 바와 같이, 적합하게는 상기 발현 카세트에서 각각의 프로모터는 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하는 탈억제성 프로모터이고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질이다. 이러한 구현예에서, 패킹(packing) 구성요소의 유도는 독시사이클린을 상기 포유동물 세포에 첨가하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 방법은, 상기 바람직한 핵산 서열의 세포 게놈에 삽입의 증가 및 대량 생산을 가능하게 하는 현탁액-기반 세포 배양의 결과로서, 렌티바이러스 벡터의 생산 증가량을 제공한다. 구현예에서, 상기 생산된 렌티바이러스 벡터의 양은 세포 유도 후 약 1 내지 5일 이내, 적합하게는 약 2일 이내에 적어도 약 104, 더욱 적합하게는 약 105 또는 약 106 형질도입 유닛/mL이다.
본원에 기재된 세포를 사용하는 생산 방법은 교반 탱크, 에어리프트(airlift), 섬유, 초극세사, 유공 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층(fluidized bed), 고정층(fixed bed), 및/또는 분류층(spouted bed) 생물반응기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 반응기(들)를 활용할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "반응기"는 발효기 또는 발효 유닛, 또는 임의의 다른 반응 용기를 포함할 수 있고, 용어 "반응기"는 "발효기"와 상호교환적으로 사용된다. 용어 발효기 또는 발효는 미생물 및 포유류 배양물을 모두 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 예시적인 생물반응기 유닛은 다음 중 하나 이상, 또는 모두를 수행할 수 있다: 영양분 및/또는 탄소 공급원 공급, 적합한 기체 (예를 들어, 산소)의 주입, 발효 또는 세포 배양 배지의 입구 및 출구 흐름, 기체 및 액체 상의 분리, 온도 유지, 산소 및 CO2 수준 유지, pH 수준 유지, 교반(agitation) (예를 들어, 교반(stirring)), 및/또는 세척/살균. 예시적인 반응기 유닛, 예를 들어 발효 유닛은 상기 유닛 내에 다중 반응기를 함유할 수 있으며, 예를 들어 상기 유닛은 각각의 유닛에서 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 생물반응기를 가질 수 있고/있거나 설비는 상기 설비 내에 단일 또는 다중 반응기를 갖는 다중 유닛을 함유할 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 생물반응기는 배치, 반유가식(semi fed-batch), 유가식, 관류 및/또는 연속 발효 공정에 적합할 수 있다. 임의의 적합한 반응기 직경이 사용될 수 있다. 구현예에서, 상기 생물반응기는 약 100 mL 내지 약 50,000 L의 부피를 가질 수 있다. 비제한적인 예는 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터, 및/또는 50,000 리터를 포함한다. 또한, 적합한 반응기는 다회용, 단회용, 일회용, 또는 비-일회용일 수 있고, 스테인리스 스틸 (예를 들어, 316L 또는 임의의 다른 적합한 스테인리스 스틸)과 같은 금속 합금 및 인코넬, 플라스틱, 및/또는 유리를 포함하는 임의의 적합한 재료로 형성될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 놀랍게도 생산 세포주를 사용하여 렌티바이러스를 생산하는 방법의 적어도 일부는 시드 트레인 생산, 세포 계대, 대용량 세포 배양 및/또는 주요 제조 단계를 포함하며, 항생제 없이 수행될 수 있는 것으로 확인되었다. 상기 렌티바이러스 생산 공정의 적어도 일부에서 항생제를 제거함으로써, 결과적인 방법은 궁극적으로 인간에게 활용될 세포 공정 및 생성물에서의 항생제의 사용과 관련된 우려를 감소시키거나 제거한다.
도 10은 본원에 기재된 바와 같은 생산자 세포주로부터 렌티바이러스를 제조하기 위한 예시적인 제조 공정 흐름을 도시한다. 도시된 바와 같이, PCL 클론은 먼저 생성되고, 이어서 대규모 제조 공정에서 사용하기 위해 선택된다. 상기 제조 공정의 초기 단계 동안, 상기 PCL은 최대 약 3회 (예를 들어, 약 2L의 부피) 계대(passaged)되고, 이 때 퓨로마이신 및/또는 제오신과 같은 항생제가 공정에서 제거될 수 있다. 이어서, 상기 계대는 상기 항생제의 부재 하에, 예를 들어 계대 3, 계대 4, 계대 5 등으로부터, 바람직한 부피의 세포에 도달할 때까지 계속될 수 있다. 예를 들어, 도 10에 도시된 바와 같이, 상기 항생제의 부재 하에 생물반응기에서 약 50 L의 부피가 적합하게 도달한다. 이어서, 상기 PCL은 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 독시사이클린을 사용함) 상기 렌티바이러스 벡터의 생산을 시작하기 위해 적합하게 유도된다. 따라서, 구현예에서, 상기 포유동물 세포 (PCL) 배양의 적어도 일부는 항생제의 부재 하에 일어나고, 적합하게는 이 기간은 계대 3 내지 유도기(induction phase)이다. 유도 후, 수확 (벤조나제 처리 및 정화 단계 포함) 및 상기 렌티바이러스 벡터의 정제 (접선 흐름 여과 및 멸균 여과 포함)를 포함하는 다운스트림 처리가 수행될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 PCL을 사용하여 상기 렌티바이러스 벡터 생산 공정의 상당 부분을 수행하는 능력은 놀랍고 예상치 못한 결과이며, 대규모 제조 공정에 상당한 이점을 제공한다.
