KR20070082597A - 유전자 - Google Patents

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KR20070082597A
KR20070082597A KR1020077013799A KR20077013799A KR20070082597A KR 20070082597 A KR20070082597 A KR 20070082597A KR 1020077013799 A KR1020077013799 A KR 1020077013799A KR 20077013799 A KR20077013799 A KR 20077013799A KR 20070082597 A KR20070082597 A KR 20070082597A
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치 펑 웡
미란다 겍 심 얍
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
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Abstract

본 발명은 서열번호: 1에 나타난 FAIM 서열에서 선택된, 세포의 아폽토시스를 매개하는 것이 가능한 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) 서열; 서열번호: 2에 나타난 FADD 서열; 서열번호: 3에 나타난 PDCD6 서열; 및 서열번호: 4에 나타난 레퀴엠(Requiem) 서열을 포함한 분리된 폴리펩타이드를 제공한다.

Description

유전자{Genes}
본 발명은 생명공학 및 분자생물학 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 아폽토시스 과정의 매개에 관련된 중국 햄스터인 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) 유래의 신규한 유전자에 관한 것이다.
인간 게놈 프로젝트의 완성과 함께 치료적 잠재성을 지닌 더 많은 단백질이 매일 발견되고 있다. 이들 신규한 생체치료제 대부분은 세계적인 요구와 일치하기 위해 매우 생산적인 제조 공정의 개발을 요구한다. 복잡한 치료적 생물제제 생산을 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포주는 중국 햄스터(크리세툴루스 그리세우스)에서 본래 유래된 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포이다.
그러나 크리세툴루스 그리세우스의 게놈은 불충분하게 특성화되었고 특히 생리적으로 중요한 과정을 조절하는 생물체 내 유전자에 대한 지식이 부족하다.
미국 특허 제6,562,797호는 세포질 영역 또는 Fas 수용체 도메인에 결합할 수 있는 능력을 지닌 FADD로 명명된 정제된 포유류 단백질을 기술한다. 또한 상기 문헌은 FAS-관련 아폽토시스를 조절하는 방법도 기술한다. 그러나 개시된 서열만이 인간 기원이다.
미국 특허 제6,683,168호 및 미국 공개특허공보 제2004/0121389호는 많은 형태의 FAIM 서열의 서열을 기술한다: 짧은, 긴, 과도하게 긴, 폐암 관련된 것. 본 서열은 인간 및 마우스 서열이다.
미국 특허 제6,544,523호는 Fas 리간드를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다. 미국 특허 제6,451,759호는 이러한 리간드의 비-분열성 버전을 기술한다.
발명의 요약
본 발명은 크리세툴루스 그리세우스 FAIM, FADD, PDCD6 및 레퀴엠 서열을 처음으로 기술한다.
본 발명의 첫 번째 관점에 따라 본 발명은 하기에서 선택된 서열을 포함한 분리된 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 서열번호: 1에 나타난 서열과 적어도 97% 이상의 서열 동일성을 지닌 cgFAIM 서열; (b) 서열번호: 2에 나타난 서열과 적어도 69% 이상의 서열 동일성을 지닌 cgFADD 서열; (c) 서열번호: 3에 나타난 서열과 적어도 89% 이상의 서열 동일성을 지닌 cgPDCD6 서열; (d) 서열번호: 4에 나타난 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 지닌 cg레퀴엠 서열; (e) 세포의 아폽토시스를 매개하는 것이 가능한, 상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 적어도 15개 이상의 인접 잔기의 단편을 지닌 서열.
본 발명의 두 번째 관점에 따라 서열번호: 1에 나타난 cgFAIM 서열; 서열번호: 2에 나타난 cgFADD 서열; 서열번호: 3에 나타난 cgPDCD6 서열; 및 서열번호: 4에 나타난 cg레퀴엠 서열에서 선택된 서열로써 세포의 아폽토시스를 매개하는 것이 가능한 크리세툴루스 그리세우스 서열을 포함한 분리된 폴리펩타이드가 제공된다.
본 발명의 첫 번째 관점에 따라 본 발명은 서열번호: 1에 나타난 cgFAIM 서열; 서열번호: 2에 나타난 cgFADD 서열; 서열번호: 3에 나타난 cgPDCD6 서열; 및 서열번호: 4에 나타난 cg레퀴엠 서열에서 선택된 서열로써 세포의 아폽토시스를 매개하는 것이 가능한 크리세툴루스 그리세우스 서열을 포함한 분리된 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 두 번째 관점에 따라 하기에서 선택된 서열을 포함한 분리된 폴리펩타이드가 제공된다: (a) 서열번호: 1에 나타난 서열과 적어도 97% 이상의 서열 동일성을 지닌 cgFAIM 서열; (b) 서열번호: 2에 나타난 서열과 적어도 69% 이상의 서열 동일성을 지닌 cgFADD 서열; (c) 서열번호: 3에 나타난 서열과 적어도 89% 이상의 서열 동일성을 지닌 cgPDCD6 서열; (d) 서열번호: 4에 나타난 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 지닌 cg레퀴엠 서열; (e) 상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 적어도 15개 이상의 인접 잔기의 단편을 지닌 서열.
본 발명은 본 발명의 세 번째 관점에 따라 바람직하게는 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7 및 서열번호: 8로 구성된 군에서 선택된 서열에 나타난 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 네 번째 관점에 따라 하기에서 선택된 서열을 포함한 분리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다: (a) 서열번호: 5에 나타난 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 지닌 cgFAIM 서열; (b) 서열번호: 6에 나타난 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 지닌 cgFADD 서열; (c) 서열번호: 7에 나타난 서열과 적어도 93% 이상의 서열 동일성을 지닌 cgPDCD6 서열; (d) 서열번호: 8에 나타난 서열과 적어도 89% 이상의 서열 동일성을 지닌 cg레퀴엠 서열; (e) 상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 적어도 15개 이상의 인접 잔기의 단편을 지닌 서열; 또는 이에 상보적이거나 높은 스트린전트 조건 하에서 이에 혼성화하는 것이 가능하거나 유전자 코드의 결과로서 이에 퇴화된 서열.
본 발명은 본 발명의 다섯 번째 관점에 따라 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하는 것이 가능한 조절 서열에 실시 가능하게 결합된 상기에 나타난 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 포함한 발현 벡터를 제공한다.
바람직하게는 이러한 발현 서열은 발현 벡터이다.
본 발명은 여섯 번째 관점에서 상기에 나타난 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 세포에 노출시 세포에 의해 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 또는 cg레퀴엠의 발현을 조절하는 것이 가능한 벡터를 제공한다.
바람직하게는 상기 벡터는 크리세툴루스 그리세우스 FAIM 서열 또는 그의 일부를 포함하고, 세포 내에서 cgFAIM, 바람직하게는 pcDNA3.1(+) FAIM(서열번호: 37)의 상향-조절을 유발하는 것이 가능하다.
바람직하게는 상기 벡터는 크리세툴루스 그리세우스 FADD 서열 또는 그의 일부를 포함하고, 세포 내에서 cgFADD, 바람직하게는 pcDNA3.1(+) FADD DN(서열번호: 38)의 하향-조절을 유발하는 것이 가능하다.
바람직하게는 상기 벡터는 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6 서열 또는 그의 일부를 포함하고, 세포 내에서 cgPDCD6, 바람직하게는 pSUPER.neo.PDCD6 siRNA(서열번호: 39)의 하향-조절을 유발하는 것이 가능하다.
바람직하게는 상기 벡터는 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠 서열 또는 그의 일부를 포함하고, 세포 내에서 cg레퀴엠, 바람직하게는 pSUPER.neo.레퀴엠 siRNA(서열번호: 40)의 하향-조절을 유발하는 것이 가능하다.
본 발명의 일곱 번째 관점에서 상기 기술된 발현 서열 또는 상기 기술된 벡터를 포함한 세포가 제공되고, 상기 발현 서열은 바람직하게는 상기 세포 내로 형질전환된다.
본 발명의 여덟 번째 관점에 따라 본 발명은 약제적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 상기 기술된 폴리펩타이드, 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드, 상기 기술된 발현 서열, 상기 기술된 벡터 또는 상기 기술된 세포를 포함한 약제적 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 아홉 번째 관점에 따라 (a) 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 및 상기 폴리뉴클레오타이드로부터 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 것이 가능한 조절 서열을 포함한 발현 서열을 제공하는 단계, (b) 상기 조절 서열의 조절 하에서 상기 발현 서열로부터 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 단계 및 (c) 선택적으로는 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함한 폴리펩타이드의 생성 방법을 제공한다.
바람직하게는 발현 서열은 세포에 의해 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하기 위해 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포 내로 전이된 발현 벡터를 포함한다.
본 발명의 열 번째 관점에 따라 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포 내에서 서열번호: 1에 나타난 서열을 지닌 cgFAIM 폴리펩타이드 또는 서열번호: 5에 나타난 서열을 지닌 cgFAIM 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하고, 바람직하게는 상향-조절하는 방법이 제공된다.
본 발명의 열한 번째 관점에 따라 본 발명은 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포 내에서 서열번호: 2에 나타난 서열을 지닌 cgFADD 폴리펩타이드; 서열번호: 3에 나타난 서열을 지닌 cgPDCD6 폴리펩타이드 또는 서열번호: 4에 나타난 서열을 지닌 cg레퀴엠 폴리펩타이드 또는 서열번호: 6에 나타난 서열을 지닌 cgFADD 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 7에 나타난 서열을 지닌 cgPDCD6 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 8에 나타난 서열을 지닌 cg레퀴엠 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하고, 바람직하게는 상향-조절하는 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 방법은 상기 기술된 벡터를 세포에 노출시키고, 바람직하게는 상기 벡터로 상기 세포를 트랜스펙트시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 열두 번째 관점에 따라 변형되지 않은 세포와 비교시 서열번호: 1에 나타난 서열을 지닌 폴리펩타이드 또는 서열번호: 5에 나타난 서열을 지닌 폴리뉴클레오타이드의 발현을 상향-조절하도록 변형되고, 바람직하게는 유전적으로 설계된 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포를 제공한다.
