PT1650307E

PT1650307E - Métodos para preparação de proteínas recombinantes utilizando inibidores de apoptose

Info

Publication number: PT1650307E
Application number: PT05020550T
Authority: PT
Inventors: Jana Van De Goor; Robert W Hamilton; Vishva Dixit
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-09-27
Filing date: 2000-09-25
Publication date: 2010-10-21
Also published as: EP1650307A2; DE60025015D1; DE60025015T2; DK1650307T3; ATE313634T1; EP1650307A3; IL148512A; ES2254230T3; EP1220934A2; CA2384880A1; WO2001023592A2; US20100087624A1; CA2384880C; EP1650307B1; DK1220934T3; DE60044690D1; JP2003510087A; HK1091228A1; WO2001023592A3; ATE474052T1

Description

ΕΡ 1 650 307/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Métodos para preparação de proteínas recombinantes utilizando inibidores de apoptose"

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se genericamente a métodos melhorados de preparação de proteínas recombinantes utilizando um ou mais inibidores de apoptose.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Crê-se que o controlo do número de células em mamíferos seja determinado, em parte, por um equilíbrio entre a proliferação celular e a morte celular. Uma forma de morte celular, por vezes referida como morte celular necrótica, é tipicamente caracterizada como uma forma patológica de morte celular resultante de algum traumatismo ou lesão celular. Em contraste, existe outra forma "fisiológica" de morte celular que habitualmente progride de um modo mais ordeiro ou controlado. Esta forma ordenada ou controlada de morte celular é frequentemente referida como "apoptose" (ver, p.ex., Barr et al., Bio/Technology 12: 487-493, 1994; Steller et al., Science 267: 1445-1449, 1995). A morte celular apoptótica ocorre naturalmente em muitos processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário e a selecção clonal no sistema imunitário (Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991). O controlo do número de células em cultura celular e biorreactores é também um equilíbrio entre a proliferação celular e a morte celular. Houve relatórios na literatura indicando que a morte celular em biorreactores pode ser um processo apoptótico (Suzuki E., et al., Cytotechnology 23: 55-59, 1997; Al-Rubeai, M. e Singh R.P., Curr. Opin. Biotech 9: 152-156, 1998) . Foi descrito que o processo apoptótico pode ser induzido através de privação de nutrientes (Franek F. e Chládkova-Srámková K., Cytotechnology 18: 113-117, 1995;

Mercille S. e Massie B., Biotechnol. Bioeng. 44: 1140-1154, 1994; Singh R.P., et al., Biotechnol. Bioeng. 44: 720-726, 1994), privação de soro (Singh R.P., et al., Biotechnol. 2 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ

Bioeng. 44: 720-726, 1994; Zanghi A., et al., Biotech. Bioeng. 64: 108-119, 1999) ou outros parâmetros controláveis da cultura celular em biorreactores, mas não é completamente controlado devido à mecânica do biorreactor, uma falta de compreensão total dos parâmetros de cultura necessários, ou outras causas indeterminadas.

Tal como actualmente entendida, a apoptose ou programa de morte celular contém pelo menos três elementos importantes -activadores, inibidores e efectores; em C. elegans, estes elementos são codificados respectivamente por três genes, Ced-4, Ced-9 e Ced-3 (Steller, Science 267: 1445, 1995); Chinnaiyan et al., Science 275: 1122-1126, 1997); Wang et al., Cell 90: 1-20, 1997). Dois dos membros da família TNFR, TNFR1 e Fas/Apol (CD95), podem activar a morte celular apoptótica (Chinnaiyan e Dixit, Current Biology 6: 555-562, 1996; Fraser e Evan, Cell 85: 781-784, 1996) . Sabe-se que o TNFR1 também medeia a activação do factor de transcrição, NF-KB (Tartaglia et al., Cell 74: 845-853, 1993; Hsu et al., Cell 84: 299-308, 1996) . Para além de alguma homologia do ECD, estes dois receptores partilham homologia no seu domínio intracelular (ICD) numa interface de oligomerização conhecida como domínio de morte (Tartaglia et al., supra; Nagata, Cell 88: 355, 1997) . Domínios de morte são também verificados em várias proteínas de metazoários que regulam a apoptose, nomeadamente a proteína de Drosophila, Reaper, e as proteínas de mamífero referidas como FADD/MORT1, TRADD, e RIP (Cleaveland e Ihle, Cell 81: 479-482, 1995).

Crê-se que, após ligação do ligando e agrupamento dos receptores, o TNFR1 e o CD95 recrutam FADD para um complexo de sinalização indutor de morte. CD95 supostamente liga-se a FADD directamente, enquanto TNFR1 se liga a FADD indirectamente através de TRADD (Chinnaiyan et al., Cell 81: 505-512, 1995; Boldin et al., J. Biol. Chem. 270: 387-391, 1995; Hsu et al., supra; Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem. 271: 4961-4965, 1996). Foi relatado que FADD serve como proteína adaptadora ou proteína que recruta a protease relacionada com Ced-3, MACH-alfa/FLICE (caspase 8), para o complexo de sinalização de morte (Boldin et al., Cell 85: 803-815, 1996; Muzio et al., Cell 85: 817-827, 1996). MACH-alfa/FLICE parece ser o gatilho que desencadeia uma cascata de proteases apoptóticas, 3 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ incluindo a enzima conversora da interleucina-1 beta (ICE) e CPP32/Yama, que pode executar alguns aspectos críticos do programa de morte celular (Fraser e Evan, supra).

Foi recentemente divulgado que a morte celular programada envolve a actividade de membros de uma família de cisteína-proteases relacionadas com o gene de morte celular de C. elegans, ced-3, e com a enzima conversora da IL-1 de mamífero, ICE. A actividade das proteases ICE e CPP32/Yama pode ser inibida pelo produto do gene do vírus da varíola bovina, crmA (Ray et al., Cell 69: 597-604, 1992; Tewari et al., Cell 81: 801-809, 1995). Estudos recentes mostram que CrmA pode inibir morte celular induzida por TNFR1 e CD95 (Enari et al., Nature 375: 78-81, 1995; Tewari et al., J. Biol. Chem. 270: 3255-3260, 1995) .

Tal como revisto recentemente por Tewari et al., TNFR1, TNFR2 e CD40 modulam a expressão de citoquinas pró-inflamatórias e co-estimuladoras, receptores de citoquina, e moléculas de adesão celular através da activação do factor de transcrição, NF-KB (Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop. 6: 39-44, 1996). NF-KB é o protótipo de uma família de factores de transcrição diméricos cujas subunidades contêm regiões Rei conservadas (Verma et al., Genes Develop. 9: 2723-2735, 1996; Baldwin, Ann. Rev. Immunol. 14: 649-681, 1996). Na sua forma latente, NF-KB é complexado com membros da família de inibidores IKB; após inactivação do IKB em resposta a certos estímulos, o NF-KB libertado transloca-se para o núcleo onde se liga a sequências de ADN específicas e activa a transcrição de genes.

Para revisões recentes de tais vias de sinalização, ver, p.ex., Ashkenazi et al., Science 281: 1305-1308, 1998; Nagata, Cell 88: 355-365, 1997.

Até à data, tem havido relatórios em conflito quanto aos efeitos dos inibidores de caspases e da expressão de genes anti-apoptóticos em células recombinantes cultivadas. Por exemplo, Murray et al., Biotech. Bioeng. 51: 298-304, 1996 descrevem que a sobre-expressão de bcl-2 em células de mieloma NSO não conseguiu afectar as características da fase de declínio das células cultivadas. Outros investigadores 4 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ verificaram, em contraste, que bcl-2 pode ser eficaz a prevenir que diferentes linhas celulares morram sob condições de cultura celular (ver, p.ex., Itoh et al., Biotechnol. Bioeng. 48: 118-122, 1995; Mastrangelo et al., TIBTECH 16: 80-95, 1998; Simpson et al., Biotechnol. Bioeng. 54: 1-16, 1997;

Singh et al., Biotechnol. Bioeng. 52: 166-175, 1996). Goswami et al., Biotechnol. Bioeng. 62: 632-640, 1999 relatam que verificaram que o inibidor de caspases, z-VAD-fmk, era incapaz de prolongar substancialmente a vida de uma cultura isenta de soro de células CHO. EM WO 98/35986A descreve-se um método de preparação de uma proteína recombinante (receptor TRAIL) utilizando um inibidor de caspases, z-VAD-fmk, em células hospedeiras CV-l/EBNA.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento baseia-se nas descobertas dos Requerentes de que o emprego de um ou mais inibidores de apoptose em cultura de células recombinantes e na produção de proteínas pode reduzir marcadamente a apoptose na cultura celular e melhorar as técnicas de produção de proteínas recombinantes. Os métodos divulgados no presente pedido são úteis, por exemplo, no prolongamento da viabilidade celular em culturas celulares ou na melhoria ou aumento do rendimento das proteínas recombinantes a partir das culturas celulares. Outras melhorias proporcionadas pelo presente invento são descritas em detalhe abaixo.

Um método de preparação de proteínas recombinantes utilizando um ou mais inibidores de apoptose é aqui descrito. O método inclui os passos de (a) proporcionar um vector compreendendo um gene que codifica um inibidor de apoptose, (b) proporcionar um vector compreendendo um gene que codifica uma proteína de interesse, (c) proporcionar uma célula hospedeira, (d) transformação ou transfecção da célula hospedeira com os vectores referidos nos passos (a) e (b), (e) proporcionar um meio de cultura, (f) cultura da célula ou células hospedeiras transformadas ou transfectadas no meio de cultura sob condições suficientes para expressar a proteína de interesse e o inibidor de apoptose, e (g) recuperação ou purificação da proteína de interesse a partir das células hospedeiras e/ou do meio de cultura celular. Opcionalmente, o 5 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ método inclui ainda o passo de mistura de um inibidor de apoptose adicional no meio de cultura. No método, os respectivos genes que codificam o inibidor de apoptose e a proteína de interesse podem ser inseridos num único vector (p.ex., co-transfectados num único vector), ou alternativamente, ser inseridos em dois vectores separados. De preferência, os respectivos genes que codificam o inibidor de apoptose e a proteína de interesse são inseridos em dois vectores separados, possuindo cada vector um tipo diferente de marcador de selecção em relação ao outro vector. Opcionalmente, o método proporciona expressão transiente da proteína de interesse e expressão estável ou transiente do inibidor de apoptose. Opcionalmente, o gene que codifica o inibidor de apoptose compreende um gene que codifica a proteína caspase-9-DN ou p35 de baculovírus.

