JP7469280B2 - レンチウイルスベクターのバイオ生産法 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年5月13日に出願された米国仮特許出願第62/161,133号の出願日の恩典を主張するものであり、さらに2015年5月13日に出願された米国仮特許出願第62/161,152号の出願日の恩典も主張するものであり、これらの開示内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本開示は、一般に、分子生物学およびウイルス学の分野に関する。特に、本開示は、レンチウイルスベクターおよびレンチウイルストランスファープラスミドのバイオ生産に関する。
本開示は、遺伝子治療およびバイオマニュファクチャリングの分野において産業上の利用可能性を有する。
HIV-1は、世界中で3000万人ほどが感染している後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因病原体である。HIVは免疫系を機能不全にさせ、日和見感染症によって死亡する確率を高める。HIV感染症は、世界保健機関(World Health Organization)によりパンデミックと指定されたことからも明らかなように、世界規模での主要な健康上の問題である。HIVに感染した、特に発展途上国の、多くの人々は最終的にAIDSを発症し、毎年100万人を上回る人々が命を奪われている。
本開示の一局面には、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むプラスミドがある。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95%の同一性を有する。いくつかの態様では、レンチウイルスベクターは該プラスミドに由来する。いくつかの態様では、派生したこのレンチウイルスベクターは、HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNAおよび/またはHIV-1融合阻害物質をコードする1つまたは複数の追加の配列を含む。いくつかの態様では、それに由来するレンチウイルスベクターは、LVsh5/C46 (本明細書で定義される)である。
[本発明1001]
SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1002]
前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95%の同一性を有する、本発明1001の組換えプラスミド。
[本発明1003]
SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1004]
SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1005]
SEQ ID NO: 1に示された配列とはヌクレオチド100個以下だけ異なる配列を有する、組換えプラスミド。
[本発明1006]
前記配列が、SEQ ID NO: 1に示された配列とはヌクレオチド50個以下だけ異なる、本発明1005の組換えプラスミド。
[本発明1007]
ヌクレオチド約6500個~ヌクレオチド約6750個を含み、かつSEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1008]
ヌクレオチド約6600個~ヌクレオチド約6700個を含む、本発明1007の組換えプラスミド。
[本発明1009]
ヌクレオチド約6611個を含む、本発明1007の組換えプラスミド。
[本発明1010]
図11にpUC57-TL20cとして示された組換えプラスミド。
[本発明1011]
BstBI、MluI、NotI、およびClaI制限エンドヌクレアーゼ部位から本質的になるマルチクローニングサイトを含む、組換えプラスミド。
[本発明1012]
パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列と;セントラルポリプリントラクトをコードするヌクレオチド配列と;Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列と;自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列とをさらに含む、本発明1011の組換えプラスミド。
[本発明1013]
(a)パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列と;(b)セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列と;(c)Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列と;(d)自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列と;(e)酵素BstBI、MluI、NotI、およびClaIに対する制限部位を有するマルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列とを含む、組換えプラスミド。
[本発明1014]
前記パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 3の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1015]