본 발명의 열세 번째 관점에 따라 본 발명은 변형되지 않은 세포와 비교시 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4에 나타난 서열을 지닌 폴리펩타이드 또는 서열번호: 6, 서열번호: 7 또는 서열번호: 8에 나타난 서열을 지닌 폴리뉴클레오타이드의 발현을 하향-조절하도록 변형되고, 바람직하게는 유전적으로 설계된 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포를 제공한다.
본 발명의 열네 번째 관점에 따라 상기 기술된 세포 또는 그의 파생체를 포함한 세포주, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포주가 제공된다.
본 발명은 본 발명의 열다섯 번째 관점에 따라 상기 기술된 세포 또는 그의 파생체 또는 상기 기술된 세포주를 포함한 세포 배양물을 제공한다.
본 발명의 열여섯 번째 관점에 따라 본 발명은 상기 기술된 세포 또는 그의 파생체를 포함한 형질전환 비-인간 동물, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스를 제공한다.
바람직하게는 폴리펩타이드의 발현이 조절되지 않은 세포주와 비교시 (ⅰ) 세포의 세포 활성이 증가되거나 증진되고, 바람직하게는 세포의 아폽토시스가 감소되고; (ⅱ) 세포의 단백질 산출량, 바람직하게는 재조합 발현 단백질 산출량이 증가되거나 증진되고; 또는 (ⅲ) 세포에 의해 발현된 단백질의 당화, 바람직하게는 시알화(sialylation)가 증가되거나 증진된다.
본 발명의 열일곱 번째 관점에 따라 본 발명은 단백질, 바람직하게는 이형성, 더욱 바람직하게는 외인성 도입 서열 유래 단백질, 가장 바람직하게는 재조합 단백질의 생성을 위한 상기 기술된 방법, 상기 기술된 세포, 상기 기술된 세포주, 상기 기술된 세포 배양물 또는 상기 기술된 형질전환 비-인간 동물의 이용을 제공한다.
본 발명은 열여덟 번째 관점에 따라 상기 기술된 세포를 제공하고, 재조합 단백질을 발현하는 것이 가능한 발현 벡터로 상기 세포를 트랜스펙트시키고 상기 세포 내에서 재조합 단백질의 발현을 유발하는 단계를 포함한 재조합 단백질의 생성 방법을 제공한다.
본 발명의 열아홉 번째 관점에 따라 본 발명은 서열번호: 9를 지닌 cgFADD 우성 음성 서열 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 서열번호: 10 또는 그의 단편, 상동체, 변이체 또는 유도체를 제공한다.
본 발명의 스무 번째 관점에 따라 본 발명은 본 발명의 열일곱 번째 또는 열여덟 번째 관점에 따른 방법에 의해 생성 가능하고, 변형되지 않은 세포로부터 생성 가능한 폴리펩타이드와 비교시 증가된 시알화를 지닌 폴리펩타이드, 바람직하게는 재조합 단백질, 더욱 바람직하게는 인터페론 감마를 제공한다.
바람직하게는 시알화는 2.9 몰 시알산 / 생성된 폴리펩타이드 몰 이상, 바람직하게는 약 3.5 몰 시알산 / 생성된 폴리펩타이드 몰이다.
또한 본 발명의 특정하고 바람직한 관점이 수반된 독립항 및 종속항 내에 기술되어 있다. 종속항의 특징은 적당한 독립항의 특징과 결합되고 청구항에 명백하게 나타난 것 이외의 것과 결합된다.
본 발명의 실행은 다른 경우를 나타내지 않는 한 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 설명된다. 예를 들어 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson "Immunocytochemistry: Theory and Practice", CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); "Immunochemical Protocols, vol 80", in the series: "Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3; and The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17th Edition, Beers, M. H., and Berkow, R, Eds, ISBN: 0911910107, John Wiley & Sons) 참조. 이들 일반 문헌 각각은 참고문헌으로 여기에 포함된다.
도 1은 관련 컨스트럭트로 트랜스펙트된 세포 내 FADD 우성 음성 및 FAIM의 과-발현 및 레퀴엠 및 PDCD6 발현의 억제를 나타내는 그래프이다.
도 2a, 2b, 2c 및 2d는 FAIM을 과-발현하는 CHO IFN-γ의 생장 동력학을 나타내는 그래프이다. 도 2a는 활성 세포 밀도(세포/ml) 대 시간을 나타낸다. 도 2b는 총 세포 밀도 대 시간을 나타낸다. 도 2c는 활성 대 시간을 나타낸다. 도 2d는 아폽토시스 세포 대 시간을 나타낸다. 세포 배양물 활성 소실은 아폽토시스 세포의 유의적인 감소에 기인하여 대조군 세포와 비교시(도 2c) FAIM 과-발현과 함께 유의적으로 감소된다(도 2d).
도 3a, 3b, 3c 및 3d는 FADD 우성 음성을 과-발현하는 CHO IFN-γ의 생장 동력학을 나타내는 그래프이다. 도 3a는 활성 세포 밀도(세포/ml) 대 시간을 나타낸다. 도 3b는 총 세포 밀도 대 시간을 나타낸다. 도 3c는 활성 대 시간을 나타낸다. 도 3d는 아폽토시스 세포 대 시간을 나타낸다. 세포 배양물 활성 소실은 아폽토시스 세포의 유의적인 감소에 기인하여 대조군 세포와 비교시(도 3c) FADD 우성 음성 과-발현과 함께 유의적으로 감소된다(도 3d).
도 4a, 4b, 4c 및 4d는 PDCD6 억제를 지닌 CHO IFN-γ의 생장 동력학을 나타내는 그래프이다. 도 4a는 활성 세포 밀도(세포/ml) 대 시간을 나타낸다. 도 4b는 총 세포 밀도 대 시간을 나타낸다. 도 4c는 활성 대 시간을 나타낸다. 도 4d는 아폽토시스 세포 대 시간을 나타낸다. 세포 배양물 활성 소실은 아폽토시스 세포의 유의적인 감소에 기인하여 대조군 세포와 비교시(도 4c) PDCD6이 억제된 경우 유의적으로 감소된다(도 4d).
도 5a, 5b, 5c 및 5d는 레퀴엠 억제를 지닌 CHO IFN-γ의 생장 동력학을 나타내는 그래프이다. 도 5a는 활성 세포 밀도(세포/ml) 대 시간을 나타낸다. 도 5b는 총 세포 밀도 대 시간을 나타낸다. 도 5c는 활성 대 시간을 나타낸다. 도 5d는 아폽토시스 세포 대 시간을 나타낸다. 세포 배양물 활성 소실은 아폽토시스 세포의 유의적인 감소에 기인하여 대조군 세포와 비교시(도 4c) 레퀴엠이 억제된 경우 유의적으로 감소된다(도 5d).
도 6a, 6b, 6c, 6d 및 6e는 CHO 세포 배양물 내 카스파제 2, 3, 8 및 9의 활성을 나타내는 그래프이다. 도 6a는 대조군으로 트랜스펙트된 세포 내 카스파제 활성을 나타낸다. 도 6b는 FAIM을 과-발현하는 세포 내 카스파제 활성을 나타낸다. 도 6c는 FADD 우성 음성을 과-발현하는 세포 내 카스파제 활성을 나타낸다. 도 6d는 PCDCD6의 억제를 지닌 세포 내 카스파제 활성을 나타낸다. 도 6e는 레퀴엠의 억제를 지닌 세포 내 카스파제 활성을 나타낸다. FAIM, FADD 우성 음성, PDCD6 또는 레퀴엠을 타겟하는 유전자는 배양물 내 카스파제 활성을 억제하거나 지연시킬 수 있다.
도 7a, 7b, 7c 및 7d는 트랜스펙트된 CHO IFN-γ 세포에 대한 인터페론-γ 생성량을 나타내는 그래프이다. 도 7a는 FAIM을 과-발현하는 세포 내 인터페론-γ 활성을 나타낸다. 도 7b는 FADD 우성 음성을 과-발현하는 세포 내 인터페론-γ 활성을 나타낸다. 도 7c는 PCDCD6의 억제를 지닌 세포 내 인터페론-γ 활성을 나타낸다. 도 7d는 레퀴엠의 억제를 지닌 세포 내 인터페론-γ 활성을 나타낸다. 300%까지의 인터페론 감마 생성량의 유의적인 증가는 유전자 타겟팅 접근을 통해 달성될 수 있다.
도 8a는 유가 배양시 레퀴엠 또는 PDCD6 억제 또는 FADD DN 또는 FAIM* 과발현을 지닌 안정한 CHO IFN-γ 클론의 활성 세포 밀도를 나타낸다(데이터는 2회 이중 실험의 평균이다).
도 8b는 유가 배양시 레퀴엠 또는 PDCD6 억제 또는 FADD DN 또는 FAIM* 과발현을 지닌 안정한 CHO IFN-γ 클론의 활성 세포 밀도를 나타낸다.
도 9a는 유가 배양시 레퀴엠 또는 PDCD6 억제 또는 FADD DN* 또는 FAIM* 과발현을 지닌 안정한 CHO IFN-γ 클론의 인터페론 감마 생성량을 나타낸다(데이터는 2회 이중 실험의 평균이다).
도 9b는 유가 배양시 레퀴엠 또는 PDCD6 억제 또는 FADD DN* 또는 FAIM* 과발현을 지닌 안정한 CHO IFN-γ 클론의 인터페론 감마 생성량을 나타낸다.