또한, 본원에 제공되는 것은 포유동물 대상체, 적합하게는 인간 대상체를 본원에 기재된 다양한 방법에 따라 생산된 렌티바이러스 벡터로 치료하는 방법이다. 적합하게는, 상기 방법은 치료적 관심 유전자를 포함하는 관심 유전자로 인간 대상체를 치료하는 데 사용된다. 인간 대상체에 대한 투여는, 예를 들어, 흡입, 주사, 또는 정맥내 투여뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 투여 방법을 포함할 수 있다.
렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 포유동물 세포가 또한 본원에 제공된다. 본원에 기재된 방법 또는 이의 변이를 사용하여, 상기 포유동물 세포에 염색체적으로 통합된 상기 핵산 분자를 포함하는 포유동물 세포가 용이하게 생산되고, 상기 핵산 분자는 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자의 발현의 렌티바이러스 조절자; 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및 제3 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자 둘 모두를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 게놈에 통합된 상기 패키징 구성요소를 함유하는 포유동물 세포는 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 염색체적으로 통합된 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, PIGGYBAC® 트랜스포자제를 포함하는 상기 트랜스포자제-기반 방법의 사용은 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)의 재조합으로 인해 생산된 서열에 의해 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는 숙주 세포 게놈에서의 핵산 서열을 초래한다.
상기 발현 카세트의 유전자 구성요소 및 상기 관심 유전자를 암호화하는 핵산과 마찬가지로, 예시적인 포유동물 세포가 본원에 기재된다.
이러한 세포를 활용하여 렌티바이러스를 생산하는 방법은, 상기 발현 카세트 및 상기 관심 유전자를 암호화하는 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계, 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
추가 예시적인 구현예
구현예 1은 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하는 방법으로서, 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자의 발현의 렌티바이러스 조절자; 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및 제3 프로모터의 제어 하에 있는 둘 모두의 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자가 여기서, 상기 발현 카세트는 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는 단계를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 패키징 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계, 및 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 단리하는 단계를 포함하는 방법이다.
구현예 2는 구현예 1의 방법을 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물이다.
구현예 3은 구현예 2의 방법을 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포 배양물은 현탁 배양물이다.
구현예 4는 구현예 3의 방법을 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포는 HEK293T 세포이다.
구현예 5는 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고, 상기 POL 유전자는 HIV POL 유전자이다.
구현예 6은 구현예 1 내지 5 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 렌티바이러스 외피 유전자는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 유전자이다.
구현예 7은 구현예 1 내지 6 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 제1, 제2 및 제3 프로모터는 탈억제성 프로모터이다.
구현예 8은 구현예 7의 방법을 포함하며, 여기서 상기 발현 카세트는 상기 제1, 제2 및 제3 탈억제성 프로모터의 억제자 요소를 추가로 암호화한다.
구체예 9는 구현예 8의 방법을 포함하며, 여기서 상기 탈억제성 프로모터 각각이 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질이다.
구현예 10은 구현예 9의 방법을 포함하며, 여기서 상기 발현 카세트는 상기 테트라사이클린 억제자 단백질을 암호화하는 서열 다음에 크루펠-관련 박스 서열을 추가로 포함한다.
구현예 11은 구현예 1 내지 10 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 트랜스포존-특이적 ITR은 레피돕테란 트랜스포존 (PIGGYBAC®)ITR이다.
구체예 12는 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 형질감염은 상기 트랜스포존-특이적 ITR을 인식하는 트랜스포자제의 존재 하에 있다.
구현예 13은 구현예 12의 방법을 포함하며, 여기서 상기 트랜스포자제가 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포자제 mRNA 또는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포즈 cDNA이다.
구현예 14는 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 생산하는 방법으로서, 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자의 발현의 렌티바이러스 조절자; 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및 제3 프로모터의 제어 하에 있는 둘 모두의 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자, 여기서 상기 발현 카세트는 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 상기 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는 단계; 및 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전달 벡터, 여기서 상기 핵산 서열은 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 상기 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는 단계를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 패키징 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 단리하는 단계를 포함하는 방법이다.
구현예 15는 구현예 14의 방법을 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물이다.
구현예 16은 구현예 15의 방법을 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포 배양물은 현탁 배양물이다.
구현예 17은 구현예 16의 방법을 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포는 HEK293T 세포이다.