前記セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 4の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1016]
前記Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 5の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1017]
前記自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 6の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1018]
前記マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 7の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1019]
(a)プラスミドのヌクレオチド配列のヌクレオチド約762からヌクレオチド約1104までに存在するパッケージング配列と;(b)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約1121からヌクレオチド約1597までに存在するセントラルポリプリントラクトと;(c)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約1598からヌクレオチド約2366までに存在するRev応答エレメントと;(d)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約409からヌクレオチド約589までに存在する自己不活性化末端反復配列と;(e)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約2376からヌクレオチド約2400までに存在するマルチクローニングサイトとを含む、組換えプラスミド。
[本発明1020]
前記プラスミドヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1021]
前記パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 3の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1022]
前記セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 4の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1023]
前記Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 5の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1024]
前記自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 6の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1025]
前記マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 7の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1026]
BstBI、MluI、NotI、およびClaI制限エンドヌクレアーゼ部位を含むマルチクローニングサイトを含み、かつSEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1027]
SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するベクターカセットをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ該ベクターカセットが、少なくとも2つの制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接しており、該少なくとも2つの制限エンドヌクレアーゼ部位が、sfiIおよびBsu36Iからなる群より独立して選択される、組換えプラスミド。
[本発明1028]
SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するベクターカセットをコードするヌクレオチド配列を含み、該ベクターカセットが、BstBI、MluI、NotI、およびClaI制限エンドヌクレアーゼ部位を有するマルチクローニングサイトを含む、組換えプラスミドであって、該ベクターカセットの上流にテトラサイクリン抑制性プロモーターをさらに含む、組換えプラスミド。
[本発明1029]
本発明1001~1028のいずれかのプラスミドを含む、細胞。
[本発明1030]
本発明1001~1028のいずれかのプラスミドと、ブレオマイシン耐性(ble)カセットとを含む、キット。
[本発明1031]
(a)本発明1001~1028のいずれかのプラスミドに1つまたは複数の遺伝子をクローニングすることによって、レンチウイルスベクターを合成する段階;(b)合成された該レンチウイルスベクターからDNA断片を生成する段階;(c)合成された該レンチウイルスベクター由来の生成された該DNA断片から、および抗生物質耐性カセットプラスミド由来のDNA断片から、コンカテマーアレイを形成する段階;(d)GPR、GPRG、GPRT、GPRGT、もしくはGPRT-Gパッケージング細胞株またはそれらの派生物に、形成された該コンカテマーアレイをトランスフェクトする段階;ならびに(e)安定した産生細胞株を単離する段階を含む、該安定した産生細胞株を作製する方法。