도 10은 유가 배양의 중간-실험, 정지 및 사멸 상태 동안 레퀴엠 또는 PDCD6 억제 또는 FADD DN* 또는 FAIM* 과발현을 지닌 안정한 CHO IFN-γ 클론 내 재조합 IFN-γ의 시알화를 나타낸다.
서열목록
서열번호: 1은 크리세툴루스 그리세우스 FAIM의 아미노산 서열의 서열이다. 서열번호: 2는 크리세툴루스 그리세우스 FADD의 아미노산 서열이다. 서열번호: 3은 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6의 아미노산 서열이다. 서열번호: 4는 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠의 아미노산 서열이다.
서열번호: 5는 크리세툴루스 그리세우스 FAIM이 핵산 서열이다. 서열번호: 6은 크리세툴루스 그리세우스 FADD의 핵산 서열이다. 서열번호: 7은 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6의 핵산 서열이다. 서열번호: 8은 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠의 핵산 서열이다.
서열번호: 9는 크리세툴루스 그리세우스 FADD 우성 음성의 아미노산 서열이다. 서열번호: 10은 크리세툴루스 그리세우스 FADD 우성 음성의 핵산 서열이다. 서열번호: 11은 크리세툴루스 그리세우스 FADD 우성 음성 5'-PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 12는 크리세툴루스 그리세우스 FADD 우성 음성 3'-PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 13은 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6 억제 벡터 삽입 5'의 서열이다. 서열번호: 14는 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6 억제 벡터 삽입 3'의 서열이다. 서열번호: 15는 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠 억제 벡터 삽입 5'의 서열이다. 서열번호: 16은 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠 억제 벡터 삽입 3'의 서열이다.
서열번호: 17은 크리세툴루스 그리세우스 FAIM 5' PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 18은 크리세툴루스 그리세우스 FAIM 3' PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 19는 크리세툴루스 그리세우스 FADD 5' PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 20은 크리세툴루스 그리세우스 FADD 3' PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 21은 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6 5' PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 22는 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6 3' PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 23은 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6 3'-RACE 프라이머의 서열이다. 서열번호: 24는 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠 5' PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 25는 레퀴엠 3' PCR 프라이머의 서열이다. 서열번호: 26은 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠 3'-RACE 프라이머의 서열이다.
서열번호: 27은 크리세툴루스 그리세우스 FAIM 정량적 실시간 PCR 프라이머 5'의 서열이다. 서열번호: 28은 크세툴루스 그리세우스 FAIM 정량적 실시간 PCR 프라이머 3'의 서열이다. 서열번호: 29는 크세툴루스 그리세우스 FADD 정량적 실시간 PCR 프라이머 5'의 서열이다. 서열번호: 30은 크세툴루스 그리세우스 FAIM 정량적 실시간 PCR 프라이머 3'의 서열이다. 서열번호: 31은 크세툴루스 그리세우스 PDCD6 정량적 실시간 PCR 프라이머 5'의 서열이다. 서열번호: 32는 크세툴루스 그리세우스 PDCD6 정량적 실시간 PCR 프라이머 3'의 서열이다. 서열번호: 33은 크세툴루스 그리세우스 레퀴엠 정량적 실시간 PCR 프라이머 5'의 서열이다. 서열번호: 34는 크세툴루스 그리세우스 레퀴엠 정량적 실시간 PCR 프라이머 3'의 서열이다. 서열번호: 35는 β-액틴 정량적 실시간 PCR 프라이머 5'의 서열이다.
서열번호: 36은 β-액틴 정량적 실시간 PCR 프라이머 3'의 서열이다. 서열번호: 37은 플라스미드 pcDNA3.1(+) FAIM의 핵산 서열이다. 서열번호: 38은 플라스미드 pcDNA3.1(+) FADD DN의 핵산 서열이다. 서열번호: 39는 플라스미드 pSUPER.neo.PDCD6 siRNA의 핵산 서열이다. 서열번호: 40은 플라스미드 pSUPER.neo.Requeim siRNA의 핵산 서열이다.
여기에 기술된 방법 및 조성물은 서열목록에 나타난 어떠한 하나 이상의 서열을 적당히 이용한다.
중국 햄스터 서열
본 발명은 일반적으로 세포 내 아폽토시스를 조절하는 것이 가능한 중국 햄스터, 크리세툴루스 그리세우스 유래의 특정 핵산, 폴리펩타이드뿐만 아니라 그의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체를 제공한다.
특히 본 발명은 서열목록에 나타난 크리세툴루스 그리세우스 FADD, FAIM, PDCD6 및 레퀴엠을 제공한다. 더욱이 본 발명은 이러한 유전자, 단편, 상동체의 이용을 제공한다.
특히 바람직한 이용은 증가된 활성, 증가된 단백질(특히 재조합 단백질) 발현 능력 및 이러한 단백질의 증가된 당화, 바람직하게는 시알화와 같은 증가된 특성에 대한 세포, 특히 중국 햄스터 난소 세포의 변형을 포함한다. 이러한 변형 세포 및 이들의 유도체(콜로니, 클론, 세포주 등)는 하기에 더욱 상세히 설명되고 재조합 단백질의 생성을 위해 아폽토시스 저항성 세포로서 이용된다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 폴리펩타이드
여기서 개시된 폴리펩타이드 서열은 서열목록에 나타난 특정 서열 또는 그의 단편 또는 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 단백질에서 수득되는 서열에 한정적인 것이 아닐 뿐만 아니라 경우에 따라 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 생물학적 활성 중의 하나를 지니는 한 예를 들어 세포성 상동체, 다른 종 유래 상동체 또는 그의 변이체 또는 유도체와 같은 어떠한 원천 유래의 상동적 서열을 포함한다.
따라서 본 발명은 서열목록에 나타난 아미노산 서열의 변이체, 상동체 또는 유도체뿐만 아니라 여기서 개시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 변이체, 상동체 또는 유도체도 포함한다. 이러한 서열은 일반적으로 경우에 따라 "cgFADD 서열", "cgFAIM 서열", "cgPDCD6 서열" 또는 "cg레퀴엠 서열"로 표기된다.
생물학적 활성
매우 바람직한 실시태양에서 서열은 경우에 따라 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 적어도 하나 이상의 생물학적 활성을 포함한다.
바람직하게는 cgFAIM의 경우 생물학적 활성은 바람직하게는 카스파제 활성의 하향-조절에 의해 분석되는 아폽토시스 저해 활성을 포함한다. 따라서 본 발명에 기술된 cgFADD 서열은 바람직하게는 세포 환경 내 아폽토시스를 저해하는 것이 가능하고, 특히 카스파제 활성을 하향-조절하는 것이 가능하다.
매우 바람직한 실시태양에서 이러한 방법을 이용한 분석시 cgFAIM 서열은 세포 내로 트랜스펙트된 경우 관련 cgFAIM 서열로 트랜스펙트되지 않은 세포와 비교시 적어도 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 30%, 40% 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상까지 아폽토시스를 저해하는 것이 가능하다.
cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠의 경우 생물학적 활성은 바람직하게는 카스파제-활성의 상향-조절에 의해 분식되는 아폽토시스 자극 활성을 포함한다. 따라서 본 발명에 기술된 cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 서열은 바람직하게는 세포 환경 내 아폽토시스를 상향-조절하는 것이 가능하고, 특히 카스파제 활성을 상향-조절하는 것이 가능하다.
매우 바람직한 실시태양에서 이러한 방법을 이용한 분석시 cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 서열은 세포 내로 트랜스펙트된 경우 관련 cgFADD, cgPDCD6 또는 cg레퀴엠 서열로 트랜스펙트되지 않은 세포와 비교시 적어도 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 30%, 40% 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상까지 아폽토시스를 자극하는 것이 가능하다.
매우 바람직한 실시태양에서 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 서열에 의한 아폽토시스의 활성화 또는 억제는 카스파제 활성을 분석함으로서 분석된다. 따라서 상기에 나타난 아폽토시스의 자극 또는 억제 비율은 매우 바람직한 실시태양에서 카스파제 활성의 자극 또는 억제 비율로서 판독되어야 한다.
따라서 비색법 또는 형광법을 이용한 카스파제 활성 측정 분석과 같은 아폽토시스 활성 모니터 방법은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 생물학적 활성을 확인하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은 아폽토시스가 영향을 받았는지 또는 카스파제 활성이 상향- 또는 하향-조절되는지 여부를 측정하기 위해 당분야에 알려진 방법과 같은 적당한 발현 컨스트럭트로 트랜스펙트된 세포 내에서 또는 실시예에 나타난 프로토콜을 이용하여 수행된다.
카스파제는 아폽토시스를 매개하는 큰 패밀리의 시스테인 단백질이다(Nicholson & Thornberry 1997; Thornberry & Littlewood 1998). 카스파제-8은 수용체-매개 아폽토시스 경로 내 최고 상류에서 작용하는 저해제 카스파제이다. 세포-표면 수용체의 활성화시 카스파제-8은 카스파제-3과 같은 하류 작동 카스파제의 단백질분해 활성을 저해한다(Srinivasula et al 1996 and Cohen 1997). 또다른 상류 카스파제인 카스파제-9는 세포질로의 사이토크롬 c의 미토콘드리아성 방출을 통해 활성화된다. 방출된 사이토크롬 c는 아폽토시스 프로테아제 활성화 인자인 APAG-1에 결합하여 전카스파제-9를 활성화하는 복합체를 형성한다(Zou et al 1999 and Hu et al 1999). 활성적 카스파제-9는 카스파제-3 및 또다른 하류 카스파제를 활성화시키는 프로테아제 연쇄반응을 개시한다.
바람직한 실시태양에서 아폽토시스 활성의 상향- 또는 하향-조절을 측정하기 위해 분석되는 카스파제 활성은 카스파제-8 또는 카스파제-9를 포함한다.
