KR20180002795A - 렌티바이러스 벡터의 바이오-생산 - Google Patents

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치-린 리
제프리 에스. 바틀렛
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칼리뮨, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 안정한 생산 세포주의 생산 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 제공된 것과 같은, 안정한 생산 세포주의 생산은 높은 역가의 렌티바이러스 스톡의 생산의 재현성 및 용이성을 증가시키는 한편 생물안정성 문제를 완화시키고 발현된 외피 단백질의 변이는 생산된 바이러스의 굴성을 정의한다. 본 발명은 또한 신규한 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드를 제공한다.

Description

렌티바이러스 벡터의 바이오-생산
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/161,133호의 출원일의 이익을 주장하며; 또한 2015년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/161,152호의 출원일의 이익을 주장하고, 이의 개시 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 바이러스학의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 렌티바이러스 벡터 및 렌티바이러스 전달 플라스미드의 바이오-생산에 관한 것이다.
산업적 응용의 언급
본 발명은 유전자 치료 및 바이오-제조 분야에서 산업적 이용가능성을 갖는다.
HIV-1은 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)의 원인균으로서 전세계적으로 3천만 명의 감염자가 있다. HIV는 면역 체계를 파괴시키며 기회 감염으로 인한 사망 확률을 높인다. HIV 감염은 세계 보건 기구에 의해 전염병으로 지정되면서 입증된 주요 세계 건강 문제이다. HIV에 감염된 대부분의 사람들, 특히 개발 도상국에서 결국 매년 1백만 명 이상의 생명을 빼앗아 가는 AIDS가 발생한다.
HIV-1은 바이러스의 레트로바이러스과 패밀리에 속하며, 외피를 가지고 있고 (enveloped) 이의 게놈은 2개의 단일 가닥 RNA 분자 (ssRNA)로 이루어져 있다. HIV-1의 주요 표적은 CD4+ 발현 세포, 예컨대 CD4+ T 세포이다. HIV-1 바이러스의 당단백질은 표적 세포의 CD4 분자 및 표적 세포의 표면상의 케모카인 공동(co-) 수용체인 CCRS 또는 CXCR4와 상호작용한다. 표적 세포에 융합되어 들어간 후, 바이러스 게놈을 함유하는 뉴클레오캡시드가 해리되어, ssRNA를 포함하여, 바이러스의 내용물을 세포질 내에 방출한다. HIV-1의 역전사 (RT) 효소는 ssRNA 게놈으로부터 바이러스 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 합성한다. 이중 가닥 HIV-1 DNA 분자의 합성 후 HIV-1 DNA는 숙주 게놈에 통합된다.
통합된 HIV-1 DNA는 통합된 HIV-1 게놈의 전사를 개시할 수 있는 HIV-1로부터 동일한 5' 및 3' 긴 말단 반복 서열 (LTR)에 의해 측부에 위치한다. 바이러스 DNA의 전사는 활성화된 T 세포에서 상향조절되는 NF-kB와 같은 전사 인자를 필요로 한다. 그 결과, 바이러스 전사는 감염 중과 같이 T 세포 활성화 후에 T 세포에서 가장 활성화된다. 통합된 HIV-1 게놈의 전사로 인해 생성된 바이러스 RNA는 이어서 번형되고 바이러스 입자내로 포장되어 세포를 탈출하여 감염성 바이러스가 된다.
HIV-1 감염 치료는 복합 항레트로바이러스 요법 (cART)을 포함한다. 뉴클레오시드 유사체 역전사 효소 억제제, 단백질 억제제, 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 인터그라제 및 융합 억제제의 조합을 포함하는 cART는 HIV의 진행을 늦춘다. 이는 결과적으로 치료가 가능한 세계의 지역에서 HIV/AIDS로 인한 이병률 및 사망률을 극적으로 감소시킨다. 그러나 cART는 HIV/ AIDS의 모든 증상을 치료하거나 완벽하게 제거하지 않는다. 또한, cART 요법은 약물 저항성 돌연변이에 의해 손상 (compromised)될 수 있으며, 심각할 수 있고 누적되는 것으로 보이는 일련의 부작용이 있다. 또한, cART 요법의 중단은 거의 변함 없이 검출가능한 바이러스 복제의 재발과 AIDS로의 진행을 유도하고 사망률 및 심각한 비 AIDS 발생의 모든 원인의 발생 빈도의 증가와 관련이 있는 것으로 나타났다. 이러한 이유로, 높은 비용의 cART와 엄격한 준수가 필요할 뿐만 아니라, 이러한 치료는 다수의 환자에게 상대적으로 비효율적일 수 있다.
HIV-기반 렌티바이러스 벡터는 연구 및 임상적인 유전자 전달 응용에서 빠르게 레트로바이러스 시스템으로 선택되고 있다. 휴지 줄기세포 및 비-분열 말단 분화된 세포 모두를 형질도입시키기 위한 렌티바이러스 벡터의 향상된 능력은 광범위한 치료적 유전자 전달 벡터의 개발뿐만 아니라, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 유전자 넉다운 라이브러리 및 말단 분화된 세포에서 다분화능의 도입을 위한 벡터와 같은 유망한 연구 도구의 개발을 이끌어 왔다. 조기 감마-레트로바이러스 임상 유전자 치료 벡터는 X-연관된 중증 복합 면역결핍증 (SCID-X1)을 가진 환자에서 면역 기능을 회복시켰지만, 후속적으로 원암-유전자 (proto-oncogene)의 전사 활성화를 통해 증식성 장애를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 최신 렌티바이러스 벡터 고안은 이러한 위험성을 현저히 감소시킬 수 있으며, 이의 예측된 안전성에 대한 최종 검증을 위한 임상 시험을 기다리고 있다. 이러한 분야는 여전히 유동적이며 임상 시험의 결과는 예측할 수 없다.
SIN- 렌티바이러스 벡터를 임상 시험을 지원하기 위한 규모로 생산하는 것은 이 분야에서 중요한 과제이다. 감마-레트로바이러스 벡터는 일시적인 형질감염 또는 안정한 생산 세포주의 생성에 의해 생산될 수 있지만, 렌티바이러스는 다중 세포독성 부속 유전자의 발현을 필요로 하기 때문에, 생산 세포의 생산을 더욱 복잡하게 만든다 (Greene et al., Transduction of Human CD34+ Repopulating Cells with a Self - Inactivating Lentiviral Vector for SCID-X1 Produced at Clinical Scale by a Stable Cell Line, HGTM, 23, 297-308 (October 2012), 이의 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있음). 일시적인 형질감염은 대신 LV의 시험 (pilot) 생산을 위한 현재의 기술이며, 안전성, 비용, 및 재현성 관점에서 매우 큰 규모 응용에는 비실용적이다. 실제로, 이러한 기술은 값이 비싸며, 표준화 및 규모 확장이 어렵고 배치 간의 가변성 및 낮은 역전사 충실도의 문제가 있다 (Stornaiuolo et al., RD2-MolPack-Chim3, a Packaging Cell Line for Stable Production of Lentiviral Vectors for Anti-HIV Gene Therapy, HGTM, 24:228-240 (August 2013), 이의 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있음).
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 플라스미드로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 유도된 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 공동-수용체 및/또는 HIV-1 융합 억제제의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하는 하나 이상의 추가 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이로부터 유도된 렌티바이러스 벡터는 LVsh5/C46이다 (본원에 정의되어 있음).
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 플라스미드로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 유도된 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 공동-수용체 (예컨대 CCR5) 및/또는 HIV-1 융합 억제제 (예컨대 C46)의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하는 하나 이상의 추가 서열을 포함한다. 이들 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CCR5 및 C46에 대한 정보가 미국 특허 공개 제US2012/0201794호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 97% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 플라스미드로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 유도된 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 공동-수용체 (예컨대 CCR5) 및/또는 HIV-1 융합 억제제 (예컨대 C46)의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하는 하나 이상의 추가 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1에 기재된 서열 (예컨대 비-연속적 또는 연속적)로부터 500개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 갖는 플라스미드이다. 본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1에 기재된 서열 (예컨대 비-연속적 또는 연속적)로부터 250개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 갖는 플라스미드이다. 본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1에 기재된 서열 (예컨대 비-연속적 또는 연속적)로부터 150개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 갖는 플라스미드이다. 본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1에 기재된 서열 (예컨대 비-연속적 또는 연속적)로부터 100개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 갖는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 상기 서열은 서열번호 1에 기재된 서열 (예컨대 비-연속적 또는 연속적)로부터 50개 이하가 다르다.
본 발명의 또 다른 양태는 약 6500개 뉴클레오티드 내지 약 6750개 뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드이며, 이때, 상기 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 이의 서열 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 약 6600개 뉴클레오티드 내지 약 6700개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 약 6611개 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 도 11에 pUC57-TL20c로 기재된 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 플라스미드로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 유도된 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 공동-수용체 및/또는 HIV-1 융합 억제제의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하는 하나 이상의 추가 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 BstBI, MluI, Notl, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위로 필수적으로 이루어진 다중 클로닝 부위를 포함하는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 포장 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 중심 폴리퓨린 관을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 자가-불활성화 (self-inactivating) 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 플라스미드는 BstBI, MluI, Notl, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위로 이루어진 다중 클로닝 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 플라스미드로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 유도된 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 공동-수용체 및/또는 HIV-1 융합 억제제의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하는 하나 이상의 추가 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 포장 서열(packaging signal)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (b) 중심 폴리퓨린 관(cPPT)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (c) Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (d) 자가-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 효소 BstBI, Mlu I, Not I, 및 Cla I에 대한 제한 부위를 갖는 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 포장 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중심 폴리퓨린 관 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7의 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 플라스미드 뉴클레오티드 서열의 약 762번째 뉴클레오티드 내지 약 1104번째 뉴클레오티드에 존재하는 포장 서열; (b) 플라스미드 뉴클레오티드 서열의 약 1121번째 뉴클레오티드 내지 약 1597번째 뉴클레오티드에 존재하는 중심 폴리퓨린 관; (c) 플라스미드 뉴클레오티드 서열의 약 1598번째 뉴클레오티드 내지 약 2366번째 뉴클레오티드에 존재하는 Rev 반응 요소; (d) 플라스미드 뉴클레오티드 서열의 약 409번째 뉴클레오티드 내지 약 589번째 뉴클레오티드에 존재하는 자기-불활성화 긴 말단 반복; 및 (e) 플라스미드 뉴클레오티드 서열의 약 2376번째 뉴클레오티드 내지 약 2400번째 뉴클레오티드에 존재하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 플라스미드 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 포장 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중심 폴리퓨린 관 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7의 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 BstBI, MluI, NotI, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 플라스미드이며, 이때, 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 플라스미드로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 유도된 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 공동-수용체 및/또는 HIV-1 융합 억제제의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하는 하나 이상의 추가 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 벡터 백본을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드이며, 이때, 상기 벡터 백본은 적어도 2개의 추가의 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 측부위 위치하며, 상기 적어도 2개의 추가의 제한 엔도뉴클레아제 부위는 sfil 및 Bsu36I로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 플라스미드로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 유도된 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 공동-수용체 및/또는 HIV-1 융합 억제제의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하는 하나 이상의 추가 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 벡터 백본을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드이며, 상기 벡터 백본은 BstBI, MluI, NotI, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 다중 클로닝 부위를 포함하며, 이때, 플라스미드는 벡터 백본의 테트라사이클린 억제가능한 프로모터 상류를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 벡터 백본을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드이며, 상기 벡터 백본은 BstBI, MluI, NotI, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 다중 클로닝 부위로 이루어져 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기술된 바와 같은 플라스미드 또는 이로부터 유도된 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 조혈전구/줄기 세포, 단핵구, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, 또는 수지상 세포이다. 본 발명의 또 다른 양태는 제1 용기 내에 조혈전구/줄기 세포 및 도 11의 플라스미드 또는 이로부터 유도된 렌티바이러스 벡터를 포함하는 키트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 하나 이상의 유전자를 본원에 기술된 플라스미드, 예컨대 pUC57-TL20c에 클로닝하여 렌티바이러스 벡터를 합성하는 단계; (b) 합성된 렌티바이러스 벡터로부터 DNA 단편을 생성하는 단계; (c) 합성된 렌티바이러스 벡터로부터 생성된 DNA 단편 및 항생제 저항성 카세트 플라스미드로부터의 DNA 단편으로부터 콘카테머 어레이(concatemeric array)를 형성하는 단계; (d) GPR, GPRG, GPRT, GPRGT 또는 GPRT-G 포장 세포주 또는 이의 유도체를 형성된 콘카테머 어레이로 형질감염시키는 단계; 및 (e) 하나 이상의 안정한 생산 세포주 클론을 분리하는 단계를 포함하는 안정한 생산 세포주를 생성하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) HIV-1 공동-수용체의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하고 HIV-1 융합 억제제를 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 합성하는 단계로서, 상기 렌티바이러스 벡터는 짧은 헤어핀 RNA 및 융합 억제제 둘 모두를 암호화는 cDNA를 본원에 기술된 플라스미드에 클로닝함으로써 합성되는 단계; (b) 합성된 렌티바이러스 벡터로부터 DNA 단편을 생성하는 단계; (c) 합성된 렌티바이러스 벡터로부터 생성된 DNA 단편 및 항생제 저항성 카세트 플라스미드로부터의 DNA 단편으로부터 콘카테머 어레이를 형성하는 단계; (d) GPR, GPRG, GPRT, GPRGT 또는 GPRT-G 포장 세포주 또는 이의 유도체를 형성된 콘카테머 어레이로 형질감염시키는 단계; 및 (e) 하나 이상의 안정한 생산 세포주 클론을 분리하는 단계를 포함하는 안정한 생산 세포주를 생산하는 방법이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 HIV-1 공동 수용체의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하고 HIV-1 융합 억제제 (LVsh5/C46)를 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해 안정한 생산 세포주를 유도하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 안정한 생산 세포주로부터 벡터 상등액을 회수하는 방법이며, 이때, 벡터 상등액은 약 48시간 마다 회수된다. 본 발명의 또 다른 양태는 안정한 생산 세포주로부터 벡터 상등액을 회수하는 방법이며, 이때, 벡터 상등액은 40 내지 56시간 마다 회수된다.
