ES2346659T3 - Procedimientos de fabricacion de proteinas recombinantes utilizando inhibidores de la apoptosis. - Google Patents
Procedimientos de fabricacion de proteinas recombinantes utilizando inhibidores de la apoptosis. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2346659T3 ES2346659T3 ES05020550T ES05020550T ES2346659T3 ES 2346659 T3 ES2346659 T3 ES 2346659T3 ES 05020550 T ES05020550 T ES 05020550T ES 05020550 T ES05020550 T ES 05020550T ES 2346659 T3 ES2346659 T3 ES 2346659T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cell
- cells
- protein
- apoptosis
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/36—Lipids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
- C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/48—Regulators of apoptosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Procedimiento para fabricar proteínas recombinantes utilizando uno o más inhibidores de la apoptosis, que comprende las etapas de: (a)provisión de un vector que comprende un gen que codifica una proteína de interés; (b)provisión de una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO); (c)transformación o transfección de la célula huésped con el vector de la etapa (a); (d)provisión de los medios de cultivo celular; (e)provisión de una cantidad de inhibidor de caspasa z-VAD-fmk; (f)mezclar el inhibidor de caspasa en los medios de cultivo celular; (g)cultivo de la célula huésped transformada o transfectada en el medio de cultivo celular bajo las condiciones suficientes para la expresión de la proteína de interés; y, opcionalmente (f)recuperación o purificación de la proteína de interés de la célula huésped y/o del medio de cultivo celular.
Description
Procedimientos de fabricación de proteínas
recombinantes utilizando inhibidores de la apoptosis.
La presente invención se refiere, en general, a
la mejora en los procedimientos de fabricación de proteínas
recombinantes utilizando uno o más inhibidores de la apoptosis.
Se cree que el control del número de células en
los mamíferos viene determinado, en parte, por un equilibrio entre
la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte
celular, en ocasiones denominada muerte celular necrótica, se
caracteriza normalmente por ser una forma patológica de muerte
celular producida como resultado de algún tipo de trauma o de
lesión celular. Por otra parte, existe otra forma, la forma
"fisiológica" de muerte celular, que suele producirse de una
manera ordenada o controlada. Esta forma ordenada o controlada de
muerte celular se denomina, a menudo, "apoptosis" [ver, por
ejemplo, Barr et al., Bio/Technology,
12:487-493 (1994); Steller et al.,
Science, 267:1445-1449 (1995)]. La
muerte celular apoptótica se produce de manera natural en numerosos
procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario y la
selección clonal en el sistema inmunológico [Itoh et al.,
Cell, 66:233-243 (1991)].
El control del número de células en un cultivo
celular y en los biorreactores también es un equilibrio entre la
proliferación celular y la muerte celular. Existen datos en la
literatura que indican que la muerte celular que se produce en los
biorreactores puede ser un proceso apoptótico [Suzuki E., et
al., Cytotechnology, 23:55-59
(1997); Al-Rubeai, M. y Singh R.P, Curr. Opin.
Biotech, 9:152-156 (1998)]. Se ha
descrito que el proceso apoptótico puede estar inducido por una
deficiencia de nutrientes [Franek F. y
Chládkova-Srámková K., Cytotechnology,
18:113-117 (1995); Mercille S. y Massie B.,
Biotechnol. Bioeng., 44:1140-1154
(1994); Singh R.F., et al., Biotechnol. Bioeng.,
44:720-726 (1994)], deficiencia sérica [Singh
R.P., et al., Biotechnol. Bioeng.,
44:720-726 (1994); Zanghi A., et al.,
Biotech. Bioeng., 64:108-119 (1999)] o
por otros parámetros controlables del cultivo celular en
biorreactores, aunque no se trata de un proceso totalmente
controlado debido a la mecánica de los biorreactores, a una falta de
total comprensión de los parámetros necesarios para el cultivo, o
por otras causas indeterminadas.
Tal como se entiende actualmente, el programa de
la apoptosis o muerte celular contiene, al menos, tres elementos
importantes: los activadores, los inhibidores y los efectores; en
C. elegans, estos elementos están codificados,
respectivamente, por tres genes, Ced-4,
Ced-9 y Ced-3
[Steller, Science, 267:1445 (1995); Chinnaiyan et
al., Science, 275:1122-1126
(1997); Wang et al., Cell,
90:1-20 (1997)]. Dos de los miembros de la
familia de TNFR, TNFR1 y Fas/Apol (CD95), pueden activar la muerte
celular apoptótica [Chinnaiyan y Dixit, Current Biology,
6:555-562 (1996); Fraser y Evan, Cell;
85:781-784 (1996)]. TNFR1 también es conocido
por mediar la activación del factor de transcripción,
NF-KB [Tartaglia et al., Cell,
74:845-853 (1993); Hsu et al.,
Cell, 84:299-308 (1996)]. Además de
cierta homología ECD, estos dos receptores comparten homología en
su dominio intracelular (ICD) en una interfase de oligomerización
conocida como el dominio de muerte [Tartaglia et al.,
supra; Nagata, Cell, 88:355 (1997)]. Los
dominios de muerte también se encuentran en diversas proteínas de
metazoos que regulan la apoptosis, a saber, la proteína Drosophila,
Reaper, y las proteínas de mamíferos denominadas FADD/MORT1, TRADD,
y RIP [Cleaveland y Ihle, Cell,
81:479-482 (1995)].
Durante la unión del ligando y la agregación del
receptor, se cree que TNFR1 y CD95 reclutan la proteína FADD para
que entre a formar parte de un complejo de señalización inductor de
la muerte. Supuestamente, CD95 se une directamente a FADD, mientras
que TNFR1 se une a FADD indirectamente a través de TRADD [Chinnaiyan
et al., Cell, 81:505-512
(1995); Boldin et al., J. Biol. Chem.,
270:387-391 (1995); Hsu et al.,
supra; Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem.,
271:4961-4965 (1996)]. Se ha descrito que
FADD actúa como una proteína adaptadora que recluta la proteasa
relacionada con Ced3, MACH-alfa/FLICE (caspasa 8),
para que entre a formar parte de un complejo de señalización de
muerte [Boldin et al., Cell,
85:803-815 (1996); Muzio et al.,
Cell, 85:817-827 (1996)].
MACH-alfa/FLICE parece ser el desencadenante que
activa una cascada de proteasas apoptóticas, incluyendo la enzima
conversora de interleucina-1beta (ICE) y la
CPP32/Yama, que pueden ejecutar algunos aspectos críticos del
programa de muerte celular [Fraser y Evan, supra].
Recientemente se ha revelado que la muerte
celular programada implica la actividad de miembros de una familia
de proteasas de cisteína relacionadas con el gen de muerte celular
de C. elegans, Ced-3, y con la enzima
conversora de IL-1 de mamífero, ICE. La actividad de
las proteasas ICE y CPP32/Yama puede inhibirse por el producto del
gen del virus de vaccinia, crmA [Ray et al.,
Cell, 69:597-604 (1992); Tewari et
al., Cell, 81:801-809 (1995)].
Estudios recientes muestran que CrmA puede inhibir la muerte celular
inducida por TNFR1 y CD95 [Enari et al., Nature,
375:78-81 (1995); Tewari et al., J.
Biol. Chem., 270:3255-3260 (1995)].
Como se muestra en la revisión recientemente
realizada por Tewari et al., TNFR1, TNFR2 y CD40 modulan la
expresión de citoquinas proinflamatorias y coestimulatorias, de
receptores de citoquinas, y de moléculas de adhesión celular
mediante la activación del factor de transcripción,
NF-KB [Tewari et al., Curr. Op. Genet.
Develop., 6:39-44 (1996)].
NF-KB es el prototipo de una familia de factores de
transcripción diméricos cuyas subunidades contienen regiones Rel
convervadas [Verma et al., Genes Develop.,
9:2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev.
Immunol., 14:649-681 (1996)]. En su forma
latente, NF-KB forma un complejo con miembros de la
familia de inhibidores de IKB; durante la inactivación de la IKB
como respuesta a determinados estímulos, el NF-KB
liberado se transloca al núcleo, en donde se une a secuencias
específicas de ADN y activa la transcripción del gen.
Para revisiones recientes de dichas rutas de
señalización, ver, por ejemplo, Ashkenazi et al.,
Science, 281:1305-1308 (1998);
Nagata, Cell, 88:355-365 (1997).
Hasta la fecha se han publicado informes
conflictivos en lo referente a los efectos de los inhibidores de
caspasas y a la expresión de genes anti-apoptóticos
en células recombinantes cultivadas. Por ejemplo, Murray et
al., Biotech. Bioeng., 51:298-304
(1996) describen que la sobreexpresión de
bcl-2 en células de mieloma NSO no afecta a
la fase de decadencia característica de las células cultivadas.
Otras investigaciones han encontrado, por el contrario, que
bcl-2 puede ser efectivo en la prevención de
la muerte de algunas líneas celulares bajo condiciones de cultivo
celular [ver, por ejemplo, Itoh et al., Biotechnol.
Bioeng., 48:118-122 (1995); Mastrangelo et
al., TIBTECH, 16:88-95 (1998);
Simpson et al., Biotechnol. Bioeng.,
54:1-16 (1997); Singh et al.,
Biotechnol. Bioeng., 52:166-175
(1996)]. Goswami et al., Biotechnol. Bioeng.,
62:632-640 (1999) publican que han observado que el
inhibidor de caspasa, z-VAD-fmk, no
es capaz de ampliar de forma significativa la vida de un cultivo
libre de suero de células CHO. WO 98 35986A describe un
procedimiento para fabricar una proteína recombinante (receptor
TRAIL) utilizando un inhibidor de caspasa,
z-VAD-fmk, en células huésped
CV-1/EBNA.
La presente invención se basa en los
descubrimientos de los Solicitantes que, utilizando uno o más
inhibidores de la apoptosis en cultivos de células recombinantes y
en la producción de proteínas, pueden reducir de forma
significativa la apoptosis en el cultivo celular y mejorar las
técnicas de producción de proteínas recombinantes. Los
procedimientos revelados en la presente aplicación son útiles, por
ejemplo, en la prolongación de la viabilidad de las células de los
cultivos celulares o en la mejora o aumento del rendimiento de la
producción de proteínas recombinantes a partir de los cultivos
celulares. Mejoras adicionales proporcionadas por la invención se
describen en detalle más adelante.
La invención describe un procedimiento para la
fabricación de proteínas recombinantes utilizando uno o más
inhibidores de la apoptosis. El procedimiento incluye las etapas de
(a) provisión de un vector que comprende un gen que codifica una
proteína de interés, (b) provisión de un vector que comprende un gen
que codifica una proteína de interés, (c) provisión de una célula
huésped, (d) transformación o transfección de la célula huésped con
los vectores referidos en las etapas (a) y (b), (e) provisión de
los medios de cultivo celular, (f) cultivo de la célula o células
huésped transformadas o transfectadas en un medio de cultivo
celular bajo las condiciones suficientes para la expresión de la
proteína de interés y el inhibidor de la apoptosis, y (g)
recuperación o purificación de la proteína de interés de las
células huésped y/o del medio de cultivo celular. Opcionalmente, el
procedimiento también incluye la etapa de mezclar un inhibidor
adicional de la apoptosis al medio de cultivo. En el procedimiento,
los genes que codifican, respectivamente, el inhibidor de la
apoptosis y la proteína de interés se pueden insertar en un vector
único (por ejemplo, co-transfectados en un vector
único) o, de forma alternativa, se pueden insertar en dos vectores
separados. Preferiblemente, los genes que codifican,
respectivamente, el inhibidor de la apoptosis y la proteína de
interés se insertan en dos vectores separados, presentando cada
vector un tipo de marcador de selección diferente al del otro
vector. Opcionalmente, el procedimiento provee la expresión
transitoria de la proteína de interés y la expresión estable o
transitoria del inhibidor de la apoptosis. Opcionalmente, el gen
que codifica el inhibidor de apoptosis comprende un gen que codifica
la proteína caspasa-9-DN o
baculovirus p35.
En otro ejemplo, el procedimiento incluye las
etapas de (a) provisión de un vector que comprende un gen que
codifica una proteína de interés, (b) provisión de una célula
huésped que comprende ADN que codifica un inhibidor de la
apoptosis, (c) transformación o transfección de la célula o células
huésped con el vector referido en la etapa (a), (d) provisión de
los medios de cultivo celular, (e) cultivo de la célula o células
huésped transformadas o transfectadas en el medio de cultivo celular
bajo las condiciones suficientes para la expresión de la proteína
de interés y el inhibidor de la apoptosis, y (f) recuperación o
purificación de la proteína de interés de las células huésped y/o
del medio de cultivo celular. Opcionalmente, el gen que codifica el
inhibidor de la apoptosis se puede integrar de manera estable en el
genoma de la célula huésped. Opcionalmente, el procedimiento
incluye la etapa adicional de mezclar una molécula adicional
inhibidora de la apoptosis en el medio de cultivo. Opcionalmente,
el procedimiento proporciona la expresión transitoria de la
proteína de interés y la expresión estable o transitoria del
inhibidor de la apoptosis.
La presente invención proporciona un
procedimiento de fabricación de proteínas recombinantes que utiliza
uno o más inhibidores de apoptosis, cuyo procedimiento incluye las
etapas de (a) provisión de un vector que comprende un gen que
codifica una proteína de interés, (b) provisión de una célula
huésped, (c) transformación o transfección de la célula huésped con
el vector referido en la etapa (a), (d) provisión de los medios de
cultivo celular, (e) provisión de un inhibidor de apoptosis, (f)
mezcla del inhibidor de apoptosis en el medio de cultivo, (g)
cultivo de la célula o células huésped en el medio de cultivo
celular bajo las condiciones suficientes para la expresión de la
proteína de interés, y opcionalmente (h) la recuperación o
purificación de la proteína de interés de las células huésped y/o
del medio de cultivo celular tal como se define en las
reivindicaciones. Opcionalmente, el procedimiento proporciona la
expresión transitoria de la proteína de interés.
En otro ejemplo descrito aquí, el método incluye
las etapas de (a) provisión de un vector que comprende un gen que
codifica un inhibidor de la apoptosis, (b) provisión de un vector
que comprende un gen que codifica una proteína de interés, (c)
provisión de una célula huésped, (d) transformación o transfección
de la célula huésped con los vectores referidos en las etapas (a) y
(b), (e) provisión de los medios de cultivo celular, (f) cultivo de
la célula o células huésped transformadas o transfectadas en el
medio de cultivo bajo las condiciones suficientes para la expresión
de la proteína de interés y el inhibidor de la apoptosis, y (g)
congelación y posterior descongelación de las células huésped y/o
los medios de cultivo celular. Opcionalmente, el procedimiento
incluye además la etapa de mezclar un inhibidor de la apoptosis
adicional en los medios de cultivo en las etapas (e) o (f). En el
procedimiento, los genes que codifican, respectivamente, el
inhibidor de la apoptosis y la proteína de interés se pueden
insertar en un único vector, o de forma alternativa, se pueden
insertar en dos vectores separados. Preferiblemente, los genes que
codifican, respectivamente, el inhibidor de la apoptosis y la
proteína de interés se insertan en dos vectores separados, cada
vector con un tipo de marcador de selección diferente al del otro
vector. Opcionalmente, el procedimiento proporciona la expresión
transitoria de la proteína de interés y la expresión estable o
transitoria del inhibidor de la apoptosis.