Noutro exemplo, o método inclui os passos de (a) proporcionar um vector compreendendo um gene que codifica uma proteína de interesse, (b) proporcionar uma célula hospedeira compreendendo ADN codificando um inibidor de apoptose, (c) transformação ou transfecção da célula ou células hospedeiras com o vector referido no passo (a), (d) proporcionar o meio da cultura celular, (e) cultura da célula ou células hospedeiras transformadas ou transfectadas no meio de cultura sob condições suficientes para expressar a proteína de interesse e o inibidor de apoptose, e (f) recuperação ou purificação da proteína de interesse a partir das células hospedeiras e/ou do meio de cultura celular. Opcionalmente, o gene que codifica o inibidor de apoptose pode ser integrado estavelmente no genoma da célula hospedeira. Opcionalmente, o método inclui ainda o passo de mistura de uma molécula inibidora de apoptose adicional no meio de cultura. Opcionalmente, o método proporciona expressão transiente da proteína de interesse e expressão estável ou transiente do inibidor de apoptose. O presente invento proporciona um método de preparação de proteínas recombinantes utilizando um ou mais inibidores de apoptose, método que inclui os passos de (a) proporcionar um vector compreendendo um gene que codifica a proteína de interesse, (b) proporcionar uma célula hospedeira, (c) transformação ou transfecção da célula hospedeira com o 6 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ vector referido no passo (a) , (d) proporcionar um meio de cultura celular, (e) proporcionar um inibidor de apoptose, (f) mistura do inibidor de apoptose no meio de cultura, (g) cultura da célula ou células hospedeiras no meio de cultura sob condições suficientes para expressar a proteína de interesse, e opcionalmente (h) recuperação ou purificação da proteína de interesse a partir das células hospedeiras e/ou do meio de cultura celular tal como definido nas reivindicações. Opcionalmente, o método proporciona expressão transiente da proteína de interesse.

Noutro exemplo aqui descrito, o método inclui os passos (a) proporcionar um vector compreendendo um gene que codifica um inibidor de apoptose, (b) proporcionar um vector compreendendo um gene que codifica uma proteína de interesse, (c) proporcionar uma célula hospedeira, (d) transformação ou transfecção da célula hospedeira com os vectores referidos nos passos (a) e (b), (e) proporcionar um meio de cultura celular, (f) cultura da célula ou células hospedeiras transformadas ou transfectadas no meio de cultura sob condições suficientes para expressar a proteína de interesse e o inibidor de apoptose, e (g) congelação e subsequentemente descongelação das células hospedeiras e/ou do meio de cultura celular. Opcionalmente, o método inclui ainda o passo de mistura de um inibidor de apoptose adicional no meio de cultura no passos (e) ou (f) . No método, os respectivos genes que codificam o inibidor de apoptose e a proteína de interesse podem ser inseridos num único vector, ou alternativamente, ser inseridos em dois vectores separados. De preferência, os respectivos genes que codificam o inibidor de apoptose e a proteína de interesse são inseridos em dois vectores separados, possuindo cada vector um tipo de marcador de selecção diferente em relação ao outro vector. Opcionalmente, o método proporciona expressão transiente da proteína de interesse e expressão estável ou transiente do inibidor de apoptose.

Noutro exemplo, o método inclui os passo de (a) proporcionar um vector compreendendo um gene que codifica uma proteína de interesse, (b) proporcionar uma célula hospedeira compreendendo ADN codificando um inibidor de apoptose, (c) transformação ou transfecção da célula ou células hospedeiras com o vector referido no passo (a), 7 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ (d) proporcionar um meio de cultura celular, (e) cultura da célula ou células hospedeiras transformadas ou transfectadas no meio de cultura sob condições suficientes para expressar a proteína de interesse e o inibidor de apoptose, e (f) congelação e subsequentemente descongelação das células hospedeiras e/ou meio de cultura celular. Opcionalmente, o gene que codifica o inibidor de apoptose pode ser estavelmente integrado no genoma da célula hospedeira. Opcionalmente, o método inclui ainda o passo de mistura de uma molécula inibidora de apoptose adicional no meio de cultura. Opcionalmente, o método proporciona expressão transiente da proteína de interesse e expressão estável ou transiente do inibidor de apoptose.

Noutra concretização, o método inclui os passos de (a) proporcionar um vector compreendendo um gene que codifica a proteína de interesse, (b) proporcionar uma célula hospedeira, (c) transformação ou transfecção da célula hospedeira com o vector referido no passo (a) , (d) proporcionar um meio de cultura celular, (e) proporcionar um inibidor de apoptose, (f) mistura do inibidor de apoptose no meio de cultura, (g) cultura da célula ou células hospedeiras no meio de cultura sob condições suficientes para expressar a proteína de interesse, e (h) congelação e subsequentemente descongelação das células hospedeiras e/ou do meio de cultura celular tal como definido nas reivindicações. Opcionalmente, o método proporciona expressão transiente da proteína de interesse. São também aqui descritos métodos melhorados de transfecção em que pode ser empregue a utilização de um ou mais inibidores de apoptose e concentrações crescentes de reagente de transfecção para aumentar a eficiência da transfecção. É também aqui descrita uma proteína de interesse produzida de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos. A proteína de interesse pode compreender uma proteína de mamífero ou proteína sem ser de mamífero e pode, opcionalmente, compreender um receptor ou um ligando. A proteína de interesse pode compreender uma proteína que seja ela mesma capaz de induzir apoptose em células de mamífero ou 8 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ sem serem de mamífero in vitro ou in vivo, tal como o ligando de Apo-2/TRAIL, ligando de Fas, ou TNF-alfa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura IA mostra um gráfico ilustrando a viabilidade celular de células CHO criadas num biorreactor de 2 litros. Os dados mostram que as células criadas em biorreactores podem começar a perder viabilidade logo no dia 3, frequentemente seguida de uma queda dramática na viabilidade no dia ou dias seguintes. A Figura 1B mostra um gráfico ilustrando os resultados de três ensaios de apoptose efectuados nas células CHO (referidas na Figura IA e Exemplo 1): activação de caspase-3, fragmentação de ADN e ligação anexina/PI (alterações da membrana plasmática ("MP")). A activação de caspases foi detectada pela primeira vez no dia 3, no dia em que a queda na viabilidade foi detectada (Figura IA). A Figura 2 mostra uma análise Western blot de lisados de clones transfectados com caspase-9-DN. Um clone transfectado com um vector mpsv (sozinho) foi utilizado como controlo. O blot foi sondado com anti-soro de coelho anti-caspase-9 (Pharmingen) e revelado utilizando quimioluminescência. A Figura 3 mostra os resultados de um ensaio em que os clones 2 e 14 da caspase-9-DN, bem como os controlos (células E25 não transfectadas e células transfectadas com o vector mpsv) foram incubados com um indutor de apoptose, estaurosporina (1 micromolar). Foram tomadas amostras e as células foram analisadas quanto à % de células viáveis. A Figura 4 mostra uma análise da actividade da caspase-3 para amostras celulares tomadas 24 horas após indução com estaurosporina 1 micromolar.

As Figuras 5-8 mostram resultados do ensaio dos clones 2 e 14 que expressam caspase-9-DN, bem como dos controlos, aumentado em escala e semeado a 1 milhão de células/ml num biorreactor de 2 litros. Foram tomadas amostras diariamente que foram analisadas quanto à viabilidade (Fig. 5), contagem 9 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ de células viáveis (Fig. 6), actividade da caspase-3 (Fig. 7) e concentração da proteína de interesse (anticorpo E25) segregada para o meio (Fig. 8).

As Figuras 9-10 mostram os resultados do ensaio de células CHO semeadas em caixas de 60 mm e expostas ao inibidor de caspases, z-VAD-fmk (adicionado à cultura celular a uma concentração de 100 micromolar, 48 horas após serem semeadas). O inibidor z-VAD-fmk foi adicionado à cultura de 24 em 24 horas a partir daí. Foram tomadas amostras todos os dias e analisadas quanto à actividade da caspase-3 (Fig. 9) e à % de células viáveis (Fig. 10).

As Figuras 11-12 mostram os resultados de um clone que expressa p35 de Baculovírus criado num biorreactor de 2 litros e ensaiado diariamente quanto à viabilidade celular (Fig. 11) e actividade da caspase-3 (Fig. 12) . O controlo é um clone transfectado com um vector, cpc. A Figura 13 mostra um diagrama de barras dos efeitos de várias concentrações do reagente de transfecção, DMRIE-C, na viabilidade celular. A Figura 14 mostra uma comparação das eficiências de transfecção total e viável obtidas para o clone 14 de caspase-9-DN e controlos, células CHO DP12 e células CHO DP12 que expressam o anticorpo E25. A Figura 15 mostra uma comparação da produtividade específica (medida em título de ADNase/LDH total) obtida para o clone 14 de caspase-9-DN e controlos, células CHO DP12 e células CHO DP12 que expressam o anticorpo E25. A Figura 16 mostra uma comparação do título de ADNase obtido para o clone 14 de caspase-9-DN e controlos, células CHO DP12 e células CHO DP12 que expressam o anticorpo E25.

As Figuras 17 e 18 mostram a viabilidade e os títulos de caspase-9-DN e controlo de E25 criados em biorreactores de 2 litros com mudança de temperatura, meio concentrado e uma alimentação. 10 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ

As Figuras 19 e 20 mostram a viabilidade e contagem de células viáveis de culturas de controlo de E25 e de clone 14 de caspase-9-DN semeadas em vasos agitados (spinners) a partir de frascos congelados. Os dados foram obtidos através de exclusão de azul tripano.