본 발명의 또 다른 양태는 LVsh5/C46 렌티바이러스 벡터를 포함하는 벡터 상등액을 회수하는 방법이며, 이때, 벡터 상등액은 약 48시간 마다 회수된다.
본 발명의 또 다른 양태는 LVsh5/C46의 생산에 적절한 안정한 생산 세포주이다. 일부 구현예에서, 안정한 생산 세포주는 GPRG 포장 세포주에 기초한다. 일부 구현예에서, 안정한 생산 세포주는 GPRT 포장 세포주에 기초한다. 일부 구현예에서, 안정한 생산 세포주는 GPR 포장 세포주에 기초한다. 일부 구현예에서, 안정한 생산 세포주는 GPRT-G 포장 세포주에 기초한다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 8의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터의 생산에 적절한 안정한 생산 세포주이다. 일부 구현예에서, 안정한 생산 세포주는 GPRG 포장 세포주에 기초한다. 일부 구현예에서, 안정한 생산 세포주는 GPRT 포장 세포주에 기초한다. 일부 구현예에서, 안정한 생산 세포주는 GPR 포장 세포주에 기초한다. 일부 구현예에서, 안정한 생산 세포주는 GPRT-G 포장 세포주에 기초한다.
본 발명의 또 다른 양태는 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드로부터의 DNA 단편을 포함하는 콘카테머 어레이이며; 제1 플라스미드는 pUC57-TL20c로부터 유도되고; 제2 플라스미드는 블레오마이신 항생제 저항성 카세트를 포함하고; 이때, 제1 플라스미드 대 제2 플라스미드의 DNA 단편 비는 약 50:1 내지 약 1:50의 범위이다. 일부 구현예에서, 제1 플라스미드 대 제2 플라스미드로부터의 DNA 단편 비는 약 25:1 내지 약 1:25이다. 일부 구현예에서, 제1 플라스미드 대 제2 플라스미드로부터의 DNA 단편 비는 약 15:1 내지 약 1:15이다.
본 발명의 또 다른 양태는 안정한 생산 세포주이며, 상기 안정한 생산 세포주는 GPR, GPRG, GPRT, GPRT-G 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 포장 세포주를 콘카테머 어레이로 형질전환시킴으로써 생산되며, 상기 콘카테머 어레이는 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드로부터의 DNA 단편을 포함하며; 제1 플라스미드는 pUC57-TL20c로부터 유도되고; 제2 플라스미드는 블레오마이신 항생제 저항성 카세트를 포함하고; 이때 제1 플라스미드 대 제2 플라스미드로부터의 DNA 단편 비는 약 25:1 내지 약 1:25이다. 일부 구현예에서, 안정한 생산 세포주는 LVsh5/C46을 생산한다. 일부 구현예에서, LVsh5/C46은 약 48시간 마다 회수될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 도 11의 플라스미드 맵을 갖는 분리된 벡터이다.
본 발명의 또 다른 양태는 (1) 본원에 기술된 플라스미드, 및 (2) 블레오마이신 저항성 (ble) 카세트를 포함하는 키트이다. 일부 구현예에서, 키트는, 본원에 기술된 절차에 따른 것과 같은, 렌티바이러스 벡터 및/또는 콘카테머 어레이의 제조를 위한 지침을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 본원에 기술된 바와 같은 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드; 및 (b) 포장 세포를 포함하는 키트이다. 일부 구현예에서, 포장 세포는 GPR, GPRG, GPRT, GPRTG, 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 키트는 블레오마이신 저항성 (ble) 카세트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는, 본원에 기술된 절차에 따른 것과 같은, 렌티바이러스 벡터 및/또는 콘카테머 어레이의 제조를 위한 지침을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기술된 바와 같은 플라스미드로부터 유도된 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 적어도 하나의 추가 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가 뉴클레오티드 서열은 HIV-1 공동-수용체의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 HIV-1 융합 억제제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 LVsh5/C46이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 서열번호 8의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기된 렌티바이러스 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이다. 일부 구현예에 약학적으로 허용되는 담체는 인간에게 투여하기에 적절한 약제와 같은, 약제를 제형화하는데 사용하기에 적절한 용매, 완충액, 용액, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 화합물을 약제학적 담체와 제형화하는 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 Remington's Pharmaceutical Science, (17th ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1985); 및 Goodman & Gillman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics (11th Edition, McGraw-Hill Professional, 2005)에 기술되어 있으며, 이의 기술내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.
도 1은 동일한 렌티바이러스 벡터가 확립된 절차에 따라 HEK293T/17 세포 상에 일시적인 형질감염에 의해, 또는 GPRG-기반의 안정한 생산 세포주의 사용에 의해 반복적으로 생산됨을 나타낸다. 벡터 함유 배지 (VCM)를 초원심분리로 100x로 농축하고 렌티바이러스 (LV) 역가를 유전자 형질도입 분석법으로 측정하였다.
도 2는 안정한 생산 세포주를 생산하는 방법 및 생산된 안정한 생산 세포주로부터 생산된 렌티바이러스 벡터를 회수하는 방법을 나타낸다.
도 3은 3개월 기간의 연속적인 계대에 걸쳐 2개의 상이한 세포주 MWCB에 대한 생산 세포주 안정성 평가를 나타낸다. 규칙적인 간격으로, LV를 테트라사이클린 (TET) 제거로 유도하고 VCM을 유전자 형질도입 분석법에 의해 LV 역가에 대해 평가하였다. 두 세포주 모두 3개월의 기간 및 약 25회 초과의 계대 동안 안정하였고 le6/ml 초과하는 LV를 생산할 수 있었다.
도 4는 TET의 제거에 의해 유도한 후 렌티바이러스 벡터 생산의 동력학을 나타낸다. 벡터 역가를 유전자 형질도입 분석법에 의해 VCM에서 평가하였다. 모든 경우에서, GPRG-기반의 안정한 생산 세포주가 유도 후 적어도 5일 동안 약 le6 TU/ml (농축되지 않음) 초과의 수준으로 LV 생산을 유지할 수 있었다.
도 5는 안정한 세포주로부터의 렌티바이러스 벡터 생산의 동력학을 나타낸다. (A) 벡터 생산 동안, 배지를 매일 (■) 또는 2일마다 (□) 신선한 배지로 교체하였다. (B) 회수된 배지 중의 총 LV 양을 293T 세포 상에서 적정하였다. 제시된 데이터는 평균 값 ± SD 이다 (N = 2). TU는 형질도입 단위이다.
도 6-(A)는 GPRG 및 293T 세포가 독시사이클린 (Dox)이 없는 배지 중에 유도된 것을 나타낸다. VSVG 발현을 탐지하기 위해 항-VSVG 항체로 유도된 세포를 염색하였고 유동 세포 계측법으로 측정하였다; (B)는 연장된 배양 후에 LV를 생산할 수 있는 GPRG의 능력을 평가한 것을 나타낸다.
도 7은 상이한 배양 조건에서의 렌티바이러스 생산을 나타낸다. (A) 혈청-함유 배지에서 배양/생산. (B, 좌측) 혈청 함유 배지에서 배양/무혈청 배지에서 생산; (B, 우측) 무혈청 배지에서 배양/생산. D10: 500 mL DMEM/GlutaMAX™; 50 mL FBS (10% w/v); 5 mL Pen/Strep; SFM: 무혈청 배지.
도 8은 신선한 배지 (벡터 없음) 또는 LVsh5/C46 벡터와 함께 인큐베이션한 293T 또는 TF-1a 세포의 FACS 분석을 나타낸다.
도 9는 감염된 세포 중의 렌티바이러스 벡터 복사본 수의 양을 나타낸다. 2개 투여량 (MOI = 1 또는 0.3)으로 형질도입한 후 숙주 게놈 당 벡터 복사본 수를 측정하기 위해 C46 qPCR을 사용하였다.
도 10은 LVsh5/C46 벡터로 형질도입한 Ghost-CCR5 세포를 나타낸다. CCR5 발현의 감소된 수준을 FACS로 측정하였다.
도 11은 pUC57-TL20의 개략적인 도식을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일부 구현예에 따른 렌티바이러스 전달 벡터에 기초한 HIV-1을 나타낸다. 이러한 특정 전달 벡터는, HIV-1 융합 억제제 (C46)와 조합하여, HIV-1 공동-수용체 CCR5의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 암호화한다.
도 13은 본원에 개시되고 혈청이 없는 방법을 사용한 렌티바이러스 유도를 나타낸다. 무혈청 배지에서 배양된 세포는 거의 10% PBS로 배양된 것만큼 바이러스를 생산한다. 이는 본원에 개시된 방법이 무혈청 배양 환경에 적절할 수 있는 것으로 믿어진다.
도 14는 DNA 단편을 생산하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 15는 콘카테머 어레이를 합성하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 16은 콘카테머 어레이를 포장 세포주에 도입하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 17은 형질감염된 클론을 선택하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 18은 단일 콜로니 분리를 수행하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 19는 바이러스 생산을 평가하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 20a, 20b, 및 20c는, 일반적으로 TL20-Call-wpre 및 TL20-Unc-GFP 벡터를 합성하기 위한 생산자 세포를 기술한다. 도 20a는 신선한 배지 (좌측: 벡터 없음) 또는 가장 강력한 생산자 클론으로부터 회수된 TL20-Call-WPRE (우측)와 인큐베이션한 293T 세포의 유동 세포 계측법 분석을 나타낸다. 도 20b는 신선한 배지 (진한 회색 막대; 벡터 없음) 또는 가장 강력한 생산자 클론으로부터 회수된 TL20-UbcGFP (밝은 회색 막대)와 함께 인큐베이션한 293T 세포의 유동 세포 계측법 분석을 나타낸다. 도 20c는 TL20-Call-WPRE (좌측) 또는 TL20-UbcGFP (우측) 벡터를 제조하기 위한 독립적인 생산자 클론으로부터의 상등액의 측정된 벡터 역가의 분포를 나타낸다. 벡터를 293T 세포에 적정하고 유동 세포 계측법으로 분석하였다. 다클론 생산자 세포 (단일 클론 선택 이전)를 사용하여 제조된 벡터에 대해 달성된 가장 높은 역가를 점선으로 나타냈다. 설명: Ubc: 유비퀴틴 C 프로모터; GFP: 향상된 녹색 형광 단백질.
