CN112080439B

CN112080439B - 人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用

Info

Publication number: CN112080439B
Application number: CN202010749082.5A
Authority: CN
Inventors: 孙杰; 屈朕朕; 张丽丽; 竺少铭; 唐学超; 袁围; 汪钊; 孔望欣; 王红卫; 夏美芳
Original assignee: Changhai Biological Branch Of Zhejiang Pharmaceutical Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Changhai Biological Branch Of Zhejiang Pharmaceutical Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: CN112080439A

Abstract

本发明公开了一种人源细胞凋亡调控蛋白Bcl‑2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用，本发明只需要简单地在含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌中过表达人源抗凋亡调控蛋白Bcl‑2编码基因，就可以促进橙花叔醇合成，橙花叔醇摇瓶量提高了77.7％，达到594.1mg/L。向培养基中添加脂肪酸后，橙花叔醇摇瓶产量进一步提高至725.5mg/L，为目前报道的摇瓶发酵最高产量。

Description

人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2的应用，特别涉及一种人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用。

(二)背景技术

酿酒酵母具有遗传操作简便、生物安全性高和发酵稳定等优点，是一种应用广泛的生物细胞工厂。萜类化合物的通用C5前体为异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，它们在酵母中通过甲羟戊酸(MVA)途径合成。萜类化合物具有重要的应用价值。类胡萝卜素、薄荷醇、柠檬烯、松萜和柠檬醛等可以用作食用色素、香料和香水，樟脑、青蒿素和紫杉醇等则可以作为药物使用。通过提高乙酰-COA和MVA水平，研究者已经成功地将酿酒酵母改造为异源生物合成萜类化合物的高产微生物。

在哺乳动物细胞中，人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma 2)蛋白家族是压力信号网络的一个核心分子，与细胞死亡、钙离子平衡、UPR和细胞自噬的信号途径均有联系，与癌症发生关系密切。Bcl-2蛋白家族分为促凋亡和抗凋亡亚家族。促凋亡蛋白Bax可以直接激活未折叠蛋白反应(UPR)，Bax也直接诱导KAR2、DER1和GCN4等UPR靶基因的表达。抗凋亡蛋白Bcl-XL和Bcl-2可以与Bax蛋白相互作用，抑制Bax促凋亡活性，并通过未知的机制，调节内质网压力信号。虽然酵母中没有Bcl-2蛋白家族的同源序列，但是Bcl-2蛋白家族在酵母中表达后展现出一些生理活性，例如，可以保护由于氧化损伤造成的细胞损伤(Kane,et al.(1993)Science 262,1274-1276.)，提高暴露于氧压和热应激的酵母细胞的生存效率(Chen et al(2003).Free Radic Biol Med.34(10):1315-1325.)。橙花叔醇(Nerolidol)是一种重要的香料和倍半萜精油成分，被广泛应用于合成橡胶和医药等领域。

在本发明中，我们发现Bcl-2蛋白可以显著增加酵母合成橙花叔醇产量，并且培养基中添加不饱和脂肪酸可以进一步提高表达BCL-2的酵母工程菌的橙花叔醇产量。本发明以酵母工程菌中橙花叔醇的合成为例，为提高酵母倍半萜类化合物的生产提供了一种简便有效的方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用，利用橙花叔醇合成酶基因酵母工程菌过表达人源抗凋亡调控蛋白编码基因BCL-2，并向培养基中添加不饱和脂肪酸，显著提高目标代谢产物的合成。

本发明采用的具体技术方案是：

本发明提供一种人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用，所述人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，按照酿酒酵母密码子偏好性优化后的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述应用是利用含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌过表达人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2，从而提高酿酒酵母合成橙花叔醇的产量。

所述橙花叔醇合成酶AcNES1氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，所述含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌优选酵母工程菌YS036(构建方法见Qu et al.,Enzyme Microb Tech.2019,0141-0229.)。

所述过表达人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2的方法包括：将BCL-2基因与TDH3启动子整合到含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌基因组位点YPRCtau3；或者使用pRS316质粒组成型过表达BCL-2，并将质粒导入含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌；或者使用pRS316质粒过表达GAL1启动子驱动的BCL-2，并将质粒导入含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌。

本发明所述提高橙花叔醇产量的方法为：将过表达BCL-2且含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌接种至葡萄糖合成最小培养基，在30℃，摇瓶转速200rpm下培养过夜，取培养物以体积浓度1％的接种量接种至蔗糖合成最小培养基，在30℃，摇瓶转速200rpm条件下发酵培养24小时，加入发酵液10％体积的十二烷，继续培养至96小时，此时产物橙花叔醇浓度不再继续增加，培养物离心，获得含橙花叔醇的十二烷有机相，提取橙花叔醇；

所述蔗糖合成最小培养基质量终浓度组成：2％蔗糖，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵和20mg/L微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)和尿嘧啶(Ura3)中的一种或多种；根据筛选不同选择标记的需要，在培养基中添加不同微量营养素，例如：本发明中的菌株YS039、YS043和YS044筛选标记为Leu2和Ura3，则培养基中添加微量营养素为组氨酸；所述葡萄糖合成最小培养基是将蔗糖合成最小培养基中2％蔗糖替换为2％葡萄糖；固体平板在上述组分基础上再加入2％琼脂。