As Figuras 21 e 22 mostram a viabilidade e os títulos de E25 de culturas de células de controlo de E25 e do clone 14 de caspase-9-DN após indução de expressão através de butirato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS I. Definições O termo "inibidor de apoptose" é aqui utilizado para referir uma molécula ou substância cuja expressão ou presença numa cultura celular in vitro proporciona uma redução ou inibição da apoptose nas células cultivadas, ou proporciona resistência das células cultivadas a estímulos apoptóticos. O inibidor de apoptose pode compreender uma proteína ou molécula semelhante a proteína, ou uma molécula orgânica ou inorgânica. O inibidor de apoptose pode estar presente (e/ou funcionar) intracelularmente, extracelularmente, ou à superfície celular (membrana) das células cultivadas. O inibidor de apoptose particular contemplado pelo presente invento inclui, mas não se limita a, o mutante dominante negativo da caspase-9 (caspase-9-DN), bcl-2, p35 de baculovírus, caspase-9S (Seol, D.W. et al., J. Biol. Chem. 274: 2072-2076, 1999), crmA, z-VAD-fmk, z-DEVD-fmk, B-D-fmk, e z-YVAD-fmk, e variantes destes. De preferência, o inibidor de apoptose é um que actua sobre uma ou mais caspases localizadas a jusante da via de morte celular intracelular da célula, tal como na caspase-3. Opcionalmente, o inibidor de apoptose diminuirá ou reduzirá, numa quantidade eficaz, a apoptose numa cultura celular em pelo menos 50%, de preferência, em pelo menos 75%, de maior preferência, em pelo menos 85%, e ainda de maior preferência, em pelo menos 95%, em comparação com uma cultura celular de controlo que não contenha um tal inibidor de apoptose. A apoptose ou actividade apoptótica em tais culturas celulares pode ser medida e determinada utilizando ensaios tais como os aqui descritos. Opcionalmente, o inibidor de apoptose, numa quantidade eficaz, estimulará ou aumentará o rendimento da 11 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ proteína recombinante de interesse em pelo menos 1 vez e de preferência em pelo menos 2 vezes, em comparação com uma cultura celular de controlo que não contenha tal inibidor de apoptose. Opcionalmente, o inibidor de apoptose, numa quantidade eficaz, estimulará ou aumentará a eficiência de transfecção em transfecções transientes, de preferência em pelo menos 1 vez e de maior preferência, em pelo menos 2 vezes, em comparação com uma cultura celular de controlo que não contenha um tal inibidor de apoptose. O termo "proteína de interesse" refere-se a qualquer proteína que possa ser útil para fins de investigação, diagnóstico ou terapia. A proteína de interesse pode compreender uma proteína de mamífero ou proteína sem ser de mamífero, e pode opcionalmente compreender um receptor ou um ligando. Proteínas de interesse exemplares incluem, mas não se limitam a, moléculas tais como renina; uma hormona de crescimento, incluindo hormona de crescimento humana e hormona de crescimento bovina; factor de libertação de hormona de crescimento; hormona paratiróide; hormona estimuladora da tiróide; lipoproteínas; antitripsina alfa-1; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; proinsulina; hormona estimuladora do folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação tais como o factor VIIIC, factor IX, factor tecidual, e factor de von Willebrands; factores anticoagulantes tais como Proteína C; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; um activador do plasminogénio, tal como uroquinase ou urina humana ou activador do plasminogénio de tipo tecidual (t-PA); bombesina; trombina; factor de crescimento hematopoiético; membros da família dos TNF e receptores de TNF (TNFR), tais como o factor de necrose tumoral-alfa e -beta, ligando de CD40, ligando de Apo-2/TRAIL, DR4, DR5, DcRl, DcR2, DcR3, OPG, ligando de Fas; encefalinase; RANTES (regulado na activação normalmente expresso e segregado por células T); proteína inflamatória dos macrófagos humanos (ΜΙΡ-1-alfa); uma albumina do soro tal como a albumina do soro humana; substância inibidora mulleriana; cadeia A da relaxina; cadeia B da relaxina; prorelaxina; péptido associado à gonadotrofina de ratinho; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; ADNase; IgE; um antigénio associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular 12 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ (VEGF); receptores para hormonas ou factores de crescimento; proteína A ou D; factores reumatóides; um factor neurotrófico tal como o factor neurotrófico derivado do osso (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um factor de crescimento dos nervos tal como NGF-β; factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF); factor de crescimento dos fibroblastos tal como FGF-α e FGF-β; factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-βΙ, TGF^2, TGF^3, TGF^4, ou TGF^5; factor de crescimento semelhante a insulina-I e II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação ao factor de crescimento semelhante a insulina; proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; factores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferão tal como interferão-alfa, -beta e -gama; factores estimuladores de colónias (CSF), p.ex., M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; trombopoietina (TPO); interleucinas (IL), p.ex., IL-1 a IL-10; superóxido-dismutase; receptores de células T; proteínas da superfície membranar; factor de aceleração do decaimento; antigénio virai tal como, for exemplo, uma porção do envelope da SIDA, gpl20; proteínas de transporte; receptores de retorno; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas tais como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, uma ICAM, VLA-4 e VCAM; um antigénio associado a tumores tal como o receptor HER2, HER3 ou HER4; e variantes e/ou fragmentos de qualquer um dos polipéptidos acima listados; bem como anticorpos contra vários antigénios proteicos como proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 e CD34; membros da família de receptores de ErbB tal como o receptor de EGF, ou o receptor HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Macl, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e a integrina αν/β3 incluindo a subunidade α ou β desta (p.ex. anticorpos anti-CDlla, anti-CD18 ou anti-CDllb); factores de crescimento tais como VEGF; IgE; antigénios do grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C; um receptor de Apo-2L tal como Apo-2 (DR5), DR4, DcRl, DcR2, DcR3; e variantes e/ou fragmentos dos anticorpos acima identificados, etc. Numa concretização do presente invento, a proteína de interesse compreenderá uma proteína que será ela mesma capaz de induzir apoptose em células de mamífero ou sem ser de mamífero in 13 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ vitro ou ίη vivo, tal como ligando de Apo-2/TRAIL, ligando de Fas, ou TNF-alfa. "Isolada", quando utilizada para descrever as várias proteínas de interesse aqui divulgadas, significa uma proteína que foi identificada e separada e/ou recuperada a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com utilizações de investigação, diagnóstico ou terapêuticas para a proteína de interesse, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, a proteína será purificada (1) até um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos de uma sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (2) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras utilizando Azul de Coomassie ou, de preferência, coloração de prata. A proteína isolada inclui a proteína in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural da proteína de interesse não estará presente. Vulgarmente, no entanto, a proteína isolada será preparada através de pelo menos um passo de purificação. O termo "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e estimuladores. O ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou líder de secreção está operativamente ligado ao ADN para um polipéptido se for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou estimulador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma 14 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ sequência de codificação se estiver posicionado de modo a permitir a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a ligar são contíguas e, no caso de um líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os estimuladores não têm de ser contíguos. A ligação é alcançada através da união em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existirem, são utilizados adaptadores ou ligadores oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional.

Tal como aqui se utiliza, as expressões "célula", "linha celular" e "cultura celular" são utilizadas alternadamente e todas as designações incluem a descendência. Assim, os termos "transformantes" e "transfectantes" incluem a célula primária sujeito e culturas derivadas desta sem considerar o número de transferências. "Fase de crescimento" da cultura celular refere-se ao período de crescimento celular exponencial (a fase ligarítmica) onde as células estão geralmente em rápida divisão. Durante esta fase, as células são cultivadas durante um período de tempo, habitualmente entre 1-4 dias e sob condições que maximizem o crescimento celular. A determinação do ciclo de crescimento para a célula hospedeira pode ser determinada para a célula hospedeira particular considerada sem demasiada experimentação. "Período de tempo e sob condições que maximizem o crescimento celular" e semelhantes, referem-se às condições de cultura que, para uma determinada linha celular, são determinadas como sendo óptimas para o crescimento e divisão celulares. Durante a fase de crescimento, as células são cultivadas em meio nutriente contendo os aditivos necessários geralmente a cerca de 30-40°C, de preferência cerca de 37°C, numa atmosfera húmida, controlada, para que seja alcançado o crescimento óptimo para a linha celular particular. As células são mantidas na fase de crescimento durante um período de cerca de entre um e quatro dias, habitualmente entre dois e três dias. "Fase de transição" da cultura celular refere-se ao período de tempo durante o qual são iniciadas as condições de cultura para a fase de produção. Durante a fase de transição, factores ambientais tais como pH, concentração iónica e 15 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ temperatura podem ser mudados das condições de crescimento para as condições de produção. "Fase de produção" da cultura celular refere-se ao período de tempo durante o qual o crescimento celular atinge um patamar. Durante a fase de produção, o crescimento celular logarítmico terminou e a produção de proteína é primária. Durante este período de tempo o meio é geralmente suplementado para suportar a produção contínua de proteína e para alcançar o produto proteico desejado. O termo "expressão" ou "expressa" é aqui utilizado para referir a transcrição e tradução que ocorrem dentro de uma célula hospedeira. O nível de expressão de um gene de produto numa célula hospedeira pode ser determinado com base na quantidade de ARNm correspondente que está presente na célula ou na quantidade de proteína codificada pelo gene de produto que é produzida pela célula. Por exemplo, o ARNm transcrito de um gene de produto é desejavelmente quantificado através de hibridação de Northern. Ver, p.ex., Sambrook et al.r "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", págs. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A proteína codificada por um gene de produto pode ser quantificada através de ensaio da actividade biológica da proteína ou empregando ensaios que são independentes de tal actividade, tais como Western blotting ou radioimunoensaio utilizando anticorpos que sejam capazes de reagir com a proteína. Ver, p.ex., Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", págs. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Os termos "apoptose" e "actividade apoptótica" são utilizados num sentido amplo e referem-se à forma ordenada ou controlada de morte celular em células de mamífero ou sem ser de mamífero que é tipicamente acompanhada de uma ou mais alterações celulares características, incluindo condensação do citoplasma, perda de microvilosidades da membrana plasmática, activação de uma ou mais caspases, segmentação do núcleo, degradação do ADN cromossómico ou perda da função mitocondrial. Esta actividade pode ser determinada e medida, por exemplo, através de ensaios da viabilidade celular, análise FACS, ligação de anexina V, ou electroforese de ADN tal como é conhecido na especialidade e melhor descrito aqui. 16 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ II. Os Métodos do Invento

As células criadas em cultura celular podem começar a perder a viabilidade dentro de dias desde o inicio da cultura. A perda de viabilidade celular pode ser particularmente problemática quando se cultivam as células em culturas à escala de produção relativamente grandes ou biorreactores. Por exemplo, células CHO criadas em cultura de lotes podem começar a perder a viabilidade celular logo no Dia 4 após o que um rápido declinio na viabilidade pode continuar até a cultura ser terminada. O mecanismo através do qual tais células cultivadas morrem pode ser através de necrose ou apoptose. Utilizando ensaios de ligação TUNEL e Anexina/PI, os Requerentes descobriram que aproximadamente 80% de algumas células CHO criadas em cultura de lotes morrem através de apoptose em vez de necrose. Tal como aqui descrito, os Requerentes encontraram surpreendentemente métodos que permitem uma marcada redução de tal apoptose.

Os métodos divulgados no presente pedido têm uma variedade de aplicações e melhoramentos para a produção de proteínas recombinantes. Primeiro, ao prolongar a viabilidade da célula hospedeira em cultura (e durante a fermentação) , um perito na especialidade pode aumentar a produção e o rendimento da proteína de interesse. Isto pode melhorar a eficiência da cultura celular e resultar em marcada redução de custos. Mais, os Requerentes verificaram que a utilização de um ou mais inibidores de apoptose nos métodos do presente invento pode proteger contra efeitos adversos de agentes tais como butirato ou TSA incluídos na cultura celular. Também, os métodos daqui podem aumentar a qualidade da proteína de interesse expressa e recuperada. A qualidade da proteína de interesse expressa e recuperada pode ser avaliada utilizando técnicas conhecidas na especialidade, tais como SDS-PAGE, etc. A ocorrência de morte celular em culturas de células recombinantes resulta frequentemente na libertação de várias proteínas activas pelas células a morrer, tais como proteases (Lao, M., et al., Cytotechnology 22: 43-52, 1996; Teige, M., et al., J. Biotechnol. 34: 101-105, 1994), glicosidases tais como sialidase ou β-galactosidase (Gramer M.J. e Goochee C.F., Biotechnol. Prog. 9: 366-373, 1999), ou prolina-isomerase 17 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ (Schmid, Current Biology 5: 933-944, 1995). Estas e outras destas proteínas são frequentemente capazes de degradar a qualidade do produto ou função da proteína ou proteínas recombinantes desejadas a expressar, por exemplo, através de clivagem indesejada, modificação de hidratos de carbono (modificação de glicoproteínas) (Wittwer A., e Howard, S.C., Biochem. 29: 4175-4180, 1990; Hart, Curr. Op. Cell Biol. 4: 1017-1023, 1992; Goochee, et al., Bio/Technology 9: 1347-1355, 1991), ou modificação da estrutura proteica (tal como dobragem ou agregação). Ao diminuir ou inibir a apoptose na cultura celular, os presentes métodos podem diminuir o número ou a presença de tais proteases adversas no meio de cultura e proteger a proteína de interesse expressa contra degradação proteolítica.