카스파제-8 및 카스파제-9 활성의 분석 방법은 당분야에 알려져 있고 예를 들어 Nicholson DW and Thornberry NA (1997) Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci. 272: 2952-2956 and Thornberry NA and Littlewood Y (1998) Caspases: Enemies within. Science 281:1312-1316에 상세히 기술되어 있다. 선행 기술에 나타난 어떠한 프로토콜도 카스파제 활성을 분석하는데 이용된다.
그러나 바람직한 실시태양에서 하기에 나타난 "카스파제 분석 프로토콜"은 카스파제-8 및 카스파제-9 활성을 분석하는데 이용된다.
카스파제 분석 프로토콜
카스파제 활성은 세포벽 내에 고정된 다른 카스파제에 특이적인 형광 기질을 이용함으로서 분석될 수 있다. 세포벽으로의 활성 카스파제를 포함한 세포 용해질의 적용은 기질을 분해하고 표준 형광 플레이트 판독기를 이용하여 검출될 수 있는 형광 생성물을 방출할 것이다.
상세하게는 BD ApoAlertTM Caspase 분석 플레이트(카달로그 번호 K2033-1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, California, USA)는 그의 각각의 활성화된 카스파제에 의해 인식되는 짧은 펩타이드로 구성된 다른 카스파제 기질을 이용한다. 펩타이드는 형광 염료 7-아미노-4-메틸 쿠마린(AMC)에 공유결합으로 결합된다. AMC에 결합된 펩타이드는 UV 범위(λ최대=380 nm)에서 방사되고 결합되지 않은 AMC는 녹색 범위(λ최대=460 nm)에서 방사된다. 이는 시험 표본 내에서 460 nm에서의 형광 강도 증가를 각각의 카스파제의 활성 증가와 상호관련시키는 것을 가능하게 하고, 사용된 기질은 VDVAD-AMC이고 카스파제-9 활성에 대한 분석은 기질로서 LEHD-AMC를 이용한다.
BD ApoAlertTM Caspase 분석 플레이트를 이용하여 카스파제 활성을 분석하기 위해 표본 유래 세포는 원심분리에 의해 펠렛화된 후 1x 세포 용해 완충액(BD Biosciences Clontech) 내에 재현탁되고 얼음 위에서 10분간 인큐베이트된다. 이후 세포 파편은 4℃에서 5분간 원심분리에 의해 제거된다. 이후 50 ㎕의 2X 반응 완충액/DTT 혼합물은 사용될 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가된다. 플레이트는 37℃에서 5분간 예비-인큐베이트된다. 이후 50 ㎕의 적당한 세포 용해질(들)이 웰이 첨가되고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이트된다. 이후 형광 플레이트 판독기는 방출된 AMC의 함량을 측정하는데 이용된다(380 nm에서 여기, 460 nm에서 방사).
카스파제 활성은 참고 표본의 460 nm에서의 절대 방사로부터의 삭감 후 표본의 460 nm에서의 절대 방사로 정의된다. 참고 표본은 참고 0 시간에 채추된 표본이다.
경우에 따라 아폽토시스가 자극되거나 억제된 비율을 측정하기 위해 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 발현 박테로 트랜스펙트된 세포의 카스파제 활성은 무효-벡터(또는 트랜스펙트되지 않은)로 트랜스펙트된 세포와 비교된다.
["카스파제 분석 프로토콜"의 결과]
바람직한 실시태양에서 이러한 방법을 이용하여 분석시 cgFAIM 서열은 세포 내로 트랜스펙트된 경우 관련 cgFAIM 서열로 트랜스펙트되지 않은 세포와 비교시 적어도 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 30%, 40% 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상까지 카스파제-8 또는 카스파제-9 또는 이 둘 모두의 발현을 저해하는 것이 가능하다.
매우 바람직한 실시태양에서 이러한 방법을 이용하여 분석시 cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 서열은 세포 내로 트랜스펙트된 경우 관련 cgFADD, cgPDCD6 또는 cg레퀴엠 서열로 트랜스펙트되지 않은 세포와 비교시 적어도 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 30%, 40% 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상까지 카스파제-8 또는 카스파제-9 또는 이 둘 모두의 발현을 자극하는 것이 가능하다.
멤브레인 변화, DNA 무사분열과 같은 아폽토시스 관련 이벤트 또는 아폽토시스의 다른 생화학적 인증을 검출하는 또다른 분석방법도 기술된 분석방법 대신 또는 이에 더하여 이용될 수 있다.
상동체
개시된 폴리펩타이드는 예를 들어 관련 바이러스/박테리아 단백질, 세포성 상동체 및 합성 펩타이드와 같은 어떠한 원천에서 수득되는 상동적 서열뿐만 아니라 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 따라서 폴리펩타이드는 포유류 특히 설치류(즉, 마우스, 래트 또는 토끼)와 같은 동물을 포함한 다른 종 유래의 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 상동체를 암호화하는 것도 포함한다.
본 발명의 정황상 상동적 서열 또는 상동체는 경우에 따라 적어도 30개 이상, 바람직하게는 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 아미노산 수준에서 예를 들어 서열목록에 나타난 바와 같이 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠과 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89 또는 90% 이상, 바람직하게는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함해야 한다. 본 발명의 정황상 상동적 서열은 바람직하게는 15, 25, 35, 50 또는 100개, 바람직하게는 200, 300, 400 또는 500개 이상의 아미노산 수준에서 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠과 적어도 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 97, 88, 89 또는 90% 이상, 바람직하게는 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함해야 한다. 예를 들어 서열은 cgFADD(바람직하게는 서열번호: 1에 나타난 서열을 포함), cgFAMI(바람직하게는 서열번호: 2에 나타난 서열을 포함), cgPDCD6(바람직하게는 서열번호: 3에 나타난 서열을 포함) 또는 cg레퀴엠(바람직하게는 서열번호: 4에 나타난 서열을 포함)과 지정된 서열 동일성을 지닌다.
상동성이 유사성(즉 유사한 화학적 특성/기능을 지닌 아미노산 잔기)의 측면에서도 고려될 수 있으나 본 발명의 정황상 서열 동일성의 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다. 매우 바람직한 실시태양에서 서열 동일성은 관련 서열의 완전한 길이 즉 관련 유전자의 완전한 길이 또는 전체 길이 서열과 관련하여 측정된다.
상동성 비교는 육안으로 또는 더욱 일반적으로는 용이하게 이용 가능한 비교 프로그램의 원조로 수행될 수 있다. 이들 통상적을 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2 이상의 서열 사이의 % 상동성을 계산할 수 있다.
% 상동성은 인접 서열에 대해 계산된다 즉 하나의 서열은 다른 서열과 정렬되고 하나의 서열 내 각각의 아미노산은 한번에 하나의 잔기씩 다른 서열 내 대응 아미노산과 직접 비교된다. 이는 "언갭된(ungapped)" 정렬로 명명된다. 일반적으로 이러한 언갭된 정렬은 매우 적은 수의 잔기에 대해서만 수행되다(예를 들어 50개 이상의 인접 아미노산).
이는 매우 단순하고 일관성 있는 방법이나 예를 들어 서열의 동일한 쌍 내에서 하나의 삽입 또는 삭제가 하기 아미노산 잔기를 정렬로부터 제거되게 하고, 따라서 전체 정렬이 수행될 때 % 상동성의 큰 감소를 잠재적으로 유발할 것임이 고려되지 못한다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 득점에 부당하게 패널티를 부과하지 않고 가능한 삽입 및 삭제를 고려하도록 최적 정렬을 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬 내 "갭"을 삽입함으로서 달성된다.
그러나 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬 내에 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 동일한 수의 아미노산의 경우 가능한 적은 갭을 지닌 서열 정렬이 - 2개의 비교 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영하는 - 많은 갭을 지닌 것보다 더 높은 득점을 달성할 것이다. "친화성 갭 코스트(Affine gap cost)"는 일반적으로 갭의 존재에 대해 매우 높은 코스트 및 갭 내 각각의 하위 잔기에 대한 적은 패널티를 부과하는데 사용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 물론 높은 갭 패널티는 적은 갭으로 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것을 가능하게 한다. 그러나 서열 비교에 이러한 소프트웨어를 이용시 디폴트 수치를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit package(하기 참조)를 이용시 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭에 대해 -12이고 각 확장에 대해 -4이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 먼저 갭 패널티를 고려하여 최적 정렬의 생성을 요구한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit package(Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST package(Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18 참조), FASTA(Altschul et al, 1990 J MoI. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparison tools을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색으로 이용 가능하다(Ausubel et ah, 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 내지 7-60 참조). 그러나 GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다.
최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있더라도 정렬 과정 그 자체는 일반적으로 전부-또는-전무(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신에 일반적으로 눈금이 있는 유사성 득점 매트릭스가 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 이원비교(pairwise comparison)에 점수를 할당하는데 이용된다. 일반적으로 이용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - 프로그램 BLAST 한 벌에 대한 디폴트 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 수치 또는 공급되는 경우 맞춤 기호 비교를 이용한다(또다른 상세한 설명은 사용자 설명서 참조). 일부 적용을 위해 GCG 팩키지의 경우 공개 디폴트 수치를 이용하고, 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.
소프트웨어가 최적 정렬을 생성하면 % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 일반적으로 소프트웨어는 서열 비교의 일부로서 이를 수행하고 수적인 결과를 생성한다.
바람직한 실시태양에서 서열 유사성, 동일성, 상동성 또는 상보성은 비교를 위해 사용되는 관련 서열의 전체 길이에 대해 조정된다.