일반적으로, 본 발명은 안정한 생산 세포주를 생산하는 방법을 제공한다. 안정한 생산 세포주, 예컨대 본 발명에 따라 제공된 것들은 높은 역가의 렌티바이러스 스톡 생성의 재현성 및 용이성을 증가시키는 한편 바이오 안전성 문제를 완화하고 발현된 외피 (envelope) 단백질의 다양성은 생성된 바이러스의 굴성 (tropism)을 정의한다. 본 발명은 또한 신규한 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드를 제공한다.
본원에 사용된 단수 용어 "하나의 (a, an)" 및 "그 (the)"는 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한 "그리고"를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "포함하는 (comprising)", "포괄하는 (including)" "갖는 (having)" 등은 상호교환적으로 사용되며 동일한 의미를 갖는다. 유사하게, "포함하다", "포괄하다", "갖는다" 등은 상호교환적으로 사용되며 동일한 의미를 갖는다. 특히, 각각의 용어는 일반적인 미국 특허법의 "포함하는"의 정의와 일치하는 것으로 정의되며 따라서 "적어도 다음의"를 의미하는 개방형 용어로 해석되어야 하며 또한 추가의 특징, 제한, 양태 등을 배제하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 예컨대, "구성요소 a, b, 및 c를 갖는 장치"는 장치가 적어도 구성요소 a, b 및 c를 포함하는 것을 의미한다. 유사하게, 어구 "단계 a, b 및 c를 수반하는 방법"은 방법이 적어도 단계 a, b 및 c를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 단계 및 공정이 특정 순서로 본원에 개략적으로 설명될 수 있지만, 당업자는 단계 및 공정을 순서화하는 것이 변할 수 있음을 인식할 것이다.
본원에 사용된 용어 "클로닝"은 핵산 분자를 플라스미드에 라이게이션하고 숙주의 증식 동안 복제를 위해 이를 적절한 숙주 세포에 전달하는 공정을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "HIV"는 HIV-1뿐만 아니라, HIV-1의 다양한 균주 (예컨대 균주 BaL 또는 균주 SF162) 및 HIV-1의 다양한 하위 유형 (예컨대 하위 유형 A, B, C, D, F, G H, J, 및 K)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "다중 클로닝 부위 (MCS)"는 핵산 단편을 클로닝 벡터 플라스미드에 클로닝하기 위한 목적의 제한 효소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 폴리링커 또는 폴리클로닝 부위로도 지칭되는 MCS는 클로닝 부위의 집합으로서 다수의 제한 효소가 이 부위 내에서 작동할 수 있다. 일부 구현예에서 클로닝 부위는 제한 효소가 플라스미드를 선형화하거나 절단하기 위해 작동하는 서열로 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "생산 세포"는 렌티바이러스 벡터 입자의 생산에 필요한 모든 요소를 함유하는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "포장 세포"는 재조합 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드에는 결여되어 있는 감염성 재조합 바이러스의 생산을 위해 필요한 요소를 함유하는 세포를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 포장 세포는 바이러스 구조 단백질 (예컨대 gag, pol 및 env)을 발현할 수 있는 하나 이상의 발현 카세트를 함유하지만 포장 신호를 함유하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "제한 엔토뉴클레아제" 또는 "제한 효소"는 핵산 분자 (예컨대 DNA)의 동족 서열에 결합하고 그 서열 내의 정확한 위치에서 이를 절단하는 촉매 분자의 부류의 구성원 또는 구성원들을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "자가-불활성화" 또는 "SIN"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 변형된 벡터를 지칭하고, 이때, 상기 변형은 일단 수용체의 게놈에 통합되면 벡터가 이동하는 능력을 크게 감소시켜 유저자 전달 벡터로서의 사용의 안전성을 증가시킨다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자의 세포로의 도입, 예컨대, 전달, 수송 등을 매개할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자 내로 연결, 예컨대 삽입된다. 벡터는 자가 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA 내로 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 바이러스 벡터는 전달된 핵산 분자의 도입을 매개하는 핵산 외에 다양한 바이러스 구성요소를 포함할 수 있다.
방법의 개요
렌티 바이러스 벡터 (LV)는 이의 효율 및 분화 및 비분화 세포 둘 모두를 안정하게 형질도입시키는 능력 때문에 유전자 전달에 중요한 도구이다. 그 결과, 연구자들은 이를 매우 다양한 임상적 응용에서 유전자 전달 비히클로서 사용하고 있다. 그럼에도 불구하고, 현행 우수 제조관리 기준 (cGMP) 방법을 사용하는 대규모 임상 생산에는 렌티 바이러스 벡터를 사용하는 보다 많은 임상 시험이 규제 승인을 받은 것으로 간주되어야 하는 일련의 과제가 있다. cGMP-호환 공정의 고안에서 하나의 중요한 고려사항은 다수의 cGMP 생산에서 일관된 렌티바이러스를 생산할 수 있는 제조 공정에 규제 고려사항을 통합해야 할 필요가 있다는 것이다. 임상적으로 사용되는 다수의 주요 렌티바이러스 벡터는 일시적인 형질감염에 의해 생산되어 왔다. 그러나 일시적인 형질감염에 기초한 생산은 종종 노동 집약적이고 변동성이 있다. 이러한 이유로, 몇몇 안정한 포장 세포주 시스템이 최근 개발되었다. LV의 바이오-제조를 위한 이러한 세포주의 사용은 확장성 및 일관성 모두에서 특히 매력적이지만, 이러한 세포주의 개발은 시간이 소요되며 이러한 라인의 cGMP 사용을 위한 규제 경로가 확실하게 정립되지 않았다.
이러한 관점에서, 본 발명은 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 (SIN-LV)의 임상적인 생산 공정을 기술한다. GPR, GPRG, GPRT, GPRGT 또는 GPRT-G 포장 세포주 (또는 유도체 또는 이로부터 유도된 유사체 포장 세포주)와 함께 신규한 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드의 사용을 통해, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 (예컨대 LVsh5/C46)의 생산을 가능케 하기 위한 안정한 생산 세포주가 생산될 수 있는 것으로 믿어진다. 본원에 기술된 특정 구현예 및 실시예는, HIV-1 융합 억제제 (즉, C46)와 조합하여, HIV-1 공동-수용체 CCR5의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 암호화하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터인, LVsh5/C46의 생산에 대해 언급하지만, 당업자는 본원에 기술된 방법이 임의의 원하는 또는 의뢰자로부터 공급된 유전자 또는 서열을 포함하는, 임의의 SIN-LV를 생산할 수 있는 안정한 생산 세포주의 생산에 적절함을 인식할 것이다.
본 출원인은 일시적인 형질감염에 의해 생산된 SIN-LV와 비교하여, 본원에 개시된 방법이 (i) 유사한 품질 및 양의 SIN-LV를 생산할 수 있고; (ii) 보다 우수한 효능을 가질 수 있는 LV를 생산하고; (ii) 일시적인 형질감염으로 보이는 제조 간 가변성을 크게 감소시키면서 수율을 유지함을 입증하였다.
pUC57 - TL20c
본 발명의 일 양태는 신규하고 다양한 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함하는 제 3세대, 자가-불활성화 (SIN) 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 (이하 본원에서 "pUC57-TL20"로 지칭됨)에 기초한 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1)이다 (도 11 참조).
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 그 자체로서는 내부 프로모터를 포함하지 않는 (따라서, "프로모터가 없는") 벡터 백본 ("TL20c")을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 벡터 백본 상류에 하나의 프로모터, 예컨대 테트라사이클린 억제가능한 프로모터를 포함한다 (도 12 참조). 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않고, 벡터 백본의 프로모터가 없는 고안은 사용자에 의해 결정된 프로모터의 관심 유전자의 전달 및 후속 발현을 가능카하는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드의 생산을 가능케 한다고 믿어진다.
도 11은 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드의 구성 요소를 나타내는 유전자 맵을 기술한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 약 6500개 뉴클레오티드 내지 약 6750개 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 6600개 뉴클레오티드 내지 약 6700개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 벡터 백본은 약 3850개 뉴클레오티드 내지 약 3950개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 벡터 백본은 약 3901개 뉴클레오티드를 포함한다.
도 11에 나타난 바와 같이, 플라스미드는 5' 측부 HIV LTR, 포장 신호 또는 ψ+, 중심 폴리퓨린 관 (cPPT), Rev-반응 요소 (RRE), 다중 클로닝 부위 (MCS), 및 3' 측부 HIV LTR을 포함한다. LRR 영역은 U3 및 U5 영역뿐만 아니라 R 영역을 추가로 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 전달 플라스미드는 자가-불활성화 (SIN) LTR을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 레트로바이러스 생애 주기 동안, 3' LTR의 U3 영역이 복제되어 역전사 및 바이러스 DNA 합성 과정에서 5' LTR에 상응하는 영역을 형성한다. SIN LTR의 생성은 3' LTR의 U3 영역의 불활성화에 의해 (바람직하게는 이의 부분을 결실, 예컨대 TATA 서열의 제거에 의해) 달성된다. 상기 변경은 역전사 후 5' LTR로 전달되어 복제 능력이 있는 바이러스에 의해 이동을 방지하는 것으로 믿어지는 프로바이러스에서 LTR의 전사 단위를 제거한다. 추가의 안전성 향상은 5' LTR의 U3 영역을 이종성 프로모터로 대체하여 바이러스 입자의 생산 중에 바이러스 게놈의 전사를 유도함으로써 제공된다.
일부 구현예에서, 포장 신호는 Gag 서열의 약 361개 염기 쌍 및 야생형 HIV (예컨대 HIVOl HXB2_LAI_IIIB)의 Pol 서열의 약 448개 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, cPPT는 야생형 HIV의 Vif 서열의 약 85개 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, HIV 폴리퓨린 관 (pPu)은 야생형 HIV의 Nef 서열의 약 106개 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, RRE는 Rev 서열의 약 26개 염기 쌍, tat 서열의 약 25개 염기 쌍, 및 야생형 HIV의 Env 서열의 약 769개 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 플라스미드는 염색질 절연체 및/또는 베타-글로불린 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
일부 구현예에서, 포장 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 포장 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 포장 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중심 폴리퓨린 관 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 서열 또는 서열번호 4의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중심 폴리퓨린 관 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 서열 또는 서열번호 4의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중심 폴리퓨린 관 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 서열 또는 서열번호 4의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 서열 또는 서열번호 5의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 서열 또는 서열번호 5의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 5의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 자가-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 서열 또는 서열번호 6의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 서열 또는 서열번호 6의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 서열 또는 서열번호 6의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 10과 적어도 85% 동일성을 갖는 독시사이클린 억제가능한 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 10과 적어도 90% 동일성을 갖는 독시사이클린 억제가능한 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 10과 적어도 95% 동일성을 갖는 독시사이클린 억제가능한 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 11과 적어도 85% 동일성을 갖는 HIV LTR R5 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 11과 적어도 90% 동일성을 갖는 HIV LTR R5 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 11과 적어도 95% 동일성을 갖는 HIV LTR R5 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 12와 적어도 85% 동일성을 갖는 HIV LTR U5 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 12와 적어도 90% 동일성을 갖는 HIV LTR U5 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 12와 적어도 95% 동일성을 갖는 HIV LTR U5 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 13과 적어도 85% 동일성을 갖는 염색질 절연체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 13과 적어도 90% 동일성을 갖는 염색질 절연체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 13과 적어도 95% 동일성을 갖는 염색질 절연체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 14와 적어도 85% 동일성을 갖는 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 14와 적어도 90% 동일성을 갖는 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 14와 적어도 95% 동일성을 갖는 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 15와 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 15와 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 15와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 다양한 상이한 제한 효소를 위한 MCS를 도입하는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, MCS는 약 20개 내지 40개 뉴클레오티드를 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 개시된 플라스미드의 MCS는 적어도 2개의 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 개시된 플라스미드의 MCS는 적어도 3개의 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 개시된 플라스미드의 MCS는 약 2개 내지 약 10개의 제한 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, MCS 내의 제한 부위는 BstBI, MluI, NotI, ClaI, Apal, Xhol, Xbal, Hpal, Nhel, Pad, Nsil, Sphl, Sma/Xma, Accl, BamHI, 및 Sphl, 또는 이의 유도체 또는 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드의 MCS 영역은 원하는 트랜스진 카세트의 용이한 서브-클로닝을 가능케 한다고 믿어지는 4개의 고유한 제한 효소 절단 부위를 갖는다. 일부 구현예에서, 다중 클로닝 부위는 BstBI, MluI, NotI, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7의 서열 또는 서열번호 7의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 이러한 제한 부위는 임의의 순서로 배열될 수 있다.