本发明为了进一步提高橙花叔醇产量，在发酵培养过程中向蔗糖合成最小培养基添加终浓度1～5mmol/L(优选3mmol/L)不饱和脂肪酸；所述不饱和脂肪酸为油酸、亚油酸或亚麻酸中的一种。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明中只需要简单地在含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌中过表达人源抗凋亡调控蛋白Bcl-2，就可以促进橙花叔醇合成，橙花叔醇摇瓶量提高了77.7％，达到594.1mg/L。向培养基中添加脂肪酸后，橙花叔醇摇瓶产量进一步提高至725.5mg/L，为目前报道的摇瓶发酵最高产量。

(四)附图说明

图1为BCL-2不同过表达方式对橙花叔醇产量的影响，不同字母代表差异显著(P<0.05)。

图2为BCL-2过表达菌株和出发菌株的橙花叔醇合成曲线(a)和菌体生长曲线(b)。

图3为过表达BCL-2对细胞活力(a)和细胞内ROS(b)的影响。误差线表示三个生物学重复测定的标准差；ROS含量由单位荧光强度表示；*表示P<0.05。

图4为不同脂肪酸的添加对菌株合成橙花叔醇的影响。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

(五)具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。除非另作定义，本发明公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1、BCL-2的过表达

1、基因及来源

将来源于人源细胞凋亡调控因子Bcl-2氨基酸序列(SEQ ID NO.1，UNIPROT数据库登录号P10415)，按酿酒酵母密码子偏好性，合成核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，连接至克隆载体pUC18中，构建pUC18-Bcl2载体。

将来源于猕猴桃(Actinidia chinensis)的橙花叔醇合成酶AcNES1氨基酸序列(SEQ ID NO.3，UNIPROT数据库登录号H9M5U5)，按酿酒酵母密码子偏好性，合成核苷酸序列(SEQ ID NO.4)，通过限制性内切酶BamHI/EcoRI克隆至pYES2载体(Invitrogen，美国)，获得带有橙花叔醇合成酶编码基因的质粒pYES2-AcNES1。

2、BCL-2过表达菌株的构建

根据表1和表2，使用引物对BCL2-F1/BCL2-R1从含有BCL-2基因的pUC18-Bcl2载体上克隆出BCL-2DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。以pRS316载体(Sikorski,etal.Genetics，1989,122,19-27)为模板，利用引物对pRS316-2501-F/pRS316-R扩增出载体pRS316骨架(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)。以YS036菌株基因组为模板，利用引物对tTDH3p-F1/tTDH3p-R扩增出TDH3启动子(核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)。利用引物对Leu2-HAC1-F/Leu2-R从YEPlac181载体(Gietz,et al.Gene,1988,74:527–534))扩增出筛选标记Leu2(核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示)。上述BCL-2、TDH3启动子、pRS316载体骨架、Leu2片段之间有40-50bp的同源序列。将BCL-2、TDH3启动子、pRS316载体骨架、Leu2片段以及带有橙花叔醇合成酶编码基因的质粒pYES2-AcNES1通过乙酸锂化学转化法(Gietz,etal.Method.Enzymol.2002,350,87–96)，同时转入YS036菌株中，构建出菌株YS039。由此，菌株YS039带有了pYES2-AcNES1和pRS316_Leu2-P_TDH3-BCL-2两个质粒。

将BCL-2表达盒与启动子TDH3整合到菌株YS036的基因组位点YPRCtau3，构建菌株YS043，具体为：以菌株YS036的基因组为模板，使用引物对Bcl2-YPRCtau3up-F/Bcl2-YPRCtau3-R和Bcl2-YPRCtau3down-F/Bcl2-YPRCtau3down-R分别扩增YPRCtau3位点的上、下游同源臂(SEQ ID NO.8和9)。使用引物对Bcl2-Prs316-F/Bcl2-Leu2-R以菌株YS039的pRS316_Leu2-P_TDH3-BCL-2质粒为模板扩增出BCL-2-Leu2片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示)。将YPRCtau3位点的上下游同源臂、BCL-2-Leu2片段、质粒pYES2-AcNES1同时转入YS036菌株中，构建出菌株YS043。

在pRS316质粒上过表达了GAL1启动子驱动的BCL-2，构建了菌株YS044，具体为：使用引物对Bcl2-pRS316-F/Bcl2-pRS316-R从菌株YS039的pRS316_Leu2-P_TDH3-BCL-2质粒中扩增带有BCL-2和Leu2的pRS316载体骨架(SEQ ID NO.11)，使用引物P_Gal1-F/P_Gal1-R扩增载体pYES2上的GAL1启动子(核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示)。将带有BCL-2和Leu2的pRS316载体骨架、GAL1启动子片段、质粒pYES2-AcNES1同时转入YS036菌株中，构建出菌株YS044。由此，菌株YS044带有了pYES2-AcNES1和pRS316_Leu2-P_GAL1-BCL-2两个质粒。