변이체 및 유도체
여기서 기술된 아미노산 서열과 관련한 "변이체" 또는 "유도체"라는 용어는 서열로부터 또는 이에 대해 하나(또는 그 이상)의 아미노산의 어떠한 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 또는 삭제를 포함한다. 바람직하게는 수득된 아미노산 서열은 변형되지 않은 서열과 동일한 활성을 실질적으로 보유하고, 바람직하게는 서열목록에 나타난 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 폴리펩타이드와 적어도 동일한 활성을 지닌다. 따라서 서열의 주요 특징 - 즉 이들이 하나 이상의 아폽토시스 과정을 조절하는 것이 가능한 - 은 바람직하게는 유지된다.
실시예에 나타난 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또느 상동체는 여기서 기술된 방법 또는 비교에 이용하기 위해 변형되기도 한다. 일반적으로 변형은 서열의 생물학적 활성을 유지시키게 한다. 변형된 서열이 변형되지 않은 서열의 생물학적 활성을 보유하는 한 아미노산 치환은 예를 들어 1, 2 또는 3부터 10, 20 또는 30까지의 치환과 같이 이루어진다. 아미노산 치환은 치료적으로 투여된 폴리펩타이드의 혈장 반감기를 증가시키기 위한 비-자연 발생적 아날로그의 이용을 포함한다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠의 천연 변이체는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 치환은 하기 표에 따라 정의된다. 두 번째 컬럼 내 동일한 블록 내, 바람직하게는 세 번째 컬럼 내 동일한 칸 내의 아미노산은 서로 치환된다:
단편
또한 여기서 개시되고 마커로 유용한 폴리펩타이드는 서열목록에 나타난 서열의 단편을 포함한 상기 논의된 전체 길이 폴리펩타이드 및 그의 변이체의 단편을 포함한다.
또한 폴리펩타이드는 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 중 어느 하나의 전체 길이 서열의 단편을 포함한다. 바람직하게는 단편은 적어도 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 에피토프의 확인 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 단편은 일반적으로 적어도 6개 이상, 더욱 바람직하게는 10, 20, 30, 50 또는 100개 이상의 아미노산을 포함한다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 아미노산 서열 유래의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 또는 150개 이상의 잔기를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성된 단편이 포함된다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 단백질의 폴리펩타이드 단편 및 그의 대립성 및 종 변이체는 보존된 치환을 포함한 하나 이상의(즉 5, 10, 15 또는 20) 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 예를 들어 다른 종 내에서 치환, 결실 및/또는 삽입이 발생하는 경우 바람직하게는 서열목록에 나타난 50%, 40% 또는 20% 이하의 아미노산 잔기가 변경된다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 및 그의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체는 재조합 방법에 의해 제조된다. 그러나 이들은 고형상 합성과 같은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용한 합성 방법에 의해서도 제조된다. 또한 단백질은 예를 들어 추출 및 정제를 촉진하기 위해 융합 단백질로서 생성된다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-전이효소(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성화 도메인) 및 β갈락토시다제를 포함한다. 또한 융합 단백질 서열의 제거를 가능하게 하기 위해 융합 단백질 파트너와 목적 단백질 서열 사이에 단백질분해성 분열 사이트를 포함하는 것이 편리하다. 바람직하게는 융합 단백질은 목적 서열 단백질의 기능을 방해하지 않을 것이다. 또한 단백질은 동물 세포 유래 세포 추출물의 정제에 의해서도 수득된다.
여기서 개시된 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 폴리펩타이드, 변이체, 상동체, 단편 및 유도체는 실질적으로 분리된 형태이다. 이러한 폴리펩타이드가 단백질의 의도된 목적을 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합되고 여전히 실질적으로 분리된 것으로 간주됨이 이해될 것이다. 또한 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체는 실질적으로 정제된 형태이고, 이러한 경우 일반적으로 제제 내 90% 이상, 예를 들어 95%, 98% 또는 99%의 단백질이 단백질인 제제 내 단백질을 포함할 것이다.
여기서 개시된 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 폴리펩타이드, 변이체, 상동체, 단편 및 유도체는 표시 표지로 표지된다. 표시 표지는 폴리펩타이드 등이 검출되게 하는 어떠한 적당한 표지도 된다. 적당한 표지는 방사성 동위원소 예를 들어 125I, 효소, 항체, 폴리뉴클레오타이드 및 비오틴과 같은 링커를 포함한다. 표지된 폴리펩타이드는 표본 내 폴리펩타이드의 함량을 측정하기 위한 면역분석과 같은 진단 절차에 이용된다. 또한 폴리펩타이드 또는 표지된 폴리펩타이드는 표준 프로토콜을 이용하여 동물 및 인간 내에서 상기 폴리펩타이드에 대한 면역 반응성 검출에 대한 혈청학적 또는 세포-매개 면역 분석에도 이용된다.
선택적으로 표지되는 여기서 개시된 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 폴리펩타이드, 변이체, 상동체, 단편 및 유도체는 예를 들어 면역분석 웰 또는 딥스틱(dipstick)의 표면과 같은 고형상에 고정된다. 이러한 표지되거나 고정된 폴리펩타이드는 적당한 시약, 조절제, 지침과 함께 적당한 용기 내에 키트로 포장된다. 이러한 폴리펩타이드 및 키트는 면역분석에 의해 폴리펩타이드 또는 그의 대립유전성 또는 종 변이체에 대한 항체의 검출 방법에 이용된다.
면역분석 방법은 당분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 (a) 단백질에 대한 항체에 의해 결합 가능한 에피토프를 포함한 폴리펩타이드를 제공하는 단계; (b) 항체-항원 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 폴리펩타이드와 생물학적 표본을 인큐베이트시키는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드를 포함한 항체-항원 복합체가 형성되는지 여부를 측정하는 단계를 포함할 것이다.
여기서 개시된 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 폴리펩타이드, 변이체, 상동체, 단편 및 유도체는 질병 내 기능을 포함한 세포 기능의 대응 유전자 및 그의 상동체의 역할을 연구하기 위한 시험관 내 또는 생체 내 세포 배양 시스템에 이용된다. 예를 들어 절단되거나 변형된 폴리펩타이드는 세포 내로 도입되어 세포 내에서 발생하는 정상 기능을 붕괴시킨다. 폴리펩타이드는 재조합 발현 벡터(하기 참조) 유래의 폴리펩타이드의 원 위치 발현에 의해 세포 내로 도입된다. 발현 벡터는 선택적으로는 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 유도 가능한 프로모터를 지닌다.
곤충 세포 또는 포유류 세포와 같은 적당한 숙주 세포의 이용은 재조합 발현 생성물 상에 최적 생물학적 활성을 부여하는데 필요하므로 이러한 후-번역적 변형(예를 들어 미리스톨레이션(myristolation), 당화, 절단, 지질화 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 인산화)을 제공할 것으로 기대된다. 여기서 개시된 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 폴리펩타이드, 변이체, 상동체, 단편 및 유도체가 발현되는 이러한 세포 배양 시스템은 세포 내 폴리펩타이드의 기능을 방해하거나 증진시키는 후모 물질을 확인하는 분석 시스템에 이용된다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 핵산
본 발명은 일반적으로 다수의 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 핵산과 함께 그의 단편, 상동체, 변이체 또는 유도체를 제공한다. 이들 핵산 서열은 바람직하게는 여기, 특히 서열목록에 개시된 폴리펩타이드 서열을 암호화한다.
바람직하게는 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 각각 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7 및 서열번호: 8로 구성된 군에서 선택된 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 핵산을 포함한다.
특히 본 발명은 여기서 개시된 크리세툴루스 그리세우스 폴리펩타이드 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 따라서 "cgFADD 서열", "cgFADD 서열", "cgPDCD6 서열" 및 "cg레퀴엠 서열"이라는 용어는 이에 따라 해석되어야 한다. 그러나 바람직하게는 이러한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 5 내지 16 및 서열번호: 37, 38, 39 및 40에 나타난 서열 중 어느 하나 또는 대응 폴리펩타이드 중 어느 하나를 암호화하는 서열 및 이러한 핵산의 단편, 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 따라서 상기 용어는 바람직하게는 이들 서열을 나타내어야 한다.
본 발명에서 사용된 "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드" 및 핵산 이라는 용어는 서로 동의어가 되어야 한다. "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA인 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오타이드를 나타낸다. "폴리뉴클레오타이드"는 제한 없이 단일- 및 이중-나선 DNA, 단일- 및 이중-나선 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-나선 RNA 및 단일- 및 이중-나선 영역의 혼합물인 RNA, 단일-나선 또는 더욱 일반적으로는 이중-나선 또는 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA 및 RNA를 포함한 하이브리드 분자를 포함한다. 더욱이 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 모두를 포함한 삼중-나선 구역을 나타낸다. 또한 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 하나 이상의 변형된 염기를 포함한 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸레이트된(tritylated) 염기 및 이노신과 같은 특정 염기를 포함한다. 다양한 변형은 DNA 및 RNA에서 이루어지고, 따라서 "폴리뉴클레오타이드"는 자연 내에서 일반적으로 발견되는 폴리펩타이드의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특성의 화학적 형태를 포함한다. 또한 "폴리뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드로 표기되는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
많은 다른 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 유전자 코드의 퇴화 결과로 동일한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 더욱이 일반적 기술을 이용하여 당업자가 폴리펩타이드가 발현되는 어떠한 특정 숙주 세포의 코돈 용법을 반영하도록 여기서 기술된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오타이드 치환을 생성함이 이해된다.
변이체, 유도체 및 상동체
여기서 기술된 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 이들은 단일-나선 또는 이중-나선이다. 또한 이들은 합성 또는 변형된 뉴클레오타이드 내에 포함된다. 올리고뉴클레오타이드로의 많은 다른 형태의 변형은 당분야에 알려져 있다. 이들은 메틸포스포테이트 및 포스포로티오에이트 백본, 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서의 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적으로 여기서 기술된 폴리뉴클레오타이드가 당분야에서 이용 가능한 어떠한 방법에 의해서도 변형됨이 이해되어야 한다. 이러한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 생체 내 활성 또는 수명을 증가시키기 위해 수행된다.