En otro ejemplo, el procedimiento incluye las
etapas de (a) provisión de un vector que comprende un gen que
codifica un inhibidor de la apoptosis, (b) provisión de una célula
huésped que comprende ADN que codifica un inhibidor de la
apoptosis, (c) transformación o transfección de la célula o células
huésped con el vector referido en la etapa (a), (d) provisión de
los medios de cultivo celular, (e) cultivo de la célula o células
huésped transformadas o transfectadas en el medio de cultivo bajo
las condiciones suficientes para la expresión de la proteína de
interés y el inhibidor de la apoptosis, y (f) congelación y
posterior descongelación de las células huésped y/o los medios de
cultivo celular. Opcionalmente, el gen que codifica el inhibidor de
la apoptosis se puede integrar de manera estable en el genoma de la
célula huésped. Opcionalmente, el procedimiento incluye además la
etapa de mezclar un inhibidor de la apoptosis adicional en los
medios de cultivo. Opcionalmente, el procedimiento proporciona la
expresión transitoria de la proteína de interés y la expresión
estable o transitoria del inhibidor de la apoptosis.
En otra realización, el procedimiento incluye
las etapas de (a) provisión de un vector que comprende un gen que
codifica una proteína de interés, (b) provisión de una célula
huésped, (c) transformación o transfección de la célula huésped con
el vector referido en la etapa (a), (d) provisión de los medios de
cultivo celular, (e) provisión de un inhibidor de la apoptosis, (f)
mezcla del inhibidor de la apoptosis en el medio de cultivo, (g)
cultivo de la célula o células huésped en el medio de cultivo bajo
las condiciones suficientes para la expresión de la proteína de
interés, y (h) congelación y posterior descongelación de las células
huésped y/o los medios de cultivo celular tal como se define en las
reivindicaciones. Opcionalmente, el procedimiento proporciona la
expresión transitoria de la proteína de interés.
También se describe en la presente invención
procedimientos de transfección mejorados en los que se pueden
utilizar el uso de uno o más inhibidores de la apoptosis y mayores
concentraciones de reactivo para la transfección para incrementar
la eficacia de la transcripción.
También se describe en la presente invención una
proteína de interés producida según cualquiera de los métodos
descritos aquí. La proteína de interés puede comprender una proteína
de mamífero o una proteína de no mamífero y, opcionalmente, puede
comprender un receptor o un ligando. La proteína de interés puede
comprender una proteína que por sí misma es capaz de inducir la
apoptosis de las células de mamífero o no mamífero in vitro
o in vivo, tales como el ligando Apo-2/TRAIL,
el ligando Fas, o TNF-alfa.
La Figura 1A muestra una gráfica que ilustra la
viabilidad celular de las células CHO crecidas en un biorreactor de
2 litros. Los datos muestran que las células crecidas en
biorreactores pueden comenzar a perder viabilidad a partir tan solo
del día 3, y esta pérdida de viabilidad va seguida, a menudo, de una
caída dramática de la viabilidad en el(los)
día(s)
posterior(es).
posterior(es).
La Figura 1B muestra una gráfica que ilustra los
resultados de tres ensayos de apoptosis realizados sobre células
CHO (citadas en la Figura 1A y en el Ejemplo 1): activación de
caspasa-3, fragmentación de ADN y cambios en la
unión anexina/PI (cambios en la membrana plasmática ("PM")). La
activación de las caspasas se detectó, por primera vez, en el día
3, el día en que se detectó la caída de viabilidad (Figura 1A).
La Figura 2 muestra un análisis de Western blot
de lisatos procedentes de clones transfectados de
caspasa-9-DN. Como control se
utilizó un clon transfectado con un vector mpsv (independiente). El
blot fue enfrentado a antisuero
anti-caspasa-9 de conejo
(Pharmingen) y se fue revelado utilizando quimioluminiscencia.
La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo
en el que los clones 2 y 14 de la
caspasa-9-DN, así como los
controles (células E25 transfectadas y células transfectadas del
vector mpsv), fueron incubados con un inductor de la apoptosis, la
estaurosporina (1 micromolar). A continuación, se tomaron muestras
de las células y se analizó el % de células viables.
La Figura 4 muestra un análisis de la actividad
de la caspasa-3 para muestras celulares recogidas 24
horas después de la inducción con estaurosporina en concentración 1
micromolar.
Las Figuras 5-8 muestran los
resultados de ensayos realizados con los clones 2 y 14 que expresan
caspasa-9-DN, así como con los
controles, amplificados y sembrados a 1 millón de células/ml en un
biorreactor de 2 litros. Las muestras fueron recogidas diariamente
y se analizó su viabilidad (Fig. 5), el recuento de células viables
(Fig. 6), la actividad de la caspasa-3 (Fig. 7) y la
concentración de la proteína de interés (anticuerpo E25) secretada
al medio (Fig. 8).
Las Figuras 9-10 muestran los
resultados de los ensayos realizados con células CHO sembradas en
placas de 60 mm y expuestas al inhibidor de la caspasa,
z-VAD-fmk (añadido al cultivo
celular en una concentración 100 micromolar, 48 horas después de la
siembra). El inhibidor z-VAD-fmk fue
añadido posteriormente al cultivo cada 24 horas. Las muestras
fueron recogidas diariamente y se analizó la actividad de la
caspasa-3 (Fig. 9) y el % de células viables (Fig.
10).
Las Figuras 11-12 son ejemplos
comparativos que muestran los resultados de los ensayos de
crecimiento de un clon que expresa Baculovirus p35 en un
biorreactor de 2 litros y el análisis diario de la viabilidad
celular (Fig. 11) y de la actividad de la caspasa-3
(Fig. 12). El control es un clon transfectado con un vector,
cpc.
La Figura 13 muestra un diagrama de barras en el
que se representan los efectos de varias concentraciones del
reactivo de transfección, DMRIE-C, en la viabilidad
celular.
La Figura 14 muestra una comparación de las
eficiencias de transfección total y viable obtenidas para el clon
14 de caspasa-9-DN y para los
controles, células CHO DP12 y células CHO-DP12 que
expresan anticuerpo E25.
La Figura 15 muestra una comparación de la
productividad específica (medida en títulos de ADNsc/LDH total)
obtenida para el clon 14 de
caspasa-9-DN y para los controles,
células CHO-DP12 y células CHO-DP12
que expresan anticuerpo E25.
La Figura 16 muestra una comparación de títulos
de ADNasa obtenidos para el clon 14 de
caspasa-9-DN y para los controles,
células CHO-DP12 y células CHO-DP12
que expresan anticuerpo E25.
Las Figuras 17 y 18 muestran la viabilidad y los
títulos de caspasa-9-DN y del
control E25 crecidos en biorreactores de 2 litros con variación de
temperatura, medio concentrado y un nutriente.
Las Figuras 19 y 20 muestran la viabilidad y el
recuento de células viables de cultivos del control E25 y del clon
14 de caspasa-9-DN sembrados en
centrífugas a partir de viales congelados. Los datos fueron
obtenidos por exclusión con azul de tripán.
Las Figuras 21 y 22 muestran la viabilidad y los
títulos de E25 de cultivos de células de control E25 y del clon 14
de caspasa-9-DN durante la inducción
de la expresión por butirato.
El término "inhibidor de la apoptosis" se
utiliza aquí para referirse a una molécula o sustancia cuya
expresión o presencia en un cultivo celular in vitro
proporciona una reducción o inhibición de la apoptosis en las
células cultivadas, o proporciona resistencia de las células
cultivadas a los estímulos apoptóticos. El inhibidor de la
apoptosis puede comprender una proteína o molécula de tipo proteína,
o una molécula orgánica o inorgánica. El inhibidor de la apoptosis
puede presentarse (y/o funcionar) intracelularmente,
extracelularmente, o en la superficie celular (membrana) de las
células cultivadas. Entre los inhibidores de apoptosis particulares
contemplados por la presente invención se incluyen, pero sin
limitación, el mutante dominante negativo de la
caspasa-9
(caspasa-9-DN),
bcl-2, baculovirus p35, caspasa-9S
(Seol, D.W. et al., J. Biol. Chem., 274,
2072-2076 (1999)), crmA,
z-VAD-fmk,
z-DEVD-fmk,
B-D-fmk y
z-YVAD-fmk, y variantes de los
mismos. Preferiblemente, el inhibidor de la apoptosis es un
inhibidor que actúa sobre una o más caspasas localizadas
"downstream" en la ruta de muerte celular intracelular de la
célula, como la caspasa-3. Opcionalmente, el
inhibidor de la apoptosis disminuirá o reducirá, en una cantidad
efectiva, la apoptosis en un cultivo celular en al menos un 50%,
ventajosamente en al menos un 75%, más ventajosamente en al menos
un 85%, e incluso más ventajosamente en al menos un 95%, en
comparación con un cultivo de células de control que no contenga
dicho inhibidor de la apoptosis. La apoptosis o actividad
apoptótica en dichos cultivos celulares puede medirse y determinarse
utilizando ensayos como los aquí descritos. Opcionalmente, el
inhibidor de la apoptosis mejorará o aumentará, en una cantidad
efectiva, el rendimiento de la proteína recombinante de interés en
al menos 1 vez, y ventajosamente en al menos 2 veces, en
comparación con un cultivo de células de control que no contenga
dicho inhibidor de la apoptosis. Opcionalmente, el inhibidor de la
apoptosis mejorará o aumentará, en una cantidad efectiva, la
eficiencia de transfección en las transfecciones transitorias,
ventajosamente en al menos 1 vez, y más ventajosamente en al menos 2
veces, en comparación con un cultivo de células de control que no
contenga dicho inhibidor de la apoptosis.
El término "proteína de interés" se refiere
a cualquier proteína que pueda ser de utilidad con fines de
investigación, diagnósticos o terapéuticos. La proteína de interés
puede comprender una proteína de mamífero o una proteína de no
mamífero y puede, opcionalmente, comprender un receptor o un
ligando. Las proteínas ejemplares de interés incluyen, pero no
están limitadas a, moléculas como renina; una hormona de
crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la
hormona de crecimiento bovina, factor de liberación de la hormona de
crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimuladora del
tiroides; lipoproteínas;
alfa-1-antitripsina; cadena A de la
insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona estimuladora
del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores
de coagulación como el factor VIIIC, el factor IX, el factor
tisular, y el factor von Willebrands; factores anticoagulantes como
la Proteína C; factor natriurético atrial; un surfactante pulmonar;
un activador plasminógeno, como uroquinasa u orina humana o un
activador plasminógeno de tipo tisular (t-PA);
bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; miembros de
la familia de TNF y de receptores de TNF (TNFR), como el
factor-alfa y -beta de la necrosis tumoral, el
ligando CD40, el ligando Apo-2/TRAIL, DR4, DR5,
DcR1, DcR2, DcR3, OPG, el ligando Fas; encefalinasa; RANTES
(regulador de la activación de las células T normalmente expresadas
y secretadas); proteína inflamatoria de macrófagos humanos
(MIP-1-alfa); una albúmina sérica
como la albúmina sérica humana; una sustancia inhibidora Mülleriana;
cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; un péptido
asociado a la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, como
la beta-lactamasa; ADNasa; IgE; un antígeno
asociado al linfocito T citotóxico (CTLA), como
CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF); receptores de hormonas o factores de
crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor
neurotrófico como el factor neurotrófico derivado del cerebro
(BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ó -6
(NT-3, NT-4, NT-5, o
NT-6), o un factor de crecimiento nervioso como el
NGF-b; factor de crecimiento derivado de las
plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblasto como el aFGF
y el bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de
crecimiento transformante (TGF) como el TGF-alfa y
el TGF-beta, incluyendo
TGF-\beta1, TGF-\beta2,
TGF-\beta3, TGF-\beta4, o
TGF-\beta5; factor de crecimiento tipo
insulina-I y -II (IGF-I y
IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I del cerebro), proteínas de unión de los
factores de crecimiento de tipo insulina; proteínas CD como CD3,
CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductivos;
inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón
como el interferón-alfa, -beta, y -gamma; factores
de estimulación de colonias (CSFs), por ejemplo,
M-CSF, GM-CSF, y
G-CSF; trombopoyetina (TPO); interleucinas (ILs),
por ejemplo, IL-1 a IL-10; dismutasa
superóxido; receptores de células T; proteínas de membranas
superficiales; factor acelerador de la degradación; antígeno viral
como, por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA, gp120;
proteínas de transporte; receptores de superficie; diriginas;
proteínas regulatorias; integrinas como CD11a, CD11b, CD11c, CD18,
una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor
como el receptor HER2, HER3 o HER4; y variantes y/o fragmentos de
cualquiera de los polipéptidos anteriormente enumerados; así como
anticuerpos frente a varios antígenos de proteínas como las
proteínas CD como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34; miembros de la
familia de receptores ErbB como el receptor EGF, el receptor HER2,
HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular como
LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4,
ICAM-1, VCAM y la integrina \alphav/\beta3
incluyendo las subunidades \alpha o \beta (por ejemplo,
anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o
anti-CD11b); factores de crecimiento como VEGF;
IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de
obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4;
proteína C; un receptor Apo-2L como
Apo-2 (DR5), DR4, DcR1, DcR2, DcR3; y variantes y/o
fragmentos de los anticuerpos anteriormente identificados, etc. En
una realización de la invención, una proteína de interés
comprenderá una proteína que es capaz, por sí misma, de inducir la
apoptosis en células de mamífero o no mamífero in vitro o
in vivo, como el ligando Apo-2/TRAIL, el
ligando Fas, o TNF-alfa.
"Aislada" cuando se utiliza para describir
las diferentes proteínas de interés aquí reveladas, significa que
la proteína ha sido identificada y separada y/o recuperada de un
componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de
su entorno natural son materiales que interferirían normalmente con
los usos de investigación, diagnósticos o terapéuticos de la
proteína de interés, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros
solutos proteináceos o no proteináceos. En las realizaciones
ventajosas, la proteína será purificada (1) hasta un grado
suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia
N-terminal o interna de aminoácidos mediante la
utilización de un secuenciador tipo Edman, o (2) hasta conseguir la
homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones
no-reductoras o reductoras utilizando azul de
Coomassie o, ventajosamente, un colorante de plata. La proteína
aislada incluye la proteína in situ dentro de las células
recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural de
la proteína de interés no estará presente. Sin embargo, la proteína
aislada se preparará, normalmente, mediante al menos una etapa de
purificación.