구현예 18은 구현예 14 내지 17 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고, 상기 POL 유전자는 HIV POL 유전자이다.
구현예 19는 구현예 14 내지 18 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 렌티바이러스 외피 유전자는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 유전자이다.
구현예 20은 구현예 14 내지 19 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 제1, 제2 및 제3 프로모터는 탈억제성 프로모터이다.
구현예 21은 구현예 20의 방법을 포함하며, 여기서 상기 발현 카세트가 상기 제1, 제2 및 제3 탈억제성 프로모터의 억제자 요소를 추가로 암호화한다.
구현예 22는 구현예 21의 방법을 포함하며, 여기서 상기 탈억제성 프로모터 각각이 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질이다.
구현예 23은 구현예 22의 방법을 포함하며, 여기서 상기 발현 카세트는 상기 테트라사이클린 억제자 단백질을 암호화하는 서열 다음에 크루펠-관련 박스 서열을 추가로 포함한다.
구현예 24는 구현예 14 내지 23 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 트랜스포존-특이적 ITR은 레피돕테란 트랜스포존 (PIGGYBAC®) ITR이다.
구현예 25는 구현예 14 내지 24 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 형질감염은 상기 트랜스포존-특이적 ITR을 인식하는 트랜스포자제의 존재 하에 있다.
구현예 26은 구현예 25의 방법을 포함하며, 여기서 상기 트랜스포자제는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포자제 mRNA 또는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포즈 cDNA이다.
구현예 27은 구현예 14 내지 26 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 관심 유전자는 치료적 관심 유전자이다.
구현예 28은 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 구현예 1에 따른 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하는 단계; 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전달 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; 상기 발현 카세트 및 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계; 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법이다.
구현예 29는 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 구현예 14에 따른 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 생산하는 단계, 상기 발현 카세트 및 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계, 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법이다.
구현예 30은 구현예 28 또는 구현예 29의 방법을 포함하며, 여기서 상기 발현 카세트에서의 프로모터 각각이 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하는 탈억제성 프로모터이고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질이고, 상기 유도는 독시사이클린을 상기 포유동물 세포에 첨가하는 단계를 포함한다.
구현예 31은 구현예 28 또는 구현예 29의 방법을 포함하며, 여기서 상기 생산된 렌티바이러스 벡터의 양은 유도 2일 후에 적어도 약 106 형질도입 유닛/mL이다.
구현예 32는 렌티바이러스 벡터로 치료 방법으로서, 구현예 28 또는 구현예 29에 따라 생산된 상기 렌티바이러스 벡터를 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
구현예 33은 구현예 32의 방법을 포함하며, 여기서 상기 투여는 흡입, 주사 또는 정맥내 투여를 포함한다.
구현예 34는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 포유동물 세포로서, 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자의 발현의 렌티바이러스 조절자를 포함하는 상기 포유동물 세포에 염색체적으로 통합된 핵산 분자; 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및 둘 모두 제3 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자를 포함하고, 여기서 상기 핵산 서열은 상기 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)의 재조합으로 생성된 서열이 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는 단계를 포함한다.
구현예 35는 구현예 34의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 염색체적으로 통합된 핵산 서열을 추가로 포함한다.
구현예 36은 구현예 34 또는 구현예 35의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물이다.
구현예 37은 구현예 36의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포 배양물은 현탁 배양물이다.
구현예 38은 구현예 37의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포는 HEK293T 세포이다.
구현예 39는 구현예 34 내지 38 중 어느 하나의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고, 상기 POL 유전자는 HIV POL 유전자이다.
구현예 40은 구현예 34 내지 39 중 어느 하나의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 렌티바이러스 외피 유전자는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 유전자이다.
구현예 41은 구현예 34 내지 40 중 어느 하나의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 제1, 제2 및 제3 프로모터는 탈억제성 프로모터이다.
구현예 42는 구현예 41의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 발현 카세트는 제1, 제2 및 제3 탈억제성 프로모터의 억제자 요소를 추가로 암호화한다.
구현예 43은 구현예 42의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 각각의 상기 탈억제성 프로모터는 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질이다.
구현예 44는 구현예 43의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 발현 카세트는 테트라사이클린 억제자 단백질을 암호화하는 서열 다음에 크루펠-관련 박스 서열을 추가로 포함한다.
구현예 45는 구현예 34 내지 44 중 어느 하나의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 트랜스포존-특이적 ITR은 레피돕테란 트랜스포존 (PIGGYBAC®) ITR이다.
구현예 46은 구현예 35의 상기 포유동물 세포를 포함하며, 여기서 상기 관심 유전자는 치료적 관심 유전자이다.
구현예 47은 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 구현예 34에 따른 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하는 단계; 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전달 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; 상기 발현 카세트 및 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계; 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법이다.
구현예 48은 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 염색체적으로 통합된 핵산 서열의 생산을 유도하는 단계 및 구현예 35의 상기 포유동물 세포의 관심 유전자를 암호화하는 상기 염색체적으로 통합된 핵산 서열; 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법이다.