Os métodos daqui podem ainda ser empregues para aumentar a eficiência de transfecção e a viabilidade das células durante a transfecção. Os reagentes utilizados em várias técnicas de transfecção, tais como Lipofectamina ou DMRIE-C (Gibco), podem ser relativamente tóxicos para as células quando utilizados em concentrações mais elevadas. A utilização de concentrações mais elevadas de reagentes de transfecção, no entanto, será particularmente útil para se alcançar eficiências de transfecção mais elevadas. A expressão do inibidor de apoptose e/ou a adição de inibidor de apoptose directamente ao meio de cultura das células podem ser utilizadas para reduzir ou inibir a morte celular mesmo quando são seleccionadas tais concentrações mais elevadas de um reagente de transfecção. A utilização do inibidor de apoptose deste modo pode resultar numa eficiência de transfecção mais elevada e num rendimento mais elevado da proteína recombinante de interesse.

Os métodos divulgados podem ainda ser utilizados para expressar proteínas de interesse que sejam proteínas que induzam elas próprias apoptose. Tais proteínas como ligando de Apo-2/TRAIL ou ligando de Fas, podem desencadear apoptose quando expressas em células. A presença de um ou mais inibidores de apoptose, de acordo com os presentes métodos, pode bloquear tal actividade apoptótica e permitir uma melhor expressão da proteína de interesse. 18 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ

Adicionalmente, os métodos podem ser utilizados para aumentar a viabilidade de células sujeitas a procedimentos de congelação/armazenamento/descongelação. Durante estes procedimentos as células podem, geralmente, perder viabilidade. A presença de um ou mais inibidores de apoptose expressos nas células (ou adicionados ao meio de cultura celular) pode proporcionar uma maior viabilidade celular e ajudar na redução ou eliminação das variabilidades na viabilidade celular entre alíquotas ou frascos de células.

Os métodos de acordo com o presente invento são descritos com mais detalhe abaixo. O ADN que codifica a proteína de interesse pode ser obtido a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, a partir de qualquer biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido que se creia possuir o seu ARNm e expressando-o a um nível detectável. O gene que codifica a proteína de interesse pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou através de síntese oligonucleotídica. A pesquisa de uma tal biblioteca de ADNc ou genómica com uma sonda seleccionada pode ser conduzida utilizando procedimentos padrão, tal como descrito em Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene que codifica a proteína de interesse é utilizar metodologia de PCR (Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., "PCR Primer: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)). Várias proteínas de interesse foram especialmente referidas acima e as suas respectivas sequências génicas são geralmente conhecidas e estão publicamente disponíveis.

Genes que codificam vários inibidores de apoptose foram também descritos na literatura (ver p.ex., Ciem R.J. et al., Science 254: 1388-1390, 1991; Duan, H. et al., J. Biol. Chemistry 271: 16720-16724, 1996; Pan, G. et al., J. Biol.

Chemistry 273: 5841-5845, 1998; Vaux, D.L. et al., Science 258: 1955-1957, 1998; Tsujimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 83: 5214-5218, 1986). Os métodos do presente invento contemplam a utilização de um único gene codificando um inibidor de apoptose bem como a utilização de uma combinação 19 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ de dois ou mais genes que codificam inibidores de apoptose. Potencialmente, a expressão de dois ou mais tipos de inibidor ou inibidores de apoptose numa célula hospedeira pode ser benéfica no controlo da apoptose na cultura celular. Um perito na especialidade pode monitorizar a quantidade ou proporção de inibidor de apoptose expresso pelas células hospedeiras, tal como através de análise Western blot utilizando um anticorpo que reconheça o inibidor de apoptose. A quantidade ou proporção de inibidor de apoptose, bem como o momento da sua expressão, podem ser regulados ou monitorizados, por exemplo, através da escolha de um vector com um promotor indutivel.

Quando seleccionam um inibidor de apoptose para utilização nos métodos reivindicados, os peritos na especialidade reconhecerão que várias moléculas inibidoras de apoptose podem actuar sobre diferentes componentes intracelulares da via de sinalização que conduz à morte celular. As vias envolvidas na morte celular compreendem uma família de cisteína-proteases, designadas caspases, que são aparentadas com a enzima conversora da interleucina-1 beta de mamífero (caspase-1) e com Ced-3, o produto de um gene de C. elegans. Crê-se que tais moléculas de caspase podem actuar pelo menos a dois níveis diferentes. As caspases iniciadoras são tipicamente moléculas "a montante" que são activadas em resposta a estímulos indicando que a célula foi sujeita stress, danificada ou recebeu alguma forma de sinal para iniciar morte celular por apoptose. Um exemplo de uma tal caspase a montante é a caspase-8. As caspases iniciadoras podem então, por sua vez, clivar e activar outra família de caspases "a jusante", tais como a caspase-3. Dependendo da natureza do estímulo apoptótico bem como do tipo celular, apenas uma porção da via de sinalização pode estar envolvida no mecanismo de sinalização e execução de morte celular. Por exemplo, crê-se que certos inibidores de apoptose, tais como CrmA, actuem sobre caspases, tais como a caspase-8, localizadas a montante e são habitualmente directamente activadas através da ligação de um ligando a um receptor de morte. Crê-se que outros inibidores de apoptose actuam sobre outras caspases localizadas a jusante na via de sinalização intracelular. Assim, crê-se actualmente que os inibidores da molécula ou das moléculas que estão de facto envolvidas (tal como activamente envolvidas na transmissão de sinal) no 20 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ aparelho de morte celular numa célula seleccionada serão eficazes como inibidores de apoptose, tal como aqui descrito. Os Requerentes observam, no entanto, que os peritos na especialidade compreenderão que em tais vias de sinalização existe um ponto no qual a célula está "comprometida" com a morte celular, e após a via de sinalização ter transmitido um sinal ou sinais até ao ponto onde a célula fica comprometida com morte celular, as moléculas inibidoras de apoptose, como as aqui descritas, podem não ser eficazes na inibição ou prevenção da apoptose da célula "comprometida". O modificador da resposta a citoquinas, CrmA, é uma serpina de 38 kDa identificada a partir do vírus de varíola bovina que foi relatada como inibindo apoptose em vários sistemas (Gagliardini et al., Science 263: 826-828, 1994; Tewari et al., J. Biol. Chem. 270: 3255-3260, 1995). CrmA foi avaliada como inibidor da caspase-1 e da caspase-8 (Nicholson et al., Nature 376: 37-43, 1995; Zhou et al., J. Biol. Chem. 272: 7797-7800, 1997). Nalguns estudos conduzidos pelos

Requerentes, foi observado que a sobre-expressão de CrmA em células CHO dhfr+ foi incapaz de atrasar substancialmente a morte celular no ambiente de um biorreactor. Este resultado sugeriu que neste sistema particular de células CHO seleccionado pelos Requerentes, nem a caspase-1 nem a caspase-8 estavam activamente envolvidas na via de morte celular das células cultivadas particulares. Deste modo, para alcançar os efeitos aqui desejados, é preferível seleccionar uma molécula inibidora de apoptose que actue a jusante na via de sinalização de morte celular da célula hospedeira seleccionada, mas antes do ponto onde a célula ficou comprometida com a morte celular.

Os ácidos nucleicos (p.ex., ADNc ou ADN genómico) codificando a proteína de interesse e o inibidor de apoptose podem ser inseridos num vector ou vectores replicáveis para expressão. Vários vectores estão disponíveis ao público. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição, cada um dos quais é descrito abaixo. Sequências sinal, origens de replicação, genes marcadores, elementos 21 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ estimuladores e sequências terminadoras da transcrição opcionais que podem ser empregues são conhecidos na especialidade e descritos com mais detalhe em W097/25428.

As técnicas para inserção de tais genes em vectores são bem conhecidas dos peritos e tais técnicas podem ser alcançada sem demasiada experimentação. A construção de vectores adequados pode empregar técnicas de ligação padrão. Os plasmídeos isolados ou fragmentos de ADN são clivados, cortados à medida e novamente ligados na forma desejada para gerar os plasmídeos necessários. Podem ser empregues as técnicas conhecidas na especialidade (ver, p.ex., Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309, 1981; Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499, 1980). O gene que codifica o inibidor de apoptose e o gene que codifica a proteína de interesse podem ser inseridos num único vector (co-transfectado), ou serem inseridos em dois vectores separados ou diferentes. De preferência, os respectivos genes são inseridos em dois vectores separados. Cada um desses vectores conterá tipicamente um gene de selecção, também designado um marcador seleccionável. Genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, p.ex., ampicilina, neomicina, puromicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, p.ex., o gene que codifica D-alanina-racemase para Bacilli.

Um exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para tomar o ácido nucleico codificador, tais como DHFR ou timidina-quinase. Uma célula hospedeira apropriada quando é empregue DHFR de tipo selvagem é a linha celular CHO deficiente na actividade de DHFR, preparada e propagada tal como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216, 1980. Um gene de selecção adequado para utilizar em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282: 39, 1979; Kingsman et al., Gene 7: 141, 1979; Tschemper et al., Gene 10: 157, 1980) . O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade de 22 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N.° 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12, 1977).

Nos métodos que empregam um primeiro vector compreendendo um gene de inibidor de apoptose e um segundo vector compreendendo um gene que codifica a proteína de interesse, é preferível que o primeiro e o segundo vectores possuam marcadores de selecção diferentes. Por exemplo, um vector compreendendo o gene do inibidor de apoptose pode possuir um gene de selecção para conferir resistência a ampicilina enquanto o vector compreendendo o gene que codifica a proteína de interesse poderá possuir um gene de selecção para conferir resistência a metotrexato.