表1本发明涉及到的菌株

表2实施例1中所使用的引物列表

注：引物序列中的小写字母序列为与相邻片段的重叠序列。

3、菌株培养

酿酒酵母工程菌培养方法为：将步骤2构建的酿酒酵母工程菌接种至葡萄糖合成最小培养基，在30℃，摇瓶转速200rpm下培养过夜，取培养物0.18mL接种至18mL蔗糖合成最小培养基，使初始OD₆₀₀＝0.2，然后加入2mL十二烷，用于橙花叔醇的边合成边萃取，在30℃，摇瓶转速200rpm条件下培养96h，培养物离心，取上层有机相进行橙花叔醇含量测定。

所述蔗糖合成最小培养基质量终浓度组成：2％蔗糖，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵和微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)和尿嘧啶(Ura3)，它们在培养基中的终浓度均为20mg/L；本发明中的菌株YS039、YS043和YS044筛选标记为Leu2和Ura3，则培养基中添加微量营养素为组氨酸。

葡萄糖合成最小培养基为上述蔗糖合成最小培养基中2％蔗糖替换为2％葡萄糖；固体平板在上述组分基础上再加入2％琼脂。

实施例2橙花叔醇产量测定

橙花叔醇气相色谱测定条件：使用安捷伦7890A GC系统测定，进样口温度280℃，进样量1μl，分流比1:10，色谱柱：HP-5GC(30m×0.25μm×0.25μm)；色谱条件：氦气流量1mL/min，60℃，5min，10℃/min升温到280℃。

实施例1发酵培养96h后，取上层有机相进行橙花叔醇含量测定，如图1所示，与菌株YS037相比，pRS316质粒上组成型表达BCL-2的菌株YS039的橙花叔醇产量提高了77.7％，达到594.1mg/L；整合在基因组YPRCtau3位点的菌株YS043的橙花叔醇产量提高了51.6％，达到510.2mg/L；GAL1启动子驱动的菌株YS044橙花叔醇提高了60.3％，达到539.4mg/L。由此可知，表达BCL-2可以促进酿酒酵母橙花叔醇的生物合成，且在pRS316质粒上由TDH3组成型启动子驱动表达的促进效果最为显著。

分别观察了实施例1中菌株YS037和YS039的橙花叔醇合成曲线(图2中a)，发酵48小时后，YS039产生的橙花叔醇比YS037(377mg/Lvs.241.7mg/L)多60％。96h时，YS039的橙花叔醇产量达到最高水平，为594.1mg/L，是YS037的1.8倍。同时还观察到YS037和YS039的生长曲线(图2中b)，在96小时的培养过程中，YS039的生物量始终略低于YS037，可能与YS039合成更高的橙花叔醇抑制菌体生长有关。两株菌在96小时发酵后达到了相似的生物量。总之，在酵母中BCL-2的过表达增加了橙花叔醇的产生，且对生物量合成没有较大的影响。

实施例3过表达BCL-2对细胞活力和胞内活性氧(ROS)的影响

1、过表达BCL-2对细胞活力的影响

向100mL的质量浓度0.01％氢氧化钠水溶液中加入30mL的体积浓度95％乙醇水溶液和0.3g亚甲基蓝染料(索莱宝，中国)，得到亚甲基蓝染液。分别收集实施例1中发酵培养24h、48h、72h和96h的菌株YS037培养液和菌株YS039培养液，将收取的培养液使用无菌水洗涤后悬浮至OD₆₀₀为1，吸取10μL滴在载玻片上，然后吸取10μL配置好的亚甲基蓝染液覆盖菌液，室温染色5min后光学显微镜观察。活的细胞可以将亚甲基蓝氧化为无色，死的或者活力较差的细胞会被染成蓝色或淡蓝色。细胞活力＝活细胞数/细胞总数。

如图3中a，在24h时，菌株YS037和YS039的细胞活力没有显著差异；48h时，YS039的细胞存活率(55％)显著高于YS037(43.5％)；随着碳源的消耗及产物的积累对菌体的影响，在72h和96h，两株菌细胞活力虽然呈同样的下降趋势，但菌株YS039的细胞活力也一直高于菌株YS037。

2、过表达BCL-2对胞内ROS的影响

由于细胞生长过程中胞内氧化还原反应会造成ROS的产生，我们进一步用荧光染料DCFH-DA测定菌株YS037和YS039内源性ROS的生成。

分别收集实施例1发酵培养24h、48h、72h和96h的菌株YS037细胞和菌株YS039细胞，将2×10⁶–3×10⁷个细胞加入1mL 10μM DCFH-DA溶液(Macklin,中国)中，37℃孵浴40min。然后使用10mM PBS缓冲液(pH7.4)清洗细胞。使用酶标仪(Max M5，MolecularDevices公司，美国)在激发波长488nm和发射波长525nm处测定荧光强度。如图3中b所示，可以观察到在细胞生长过程中，随着培养时间的延长，ROS逐渐降低。过表达BCL-2的菌株YS039胞内ROS在72h和96h显著低于对照菌株YS037(P<0.05)，72h时胞内ROS降低43.2％。因此，过表达BCL-2增加了YS039的细胞活力并且降低了胞内ROS的含量。