El término "secuencias de control" se
refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida de forma operativa en un organismo
huésped específico. Las secuencias de control que son adecuadas
para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente
una secuencia de operador, y un lugar de unión de un ribosoma. Las
células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales
de poliadenilación e intensificadores.
Un ácido nucleico está "unido de forma
operativa" cuando está situado en una relación funcional con
otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una
presecuencia o secuencia líder secretora está unido de forma
operativa al ADN de un polipéptido si está expresado como una
preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un
promotor o intensificador está unido de forma operativa a una
secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia;
o un lugar de unión de un ribosoma está unido de forma operativa a
una secuencia codificante si está ubicado de forma que facilite la
traducción. En general, "unido de forma operativa" significa
que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas, y, en
el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de
lectura. No obstante, los intensificadores no tienen que estar
contiguos. La unión se consigue mediante ligación en sitios de
restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los
adaptadores o ligadores sintéticos de oligonucleótidos se utilizan
de acuerdo con la práctica convencional.
Como se utilizan aquí, las expresiones
"célula", "línea celular" y "cultivo celular" se
utilizan de forma intercambiable y todas estas designaciones
incluyen la progenie. Así, los términos "transformantes" y
"transfectantes" incluyen las células y cultivos del sujeto
primario derivado del mismo sin tener en cuenta en número de
transferencias.
"Fase de crecimiento" del cultivo celular
se refiere al periodo exponencial de crecimiento celular (la fase
logarítmica) en la que, en general, las células se dividen
rápidamente. Durante esta fase, las células se cultivan durante un
periodo de tiempo, normalmente entre 1 y 4 días, y es bajo dichas
condiciones cuando el crecimiento celular se maximiza. La
determinación del ciclo de crecimiento de la célula huésped puede
determinarse para la célula huésped específica prevista sin
experimentación indebida. "Periodo de tiempo y es bajo dichas
condiciones cuando el crecimiento celular se maximiza" y
similares se refieren a aquellas condiciones de cultivo que, para
una línea celular específica, se ha determinado que son óptimas para
el crecimiento y la división celulares. Durante la fase de
crecimiento, las células se cultivan en un medio nutriente que
contiene los aditivos necesarios generalmente a aproximadamente
30-40ºC, ventajosamente a aproximadamente 37ºC, en
una atmósfera humidificada y controlada, de forma que se consigue
un crecimiento óptimo para la línea celular específica. Las células
se mantienen en la fase de crecimiento durante un periodo de,
aproximadamente, entre uno y cuatro días, normalmente entre dos y
tres días.
"Fase de transición" del cultivo celular se
refiere al periodo de tiempo durante el cual se ajustan las
condiciones de cultivo para la fase de producción. Durante la fase
de transición, los factores medioambientales como el pH, la
concentración de iones y la temperatura pueden variar para pasar de
las condiciones de crecimiento a las condiciones de producción.
"Fase de producción" del cultivo celular se
refiere al periodo de tiempo durante el cual el crecimiento celular
ha alcanzado un máximo. Durante la fase de producción, el
crecimiento celular logarítmico ha finalizado y la producción de
proteína es primaria. Durante este periodo de tiempo, el medio suele
suplementarse para ayudar a la producción continuada de proteína y
para conseguir el deseado producto de proteína.
El término "expresión" o "expresa" se
utiliza aquí para referirse a la transcripción o traducción que se
produce dentro de una célula huésped. El nivel de expresión de un
gen de producto en una célula huésped puede determinarse en base a
la cantidad del correspondiente ARNm que está presente en una célula
o a la cantidad de proteína codificada por el gen de producto que
es producida por la célula. Por ejemplo, el ARNm transcrito de un
gen de producto se cuantifica, de forma deseable, mediante
hibridización Northern. Ver, por ejemplo, Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La proteína codificada
por un gen de producto puede cuantificarse mediante un ensayo para
la determinación de la actividad biológica de la proteína o
mediante el empleo de ensayos que son independientes de dicha
actividad, como el Western blotting o el radioinmunoensayo
utilizando anticuerpos que son capaces de reaccionar con la
proteína. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Los términos "apoptosis" y "actividad
apoptótica" se utilizan en un sentido amplio y se refieren a la
forma ordenada o controlada de muerte celular en células de mamífero
o no-mamífero que suele ir acompañada por uno o más
cambios celulares característicos, incluyendo condensación del
citoplasma, pérdida de microvellos de la membrana plasmática,
activación de caspasa(s), segmentación del núcleo,
degradación del ADN cromosómico o pérdida de función mitocondrial.
Esta actividad puede determinarse y medirse, por ejemplo, mediante
ensayos de viabilidad celular, análisis FACS, unión de anexina V, o
electroforesis de ADN como es conocido en la técnica y descrito
aquí más adelante.
Las células crecidas en cultivo celular pueden
comenzar a perder viabilidad en los días siguientes al inicio del
cultivo. La pérdida de viabilidad celular puede ser particularmente
problemática cuando las células se cultivan en cultivos o
biorreactores relativamente grandes a escala discontinua. Por
ejemplo, las células CHO crecidas en un cultivo discontinuo pueden
comenzar a perder viabilidad celular tan pronto como el Día 4, tras
el cual puede producirse una rápida disminución de la viabilidad
hasta que el cultivo finalice. El mecanismo por el cual mueren
dichas células cultivadas puede ser la necrosis o la apoptosis.
Utilizando ensayos TUNEL y de unión Anexina/PI, los Solicitantes
descubrieron que aproximadamente el 80% de algunas células CHO
crecidas en cultivo discontinuo pueden morir por apoptosis en lugar
de mediante necrosis. Como aquí se describe, los Solicitantes han
encontrado, sorprendentemente, procedimientos que permiten una
marcada reducción de dicha apoptosis.
Los procedimientos revelados en la presente
aplicación presentan una gran variedad de aplicaciones y mejoras
para la producción de proteínas recombinantes. Primero, al prolongar
la viabilidad de la célula huésped en el cultivo (y durante la
fermentación), un experto en la técnica puede incrementar la
producción y el rendimiento de la proteína de interés. Esto puede
mejorar la eficacia del cultivo celular y producir un marcado
ahorro de costes. Además, los Solicitantes han encontrado que el uso
de uno o más inhibidores de la apoptosis en los procedimientos de
la invención puede servir de protección frente a los potenciales
efectos adversos de agentes como el butirato o la TSA incluidos en
el cultivo celular. Además, los procedimientos aquí descritos
pueden mejorar la calidad de la proteína de interés expresada y
recuperada. La calidad de la proteína de interés expresada y
recuperada puede evaluarse utilizando técnicas conocidas en la
técnica, como SDS-PAGE, etc. La ocurrencia de
muerte celular en cultivos de células recombinantes resulta a menudo
en la liberación de varias proteínas activas procedentes de las
células agonizantes, como proteasas [Lao, M., et al.,
Cytotechnology, 22:º43-52 (1996);
Teige, M., et al., J. Biotechnol.,
34:101-105 (1994)], glicosidasas como la
sialidasa o la \beta-galactosidasa [Gramer M.J. y
Goochee C.F., Biotechnol. Prog.,
9:366-373 (1999)], o la isomerasa de prolina
[Schmid, Current Biology, 5:933-944
(1995)]. Éstas y otras proteínas similares suelen ser capaces de
degradar la calidad del producto o la función de la(s)
proteína(s) recombinante(s) deseada(s) que se
está(n) expresando, por ejemplo, mediante una escisión no deseada,
una modificación de los carbohidratos (modificación de
glicoproteína) [Wittwer A. y Howard, S.C., Biochem.,
29:4175-4180 (1990); Hart, Curr. Op. Cell
Biol., 4:1017-1023 (1992); Goochee et
al., Bio/Technology, 9:25
1347-1355 (1991)], o una modificación de la
estructura de la proteína (como plegamiento o agregación). Al
disminuir o inhibir la apoptosis en el cultivo celular, los
procedimientos presentes pueden disminuir el número o la presencia
de dichas proteasas adversas en el medio de cultivo y proteger la
proteína de interés expresada frente a la degradación
proteolítica.
Los procedimientos aquí descritos pueden
emplearse, además, para incrementar la eficiencia de transfección y
la viabilidad de las células durante la transfección. Los reactivos
usados en varias técnicas de transfección, como la Lipofectamina o
DMRIE-C (Gibco), pueden ser relativamente tóxicos
para las células cuando se utilizan en concentraciones más
elevadas. La utilización de concentraciones más elevadas de
reactivos de transfección, sin embargo, sería de especial utilidad
para conseguir mayores eficiencias de transfección. La expresión del
inhibidor de la apoptosis y/o la adición del inhibidor de la
apoptosis directamente al medio de cultivo celular se pueden
utilizar para reducir o inhibir la muerte celular incluso cuando se
seleccionan dichas concentraciones más elevadas del reactivo de
transfección. La utilización de un inhibidor de la apoptosis de esta
manera puede producir una mayor eficacia de transfección y en un
mayor rendimiento de la proteína recombinante de interés.
Los procedimientos revelados pueden utilizarse,
además, para expresar proteínas de interés que sean proteínas que,
por sí mismas, induzcan la apoptosis. Dichas proteínas, como el
ligando Apo-2/TRAIL o el ligando Fas, pueden
desencadenar la apoptosis cuando se expresan en las células. La
presencia de inhibidor(es) de la apoptosis, de acuerdo con
los presentes procedimientos, puede bloquear dicha actividad
apoptótica y permitir una expresión mejorada de la proteína de
interés.
Además, los procedimientos se pueden utilizar
para incrementar la viabilidad de las células sometidas a procesos
de congelación/almacenamiento/descongelación. En general, durante
estos procesos las células pueden perder viabilidad. La presencia
de inhibidor(es) de la apoptosis expresados en las células (o
añadidos al medio de cultivo celular) puede aumentar la viabilidad
celular y ayudar a reducir o eliminar la variabilidad en las
viabilidades celulares entre las diferentes alícuotas o viales de
células.
Los procedimientos conformes a la presente
invención se describen en detalle más adelante.
El ADN codificador de la proteína de interés
puede obtenerse de una gran variedad de fuentes como, por ejemplo,
de cualquier librería de ADNc preparada a partir de un tejido que
supuestamente posea su ARNm y que lo exprese a un nivel detectable.
El gen codificador de la proteína de interés también puede obtenerse
de una librería genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.
Un cribado como una librería de ADNc o genómica con una sonda
seleccionada puede llevarse a cabo utilizando los procedimientos
estándares, como los descritos en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un método alternativo para
aislar el gen codificador de la proteína de interés es utilizar la
metodología PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach
et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1995)].
Varias proteínas de interés han sido
expresamente citadas anteriormente y sus respectivas secuencias
génicas son, en general, conocidas y están públicamente
disponibles.
Los genes codificadores de varios inhibidores de
la apoptosis también han sido descritos en la literatura [ver, por
ejemplo, Clem R.J. et al., Science, 254,
1388-1390 (1991); Duan, H. et al., J.
Biol. Chemistry, 271, 16720-16724
(1996); Pan, G. et al., J. Biol. Chemistry,
273, 5841-5845 (1998); Vaux, D.L. et
al., Science, 258, 1955-1957
(1998); Tsujimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
83:5214-5218 (1986)]. Los procedimientos de
la presente invención contemplan la utilización de un único gen
codificador del inhibidor de la apoptosis, así como la utilización
de una combinación de dos o más genes codificadores de inhibidores
de la apoptosis. Potencialmente, la expresión de dos o más tipos de
inhibidores de la apoptosis en una célula huésped puede ser
beneficiosa para el control de la apoptosis en el cultivo celular.
Un experto en la técnica puede monitorizar la cantidad de inhibidor
de la apoptosis que está siendo expresada por las células huéspedes
mediante, por ejemplo, un análisis Western blot en el que se
utilice un anticuerpo que reconozca al inhibidor de la apoptosis.
La cantidad de inhibidor de la apoptosis, así como el momento de su
expresión, pueden regularse o monitorizarse, por ejemplo, mediante
la elección de un vector con un promotor inducible.
Cuando se selecciona un inhibidor de la
apoptosis para utilizarlo en los procedimientos de las
reivindicaciones, los expertos en la técnica apreciarán que varias
moléculas inhibidoras de la apoptosis puedan actuar sobre
diferentes componentes intracelulares de la ruta de señalización que
lleva a la muerte celular. Las rutas involucradas en la muerte
celular comprenden una familia de proteasas de cisteína, denominadas
caspasas, que están relacionadas con la enzima conversora de
interleucina-1beta de mamífero
(caspasa-1) y con Ced-3, el
producto de un gen de C. elegans. Se cree que dichas
moléculas de caspasa pueden actuar, al menos, en dos niveles
diferentes. Las caspasas iniciadoras suelen ser moléculas
"upstream" que se activan como respuesta a ciertos estímulos
indicativos de que la célula ha sido comprimida, dañada o ha
recibido algún tipo de señal para que inicie la muerte celular por
apoptosis. Un ejemplo de dichas caspasas "upstream" es la
caspasa-8. Las caspasas iniciadoras pueden,
sucesivamente, liberar y activar otra familia de caspasas
"downstream", como la caspasa-3. Dependiendo
de la naturaleza del estímulo apoptótico y del tipo de célula, sólo
una parte de la ruta de señalización estará involucrada en el
mecanismo de señalización y en la ejecución de la muerte celular.
Se cree, por ejemplo, que ciertos inhibidores de la apoptosis, como
CrmA, actúan sobre caspasas localizadas "upstream", como la
caspasa-8, y suelen ser activados directamente por
un receptor de muerte unido a un ligando. Otros inhibidores de la
apoptosis actúan sobre otras caspasas localizadas "downstream"
en la ruta de señalización intracelular. Así, en la actualidad se
cree que los inhibidores de aquella(s) molécula(s) que
están involucradas de forma efectiva (así como las involucradas de
forma activa en la transmisión de la señal) en el aparato de muerte
celular en una célula seleccionada serán efectivos como inhibidores
de la apoptosis, como los aquí descritos. Los Solicitantes
observan, sin embargo, que los expertos en la técnica comprenderán
que existe un punto en dichas rutas de señalización en la que la
célula está "entregada" a la muerte celular y que, cuando la
ruta de señalización ha transmitido una(s) señal(es)
al punto en donde la célula se entrega a la muerte celular, las
moléculas inhibidoras de la apoptosis, como las aquí descritas,
pueden no resultar efectivas en la inhibición o prevención de la
apoptosis de la célula "entregada".
El modificador de la respuesta de las
citoquinas, CrmA, es una serpina de 38 kDa identificada en el virus
de la viruela que ha sido descrita como un inhibidor de la apoptosis
en diversos sistemas [Gagliardini et al., Science,
263:826-828 (1994); Tewari et al.,
J. Biol. Chem., 270:3255-3260 (1995)].
La CrmA ha sido evaluada como un inhibidor de la
caspasa-1 y de la caspasa-8
[Nicholson et al., Nature,
376:37-43 (1995); Zhou et al., J.