일부 구현예에서, 전달 플라스미드는 벡터 백본 측부에 하나 이상의 추가의 제한 효소 절단 부위를 포함한다 (도 11 참조). 임의의 특정한 이론에 구속되기를 바라지 않고, 추가의 측부 제한 효소 절단 부위는 방향성 ("머리에서 꼬리로") 콘카테머 어레이의 생성을 가능케 한다고 믿어진다. 일부 구현예에서, 제한 효소 절단 부위는 Sfil 및 Bsu36I로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터는 플라스미드로부터 유도된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 97% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1에 기재된 서열로부터 100개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 97% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2에 기재된 서열로부터 100개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드는 당업자에게 공지된 방법에 따라 합성된다. 예컨대, 플라스미드는 당업자에게 공지된 전통적인 제한 소화 및 라이게이션 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 예컨대, 당업자에게 공지된 표준 소화 및 라이게이션 공정을 사용하여, TL20c 벡터 백본을 포함하는 공여 플라스미드는 pU57C 수용 플라스미드 (예컨대 Genescript로부터 상업적으로 이용 가능한 것과 같은 것들) 내에 서브클로닝될 수 있다(예컨대, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y. 참조, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있음).
본 발명은 또한 렌티바이러스 벡터, 예컨대 LVsh5/C46의 생산 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 유전자의 cDNA를 합성하는 단계 및 합성된 cDNA를 플라스미드, 예컨대 pUC57-TL20c의 제한 부위 내로 클로닝하는 단계를 포함한다. 유전자는 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 적절한 클로닝 부위 내로 삽입될 수 있다. 예컨대, 유전자는 PCR에 의해 증폭될 수 있고 이어서 원하는 프로모터 또는 유전자 발현 조절 요소를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다.
일부 구현예에서, 그리고 오직 예시로서, 상기 방법은 세포 내로의 HIV 융합 또는 HIV 복제를 방지할 수 있는 단백질을 발현하는 유전자의 cDNA를 합성하는 단계; 및 이어서 합성된 cDNA를 본원에 개시된 바와 같은 플라스미드 내의 제한 부위 내로 클로닝하는 단계를 포함한다.
안정한 생산 세포주의 생산 및 이로부터 생산된 렌티바이러스 벡터의 회수
본 발명의 일부 구현예는 안정한 생산 세포주 형성 방법 및 생산된 안정한 생산 세포주로부터 생산된 렌티바이러스 벡터를 회수하는 방법이다. 도 2를 참조하면, 안정한 생산 세포주 생산의 제1 단계는 예컨대 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드로부터 및 제2 플라스미드, 예컨대 항생제 저항성 카세트 플라스미드로부터 DNA 단편 (10)을 생산하는 것이다. DNA 단편 생성 (10) 후에, DNA는 이어서 콘카테머 어레이 (20)를 형성하기 위해 사용된다. 후속하여, 콘카테머 어레이가, 예컨대 형질감염에 의해 포장 세포주 (30)(예컨대 GPR, GPRG, GPRT, GPRG, GPRT-G 또는 이의 포장 세포주의 유도체) 내로 도입된다. 어레이(30)의 도입 및 후속 형질감염 후에, 안정한 생산 세포주 (60)를 생성하기 위해 클론이 선택되고 (40) 분리된다 (50). 렌티바이러스 벡터를 포함하는 벡터 상등액이 이어서 회수될 수 있다.
콘카테머 어레이 형성 및 정제
"콘카테머(concatemer)" 또는 "콘카테머 어레이(concatemeric array)" (본원에서 상호교환적으로 사용됨) (연속적으로 직접 또는 간접적으로 연결된 동일한 DNA 서열의 다중 복사본을 함유하는 긴 연속적인 DNA 분자)가 생성되며 포장 세포주의 형질감염에서 사용된다. 일부 구현예에서, 콘카테머는 그 안에 항생제 저항성 카세트가 산재되어 있는, 연결된 벡터 게놈 발현 카세트의 큰 어레이다.
도 14를 참조하면, 콘카테머 어레이를 형성하기 위해, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 (단계 100) 및 항생제 저항성 카세트 플라스미드로부터 DNA 단편이 생성된다 (단계 110). 일부 구현예에서, DNA 단편은 당업자에게 공지된 프로토콜에 따라 각각의 플라스미드를 소화시키고 이어서 소화된 단편을 라이게이션함으로써 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전기영동 및 아로스 겔을 이용하여 원하는 DNA 단편이 수득된다 (단계 120). 일부 구현예에서, DNA 단편 농도는 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 측정될 수 있다 (단계 130). DNA 단편을 라이게이션 하기 위한 다양한 전략이 이용 가능하며, 이의 선택은 DNA의 단편의 말단의 성질에 따라 다르고 이의 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드는 pUC57-TL20c에 기초한다. 일부 구현예에서, 항생제 저항성 카세트 플라스미드는 PGK 프로모터에 의해 구동된다. 일부 구현예에서, 항생제 저항성 카세트 플라스미드는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드에 렌티바이러스 카세트와의 콘카테머화를 위한 측부 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 항생제 저항성 카세트 플라스미드는 PGK-ble (블레오마이신 저항성)이다. 일부 구현예에서, PGK-ble 플라스미드는 서열번호 9의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 콘카테머 어레이는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 및 PGK-ble 플라스미드로부터의 DNA 단편의 시험관 내 라이게이션을 통해 형성된다.
도 15는 콘카테머 어레이를 형성하기 위해 사용되는 일반적인 단계를 개략적으로 나타낸다. 단계 200에서, 생성된 DNA 단편은 혼합되고 라이게이션 반응 중의 단편 부피는 목적하는 비율을 유지하기 위해 최대화된다 (단계 210). 일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 DNA의 양 대 항생제 저항성 카세트 플라스미드 DNA의 양의 비율은 약 100:1 내지 약 1:100의 범위이다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 DNA의 양 대 항생제 저항성 카세트 플라스미드 DNA의 양의 비율은 약 50:1 내지 약 1:50의 범위이다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 DNA의 양 대 항생제 저항성 카세트 플라스미드 DNA의 양의 비율은 약 25:1 내지 약 1:25의 범위이다. 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 DNA의 양 대 항생제 저항성 카세트 플라스미드 DNA의 양의 비율은 약 10:1 내지 약 1:10의 범위이다.
일부 구현예에서, 콘카테머 반응 혼합물은 실온에서 밤새 인큐베이션된다 (단계 220). 후속하여, 각각의 샘플에 대한 DNA 단편 농도는 이어서 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 측정될 수 있다(단계 230).
일부 구현예에서, 방향성 콘카테머 어레이가 형성되고 포장 세포주의 형질감염에서 사용된다. 일부 구현예에서, 방향성 어레이의 형성은 렌티바이러스 벡터 백본의 측부에 위치하는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드의 제한 효소 부위를 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, 제한 소화는 TL20c 벡터 카세트의 측부에 위치하는 제한 효소 부위를 사용하고 비회문형 오버행 뉴클레오티드의 형성을 가능케 하며, 이는 머리에서 꼬리로의 라이게이션에서만 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따른 방향성 라이게이션은 우세하게 머리에서 꼬리로의 DNA 생성물을 포함하는 콘카테머 어레이의 생성을 가능케 한다.
일부 구현예에서, 콘카테머 어레이는 본원의 실시예 3에 기술된 방법에 따라 형성된다. 물론, 당업자는 실시예 3에 제공된 절차가 제1 플라스미드 대 제2 플라스미드의 상이한 비율을 갖는 콘카테머 어레이의 형성 및 LVsh5/C46 외의 전달 플라스미드를 위해 채택될 수 있음을 인지할 것이다.
일부 구현예에서, 콘카테머 어레이는 포장 세포주 내로 형질감염 되기 전에 페놀-추출 및 에탄올 침전에 의해 정제될 수 있다. 전통적인 기법은 값이 싸고 효율적이지만, 이러한 절차는 시간 소모적이고 재현성 있는 수율을 산출하지 않을 수 있다. 페놀/클로로폼이 최종 샘플 내로 옮겨질 위험이 있다고 믿어진다. 또한, 이러한 공정은 유해한 화학물질을 포함하고 있으며, 유해 폐기물 지침에 따라 신중히 처리해야 하는 독성 폐기물을 생성할 수 있다.
대안적으로, 다른 구현예에서, 라이게이션 후 새롭게 합성된 콘카테머 어레이를 정제하기 위해 실리카-기반 방법이 사용된다. 이러한 방법은 고품질 형질감염- 등급 콘카테머 어레이의 분리를 위한 단순하고, 신뢰성 있고, 신속하고 편리한 방법을 제공한다고 믿어진다. 일부 구현예에서, 콘카테머 어레이는, 실시예 6에 기술된 절차의 사용과 같이, Qiagen으로부터 이용가능한 DNeasy Mini 스핀 컬럼을 사용하여 정제된다.
형질감염/단일 클론 분리
콘카테머 어레이의 정제 후에, 상기 어레이는 이어서 포장 세포주 세포를 형질감염하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 외래 핵산 (예컨대, DNA 또는 RNA)를 세포 내로 도입하기 위한 다양한 당업계에서 인정되는 기법을 지칭한다. 본원에 제공된 실시예로부터 명백할 것인 바와 같이, 렌티바이러스 입자의 생산을 허용하는 숙주 세포가 생산된 콘카테머 어레이로 형질감염되는 경우, 상기 세포는 생산 세포, 즉, 감염성 렌티바이러스 입자를 생산하는 세포가 된다.
일반적으로, 콘카테머 어레이 또는 방향성 콘카테머 어레이는 전통적인 형질감염 기법을 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 도 16을 참조하면, 일부 구현예에서, 세포가 회수되고 형질감염 전 20 내지 24시간에 씨딩되고 (단계 300) 이어서 합성된 콘카테머 어레이(310)로 형질감염된다 (단계 320). 포장세포주 세포를 형질감염시키기 위한 절차가 본원의 실시예 4에 제공되어 있다.
형성된 콘카테머 어레이로 형질감염하기에 적절한 하나의 포장 세포주는 GPR 포장 세포주이다. GPR 라인은 필요한 바이러스 구성성분 gagpol 및 rev를 갖는 293 T/17 세포로부터 유도된 HIV- 1 기반 포장 세포주이다 (Throm et al., Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood 113 : 5104-5110 참조, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있음).