[本発明1032]
(a)HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNAをコードしかつHIV-1融合阻害物質をコードするレンチウイルスベクターを合成する段階であって、該レンチウイルスベクターが、本発明1001~1028のいずれかのプラスミドに該短鎖ヘアピンRNAと該融合阻害物質の両方をコードするcDNAをクローニングすることによって合成される、段階;(b)合成された該レンチウイルスベクターからDNA断片を生成する段階;(c)合成された該レンチウイルスベクター由来の生成された該DNA断片から、および抗生物質耐性カセットプラスミド由来のDNA断片から、コンカテマーアレイを形成する段階;(d)GPR、GPRG、GPRT、GPRGT、もしくはGPRT-Gパッケージング細胞株またはそれらの派生物に、形成された該コンカテマーアレイをトランスフェクトする段階;ならびに(e)安定した産生細胞株を単離する段階を含む、該安定した産生細胞株を作製する方法。
[本発明1033]
ベクター上清を約40時間~約56時間毎に回収する、安定した産生細胞株から該ベクター上清を回収する方法。
[本発明1034]
LVsh5/C46レンチウイルスベクターを含むベクター上清を約40時間~約56時間毎に回収する、該ベクター上清を回収する方法。
[本発明1035]
LVsh5/C46を産生させるのに適している安定した産生細胞株。
[本発明1036]
GPRGパッケージング細胞株に基づいている、本発明1035の安定した産生細胞株。
[本発明1037]
GPRTパッケージング細胞株に基づいている、本発明1035の安定した産生細胞株。
[本発明1038]
GPRパッケージング細胞株に基づいている、本発明1035の安定した産生細胞株。
[本発明1039]
自己不活性化レンチウイルスベクターを産生させるのに適している安定した産生細胞株であって、該レンチウイルスベクターが、SEQ ID NO: 8の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、安定した産生細胞株。
[本発明1040]
GPRGパッケージング細胞株に基づいている、本発明1039の安定した産生細胞株。
[本発明1041]
GPRTパッケージング細胞株に基づいている、本発明1039の安定した産生細胞株。
[本発明1042]
GPRパッケージング細胞株に基づいている、本発明1039の安定した産生細胞株。
[本発明1043]
第1のプラスミドにおよび第2のプラスミドに由来するDNA断片を含むコンカテマーアレイであって、該第1のプラスミドがpUC57-TL20cに由来し、該第2のプラスミドがブレオマイシン抗生物質耐性カセットを含み、該第1のプラスミド由来のDNA断片対該第2のプラスミド由来のDNA断片の比が、約25:1~約1:25の範囲である、コンカテマーアレイ。
[本発明1044]
GPR、GPRG、GPRT、GPRGT、およびGPRT-Gパッケージング細胞株またはそれらの派生物からなる群より選択されるパッケージング細胞株に、本発明1043のコンカテマーアレイをトランスフェクトすることによって作製される、安定した産生細胞株。
[本発明1045]
LVsh5/C46を産生する、本発明1044の安定した産生細胞株。
[本発明1046]
前記LVsh5/C46を約40時間~約56時間毎に回収することが可能である、本発明1045の安定した産生細胞株。
[本発明1047]
SEQ ID NO: 7に示されるヌクレオチド配列を含むマルチクローニングサイトを含む、図11のプラスミドマップを有する単離されたベクター。
[本発明1048]
本発明1001~1028のいずれかのプラスミドを切断する段階、および切断された該プラスミドの末端を、導入されるポリヌクレオチドの適合性末端に連結する段階を含む、プラスミドベクターを作製するための方法。
[本発明1049]
前記導入されるポリヌクレオチドが、HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNAの少なくとも1つをコードするか、またはHIV-1融合阻害物質をコードする、本発明1048の方法。
[本発明1050]
(a)本発明1001~1028のいずれかのレンチウイルストランスファーベクタープラスミドと;(b)パッケージング細胞株の細胞とを含む、キット。
[本発明1051]
前記パッケージング細胞株の細胞が、GPR、GPRG、GPRT、GPRTG、およびそれらの派生物からなる群より選択される、本発明1050のキット。
[本発明1052]
ブレオマイシン耐性(ble)カセットをさらに含む、本発明1050のキット。
[本発明1053]
本発明1001~1028のいずれかのプラスミドに由来する、レンチウイルスベクター。
[本発明1054]
少なくとも1つの追加のヌクレオチド配列を含む、本発明1053のレンチウイルスベクター。
[本発明1055]
前記少なくとも1つの追加のヌクレオチド配列が、HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNAをコードするヌクレオチド配列およびHIV-1融合阻害物質をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される、本発明1054のレンチウイルスベクター。
[本発明1056]
LVsh5/C46である、本発明1055のレンチウイルスベクター。