实施例4培养基中脂肪酸添加提高BCL-2表达菌株的橙花叔醇产量

1、BCL-2高表达对菌株脂肪酸氧化途径关键酶编码基因转录的影响

将实施例1菌株YS307和YS309发酵培养48h后的培养物离心，取菌体沉淀进行转录组测定，RNA文库的制备和测序委托上海派森诺生物技术有限公司(中国，上海)进行。使用RNA样品制备试剂盒(Illumina，美国)生成测序文库。样品经过RNA抽提、纯化、建库之后，纯化产物在Bioanalyzer 2100系统(安捷伦，美国)上使用高灵敏度DNA测定法对产物进行定量。然后将测序文库在Hiseq平台(Illumina，美国)上测序。使用Hiseq 0.6.1p2进行基因表达分析。

表3菌株YS037和YS039与脂肪酸利用相关的基因转录水平变化

如表3所示，在过表达BCL-2后YML054C、YAL054C、YOR100C、YIL160C、YGL205W、YKR009C等基因的转录活性显著提升。YKR009C(FOX2)编码脂肪酸氧化酶的合成，在胞内脂肪酸β-氧化过程中促进不饱和脂肪酸的氧化；YAL054C(ACS1)编码乙酰-CoA合酶的表达，可以将丙酮酸转化为乙酰-CoA，从而促进细胞质中乙酰-CoA的合成；YOR100C编码肉碱转运酶的表达，在脂肪酸氧化过程中，乙酰-CoA依赖于肉碱从过氧化物酶体运输到线粒体，或从线粒体运输到细胞质中。另外，YNL117W(MLS1)的转录水平显著提高。MLS1编码利用乙酰辅酶A作为底物合成苹果酸的苹果酸合成酶，当培养基中存在油酸时定位于过氧化物酶体，而不存在油酸时，定位于细胞质(Kunze M,et al.Eur J Biochem.2002,269(3):915-22)。因此，不饱和脂肪酸的添加或许抑制了该酶在细胞质中对乙酰辅酶A的利用。上述基因转录活性的提高可以为MVA途径提供充足的前体乙酰-CoA，从而增加了倍半萜前体物质FPP的合成。推测BCL-2的表达可以增加β-脂肪酸氧化途径的基因转录水平。

2、培养基中脂肪酸添加提高BCL-2表达菌株的橙花叔醇产量

实施例1步骤1菌株YS307、YS309发酵培养24h后，向培养液中加入终浓度均为3mM的三种不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、亚麻酸)，以不添加(No-addition)为对照，继续培养96h至发酵结束。采用实施例2方法检测橙花叔醇产量，结果见图4所示，三种不饱和脂肪酸的添加对菌株YS037的橙花叔醇产量没有显著影响。而对于表达BCL-2的菌株YS039，三种不饱和脂肪酸的添加均显著提高了菌株的橙花叔醇产量，油酸(oleic acid)、亚油酸(linoleic acid)、亚麻酸(linolenic acid)的添加分别提高橙花叔醇产量15.7％、24.0％和22.7％。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

序列表

<110> 浙江工业大学、浙江医药股份有限公司昌海生物分公司

<120> 人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met

1 5 10 15

Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala

20 25 30

Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile

35 40 45

Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp

50 55 60

Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr

85 90 95

Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe

100 105 110

Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly

115 120 125

Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp

130 135 140

Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu

145 150 155 160

Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp

165 170 175

Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn

180 185 190

Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro

195 200 205

Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala

210 215 220

Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys

225 230 235

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atggcacacg ctggtagaac tggttatgac aacagagaaa tagttatgaa atacatccac 60

tacaagttgt ctcaaagagg ttacgaatgg gacgctggtg acgttggtgc tgctccacca 120

ggtgctgctc ctgcaccagg tattttttca tcacaaccag gtcacactcc acacccagcc 180

gcatctagag atccagttgc cagaacttct ccattgcaaa ctccagctgc tccaggtgct 240

gccgctggtc cagctttatc tccagtccca ccagttgttc atttgacttt aagacaagct 300

ggtgatgatt ttagtagaag atatagaaga gacttcgcag aaatgtcttc tcaattgcat 360

ttgactccat ttactgctag aggtagattt gctactgttg ttgaagaatt gtttagagat 420

ggtgttaatt ggggtagaat tgtagcattt tttgaatttg gtggtgttat gtgtgttgaa 480

tctgttaata gagaaatgtc tccattggtt gataatattg ctttgtggat gaccgaatat 540

ttgaatagac atttgcatac ttggatccaa gataatggtg gttgggatgc ttttgtagaa 600

ttgtatggtc catctatgag acctttgttt gatttttctt ggttgtcctt gaaaactttg 660

ttgagtttag ctttggttgg tgcttgtatt actttgggtg cttatttggg tcataagtaa 720

<210> 3

<211> 573

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Met Ala Thr Ala Ala Gly Pro Ile Ala Thr Asn Asn Ser Pro Gln Asn

1 5 10 15

Ser Asn Ala Tyr Arg Thr Pro Ile Ala Pro Ser Val Pro Ile Thr His

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Lys Trp Ser Ile Ala Glu Asp Leu Thr Cys Ile Ser Asn Pro Ser Lys