형성된 콘카테머 어레이로 형질감염하기에 적절한 또 다른 포장 세포주는 GPRG 포장 세포주이다. 일부 구현예에서, GPRG 포장 세포주는 gagpol, rev, 및 VSV-G를 포함한다.
형성된 콘카테머 어레이로 형질감염하기에 적절한 또 다른 포장 세포주는 GPRT 포장 세포주 (gagpol, rev, 및 tat)이다. GPRG 및 GPRT 포장 세포주 및 이를 형성하는 방법이 또한 Throm et. al에 의해 개시되어 있으며, 이의 개시 내용은 다시 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다. 다른 적절한 포장 세포주 (예컨대 GPRT-G)가 Wielgosz et al. "Generation of a lentiviral vector producer cell clone for human Wiskott-Aldrich syndrome gene therapy," Molecular Therapy- Methods & Clinical Development 2, Article number: 14063 (2015)에 의해 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.
당업자는 본원에 개시된 방법의 사용을 위해 적절한 다른 포장 세포주가 또한 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 일부 구현예에서, 다른 포장 세포주는 GPR, GPRG, GPRT, 또는 GPRT-G 포장 세포주로부터 유도될 수 있다. 임의의 특정한 이론에 구속되기를 바라지 않고, GPRT-G 세포주는 CD34+ 세포에서 보다 높은 형질도입 효율을 갖는 것으로 믿어진다 (Wielgosz 참조). "로부터 유도된"은 개별적인 세포로부터 클론에 의해 유도되고, 일부 선택 특성, 예컨대 주어진 역가에서 활성 단백질을 생산하는 능력, 또는 특정 밀도로 증식하는 능력을 갖는 세포 집단을 의미한다.
도 17은 형질감염된 세포를 선택하는 일반적인 공정을 나타낸다. 일부 구현예에서, 그리고 형질감염 후 약 72시간 후에, GPRG 세포가 선택 배지 (제오신 및 독시사이클린)로 배양된다 (단계 400). 이어서, 상기 세포 병소(foci)가 확인될 때까지 3 내지 4일마다 선택 배지 (제오신 및 독시사이클린)가 상기 세포에 공급된다 (단계 410). 후속하여, 상기 세포주는 확장되고 평가된다 (단계 420).
일부 구현예에서, 형질감염 후 우수한 제조 잠재력을 갖는 단일 세포 클론을 확인하기 위해 단일 병소 선택/스크리닝 공정이 사용된다. 이러한 방법에 따르면, 일부 구현예에서, 선택된 세포는 150 × 25 mm 디시에 드물게 씨딩되고 2 내지 3주 동안 확장되고 식별가능한 콜로니가 형성되도록 한다. 개별적인 콜로니는 이어서 단클론 확장을 위해 또 다른 보다 작은 배양 접시로 옮겨질 수 있다. 이러한 방법은 비용 효율적이고 빈번하게 채택되는 기법이라고 믿어질 수 있지만; 단일 병소 선택 기법의 본래의 한계 때문에, 우수한 생산 세포주의 단클론성의 높은 가능성을 달성하기가 어려울 수 있다.
도 18은 단일 콜로니 분리를 나타낸다. 단계 500에서, 단일 세포를 분류를 준비하기 위해 유동 세포 계측법이 사용된다. 상기 세포는 이어서 조건화된 배양 배지에 플레이팅되고 (단계 510) 확장된다 (단계 520).
다른 구현예에서, 높은 역가의 렌티바이러스 벡터 안정한 생산 세포주를 생산하기 위해, 단일 클론을 분리하기 위해 형광 활성화된 세포 분류기 (FACS)가 사용된다 (예컨대 도 8 참조). 또한 세포 부착 및 생존력을 증가시키고, 콜로니 형성을 촉진하기 위해 조건화된 배지, 예컨대 제오신 (50ug/mL) 및 독시사이클린 (1ng/mL)이 분류 공정 동안 첨가될 수 있다. 조건화된 성장 배지의 사용 및 FACS 시스템의 높은 처리 능력은 다수의 클론의 스크리닝을 가능케 한다고 믿어지고 이에 따라 높은 역가의 렌티바이러스 벡터 생산자 클론을 발견할 가능성을 증가시킨다고 믿어진다.
일부 구현예에서, 우수한 성장률 및 바이러스 생산 능력을 갖는 클론이 약 20 계대를 넘는 안정성에 대해 시험되었다.
바이러스를 생산하기 위한 생산 세포주의 유도
선택 및 선택된 클론의 확장 후에, 벡터 상등액을 생성하기 위해 선택된 클론이 유도되고, 유도는 당업자에게 공지된 절차에 따라 수행될 수 있다. 유도된 안정한 생산자 라인에 의해 생산된 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해, 일부 구현예에서, 7일 이하 동안 매일 배양 상등액이 회수된다. 다양한 시험 벡터를 작은 규모로 생산하기 위해 이러한 생산 프로토콜이 용이하게 이용될 수 있다. 반복된 바이러스 회수 프로토콜은 또한 바이러스 벡터의 최종 수율을 증가시킬 수 있다. 그러나 일일 회수 및 배지 교환은 종종 경제적이지 않고, 일일 회수의 대안으로서, 새로운 2일 회수 프로토콜이 고안되었다. 이러한 새로운 바이러스 벡터 생산 프로토콜은, 하기와 같이, 보다 적은 배양 배지 소모로 동량의 바이러스 벡터가 생산되도록 한다.
도 19는 유도 및 평가 공정을 추가로 나타낸다. 단계 600에서, 바이러스 벡터가 유도되고 이어서 형질도입 효율을 측정하기 위해 293T의 스핀접종 (spinoculation)이 수행된다 (단계 610). 상위 3개 클론이 스크리닝되고 (단계 620) 확장된다 (단계 630). 클론은 이어서 저장된다 (예컨대 액체 질소 하에) (단계 640).
2일마다 회수
본 출원인은 예기치 않게 2일 회수가 보다 전통적인 일일 회수와 거의 동일한 양의 바이러스 벡터를 생산하는 동시에, 또한 보다 적은 배양 배지를 요구한다는 이점을 제공한다는 것을 발견하였다.
일 구현예는 본 발명에 따른 2일 회수로부터 바이러스 벡터를 생산하는 제1 방법이며, 상기 제1 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(1) 생산자 라인 배양 디시의 오래된 배양 배지를 가능한 완벽하게 제거하고 세포를 l×PBS로 세척하는 단계.
(2) TrypLE™ 발현 효소 (1×)를 상기 배양 디시에 첨가하는 단계 (ThermoFisher Scientific으로부터 이용가능함).
(3) 37 ℃ 인큐베이터에 2분 동안 놓아두는 단계.
(4) D10 배지 (약물 없음)를 첨가하여 세포를 세척하고 피펫팅으로 올리고 내려서 클러스터를 단일 세포로 분리시키는 단계 (D10 배지: 고 글루코스, GlutaMAX™ 보충제 및 10% (w/v) FBS 및 1% (w/v) 페니실린/스트렙토마이신이 있는Dulbecco 변형된 이글 배지).
(5) 4 ℃에서 1200 rpm에서 5분 동안 세포를 원심분리하는 단계.
(6) 배지를 흡입하고 펠릿을 신선한 D10 배지 (약물 없음) 중에 부드럽게 현탁시키는 단계.
(7) 세포를 배양 디시에 약 95%의 컨플루언트로 씨딩하는 단계 (대략적으로 4 x 106 세포/6-mm 배양 디시에 플레이팅에 의해, 벡터 유도).
(8) 24시간 후에 씨딩된 세포에 신선한, 미리 가온된 D10 배지를 보충하는 단계 (유도 후 제1일).
(9) 첫 회 배지 교체 후 48시간에 세포로부터 바이러스 벡터가 처음으로 회수될 수 있음 (유도 후 제3일)
(10) 신선한, 미리 가온된 배지를 배양 디시에 첨가하는 단계.
(11) 두 번째 배지 교체 후 48시간에 두 번째 바이러스 벡터를 회수하는 단계 (유도 후 제5일).
(12) 신선한, 미리 가온된 배지를 배양 디시에 첨가하는 단계.
(13) 세 번째 배지 교체 후 48시간에 세 번째 바이러스 벡터를 회수하는 단계 (유도 후 제7일).
본 출원인은, 유도 후 제7일에 바이러스 벡터가 수집될 수 있는 보다 전통적인 방법에 비해, 유도 후 제4일 및 제5일에 두 번째 바이러스 벡터 수집에서 바이러스 역가가 산출될 수 있음을 발견하였다.
또 다른 구현예는 본 발명에 따른 2일 회수로부터 바이러스 벡터를 생산하는 제2 방법이며, 제1 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(1) 생산자 라인 배양 디시의 배지를 가능한 완벽하게 제거하고 세포를 l×PBS로 세척하는 단계.
(2) 100 mm 배양 디시에서 세척된 세포 단일층 상에 3 mL l×TrypLE Express를 부드럽게 피펫팅하는 단계.
(3) 단일층을 TrypLE Express로 덮기 위해 플라스크를 회전시키는 단계.
(4) 플라스크를 인큐베이터로 되돌리고 2분 동안 놓아두는 단계.
(5) 플라스크 측면을 부드럽게 두드려서 임의의 잔여 부착된 세포를 방출하는 단계.
(6) 세포를 2 mL의 신선한 D10 배지 (항생제 없음)에 재현탁시키고 15 mL 고깔 원심분리 튜브에 옮기는 단계.
(7) 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하는 단계.
(8) 배지를 흡입하고 5 mL 신선한 D10 배양 배지 (항생제 없음) 중에 펠릿을 부드럽게 현탁시키는 단계.
(9) TC 10™ 자동화된 세포 계수기로 세포 수를 측정하는 단계.
(10) 세포를 배양 디시에 95% 초과의 컨플루언트로 씨딩하는 단계 (60-mm 배양 디시 중에 4×106의 살아있는 세포를 플레이팅함으로써).
(11) 씨딩된 세포에 신선한, 가온된 D10 배지를 매일 보충하는 단계 (24시간마다).
본 출원인은 유도 후 48시간에 세포로부터 바이러스 벡터가 회수될 수 있다는 것과 유도 후 72시간에 가장 높은 바이러스 역가가 산출될 수 있음을 발견하였다. 본 출원인은 다시 한번 예기치 않게 유도 후 제2일 내지 제4일로부터 바이러스 벡터가 회수될 수 있음을 발견하였다.
일부 구현예에서, 회수된 벡터는 여과를 통해 정제된다. 일부 구현예에서, 회수된 벡터는 바이러스 역가, 세포 게놈 당 바이러스 복사본, 및 p24 농도에 의해 특성분석 된다.
일일 회수 대 2일 회수의 일일 비교가 도 5에 나타나 있다.
실시예 1 - 일시적인 형질감염에 의해 생산된 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터와 개시된 안정한 세포주 방법에 의해 생산된 벡터의 상세한 비교
본원에 개시된 방법은, HIV-1 융합 억제제인 C46과 조합되어, HIV-1 공동-수용체 CCR5의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 암호화하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 (SIN-LV)인 LVsh5/C46을 생산하기 위한 안정한 세포주를 생산하기 위해 사용된다. 일시적인 형질감염에 의해 생산된 LV는 현재 HIV-감염된 개인에서 임상 시험에서 평가되고 있다. 본원에서 우리는 일시적인 형질감염에 의해 생산된 LVsh5/C46 및 LVsh5/C46 및 다른 SIN-LV의 임상적 제조를 위한 이러한 시스템의 적용을 지지하기 위해 본원에 개시된 방법을 사용하여 생산된 LVsh5/C46의 비교 분석을 수행하였다.
렌티바이러스 벡터 (LV)를 4개-플라스미드 시스템 (1개의 전달 벡터, 2개의 포장 벡터, 및 개의 외피막 벡터)을 사용하여 293T 세포에서 칼슘 포스페이트 형질감염으로 생성하였다. 바이러스-함유 배지 (VCM)를 감염 후 48시간에 회수하고 20% 수크로스 완충을 통해 초원심분리로 농축하였다.