[本発明1057]
SEQ ID NO: 8の配列に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、本発明1055のレンチウイルスベクター。
[本発明1058]
本発明1053~1057のいずれかのレンチウイルスベクターを含む、細胞。
[本発明1059]
本発明1053~1057のいずれかのレンチウイルスベクターと担体とを含む、薬学的組成物。
一般的に、本開示は、安定した産生細胞株を作製する方法を提供する。本発明に従って提供されるような安定した産生細胞株の作製は、バイオセーフティーに対する懸念を緩和しつつ高力価レンチウイルスストックの生成の再現性および簡便性を高め、かつ、発現したエンベロープタンパク質の変化により、作製されたウイルスの親和性が規定される。本開示はまた、新規レンチウイルストランスファーベクタープラスミドも提供する。
レンチウイルスベクター(LV)は、分裂細胞と非分裂細胞の両方に安定して形質導入するそれらの効率および能力のために、遺伝子導入のための重要なツールである。結果として、研究者らは、広範囲の臨床応用において遺伝子送達ビヒクルとしてそれらを使用している。それにもかかわらず、現行の医薬品適正製造規範(current good manufacturing practice: cGMP)の方法を用いた大規模な臨床生産には、レンチウイルスベクターを用いた臨床試験が規制当局の承認を受けるときに考慮しなければならない一連の課題が付いてくる。cGMP適合性工程を設計する際の重要な考慮事項の1つは、多重cGMP生産用の一貫性のあるレンチウイルスを生産することが可能な製造工程に、規制当局の考慮事項を組み入れる必要があることである。臨床的に使用されているレンチウイルスベクターの大部分は、一過性トランスフェクションによって生産されてきた。しかしながら、一過性トランスフェクションに基づいた生産は、しばしば労働集約的であり、バラツキが多い。この理由から、最近、いくつかの安定したパッケージング細胞株系が開発されている。これらの細胞株をLVのバイオ製造に使用することは、スケーラビリティと一貫性の両方にとって特に魅力的であるが、そのような細胞株の開発には時間がかかり、これらの細胞株のcGMP使用のための規制当局による道筋はしっかり確立されていない。
本開示の一局面には、新規な、用途の広いマルチクローニングサイト(MCS)を含む、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)に基づいた第3世代の自己不活化(SIN)レンチウイルストランスファーベクタープラスミド(以後、「pUC57-TL20」という)がある(図11参照)。
本開示のいくつかの態様は、安定した産生細胞株を作製し、作製された安定な産生細胞株から産生されたレンチウイルスベクターを回収する方法である。図2を参照すると、安定した産生細胞株を作製する際の第1段階は、例えば、レンチウイルスベクタートランスファープラスミドからおよび抗生物質耐性カセットプラスミドなどの第2のプラスミドから、DNA断片を生成する(10)ことである。DNA断片の生成(10)に続いて、該DNAを用いてコンカテマーアレイを形成する(20)。続いて、該コンカテマーアレイを、パッケージング細胞株(例えば、GPR、GPRG、GPRT、GPRG、GPRT-G、またはそれらの派生物のパッケージング細胞株)に、例えばトランスフェクションによって、導入する(30)。該アレイの導入(30)およびその後のトランスフェクションに続いて、クローンを選別し(40)、かつ分離して(50)、安定した産生細胞株を作製する(60)。その後、レンチウイルスベクターを含むベクター上清を回収することができる。
「コンカテマー」または「コンカテマーアレイ」(本明細書では交換可能に使用される)(直接または間接的に直列に連結された同じDNA配列の複数コピーを含む長い連続DNA分子)が作製され、パッケージング細胞株のトランスフェクションにおいて使用される。いくつかの態様では、コンカテマーは、抗生物質耐性カセットが散在している、連結されたベクターゲノム発現カセットの大きなアレイである。
コンカテマーアレイの精製後、該アレイはパッケージング細胞株の細胞をトランスフェクトするために使用される。本明細書で使用する用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸(例えば、DNAまたはRNA)を細胞に導入するための当技術分野で認識されている様々な技術を指すものとする。本明細書に提供される実施例から明らかなように、レンチウイルス粒子の産生に対して許容状態の宿主細胞に、作製されたコンカテマーアレイをトランスフェクトすると、該細胞は、産生細胞、すなわち感染性レンチウイルス粒子を産生する細胞になる。
クローンの選択および選択されたクローンの増殖に続いて、選択されたクローンはベクター上清を産生するように誘導され、その誘導は当業者に公知の手順に従って行うことができる。誘導された安定な産生細胞株により産生されたレンチウイルスベクターを生成するために、培養上清が、いくつかの態様では、最大7日間にわたり毎日回収される。この生産プロトコールは、様々な試験ベクターを小規模で生産するために容易に用いることができる。この反復ウイルス回収プロトコールはまた、ウイルスベクターの最終収量を増加させることができる。しかし、毎日の回収と培地交換は経済的でないことが多く、毎日の回収に代わるものとして、新しい2日回収(two-day harvest)プロトコールが考え出された。以下に記載される、この新しいウイルスベクター生産プロトコールは、より少ない培地消費で同量のウイルスベクターを生成させることができる。