Biol. Chem., 272:7797-7800 (1997)]. En
algunos estudios llevados a cabo por los Solicitantes, se ha
observado que la sobreexpresión de CrmA en células CHO dhfr+ no es
capaz de retrasar de forma sustancial la muerte celular en el
entorno de un biorreactor. Este resultado sugiere que, en este
sistema específico de células CHO seleccionado por los
Solicitantes, ni la caspasa-1 ni la
caspasa-8 han estado involucradas activamente en la
ruta de muerte celular de dichas células cultivadas específicas. Por
consiguiente, para conseguir los efectos deseados aquí descritos,
resulta ventajoso seleccionar una molécula inhibidora de la
apoptosis que actúe "downstream" en la ruta de señalización de
muerte celular de la célula huésped seleccionada, pero que lo haga
antes de llegar al punto en el que la célula está entregada a la
muerte celular.
Los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico) codificadores de la proteína de interés y del inhibidor
de la apoptosis pueden insertarse en un(os) vector(es)
replicable(s) para su expresión. Existen varios vectores
disponibles públicamente. Los componentes del vector generalmente
incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes:
una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes
marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia
de terminación de la transcripción, cada uno de los cuales se
describe más adelante. Las secuencias de señal, orígenes de
replicación, genes marcadores, elementos intensificadores y
secuencias de terminación de la transcripción opcionales que se
pueden emplear son conocidos en la técnica y se describen con mayor
detalle en WO97/25428.
Las técnicas de inserción de dichos genes en los
vectores son bien conocidas para el experto en la técnica y dichas
técnicas pueden realizarse sin experimentación indebida. Para la
construcción de vectores adecuados se pueden emplear técnicas de
ligación estándares. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se
liberan, adaptan y vuelven a unirse en la forma deseada para generar
los plásmidos necesarios. Para ello se pueden emplear técnicas
conocidas en la técnica. [Ver, por ejemplo, Messing et al.,
Nucleic Acids Res., 9:309 (1981); Maxam et
al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980)].
El gen codificador del inhibidor de la apoptosis
y el gen codificador de la proteína de interés pueden insertarse en
un vector único (co-transfectados), o insertarse en
dos vectores separados o diferentes. Los genes correspondientes se
insertarán, ventajosamente, en dos vectores separados. Cada uno de
estos vectores contendrá, normalmente, un gen de selección, también
denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección
estándares codifican proteínas que (a) confieren resistencia a
antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina,
neomicina, puromicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan
las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes
críticos no disponibles en los medios complejos como, por
ejemplo, el gen codificador de D-alanina
racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la
identificación de células que compiten para incorporar el ácido
nucleico codificador, como DHFR o timidina quinasa. Una célula
huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo natural es la línea
celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada
según se describe en Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para
su utilización en levaduras es el gen trp1 presente en el
plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature,
282:39 (1979); Kingsman et al., Gene,
7:141 (1979); Tschemper et al., Gene,
10:157 (1980)]. El gen trp1 provee un marcador de
selección para una cepa mutante de levadura que no presenta la
capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC nº 44076 o
PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12
(1977)].
En los procedimientos que emplean un primer
vector que comprende un gen inhibidor de la apoptosis y un segundo
vector que comprende un gen codificador de la proteína de interés,
es ventajoso que el primer y el segundo vector lleven diferentes
marcadores de selección. Así, por ejemplo, un vector que comprenda
el gen inhibidor de la apoptosis puede llevar un gen de selección
que confiera resistencia a la ampicilina, mientras que el vector
que comprende el gen codificador de la proteína de interés puede
llevar un gen de selección que confiera resistencia al
metotrexato.
Los vectores de expresión también suelen
contener un promotor, que es reconocido por el organismo huésped y
que va unido de forma operativa a la(s) secuencia(s)
de ácidos nucleicos insertada(s) descrita(s)
anteriormente. Los promotores son secuencias no traducidas
localizadas "upstream"(5') en el codón inicial de un gen
estructural (normalmente entre aprox. 100 a 1000 pares de bases) y
que controlan la transcripción y la traducción de una secuencia
específica de ácidos nucleicos, a los que están unidos de forma
operativa. Dichos promotores se incluyen normalmente dentro de dos
clases, inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son
promotores que inician niveles superiores de transcripción del ADN
bajo su control como respuesta a algún cambio en las condiciones
del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o
un cambio en la temperatura. En la actualidad, se conocen un gran
número de promotores reconocidos por una gran variedad de células
huésped potenciales. Estos promotores están unidos de forma
operativa al ADN codificador mediante la eliminación del promotor
del ADN fuente por digestión de la enzima de restricción e inserción
de la secuencia aislada del promotor en el vector.
Los promotores adecuados para uso con huéspedes
procariotas y eucariotas son conocidos en la técnica, y se
describen con mayor detalle en la patente WO97/25428.
Se pueden emplear vectores de expresión que
provean la expresión transitoria del ADN codificador de la proteína
de interés. En general, la expresión transitoria conlleva la
utilización de un vector de expresión que sea capaz de replicarse
eficientemente en una célula huésped, de forma que la célula huésped
acumule varias copias del vector de expresión y, posteriormente,
sintetice elevados niveles de la proteína deseada codificada por el
vector de expresión [Sambrook et al., supra]. Los
sistemas de expresión transitoria, comprendiendo un vector de
expresión y una célula huésped adecuados, permiten la conveniente
identificación positiva de las proteínas codificadas por ADNs
clonados, así como el rápido cribado de dichas proteínas en función
de las propiedades biológicas y fisiológicas deseadas.
Las células huésped se transfectan o transforman
con los vectores de expresión anteriormente descritos para la
producción de la proteína de interés y para el cultivo en medios
nutrientes modificados para que resulten apropiados para inducir a
los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los
genes codificadores de las secuencias deseadas.
La transfección se refiere a la incorporación de
un vector de expresión por parte de una célula huésped tanto si se
han expresado secuencias codificantes como si no lo han hecho.
Existen numerosos procedimientos de transfección conocidos por el
experto en la técnica, por ejemplo, CaPO4 y electroporación. Una
transfección satisfactoria suele reconocerse cuando se produce
cualquier indicación de la operación de este vector dentro de la
célula huésped. Como se ha descrito anteriormente, la utilización de
un gen inhibidor de la apoptosis (o la adición de una molécula
inhibidora de la apoptosis directamente al medio de cultivo) puede
mejorar la eficiencia de la transfección. Se cree que la
utilización de dicho(s) inhibidor(es) de la apoptosis
permitirá la utilización de mayores cantidades de reactivos de
transfección, como Lipofectamina o DMRIE-C (como se
describe en los Ejemplos más adelante).
Los medios de transformación introducen ADN en
un organismo de forma tal que el ADN sea replicable, ya sea como un
elemento extracromosómico o mediante un integrante cromosómico.
Dependiendo del tipo de célula huésped utilizado, la transformación
se realizará utilizando técnicas estándares adecuadas a dichas
células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro cálcico,
según se describe en Sambrook et al., supra, o la
electroporación suelen utilizarse en células procariotas u otro
tipo de células que contienen sustanciales barreras
célula-pared celular. La infección con
Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación
de ciertas células de plantas, según se describe en Shaw et
al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada
el 29 de junio de 1989. Además, las plantas pueden transfectarse
utilizando un tratamiento con ultrasonido, según se describe en WO
91/00358 publicada el 10 de enero de 1991. Para las células de
mamífero sin dichas paredes celulares, se puede utilizar el
procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van
der Eb, Virology, 52:456-957 (1978).
Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas huésped
de células de mamífero han sido descritos en la Patente USA nº
4.399.216. Las transformaciones en levaduras suelen llevarse a cabo
conforme al procedimiento de Van Solingen et al., J.
Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). No obstante,
también se pueden emplear otros procedimientos para introducir ADN
en las células, como son la microinyección nuclear, la
electroporación, la fusión de protoplasma bacteriano con células
intactas, o los policationes como, por ejemplo, el polibreno o la
poliornitina. Para conocer diferentes técnicas de transformación de
células de mamífero, ver Keown et al., Methods in
Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour
et al., Nature, 336:398-352
(1988).
Las células huésped adecuadas para expresar el
ADN en los vectores de la presente invención incluyen células
procariota, de levadura o eucariotas superiores. Los procariotas
adecuados incluyen, pero sin limitación, eubacterias, tales como
organismos Gram negativo o Gram positivo, por ejemplo,
Enterobacteriaceae, tales como E. coli. Existen varias cepas
de E. coli disponibles públicamente, tales como cepa MM294 de
E. coli K12 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC
31,537); cepa W3110 de E. coli (ATCC 27,235) y K5 772 (ATCC
53,635); Enterobacter; Erwinia, Klebsiella, Proteus,
Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium,
Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y
Shigella, así como Bacilli, tales como B. subtilis y
B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P
descrito en DD 266,710 publicada el 12 de abril de 1989),
Pseudomonas, tales como P. Aeruginosa y
Streptomyces.
Además de procariotas, también son adecuados los
microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levadura. El
Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped
eucariota inferior utilizado habitualmente.
Las células huésped adecuadas pueden derivar de
organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células
invertebradas se incluyen células de insectos, tales como Drosophila
S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Ente los ejemplos
de líneas de células huésped de mamífero útiles se incluyen células
del ovario de hámster chino (CHO) y células COS. Ejemplos más
específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por
SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón
embrionario humano (células 293 o células 293 subclonadas para el
crecimiento en el cultivo en suspensión, Graham et al., J.
Gen. Virol., 36: 59 (1977)); células de ovario de hámster
chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:
4216 (1980)); dp12.CHO (EP 307,247, publicada el 15 de marzo de
1989), células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:
243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138,
ATCC CCL 75); células de riñón humano (Hep G2, HB 8065); y tumor
mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula
\hbox{huésped apropiada se estima que se encuentra dentro de la técnica del sector.}
La selección de un inhibidor de la apoptosis
específico para emplearse en una célula huésped específica y de una
proteína de interés específica puede llevarse a cabo sin
experimentación indebida por parte de un experto en la técnica.
Las células procariotas utilizadas para producir
la proteína de interés pueden cultivarse en medios de cultivo
adecuados, según se describe de forma general en Sambrook et
al., supra. Las formas específicas de los medios de
cultivo que pueden emplearse para cultivar células CHO se describen
en detalle en los Ejemplos más adelante. Las células huésped de
mamífero utilizadas para producir la proteína de interés pueden
cultivarse en una gran variedad de medios de cultivo. Las
condiciones de cultivo adecuadas para las células de mamífero son
bien conocidas en la técnica (J. Immunol. Methods
(1983)56:221-234) o pueden ser fácilmente
determinadas por un experto en la técnica (ver, por ejemplo,
Animal Cell Culture: A Practical Approach 2ª Ed., Rickwood,
D. y Hames, B.D., eds. Oxford University Press, New York (1992)), y
varían en función de la célula huésped específicamente
seleccionada.
Ejemplos de medios de cultivos disponibles
comercialmente incluyen Ham's F10 (Sigma), Medio Mínimo Esencial
("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de
Eagle Modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma). Además, se
puede utilizar cualquiera de los medios descritos en Ham y
Wallace,(1979) Meth. Enz., 58:44; Barnes y Sato,(1980) Anal.
Biochem., 102:255; Patentes USA n^{os} 4.767.704;
4.657.866; 4.927.762; 5.122.469 ó 4.560.655; Publicación
Internacional n^{os} WO 90/03430; y WO 87/00195. Cualquiera de
estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas
y/o factores de crecimiento (como insulina, transferrina, o factor
de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro sódico, calcio,
magnesio, y fosfato), tampones (como HEPES), nucleósidos (como
adenosina y timidina), antibióticos (como el medicamento
Gentamycin^{TM}), oligoelementos (definidos como compuestos
inorgánicos que suelen presentarse en concentraciones finales del
rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente.
También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a la
concentración apropiada que sea conocido por los expertos en la
técnica. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y
similares son las empleadas previamente con la célula huésped
seleccionada para su expresión, y resultarán evidentes para el
experto en la técnica. Los factores de crecimiento necesarios para
una célula específica se determinan empíricamente de forma sencilla
sin requerir experimentación indebida, según se describe, por
ejemplo, en Mammalian Cell Culture (Mather, J.P. ed., Plenum
Press, N.Y. (1984), y Barnes y Sato, (1980) Cell,
22:649.
Otros procedimientos, vectores y células huésped
adecuados para la adaptación de la síntesis de la proteína de
interés en un cultivo de células de vertebrados se describen en
Gething et al., Nature,
293:620-625 (1981); Mantei et al.,
Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060;
y EP 117.058. En general, los principios, protocolos, y técnicas
prácticas que permiten maximizar la productividad de los cultivos de
células de mamífero pueden encontrarse en Mammalian Cell
Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press,
1991).
La cantidad de inhibidor de la apoptosis añadido
directamente, o incorporado, al medio de cultivo dependerá de
varios factores, como pueden ser el tipo de molécula inhibidora de
la apoptosis que se está empleando, el tipo de célula huésped, las
condiciones de cultivo, etc. La determinación de la concentración
deseada de inhibidor de la apoptosis a añadir al medio de cultivo
forma parte del estado de la técnica y puede determinarse
empíricamente sin requerir experimentación indebida. Ventajosamente,
una cantidad efectiva o concentración deseada del inhibidor de la
apoptosis añadido directamente al medio de cultivo es la necesaria
para que el inhibidor de la apoptosis penetre en la célula huésped.
El experto en la técnica apreciará realmente que diferentes
inhibidores de la apoptosis puedan presentar diferentes capacidades
de penetración en la célula huésped y, por ello, se debe elegir una
concentración que permita dicha penetración en la célula huésped.
Normalmente, existirá un rango superior de concentración de
inhibidor de la apoptosis que puede no ser deseable debido a que la
concentración se aproxime a un rango en el que resulte adverso o
tóxico para las células huésped. Como se describe posteriormente en
los Ejemplos, los Solicitantes han encontrado que
z-VAD-fmk puede inhibir la
apoptosis cuando se añade a los cultivos celulares en una
concentración aproximada de 100 micromolar. Existe una gran
variedad de compuestos inhibidores de la apoptosis, como son
z-VAD-fmk,
z-DEVD-fmk,
B-D-fmk, y
z-YVAD-fmk, que se pueden obtener
de empresas como Pharmigen y Enzyme Systems, Livermore, CA.
El inhibidor de la apoptosis se puede añadir
directamente al medio de cultivo. El inhibidor de la apoptosis se
puede añadir en cualquier momento durante el cultivo de las células.