세포주 생산을 위해, 생산자 세포를 독시사이클린 (Dox)이 없는 배지에서 유도하였고, VCM을 72시간에 회수하고 초원심분리로 유사하게 농축하였다. 표 1 및 도 8 및 도 9를 참조하면, 각각의 방법에 의해 생산된 LV를 입자 역가에 기초하고 293T 및 TF-la T 세포주에 대한 유전자 형질도입 효능에 대해 3개의 독립적인 분석법을 사용하여 비교하였다. 여기에는 세포 표면 C46 발현에 대한 FACS 분석 및 CCR5 발현의 shRNA-매개된 넉다운, 및 숙주 세포 게놈 당 벡터 복사본 수 (VCN)에 대한 qPCR 분석법이 포함된다. 모든 분석법에 대해, 선형 관계를 정의하기 위해 벡터 희석 범위에 걸쳐 역가를 결정하였다. qPCR 분석법은 형질도입된 세포로부터 추출된 게놈 DNA를 사용하고, C46 트랜스진 및 내인성 β-글로빈 유전자로부터의 서열을 검출한다. 이와 같이, C46 VCN이 세포 게놈에 대해 정규화될 수 있다.
Figure pct00001
1. 약어: TU, 형질도입 단위; VCM, 바이러스-함유 배지
2. VCM을 초원심분리에 의해 20% 수크로스 완충을 통해 100배 농축하였음.
일시적인 형질감염 방법에 비해 생산 세포주에서 생산된 VCM에서 보다 높은 농도의 p24가 관찰되었다. 그러나 2개의 상이한 시스템을 사용하여 생산된 LVsh5/C46의 수율 및 효능은 유사하였다. 동일한 부피의 VCM을 사용하여 FACS로 C46 역가에 대해 벡터를 우선 평가하였다. 일시적인 형질감염에 의해 생산된 벡터가 약간 증가된 역가를 갖는 반면, C46 역가를 정규화하고 벡터 제제를 qPCR 분석법을 사용하거나 CCR5의 기능적인 넉다운을 통해 유전자 형질도입에 대해 평가했을 때, 안정한 생산 세포주에 의해 생산된 벡터는 보다 큰 효능을 나타냈다 (표 2 참조). 일시적인 형질감염에 의해 생산된 벡터로 처리한 것에 비해, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 LVsh5/C46으로 처리한 표적 세포에서 CCR5 발현 및 게놈 C46 트랜스진 (VCN)의 하향 조절이 현저하게 더 높았다 (표 3 및 도 10 참조).
Figure pct00002
1. 약어: ND, 측정되지 않음; MOI, 감염 다중도
2. LVsh5/C46 단일 복사본 세포주
3. C46 형질도입 역가에 기반한 MOI
1. 약어: ND, 측정되지 않음; MOI, 감염 다중도
2. LVsh5/C46 단일 복사본 세포주
3. C46 형질도입 역가에 기반한 MOI
3개의 독립적인 분석법에 기초하여, 우리는 본원에 기술된 방법이, 일시적인 형질감염 방법과 비교하여, 유사한 품질 및 양의 SIN-LV를 생산할 수 있는 안정한 LV 생산 시스템을 제공함을 입증하였다. 형질도입된 세포에서 보다 높은 CCR5 하향 조절 효율 및 C46 VCN (C46 역가에 대해 정규화됨)은 생산자 세포에 의해 생산된 LVsh5/C46이 전통적인 4개-플라스미드 일시적인 형질감염을 사용하여 생산된 벡터에 비해 보다 우수한 효능을 가짐을 나타낸다. 지루한 일시적인 형질감염 단계를 제거함으로써, 임의의 특정한 이론에 구속되기를 바라지 않고, 이러한 생산 시스템은 인간에서 사용하기 위한 임상적인 등급의 물질의 제조를 위한 cGMP 조건에 용이하게 채택될 수 있는 것으로 믿어진다.
실시예 2 - HIV 유전자 치료를 위한 렌티바이러스 벡터의 바이오-생산을 위한 GPRG-기반 생산 세포주의 개발 및 특성분석
자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 (SIN-LV)의 임상적인 생산을 위해 GPRG 세포주 시스템을 이전에 확립하였다. 여기에서, 우리는 HIV에 감염된 개인의 치료를 위한 임상에서 현재 평가중인 SIN-LV인, LVsh5/C46의 생산을 위해 GPRG를 기반으로 하는 생산 세포주를 확립하고자 하였다. 이러한 벡터는 2개의 바이러스 진입 억제제인, HIV 공동 수용체 CCR5에 대한 짧은 헤어핀 RNA인 sh5, 및 바이러스 융합 억제제인 C46을 암호화한다. 우리는 또한 LVsh5/C46의 바이오-생산을 위한 GPRG 시스템의 규제 충족 및 임상 적용에 요구되는 바와 같이 테트라사이클린 유도 후 GPRG 포장 세포주, GRPG-기반 LVsh5/C46 생산 세포주, 및 LVsh5/C46 생산의 안정성을 정의하고자 하였다.
독시사이클린 (Dox) 및 퓨로마이신 (Puro)이 함유된 D10 배지에 GPRG 세포를 배양하였다. LVsh5/C46 생산자 세포를 생성하기 위해, 전달 플라스미드 TL20-LVsh5/C46 및 콘카테머 어레이로서 제오신-저항성 플라스미드를 사용하여 GPRG 세포를 형질감염 시켰다. 개별적인 클론을 이들이 LVsh5/C46 벡터를 생산하는 능력에 대해 평가하였고 Dox, Puro, 및 제오신이 함유된 D10 배지에 유지시켰다. LV 생산을 위한 모 GPRG 세포주의 안정성을 평가하기 위해, 3개월의 기간에 걸쳐 10 계대마다 전달 벡터로 GPRG 세포를 형질감염시켰다 (50+ 총 계대) (도 3a 및 3b 참조). 바이러스-함유 배지 (VCM)를 감염 후 48시간에 회수하고 벡터 역가를 상보성 유전자 형질도입 분석법으로 평가하였다. 안정한 생산 세포 클론으로부터의 LV 생산의 안정성을 평가하기 위해, 세포를 Dox가 없는 D10 배지에서 유도하였다. VCM을 유도 후 72시간에 회수하고 역가를 벡터 희석 범위에 걸쳐 유사하게 평가하였다. 장기 계대 후 유도에 따른 VSV-G 발현의 안정성을 분석하기 위해, GPRG 세포를 Dox를 빼고 유도한 다음 비오틴-접합된 항-VSV-G 항체를 사용하여 염색한 후, 이어서 스트렙타비딘-피코에리트린으로 2차 염색하였다.
GPRG 세포는 VSV-G의 엄격한 테트라사이클린-조절된 발현을 나타냈다. 이러한 포장 세포주는 LV 전달 벡터로 형질감염 후 107 LV 형질도입 단위 (TU)/mL 이하를 생산할 수 있었고, 연속 배양에서 50 계대 초과 동안 높은 수준의 LV 생산을 유지하였다 (도 6A 및 6B 참조). 콘카테머 어레이 형질감염을 사용함으로써, 우리는 LVsh5C46의 생산을 위한 GPRG에 기초한 생산 세포주의 효율적인 구축을 입증하였다. 이러한 세포주는 106 TU/mL 초과의 역가를 일관되게 생산하였다. 2차 생산 세포주의 재클로닝 및 선택에 의해 역가의 추가의 증가가 달성될 수 있다. 역가는 유도 후 2 내지 5일에 최대였다. 우리는 또한, 확립된 안정한 생산 세포주가 25 계대를 초과하는 연속 배양 동안 106 TU/mL을 초과하는 역가를 갖는 LVsh5/C46 생산을 지속적으로 유지할 수 있음을 보여주었다.
GPRG 세포주는 Dox의 제거 시 세포 표면에서 VSV-G를 효율적으로 발현하였다. 이는 또한 전달 벡터 플라스미드의 형질감염 후 높은 역가의 LV를 생성할 수 있었다. 또한, 이러한 세포주는 SIN-LV를 위한 높은 역가의 생산 세포주를 유도하는 것을 가능케 하였다. 생산 세포주는 연장된 배양 동안 안정한 벡터 생산을 나타냈고, 무혈청 현탁 배양 시스템에서 벡터 생산을 채택하기 위한 채택가능성의 평가를 탐구하였다 (도 7A 및 7B 참조).
실시예 3 - 콘카테머 어레이의 생산을 위한 프로토콜
단계 1
490mL 탈이온수와 lOmL 50×TAE ((트리스-아세테이트-EDTA) 완충액)를 합하여 500mL l×TAE 러닝(running) 완충액을 제조하였다.
lg 아가로스와 100 mL 1×TAE 완충액 (98 mL 오토클레이브된 물과 함께 2 mL 50×TAE를 첨가)을 비커에 첨가하고 고체 입자 또는 기포가 존재하지 않을 때까지 전자레인지에 돌려서 (약 2.5 분) 1% 아가로스 겔을 제조하였다.
상기 혼합물을 3분 동안 냉각하였다.
10 μL GelRed™를 아가로스 겔 혼합물에 첨가하고 교반하였다 (Biotium으로부터 입수가능함).
겔 캐스터 및 겔 콤브를 조립하였다. 상기 혼합물을 겔 주형에 붓고 30분 동안 냉각되게 하였다 (수용력 : 큰 콤브의 경우 60 μL)
겔이 냉각되면, 겔이 완전히 잠길 때까지 박스에 l×TAE 완충액을 채웠다.
DNA를 선형화하기 위해 실온에서 소화 반응 혼합물을 제조하였다.
25 μg 벡터 플라스미드를 제한효소 Sfil로 소화시켰다. 별도의 반응에서, 저항성 카세트 플라스미드 PGK-ble를 PflMI (10 μg 이상이면 충분함)로 소화시켰다.
Figure pct00004
부드럽게 혼합하고 37 ℃에서 15분 동안 인큐베이션 하였다.
10 μL GeneRuler lkb 플러스 DNA 래더 (ladder) 혼합물 (2 μL DNA 래더 + 8 μL 뉴클레아제가 없는 물)과 50 μL 샘플 혼합물을 이용가능한 슬롯에 첨가하였다.
전기영동 기기를 켜고 150 V로 1시간 동안 수행하였다.
겔을 UVP PhotoDoc-It 이미지화 시스템으로 옮기고, 생성된 이미지를 수득하였다.
겔 사진을 Eye-Fi 웹사이트로부터 다운로드하였다.
NanoDrop 2000 분광광도계를 사용하여 각각의 샘플의 DNA 농도를 측정하였다.
단계 2
아가로스 겔로부터 DNA 밴드를 잘라냈다.
3 부피의 완충액 QG를 1 부피의 겔에 첨가하였다 (일반적으로 500 μL QG를 첨가함).
겔 조각을 완전히 용해시킨 후 50 ℃에서 10분 동안 인큐베이션 하였다.
샘플을 QIAquick 컬럼에 적용하고, 17,900 rpm에서 1분 동안 원심분리 하였다 (Qiagen으로부터 이용가능함).
흘러내린 것을 버리고 QIAquick 컬럼을 다시 샘플 수집 튜브에 두었다.
0.5 ml 완충액 QG를 QIAquick 컬럼에 첨가하고 1분동안 원심분리 하였다.
0.75 ml 완충액 PE를 QIAquick 컬럼에 첨가하고 1분동안 원심분리 하였다.
흘러내린 것을 버리고 QIAquick 컬럼을 17,900 rpm에서 추가의 1분 동안 원심분리 하였다.
QIAquick 컬럼을 깨끗한 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에 두었다.
DNA를 용리하기 위해, 35 μL 완충액 EB를 QIAquick 막의 중심에 첨가하고 컬럼을 17,900 rpm에서 1분 동안 원심분리 하였다 (완충액 EB는 lOmM 트리스-cl, pH 8.5이다).