本出願人は、予期せざることに、2日回収がより伝統的な毎日回収の場合とほぼ同量のウイルスベクターの生成を可能にすると同時に、より少ない培地を必要とするという利点をもたらすことを見出した。
(1)産生細胞株の培養皿の古い培地をできるだけ完全に除去し、該細胞を1×PBSで洗浄する。
(2)該培養皿にTrypLE(商標)Express酵素(1×)を加える(ThermoFisher Scientific社から入手可能)。
(3)37℃のインキュベーターに2分間入れる。
(4)D10培地(薬物なし)を添加することにより細胞を洗い流し、上下にピペッティングして細胞クラスターを単一の細胞に解離させる(D10培地:ダルベッコ改変イーグル培地/高グルコース、GlutaMAX(商標)サプリメント、10%(w/v)FBSおよび1%(w/v)ペニシリン/ストレプトマイシン)。
(5)細胞を4℃、1200rpmで5分間遠心分離する。
(6)培地を吸引し、ペレットを新鮮なD10培地(薬物なし)中に軽く懸濁する。
(7)該細胞を約95%コンフルエントで培養皿に播種する(およそ4×106個/6mm培養皿の細胞を播種することによる;ベクター誘導)。
(8)播種した細胞に、予め温めた新鮮なD10培地を24時間後(誘導後1日目)に補充した。
(9)ウイルスベクターを、1回目の培地交換の48時間後(誘導後3日目)に該細胞から初回回収することができる。
(10)予め温めた新鮮な培地を該培養皿に加える。
(11)2回目の培地交換の48時間後(誘導後5日目)に2回目のウイルスベクター回収を行う。
(12)予め温めた新鮮な培地を該培養皿に加える。
(13)3回目の培地交換の48時間後(誘導後7日目)に3回目のウイルスベクター回収を行う。
(1)産生細胞株の培養皿の培地をできるだけ完全に除去し、該細胞を1×PBSで洗浄する。
(2)洗浄した細胞単層上に1×TrypLE Expressを、100mm培養皿の場合は3mL使用して、ピペットで静かに分注する。
(3)TrypLE Expressで単層を覆うようにフラスコを回転させる。
(4)フラスコをインキュベーターに戻し、2分間放置する。
(5)フラスコの片面を軽くタッピングして、付着している残りの細胞を剥離させる。
(6)新鮮なD10培地(抗生物質なし)2mLに該細胞を再懸濁し、15mLコニカル遠心チューブに移す。
(7)細胞を1200rpmで5分間遠心分離する。
(8)培地を吸引し、ペレットを新鮮なD10培地(抗生物質なし)5mL中に軽く懸濁する。
(9)TC10(商標)全自動セルカウンターにより細胞数を測定する。
(10)該細胞を>95%コンフルエントで培養皿に播種する(60mm培養皿に4×106個の生細胞を播種することによる)。
(11)播種した細胞に予め温めた新鮮なD10培地を毎日(24時間毎に)補充した。
本明細書に記載の方法を用いて、HIV-1共受容体CCR5の下方制御のための短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を、HIV-1融合阻害物質C46と組み合わせて、コードする自己不活性化レンチウイルスベクター(SIN-LV)であるLVsh5/C46を産生させるための安定した細胞株を作製した。一過性トランスフェクションにより産生されたこのLVは、HIV感染者による臨床試験において現在評価中である。ここで、本発明者らは、一過性トランスフェクションにより産生されたLVsh5/C46と、本明細書に記載の方法を用いて産生されたLVsh5/C46の比較分析を行って、LVsh5/C46および他のSIN-LVの臨床製造へのこのシステムの適用を裏付ける。
1. 略語: TU、形質導入単位;VCM、ウイルス含有培地。
2. VCMは超遠心分離によって20%スクロースクッションに通して100倍に濃縮した。
GPRG細胞株システムは、自己不活性化レンチウイルスベクター(SIN-LV)の臨床生産のために以前に樹立されている。ここで、本発明者らは、HIV感染者の治療のために診療所で現在評価されているSIN-LVであるLVsh5/C46を産生させるための、GPRGに基づいている産生細胞株を樹立しようとした。このベクターは2つのウイルス侵入阻害物質、すなわちHIV共受容体CCR5に対する短鎖ヘアピンRNAであるsh5およびウイルス融合阻害物質であるC46、をコードする。本発明者らはまた、LVsh5/C46のバイオ生産用のGPRGシステムの承認申請と臨床応用に必要とされるGPRGパッケージング細胞株、GRPGベースのLVsh5/C46産生細胞株、およびテトラサイクリン誘導後のLVsh5/C46産生の安定性を明確にしようとした。
段階1
490mLの脱イオン水を10mLの50×TAE((Tris-アセテート-EDTA)緩衝液)と合わせることにより、500mLの1×TAEランニング緩衝液を調製する。
1gのアガロースおよび100mLの1×TAE緩衝液(2mLの50×TAEに98mLのオートクレーブ滅菌水を添加)をビーカーに入れて1%アガロースゲルを作り、この混合物を固体粒子または気泡がなくなるまで(約2.5分間)マイクロ波処理する。
該混合物を3分間冷却させる。
アガロースゲル混合液に10μLのGelRed(商標)を添加して、撹拌する(Biotium社から入手可能)。
ゲルキャスターとゲルコームを組み立てる。該混合物をゲルモールドに注ぎ、それを30分間冷ます(大きいコームの場合の容量:60μL)。
ゲルが冷めたら、ゲルが完全に浸水するまでボックスに1×TAE緩衝液を充填する。
DNAを線状化するために消化反応混合液を室温で調製する。
25μgのベクタープラスミドを制限酵素SfiIで消化する。別の反応で、耐性カセットプラスミドPGK-bleをPflMIで消化する(10μgは十分過ぎるほどである)。