Os vectores de expressão contêm também habitualmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado à sequência ou sequências de ácido nucleico inseridas descritas acima. Os promotores são sequências não traduzidas localizadas a montante (5') do codão de início de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controla a transcrição e tradução de uma determinada sequência de ácido nucleico, à qual eles estão operativamente ligados. Tais promotores caem tipicamente em duas classes, indutíveis e constitutivos. Os promotores indutíveis são promotores que iniciam níveis aumentados de transcrição a partir do ADN sob o seu controlo em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, p.ex., a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança na temperatura. Neste momento é bem conhecido um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras. Estes promotores são operativamente ligados ao ADN codificador através de remoção do promotor do ADN fonte por digestão com enzimas de restrição e inserção da sequência promotora isolada no vector.

Promotores adequados para utilizar com hospedeiros procarióticos e eucarióticos são conhecidos na especialidade e são descritos em maior detalhe em W097/25428.

Podem ser empregues vectores de expressão que proporcionem a expressão transiente do ADN codificando a proteína de interesse. Em geral, a expressão transiente 23 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ envolve a utilização de um vector de expressão que seja capaz de se replicar eficientemente numa célula hospedeira, de modo a que a célula hospedeira acumule muitas cópias do vector de expressão e, por sua vez, sintetize niveis elevados de uma proteína desejada codificada pelo vector de expressão (Sambrook et al., supra) . Os sistemas de expressão transiente, compreendendo um vector de expressão adequado e uma célula hospedeira, permitem a identificação positiva conveniente das proteínas codificadas pelos ADN clonados, bem como a pesquisa rápida de tais proteínas quanto às propriedades biológicas ou fisiológicas desejadas.

As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com os vectores de expressão acima descritos para produção da proteína de interesse e cultivadas em meios nutrientes modificados conforme apropriado para indução dos promotores, selecção dos transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas. A transfecção refere-se à tomada de um vector de expressão por uma célula hospedeira sejam ou não realmente expressas quaisquer sequências de codificação. São conhecidos das pessoas competentes na matéria numerosos métodos de transfecção, por exemplo, CaPC>4 e electroporação. A transfecção bem sucedida é geralmente reconhecida quando qualquer indicação da operação deste vector ocorre dentro da célula hospedeira. Tal como descrito acima, a utilização de um gene de inibidor de apoptose (ou a adição de uma molécula inibidora de apoptose directamente ao meio de cultura) pode melhorar a eficiência de transfecção. Crê-se que a utilização de um tal ou tais inibidores de apoptose permitirá a utilização de quantidades maiores de reagentes de transfecção, tais como Lipof ectamina ou DMRIE-C (tal como descrito nos Exemplos abaixo). "Transformação" significa a introdução de ADN num organismo de modo a que o ADN seja replicável, como um elemento extracromossómico ou como integrante cromossómico. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas padrão apropriadas a tais células. O tratamento de cálcio empregando cloreto de cálcio, tal como descrito em Sambrook et al., supra, ou a electroporação são 24 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ geralmente utilizados para procariotas ou outras células que contenham barreiras de parede celular substanciais. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de certas células vegetais, tal como descrito por Shaw et al., Gene 23: 315, 1983 e WO 89/05859 publicado a 29 de Junho de 1989. Adicionalmente, as plantas podem ser transfectadas utilizando tratamento de ultra-sons tal como descrito em WO 91/00358 publicado a 10 de Janeiro de 1991. Para células de mamífero sem tais paredes celulares, pode ser empregue o método de precipitação em fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology 52: 456-457, 1978. Os aspectos gerais das transformações de sistemas de células hospedeiras de mamífero foram descritos na Patente U.S. 4399216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact. 130: 946, 1977 e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76: 3829, 1979. No entanto, podem também ser utilizados outros métodos para a introdução de ADN nas células, tais como através de microinjecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, p.ex., polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para transformação de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology 185: 527-537, 1990 e Mansour et al., Nature 336: 348-352, 1988.

Células hospedeiras adequadas para expressão do ADN nos vectores daqui incluem células procarióticas, de levedura ou eucarióticas superiores. Procariotas adequados incluem mas não se limitam a eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como E. coli. Várias estirpes de E. coli estão disponíveis ao público, tais como a estirpe de E. coli K12, MM294 (ATCC 31446); E. coli X1776 (ATCC 31537); estirpe W3110 (ATCC 27325) e K5772 (ATCC 53635) de E. coli; Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ex., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ex., Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (p.ex., B. licheniformis 41P divulgada em DD 266710 publicada a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces.

Para além dos procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são adequados. 25 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ

Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucariótico inferior vulgarmente utilizado. Células hospedeiras adeguadas podem ser derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de insecto tais como S2 de Drosophila e Sf9 de Spodoptera, bem como células vegetais. Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e COS. Exemplos mais específicos incluem a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad Sei. USA 77: 4216, 1980); dpl2.CHO (EP 307247 publicada a 14 de Março de 1989), células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2. HB 8065), e tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51). A selecção da célula hospedeira apropriada é considerada fazendo parte dos conhecimentos de um perito na especialidade. A selecção de um determinado inibidor de apoptose para empregar com uma determinada célula hospedeira e proteína de interesse pode ser feita sem demasiada experimentação por uma pessoa competente na matéria.

As células procarióticas utilizadas para produzir a proteína de interesse podem ser cultivadas em meio de cultura adeguado tal como descrito geralmente em Sambrook et al., supra. Formas particulares de meios de cultura gue podem ser empregues para cultivar CHO são melhor descritas nos Exemplos abaixo. As células hospedeiras de mamífero utilizadas para produzir a proteína de interesse podem ser cultivadas numa variedade de meios de cultura. As condições de cultura adeguadas para células de mamífero são bem conhecidas na especialidade (J. Immunol. Methods 56: 221-234, 1983) ou podem ser facilmente determinadas pelo perito na especialidade (ver, por exemplo, "Animal Cell Culture: A Practical Approach" 2a Ed., Rickwood, D. e Hames, B.D., eds. Oxford University Press, 26 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ

New York, 1992), e variam de acordo com a célula hospedeira particular seleccionada.

Exemplos de meios de cultura comercialmente disponíveis incluem FIO de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma). Adicionalmente, pode ser utilizado qualquer um dos meios descritos em Ham e Wallace, Meth. Enz. 58: 44, 1979; Barnes e Sato, Anal. Biochem. 102: 255, 1980;

Patentes U.S. 4767704; 4657866; 4927762; 5122469 ou 4560655;

Publicações Internacionais WO 90/03430; e WO 87/00195. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco Gentamicina™) , elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presentes em concentrações finais no intervalo micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos nas concentrações apropriadas que serão conhecidas dos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão evidentes para os peritos na especialidade. Os factores de crescimento necessários para uma determinada célula são facilmente determinados empiricamente sem demasiada experimentação, tal como descrito por exemplo em "Mammalian Cell Culture" (Mather, J.P. ed., Plenum Press, N.Y., 1984), e Barnes e Sato, Cell 22: 649, 1980.

Outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese da proteína de interesse em cultura de células recombinantes de vertebrado são descritos em Gething et ai., Nature 293: 620-625, 1981; Mantei et ai., Nature 281: 40-46, 1979; EP 117060; e EP 117058. Em general, os princípios, protocolos e as técnicas práticas para maximizar a produtividade das culturas de células de mamífero podem ser verificados em "Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach", M. Butler, ed. (IRL Press, 1991). 27 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ A quantidade de inibidor de apoptose adicionada directamente, ou misturada com o meio de cultura dependerá de vários factores, por exemplo, do tipo de molécula inibidora de apoptose a empregar, do tipo de célula hospedeira, das condições de cultura, etc. A determinação da concentração desejada de inibidor de apoptose a adicionar ao meio de cultura faz parte dos conhecimentos de um perito na especialidade e pode ser avaliada empiricamente sem demasiada experimentação. De preferência, uma quantidade eficaz ou concentração desejada de inibidor de apoptose adicionada directamente ao meio de cultura é uma em que o inibidor de apoptose penetre na célula hospedeira. O perito na especialidade reconhecerá facilmente que diferentes inibidores de apoptose podem ter diferentes capacidades para penetrar na célula hospedeira, e portanto, deve-se escolher uma concentração que permita tal penetração na célula hospedeira. Existirá tipicamente um intervalo superior de concentração de inibidor de apoptose que pode não ser desejável uma vez que a concentração se aproxima de um intervalo que é adverso ou tóxico para as células hospedeiras. Tal como descrito nos

Exemplos abaixo, os Requerentes verificaram que z-VAD-fmk pode inibir a apoptose quando adicionado a culturas celulares a uma concentração de cerca de 100 micromolar. Uma variedade de compostos inibidores de apoptose tais como z-VAD-fmk, z-DEVD-fink, B-D-fmk e z-YVAD-fmk está disponível em vendedores, tais como Pharmingen e Enzyme Systems, Livermore, CA. O inibidor de apoptose pode ser adicionado directamente no meio de cultura. O inibidor de apoptose pode ser adicionado em qualquer ponto durante a cultura das células. Opcionalmente, o inibidor de apoptose é adicionado ao meio de cultura no começo (no momento da iniciação, dia 0) do processo de cultura das células. De preferência, um tal inibidor de apoptose será adicionado ao meio de cultura durante a cultura das células mas antes do ponto em que ocorre a indução de apoptose; tipicamente, a indução de apoptose pode ser observada em culturas celulares de larga escala a cerca do dia 3 ou dia 4 da cultura, e portanto, o inibidor de apoptose será de preferência adicionado antes do dia 3 ou dia 4. Opcionalmente, uma quantidade desejada de inibidor de apoptose é adicionada ao longo ou durante a duração da cultura celular, por exemplo, numa base diária durante toda a fermentação. Como 28 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ exemplo, para uma cultura de 5 dias, o inibidor de apoptose pode ser adicionado no dia 0 e de 24 em 24 horas a partir daí até a cultura ser terminada.

No presente invento, a célula hospedeira seleccionada é uma célula CHO, de preferência uma célula dpl2.CHO. Numa concretização, o meio de cultura seleccionado contém um componente básico do meio tal como uma formulação baseada em DMEM/HAM F-12 (para a composição do meio DMEM e HAM F12 e especialmente meios isentos de soro, ver as formulações de meios de cultura no Catálogo de Linhas Celulares e Hibridomas da American Type Culture Collection, Sexta Edição, 1988, páginas 346-349) (a formulação do meio tal como descrita na Patente U.S. 5122469 é particularmente apropriada) com concentrações modificadas de alguns componentes tais como aminoácidos, sais, açúcar e vitaminas, e contendo opcionalmente glicina, hipoxantina e timidina; insulina humana recombinante, peptona hidrolisada, tal como Primatone HS ou Primatone RL (Sheffield, Inglaterra), ou o equivalente; um agente protector celular, tal como Pluronic F68 ou o equivalente poliol Pluronic; Gentamicina; e elementos vestigiais. De preferência, o meio de cultura celular seleccionado é isento de soro.