NanoDrop 2000 분광광도계를 사용하여 DNA 단편 농도를 측정하였다 (표 1; 블랭크 측정을 위해 EB 완충액을 사용함).
단계 3
얼음 위에서 1.7 mL Eppendorf 마이크로원심분리 튜브에서 라이게이션 반응을 설정하였다.
미리 구축한 스프레드시트 (Concatemeric Ligations. xlsx)를 사용하여 벡터 대 PGK-ble의 몰비가 약 25: 1이 되도록 혼합해야 하는 각각의 단편의 부피를 계산하였다.
라이게이션 반응에서 단편의 부피를 최대화 하고 목적하는 몰비를 유지하였다.
T4 DNA 리가아제 완충액은 실온에서 해동시켜서 재현탁해야한다 (T4 DNA 리가아제 완충액은 다음의 구성성분을 포함함: 50mM 트리스-HC1, lOmM MgC12, 1mM ATP, lOmM DTT, pH 7.5).
라이게이션 반응을 피펫팅하였다. 상기 실시예에서, 우리는 10 μL 10× 라이게이션 완충액 (NEB Quick 라이게이션 키트), 및 0.5 μL 리가아제 효소 (New England BioLabs로부터 이용가능함)를 첨가함으로써 90 μL DNA 혼합물을 사용하였다.
실온에서 다음을 함유하는 반응 혼합물을 제조하였다:
Figure pct00005
위 아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하였다.
실온에서 밤새 인큐베이션 하였다.
단계 4
실리카-기반 막 (DNeasy Blood & Tissue 키트)에 의해 GPRG 세포에 형질감염시키기 전에 콘카테머 어레이를 회수하고 정제하였다.
2 ml 수집 튜브에 놓여진 DNeasy Mini 스핀 컬럼 내로 콘카테머 어레이 혼합물을 피펫팅하였다.
8000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다. 흘러내린 것 및 수집 튜브를 버렸다.
DNeasy Mini 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 수집 튜브 (제공됨) (Qiagen으로부터 이용가능함)에 두었다.
500 μL 완충액 AW1을 첨가하고, 8000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다.
흘러내린 것 및 수집 튜브를 버렸다.
DNeasy Mini 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 수집 튜브 (제공됨)에 두었다.
500 μL 완충액 AW2를 첨가하고, 20,000 × g에서 3분 동안 원심분리하여 DNeasy 막을 건조시켰다.
흘러내린 것 및 수집 튜브를 버렸다.
DNeasy Mini 스핀 컬럼을 깨끗한 1.7 ml Eppendorf 마이크로원심분리 튜브에 두었다.
200 μL 완충액 AE를 DNeasy 막 위에 직접 첨가하였다.
실온에서 4분 동안 인큐베이션 하였다.
8000 × g에서 1분 동안 원심분리하여 DNA 혼합물을 용리하였다.
용리를 한번 더 반복하였다.
NanoDrop Lite 분광광도계로 콘카테머 DNA 농도를 측정하였다.
실시예 4- 콘카테머 어레이를 사용하여 생산 세포주를 생성하기 위한 프로토콜
바이러스 벡터 생산에서 세포를 사용하기 전에 해동시킨 후 세포를 적어도 4회 계대하였다.
트립판 블루 방법 (트립판 블루는 생존 세포 계수를 위해 염료 배제 절차에서 통상적으로 사용된다. 이러한 방법은 살아있는 (생존) 세포는 특정 염료를 흡수하지 않는 반면, 죽은 (비-생존) 세포는 흡수한다는 원리에 기초한다. 염색은 세포 형태의 시각화를 용이하게 한다) 을 사용하여 벡터 유도 전에 세포가 건강하고 95% 초과의 생존해 있는지를 확인하였다. .
목적하는 양의 GPRG 세포를 배양하였다.
세포를 씨딩하기 전에 적어도 2회 일일 계대로 세포를 계대배양 하였다.
제1일에, GPRG 세포주 배양 디시의 배지를 제거하고 세포를 1 xPBS로 세척하였다.
T75 플라스크의 경우 3 ml 또는 T25 플라스크의 경우 1 mL을 사용하여 세척된 세포 단일층 상에 1 xTrypLE Express를 부드럽게 피펫팅하였다.
단일층을 TrypLE Express로 덮기 위해 플라스크를 회전시켰다.
플라스크를 인큐베이터에 되돌려놓고 2분 동안 두었다.
임의의 잔여 부착 세포를 방출시키기 위해 플라스크의 측면을 부드럽게 두드렸다.
2 mL 신선한 D10 배지 중에 세포를 재현탁시키고 15 mL 고깔 원심분리 튜브로 옮겼다.
세포를 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다.
배지를 흡입하고 독시사이클린 (1ng/mL)이 포함된 5 mL 신선한 D10 배양 배지 중에 부드럽게 현탁시켰다.
TC10™ 자동화 세포 계수기로 세포 수를 측정하였다 (표 5).
형질감염 전 20 내지 24시간에 배양 디시에 세포를 80% 컨플루언트로 씨딩하였다 (독시사이클린이 포함된 60-mm 배양 디시에 3.2×106의 살아있는 세포를 플레이팅함으로써; 표 9).
콘카테머 어레이 형성을 제조하였다 (예컨대, 실시예 3 참조).
제2일에, 형질감염 전에 CalPhosTM 포유류 형질감염 키트를 실온에 두었다 (표 7) (ClonTech로부터 이용가능함).
콘카테머 DNA를 정제하고 농도를 측정하였다 (콘카테머 어레이는 본원에 개시된 방법에 따라 정제될 수 있음).
형질감염 플라스미드 DNA 표를 제조하였다 (표 8; 4 mL, 60 mm 배양 디시).
각각의 형질감염에서, 별도의 15 mL 고깔 원심분리 튜브에서 용액 A 및 용액 B를 제조하였다.
피펫팅-도움으로 용액 B (2×HBS)를 발포시키고 용액 A (DNA 혼합물)를 적하 방식으로 첨가하였다.
형질감염 용액을 실온에서 15분 동안 인큐베이션 하였다.
형질감염 용액을 배양 디시에 부드럽게 첨가하였다.
플레이트를 부드럽게 앞 뒤로 움직여서 형질감염 용액을 고르게 분배하였다.
플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션 하였다.
60 mm 배양 디시 당 5 mL 신선한 D10 배지를 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 가온하였다.
4시간 후에 1 mL의 미리 가온된 D10으로 세척하고 4 mL의 미리 가온된 신선한 D10 배지로 교체하였다.
5% C02 37 ℃ 인큐베이터에서 인큐베이션 하였다.
콘카테머 형질감염 48시간 후에, 형질감염된 GPRG 세포를 회수하였다 (세포 계대배양을 수행함).
제오신 (50ug/ml) 및 독시사이클린 (1ng/mL)이 함유된 신선한 D10 배지가 있는 T150 플라스크 또는 30 mL, 150 mm 배양 디시에 세포를 다시 플레이팅하였다.
세포 병소가 확인될 때까지 (통상적으로 1 내지 2주 이내에 관찰됨) 3 내지 4일마다 독시사이클린 (1ng/mL)이 있는 선택 배지 (제오신, 50ug/ml)를 세포에 공급하였다.
실시예 5 - GPRG 포장 세포주를 생성하기 위해 사용된 세포주 및 서열 기술
HEK-293T/17은 HEK-293T의 서브 클론이다. 이러한 세포는 SV-40 T 항원을 안정적으로 발현하며, 특정 클론은 이의 높은 형질감염 능력에 대해 선택되었다. HEK-293T/17에 기초한 마스터 세포 은행을 생성하였다 (HEK-293T/17 MCB).
SFG-IC-HIVgp-Ppac2는 퓨로마이신 저항성을 갖는, CMV 프로모터의 제어 하에 코돈-최적화된 HIV gagpol을 발현하는 감마 레트로바이러스 벡터이다. 이러한 벡터를 제조하기 위해 사용된 플라스미드 (pSFG-IC-HIVgp-Ppac2)를 다음의 구성성분을 사용하여 구축하였다:
(1) 레트로바이러스 벡터 백본 플라스미드 (SFG)로부터 유도된 pSFG tcLuc ECT3, 테트라사이클린-조절된 프로모터 시스템을 사용하여 조절된 유전자 발현을 위해 개작됨 (Lindemann, D., Patriquin, E., Feng, S., & Mulligan, R.C. Versatile retrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro and in vivo. Mol. Med. 3, 466-476 (1997));
(2) 코돈 최적화된 HIV L4-3 gagpol 유전자를 구동시키는 CMV 인핸서/프로모터;
(3) pMSCVpac으로부터 유도된 퓨로마이신 저항성 유전자를 구동시키는 PGK 프로모터 (Hawley, R.G., Lieu, F.H., Fong, A.Z., & Hawley, T.S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994)).
SFG-IC-HIVgp-Ppac2 레트로바이러스 벡터로 HEK-293T/17 MCB을 감염시켜 GP 세포주를 생산하였다.
SFG-tc-revco는 테트라사이클린 반응성 프로모터의 제어 하에 코돈-최적화된 HIV rev를 발현하는 감마 레트로바이러스 벡터이다. 이러한 벡터 (p SFG-tc-revco)를 생산하기 위해 사용된 플라스미드를 다음의 구성성분을 사용하여 구축하였다 :
(1) 상기 NL4-3 균주 서열에 기초한 HIV rev 유전자, 및
(2) pSFG tcLuc ECT3 (상기됨)
SFG-tTA는 레트로바이러스 LTR의 제어 하에 키메라 전사의 전사활성인자를 발현하는 감마 레트로바이러스 벡터이다 (Lindemann, D., Patriquin, E., Feng, S., and Mulligan, R.C. Versatile retrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro and in vivo. Mol. Med. 3, 466-476 (1997)). 이는 SFG 레트로바이러스 벡터에 기초하고, 플라스미드 pUHD15-1의 Tet 프로모터 요소를 포함한다 (Gossen M, and Bujard, H. (1992) PNAS 89 12:5547-5551).
SFG-tc-revco 및 SFG-tTA로 GP 세포주를 감염시켜 GPR 세포주를 생산하였다.
SFG-tc-VSVG는 테트라사이클린-조절된 프로모터의 제어 하에 VSV 당단백질 G를 발현하는 감마 레트로바이러스 벡터이다. 이러한 벡터 (pSFG-tc-VSVG)를 제조하기 위해 사용된 플라스미드는 다른 벡터와 같이 동일한 pSFGtcLucECT3 백본, 및 VSVG 외피 단백질의 공급원으로서 플라스미드 pMD.G를 사용하여 생성된다 (Ory, D.S., Neugeboren, B.A., and Mulligan, R.C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11400-11406 (1996) 및 Rose, J. K. & Gallione, C. (1981) J. Virol. 39, 519-528 참조).
SFG-tc-VSVG로 GPR 세포주를 감염시켜 GPRG 세포주를 생산하였다.
Retro-SVGmu로 GPR 세포주를 감염시켜 GPRS 세포주를 생산하는 것이 Lee, Chi-Lin et al. "Construction of Stable Producer Cells to Make High-Titer Lentiviral Vectors for Dendritic Cell-Based Vaccination." Biotechnology and Bioengineering 109.6 (2012): 1551-1560. PMC. Web. 14 Apr. 2016에 기술되어 있다.
실시예 6 - 콘카테머 어레이 정제
실리카-기반 막 (DNeasy Blood & Tissue 키트)에 의해 GPRG 세포에 형질감염시키기 전에 콘카테머 어레이를 회수하고 정제하였다.
2 ml 수집 튜브에 놓여진 DNeasy Mini 스핀 컬럼 내에 콘카테머 어레이 혼합물을 피펫팅하였다.
6000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다. 흘러내린 것 및 수집 튜브를 버렸다.