10μLのGeneRuler 1kb plus DNAラダー混合物(2μLのDNAラダー+8μLのヌクレアーゼフリー水)および50μLのサンプル混合物を使用可能なスロットに加える。
電気泳動装置の電源を入れて、150Vの電圧で1時間運転する。
該ゲルをUVP PhotoDoc-Itイメージングシステムに移し、結果の画像を取得する。
Eye-Fiウェブサイトからゲル写真をダウンロードする。
NanoDrop 2000分光光度計を用いて各サンプルのDNA濃度を測定する。
アガロースゲルからDNAバンドを切り出す。
1容量のゲルに3倍容量のBuffer QGを加える(一般には500μLのQGを加える)。
ゲルスライスが完全に溶解した後、50℃で10分間インキュベートする。
サンプルをQIAquickカラムにアプライして、17,900rpmで1分間遠心分離する(Qiagen社から入手可能)。
フロースルーを捨て、QIAquickカラムを同じ収集用チューブに戻す。
QIAquickカラムに0.5mlのBuffer QGを添加し、1分間遠心分離する。
QIAquickカラムに0.75mlのBuffer PEを添加し、1分間遠心分離する。
フロースルーを捨て、QIAquickカラムを17,900rpmでさらに1分間遠心分離する。
QIAquickカラムを清浄な1.5ml微量遠心チューブに入れる。
DNAを溶出するために、35μLのBuffer EBをQIAquickメンブレンの中央に加え、カラムを17,900rpmで1分間遠心分離する(Buffer EBは10mM Tris-Cl, pH8.5である)。
NanoDrop 2000分光光度計を用いてDNA断片の濃度を測定する(表1;ブランク測定にEB緩衝液を使用)。
氷上で1.7mLエッペンドルフ微量遠心チューブ内にライゲーション反応をセットアップする。
予め構築されたスプレッドシート(Concatemeric Ligations. xlsx)を使用して、ベクター対PGK-bleのモル比が約25:1になるように混合する必要がある各断片の容量を計算する。
ライゲーション反応における断片の容量を最大化し、所望のモル比を維持する。
T4 DNAリガーゼ緩衝液を解凍し、室温で再懸濁すべきである(T4 DNAリガーゼ緩衝液は以下の成分を含む:50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、10mM DTT、pH7.5)。
ライゲーション反応をピペットで分注する。上記の例では、10μLの10×ライゲーション緩衝液(NEB Quick Ligationキット)および0.5μLのリガーゼ酵素(New England BioLabs社から入手可能)を添加することにより90μLのDNA混合物を使用した。
以下の成分を含む反応混合物を室温で調製する。
上下にピペッティングして軽く混合する。
室温で一晩インキュベートする。
コンカテマーアレイを回収し、GPRG細胞へのトランスフェクション前にシリカベースのメンブレン(DNeasy Blood & Tissue Kit)により精製した。
2ml収集用チューブに入れたDNeasy Miniスピンカラムにコンカテマーアレイ混合物をピペットで移す。
8000×gで1分間遠心分離する。フロースルーと収集用チューブを捨てる。
該DNeasy Miniスピンカラムを新しい2ml収集用チューブ(装備品)(Qiagen社から入手可能)に入れる。
500μLのBuffer AW1を加えて、8000×gで1分間遠心分離する。
フロースルーと収集用チューブを捨てる。
該DNeasy Miniスピンカラムを新しい2ml収集用チューブ(装備品)に入れる。
500μLのBuffer AW2を加え、20,000×gで3分間遠心分離してDNeasyメンブレンを乾燥させる。
フロースルーと収集用チューブを捨てる。
該DNeasy Miniスピンカラムを清浄な1.7mlエッペンドルフ微量遠心チューブに入れる。
200μLのBuffer AEを該DNeasyメンブレンに直接添加する。
室温で4分間インキュベートする。
8000×gで1分間遠心分離してDNA混合物を溶出する。
溶出を1回繰り返す。
NanoDrop Lite分光光度計でコンカテマーDNA濃度を測定する。
細胞をウイルスベクターの産生に使用する前に、細胞を解凍した後で少なくとも4回継代する。
ベクターの誘導前に、トリパンブルー法を用いて細胞が健全であり、95%超が生存可能であることを確認する(トリパンブルーは一般に生存細胞計数のための色素排除法において使用される。この方法は、生きた(生存可能な)細胞は特定の色素を取り込まないが、死んだ(生存不可能な)細胞は取り込むという原理に基づく。染色は細胞形態の可視化を容易にする)。
所望の量のGPRG細胞を培養する。
細胞を播種する前に、細胞を毎日の継代で少なくとも2回二次培養する。
1日目に、GPRG細胞株の培養皿の培地を除去し、該細胞を1×PBSで洗浄する。
洗浄した細胞単層上に1×TrypLE Expressを、T75フラスコでは3mlを、T25フラスコでは1mLを使用して、ピペットで静かに分注する。
TrypLE Expressで該単層を覆うようにフラスコを回転させる。
フラスコをインキュベーターに戻し、2分間放置する。
フラスコの片面を軽くタッピングして、付着している残りの細胞を剥離させる。
2mLの新鮮なD10培地に該細胞を再懸濁し、15mLコニカル遠心チューブに移す。
細胞を1200rpmで5分間遠心分離する。
培地を吸引し、ペレットを、ドキシサイクリン(1ng/mL)を含む5mLの新鮮なD10培地中に軽く懸濁する。