As proteínas de interesse podem ser produzidas criando as células hospedeiras sob uma variedade de condições de cultura celular. Por exemplo, os procedimentos de cultura celular para a produção de proteínas em grande ou pequena escala são potencialmente úteis dentro do contexto do presente invento. Podem ser utilizados procedimentos incluindo, mas não se limitando a, um biorreactor de leito fluido, biorreactor de fibra oca, cultura em frascos rolantes, ou sistema biorreactor de tanque com agitação, nos últimos dois sistemas, com ou sem microtransportadores, e operados alternativamente num modo de lotes, alimentado em lotes ou contínuo.

Numa concretização preferida, a cultura celular do presente invento é efectuada num sistema biorreactor de tanque com agitação e é empregue um procedimento de cultura alimentada em lotes. No sistema biorreactor preferido, o tamanho dos biorreactores é suficientemente grande para produzir a quantidade desejada da proteína de interesse, tal 29 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ como um tamanho de 1000 Litros ou 12 000 Litros, mas não se limita a tais tamanhos uma vez que podem ser apropriados vasos biorreactores de tamanho muito menor (i.e., 2 Litros, 400 Litros) ou maior (i.e., 25 000 Litros, 50 000 Litros). Na cultura alimentadas em lotes preferida, as células hospedeiras de mamífero e o meio de cultura são fornecidos inicialmente a um vaso de cultura e nutrientes adicionais da cultura são fornecidos, continuamente ou em aumentos discretos, à cultura durante a sua duração, com ou sem colheita periódica de células e/ou de produto antes da terminação da cultura. A cultura alimentada em lotes pode incluir, por exemplo, uma cultura alimentada em lotes semi-contínua, em que periodicamente toda a cultura (incluindo células e meio) é removida e substituída por meio fresco. A cultura alimentada em lotes é distinta da cultura de lote simples em que todos os componentes para a cultura das células (incluindo as células e todos os nutrientes da cultura) são fornecidos ao vaso de cultura no início do processo de cultura. A cultura alimentada em lotes pode ainda ser distinguida da cultura de perfusão por o sobrenadante não ser removido do vaso de cultura durante o processo mas na terminação do processo de cultura (na cultura de perfusão, as células são restringidas na cultura através, p.ex., de filtração, encapsulação, ancoramento a microtransportadores etc. e o meio de cultura é introduzido continuamente ou intermitentemente e removido do vaso de cultura).

Mais, as células cultivadas podem ser propagadas de acordo com qualquer esquema ou rotina que possa ser adequado para a célula hospedeira particular e o plano de produção particular contemplado. Por essa razão, o presente invento contempla um procedimento de cultura de um único passo ou de múltiplos passos. Numa cultura de um único passo, as células hospedeiras são inoculadas num ambiente de cultura e os passos do método do presente invento são empregues durante uma única fase de produção da cultura celular. Alternativamente, é considerada a cultura de múltiplos estádios. Na cultura de múltiplos estádios, as células podem ser cultivadas em vários passos ou fases. Por exemplo, as células podem ser criadas num primeiro passo ou cultura em fase de crescimento em que as células, possivelmente removidas do armazenamento, são inoculadas num meio adequado para promoção do crescimento e 30 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ elevada viabilidade. As células podem ser mantidas na fase de crescimento durante um período de tempo adequado através da adição de meio fresco à cultura de células hospedeiras.

De acordo com um aspecto preferido do presente invento, as condições de cultura celular alimentada em lotes ou contínua são consideradas para aumentar o crescimento das células de mamífero na fase de crescimento da cultura celular. Na fase de crescimento, as células são criadas sob condições e durante um período de tempo que é maximizado para o crescimento. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, oxigénio dissolvido (dC>2) e semelhantes, são as utilizadas com o hospedeiro particular e serão evidentes para uma pessoa competente na matéria. Geralmente, o pH é ajustado a um nível entre cerca de 6,5 e 7,5 utilizando um ácido (p.ex., CO2) ou uma base (p.ex., Na2CC>3 ou NaOH) . Um intervalo de temperatura adequado para cultura de células de mamífero tais como células CHO é entre cerca de 30 a 38°C e de preferência cerca de 37°C e um dC>2 adequado é entre 5-90% de saturação do ar. A um determinado intervalo as células podem ser utilizadas para inocular uma fase ou passo de produção da cultura celular. Alternativamente, tal como descrito acima, a fase ou passo de produção pode ser contínuo com a inoculação ou fase de crescimento ou passo.

De acordo com o presente invento, o ambiente da cultura celular durante a fase de produção da cultura celular é controlado. De acordo com os passos dos métodos actualmente divulgados, a concentração de inibidor de apoptose no meio de cultura pode ser manipulada de modo a que o teor e a qualidade desejados da proteína de interesse sejam alcançados e mantidos no fluido da cultura celular resultante. Num aspecto preferido, a fase de produção da cultura celular é precedida de uma fase de transição da cultura celular em que está envolvida a expressão ou adição de inibidor ou inibidores de apoptose para a fase de produção da cultura celular. As concentrações de inibidor ou inibidores de apoptose são de preferência monitorizadas em ligação com outros parâmetros do processo tais como a osmolalidade da fase de produção uma vez que a osmolalidade pode afectar a produtividade específica da célula. 31 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ

Em qualquer um dos métodos acima descritos, está contemplado que pode ser desejável incluir uma quantidade desejada de agente tal como butirato ou TSA no meio de cultura das células. São conhecidas na especialidade várias formas de butirato e seus sais, tais como ácido butirico e butirato de sódio, e estão disponíveis ao público em fontes tais como Sigma Chemical Co. Foi relatado na literatura que o butirato aumenta a produtividade e a expressão proteica de culturas celulares (Arts et al., Biochem J. 310: 171-176, 1995; Gorman et al., Nucleic Acids Res. 11: 7631-7698, 1983; Krugh, Mol. Cell. Biochem. 42: 65-82, 1982; Lamotte et al., Cytotechnology 29: 55-64, 1999; Chotigeat et al., Cytotechnology 15: 217-221, 1994) . A tricostatina A (TSA) é um inibidor da histona-desacetilase e pode actuar de modo semelhante ao butirato no aumento da produtividade e expressão proteica em culturas celulares (Medina et al., Câncer Research 57: 3697-3707, 1997) . Embora o butirato tenha alguns efeitos positivos na expressão proteica, é também reconhecido na especialidade que em certas concentrações o butirato pode induzir apoptose nas células cultivadas e deste modo diminuir a viabilidade da cultura bem como a densidade de células viáveis (Hague et al., Int. J. Câncer 55: 498-505, 1993; Calabresse et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 195: 31-38, 1993; Fillipovich et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 198: 257-265, 1994; Medina et al., Câncer Research 57: 3697-3707, 1997). Nos métodos do presente invento, pode ser adicionada uma quantidade desejada de butirato ou TSA à cultura celular no surgimento da fase de produção e, de preferência, pode ser adicionada à cultura celular após ter sido implementada uma mudança de temperatura. O butirato ou TSA pode ser adicionado numa quantidade desejada determinada empiricamente pelos peritos na especialidade, mas de preferência o butirato é adicionado à cultura celular a uma concentração de cerca de 1 a cerca de 25 mM, e de maior preferência, a uma concentração de cerca de 1 a cerca de 6 mM. A expressão da proteína de interesse pode ser medida numa amostra directamente, por exemplo, através de ELISA, Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 5201-5205, 1980), dot blotting (análise de ADN), ou hibridação in situ, utilizando uma sonda apropriadamente marcada. Podem 32 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ ser empregues vários marcadores, muito vulgarmente radioisótopos, e particularmente 32P. No entanto, podem também ser empregues outras técnicas, tais como a utilização de nucleótidos modificados com biotina para introdução num polinucleótido. A biotina serve então como local para ligação a avidina ou anticorpos, que podem ser marcados com uma ampla variedade de marcadores, tais como radionucleótidos, fluorescentes ou enzimas. Alternativamente, podem ser empregues anticorpos que possam reconhecer dúplices específicos, incluindo dúplices de ADN, dúplices de ARN, e dúplices híbridos de ADN-ARN ou dúplices de ADN-proteína. Os anticorpos podem por sua vez ser marcados e o ensaio pode ser realizado quando o dúplex se liga a uma superfície, de modo que após a formação do dúplex à superfície possa ser detectada a presença do anticorpo ligado ao dúplex. A expressão génica, alternativamente, pode ser medida através de métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecido e ensaio da cultura celular ou de fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto génico. Com técnicas de coloração imuno-histoquímicas, é preparada uma amostra celular, tipicamente através de desidratação e fixação, seguida de reacção com anticorpos marcados específicos para o produto génico ligado, onde os marcadores são habitualmente visualmente detectáveis, tais como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes e semelhantes.

Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. É habitualmente necessário recuperar ou purificar a proteína de interesse a partir de proteínas ou polipéptidos de células recombinantes para obter preparações que sejam substancialmente homogéneas. Como primeiro passo, o meio de cultura ou lisado pode ser centrifugado para remover restos celulares particulados. A proteína de interesse é a partir daí purificada de proteínas e polipéptidos solúveis contaminantes, sendo os seguintes procedimentos exemplares de procedimentos de purificação adequados: através de fraccionamento numa 33 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ coluna de permuta iónica; precipitação em etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em silica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatografia em colunas de proteína A-Sepharose, cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação em sulfato de amónio; e filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75. A proteína de interesse recuperada ou purificada será tipicamente analisada através de um ou mais dos seguintes métodos: electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, HPLC, espectrometria de massa de uma digestão tríptica, análise das glicoproteínas e ensaios de actividade.

Os seguintes exemplos são dados apenas para fins ilustrativos, e não se pretende que limitem de modo algum o âmbito do presente invento.

EXEMPLOS

Os reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante a menos que indicado em contrário. A fonte das células identificadas nos seguintes exemplos, e ao longo do fascículo, a menos que indicado em contrário, é a American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia. EXEMPLO 1

Morte Celular Apoptótica em Biorreactores Células adaptadas a crescimento sem soro, CHO (dhfr+) foram aumentadas em escala e semeadas a 1 milhão de células/ml em biorreactores de 2 litros (n=2). O meio da cultura celular foi um meio baseado em DMEM/Ham F-12 sem soro contendo insulina humana recombinante e elementos vestigiais. As células foram criadas a 37°C com agitação regulada para 275 rpm. O pH foi mantido a 7,2 e foi automaticamente ajustado ao longo da experiência. Os biorreactores foram aspergidos com uma mistura de oxigénio e ar. Este é um sistema modelo que imita as condições durante produção em larga escala de proteínas terapêuticas. 34 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ

Foram tomadas amostras todos os dias para medir os seguintes parâmetros: viabilidade celular, actividade de caspase (Clontech), fragmentação do ADN e ligação de anexina/PI (Chemicon) A Figura IA mostra a viabilidade celular tal como determinada (através de exclusão de azul Tripano) ao longo do curso de 5 dias. A Figura 1B mostra que a perda de viabilidade celular ao longo do período de 5 dias em cultura era o resultado de apoptose. EXEMPLO 2

Efeitos da caspase-9 dominante negativa em células CHO

Construção de expressão: ADNc da caspase-9-dominante negativa ("caspase-9-DN") com o terminal C marcado com FLAG (Duan, H. et al. , J. Biol. Chemistry 271: 16720-16724, 1996; Pan, G. et al., J. Biol. Chemistry 273: 5841-5845, 1998) foi subclonado num dador de união mpsv tal como melhor descrito: 2 pg do vector mpsv (Genentech, Inc.) foram digeridos com 5 U de HcoRI e 5 U de BamEI (Boehringer Mannheim) e 2 μΐ de tampão A (Boehringer Mannheim) num volume total de 20 μΐ durante 1 hora a 37°C. 2 pg da construção caspase-9-DN/pcDNA3 foram digeridos com 5 U de HindiII e 5 U de Xfoal com 2 pl de tampão B (Boehringer Mannheim) num volume total de 20 pl durante 1 hora a 37°C. Após incubação, foi adicionado 1 pl dos dNTP 1 mM (Clontech) e 0,2 U de polimerase Klenow (Boehringer Mannheim) a cada reacção e a incubação foi continuada durante mais 15 minutos a 37°C.