구현예 49는 구현예 47 또는 구현예 48의 방법을 포함하며, 여기서 상기 발현 카세트에서의 프로모터 각각이 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하는 탈억제성 프로모터이고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질이고, 상기 유도는 독시사이클린을 상기 포유동물 세포에 첨가하는 단계를 포함한다.
구현예 50은 구현예 47 또는 구현예 48의 방법을 포함하며, 여기서 생산된 상기 렌티바이러스 벡터의 양은 유도 2일 후에 적어도 약 106 형질도입 유닛/mL이다.
구현예 51은 렌티바이러스 벡터로 치료 방법으로서, 구현예 47 또는 구현예 48에 따라 생산된 상기 렌티바이러스 벡터를 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
구현예 52는 구현예 51의 방법을 포함하며, 여기서 상기 투여는 흡입, 주사 또는 정맥내 투여를 포함한다.
구현예 53은 구현예 28 내지 31 및 47 내지 50 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포 배양의 적어도 일부가 항생제의 부재 하에 발생한다.
구현예 54는 구현예 53의 방법을 포함하며, 여기서 상기 배양의 일부는 계대 3 내지 유도기(induction phase)이다.
실시예
실시예 1: 렌티바이러스 생산자 세포주의 설계 및 구성
재료 및 방법
렌티바이러스 생산자 세포주를 구성하기 위해, 2개의 플라스미드를 설계하였다:
1) GAG-Pol, VSV-G, 및 Rev를 조절된 방식으로 발현하는 패키징 플라스미드; 및
2) 관심 유전자를 발현하는 전달 벡터.
코돈 최적화가 단백질의 실제 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 단백질 합성을 증가시키는 가장 효과적인 방법 중 하나로서 증명된 바와 같이, VSV-G 및 Rev에 대한 코딩 서열은 코돈-최적화 (co)된다.
GAG-Pol을 암호화하는 서열은 코돈-최적화되지 않았다. 이들 서열 모두는 CMV-TO 프로모터의 제어 하에 놓이며, 이의 활성은 TetR에 의해 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 부재 하에 억제된다. 본 발명자의 설계에서, 인간 아연 핑거 단백질 10으로부터의 전사 억제 도메인인 크루펠-관련 박스 (KRAB)의 서열은 CMV-TO의 보다 엄격한 조절을 달성하기 위해 TetR 코딩 서열 바로 다음에 삽입되었다.
TetR에 결합시, 독시사이클린의 첨가는 TetR의 입체형태 변화를 유도하여 CMV-TO에서 TetR을 방출한다. 그 결과, CMV-TO는 활성이 되고 VSV-G, Rev, 및 GAG-Pol을 발현한다. 상기 VSV-G, Rev, 및 GAG-Pol의 조절된 발현은 이러한 단백질과 관련된 임의의 세포독성을 최소화하고, 또한 상기 렌티바이러스 벡터 생산을 임의의 유도 전에 기저 수준(basal level)으로 유지한다. 상기 선발 과정을 용이하게 하기 위해, KRAB 서열 바로 다음에 위치에 위치한 상기 IRES 서열의 플라스미드 다운스트림에 항생제 내성 마커 (퓨로마이신)를 도입하였다. 따라서, 인간 포스포글리세레이트(phosphoglycerate) 프로모터는 상기 TetR-KRAB 및 퓨로마이신 내성 유전자의 발현을 함께 유도한다.
렌티바이러스 벡터 생산을 시험하기 위해, 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 관심 유전자(GOI)로 선발하였다. 구성적 발현을 위해 CMV 프로모터 하에 놓았다. 전달 벡터에 블레오마이신 내성 마커(BleoR)를 도입하여 선발 공정을 보다 효율적으로 만들었다.
전통적인 접근법에서, 발현 카세트의 통합은 무작위 통합 이벤트에 의존한다. 따라서, 이는 본질적으로 제어되고 효율적인 공정이 아니다. 더욱이, 최종 선발된 클론은 불완전한 발현 카세트를 갖는 단편화된 부분적 항생제 마커(들)가 우연히 염색체에 통합될 수 있기 때문에 거짓-양성 (즉, 상기 의도된 GOI를 발현하지 않음)일 수 있다.
상기 생산자 세포주 생성 동안 이러한 원치 않는 이벤트를 피하기 위해, 상기 패키징 및 전달 벡터 플라스미드에서의 모든 발현 카세트는 PIGGYBAC® 역위 말단 반복부 (ITR) 서열에 의해 플랭킹되었다. PIGGYBAC® 트랜스포자제는 이러한 ITR 서열을 특이적으로 인식하여 생체 내 부위 특이적 재조합을 촉진한다. 따라서, 상기 PIGGYBAC® 트랜스포자제 mRNA의 공동-형질감염시, 상기 전체 발현 카세트를 함유하는 상기 플라스미드 영역은 세포의 염색체에 효율적으로 통합된다.