TC10(商標)全自動セルカウンターにより細胞数を測定する(表5)。
トランスフェクションの20~24時間前に該細胞を80%コンフルエントで培養皿に播種する(ドキシサイクリンを含む60mm培養皿に3.2×106個の生細胞を播種することによる;表9)。
コンカテマーアレイの形成を準備する(例えば、実施例3参照)。
2日目に、トランスフェクションに先立ってCalPhos(商標)Mammalian Transfection Kitを室温に戻す(表7)(ClonTech社から入手可能)。
コンカテマーDNAを精製し、その濃度を測定する(コンカテマーアレイは本明細書に記載の方法に従って精製することができる)。
トランスフェクションプラスミドDNA表を作成する(表8;4mL、60mm培養皿)。
各トランスフェクションのために、溶液Aおよび溶液Bを別々の15mLコニカル遠心チューブに調製する。
ピペットを用いて溶液B(2×HBS)をバブリングし、溶液A(DNA混合物)を一滴ずつ添加する。
該トランスフェクション溶液を室温で15分間インキュベートする。
該トランスフェクション溶液を該培養皿に静かに加える。
プレートを静かに前後に動かして、トランスフェクション溶液をむらなく分配する。
プレートをCO2インキュベーター内で37℃、4時間インキュベートする。
37℃のCO2インキュベーター内で60mm培養皿あたり5mLの新鮮なD10培地を温める。
4時間後、1mLの予め温めたD10培地で洗浄し、4mLの予め温めた新鮮なD10培地と交換する。
37℃の5%CO2インキュベーターでインキュベートする。
コンカテマートランスフェクションの48時間後、トランスフェクトされたGPRG細胞を回収する(二次培養用の細胞で行う)。
ゼオシン(50μg/ml)とドキシサイクリン(1ng/mL)を含む新鮮なD10培地を用いて、T150フラスコまたは30mL,150mm培養皿に該細胞を再播種する。
細胞フォーカスが確認されるまで(通常1~2週間以内に観察される)、該細胞にドキシサイクリン(1ng/mL)を含む選択培地(ゼオシン、50μg/ml)を3~4日毎に供給する。
HEK-293T/17はHEK-293Tのサブクローンである。これらの細胞はSV-40 T抗原を安定に発現し、特定のクローンを特にその高いトランスフェクション能力(transfectability)のために選択した。HEK-293T/17に基づくマスター細胞バンク(HEK-293T/17 MCB)が作製された。
(1) pSFG tcLuc ECT3は、テトラサイクリン調節プロモーター系を用いる制御された遺伝子発現に適した、レトロウイルスベクター骨格プラスミド(SFG)の派生物である(Lindemann, D., Patriquin, E., Feng, S., & Mulligan, R.C. Versatile retrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro and in vivo. Mol. Med. 3, 466-476 (1997));
(2) CMVエンハンサー/プロモーター駆動されたコドン最適化HIV NL4-3 gagpol遺伝子;
(3) pMSCVpacに由来するPGKプロモーター駆動ピューロマイシン耐性遺伝子(Hawley, R.G., Lieu, F.H., Fong, A.Z., & Hawley, T.S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994))。
(1) 上記のようなNL4-3株の配列に基づくHIV rev遺伝子;および
(2) pSFG tcLuc ECT3(上記)。
GPRG細胞へのトランスフェクション前に、シリカベースのメンブレン(DNeasy Blood & Tissue Kit)でコンカテマーを回収し、精製した。
2mL収集用チューブに入れたDNeasy Miniスピンカラムにコンカテマーアレイ混合物をピペットで移す。
6000×gで1分間遠心分離する。フロースルーと収集用チューブを捨てる。
該DNeasy Miniスピンカラムを新しい2mL収集用チューブ(装備品)に入れる。
500μLのBuffer AW1を加えて、6000×gで1分間遠心分離する。
フロースルーと収集用チューブを捨てる。
該DNeasy Miniスピンカラムを新しい2ml収集用チューブ(装備品)に入れる。
500μLのBuffer AW2を加え、20,000×gで3分間遠心分離してDNeasyメンブレンを乾燥させる。
フロースルーと収集用チューブを捨てる。
該DNeasy Miniスピンカラムを清浄な1.7mLエッペンドルフ微量遠心チューブに入れる。
200μLのBuffer AEを該DNeasyメンブレンに直接添加する。
室温で4分間インキュベートする。
6000×gで1分間遠心分離してDNA混合物を溶出する。
溶出を1回繰り返す(新しい溶出緩衝液を加える)。
NanoDrop Lite分光光度計でコンカテマーDNA濃度を測定する。
以下の表は、本明細書に記載の方法に従って合成された2つの産生細胞株を要約したものである。TL20-Cal1-wpreおよびTL20-Unc-GFPベクターに関するデータは、図20A、20B、および20Cにさらに示されている。
2. USC Flow Cytometry Core Facilityでフローサイトメーターを使用することにより単一細胞ソーティングを行う。
3. 馴化培地: GlutaMax含有DMEM; FBS (10%w/v); ペニシリン/ストレプトマイシン(1%w/v); ドキシサイクリン(1ng/mL)。
Claims (17)
- SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を有するベクターカセットを含む、組換えプラスミドであって、該ベクターカセットが、レンチウイルスベクター骨格をコードし、該組換えプラスミドが、4つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含むマルチクローニングサイトを含み、かつ、該4つの制限エンドヌクレアーゼ部位が、BstBI、MluI、NotI、およびClaI制限エンドヌクレアーゼ部位である、組換えプラスミド。
- 前記ベクターカセットが、SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも97%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の組換えプラスミド。
- 前記組換えプラスミドが、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1または2に記載の組換えプラスミド。
- 前記ベクターカセットが、少なくとも2つの制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接しており、該少なくとも2つの制限エンドヌクレアーゼ部位が、sfiIおよびBsu36Iからなる群より独立して選択される、請求項1または2に記載の組換えプラスミド。
- 前記ベクターカセットの上流にテトラサイクリン抑制性プロモーターを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の組換えプラスミド。
- 前記組換えプラスミドが、(a)パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列と;(b)セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列と;(c)Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列と;(d)自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列とを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の組換えプラスミド。
- 前記パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 3の配列を含み、
前記セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 4の配列を含み、
前記Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 5の配列を含み、または
前記自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 6の配列を含む、
請求項6に記載の組換えプラスミド。 - 前記マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 7の配列を含む、請求項6に記載の組み換えプラスミド。
- 前記組み換えプラスミドが、内部プロモーターを含まない、請求項1または2に記載の組み換えプラスミド。
- SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を有するベクターカセットを含む、組換えプラスミドであって、該ベクターカセットが、レンチウイルスベクター骨格をコードし、かつ、該組換えプラスミドが、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
- 前記組換えプラスミドが、(a)パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列と;(b)セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列と;(c)Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列と;(d)自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列とを含む、請求項10に記載の組換えプラスミド。
- SEQ ID NO: 2に示した配列とはヌクレオチド100個以下だけ異なるヌクレオチド配列を有するベクターカセットを含む、組換えプラスミドであって、該組換えプラスミドが、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
- マルチクローニングサイトにクローニングされた導入遺伝子とともに請求項1~12のいずれか一項に記載の組み換えプラスミドを含む、レンチウイルスベクター。
- 請求項13に記載のレンチウイルスベクターのベクターカセット配列と、抗生物質耐性カセットと、を含む、コンカテマーDNA。
- 前記コンカテマーDNAが、一方向性コンカテマーである、請求項14に記載のコンカテマーDNA。
- 請求項14または15に記載のコンカテマーDNAがトランスフェクトされたパッケージング細胞株であって、該パッケージング細胞株がGPR、GPRG、GPRT、およびGPRT-Gパッケージング細胞株からなる群から選択される、パッケージング細胞株。
- 請求項16に記載のトランスフェクトされたパッケージング細胞株から選択される安定した産生細胞株。
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