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His Asn Asn Pro Gln Thr Gly Tyr Arg Ser Phe Ser Asp Glu Leu Tyr

50 55 60

Val Lys Tyr Glu Glu Lys Leu Glu Asp Val Arg Lys Ala Leu Arg Glu

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Val Glu Glu Asn Pro Leu Glu Gly Leu Val Met Ile Asp Ala Leu Gln

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Gln Lys Gln Gln Ile Ile Ser Ser Thr Pro Asp Gly Tyr Pro Glu His

115 120 125

Gly Leu Tyr Glu Val Ser Thr Leu Phe Arg Phe Leu Arg Gln Glu Gly

130 135 140

His Asn Val Thr Ala Asp Val Phe Asn Asn Phe Lys Asp Lys Glu Gly

145 150 155 160

Arg Phe Arg Ser Glu Leu Ser Thr Asp Ile Arg Gly Leu Met Ser Leu

165 170 175

Tyr Glu Ala Ser Gln Leu Arg Ile Glu Gly Glu Asp Ile Leu Asp Gln

180 185 190

Ala Ala Asp Phe Ser Ser Gln Leu Leu Gly Arg Trp Thr Lys Asp Pro

195 200 205

Asn His His Glu Ala Arg Leu Val Ser Asn Thr Leu Thr His Pro Tyr

210 215 220

His Lys Ser Leu Ala Thr Phe Met Gly Gln Lys Leu Ser Tyr Met Asn

225 230 235 240

Cys Lys Gly Pro Asn Trp Asp Gly Val Asp Asn Leu Gln Glu Leu Ala

245 250 255

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260 265 270

Gln Val Ser Gln Trp Trp Lys Asp Thr Gly Leu Ala Asn Glu Leu Lys

275 280 285

Leu Ala Arg Asn Gln Pro Leu Lys Trp Tyr Met Trp Pro Met Ala Ala

290 295 300

Leu Thr Asp Pro Arg Phe Ser Glu Glu Arg Val Glu Leu Thr Lys Pro

305 310 315 320

Ile Ser Phe Ile Tyr Ile Ile Asp Asp Ile Phe Asp Val Tyr Gly Thr

325 330 335

Ile Glu Glu Leu Thr Leu Phe Thr Asp Ala Val Asn Arg Trp Glu Leu

340 345 350

Ser Ala Val Glu Gln Leu Pro Asp Tyr Met Lys Val Cys Phe Lys Ala

355 360 365

Leu Tyr Asp Val Thr Asn Glu Ile Ala Tyr Lys Ile Tyr Lys Lys His

370 375 380

Gly Gln Asn Pro Ile Asp Ser Leu Gln Lys Thr Trp Ala Ser Leu Cys

385 390 395 400

Asn Ala Phe Leu Val Glu Ala Lys Trp Phe Ala Ser Gly His Leu Pro

405 410 415

Asn Ala Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Gly Ile Ile Ser Ser Gly Val His

420 425 430

Val Val Leu Ala His Met Phe Phe Leu Leu Gly Asp Gly Ile Thr Gln

435 440 445

Glu Ser Val Asp Leu Val Asp Asp Tyr Pro Gly Ile Ser Thr Ser Ile

450 455 460

Ala Thr Ile Leu Arg Leu Ser Asp Asp Leu Gly Ser Ala Lys Asp Glu

465 470 475 480

Asp Gln Asp Gly Tyr Asp Gly Ser Tyr Ile Glu Cys Tyr Met Lys Glu

485 490 495

His Lys Gly Ser Ser Val Asp Ser Ala Arg Glu Glu Val Ile Arg Met

500 505 510

Ile Ser Glu Ala Trp Lys Cys Leu Asn Lys Glu Cys Leu Ser Pro Asn

515 520 525

Pro Phe Ser Glu Ser Phe Arg Ile Gly Ser Leu Asn Met Ala Arg Met

530 535 540

Ile Pro Met Met Tyr Ser Tyr Asp Asp Asn His Asn Leu Pro Ile Leu

545 550 555 560

Glu Glu His Met Lys Ala Met Ile Tyr Asn Thr Ser Leu

565 570

<210> 4

<211> 1722

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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atggctaccg cagcaggtcc tatcgcaact aacaactccc cacaaaactc caacgcttac 60