Foram analisadas alíquotas de cada digestão através de electroforese em gel de agarose a 1%. O ADNc de caspase-9-DN de 1,2 kpb e vector mpsv linearizado de 9,7 kpb foram cortados do gel e o ADN foi purificado utilizando GeneClean (BiolOl, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante. A ligação de caspase-9-DN e vector mpsv: 50 ng do vector e 42 ng da inserção foram ligados em 10 pl de tampão de ligação 2X e 1 pl de ADN-ligase DE T4 em 20 pl de volume total à temperatura ambiente durante 5 minutos (Boehringer Mannheim).

Transformação: células competentes MaxEfficiency DH5alfa (Gibco BRL) foram transformadas com 2 pl de mistura de ligação 35 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ de acordo com as instruções do fabricante. As células transformadas foram então plaqueadas em placas de LB contendo carbenicilina. Colónias foram apanhadas aleatoriamente e analisadas através de digestão de restrição para identificar uma colónia contendo a construção correcta. A colónia #30 foi escolhida para mais trabalhos.

Transfecção: células CHO DP12 produtoras de E25 (tal como designadas ao longo do presente pedido, "E25" refere-se às células CHO transfectadas que expressam um anticorpo monoclonal humanizado contra IgE humana; ver Presta et al., J. Immunology 151: 2623-2632, 1993) foram escolhidas para transfecção com mpsv/caspase-9-DN e vector mpsv. A transfecção foi feita utilizando Reagente LipofectAMINE Plus (Gibco BRL) e foi efectuada como se segue: - células E25 criadas em suspensão foram plaqueadas em caixas de cultura de tecidos de 60 mm (1 milhão de células/placa) 24 horas antes da transfecção num meio contendo soro. O ADN para transfecção foi quantificado espectrofotometricamente. Foram misturados 2 yg de ADN com 250 μΐ de meio sem soro e 8 μΐ de reagente Plus e incubou-se durante 15 minutos à temperatura ambiente. Foram misturados 12 μΐ de reagente com 250 μΐ de meio sem soro e adicionou-se directamente à mistura seguido de incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente. O meio sobre as células foi substituído por 5 ml de meio sem soro fresco e a mistura de transfecção foi adicionada à caixa. Três horas após a transfecção, o meio foi substituído por um meio contendo soro. Vinte e quatro horas após a transfecção, cada caixa transfectada foi dividida em 5 caixas e foi aplicada uma pressão de selecção através da adição de 5 yg/ml de puromicina. Clones transfectados (resistentes a puromicina) começaram a surgir cerca de duas semanas após a transfecção. Foram escolhidos vários clones para análise da expressão de caspase-9-DN através de Western blotting.

Análise Western blot: os clones seleccionados foram apanhados e transferidos para uma placa de 24 poços. Quando confluentes, as células de cada poço foram enxaguadas com PBS e lisadas durante 3 minutos em 100 μΐ de tampão de lise (NP40 a 3% em PBS). Os lisados foram centrifugados durante 3 minutos a 12000 xg. O sobrenadante foi colhido, misturado com uma 36 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ quantidade igual de tampão de carga SDS 2x redutor (Novex) e fervido durante 3 minutos. As amostras foram armazenadas a -20°C. Aliquotas dos lisados foram sujeitas a um ensaio proteico para determinar a concentração proteica total utilizando o Estojo de Reagentes de Ensaio de Proteínas Micro BCA (Pierce).

Aliquotas dos lisados correspondendo a 3 pg da proteína total foram carregadas num gel de SDS-Tris-glicina a 10% (Novex) e corridas durante 1,5 hora. As proteínas foram transferidas para uma membrana de transferência Immobilon-P de acordo com as direcções do fabricante. A membrana foi sondada com soro de coelho anti-caspase-9 (Pharmingen) seguido de anti-soro de cabra anti-coelho conjugado com HRP e revelada utilizando o Reagente de detecção de Western Blotting ECL (Amersham). Clones com expressão elevada bem como baixa de caspase-9-DN (clones 2 e 14) foram seleccionados para mais caracterização. Ver Figura 2. A indução de apoptose com estaurosporina: os clones 2 e 14 que expressam níveis baixos e elevados de caspase-9-DN (respectivamente) foram adaptados a crescimento em meio isento de soro em vasos agitados. Os clones foram semeados em vasos agitados a 1 milhão de células/ml e um agente indutor de apoptose, estaurosporina (Sigma), foi adicionado a uma concentração final de 1 μΜ. Aliquotas da cultura foram analisadas quanto à apoptose através de vários ensaios: anexina/PI (Chemicon) para medir a % de células apoptóticas e através de actividade da caspase-3 (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante. Ver Figuras 3 e 4. 0 efeito da expressão de caspase-9-DN na viabilidade em biorreactores de 2 litros: os clones 2 e 4 que expressam caspase-9-DN, adaptados a crescerem sem soro, um vector de controlo e células de E25 não transfectadas foram aumentados em escala e semeados a 1 milhão de células/ml em biorreactores de 2 litros (n=2) . O meio de cultura celular foi um meio baseado em DMEM/Ham F-12 sem soro contendo insulina humana recombinante e elementos vestigiais. As células foram criadas a 37°C com agitação regulada para 275 rpm. 0 pH foi mantido a 7,2 e foi automaticamente ajustado ao longo da experiência. Os 37 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ biorreactores foram aspergidos com uma mistura de oxigénio e ar. Este é um sistema modelo gue imita as condições durante a produção em larga escala de proteínas terapêuticas.

Foram tomadas amostras todos os dias para medir os seguintes parâmetros: viabilidade celular, densidade celular, apoptose, activação da caspase-3, consumo de glicose, osmolalidade, produção de lactato e títulos de E25. Ver Figuras 5-8.

Os resultados mostram expressão estável de caspase-9-DN em células CHO gue expressam E25. A expressão estável resultou numa resistência das células a um agente indutor de apoptose, estaurosporina. A resistência foi proporcional aos níveis de expressão de caspase-9-DN. No ambiente de um biorreactor, o clone 14 de elevada expressão prolongou dramaticamente a viabilidade e a contagem de células viáveis em comparação com o clone 2 de menor expressão, gue mostrou apenas um prolongamento moderado da viabilidade e da contagem de células viáveis. O prolongamento da viabilidade está reflectido no surgimento retardado da activação da caspase-3 no clone 14 em comparação com os controlos. Os resultados inesperados foram obtidos no ensaio da quantidade de anticorpo E25 segregado para o meio. Embora o clone 14 de caspase-9-DN tenha resultado num prolongamento superior da viabilidade no biorreactor que o clone 2, o clone 14 produziu menos proteína de interesse (anticorpo E25) . Os dados sugerem que a elevada expressão do inibidor de apoptose pode não retardar concomitantemente a morte celular e aumentar o rendimento da proteína de interesse.

No entanto, noutro ensaio de biorreactor de 2 litros, uma cultura celular foi corrida semelhantemente tal como descrito acima com a excepção das seguintes alterações: (1) o clone 14 que expressa caspase-9 e as células de controlo de E25 foram semeados a 1 milhão de células/ml; e (2) o meio era um meio concentrado isento de soro (utilizado para aumentar o fornecimento de nutrientes no meio) baseado em DMEM/Ham F-12 com insulina e elementos vestigiais. As culturas celulares foram criadas durante 1 dia a 3 7°C e depois a temperatura mudou para 33°C. No terceiro dia, o pH das culturas foi mudado de pH 7,15 para pH 7,0, e as culturas foram alimentadas com 38 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ DMEM/Ham F-12 concentrado, glicose e meio de hidrolisado proteico para fornecer nutrientes suficientes para suportar um crescimento óptimo.

Os resultados são mostrados nas Figuras 17 e 18. Tal como ilustrado nos gráficos, a expressão de caspase-9-DN resultou no prolongamento da viabilidade e no aumento da densidade de células viáveis, bem como em títulos mais elevados da proteína de interesse (anticorpo E25) em comparação com o controlo. Sob as condições de cultura alimentada em lotes onde os nutrientes não foram limitantes, os dados mostraram que o prolongamento da viabilidade e aumento da densidade de células viáveis eram acompanhados de um marcado aumento no título do produto. EXEMPLO 3

Efeitos do inibidor de caspases z-VAD-fmk na apoptose Células CHO (dhfr+) criadas em suspensão foram semeadas a 1 milhão de células/ml em caixas de cultura de tecidos de 60 mm. 0 meio da cultura celular foi um meio baseado em DMEM/Ham F-12 sem soro contendo insulina humana recombinante e elementos vestigiais. A viabilidade da cultura no dia 0 era de 96%. Foram analisadas duas placas todos os dias quanto à viabilidade através de exclusão de Azul Tripano e através de ligação de anexina/PI (Clontech) e quanto à densidade de células viáveis. A experiência foi realizada durante 10 dias. Um inibidor químico de caspases, z-VAD-fmk (Enzyme Systems Products) foi dissolvido em DMSO para fazer uma reserva a 100 mM (1000x) e foram adicionados 4 μΐ a uma caixa de 60 mm contendo 4 ml de cultura. O inibidor foi adicionado 48 horas após o início da experiência (antes do surgimento de apoptose) e foi adicionada uma nova alíquota de inibidor z-VAD-fmk de 24 em 24 horas. Os controlos eram culturas sem qualquer adição e culturas apenas com adição de DMSO.