DNeasy Mini 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 수집 튜브 (제공됨)에 두었다.
500 μL 완충액 AW1을 첨가하고, 6000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다.
흘러내린 것 및 수집 튜브를 버렸다.
DNeasy Mini 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 수집 튜브 (제공됨)에 두었다.
500 μL 완충액 AW2를 첨가하고, 20,000 × g에서 3분 동안 원심분리하여 DNeasy 막을 건조시켰다.
흘러내린 것 및 수집 튜브를 버렸다.
DNeasy Mini 스핀 컬럼을 깨끗한 1.7 ml Eppendorf 마이크로원심분리 튜브에 두었다.
200 μL 완충액 AE를 DNeasy 막 위에 직접 첨가하였다.
실온에서 4분 동안 인큐베이션 하였다.
6000 × g에서 1분 동안 원심분리하여 DNA 혼합물을 용리하였다.
용리를 한번 더 반복하였다 (새로운 용리 완충액을 첨가함).
NanoDrop Lite 분광광도계로 콘카테머 DNA 농도를 측정하였다.
실시예 7 - TL20- UbcGFP 및 Call - WPRE 생산 세포주
다음의 표는 본원에 기술된 방법에 따라 합성된 2개의 생산 세포주를 요약한 것이다. TL20-Call-wpre 및 TL20-Unc-GFP 벡터와 관련된 데이터를 도 20a, 20b 및 20c에 추가로 나타냈다.
Figure pct00006
1. 약어: TU, 형질도입 단위
2. USC 유동 세포 계측법 핵심 시설 (Core Facility)에서 유동 세포 계측기를 사용하여 단일 세포 분리를 수행함.
3. 조건화된 배지: DMEM w GlutaMax; FBS (10% w/v); Pen/Strep (1% w/v); 독시사이클린 (1 ng/mL)
본 명세서에 언급된 모든 간행물은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다. 광범위하게 기술된 개시 내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 특정 구현예에 나타난 바와 같이 본 개시에 다수의 변형 및 수정이 이루어질 수 있음을 당업자는 인지할 것이다. 따라서, 본 구현예는 모든 면에서 예시적이며, 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
본원의 개시 내용이 특정 구현예를 참조하여 기술되었지만, 이러한 구현예는 단지 본 발명의 원리 및 응용을 설명하는 것임을 이해해야 한다. 따라서, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 다수의 변형이 예시적인 구현예에 이루어질 수 있고 다른 구성이 고안될 수 있음을 이해해야 한다.
<110> CALIMMUNE, INC. <120> BIO-PRODUCTION OF LENTIVIRAL VECTORS <130> Cal-0013WO <150> US 62/161,133 <151> 2015-05-13 <150> US 62/161,152 <151> 2015-05-13 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6565 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: PUC57-TL20C <400> 1 ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60 aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120 ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180 aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240 accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300 tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360 ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420 ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480 caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540 aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600 acagggactt 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gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 300 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 360 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 420 aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 480 aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 540 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 600 tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 660 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 720 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 780 tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 840 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 900 tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 960 caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 1020 aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 1080 aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 1140 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 1200 agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 1260 atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 1320 cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 1380 aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 1440 cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 1500 aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 1560 ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 1620 gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 1680 ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 1740 tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 1800 tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 1860 ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 1920 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 1980 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 2040 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 2100 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 2160 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 2220 acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 2280 gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 2340 gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 2400 tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 2460 ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 2520 cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 2580 gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 2640 tgtaaaacga cggccagtga attc 2664

Claims (59)

  1. 서열번호 1의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 것인, 재조합 플라스미드.
  3. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
  4. 서열번호 2의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
  5. 서열번호 1에 기재된 서열로부터 100개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 갖는 재조합 플라스미드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서열은 서열번호 1에 기재된 서열로부터 50개 이하의 뉴클레오티드가 다른 것인, 재조합 플라스미드.
  7. 약 6500개 뉴클레오티드 내지 약 6750개 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  8. 제7항에 있어서, 약 6600개 뉴클레오티드 내지 약 6700개 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  9. 제7항에 있어서, 약 6611개 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  10. 도 11에 pUC57-TL20c로 기재된 바와 같은 재조합 플라스미드.
  11. BstBI, MluI, NotI, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위로 필수적으로 이루어진 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 플라스미드.
  12. 제11항에 있어서, 포장 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 중심 폴리퓨린 관을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 자가-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  13. (a) 포장 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (b) 중심 폴리퓨린 관 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (c) Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (d) 자가-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 효소 BstBI, Mlu I, Not I, 및 Cla I에 대한 제한 부위를 갖는 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 포장 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  15. 제13항에 있어서, 상기 중심 폴리퓨린 관 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  16. 제13항에 있어서, 상기 Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  17. 제13항에 있어서, 상기 자기-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  18. 제13항에 있어서, 상기 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  19. (a) 플라스미드의 뉴클레오티드 서열의 약 762번째 뉴클레오티드 내지 약 1104번째 뉴클레오티드에 존재하는 포장 서열; (b) 플라스미드의 뉴클레오티드 서열의 약 1121번째 뉴클레오티드 내지 약 1597번째 뉴클레오티드에 존재하는 중심 폴리퓨린 관; (c) 플라스미드 뉴클레오티드 서열의 약 1598번째 뉴클레오티드 내지 약 2366번째 뉴클레오티드에 존재하는 Rev 반응 요소; (d) 플라스미드 뉴클레오티드 서열의 약 409번째 뉴클레오티드 내지 약 589번째 뉴클레오티드에 존재하는 자기-불활성화 긴 말단 반복; 및 (e) 플라스미드 뉴클레오티드 서열의 약 2376번째 뉴클레오티드 내지 약 2400번째 뉴클레오티드에 존재하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 플라스미드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 플라스미드 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  21. 제19항에 있어서, 상기 포장 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  22. 제19항에 있어서, 상기 중심 폴리퓨린 관 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  23. 제19항에 있어서, 상기 Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  24. 제19항에 있어서, 상기 자가-불활성화 긴 말단 반복을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  25. 제19항에 있어서, 상기 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7의 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  26. BstBI, MluI, NotI, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  27. 서열번호 2의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 벡터 카세트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드로서, 상기 벡터 카세트는 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 측부에 위치하고, 상기 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 부위는 sfiI 및 Bsu36I로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 재조합 플라스미드.
  28. 서열번호 2의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 벡터 카세트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드로서, 상기 벡터 카세트는 BstBI, MluI, NotI, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 다중 클로닝 부위를 포함하고, 상기 플라스미드는 벡터 카세트의 테트라사이클린 억제가능한 프로모터 상류를 추가로 포함하는 것인, 재조합 플라스미드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 플라스미드를 포함하는 세포.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 플라스미드 및 블레오마이신 저항성 (ble) 카세트를 포함하는 키트.
  31. (a) 하나 이상의 유전자를 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 플라스미드에 클로닝하여 렌티바이러스 벡터를 합성하는 단계; (b) 합성된 렌티바이러스 벡터로부터 DNA 단편을 생성하는 단계; (c) 합성된 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 DNA 단편 및 항생제 저항성 카세트 플라스미드로부터 생산된 DNA 단편으로부터 콘카테머 어레이를 형성하는 단계; (d) GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, GPRT-G 포장 세포주 또는 이의 유도체를 형성된 콘카테머 어레이로 형질감염시키는 단계; 및 (e) 안정한 생산 세포주를 분리하는 단계를 포함하는 안정한 생산 세포주를 생산하는 방법.
  32. (a) HIV-1 공동-수용체의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하고 HIV-1 융합 억제제를 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 합성하는 단계로서, 상기 렌티바이러스 벡터는 짧은 헤어핀 RNA 및 융합 억제제 모두를 암호화하는 cDNA를 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 플라스미드에 클로닝하여 합성되는 단계; (b) 합성된 렌티바이러스 벡터로부터 DNA 단편을 생성하는 단계; (c) 합성된 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 DNA 단편 및 항생제 저항성 카세트 플라스미드로부터 생산된 DNA 단편으로부터 콘카테머 어레이를 형성하는 단계; (d) GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, GPRT-G 포장 세포주 또는 이의 유도체를 형성된 콘카테머 어레이로 형질감염시키는 단계; 및 (e) 안정한 생산 세포주를 분리하는 단계를 포함하는 안정한 생산 세포주를 생산하는 방법.
  33. 안정한 생산 세포주로부터 벡터 상등액을 회수하는 방법으로서, 상기 벡터 상등액은 약 40 시간 내지 약 56시간마다 회수되는 방법.
  34. LVsh5/C46 렌티바이러스 벡터를 포함하는 벡터 상등액을 회수하는 방법으로서, 상기 벡터 상등액은 약 40 시간 내지 약 56시간마다 회수되는 방법.
  35. LVsh5/C46을 생산하기에 적절한 안정한 생산 세포주.
  36. 제35항에 있어서, GPRG 포장 세포주에 기초한 안정한 생산 세포주.
  37. 제35항에 있어서, GPRT 포장 세포주에 기초한 안정한 생산 세포주.
  38. 제35항에 있어서, GPR 포장 세포주에 기초한 안정한 생산 세포주.
  39. 서열번호 8의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 생산하기에 적절한 안정한 생산 세포주.
  40. 제39항에 있어서, GPRG 포장 세포주에 기초한 안정한 생산 세포주.
  41. 제39항에 있어서, GPRT 포장 세포주에 기초한 안정한 생산 세포주.
  42. 제39항에 있어서, GPR 포장 세포주에 기초한 안정한 생산 세포주.
  43. 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드로부터의 DNA 단편을 포함하는 콘카테머 어레이로서; 상기 제1 플라스미드는 pUC57-TL20c로부터 유래되고; 제2 플라스미드는 블레오마이신 항생제 저항성 카세트를 포함하고; 이때, 제1 플라스미드 대 제2 플라스미드로부터의 DNA 단편 비는 약 25:1 내지 약 1:25의 범위인, 콘카테머 어레이.
  44. GPR, GPRG, GPRT, GPRGT 및 GPRT-G 포장 세포주 또는 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 포장 세포주를 제43항의 콘카테머 어레이로 형질감염시켜 생산된 안정한 생산 세포주.
  45. 제44항에 있어서, LVsh5/C46을 생산하는 안정한 생산 세포주.
  46. 제45항에 있어서, 상기 LVsh5/C46은 약 40시간 내지 약 56시간마다 회수될 수 있는 것인, 안정한 생산 세포주.
  47. 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 도 11의 플라스미드 맵을 갖는 분리된 벡터.
  48. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 플라스미드를 절단하는 단계 및 절단된 플라스미드 말단을 도입된 폴리뉴클레오티드의 호환가능한 말단과 라이게이션시키는 단계를 포함하는 플라스미드 벡터를 제조하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 도입된 폴리뉴클레오티드는 HIV-1 공동-수용체의 하향 조절을 위한 적어도 하나의 짧은 헤어핀 RNA 및 HIV-1 융합 억제제를 암호화하는 것인, 방법.
  50. (a) 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 및 (b) 포장 세포주 세포를 포함하는 키트.
  51. 제50항에 있어서, 상기 포장 세포주 세포는 GPR, GPRG, GPRT, GPRTG, 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 키트.
  52. 제50항에 있어서, 블레오마이신 저항성 (ble) 카세트를 추가로 포함하는 것인, 키트.
  53. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 플라스미드로부터 유도된 렌티바이러스 벡터.
  54. 제53항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터.
  55. 제54항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 뉴클레오티드 서열은 HIV-1 공동-수용체의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 HIV-1 융합 억제제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 렌티바이러스 벡터.
  56. 제55항에 있어서, LVsh5/C46인 렌티바이러스 벡터.
  57. 제55항에 있어서, 서열번호 8의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 렌티바이러스 벡터.
  58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항의 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포.
  59. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항의 렌티바이러스 벡터 및 담체를 포함하는 약학 조성물.
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