agaactccaa tcgctccttc cgtaccaatt actcataaat ggtctatagc tgaagatttg 120

acatgtattt ccaatcctag taagcacaat aaccctcaaa ctggttacag atcattttct 180

gacgaattat acgttaagta cgaagaaaag ttggaagatg ttagaaaagc attaagagaa 240

gttgaagaaa accctttgga aggtttagtt atgatagacg ctttgcaaag attgggtatc 300

gattaccatt tcagaggtga aattggtgca ttcttgcaaa agcaacaaat catatcttca 360

actccagatg gttaccctga acatggtttg tacgaagttt caacattgtt tagattctta 420

agacaagaag gtcacaatgt taccgctgac gtctttaata acttcaagga taaggaaggt 480

agattcagat cagaattgtc aacagatatt agaggtttga tgtccttata cgaagcaagt 540

caattgagaa tagaaggtga agacatctta gatcaagctg ctgatttctc cagtcaattg 600

ttaggtagat ggacaaaaga tcctaatcat cacgaagcca gattggtttc taacacttta 660

acacatccat accacaagtc attggctacc tttatgggtc aaaaattgtc ctacatgaac 720

tgcaagggtc caaactggga cggtgtcgat aatttgcaag aattagctaa gatggatttg 780

actatcgtac aaagtatcca tcaaaaggaa gtattccaag tttctcaatg gtggaaggat 840

acaggtttag ccaatgaatt gaaattggct agaaaccaac cattgaagtg gtatatgtgg 900

cctatggccg ctttaaccga tccaagattc agtgaagaaa gagttgaatt aactaagcct 960

atttctttta tatacatcat agatgacatc ttcgacgtct atggtaccat tgaagaattg 1020

accttgttta ctgatgcagt taatagatgg gaattgtctg ccgtcgaaca attaccagac 1080

tacatgaaag tatgtttcaa ggctttgtac gatgttacca acgaaatcgc atacaaaatc 1140

tataaaaagc atggtcaaaa ccctattgat tccttgcaaa agacttgggc tagtttgtgc 1200

aatgcatttt tagttgaagc aaagtggttc gcctctggtc acttgccaaa tgcagaagaa 1260

tacttaaaga acggtatcat ctcttcaggt gttcatgttg tcttggccca catgtttttc 1320

ttgttaggtg acggtattac acaagaatca gttgatttgg tagatgacta tccaggtatt 1380

tccacaagta tcgcaaccat tttgagatta tctgatgact tgggttcagc caaagatgaa 1440

gaccaagatg gttatgatgg ttcttacatc gaatgttaca tgaaggaaca taagggttcc 1500

agtgtcgatt cagccagaga agaagtaata agaatgatct ccgaagcatg gaaatgtttg 1560

aataaggaat gcttatcacc aaaccctttt tctgaatcat tcagaatagg ttccttgaat 1620

atggctagaa tgatccctat gatgtactct tacgatgaca accataactt gccaatttta 1680

gaagaacaca tgaaggcaat gatctataac acatctttat aa 1722

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<212> DNA

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gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 60

aggctcggcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 120

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttc ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 180

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 240

ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 300

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 360

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 420

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 480

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 540

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 600

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 660

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 720

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 780

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 840

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactgcccgt cgtgtagata 900

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 960

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 1020

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 1080

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 1140

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 1200

gttacatgat cccccatgtt gtgaaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 1260

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 1320

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 1380

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 1440

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 1500

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 1560

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 1620

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 1680

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 1740

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 1800

cctgggtcct tttcatcacg tgctataaaa ataattataa tttaaatttt ttaatataaa 1860

tatataaatt aaaaatagaa agtaaaaaaa gaaattaaag aaaaaatagt ttttgttttc 1920

cgaagatgta aaagactcta gggggatcgc caacaaatac taccttttat cttgctcttc 1980

ctgctctcag gtattaatgc cgaattgttt catcttgtct gtgtagaaga ccacacacga 2040

aaatcctgtg attttacatt ttacttatcg ttaatcgaat gtatatctat ttaatctgct 2100

tttcttgtct aataaatata tatgtaaagt acgctttttg ttgaaatttt ttaaaccttt 2160

gtttattttt ttttcttcat tccgtaactc ttctaccttc tttatttact ttctaaaatc 2220

caaatacaaa acataaaaat aaataaacac agagtaaatt cccaaattat tccatcatta 2280

aaagatacga ggcgcgtgta agttacaggc aagcgatccg tcctaagaaa ccattattat 2340

catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg 2400

tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 2460

agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 2520

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<212> DNA

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attctgctgt aacccgtaca tgcccaaaat agggggcggg ttacacagaa tatataacat 60

cgtaggtgtc tgggtgaaca gtttattcct ggcatccact aaatataatg gagcccgctt 120

tttaagctgg catccagaaa aaaaaagaat cccagcacca aaatattgtt ttcttcacca 180

accatcagtt cataggtcca ttctcttagc gcaactacag agaacagggg cacaaacagg 240

caaaaaacgg gcacaacctc aatggagtga tgcaacctgc ctggagtaaa tgatgacaca 300

aggcaattga cccacgcatg tatctatctc attttcttac accttctatt accttctgct 360

ctctctgatt tggaaaaagc tgaaaaaaaa ggttgaaacc agttccctga aattattccc 420

ctacttgact aataagtata taaagacggt aggtattgat tgtaattctg taaatctatt 480

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tctaccctat gaacatattc cattttgtaa tttcgtgtcg tttctattat gaatttcatt 60