Opcionalmente, el inhibidor de la apoptosis se añade al medio de
cultivo al principio (en el momento de iniciarse, día 0) del proceso
de cultivo celular. Ventajosamente, dicho inhibidor de la apoptosis
se añadiría al medio de cultivo durante el cultivo de las células,
pero antes del momento en que se produce la inducción a la
apoptosis; en general, la inducción a la apoptosis se puede
observar en cultivos celulares a gran escala en el día 3 o día 4 del
cultivo, por lo que el inhibidor de la apoptosis se añadirá
ventajosamente antes del día 3 o del día 4. De manera opcional, la
cantidad de inhibidor de la apoptosis se añade durante, o por la
duración del cultivo celular, por ejemplo, de forma diaria para
toda la fermentación. Como ejemplo, para un cultivo de 5 días, el
inhibidor de la apoptosis se podría añadir en el día 0, y
posteriormente cada 24 horas hasta que el cultivo finalice.
En la presente invención, la célula huésped
seleccionada es una célula CHO, preferiblemente una célula
dp12.CHO. En una realización, el medio de cultivo seleccionado
contiene un componente de medio basal, tal como una formulación
basada en DMEM/HAM F-12 (para conocer la composición
del medio DMEM y HAM F12 y, especialmente, de un medio libre de
suero, ver las formulaciones de los medios de cultivo en American
Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,
Sexta edición, 1988, páginas 346-349) (la
formulación del medio que se describe en la Patente USA nº
5.122.469 es especialmente apropiada) con concentraciones
modificadas para algunos componentes, tales como aminoácidos,
sales, azúcares, y vitaminas, y que opcionalmente contienen glicina,
hipoxantina, y timidina; insulina recombinante humana, peptona
hidrolizada, tal como Primatone HS o Primatone RL (Sheffield,
Inglaterra), o el equivalente; un agente protector de la célula, tal
como Pluronic F68 o el poliol plurónico equivalente; Gentamicina; y
elementos traza. Los medios de cultivo celular seleccionados son,
preferiblemente, libres de suero.
Las proteínas de interés pueden producirse
mediante crecimiento de las células huésped bajo una gran variedad
de condiciones de cultivo celular. Por ejemplo, los procedimientos
de cultivo celular para la producción de proteínas a gran escala o
a pequeña escala son potencialmente útiles dentro del contexto de la
presente invención. Los procedimientos incluyen, pero no se limitan
a, un biorreactor de lecho fluidizado, un biorreactor de fibra
hueca, un cultivo sobre rodillos o un sistema biorreactor de tanque
agitado, en los dos últimos sistemas con o sin microportadores, y
operado de forma alternativa en modo discontinuo, discontinuo
alimentado o continuo.
En una realización ventajosa, el cultivo celular
de la presente invención se lleva a cabo en un sistema de
biorreactor de tipo tanque agitado y se emplea un procedimiento de
cultivo discontinuo alimentado. En el sistema de biorreactor
ventajoso, el tamaño de los biorreactores es suficientemente grande
como para producir la cantidad deseada de proteína de interés, como
los tamaños de 1.000 litros o 12.000 litros, aunque no están
limitados a dichos tamaños, pudiendo utilizar biorreactores de
tamaño muy inferior (por ejemplo, 2 litros, 400 litros) o muy
superior (por ejemplo, 25.000 litros, 50.000 litros). En el
ventajoso cultivo discontinuo alimentado, las células huésped de
mamífero y el medio de cultivo son añadidos inicialmente al
recipiente de cultivo, y el cultivo se alimenta con nutrientes
adicionales, administrados de forma continua o en incrementos
discretos, con o sin recolección periódica de las células y/o
productos antes de la finalización del cultivo. El cultivo
discontinuo alimentado puede incluir, por ejemplo, un cultivo
discontinuo alimentado semicontinuo, en el que se retire
periódicamente todo el cultivo (incluyendo las células y el medio) y
se reemplace por un medio nuevo. El cultivo discontinuo alimentado
se distingue del cultivo discontinuo simple en que todos los
componentes del cultivo celular (incluyendo las células y todos los
nutrientes del cultivo) se añaden al recipiente de cultivo al
inicio del proceso de cultivo. El cultivo discontinuo alimentado
también puede distinguirse del cultivo por perfusión en tanto que
el sobrenadante no es retirado del recipiente de cultivo durante el
proceso, sino al finalizar el proceso de cultivo (en el cultivo por
perfusión, las células son mantenidas en el cultivo mediante, por
ejemplo, filtración, encapsulación, anclaje a microportadores, etc.,
y el medio de cultivo es continua o intermitentemente introducido y
retirado del recipiente de cultivo).
Además, las células cultivadas se pueden
propagar siguiendo cualquier esquema o rutina que pueda resultar
adecuada para la célula huésped específica y para el plan de
producción contemplado específico. Por ello, la presente invención
contempla un procedimiento de cultivo en una única etapa o en
múltiples etapas. En un cultivo en una única etapa, las células
huésped se inoculan en el entorno del cultivo y las etapas del
procedimiento de la presente invención se emplean durante una fase
de producción única del cultivo celular. Alternativamente, se puede
prever un cultivo en múltiples etapas. En el cultivo en múltiples
etapas, las células se pueden cultivar en un determinado número de
etapas o fases. Por ejemplo, las células pueden crecer en una
primera etapa o fase de crecimiento, en el que las células,
posiblemente almacenadas, se inoculan en un medio adecuado para
promover el crecimiento y la elevada viabilidad. Las células se
pueden mantener en la fase de crecimiento durante un periodo
adecuado de tiempo mediante la adición de un medio nuevo al cultivo
de las células huésped.
De acuerdo con el aspecto ventajoso de la
invención, las condiciones de cultivo celular discontinuo
alimentado o continuo han sido ideadas para mejorar el crecimiento
de las células de mamífero en la fase de crecimiento del cultivo
celular. En la fase de crecimiento, las células crecen bajo
determinadas condiciones y durante un periodo de tiempo que está
maximizado para el crecimiento. Las condiciones de cultivo, como son
la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto (dO_{2}) y similares,
son las empleadas para el huésped específico y resultarán aparentes
para el experto en la técnica. En general, el pH se ajusta a un
nivel entre 6,5 y 7,5 aproximadamente utilizando un ácido (por
ejemplo, CO_{2}) o una base (por ejemplo, Na_{2}CO_{3} o
NaOH). Un rango de temperatura adecuado para el cultivo de células
de mamífero como las células CHO se encuentra entre 30 y 38ºC y,
ventajosamente, a aproximadamente 37ºC, y un dO_{2} adecuado se
encuentra entre 5 y 90% de saturación.
En un estado particular, las células se pueden
utilizar para inocular una fase o etapa de producción del cultivo
celular. Alternativamente, como se describe anteriormente, la fase o
etapa de producción puede de forma continuada a la inoculación o
fase o etapa de crecimiento.
De acuerdo con la presente invención, el entorno
del cultivo celular durante la fase de producción del cultivo
celular está controlado. De acuerdo con las etapas de los
procedimientos aquí revelados, la concentración del inhibidor de la
apoptosis en el medio de cultivo se puede manipular de forma que se
alcance y mantenga el contenido y calidad deseados de la proteína
de interés en el líquido de cultivo celular resultante. En un
aspecto ventajoso, la fase de producción del cultivo celular viene
precedida de una fase de transición del cultivo celular en la que
se llevan a cabo la expresión o la adición del (de los)
inhibidor(es) de la apoptosis para la fase de producción del
cultivo celular. Las concentraciones del (de los)
inhibidor(es) de la apoptosis se monitorizan,
ventajosamente, en conexión con otros parámetros del proceso como
son la osmolaridad de la fase de producción, ya que la osmolaridad
puede afectar a la productividad celular específica.
En algunos de los procedimientos anteriormente
descritos se contempla que puede ser deseable incluir una cantidad
deseada de un agente como butirato o TSA al medio de cultivo
celular. Existen varias formas de butirato y sus sales que son
conocidas en la técnica, como son el ácido butírico y el butirato
sódico, y están disponibles públicamente en fuentes como Sigma
Chemical Co. El butirato ha sido descrito en la literatura por
mejorar la productividad y la expresión de proteínas en los cultivos
celulares [Arts et al., Biochem J.,
310:171-176 (1995); Gorman et al.,
Nucleic Acids Res., 11:7631-7648
(1983); Krugh, Mol. Cell. Biochem.,
42:65-82 (1982); Lamotte et al.,
Cytotechnology, 29:55-64 (1999);
Chotigeat et al., Cytotechnology,
15:217-221 (1994)]. La Tricostatina A (TSA)
es un inhibidor de la desacetilasa de histonas y puede actuar de
forma similar al butirato en la mejora de la productividad y de la
expresión de proteínas en los cultivos celulares [Medina et
al., Cancer Research, 57:3697-3707
(1997)]. Aunque el butirato presenta algunos efectos positivos en la
expresión de proteínas, también es apreciado en la técnica que, a
determinadas concentraciones, el butirato puede inducir la
apoptosis en las células cultivadas y, en consecuencia, disminuir la
viabilidad del cultivo y la densidad de células viables [Hague
et al., Int. J. Cancer,
55:498-505 (1993); Calabresse et al.,
Biochim. Biophys. Res. Comm.,
195:31-38 (1993); Fillipovich et al.,
Biochim. Biophys. Res. Comm.,
198:257-265 (1994); Medina et al.,
Cancer Research, 57:3697-3707 (1997)].
En los procedimientos de la presente invención, se puede añadir una
cantidad deseada de butirato o TSA al cultivo celular al comienzo de
la fase de producción y, más ventajosamente, se puede añadir al
cultivo celular después de llevar a cabo un cambio en la
temperatura. El butirato o el TSA se pueden añadir en una cantidad
deseada determinada empíricamente por los expertos en la técnica,
pero, ventajosamente, el butirato se añade al cultivo celular a una
concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mM y, más
ventajosamente, a una concentración de aproximadamente 1 a
aproximadamente 6 mM.
La expresión de la proteína de interés puede
medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante ELISA,
Southern blotting convencional, Northern blotting para cuantificar
la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting
(análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una
sonda adecuadamente marcada. Se pueden emplear varios marcadores,
más comúnmente radioisótopos y, específicamente, ^{3-}P. No
obstante, también se pueden emplear otras técnicas, como el uso de
nucleótidos de biotina modificada para introducción en un
polinucleótido. La biotina sirve, entonces, como lugar de unión
para la avidina o los antibióticos, que pueden marcarse con una
amplia variedad de marcadores, como son los radionucleótidos,
fluorescentes o enzimas. Alternativamente, se pueden emplear
anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo los
dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos
ADN-ARN o dúplex ADN-proteína. Los
anticuerpos pueden marcarse y el ensayo se puede llevar a cabo
cuando el dúplex está unido a una superficie, de forma que, cuando
se forma el dúplex sobre la superficie, se puede detectar la
presencia del anticuerpo unido al dúplex.
La expresión génica se puede medir,
alternativamente, por procedimientos inmunológicos, como la tinción
inmunohistoquímica de células o de cortes de tejidos y el ensayo de
cultivo celular o de líquidos corporales, para cuantificar la
expresión del gen de producto. En las técnicas de tinción
inmunohistoquímica, se prepara una muestra celular, normalmente
mediante deshidratación y fijación, y seguidamente se la hace
reaccionar con anticuerpos marcados específicos del gen de producto
acoplado, en donde los marcadores suelen ser detectables
visualmente, como ocurre en el caso de los marcadores enzimáticos,
los marcadores fluorescentes, los marcadores luminiscentes y
similares.
Los anticuerpos utilizables en la tinción
inmunohistoquímica y/o ensayo de líquidos corporales pueden ser
monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier
mamífero.
La recuperación o purificación de la proteína de
interés suelen ser necesarias para separarla de las proteínas de
células recombinantes o de polipéptidos, con el fin de obtener
preparaciones que sean sustancialmente homogéneas. En una primera
etapa, el medio de cultivo o lisato se puede centrifugar para
retirar restos celulares específicos. La proteína de interés se
purifica posteriormente separándola de las proteínas y polipéptidos
solubles contaminantes, siendo los siguientes procedimientos
ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: mediante
fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación
con etanol; HPLC en fase reversa; cromatografía en sílica o en una
resina de intercambio iónico como DEAE; cromatografía en columnas
de Sefarosa-proteína A, cromatoenfoque;
SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; y
filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex
G-75.
La proteína de interés recuperada o purificada
será normalmente analizada por uno o más de los siguientes
procedimientos: electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida, HPLC, espectrometría de masas de
una digestión tríptica, análisis de glicoproteínas y ensayos de
actividad.
Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente
con fines ilustrativos, y no están destinados a limitar de forma
alguna el alcance de la presente invención.
Los reactivos comercialmente disponibles citados
en los ejemplos fueron utilizados siguiendo las instrucciones del
fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de
aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo
largo de la especificación, es, a menos que se indique lo contrario,
la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.
Ejemplo
1
Células CHO (dhfr+) adaptadas y libres de suero
fueron amplificadas y sembradas a 1 millón de células/ml en
biorreactores de 2 litros (n=2). El medio de cultivo celular era un
medio libre de suero basado en DMEM/Ham F-12 que
contenía insulina recombinante humana y oligoelementos. Las células
fueron crecidas a 37ºC con una agitación fijada a 275 rpm. El pH se
mantuvo a 7,2 y fue ajustado automáticamente durante el experimento.
Los biorreactores fueron rociados con una mezcla de oxígeno y aire.
Éste es un sistema modelo que imita las condiciones existentes
durante la producción a gran escala de proteínas terapéuticas.
Las muestras se recogieron diariamente para
medir los siguientes parámetros: viabilidad celular, actividad de
caspasa (Clontech), fragmentación de ADN y unión anexina/PI
(Chemicon). La Figura 1A muestra la viabilidad celular determinada
(mediante exclusión con azul de Tripán) en el curso de 5 días. La
Figura 1B muestra que el resultado de la apoptosis fue la pérdida
de viabilidad celular en el cultivo durante el periodo de 5
días.
Ejemplo
2
Construcción de expresión: El ADNc de la
caspasa-9 dominante negativa
("caspasa-9-DN") con marcador
FLAG C-terminal (Duan, H. et al., J. Biol.
Chemistry, 271, 16720-16724 (1996); Pan,
G. et al., J. Biol. Chemistry, 273,
5841-5845 (1998)) fue subclonado en un donador de
mpsv como se describe a continuación: 2 ug de vector mpsv
(Genentech, Inc.) fueron digeridos con 5 U de EcoRI y 5 U de BamHI
(Boehringer Mannheim) y 2 ul de tampón A (Boehringer Mannheim) en
un volumen total de 20 ul durante 1 hora a 37ºC. 2 ug de
construcción de caspasa-9-DN/pcDNA3
fueron digeridos con 5 U de HindIII y 5 U de XbaI con 2 ul de tampón
B (Boehringer Mannheim) en un volumen total de 20 ul durante 1 hora
a 37ºC. Tras la incubación, se añadieron 1 ul de dNTPs 1 mM
(Clontech) y 0,2 U de polimerasa Klenow (Boehringer Mannheim) a
cada reacción y se continuó la incubación durante 15 minutos
adicionales a 37ºC.