상기 패키징 벡터의 개략도는 도 1에 도시되어 있고; 상기 전달 벡터의 개략도는 도 2에 도시되어 있다. 상기 eGFP를 프로모터와 함께 암호화하는 서열을 도시한다. PIGGYBAC® 5' 및 3'ITR 또한 나타낸다. 5'LTR, HIV-1 ψ, RRE, cPPT/CTS 및 3'LTR과 같은 상기 렌티바이러스 벡터의 생산을 위한 요소 또한 도시되어 있다.
도 1에 도시된 상기 패키징 벡터에 대한 상기 핵산 서열은 하기에 제공된다:
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번호:1)
도 2에 도시된 전달 벡터에 대한 상기 핵산 서열은 하기에 제공된다:
ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCCCGCCGGGTAACTCACGGGGTATCCATGTCCATTTCTGCGGCATCCAGCCAGGATACCCGTCCTCGCTGACGTAATATCCCAGCGCCGCACCGCTGTCATTAATCTGCACACCGGCACGGCAGTTCCGGCTGTCGCCGGTATTGTTCGGGTTGCTGATGCGCTTCGGGCTGACCATCCGGAACTGTGTCCGGAAAAGCCGCGACGAACTGGTATCCCAGGTGGCCTGAACGAACAGTTCACCGTTAAAGGCGTGCATGGCCACACCTTCCCGAATCATCATGGTAAACGTGCGTTTTCGCTCAACGTCAATGCAGCAGCAGTCATCCTCGGCAAACTCTTTCCATGCCGCTTCAACCTCGCGGGAAAAGGCACGGGCTTCTTCCTCCCCGATGCCCAGATAGCGCCAGCTTGGGCGATGACTGAGCCGGAAAAAAGACCCGACGATATGATCCTGATGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGATCTAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAAGCCATACCAATGGGCCCTAAAAAAGGAATCCAGTCAATTCCGGGGCTAAACCTGGCTGCCACTGTTTCTTTAGGGACTTCGTTCCTGTGAGGACAccTGCAggCCGGCCGGATccTAGgTATacGCGtTAATTAaAGCTTGTTAACGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAG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번호: 2)
HEK293T 세포의 단일 세포 클론을 단리하고 현탁액을 상기 패키징 및 전달 벡터 플라스미드의 형질감염에 적응화(adapted)시켰다. 상기 PIGGYBAC® 트랜스포자제의 효과를 시험하고 확인하기 위해, 형질감염은 PIGGYBAC® 트랜스포자제 mRNA의 부재 또는 존재 하에서 실시하였다. PEIpro 형질감염제가 형질감염에 사용되었다.
렌티-eGFP에 대한 패키징 세포주를 만들기 위해, eGFP를 암호화하는 패키징 플라스미드 및 전달 벡터를 공동-형질감염시켰다. 단독의 패키징을 위한 패킹 세포주를 만들기 위해(즉, 관심 유전자 발현 없음), 패키징 플라스미드 단독을 형질감염시켰다. 형질감염 4일 후, lenti-eGFP에 대해 퓨로마이신 및 제오신을 첨가하고 패키징 세포주에 대해 퓨로마이신 단독을 첨가하여 안정적으로 형질감염된 세포를 선발하였다.
결과
트랜스포자제 mRNA의 공동-형질감염은 항생제-내성 콜로니를 크게 향상시켰으며, 이는 트랜스포자제 발현이 실제로 상기 발현 카세트의 염색체 통합을 촉진시켰다는 것을 나타낸다. 도 3a-3d는 상기 트랜스포자제 mRNA (TP mRNA)의 부재 (도 3a 및 3c) 또는 존재 (도 3b 및 3d)에서 패키징 및 eGFP 전달 벡터로 형질감염된 HEK293T 세포의 결과를 도시한다. 형질감염 4일 후, 퓨로마이신 (0.5 ug/mL) 및 제오신 (300 ug/mL)을 첨가하여 항생제-내성 세포를 선발하였다. 형질감염 후 26일차에 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, GFP 및 흑백 (B/W)에 대한 이미지를 수집하였다.
유사하게, 트랜스포자제 mRNA의 공동-형질감염은 패키징 세포주의 생성 공정 동안 항생제-내성 콜로니를 향상시켰다 (현재 표시된 데이터).
상기 항생제-내성 패키징 세포주는 특성화 전에 증폭 및 동결하였다. LV-eGFP를 암호화하는 상기 패키징 세포를 해동하고, 상기 퓨로마이신 및 제오신의 존재 하에 현탁액에서 배양하였다. 상기 렌티바이러스 벡터의 생산을 유도하기 위해, 소듐 부티레이트 (6mM) 및 독시사이클린 (2 ug/mL)을 상기 패키징 세포 배양물에 첨가하고 추가로 인큐베이션하였다.