tataaagttt atgtacaaat atcataaaaa aagagaatct ttttaagcaa ggattttctt 120

aacttcttcg gcgacagcat caccgacttc cgtggtactg ttggaaccac ctaaatcacc 180

agttctgata cctgcatcca aaaccttttt aactgcatct tcaatggcct taccttcttc 240

aggcaagttc aatgacaatt tcaacatcat tgcagcagac aagatagtgg cgatagggtt 300

gaccttattc tttggcaaat ctggagcaga accgtggcat ggttcgtaca aaccaaatgc 360

ggtgttcttg tctggcaaag aggccaagga cgcagatggc aacaaaccca aggaacctgg 420

gataacggag gcttcatcgg agatgatatc accaaacatg ttgctggtga ttataatacc 480

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tgaagaggcc aaaacattag ctttatccaa ggaccaaata ggcaatggtg gctcatgttg 660

tagggccatg aaagcggcca ttcttgtgat tctttgcact tctggaacgg tgtattgttc 720

actatcccaa gcgacaccat caccatcgtc ttcctttctc ttaccaaagt aaatacctcc 780

cactaattct ctgacaacaa cgaagtcagt acctttagca aattgtggct tgattggaga 840

taagtctaaa agagagtcgg atgcaaagtt acatggtctt aagttggcgt acaattgaag 900

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tggaagtggg acacctgtag catcgatagc agcaccacca attaaatgat tttcgaaatc 1080

gaacttgaca ttggaacgaa catcagaaat agctttaaga accttaatgg cttcggctgt 1140

gatttcttga ccaacgtggt cacctggcaa aacgacgatc ttcttagggg cagacattag 1200

aatggtatat ccttgaaata tatatatata tattgctgaa atgtaaaagg taagaaaagt 1260

tagaaagtaa gacgattgct aaccacctat tggaaaaaac aataggtcct taaataatat 1320

tgtcaacttc aagtattgtg atgcaagcat ttagtcatga acgcttctct attctatatg 1380

aaaagccggt tccgcggctc tcacctttcc tttttctccc aatttttcag ttgaaaaagg 1440

tatatgcgtc aggcgacctc tgaaattaac aaaaaatttc cagtcatcga atttgattct 1500

gtgcgatagc gcccctgtgt gttctcgtta tgttgaggaa aaaaataatg gttgctaaga 1560

gattcgaact cttgcatctt acgatacctg agtattccca cagttaattc ttgaagacga 1620

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<210> 8

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<212> DNA

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cgataagtgc taaaggaggt gcacgcatta tggagaccac tacgatacga tagctgcgtt 60

gttgttgaag gggtttctta aggttgtttt cgttgaaggt aaatattggt cgtttttgtg 120

cagcatattg tcctctagat gcaaactctg caggtccatt tgcagtaaag tgagttgcct 180

ctcgaagaat cattaatttc gtataaccgt cactattaaa gtcagaaaat aaattctgtc 240

gtagacaatg ttaccataat gttcttgtcc attttgcata cactttaaat attcatttga 300

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ggtccatcat tctgtagcaa gaagttacag tacgctgttc aagcgttaaa caagataagt 420

aatctcgaat gaaacattca tatttcgcat gagccaacat acagttgctg agtaatcttc 480

attgcgctta tttatcggca ttgagattgt aaaggaagta aaacgcattt ttgcagatct 540

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tatgccgagt cttgggttgc caaactaaga ggccatggaa tatatttgaa tgtttgtgat 60

ttggcttcat tgtaacatgt aagtgaacat caaaagagta ggcattaaaa gatgggacgt 120

cagcactgta cttgtttttg cgactagatt gtaaatcatt ctttatttaa tctctttctt 180

taactactgc ttaaagtata atttggtccg tagtttaata actatactaa gcgtaacaat 240

gcatactgac attataagcc tgaacattac gagtttaagt tgtatgtagg cgttctgtaa 300

gaggttactg cgtaaattat caacgaatgc attggtgtat ttgcgaaagc tacttctttt 360

aacaagtatt tacataagaa taatggtgat ctgctcaact gatttggtga taactctaac 420

ttttttagca acaatttaaa agataattcg aacatatata acagtaggaa gaatttgtgt 480

acgtcaaatt aagataattt agcattacca aagttattaa cctaaacata aaatatatat 540

gagacacatg tggaaatcgt atgaaacaac tgttatgaaa ctgacaagaa tgaatatata 600

gagtaagctc cgcttgtaaa gaggaatcac ttaagtgtat aaatgtctcg acgattactt 660

tagatccaag attgatgatt gatattactc tgtaatactt aagctctttt aatagctcac 720

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<212> DNA

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gcggcatcag agcagattga taaaaaacac gctttttcag ttcgagttta tcattatcaa 60

tactgccatt tcaaagaata cgtaaataat taatagtagt gattttccta actttattta 120

gtcaaaaaat tagcctttta attctgctgt aacccgtaca tgcccaaaat agggggcggg 180

ttacacagaa tatataacat cgtaggtgtc tgggtgaaca gtttattcct ggcatccact 240

aaatataatg gagcccgctt tttaagctgg catccagaaa aaaaaagaat cccagcacca 300

aaatattgtt ttcttcacca accatcagtt cataggtcca ttctcttagc gcaactacag 360

agaacagggg cacaaacagg caaaaaacgg gcacaacctc aatggagtga tgcaacctgc 420

ctggagtaaa tgatgacaca aggcaattga cccacgcatg tatctatctc attttcttac 480

accttctatt accttctgct ctctctgatt tggaaaaagc tgaaaaaaaa ggttgaaacc 540

agttccctga aattattccc ctacttgact aataagtata taaagacggt aggtattgat 600

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tatggtccat ctatgagacc tttgtttgat ttttcttggt tgtccttgaa aactttgttg 1380