Os resultados são mostrados na Figuras 9-10. O composto químico, z-VAD-fmk, é um inibidor de caspases e quando adicionado à cultura a uma concentração de 100 μΜ, resultou numa inibição da actividade de caspase-3 e no prolongamento da viabilidade celular. 39 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ EXEMPLO 4

Expressão de p35 de Baculovírus em células CHO

Construção de expressão: o ADNc de p35 de baculovírus (Beidler, D. et al., J. Biol. Chemistry 270: 16526-16528, 1995; Ciem, R.J. et al., Science 254: 1388-1390, 1991) foi subclonado a partir de um vector pcDNA3 (Invitrogen) num vector dador de união CPC como se segue: 2 pg de vector CPC (Genentech, Inc.) foram linearizados através de digestão em 2 5 μΐ contendo 7 U de EcoRI e 7 U de Xbal em tampão High (Boehringer Mannheim) durante 2 horas a 37°C. O ADNc de p35 de baculovírus foi cortado do vector pcDNA3 (Invitrogen) com as mesmas enzimas de restrição. Foi analisada uma alíquota de cada reacção através de electroforese em gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio. As bandas correspondendo ao vector CPC linearizado (9,7 kpb) e ADNc de p35 (0,9 kpb) foram cortadas do gel e isoladas utilizando GeneClean (Bio 101, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante.

Ligação: 50 ng de vector e 25 ng de ADNc de p35 foram misturados com 10 μΐ de tampão de ligação DE T4 e 1 μΐ de ADN-ligase de T4 (Estojo de Ligação Rapid DNA, Boehringer Mannheim) num volume reaccional total de 20 μΐ. A reacção foi incubada durante 5 minutos à temperatura ambiente.

Transformação: 100 μΐ de células Competentes Max Efficiency DH5alfa (Boehringer Mannheim) foram misturados com 2 μΐ de mistura de ligação e incubados em gelo durante 30 minutos. As células foram sujeitas a choque térmico durante 45 segundos a 42°C seguido de incubação em gelo durante 2 minutos. Foram adicionados às células 0,9 ml de meio LB e incubou-se durante 1 hora a 37°C com agitação. Foram plaqueados 100 μΐ de células transformadas em placas de LB-ágar com carbenicilina. Quatro clones foram apanhados aleatoriamente e foram criados de um dia para o outro em 4 ml de LB + carbenicilina. O plasmídeo foi isolado destas colónias utilizando o Estojo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídeos isolados foram sujeitos a uma digestão analítica para confirmar a construção correcta. 40 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ

Expressão de ρ35 de baculovírus em células CHO: células CHO (dhfr+) criadas num meio DMEM/Ham F-12 contendo soro fetal bovino a 2% (Gibco), insulina humana recombinante e elementos vestigiais foram plaqueadas 48 horas antes da transfecção a 2 milhões de células/caixa de cultura de tecidos de 100 mm. Foi utilizado reagente LipofectAMINE Plus (Gibco BRL) para transfecção que foi efectuada de acordo com as instruções do fabricante. As células CHO foram transfectadas com uma construção de p35/CPC e vector CPC sozinho como controlo. Uma placa transfectada de cada tipo foi colhida 24 horas após a transfecção para ensaiar o nível de expressão de p35 em transfectantes transientes (Western blotting utilizando soro policlonal de coelho anti-p35 a uma diluição 1:1000). Outras placas transfectadas foram criadas e foi aplicada pressão de selecção (5 pg/ml de puromicina) 48 horas após a transfecção. Cerca de duas semanas depois desenvolveram-se colónias resistentes à puromicina e foram adaptadas a crescimento sem soro e aumentadas em escala para mais análises. O efeito da expressão de p35 na viabilidade em biorreactores de 2 litros: o clone adaptado a crescimento sem soro que expressa p35 e um controlo do vector foram aumentados em escala e semeados a 1 milhão de células/ml em biorreactores de 2 litros (n=2) . O meio de cultura celular foi um meio baseado em DMEM/Ham F-12 sem soro contendo insulina humana recombinante e elementos vestigiais. As células foram criadas a 37°C com agitação regulada para 275 rpm. 0 pH foi mantido a 7,2 e foi automaticamente ajustado ao longo da experiência. Os biorreactores foram aspergidos com uma mistura de oxigénio e ar. Este é um sistema modelo que imita as condições durante a produção em larga escala de proteínas terapêuticas. Foram tomadas amostras todos os dias para medir os seguintes parâmetros: viabilidade celular, densidade celular, apoptose, activação de caspase-3, consumo de glicose, osmolalidade e produção de lactato.

Os resultados são mostrados nas Figuras 11-12.

Os resultados indicam que o inibidor de apoptose, p35 de baculovírus, quando expresso em células CHO resulta em prolongamento da viabilidade no ambiente do biorreactor. 41 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ EXEMPLO 5

Maior eficiência de transfecçao e expressão de anticorpo E25 em transfecções transientes utilizando Caspase-9-DN Células CHO DP12 adaptadas a crescimento sem soro foram semeadas a 1,5 milhões de células/ml em placas de cultura de tecidos de 12 poços não tratadas em meio baseado em DMEM/HAM F-12 com concentrações modificadas de alguns componentes e contendo insulina humana recombinante, elementos vestigiais e soro. A transfecção foi efectuada utilizando DMRIE-C (Gibco BRL) de acordo com as instruções do fabricante. O clone 14 que expressa caspase-9-DN foi transfectado a seguir em controlos que foram células CHO DP12 e células de E25 (CHO DP12, que expressa E25).

Vector que expressa GFP mudada para vermelho (Quantum Biotechnologies Inc.) foi co-transfectado com um vector que expressa ADNase (Shak, S. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei USA 87: 9188-9192, 1990). Vinte e quatro horas após a transfecção, foi adicionado iodeto de propídio a uma aliquota da cultura e as eficiências de transfecção total e viável foram avaliadas através de citometria de fluxo em FACSCalibur (Becton Dickinson). Cinco dias após a transfecção, uma amostra do meio foi sujeita a análise do título de ADNase utilizando ELISA.

Os dados indicaram (Fig. 13) que o reagente de transfecção, na nossa experiência DMRIE-C, pode ser tóxico para as células quando utilizado a concentrações mais elevadas (acima de 6 μΐ) . Na Figura 14, o clone 14 de caspase-9-DN mostra (em todas as concentrações de DMRIE-C testadas) eficiências de transfecção total e viável mais elevadas que os controlos. A eficiência de transfecção do clone 14 aumentou com a quantidade de reagente de transfecção e alcançou um máximo a 12 μΐ de DMRIE-C, concentração à qual ambos os controlos tinham já começado a mostrar uma diminuição na eficiência de transfecção. É possível que a eficiência de transfecção do clone 14 aumente ainda mais quando for utilizada uma quantidade de DMRIE-C mais elevada que a actualmente testada. O aumento na eficiência de transfecção do clone 14 foi reflectido na produtividade específica (título de ADNase/LDH total) da cultura e no título de ADNase (Fig. 15, 42 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ 16), os quais aumentaram ambos até quatro vezes em comparação com os controlos. EXEMPLO 6

Efeito da expressão da caspase-9-DN na viabilidade e no número de células viáveis após descongelação de uma cultura congelada 2x10 células de clone 14 que expressa caspase-9-DN e células de E25 de controlo foram congeladas num meio de congelação (1 g/1 de metilcelulose em DMEM/Ham F-12 modificado e DMSO a 10%) e armazenadas a -80°C durante um período de tempo prolongado. No dia da experiência, os frascos de células congeladas foram tirados do congelador, descongelados a 37°C e adicionados a um vaso agitado com um meio de crescimento pré-aquecido (DMEM/Ham F-12 modificado). As células foram cultivadas durante 8 dias e ensaiadas quanto à viabilidade e densidade de células viáveis.

Os resultados são mostrados nas Figuras 19 e 20. Os resultados indicam que as células que expressam caspase-9-DN mantinham uma viabilidade e contagem de células viáveis mais elevadas que as células de E25 de controlo. Assim, a expressão de caspase-9-DN nas células CHO teve um efeito benéfico na viabilidade e nas densidades de células viáveis após descongelamento das culturas celulares congeladas. EXEMPLO 7

As Células Que expressam Caspase-9-DN Mostram Resistência a Butirato O seguinte estudo foi conduzido para examinar se a expressão de caspase-9-DN afecta a resistência das células a potenciais efeitos adversos do butirato. O clone 14 que expressa caspase-9-DN e células de E25 de controlo foram semeados a lxlO6 células/ml em caixas de cultura de tecidos de 60 mm. Cada caixa continha 4 ml de meio de cultura. As culturas foram criadas a 37°C em meio concentrado baseado em DMEM/Ham F-12 com insulina e elementos vestigiais. A temperatura das culturas foi mudada para 33°C no segundo dia e o butirato foi adicionado no terceiro dia a 43 ΕΡ 1 650 307/ΡΤ concentrações finais variáveis (0, 1, 2, 3, 5, 10 mM) (n=2). A viabilidade das culturas e títulos foi ensaiada diariamente.

Os resultados são mostrados nas Figuras 21 e 22. Os resultados mostraram que as células de E25 de controlo perdem viabilidade mais rapidamente que as células que expressam caspase-9-DN (ver Fig. 21, dia 7 e dia 9) . Isto é reflectido nos títulos de proteína de interesse. Os títulos mostrados na Fig. 22 indicam que as células de caspase-9-DN deram títulos mais elevados que a adição de butirato em culturas com butirato 1, 2, 3 e 5 mM. Por outro lado, os títulos de controlos de E25 melhoraram com apenas 1 e 2 mM de butirato. Os resultados sugerem que a expressão de caspase-9-DN protege as células de efeitos adversos do butirato e pode resultar em viabilidade prolongada e títulos mais elevados.

Lisboa, 2010-10-13

Claims

ΕΡ 1 650 307/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção de proteínas recombinantes utilizando um ou mais inibidores de apoptose, compreendendo os passos de: (a) proporcionar um vector compreendendo um gene que codifica uma proteína de interesse; (b) proporcionar uma célula hospedeira de ovário de hamster chinês (CHO); (c) transformar ou transfectar a célula hospedeira com o vector do passo (a); (d) proporcionar um meio de cultura celular; (e) proporcionar uma quantidade do inibidor de caspases z-VAD-fmk; (f) misturar o inibidor de caspases no meio de cultura celular; (g) cultivar a célula hospedeira transformada ou transfectada no meio de cultura celular sob condições suficientes para expressão da proteína de interesse; e, opcionalmente, (h) recuperar ou purificar a proteína de interesse a partir da célula hospedeira e/ou do meio de cultura celular.
2. Método da reivindicação 1 em que as células hospedeiras são cultivadas sob condições para expressão transiente da proteína de interesse.
3. Método da reivindicação 1, em que a proteína de interesse compreende uma proteína que é capaz de induzir apoptose numa célula de mamífero ou sem ser de mamífero.
4. Método da reivindicação 1, em que o referido meio de cultura celular é isento de soro.
5. Método da reivindicação 1, em que após o passo (g), a célula ou células hospedeiras e/ou o meio de cultura celular são congelados e subsequentemente descongelados. Lisboa, 2010-10-13