유도 후 2일차 및 3일차에, 상기 렌티바이러스 역가의 측정을 위해 배양 상등액을 수집하였다. 상기 유도되지 않은 렌티바이러스 벡터 역가의 측정을 위해, 유도되지 않은 샘플의 배양 상등액을 사용하였다. 4E6 형질도입 유닛/mL 이상의 렌티바이러스 벡터가 유도 시에 (2일 및 3일) 생산되는 반면, 임의의 유도 전(0일차) 렌티바이러스 벡터 생산의 기저량은 기저 수준인 것으로 관찰되었다 (도 4).
실시예 2: 렌티바이러스 생산자 세포주의 추가 특성화
A. 본원에 기재된 벡터와 함께 상이한 형질감염제의 사용을 조사하기 위해 추가의 연구를 설계하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, PEI 및 리포펙타민 3000 둘 모두는 PIGGYBAC® 트랜스포자제 mRNA의 존재 하에 PCL 풀(pools)에서 감염성 렌티바이러스 역가를 성공적으로 약 100배 증가시켰으며, 이는 트랜스포자제의 발현이 숙주 세포의 염색체에 카고(cargo) 서열의 효율적인 통합을 유도함을 입증한다.
B. 상기 렌티바이러스 생산의 성공에 대한 항생제 제거의 효과를 결정하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 이러한 실험에서, 계대 21까지 유도 시의 일관된 감염성 역가를 확인하기 위해 DH4로 지정된 단일 세포 클론 (SCC), HEK-293T를 선택하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 유도되지 않은 세포는 낮은 수준의 감염성 역가를 나타내었다. 계대 7 (2일차) 이후, 유도된 세포는 1.2E7 TU/mL (형질도입 유닛/mL)를 나타내었다. 상기 세포들을 선발하기 위해, 항생제를 제거하고, 상기 세포들을 계속해서 통과시켰다. 계대 11 (2일차, 3일차)에서, 항생제를 갖는 세포는 1.5E7 TU/mL (2일차) 및 5.3E7 TU/mL (3일차)의 역가를 달성하였다. 항생제가 없는 경우와 비교하였을 때, 감염성 역가는 2일차에 여전히 1.6E7 TU/mL에 도달하였다. 계대 17 및 계대 21 (약 7주 기간)까지 연장하였을때, 바이러스성 역가는 항생제 없이 항생제가 존재하는 때와 동일한 수준으로 계속 유지되었다 (4.4E7). 2일차 대 3일차는 유도 및 수확 사이의 추가적인 일수의 효과를 비교하여, 유도 후 및 수확 전 PCL의 인큐베이션 일수를 지칭한다.
도 7은 다른 단일 세포 클론인 ED8을 사용한 유사한 결과를 도시한다. 상기 DH4 클론에서와 같이, 계대 7에서의 항생제 제거는 항생제로 치료된 세포와 동일한 규모의 감염성 바이러스 역가를 생산하는 상기 세포 클론의 능력에 유의한 영향을 미치지 않았다. 언급된 바와 같이, 계대 21에 의해, 항생제로 계속 치료된 세포에 대한 4.3E7 TU/mL와 유사한 3.5E7 TU/mL의 감염성 역가가 달성되었다.
도 8은 ddPCR 분석법을 사용하여 측정된 상기 숙주 세포 염색체에 통합된 카피 수 (관심 유전자 또는 패키징 플라스미드)를 도시한다. 상기 벡터 카피 수 (VCN)는 하기 식에 의해 계산되었다: VCN = 표적 서열의 카피수/RPP30 (리보뉴클레아제 P/MRP 서브유닛 P30)의 카피수 * 2. 긴 말단 반복부 (LTR) 및 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G (VSV-G)에 특이적인 프라이머/프로브 세트를 사용하여 각각의 상기 GOI 및 패키징 플라스미드를 검출하였다. 세포 클론 둘 모두에 대해 언급된 바와 같이, 상기 관심 유전자 및 상기 패키징 플라스미드 둘 모두는 상기 세포의 염색체에 효율적으로 통합되었다. 상기 세포의 계대 동안 (계대 70에서 다시) 상기 항생제의 제거는 상기 카피수를 약간 감소시켰지만, 상기 GOI 및 패키징 플라스미드가 상기 세포에서 여전히 충분하게 통합되었다.
이는 놀랍고 예상치 못한 결과이며, 상기 항생제의 부재 시에도, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 상기 생산자 세포주가 높은 바이러스성 역가를 생산할 수 있음을 입증한다. 이는 생산자 세포주 배양물에서 항생제를 제거하여 나중에 인간 환자 집단에서 활용될 제품의 항생제 오염 등과 관련된 위험을 최소화하는 것이 매우 바람직하기 때문에 상기 렌티바이러스의 제조에 상당한 이점을 제공한다.