Se analizaron alícuotas de cada digestión
mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. La banda 1,2 kbp
de ADNc de caspasa-9-DN y la banda
9,7 kbp del vector mpsv linearizado fueron aisladas del gel y el
ADN fue purificado utilizando GeneClean (Bio101, Inc.) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Ligación de la
caspasa-9-DN y del vector mpsv: 50
ng de vector y 42 ng de inserto fueron ligados en 10 ul de tampón
de ligación 2X y 1 ul de ADN ligasa T4 en 20 ul de volumen total a
temperatura ambiente durante 5 minutos (Boehringer Mannheim).
Transformación: Células competentes de DH5alfa
de máxima eficiencia (Gibco BRL) fueron transformadas con 2 ul de
mezcla de ligación siguiendo las instrucciones del fabricante. Las
células transformadas se colocaron en placas LB conteniendo
carbenicilina. Las colonias se seleccionaron aleatoriamente y fueron
analizadas mediante digestión con restricción para identificar una
colonia que contuviera la construcción correcta. La colonia nº 30
fue elegida para el trabajo posterior.
Transfección: Células CHO DP12 productoras de
E25 [según se designa a lo largo de la presente invención,
"E25" se refiere a las células CHO transfectadas que expresan
un anticuerpo monoclonal humanizado frente a IgE humano; ver Presta
et al., J. Immunology,
151:2623-2632 (1993)] fueron elegidas para
realizar la transfección con
mpsv/caspasa-9-DN y con el vector
mpsv. La transfección se realizó utilizando el reactivo
LipofectAMINE Plus (Gibco BRL) y se llevó a cabo de la siguiente
manera:
Células E25 crecidas en suspensión se colocaron
en placas de cultivo tisular de 60 mm (1 millón células/placa) 24
horas antes de realizar la transfección en un medio que contenía
suero. El ADN necesario para la transfección se cuantificó
espectrofotométricamente. Se mezclaron 2 ug de ADN con 250 ul de
medio libre de suero y 8 ul de reactivo Plus, y la mezcla fue
incubada durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se mezclaron 12
ul de reactivo con 250 ul de medio libre de suero y se añadieron
directamente a la mezcla para su posterior incubación durante 15
minutos a temperatura ambiente. El medio superior de las células fue
reemplazado por 5 ml de medio libre de suero nuevo y la mezcla de
transfección fue añadida a la placa. Tres horas después de la
transfección, el medio fue reemplazado por un medio conteniendo
suero. 24 horas después de la transfección, cada placa transfectada
fue dividida en 5 placas, a las que se aplicó una presión de
selección mediante la adición de 5 ug/ml de puromicina. Los clones
transfectados (resistentes a puromicina) comenzaron a aparecer dos
semanas después de la transfección. De ellos, se seleccionaron
diversos clones para el análisis de la expresión de
caspasa-9-DN mediante Western
blotting.
blotting.
Análisis de Western blot: Los clones
seleccionados fueron recogidos y transferidos a una placa de 24
pocillos. Cuando alcanzaron la confluencia, las células de cada
pocillo fueron lavadas con PBS y lisadas durante 3 minutos en 100
ul de tampón de lisis (3% NP 40 en PBS). Los lisados se
centrifugaron durante 3 minutos a 12.000 g. El supernadante fue
recuperado, mezclado con un volumen igual de tampón de carga 2x SDS
reductor (Novex) y calentado a ebullición durante 3 minutos. Las
muestras se almacenaron a -20ºC. Las alícuotas de los lisados
fueron sometidas a un ensayo de proteínas para determinar la
concentración de proteína total utilizando el kit de reactivos para
ensayo de proteínas Micro BCA (Pierce).
Alícuotas de los lisados correspondientes a 3 ug
de proteína total fueron cargadas en un gel de
Tris-glicina 10% SDS (Novex) y éste se corrió
durante 1 1/2 horas. Las proteínas fueron transferidas a una
membrana de transferencia Immobilon-P siguiendo las
instrucciones del fabricante.
La membrana fue enfrentada a suero de conejo
anti-caspasa-9 (Pharmingen), seguido
de antisuero de cabra anti-conejo HRP conjugado y
revelada utilizando reactivo de detección ECL para Western Blotting
(Amersham). Se seleccionaron clones tanto con alta como con baja
expresión de caspasa-9-DN (clones 2
y 14) para una caracterización adicional. Ver la Figura 2.
Inducción de apoptosis con estaurosporina: Los
clones 2 y 14 que expresaban niveles bajos y altos de
caspasa-9-DN (respectivamente)
fueron adaptados para su crecimiento en centrífugas en un medio
libre de suero. Los clones se sembraron en centrífugas a 1 millón
de células/ml y se adicionó un agente inductor de la apoptosis, la
estaurosporina (Sigma), a una concentración final de 1 uM. Las
alícuotas del cultivo se analizaron para apoptosis mediante
diversos ensayos: anexina/PI (Chemicon) para medir el % de células
apoptóticas y mediante actividad de caspasa-3
(Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Ver las
Figuras 3 y 4.
El efecto de la expresión de la
caspasa-9-DN en la viabilidad en
biorreactores de 2 litros: Los clones 2 y 14 adaptados, libres de
suero y expresando caspasa-9-DN, un
vector de control y células E25 no transfectadas fueron
amplificadas y sembradas a 1 millón de células/ml en biorreactores
de 2 litros (n=2). El medio de cultivo celular era un medio libre
de suero basado en DMEM/Ham F-12 que contenía
insulina recombinante humana y oligoelementos. Las células se
crecieron a 37ºC con una agitación fijada a 275 rpm. El pH se
mantuvo a 7,2 y fue ajustado automáticamente durante el
experimento. Los biorreactores fueron rociados con una mezcla de
oxígeno y aire. Éste es un sistema modelo que imita las condiciones
existentes durante la producción a gran escala de proteínas
terapéuticas.
Las muestras se recogieron diariamente para
medir los siguientes parámetros: viabilidad celular, densidad
celular, apoptosis, activación de caspasa-3, consumo
de glucosa, osmolaridad, producción de lactato y títulos E25. Ver
las Figuras 5-8.
Los resultados muestran una expresión estable de
caspasa-9-DN en células CHO que
expresan E25. La expresión estable generó una resistencia de las
células a un agente inductor de la apoptosis, la estaurosporina. La
resistencia fue proporcional a los niveles de expresión de
caspasa-9-DN. En el entorno de un
biorreactor, el clon 14 de elevada expresión mostró una viabilidad
y un recuento de células viables drásticamente prolongados en
comparación con el clon 2 con menor expresión, que mostró únicamente
una prolongación moderada de la viabilidad y del recuento de
células viables. La prolongación de la viabilidad se refleja en el
retraso en el comienzo de la activación de
caspasa-3 en el clon 14, en comparación con los
controles. En el ensayo para la determinación de la cantidad de
anticuerpo E25 secretado al medio se obtuvieron resultados no
esperados. Aunque el clon 14 de
caspasa-9-DN produjo una mayor
prolongación de la viabilidad en el biorreactor que el clon 2, el
clon 14 produjo menor cantidad de la proteína de interés
(anticuerpo E25) Los datos sugieren que la elevada expresión del
inhibidor de la apoptosis puede no retrasar de forma concomitante la
muerte celular ni aumentar el rendimiento de la proteína de
interés.
No obstante, en otro ensayo en un biorreactor de
2 litros, se obtuvo un cultivo celular de forma similar a la
descrita anteriormente, a excepción de los siguientes cambios: (1)
el clon 14 que expresa caspasa-9 y las células E25
de control fueron sembradas a 1 millón de células/ml; y (2) el medio
era un medio concentrado libre de suero (utilizado para mejorar el
aporte de nutrientes al medio) basado en DMEM/Ham
F-12 con insulina y oligoelementos. Los cultivos
celulares fueron crecidos durante 1 día a 37ºC y, a continuación,
atemperados a 33ºC. El tercer día, el pH de los cultivos fue
cambiado de pH 7,15 a pH 7,0, y los cultivos fueron alimentados con
un medio de DMEM/Ham F-12 concentrado, glucosa e
hidrolisato de proteína con el fin de suministrar suficientes
nutrientes para soportar un crecimiento
óptimo.
óptimo.
Los resultados se muestran en las Figuras 17 y
18. Como se ilustra en las gráficas, la expresión de
caspasa-9-DN generó una prolongación
de la viabilidad y un aumento de las densidades de células viables,
así como mayores títulos de la proteína de interés (anticuerpo E25)
en comparación con el control. Bajo las condiciones de cultivo
discontinuo alimentado en el que no se limitaron los nutrientes, los
datos muestran que la prolongación de la viabilidad y el aumento de
las densidades de células viables se acompañaron de un marcado
aumento en los títulos de
producto.
producto.
Ejemplo
3
Células CHO (dhfr+) crecidas en suspensión
fueron sembradas a 1 millón de células/ml en placas para cultivo
tisular de 60 mm. El medio de cultivo celular era un medio libre de
suero basado en DMEM/Ham F-12 que contenía insulina
recombinante humana y oligoelementos. La viabilidad del cultivo en
el día 0 era del 96%. Se analizaron diariamente dos placas para
determinar la viabilidad mediante exclusión con azul de tripán y
mediante unión anexina/PI (Clontech) y para determinar la densidad
de células viables. El experimento fue llevado a cabo durante 10
días. Un inhibidor químico de caspasas, el
z-VAD-fmk (Enzyme Systems Products),
fue disuelto en DMSO para obtener un stock 100 mM (1000x), del que
se añadieron 4 ul a una placa de 60 mm que contenía 4 ml de
cultivo. El inhibidor fue añadido 48 horas después del inicio del
experimento (antes del comienzo de la apoptosis) y se adicionó una
nueva alícuota de inhibidor
z-VAD-fmk cada 24 horas. Los
controles fueron cultivados sin adición alguna y los cultivos con
la adición de DMSO exclusivamente.
Los resultados se muestran en las Figuras
9-10.
El compuesto químico,
z-VAD-fmk, es un inhibidor de
caspasas y, cuando se adiciona al cultivo en una concentración 100
uM, genera una inhibición de la actividad de la
caspasa-3 y una prolongación de la viabilidad
celular.
Ejemplo
4
Construcción de expresión: El ADNc de
baculovirus p35 (Beidler, D. et al., J. Biol.
Chemistry, 270, 16526-16528 (1995);
Clem, R.J. et al., Science, 254,
1388-1390 (1991)) fue subclonado a partir de un
vector pcDNA3 (Invitrogen) en un vector donador CPC de la siguiente
manera: 2 ug de vector CPC (Genentech, Inc.) fueron linearizados
mediante digestión en 25 ul conteniendo 7 U de EcoRI y 7 U de XbaI
en tampón High (Boehringer Mannheim) durante 2 horas a 37ºC. El
ADNc de baculovirus p35 fue cortado del vector pcDNA 3 (Invitrogen)
con las mismas enzimas de restricción. Una alicuota de cada
reacción fue analizada mediante electroforesis en gel de agarosa al
1% conteniendo bromuro de etidio. Las bandas correspondientes al
vector CPC linearizado (9,7 kbp) y al ADNc de p35 (0,9 kbp) fueron
sacadas del gel y aisladas utilizando GeneClean (Bio 101, Inc.)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ligación: 50 ng de vector y 25 ng de ADNc de p35
fueron mezclados con 10 ul de tampón de ligación T4 y 1 ul de ADN
ligasa T4 (Kit de ligación rápida de ADN, Boehringer Mannheim) en 20
ul de volumen total de reacción. La reacción fue incubada durante 5
minutos a temperatura ambiente.
Transformación: 100 ul de células competentes de
DH5alfa de máxima eficiencia (Boehringer Mannheim) fueron mezclados
con 2 ul de mezcla de ligación y la mezcla fue incubada en hielo
durante 30 minutos. Las células fueron sometidas a calor durante 45
segundos a 42ºC, seguido de incubación en hielo durante 2 minutos.
Se añadieron 0,9 ml de medio LB a las células y éstas fueron
incubadas durante 1 hora a 37ºC bajo agitación. Se colocaron 100 ul
de células transformadas en una placa de agar LB con carbenicilina.
Cuatro clones fueron escogidos aleatoriamente y crecidos durante
toda la noche en 4 ml de LB+carbenicilina. El plásmido fue aislado
de estas colonias utilizando QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plásmidos aislados
fueron sometidos a una digestión analítica para confirmar la
correcta construcción.
Expresión de baculovirus p35 en células CHO:
Células CHO (dhfr+) crecidas en una medio DMEM/Ham
F-12 que contenía 2% de suero fetal bovino (Gibco),
insulina recombinante humana y oligoelementos fueron colocadas 48
horas antes de la transfección a 2 millones de células/100 m de
placa de cultivo tisular. El reactivo LipofectAMINE Plus (Gibco
BRL) fue utilizado para la transfección, que fue realizada siguiendo
las instrucciones del fabricante. Las células CHO fueron
transfectadas con una construcción p35/CPC y un solo vector CPC como
control. Una placa transfectada de cada tipo fue recogida 24 horas
después de la transfección para determinar el nivel de expresión de
p35 en los transfectantes transitorios (Western blotting utilizando
suero anti-p35 policlonal de conejo a una dilución
1:1000). Otras placas transfectadas fueron crecidas adicionalmente y
se les aplicó presión de selección (5 ug/ml de puromicina) 48 horas
después de la transfección. Aproximadamente dos semanas después,
las colonias resistentes a la puromicina fueron reveladas y
adaptadas al crecimiento libre de suero y amplificadas para su
posterior
análisis.
análisis.
El efecto de la expresión de p35 en la
viabilidad en biorreactores de 2 litros: El clon adaptado libre de
suero que expresa p35 y un vector de control fueron amplificados y
sembrados a 1 millón de células/ml en biorreactores de 2 litros
(n=2). El medio de cultivo celular era un medio libre de suero
basado en DMEM/Ham F-12 que contenía insulina
recombinante humana y oligoelementos. Las células fueron crecidas a
37ºC con una agitación fijada a 275 rpm. El pH se mantuvo a 7,2 y
fue ajustado automáticamente durante el experimento. Los
biorreactores fueron rociados con una mezcla de oxígeno y aire. Éste
es un sistema modelo que imita las condiciones existentes durante
la producción a gran escala de proteínas terapéuticas. Las muestras
se recogieron diariamente para medir los siguientes parámetros:
viabilidad celular, densidad celular, apoptosis, activación de
caspasa-3, consumo de glucosa, osmolaridad y
producción de lactato.
Los resultados se muestran en las Figuras
11-12.