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agccggttcc gcggctctca cctttccttt ttctcccaat ttttcagttg aaaaaggtat 2880

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gaaatagtta tgaaatacat ccactacaag ttgtctcaaa gaggttacga atgggacgct 120

ggtgacgttg gtgctgctcc accaggtgct gctcctgcac caggtatttt ttcatcacaa 180

ccaggtcaca ctccacaccc agccgcatct agagatccag ttgccagaac ttctccattg 240

caaactccag ctgctccagg tgctgccgct ggtccagctt tatctccagt cccaccagtt 300

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ggaaaaaaat aatggttgct aagagattcg aactcttgca tcttacgata cctgagtatt 2340

cccacagtta attcttgaag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat 2400

gtcatgataa taatggtttc tgcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 2460

gcgttgctgg cgtttttcca taggctcggc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 2520

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt cccccctgga 2580

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 2640

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 2700

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 2760

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 2820

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 2880

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 2940

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 3000

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 3060

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 3120

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 3180

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 3240

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 3300

tgactgcccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 3360

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 3420

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 3480

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 3540

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 3600

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgaaaaaa agcggttagc 3660

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 3720

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 3780

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 3840

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 3900

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 3960

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 4020

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 4080

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 4140

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 4200

acatttcccc gaaaagtgcc acctgggtcc ttttcatcac gtgctataaa aataattata 4260

atttaaattt tttaatataa atatataaat taaaaataga aagtaaaaaa agaaattaaa 4320

gaaaaaatag tttttgtttt ccgaagatgt aaaagactct agggggatcg ccaacaaata 4380

ctacctttta tcttgctctt cctgctctca ggtattaatg ccgaattgtt tcatcttgtc 4440

tgtgtagaag accacacacg aaaatcctgt gattttacat tttacttatc gttaatcgaa 4500

tgtatatcta tttaatctgc ttttcttgtc taataaatat atatgtaaag tacgcttttt 4560

gttgaaattt tttaaacctt tgtttatttt tttttcttca ttccgtaact cttctacctt 4620

ctttatttac tttctaaaat ccaaatacaa aacataaaaa taaataaaca cagagtaaat 4680

tcccaaatta ttccatcatt aaaagatacg aggcgcgtgt aagttacagg caagcgatcc 4740

gtcctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 4800

ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga 4860

gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc 4920

agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact 4980

gagag 4985

<210> 12

<211> 482

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

ggggatgatc cactagtacg gattagaagc cgccgagcgg gtgacagccc tccgaaggaa 60

gactctcctc cgtgcgtcct cgtcttcacc ggtcgcgttc ctgaaacgca gatgtgcctc 120

gcgccgcact gctccgaaca ataaagattc tacaatacta gcttttatgg ttatgaagag 180

gaaaaattgg cagtaacctg gccccacaaa ccttcaaatg aacgaatcaa attaacaacc 240

ataggatgat aatgcgatta gttttttagc cttatttctg gggtaattaa tcagcgaagc 300

gatgattttt gatctattaa cagatatata aatgcaaaaa ctgcataacc actttaacta 360

atactttcaa cattttcggt ttgtattact tcttattcaa atgtaataaa agtatcaaca 420

aaaaattgtt aatatacctc tatactttaa cgtcaaggag aaaaaacccc ggatcggact 480

ac 482

Claims

1.一种人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用，其特征在于所述应用的方法为：将过表达人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2且含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌接种至葡萄糖合成最小培养基，在30℃，摇瓶转速200rpm下培养过夜，取培养物以体积浓度1％的接种量接种至蔗糖合成最小培养基，在30℃，摇瓶转速200rpm条件下发酵培养24小时加入发酵液10％体积的十二烷，继续培养至橙花叔醇浓度不再继续增加，培养物离心，获得含橙花叔醇的十二烷有机相，提取橙花叔醇，从而提高酿酒酵母合成橙花叔醇的产量；

所述蔗糖合成最小培养基质量终浓度组成：2％蔗糖，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵，20mg/L微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶中的一种或多种；所述葡萄糖合成最小培养基是将蔗糖合成最小培养基中2％蔗糖替换为2％葡萄糖；在发酵培养过程中向蔗糖最小合成培养基中添加终浓度1～5mmol/L不饱和脂肪酸；

所述过表达人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2的方法包括：将人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2的编码基因与TDH3启动子整合到含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌基因组位点YPRCtau3；或者使用pRS316质粒组成型过表达人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2的编码基因，并将质粒导入含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌；或者使用pRS316质粒过表达GAL1启动子驱动的人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2的编码基因，并将质粒导入含橙花叔醇合成酶基因的酿酒酵母工程菌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述橙花叔醇合成酶基因的核苷酸序列为SEQID NO.4所示。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述不饱和脂肪酸为油酸、亚油酸或亚麻酸中的一种。