C. 일시적 형질감염으로부터 생산된 렌티바이러스와 비교하여, 본원에 기재된 상기 생산자 세포주를 사용하여 생산된 렌티바이러스 벡터의 형질도입 효율을 결정하기 위해 실험을 또한 수행하였다. 렌티바이러스는 HEK-293 세포의 일시적 형질감염과 함께 상기 DH4 및 ED8 세포주 둘 모두에서의 PCL을 사용하여 생산되었다. 생산 후, 렌티바이러스 벡터를 5의 감염 다중도(MOI)를 가진 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 형질도입하였다. 간단히 말해서, PMBC를 24 웰(well) 플레이트에 4E5 세포/웰로 플레이팅하였다. 1일차에, 상기 세포를 IL-2 (15ng/mL) 및 항-CD3 및 항-CD-28 (25 μL/1E6 세포)로 자극하였다. 그런 다음, 녹색 형광 단백질을 관심 유전자 (GOI)로 사용하여 5의 감염 다중도에서 렌티바이러스로 상기 세포를 형질도입시켰다. 5일 후, 유세포 분석기(flow cytometry)을 이용하여 상기 세포를 분석하여 형광-양성 세포의 분획을 결정하고, 형질도입 효율을 계산하였다.
도 9에서 입증된 바와 같이, PMBC가 5의 감염 다중도로 형질도입된 경우, PCL (DH4 및 ED8 계통)을 사용하여 생산된 렌티바이러스 및 본원에 기재된 방법 (약 55% 내지 62% 형질도입 효율)과 비교하였을 때, 일시적 형질감염 방법을 사용하여 생산된 렌티바이러스에 대해 유사한 형질도입 효율이 관찰된다.
본원에 기재된 방법 및 응용에 대한 다른 적합한 변형 및 개조가 상기 구현예의 임의의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
특정 구현예가 본원에 예시되고 기재되었지만, 청구범위는 기재되고 도시된 부분들의 특정 형태 또는 배열에 제한되는 것이 아님이 이해된다. 본 명세서에서, 예시적인 구현예가 개시되어 있으며, 특정 용어가 사용되지만, 이는 제한의 목적이 아니라 포괄적이고 설명적인 의미로만 사용된다. 상기 구현예의 변형 및 변이는 상기 교시에 비추어 가능하다. 따라서, 상기 구현예는 구체적으로 기재된 바와 달리 실시될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 통합되는 것으로 지시된 것과 동일한 범위로 참조로 통합된다.

Claims (54)

  1. 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하는 방법으로서,
    a. 포유동물 세포를 하기로 형질감염시키는 단계:
    i. 하기를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 패키징 벡터:
    1. 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자 발현의 렌티바이러스 조절자;
    2. 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및
    3. 제3 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자,
    상기 발현 카세트는 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는 단계; 및
    b. 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
    c. 상기 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양물은 현탁 배양물인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 HEK293T 세포인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고, 상기 POL 유전자는 HIV POL 유전자인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 외피 유전자는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 유전자인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로모터, 제2 프로모터 및 제3 프로모터는 탈억제성 프로모터인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 제1, 제2 및 제3 탈억제성 프로모터의 억제자 요소를 추가로 암호화하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 탈억제성 프로모터 각각이 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 테트라사이클린 억제자 단백질을 암호화하는 서열 다음에 크루펠-관련 박스 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포존-특이적 ITR은 레피돕테란 트랜스포존 (PIGGYBAC®) ITR인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질감염은 트랜스포존-특이적 ITR을 인식하는 트랜스포자제의 존재 하에 있는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 트랜스포자제는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포자제 mRNA 또는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포즈 cDNA인, 방법.
  14. 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 생산하는 방법으로서,
    a. 포유동물 세포를 하기로 형질감염시키는 단계:
    i. 하기를 암호화하는, 발현 카세트를 포함하는 패키징 벡터:
    1. 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자 발현의 렌티바이러스 조절자;
    2. 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및
    3. 제3 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스군 특이적 항원 (GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자,
    상기 발현 카세트는 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되며; 그리고
    ii. 하기를 포함하는 전달 벡터:
    1. 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열,
    상기 핵산 서열은 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는, 단계;
    b. 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
    c. 상기 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양물은 현탁 배양물인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 HEK293T 세포인, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고, 상기 POL 유전자는 HIV POL 유전자인, 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 외피 유전자는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 유전자인, 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로모터, 제2 프로모터 및 제3 프로모터는 탈억제성 프로모터인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 발현 카세트는 제1, 제2 및 제3 탈억제성 프로모터의 억제자 요소를 추가로 암호화하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 탈억제성 프로모터 각각이 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 테트라사이클린 억제자 단백질을 암호화하는 서열 다음에 크루펠-관련 박스 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포존-특이적 ITR은 레피돕테란 트랜스포존 (PIGGYBAC®) ITR인, 방법.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질감염은 상기 트랜스포존-특이적 ITR을 인식하는 트랜스포자제의 존재 하에 있는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 트랜스포자제는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포자제 mRNA 또는 레피돕테란 (PIGGYBAC®) 트랜스포즈 cDNA인, 방법.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 유전자는 치료적 관심 유전자인, 방법.