폴리뉴클레오타이드가 이중-나선인 경우 이중선의 두 나선 모두는 개별적으로 또는 결합되어 여기서 기술된 방법 및 조성물에 포함된다. 폴리뉴클레오타이드가 단일-나선인 경우 폴리뉴클레오타이드의 상보적 서열도 포함됨이 이해되어야 한다.
뉴클레오타이드 서열과 관련한 "변이체", "상동체" 또는 "유도체"라는 용어는 서열로부터 또는 이에 대한 하나의(또는 그 이상의) 뉴클레오타이드의 어떠한 치환, 변이, 변형, 대치, 결실 또는 첨가도 포함한다.
상기 나타난 바와 같이 서열 동일성에 있어서 "상동체"는 바람직하게는 서열목록에 나타난 관련 서열과 적어도 5% 이상의 동일성, 적어도 10% 이상의 동일성, 적어도 15% 이상의 동일성, 적어도 20% 이상의 동일성, 적어도 25% 이상의 동일성, 적어도 30% 이상의 동일성, 적어도 35% 이상의 동일성, 적어도 40% 이상의 동일성, 적어도 45% 이상의 동일성, 적어도 50% 이상의 동일성, 적어도 55% 이상의 동일성, 적어도 60% 이상의 동일성, 적어도 65% 이상의 동일성, 적어도 70% 이상의 동일성, 적어도 75% 이상의 동일성, 적어도 80% 이상의 동일성, 적어도 85% 이상의 동일성, 적어도 90% 이상의 동일성또는 적어도 95% 이상의 동일성을 지닌다.
더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 96% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 97% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 이상의 동일성이 존재한다. 뉴클레오타이드 상동성 비교는 상기 기술된 바와 같이 수행된다. 바람직한 서열 비교 프로그램은 상기 기술된 GCG Wisconsin Bestfit 프로그램이다. 디폴트 득점 매트릭스는 각각의 동일한 뉴클레오타이드에 대해 10 및 각각의 불일치에 대해 -9의 일치 수치를 지닌다. 각각의 뉴클레오타이드에 대해 디폴트 갭 생성 패널티는 -50이고 디폴트 갭 확장 패널티는 -3이다.
바람직한 실시태양에서 cgFAIM 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 5에 나타난 서열에 대해 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 지닌다. 바람직하게는 cgFAIM 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 5에 나타난 서열에 대해 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상의 서열 동일성을 지닌다.
유사하게는 바람직한 실시태양에서 cgFADD 서열은 서열번호: 6에 나타난 서열에 대해 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 지닌다. 바람직하게는 cgFADD 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 6에 나타난 서열에 대해 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상의 서열 동일성을 지닌다.
바람직한 실시태양에서 cgPDCD6 서열은 서열번호: 7에 나타난 서열에 대해 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 지닌다. 바람직하게는 cgPDCD6 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 7에 나타난 서열에 대해 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상의 서열 동일성을 지닌다.
바람직한 실시태양에서 cg레퀴엠 서열은 서열번호: 8에 나타난 서열에 대해 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 지닌다. 바람직하게는 cg레퀴엠 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 8에 나타난 서열에 대해 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상의 서열 동일성을 지닌다.
혼성화
또한 본 발명은 여기서 나타난 어떠한 서열에도 선택적으로 혼성화하는 것이 가능한 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이체, 단편 또는 유도체 또는 상기의 어느 하나의 상보체를 기술한다. 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 적어도 15개 이상의 뉴클레오타이드 길이, 더욱 바람직하게는 20, 30, 40 또는 50개 뉴클레오타이드 길이이다.
여기서 사용된 "혼성화"이라는 용어는 "핵산의 나선이 염기 대합을 통해 상보적 나선과 결합되는 과정"뿐만 아니라 중합효소 연쇄 반응 기술에서 수행되는 바와 같은 증폭 과정도 포함해야 한다.
여기서 나타난 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 적어도 20개 이상, 바람직하게는 적어도 25 또는 30개 이상, 예를 들어 적어도 40, 60 또는 100개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 여기서 나타난 대응 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 또는 98% 이상 상동적일 것이다.
"선택적으로 혼성화"라는 용어는 프로브로 사용된 폴리뉴클레오타이드가 타겟 폴리뉴클레오타이드가 배경보다 유의적으로 상위인 수준으로 프로브에 혼성화하는 것으로 나타난 조건 하에서 이용됨을 의미한다. 배경 혼성화는 선별되는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 나타난 다른 폴리뉴클레오타이드로 인해 발생된다. 이러한 이벤트시 배경은 타겟 DNA에서 관찰되는 특이적 상호작용 강도의 10배 이하, 바람직하게는 100배 이하인 프로브와 라이브러리의 비-특이적 DNA 멤버 사이의 상호작용에 의해 생성된 신호 수준을 의미한다. 상호작용의 강도는 예를 들어 32P와 같은 프로브를 방사성동위원소 표지함으로서 측정된다.
혼성화 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA) 내에 지침된 바와 같이 핵산 결합 복합체의 용융 온도(Tm)에 기반하고 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시"로 명명된다.
최대 스트린전시는 일반적으로 약 Tm-5℃(프로브의 Tm의 5℃ 이하)에서; 높은 스트린전시는 Tm의 약 5∼10℃ 이하에서; 중간 스트린전시는 Tm의 약 10∼20℃ 이하에서; 낮은 스트린전시는 Tm의 약 20∼25℃ 이하에서 발생한다. 당업자에게 이해되는 바와 같이 최대 스트린전시 혼성화는 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있는 반면 중간(또는 낮은) 스트린전시 혼성화는 유사하거나 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있다.
바람직한 관점에서 본 발명은 스트린전트 조건(예를 들어 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 구연산Na3 pH 7.0})하에서 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 핵산 또는 그의 단편, 상동체, 변이체 또는 유도체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 개시한다.
폴리뉴클레오타이드가 이중-나선인 경우 이중선의 두 나선 모두는 개별적으로 또는 결합되어 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오타이드가 단일-나선인 경우 폴리펩타이드의 상보적 서열도 개시되고 포함됨이 이해되어야 한다.
여기서 개시된 서열에 100% 상동적이지 않으나 본 발명 내에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 많은 방법으로 수득될 수 있다. 여기서 기술된 서열의 또다른 변이체는 예를 들어 다른 집단 유래의 개체와 같은 광범위한 개체로부터 제조된 DNA 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 더욱이 다른 바이러스성/박테리아성 또는 세포성 상동체 특히 포유류 세포(예를 들어 토끼, 마우스, 소 및 영장류 세포)에서 발견되는 세포성 상동체가 수득되고 이러한 상동체 및 그의 단편은 일반적으로 서열목록에 나타난 서열에 선택적으로 혼성화하는 것이 가능할 것이다. 이러한 서열은 다른 동물종으로부터 제조된 cDNA 라이브러 또는 다른 동물종 유래의 게놈 DNA 라이브러리를 프로브하고 중간 내지 높은 스트린전시 조건 하에서 이러한 라이브러리를 서열번호: 1∼40의 전부 또는 일부를 포함한 프로브로 프로브함으로서 수득된다. 유사한 참작은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠의 종 상동체 및 대립유전성 변이체를 수득하는데 적용된다.
여기서 기술된 폴리뉴클레오타이드는 PCR 프라이머와 같은 프라이머, 대안적 증폭 반응용 프라이머, 방사성 또는 비-방사성 표지를 이용한 종래 방법에 의한 표시 표지로 표지된 프로브를 생성하는데 이용되거나 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내로 클론된다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 적어도 15개 이상, 바람직하게는 적어도 20개 이상, 예를 들어 적어도 25, 30 또는 40개 이상의 뉴클레오타이드 길이가 될 것이고 여기서 사용된 폴리뉴클레오타이드 용어에 포함된다. 바람직한 단편은 500, 200, 100, 50 또는 20개 이하의 뉴클레오타이드 길이이다.
DNA 폴리뉴클레오타이드 및 프로브와 같은 폴리뉴클레오타이드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 당업자에게 이용 가능한 방법에 의해 생성된다. 이들은 표준 기술에 의해서도 클론된다.
일반적으로 프라이머는 한번에 하나의 뉴클레오타이드씩 원하는 핵산 서열의 단계별 제조를 포함한 합성 방법에 의해 생성될 것이다. 자동화된 기술을 이용한 이를 달성하는 기술은 당분야에 용이하게 이용 가능하다.
더 긴 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 재조합 방법을 이용하여 예를 들어 PCR(중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 이용하여 생성될 것이다. 이는 클론하기 원하는 서열의 영역의 측면에 위치한 프라이머 쌍(예를 들어 약 15∼30개 뉴클레오타이드)을 제조하고, 상기 프라이머를 동물 또는 인간 세포에서 수득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 원하는 영역의 증폭을 야기하는 조건 하에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하고, 증폭된 단편을 분리하고(예를 들어 아가로스 겔 상에서 반응 혼합물을 정제함으로서), 증폭된 DNA를 회수하는 단계를 포함한다. 프라이머는 적당한 제한 효소 인식 사이트를 포함하도록 고안되어 증폭된 DNA가 적당한 클로닝 벡터 내로 클론될 수 있다.
CG 서열의 이용
실시예에 나타난 바와 같이 본 발명은 세포 내 아폽토시스 매개에 관련된 4개 유전자를 수립하였다.
또한 본 발명은 그의 활성의 조절에 의한 이러한 유전자의 타겟팅이 아폽토시스의 감소에 따른 증가된 세포 활성을 유발함을 나타낸다. 따라서 유전자 및 폴리펩타이드 및 그의 생성물은 예를 들어 세포 배양물과 같은 많은 분야에서 유용성을 지닌다.