Los resultados indican que el inhibidor de la
apoptosis, baculovirus p35, cuando se expresa en células CHO,
produce una prolongación de la viabilidad en el entorno del
biorreactor.
Ejemplo
5
Las células CHO DP12 adaptadas y libres de suero
fueron sembradas a 1,5 millones de células/ml en placas de cultivo
tisular no tratadas de 12 pocillos en un medio basado en DMEM/HAM
F-12 con concentraciones modificadas de algunos
componentes y conteniendo insulina recombinante humana,
oligoelementos y suero. La transfección fue realizada utilizando
DMRIE-C (Gibco BRL) conforme a las instrucciones del
fabricante. El clon 14 que expresa
caspasa-9-DN fue transfectado cerca
de los controles, que fueron células CHO DP12 y células E25 (CHO
DP12 que expresan E25).
El vector que expresa GFP con desplazamiento al
rojo (Quantum Biotechnologies Inc.) fue contransfectado con un
vector que expresa ADNasa [Shak, S. et al., (1990), Proc
Natl. Acad. Sci USA, 87:9188-9192)]. 24
horas después de la transfección, se añadió ioduro de propidio a
una alícuota del cultivo y se midieron las eficiencias de
transfección total y viable mediante citometría de flujo en
FACSCalibur (Becton Dickinson). Cinco días después de la
transfección, una muestra del medio fue sometida a análisis de
títulos de ADNasa utilizando ELISA.
Los datos indican (Fig. 13) que el reactivo de
transfección, en nuestro experimento el DMRIE-C,
puede resultar tóxico para las células cuando se utiliza en
concentraciones más elevadas (por encima de 6 ul). En la Figura 14,
el clon 14 de caspasa-9-DN muestra
(en todas las concentraciones de DMRIE-C probadas)
mayores eficiencias de transfección total y viable que los
controles. La eficiencia de transfección del clon 14 aumentó con la
cantidad de reactivo de transfección y alcanzó su máximo a 12 ul de
DMRIE-C, concentración a la cual ambos controles ya
habían comenzado a mostrar una disminución en la eficiencia de
transfección. Es posible que la eficiencia de transfección del clon
14 aumente aún más cuando se utilicen cantidades de
DMRIE-C superiores a las actualmente probadas. El
aumento de la eficiencia de transfección del clon 14 se vio
reflejado en la productividad específica (títulos ADNasa/LDH total)
del cultivo y en los títulos de ADNasa (Figs. 15, 16), que
aumentaron ambos en un factor de cuatro en comparación con los
controles.
Ejemplo
6
2 x 10 células de clon 14 que expresa
caspasa-9-DN y células E25 de
control fueron congeladas en un medio de congelación (1 g/l de
metilcelulosa en DMEM/Ham F-12 modificado y 10% de
DMSO) y almacenadas a -80ºC durante un extenso periodo de tiempo. El
día del experimento, los viales de células congeladas fueron sacados
del congelador, descongelados a 37ºC e introducidos en una
centrífuga con un medio de crecimiento precalentado (DMEM/Ham
F-12 modificado). Las células fueron cultivadas
durante 8 días y analizadas para determinar la viabilidad y la
densidad de células viables.
Los resultados se muestran en las Figuras 19 y
20. Los resultados indican que las células que expresan
caspasa-9-DN conservaron una mayor
viabilidad y un mayor recuento de células viables que las células
E25 de control. Con ello, se deduce que la expresión de
caspasa-9-DN en las células CHO
tiene un efecto beneficioso en la viabilidad y en las densidades de
células viables tras la descongelación de los cultivos celulares
congelados.
Ejemplo
7
El siguiente estudio fue realizado para
determinar si la expresión de
caspasa-9-DN afecta a la resistencia
de las células a los potenciales efectos adversos del butirato.
Las células del clon 14 que expresan
caspasa-9-DN y las células E25 de
control fueron sembradas a 1 x 10^{6} células/ml en placas de
cultivo tisular de 60 mm. Cada placa contenía 4 ml de medio de
cultivo. Los cultivos fueron crecidos a 37ºC en un medio
concentrado basado en DMEM/Ham F-12 con insulina y
oligoelementos. El segundo día, los cultivos fueron atemperados a
33ºC y el tercer día se les añadió butirato a concentraciones
finales variables (0, 1, 2, 3, 5, 10 mM) (n=2). La viabilidad de los
cultivos y títulos fue examinada diariamente.
Los resultados se muestran en las Figuras 21 y
22. Los resultados muestran que las células E25 de control pierden
viabilidad más rápidamente que las células que expresan
caspasa-9-DN (ver la Fig. 21, día 7
y día 9).Esta pérdida se refleja en los títulos de la proteína de
interés. Los títulos mostrados en la Fig. 22 indican que las
células de caspasa-9-DN
proporcionaron mayores títulos que la adición 0 de butirato en
cultivos con butirato 1, 2, 3 y 5 mM. Por otra parte, los títulos
de los controles E25 mejoraron con sólo adicionar butirato en
concentración 1 y 2 mM. Los resultados sugieren que la expresión de
caspasa-9-DN protege a las células
de los efectos adversos del butirato y puede generar una mayor
viabilidad y títulos más elevados.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
\bullet WO 9835986 A [0009]
\bullet WO 9725428 A [0042] [0048]
\bullet WO 8905859 A [0052]
\bullet WO 9100358 A [0052]
\bullet US 4399216 A [0052]
\bullet DD 266710 [0053]
\bullet EP 307247 A [0055]
\bullet US 4767704 A [0058]
\bullet US 4657866 A [0058]
\bullet US 4927762 A [0058]
\bullet US 5122469 A [0058] [0062]
\bullet US 4560655 A [0058]
\bullet WO 9003430 A [0058]
\bullet WO 8700195 A [0058]
\bullet EP 117060 A [0059]
\bullet EP 117058 A [0059]
\bulletBarr et al.
Bio/Technology, 1994, vol. 12, 487-493
[0002]
\bulletSteller et al.
Science, 1995, vol. 267, 1445-1449
[0002]
\bulletItoh et al. Cell,
1991, vol. 66, 233-243 [0002]
\bulletSuzuki E. et al.
Cytotechnology, 1997, vol. 23, 55-59
[0003]
\bulletAl-Rubeai, M.;
Singh R. P. Curr. Opin. Biotech, 1998, vol. 9,
152-156 [0003]
\bulletMercille S.; Massie B.
Biotechnol. Bioeng., 1994, vol. 44,
1140-1154 [0003]
\bulletSingh R. P. et al.
Biotechnol. Bioeng., 1994, vol. 44,
720-726 [0003]
\bulletZanghi A. et al.
Biotech. Bioeng., 1999, vol. 64,
108-119 [0003]
\bulletSteller. Science,
1995, vol. 267, 1445 [0004]
\bulletChinnaiyan et al.
Science, 1997, vol. 275, 1122-1126
[0004]
\bulletWang et al. Cell,
1997, vol. 90, 1-20 [0004]
\bulletChinnaiyan; Dixit.
Current Biology, 1996, vol. 6, 555-562
[0004]
\bulletFraser; Evan.
Cell, 1996, vol. 85, 781-784
[0004]
\bulletTartaglia et al.
Cell, 1993, vol. 74, 845-853
[0004]
\bulletHsu et al. Cell,
1996, vol. 84, 299-308 [0004]
\bulletNagata. Cell,
1997, vol. 88, 355 [0004]
\bulletCleaveland; Ihle.
Cell, 1995, vol. 81, 479-482
[0004]
\bulletChinnaiyan et al.
Cell, 1995, vol. 81, 505-512
[0005]
\bulletBoldin et al. J.
Biol. Chem., 1995, vol. 270, 387-391
[0005]
\bulletChinnaiyan et al. J.
Biol. Chem., 1996, vol. 271, 4961-4965
[0005]
\bulletBoldin et al.
Cell, 1996, vol. 85, 803-815
[0005]
\bulletMuzio et al.
Cell, 1996, vol. 85, 817-827
[0005]
\bulletRay et al. Cell,
1992, vol. 69, 597-604 [0006]
\bulletTewari et al.
Cell, 1995, vol. 81, 801-809
[0006]
\bulletEnari et al.
Nature, 1995, vol. 375, 78-81
[0006]
\bulletTewari et al. J.
Biol. Chem., 1995, vol. 270, 3255-3260
[0006] [0041]
\bulletTewari et al. Curr.
Op. Genet. Develop., 1996, vol. 6, 39-44
[0007]
\bulletVerma et al. Genes
Develop., 1996, vol. 9, 2723-2735
[0007]
\bulletBaldwin. Ann. Rev.
Immunol., 1996, vol. 14, 649-681
[0007]
\bulletAshkenazi et al.
Science, 1998, vol. 281, 1305-1308
[0008]
\bulletNagata. Cell,
1997, vol. 88, 355-365 [0008]
\bulletMurray et al.
Biotech. Bioeng., 1996, vol. 51,
298-304 [0009]
\bulletItoh et al.
Biotechnol. Bioeng., 1995, vol. 48,
118-122 [0009]
\bulletMastrangelo et al.
TIBTECH, 1998, vol. 16, 80-95
[0009]
\bulletSimpson et al.
Biotechnol. Bioeng., 1997, vol. 54,
1-16 [0009]
\bulletSingh et al.
Biotechnol. Bioeng., 1996, vol. 52,
166-175 [0009]
\bulletGoswami et al.
Biotechnol. Bioeng., 1999, vol. 62,
632-640 [0009]
\bulletSeol, D. W. et al. J.
Biol. Chem., 1999, vol. 274, 2072-2076
[0020]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989, 7.3-7.57
[0029]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989, 18.1-18.88
[0029]
\bulletLao, M. et al.
Cytotechnology, 1996, vol. 22, 43-52
[0032]
\bulletTeige, M. et al. J.
Biotechnol., 1994, vol. 34, 101-105
[0032]
\bulletGramer M. J.; Goochee C.
F. Biotechnol. Prog., 1999, vol. 9,
366-373 [0032]
\bulletSchmid. Current Biology,
1995, vol. 5, 933-944 [0032]
\bulletWittwer A.; Howard, S.
C. Biochem., 1990, vol. 29, 4175-4180
[0032]
\bulletHart. Curr. Op. Cell
Biol., 1992, vol. 4, 1017-1023 [0032]
\bulletGoochee et al.
Bio/Technology, 1991, vol. 9,
1347-1355 [0032]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1999 [0037]
\bulletDieffenbach et al.
PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1995 [0037]
\bulletClem R. J. et al.
Science, 1991, vol. 254, 1388-1390
[0039]
\bulletDuan, H. et al. J.
Biol. Chemistry, 1996, vol. 271,
16720-16724 [0039] [0079]
\bulletPan, G. et al. J.
Biol. Chemistry, 1998, vol. 273,
5841-5845 [0039] [0079]
\bulletVaux, D. L. et al.
Science, 1998, vol. 258, 1955-1957
[0039]
\bulletTsujimoto et al.
Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, vol. 83,
5214-5218 [0039]
\bulletGagliardini et al.
Science, 1994, vol. 263, 826-828
[0041]
\bulletNicholson et al.
Nature, vol. 376, 37-43 [0041]
\bulletZhou et al. J. Biol.
Chem., 1997, vol. 272, 7797-7800
[0041]
\bulletMessing et al.
Nucleic Acids Res., 1981, vol. 9, 309 [0043]
\bulletMaxam et al. Methods
in Enzymology, 1980, vol. 65, 499 [0043]
\bulletUrlaub et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0045]
\bulletStinchcomb et al.
Nature, 1979, vol. 282, 39 [0045]
\bulletKingsman et al.
Gene, 1979, vol. 7, 141 [0045]
\bulletTschemper et al.
Gene, 1980, vol. 10, 157 [0045]
\bulletJones. Genetics,
1977, vol. 85, 12 [0045]
\bulletShaw et al. Gene,
1983, vol. 23, 315 [0052]
\bulletVirology, 1978, vol. 52,
456-457 [0052]
\bullet Van Solingen et al.
J. Bact., 1977, vol. 130, 946 [0052]
\bulletHsiao et al. Proc.
Natl. Acad. Sci., 1979, vol. 76, 3829 [0052]
\bulletKeown et al. Methods
in Enzymology, 1990, vol. 185, 527-537
[0052]
\bulletMansour et al.
Nature, 1988, vol. 336, 348-352
[0052]
\bulletGraham et al. J. Gen
Virol., 1977, vol. 36, 59 [0055]
\bulletUrlaub; Chasin. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0055]
\bulletMather. Biol. Reprod.,
1980, vol. 23, 243-251 [0055]
\bulletJ. Immunol. Methods,
1983, vol. 56, 221-234 [0057]
\bulletAnimal Cell Culture: A Practical
Approach. Oxford University Press, 1992 [0057]
\bulletHam; Wallace. Meth.
Enz., 1979, vol. 58, 44 [0058]
\bulletBarnes; Sato. Anal.
Biochem., 1980, vol. 102, 255 [0058]
\bulletMammalian Cell Culture. Plenum
Press, 1984 [0058]
\bulletBarnes; Sato.
Cell, 1980, vol. 22, 649 [0058]
\bulletGething et al.
Nature, 1981, vol. 293, 620-625
[0059]
\bulletMantei et al.
Nature, 1979, vol. 281, 40-46
[0059]
\bulletMammalian Cell Biotechnology: A
Practical Approach. IRL Press, 1991 [0059]
\bulletAmerican Type Culture Collection
Catalogue of Cell Lines and Hybridomas. 1988,
346-349 [0062]
\bulletArts et al. Biochem
J., 1995, vol. 310, 171-176 [0069]
\bulletGorman et al. Nucleic
Acids Res., 1983, vol. 11, 7631-7698
[0069]
\bulletKrugh. Mol. Cell.
Biochem., 1982, vol. 42, 65-82 [0069]
\bulletLamotte et al.
Cytotechnology, 1999, vol. 29, 55-64
[0069]
\bulletChotigeat et al.
Cytotechnology, 1994, vol. 15, 217-221
[0069]
\bulletMedina et al. Cancer
Research, 1997, vol. 57, 3697-3707
[0069]
\bulletHague et al. Int. J.
Cancer, 1993, vol. 55, 498-505 [0069]
\bulletCalabresse et al.
Biochim. Biophys. Res. Comm., 1993, vol. 195,
31-38 [0069]
\bulletFillipovich et al.
Biochim. Biophys. Res. Comm., 1994, vol. 198,
257-265 [0069]
\bulletThomas. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1980, vol. 77, 5201-5205
[0070]
\bulletPresta et al. J.
Immunology, 1993, vol. 151, 2623-2632
[0083]
\bulletBeidler, D. et al. J.
Biol. Chemistry, 1995, vol. 270,
16526-16528 [0096]
\bulletClem, R. J. et al.