  28. 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서,
    a. 제1항에 따른 렌티바이러스 패키징 벡터-함유 포유동물 세포를 생산하는 단계;
    b. 상기 포유동물 세포를 전달 벡터로 형질감염시키는 단계로서,
    i. 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단계;
    c. 상기 발현 카세트 및 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계;
    d. 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
    e. 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서,
    a. 제14항에 따른 렌티바이러스 벡터-생산 포유동물 세포를 생산하는 단계;
    b. 상기 발현 카세트 및 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계;
    c. 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
    d. 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 발현 카세트 내 각각의 프로모터는 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하는 탈억제성 프로모터이고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질이고, 그리고 상기 유도 단계는 독시사이클린을 상기 포유동물 세포에 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 생산된 렌티바이러스 벡터의 양은 유도 2일 후에 적어도 약 106 형질도입 유닛/mL인, 방법.
  32. 렌티바이러스 벡터로 치료하는 방법으로서,
    a. 제28항 또는 제29항에 따라 생산된 상기 렌티바이러스 벡터를 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 투여 단계는 흡입, 주사 또는 정맥내 투여를 포함하는, 방법.
  34. 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 포유동물 세포로서, 상기 포유동물 세포는:
    a. 포유동물 세포에 염색체적으로 통합되는 핵산 분자를 포함하며, 상기 핵산 분자는
    i. 제1 프로모터의 제어 하에 있는 비리온 단백질 (REV) 유전자 발현의 렌티바이러스 조절자;
    ii. 제2 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스 외피 유전자; 및
    iii. 제3 프로모터의 제어 하에 있는 렌티바이러스군 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 폴리머라제 (POL) 유전자를 포함하며,
    상기 핵산 서열은 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복부 (ITR)의 재조합에 의해 생성된 서열에 의해 5' 및 3' 단부 둘 모두에 플랭킹되는, 포유동물 세포.
  35. 제34항에 있어서, 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 염색체적으로 통합된 핵산 서열을 추가로 포함하는, 포유동물 세포.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물인, 포유동물 세포.
  37. 제36항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양물은 현탁 배양물인, 포유동물 세포.
  38. 제37항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 HEK293T 세포인, 포유동물 세포.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고, 상기 POL 유전자는 HIV POL 유전자인, 포유동물 세포.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 외피 유전자는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 유전자인, 포유동물 세포.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 프로모터는 탈억제성 프로모터인, 포유동물 세포.
  42. 제41항에 있어서, 상기 발현 카세트는 제1, 제2 및 제3 탈억제성 프로모터의 억제자 요소를 추가로 암호화하는, 포유동물 세포.
  43. 제42항에 있어서, 상기 탈억제성 프로모터 각각이 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질인, 포유동물 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 테트라사이클린 억제자 단백질을 암호화하는 서열 다음에 크루펠-관련 박스 서열을 추가로 포함하는, 포유동물 세포.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포존-특이적 ITR은 레피돕테란 트랜스포존 (PIGGYBAC®) ITR인, 포유동물 세포.
  46. 제35항에 있어서, 상기 관심 유전자는 치료적 관심 유전자인, 포유동물 세포.
  47. 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서,
    a. 제34항의 포유동물 세포를 전달 벡터로 형질감염시키는 단계로서,
    i. 제4 프로모터의 제어 하에 있는 관심 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단계;
    b. 상기 발현 카세트 및 상기 핵산의 생산을 유도하는 단계;
    c. 상기 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
    d. 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서,
    a. 제35항의 포유동물의 관심 유전자를 암호화하는 상기 염색체적으로 통합된 핵산 서열 및 상기 염색체적으로 통합된 핵산 서열의 생산을 유도하는 단계;
    b. 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
    c. 상기 렌티바이러스 벡터를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 발현 카세트 내 각각의 프로모터는 기능적 프로모터 및 테트라사이클린 작동자 서열 (TetO)을 포함하는 탈억제성 프로모터이고, 상기 억제자 요소는 테트라사이클린 억제자 단백질이고, 그리고 상기 유도 단계는 독시사이클린을 상기 포유동물 세포에 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 생산된 렌티바이러스 벡터의 양은 유도 2일 후에 적어도 약 106 형질도입 유닛/mL인, 방법.
  51. 렌티바이러스 벡터로 치료하는 방법으로서,
    a. 제47항 또는 제48항에 따라 생산된 상기 렌티바이러스 벡터를 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 투여 단계는 흡입, 주사 또는 정맥내 투여를 포함하는, 방법.
  53. 제28항 내지 제31항 및 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계의 적어도 일부는 항생제의 부재 하에 발생되는 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 배양 단계의 일부는 계대 3 내지 유도기인, 방법.
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