따라서 미국 특허 제6,586,206호는 원하는 단백질의 증가된 생성량의 효과를 지닌, 배양된 숙주 세포를 이용한 재조합 단백질 생성시 아폽토시스 저해제의 이용을 기술한다. 따라서 크리세툴루스 그리세우스 FAIM, FADD, PDCD6 및 레퀴엠 서열의 개시는 세포 배양물 내 이들 유전자의 타겟팅이 세포 활성을 증가시키고 재조합 단백질 생성의 증가된 생성량을 증진시킬 수 있다. 상세하게는 본 발명은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 변형 세포를 기술하고, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포, 더욱 바람직하게는 중국 햄스터 난소 세포가 증가된 생성량을 지닌 재조합 단백질 의 생성에 적당하게 이용된다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 변형 세포
여기서 기술된 방법 및 조성물에 따라 세포 내 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 중의 하나 이상의 조절은 개체군, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 개체군의 세포 활성을 개선시킨다. 특히 본 발명은 실시예에서 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 감소뿐만 아니라 cgFAIM의 증가된 발현이 증가된 세포 활성을 도출함을 나타낸다.
그러나 작용제 및 길항제와 같은 조절제 실재의 이용을 포함한 이들 어떠한 유전자의 조절 방법도 폴리펩타이드 발현 조절에 추가로 또는 이에 대안으로 이용됨이 인식될 것이다.
이들 유전자 중의 하나 이상의 발현이 조절된 세포는 "변형된" 세포로 편의상 표기된다 - 이들이 그 자체가 물리적으로 변형된 것이 아니라 변형 세포의 자손임이 인식될 것임. 본 발명은 상세하게는 cgFAIM 발현이 상향-조절된 세포뿐만 아니라 cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 발현 또는 이의 어떠한 결합이 하향-조절된 세포도 제공한다. 따라서 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 중 하나, 둘, 셋 또는 넷 모두의 발현이 변형 세포 내에서 조절됨이 인식될 것이다. 변형은 변형 양식에 따라 일시적이거나 영구적이거나 장기간이 된다.
변형 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포, 가장 바람직하게는 CHO 세포를 포함한다. 이들은 설치류 세포, 바람직하게는 마우스 또는 래트 세포를 포함한다. 바람직하게는 이러한 변형 세포는 크리세툴루스 그리세우스 세포, 가장 바람직하게는 CHO 세포를 포함한다. 그러나 이들은 원숭이 세포 또는 인간 세포와 같은 영장류 세포를 포함하기도 한다.
관련 세포는 당분야에 알려진 어떠한 방법에 의해 관련 유전자를 타겟함으로서 변형된다.
하나의 가능한 접근은 cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠에 대해 지시된 안티-센스 컨스트럭트를 발현시키고 유전자 기능을 저해하고 관련 폴리펩타이드의 발현을 방지하는 것이다. 또다른 접근은 세포 사멸 기구의 세포 구성요소에 대해 내인성 유전자 생성물과 경쟁하는 cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드의 비-기능성 변이체를 이용하여 기능 저해를 유발하는 것이다. 대안으로 cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 상기 기술된 분석방법에 의해 확인된 화합물이 세포에 투여되어 폴리펩타이드의 기능을 방지하는 것이다. 이는 예를 들어 재조합 DNA 기술 또는 화합물의 직접적 투여에 의해 수행된다. cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠에 대해 지시되는 적당한 항체도 작용제로 이용된다.
대안으로 이중-나선(ds) RNA는 포유류에서 성공적인 것으로 최근 나타난 광범위한 생물체 내 유전자 발현을 방해하는 강력한 방법이다(Wianny and Zernicka-Goetz, 2000, Nat Cell Biol 2000, 2, 70-75). cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 이중 나선 RNA가 세포 또는 세포주 내로 도입되거나 발현되어 세포 활성을 증가시킬 수 있다.
특히 본 발명은 단일 간섭 RNA(siRNA)의 이용뿐만 아니라 발현 감소를 원하는 우성 음성 돌연변이의 이용에 의한 변형을 기술한다. 또한 본 발명은 관련 유전자의 발현을 증가시키기 위해 관련 서열의 과-발현을 가능하게 하는 벡터의 이용을 기술한다. 변형은 일시적이거나 영구적이다. 따라서 본 발명은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 내 게놈 및 유전성 변형을 지닌 세포를 포함한 세포주를 제공한다. 이러한 세포주를 수립하기 위한 상세한 프로토콜은 실시예에 나타나 있다.
변형 세포는 단일 세포, 세포군, 클론, 클론 라인, 콜로니, 세포주 또는 조직으로 제공된다. 또한 본 발명은 세포가 cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 하향-조절된 발현 또는 cgFADD의 상향-조절된 발현 또는 이 둘 모두를 포함한 형질전환 동물을 제공한다.
바람직하게는 우성 돌연변이는 서열번호: 9에 나타난 서열을 포함한 cgFADD 우성 돌연변이를 포함한다. 대안으로 또는 이에 더하여 서열은 하기를 포함한다:
FDIVCDNVGRDWKRLARQLKVSEAKIDGIEERYPRSLSEQVREALRVWKIAEREKATVAGLVKALRACRLNLVADLVE
우성 돌연변이는 서열번호: 10에 나타난 서열 또는 대안으로 하기에 의해 암호화된다:
TTTGACATTGTATGCGACAATGTGGGGAGAGATTGGAAGAGACTGGCCCGCCAGCTGAAAGTGTCTGAGGCCAAAATTGATGGGATTGAGGAGAGGTACCCCCGAAGCCTGAGTGAGCAGGTAAGGGAGGCTCTGAGAGTCTGGAAGATTGCCGAGAGGGAGAAAGCCACGGTGGCTGGACTGGTAAAGGCACTTCGGGCCTGCCGGCTGAACCTGGTGGCTGACCTGGTGGAA
증가된 세포 활성
변형 세포는 동족 비-변형 세포 또는 야생형 세포 또는 이들이 유래된 모세포와 비교시 여러 유익한 특성을 지닌다. 이들은 증가된 세포 활성을 지닌 특성을 지닌다. 따라서 이들은 배양시 시간 또는 세대수의 측면에서 장기간 생존한다.
바람직하게는 세포 활성은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠을 타겟함으로서 변형 세포군의 활성 세포 밀도를 정량화함으로서 측정된다. 바람직하게는 변형 세포는 변형되지 않은 세포(즉, 대조군 개체군)와 비교시 더 높은 세포 활성을 유지한다. 세포 활성은 바람직하게는 활성인 관련 세포군 내 세포 비율로서 측정된다.
바람직한 실시태양에서 세포 활성은 "트리판 블루 활성 배제 분석방법"에 의해 측정된다. 본 분석방법은 세포 배양 분야에서 세포 활성 측정을 위해 일반적으로 이용된다. 상세한 프로토콜은 실시예에 나타나 있으나 간략하게는: 세포 현탁액이 인산 완충용액 내의 0.4% 트리판 블루와 혼합되고 혈구계를 이용하여 계산된다. 생세포는 원형이고 어떠한 청색-염료도 없이 굴절력이 있는 반면 사멸 세포는 염료를 흡수하여 청색을 나타낸다. 이후 활성은 계산된 총 세포에 대한 활성 세포의 비율로서 표현된다.
활성 세포는 멤브레인 완전성이 트리판 블루 배제 활성 분석방법시 트리판의 흡수를 여전히 방지할 수 있는 세포로서 정의된다.
바람직하게는 변형 세포는 대조군 개체군과 비교시 적어도 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 더욱 바람직하게는 15%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상의 활성 세포를 지닌다. 대안으로 또는 이에 더하여 변형 세포는 변형되지 않은 세포와 비교시 장기간 동안 세포 활성을 유지한다. 예를 들어 변형 세포는 대조군 세포와 비교시 장기간 동안 특정 비율의 세포 활성(예를 들어 95%)을 유지할 수 있다.
바람직하게는 변형 세포는 대조군 세포와 비교시 적어도 1시간 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 6시간 이상, 가장 바람직하게는 적어도 12시간 이상, 예를 들어 적어도 24시간 이상, 적어도 36시간 이상 또는 적어도 48시간 이상까지 연장된 세포 활성을 지닌다. 매우 바람직한 실시태양에서 변형 세포는 대조군 세포와 비교시 활성이 95% 이하로 저하되기 시작하기 전 적어도 24시간 이상까지 연장된 활성을 지닌다.
변형 세포는 바람직하게는 비변형된 대조군 세포와 비교시 더 높게 활성적인 배양물 밀도가 가능하다. 바람직하게는 변형 세포는 대조군 세포와 비교시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% 이상 더 높게 활성적인 세포 밀도가 가능하다. 예를 들어 변형 세포는 9.6 × 106 세포/ml 정도로 높은 밀도를 달성한다.
변형 세포는 바람직하게는 아폽토시스 마커, 바람직하게는 카스파제 2, 카스파제 3 또는 카스파제 8의 발현의 지연된 착수를 나타낸다. 변형 세포는 개체 세포에 대한 장시간의 생존률 또는 아폽토시스를 나타내는 세포 수의 측면에서 감소된 아폽토시스를 나타내는 특성을 지닌다. 바람직하게는 이들은 아폽토시스에 대한 저항적 특성을 지닌다(하기 참조).
증가된 단백질 생성량
유리하게는 변형 세포는 실시예 21에 나타난 바와 같이 비변형된 대조군 세포와 비교시 증가된 단백질 생성량, 바람직하게는 증가된 재조합적으로 발현된 단백질 생성량이 가능하다. 바람직하게는 변형 세포는 대조군 세포와 비교시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% 이상 더 높은 생성량이 가능하다. 더욱 바람직하게는 변형 세포는 대조군 세포와 비교시 2.5x, 3x, 5x, 10x 이상 더 높은 생성량이 가능하다. 바람직하게는 재조합적으로 발현된 단백질은 인터페론 감마를 포함한다. 따라서 본 발명은 상기 기술된 변형 세포 내의 재조합 단백질, 바람직하게는 바이오치료 분자의 발현 방법을 제공한다.