Science, 1991, vol. 254, 1388-1390
[0096]
\bulletShak, S. et al. Proc
Natl. Acad. Sci USA, 1990, vol. 87,
9188-9192 [0104]
Claims (5)
1. Procedimiento para fabricar proteínas
recombinantes utilizando uno o más inhibidores de la apoptosis, que
comprende las etapas de:
- (a)
- provisión de un vector que comprende un gen que codifica una proteína de interés;
- (b)
- provisión de una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO);
- (c)
- transformación o transfección de la célula huésped con el vector de la etapa (a);
- (d)
- provisión de los medios de cultivo celular;
- (e)
- provisión de una cantidad de inhibidor de caspasa z-VAD-fmk;
- (f)
- mezclar el inhibidor de caspasa en los medios de cultivo celular;
- (g)
- cultivo de la célula huésped transformada o transfectada en el medio de cultivo celular bajo las condiciones suficientes para la expresión de la proteína de interés; y, opcionalmente
- (f)
- recuperación o purificación de la proteína de interés de la célula huésped y/o del medio de cultivo celular.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las células huésped son cultivadas bajo condiciones para la
expresión transitoria de la proteína de interés.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la proteína de interés comprende una proteína que es capaz
de inducir la apoptosis en una célula de mamífero o de no
mamífero.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho medio de cultivo celular es un medio libre de
suero.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que, tras la etapa (g), la célula o células huésped y/o el medio
de cultivo celular se congelan y posteriormente se descongelan.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US15623299P | 1999-09-27 | 1999-09-27 | |
US156232P | 1999-09-27 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2346659T3 true ES2346659T3 (es) | 2010-10-19 |
Family
ID=22558684
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES05020550T Expired - Lifetime ES2346659T3 (es) | 1999-09-27 | 2000-09-25 | Procedimientos de fabricacion de proteinas recombinantes utilizando inhibidores de la apoptosis. |
ES00965426T Expired - Lifetime ES2254230T3 (es) | 1999-09-27 | 2000-09-25 | Procedimiento de fabricacion de proteinas recombinantes usando inhibidores de apoptosis. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES00965426T Expired - Lifetime ES2254230T3 (es) | 1999-09-27 | 2000-09-25 | Procedimiento de fabricacion de proteinas recombinantes usando inhibidores de apoptosis. |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US6586206B1 (es) |
EP (2) | EP1220934B1 (es) |
JP (1) | JP2003510087A (es) |
AT (2) | ATE474052T1 (es) |
AU (1) | AU7614600A (es) |
CA (1) | CA2384880C (es) |
DE (2) | DE60044690D1 (es) |
DK (2) | DK1650307T3 (es) |
ES (2) | ES2346659T3 (es) |
HK (1) | HK1091228A1 (es) |
IL (2) | IL148512A0 (es) |
PT (1) | PT1650307E (es) |
WO (1) | WO2001023592A2 (es) |
Families Citing this family (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1650307T3 (da) * | 1999-09-27 | 2010-10-04 | Genentech Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinante proteiner ved anvendelse af apoptoseinhibitorer |
US7405038B1 (en) | 2000-03-03 | 2008-07-29 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Stable cell lines resistant to apoptosis and nutrient stress and methods of making same |
AU2002315534B2 (en) * | 2001-07-10 | 2008-05-22 | Biogen Idec Inc. | Inhibition of apoptosis process and improvement of cell performance |
KR100454016B1 (ko) * | 2002-01-05 | 2004-10-26 | 한국과학기술원 | 항예정사 유전자로 형질전환되고 dhfr 유전자가결핍된 신규한 cho 세포주, 그의 제조 방법 및 상기형질전환된 cho 숙주 세포를 이용한 목적단백질의 생산방법 |
DE602004026759D1 (de) * | 2003-10-24 | 2010-06-02 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Neue rekombinante tierzellen mit hoher proteinproduktion, verfahren zur konstruktion davon sowie verfahren zur massenproduktion von protein unter verwendung davon |
AU2005333513B2 (en) * | 2004-07-23 | 2011-06-02 | Immunomedics, Inc. | Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture |
US7531327B2 (en) * | 2004-07-23 | 2009-05-12 | Immunomedics, Inc. | Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture |
US7537930B2 (en) * | 2004-07-23 | 2009-05-26 | Immunomedics, Inc. | Mammalian cell lines for increasing longevity and protein yield from a cell culture |
US7608425B2 (en) * | 2004-07-23 | 2009-10-27 | Immunomedics, Inc. | Methods for protein expression in mammalian cells in serum-free medium |
SG163592A1 (en) * | 2004-07-23 | 2010-08-30 | Immunomedics Inc | Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture |
EP1789095A2 (en) * | 2004-09-16 | 2007-05-30 | Sangamo Biosciences Inc. | Compositions and methods for protein production |
CN101875957A (zh) * | 2004-12-30 | 2010-11-03 | 新加坡科技研究局 | 中国仓鼠凋亡相关基因 |
US20060263809A1 (en) * | 2005-04-05 | 2006-11-23 | The Rgents Of The University Of California | Method for sensitive measure of low level apoptosis in cells |
US20070092947A1 (en) * | 2005-10-20 | 2007-04-26 | Immunomedics, Inc. | Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture |
US8911964B2 (en) | 2006-09-13 | 2014-12-16 | Abbvie Inc. | Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody |
SG10201510384UA (en) | 2006-09-13 | 2016-01-28 | Abbvie Inc | Cell culture improvements |
US8273722B2 (en) * | 2007-07-13 | 2012-09-25 | Dharmacon, Inc. | Enhanced biotherapeutic production using inhibitory RNA |
WO2009048024A1 (ja) * | 2007-10-09 | 2009-04-16 | Hiroshima University | 目的遺伝子を染色体外で高度に増幅させるためのベクターおよびその利用 |
EP2247609A1 (en) | 2008-02-25 | 2010-11-10 | Novozymes A/S | Method for increasing expression yield of a protein of interest |
US20100049284A1 (en) * | 2008-05-15 | 2010-02-25 | The Catholic University Of America | Use of heat to treat biological systems exposed to damaging radiation |
AU2009290563A1 (en) * | 2008-09-15 | 2010-03-18 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for regulating cell osmolarity |
EP2346897A2 (en) | 2008-10-20 | 2011-07-27 | Abbott Laboratories | Viral inactivation during purification of antibodies |
TW201024318A (en) * | 2008-10-20 | 2010-07-01 | Abbott Lab | Isolation and purification of antibodies using protein A affinity chromatography |
CN102369276B (zh) | 2009-02-20 | 2015-02-04 | 文特里亚生物科学公司 | 含有蛋白质组合的细胞培养基 |
WO2012149197A2 (en) | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Abbott Laboratories | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
US9181572B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Methods to modulate lysine variant distribution |
US9334319B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-05-10 | Abbvie Inc. | Low acidic species compositions |
WO2013176754A1 (en) | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Abbvie Inc. | Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
WO2014022102A1 (en) * | 2012-08-01 | 2014-02-06 | Amgen Inc. | Methods of using anti-apoptotic compounds to modulate one or more properties of a cell culture |
US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
BR112015004467A2 (pt) | 2012-09-02 | 2017-03-21 | Abbvie Inc | método para controlar a heterogeneidade de proteínas |
CA2905010A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-09-18 | Abbvie Inc. | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
WO2014151878A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides |
US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
WO2014159579A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE |
DE102013206438A1 (de) | 2013-04-11 | 2014-10-16 | Bühler Motor GmbH | Permanentmagnetrotor für einen elektronisch kommutierten Gleichstrommotor |
IL305656A (en) | 2013-09-23 | 2023-11-01 | Wilson Wolf Mfg Corporation | Improved methods for genetic modification in animal cells |
US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
US20150139988A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
EP3777535A1 (en) * | 2014-07-09 | 2021-02-17 | F. Hoffmann-La Roche AG | Ph adjustment to improve thaw recovery of cell banks |
CN111349615A (zh) * | 2018-12-24 | 2020-06-30 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 制备过表达外源基因的细胞的方法 |
CN112080439B (zh) * | 2020-07-30 | 2023-01-10 | 浙江工业大学 | 人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用 |
KR20230045615A (ko) * | 2020-08-14 | 2023-04-04 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 단백질을 제조하는 방법 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2971218B2 (ja) * | 1991-12-04 | 1999-11-02 | 協和醗酵工業株式会社 | ウリカーゼ遺伝子およびウリカーゼの製造法 |
GB9202796D0 (en) * | 1992-02-11 | 1992-03-25 | Wellcome Found | Antiviral antibody |
JPH09163983A (ja) * | 1995-08-30 | 1997-06-24 | Hisamitsu Pharmaceut Co Inc | アポトーシス抑制による有用物質の効率的生産方法および細胞 |
FR2749022B1 (fr) * | 1996-05-23 | 2001-06-01 | Rhone Merieux | Cellules aviaires immortelles |
FR2749021B1 (fr) * | 1996-05-23 | 2001-10-26 | Agronomique Inst Nat Rech | Lignees de cellules aviaires immortalisees |
US5876923A (en) * | 1996-07-26 | 1999-03-02 | Arch Development Corporation | Herpes simplex virus ICP4 as an inhibitor of apoptosis |
IL125190A (en) * | 1996-09-12 | 2003-01-12 | Idun Pharmaceuticals Inc | Tricyclic compounds for the inhibition of the ice/ced-3 protease family of enzymes and pharmaceutical compositions containing the same |
US6072047A (en) | 1997-02-13 | 2000-06-06 | Immunex Corporation | Receptor that binds trail |
US6855544B1 (en) * | 1999-04-15 | 2005-02-15 | Crucell Holland B.V. | Recombinant protein production in a human cell |
ATE366803T1 (de) * | 1999-09-08 | 2007-08-15 | Genetrol Biotherapeutics | Hohe zytokinproduktion mit verbesserte zelllebensfähigkeit |
DK1650307T3 (da) * | 1999-09-27 | 2010-10-04 | Genentech Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinante proteiner ved anvendelse af apoptoseinhibitorer |
-
2000
- 2000-09-25 DK DK05020550.9T patent/DK1650307T3/da active
- 2000-09-25 DE DE60044690T patent/DE60044690D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-25 AU AU76146/00A patent/AU7614600A/en not_active Abandoned
- 2000-09-25 PT PT05020550T patent/PT1650307E/pt unknown
- 2000-09-25 WO PCT/US2000/026352 patent/WO2001023592A2/en active IP Right Grant
- 2000-09-25 CA CA2384880A patent/CA2384880C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-25 ES ES05020550T patent/ES2346659T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-25 AT AT05020550T patent/ATE474052T1/de active
- 2000-09-25 IL IL14851200A patent/IL148512A0/xx unknown
- 2000-09-25 AT AT00965426T patent/ATE313634T1/de active
- 2000-09-25 DK DK00965426T patent/DK1220934T3/da active
- 2000-09-25 DE DE60025015T patent/DE60025015T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-25 EP EP00965426A patent/EP1220934B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-25 ES ES00965426T patent/ES2254230T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-25 EP EP05020550A patent/EP1650307B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-25 US US09/668,924 patent/US6586206B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-25 JP JP2001526974A patent/JP2003510087A/ja active Pending
-
2002
- 2002-03-05 IL IL148512A patent/IL148512A/en active IP Right Grant
-
2003
- 2003-06-27 US US10/607,882 patent/US20040002139A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-06-15 US US11/454,670 patent/US20070004009A1/en not_active Abandoned
- 2006-10-06 HK HK06111038.5A patent/HK1091228A1/xx unknown
-
2009
- 2009-11-30 US US12/592,606 patent/US20100087624A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL148512A (en) | 2011-04-28 |
CA2384880C (en) | 2010-09-21 |
EP1650307A3 (en) | 2006-05-03 |
ATE474052T1 (de) | 2010-07-15 |
DE60025015D1 (de) | 2006-01-26 |
ES2254230T3 (es) | 2006-06-16 |
CA2384880A1 (en) | 2001-04-05 |
AU7614600A (en) | 2001-04-30 |
EP1650307B1 (en) | 2010-07-14 |
EP1220934B1 (en) | 2005-12-21 |
WO2001023592A2 (en) | 2001-04-05 |
IL148512A0 (en) | 2002-09-12 |
PT1650307E (pt) | 2010-10-21 |
WO2001023592A3 (en) | 2001-12-20 |
EP1650307A2 (en) | 2006-04-26 |
ATE313634T1 (de) | 2006-01-15 |
US20070004009A1 (en) | 2007-01-04 |
DK1650307T3 (da) | 2010-10-04 |
US6586206B1 (en) | 2003-07-01 |
HK1091228A1 (en) | 2007-01-12 |
JP2003510087A (ja) | 2003-03-18 |
DK1220934T3 (da) | 2006-05-08 |
US20100087624A1 (en) | 2010-04-08 |
US20040002139A1 (en) | 2004-01-01 |
DE60025015T2 (de) | 2006-08-03 |
EP1220934A2 (en) | 2002-07-10 |
DE60044690D1 (de) | 2010-08-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2346659T3 (es) | Procedimientos de fabricacion de proteinas recombinantes utilizando inhibidores de la apoptosis. | |
DE69832970T2 (de) | Humanisierte antikörper und verfahren zu ihrer herstellung | |
Butler | Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals | |
Costa et al. | Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production | |
US9096879B2 (en) | Method of supplementing culture media to prevent undesirable amino acid substitutions | |
EP1910515B1 (en) | Improved methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture | |
ES2437068T3 (es) | Líneas celulares para expresar enzima útil en la preparación de productos amidados | |
KR101210083B1 (ko) | 폴리펩티드의 생산 방법 | |
US20070015250A1 (en) | Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture | |
KR20110060911A (ko) | 고 역가 항체 생산 | |
US20080206819A1 (en) | Intensified Perfusion Production Method | |
MX2012012526A (es) | Medio de cultivo celular mejorado. | |
AU2016201429B2 (en) | Methods for improving viability and productivity in cell culture | |
JP2015154790A (ja) | 実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンおよび実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを作製するための方法 | |
AU763513B2 (en) | Secretion of glycosylated proteins using a tissue plasminogen activator pro-sequence | |
US20070092947A1 (en) | Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture | |
Lu et al. | Production of the soluble human Fas ligand by Dictyostelium discoideum cultivated on a synthetic medium | |
CN101163792A (zh) | 包含mCMV启动子和hCMV主要立即早期基因第一内含子的哺乳动物表达载体 | |
AU2009201482B2 (en) | Methods for making recombinant proteins using apoptosis inhibitors | |
KR102639552B1 (ko) | 구리염을 이용한 재조합 혈장 단백질의 생산 방법 | |
KR101452286B1 (ko) | Gdf5 발현 세포를 mtx 및 제오신이 포함된 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법 | |
AU2005333513B2 (en) | Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture | |
EP1270733A1 (en) | Method for introducing a nucleic acid into a eukaryotic cell | |
AU2016374304A1 (en) | Method for increasing the heterogeneity of O-glycosylation of recombinant factor VII | |
WO2003000908A1 (en) | A method for introducing a nucleic acid into a eukaryotic cell |