바람직하게는 변형 세포는 일괄 배양, 유가 배양 또는 바람직하게는 이 둘 모두에서 하나 이상의 이들의 특성을 나타낸다.
증가된 당화
변형 세포는 바람직하게는 대조군 비변형 세포와 비교시 발현 단백질의 증가된 당화가 가능하다. 실시예는 세포 배양 활성의 소실이 발생하는지 여부에 관계 없이 변형 세포가 연장된 세포 배양 시간 동안 단백질 당화를 유지하는 것이 가능하다. 매우 바람직한 실시태양에서 당화는 시알화를 포함한다.
낮은 정도의 시알화가 생체 내에서 단백질-기반 약물의 반감기를 감소시킬 수 있기 때문에 이러한 변형 세포의 특성은 특히 바이오치료제의 제조에 유리하다(Varki, 1993, Biotechnol Bioeng 43:423-428; Gramer et al., 1995, Glycobiology 3:97-130).
바람직한 실시태양에서 발현 단백질의 당화는 하나 이상의 세포 배양 생장 시기 동안, 바람직하게는 적어도 일부의 지수 시기 동안(바람직하게는 적어도 중간-지수 시기 동안), 더욱 바람직하게는 최대 활성 세포 밀도가 발생하는 시점 동안, 더욱 바람직하게는 세포 사멸이 모세포 또는 비변형 세포에서 발생하는 시점 동안 실질적으로 유지된다. 이러한 경우 당화 수치는 바람직하게는 모세포 또는 비변형 세포에서 감소되는 수치에서 유지된다. 바람직한 실시태양에서 당화는 적어도 발현 단백질 몰 당 2.7 몰 이상, 바람직하게는 적어도 2.9 몰 이상의 당 수치에서 유지된다.
바람직한 실시태양에서 변형 세포에 의한 발현 단백질의 당화는 생장 시기 내 동족 시점에서 모세포 또는 비변형 세포와 비교시 증가된다. 이러한 바람직한 실시태양에서 당화는 발현 단백질 몰 당 2.9 몰 이상, 바람직하게는 적어도 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 또는 3.5 몰 이상의 당 수치에서 유지된다.
또한 본 발명은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 발현을 조절함으로서 상기 특성 중 어느 하나를 나타내도록 세포를 변형시키는 방법을 제공한다.
아폽토시스
본 발명에 따라 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 변형 세포의 세포 활성 증가는 변형 세포군 내 아폽토시스 감소에서 유발된다. 이러한 변형 세포는 감소된 아폽토시스를 나타내거나 아폽토시스에 저항적이다. 변형 세포는 대조군 세포와 비교시 바람직하게는 더 긴 기간 동안 더 높은 활성 세포 밀도를 유지하는 것이 가능하다. 바람직하게는 변형 개체군 내 활성 세포수는 비변형 대조군 개체군과 비교시 예를 들어 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200%, 500% 이상으로 더 높다.
바람직하게는 변형 세포는 대조군 세포와 비교시 적어도 6시간 이상, 적어도 12시간 이상, 바람직하게는 적어도 18시간 이상 및 가장 바람직하게는 적어도 24시간 이상까지 활성 연장을 나타낸다. 매우 바람직한 실시태양에서 카스파제 2 및/또는 카스파제 3 및/또는 카스파제 8 발현은 대조군 세포와 비교시 이러한 시간까지 지연된다.
따라서 바람직하게는 변형 세포군 내 아폽토시스는 대조군 개체군과 비교시 적어도 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 40%, 50%, 75%, 95% 이상까지 지연된다. 바람직한 실시태양에서 변형 세포군 내 아폽토시스 세포의 비율은 이러한 양까지 감소된다. 매우 바람직한 실시태양에서 변형 세포는 아폽토시스에 대해 저항적이고, 즉 유의적인 아폽토시스를 거의 또는 전혀 나타내지 않는다.
아폽토시스의 분석 방법은 당분야에 알려져 있고 하기 및 실시예에 상세히 기술되어 있다. 바람직한 아폽토시스 분석 방법은 실시예 14: 아폽토시스 분석방법에 나타나 있다.
아폽토시스의 대안적 분석방법은 관련 세포 내 카스파제 2, 카스파제 3 및 카스파제 8 중의 어느 하나의 수치의 정량화 또는 측정을 포함한다. 따라서 바람직하게는 이들 카스파제 중 어느 하나의 수치는 변형되지 않은 세포와 비교시 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% 이상까지 변형 세포 내에서 감소된다. 바람직하게는 변형 세포는 변형되지 않은 대조군 세포와 비교시 바람직하게는 적어도 1시간 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 6시간 이상, 가장 바람직하게는 적어도 12시간 이상, 예를 들어 적어도 24시간 이상, 적어도 36시간 이상, 적어도 48시간 이상, 적어도 72시간 이상, 적어도 144시간 이상, 적어도 288시간 이상까지 카스파제 2, 카스파제 3 및 카스파제 8 중의 어느 하나의 발현 지연을 나타낸다. 카스파제 수치는 RT-PCR, RNAse 보호, SDS-PAGE, 면역분석 등을 포함하여 당분야의 어떠한 방법에 의해서도 분석된다.
세포 삼령은 2가지 별도의 메커니즘인 괴사 또는 아폽토시스에 의해 발생할 수 있다. 더욱이 특정 화학 화합물 및 세포는 세포에 세포독성적 즉 사멸을 유발하는 것으로 간주된다.
"세포독성"은 화학 화합물(식품, 화장품 또는 약제와 같은) 또는 매개자 세포(세포독성 T 세포)의 세포 사살 특성을 나타낸다. 괴사 및 아폽토시스와 대조적으로 세포독성이라는 용어는 특정 세포 사멸 메커니즘을 항상 나타내는 것은 아니다. 예를 들어 세포 매개된 세포독성(즉 세포독성 T 림프구[CTL] 또는 자연 살상[NK] 세포)에 의해 매개된 세포 사멸은 괴사와 아폽토시스 모두의 일부 측면을 결합시킨다.
"괴사"(또한 "우발적" 세포 사멸로도 표기됨)는 세포가 심각한 물리적 또는 화학적 손상에 노출시 발생하는 병리적 과정을 나타낸다. 괴사는 세포가 플라스마 멤브레인의 손상을 유발하는 생리적 조건(예를 들어 저체온증, 저산소증)으로부터의 과도한 변동에 노출시 발생한다. 생리적 조건 하에서 플라스마 멤브레인의 직접적인 손상은 보체 및 세포용해 바이러스 유사 작용제에 의해 야기된다. 괴사는 세포의 항상성 유지 능력의 손상으로 시작되어 물과 세포외 이온의 유입을 도출한다. 세포내 소기관, 가장 현저하게는 미토콘드리아 및 전체 세포가 팽창되고 파열된다(세포 용해). 플라스미 멤브레인의 최종 파열로 인해 리소좀 효소를 포함한 세포질 함유물이 세포외액 내로 방출된다. 따라서 생체 내에서 괴사성 세포 사멸은 강한 염증 반응을 유발하는 광범위한 조직 손상과 관련된다.
"아폽토시스"("정상" 또는 "프로그램화된" 세포 사멸)는 원치 않거나 필요업는 세포가 발달 및 다른 정상 생물학적 과정 동안 제거되는 생리적 과정을 나타낸다. 아폽토시스는 정상 생리적 조건 하에서 발생하는 세포 사멸의 양식이고 세포는 자신의 소멸에 활성적인 참여자이다("세포성 자살"). 이는 정상 세포 전환 및 조직 항상성, 배아발생, 면역 내성의 유도 및 유지, 신경계의 발달 및 내분비의존성 조직 위축 동안 가장 빈번하게 발견된다. 아폽토시스를 진행하는 세포는 특징적인 형태 및 생화학적 특징을 나타낸다. 이들 특징은 크로마틴 응집, 세포핵 및 세포질 응축, 리보솜을 포함한 멤브레인 결합된 소포(아폽토시스 소체) 내로의 세포질 및 세포핵의 분할, 형태적으로 손상되지 않은 미토콘드리아 및 세포핵 물질을 포함한다. 생체 내에서 이들 아폽토시스 소체는 대식세포 또는 인접 상피 세포에 의해 빠르게 인식되고 식균된다. 생체 내 아폽토시스 세포의 제거를 위한 이러한 효과적인 메커니즘으로 인해 어떠한 염증 반응도 유도되지 않는다. 시험과 내에서 아폽토시스 소체뿐만 아니라 잔여 세포 단편은 결국 팽창되어 최종적으로 용해된다. 이러한 시험관 내 세포 사멸의 종말 상태는 "2차 괴사"로 표현되었다.
표 1은 괴사 및 아폽토시스 사이의 다양한 관찰 가능한 차이를 요약한 것이다. 바람직하게는 변형 세포는 하나 이상의 이들 특징의 감소를 나타낸다. 세포 사멸이 아폽토시스 의해 또는 괴사에 의해 발생되는지 여부를 측정하기 위해 이들 차이 단독 또는 결합 중의 하나가 분석된다.
괴사 및 아폽토시스의 차별적 특징 및 유의성
괴사 아폽토시스
형태학적 특징 멤브레인 완전성세포질 및 미토콘드리아의 팽창으로 시작총 세포 용해로 종료소포 형성, 완전한 세포용해 없음소기관의 붕괴(팽창) 멤브레인 수포 형성, 완전성의 소실은 없음세포핵막에서의 크로마틴 응집세포질의 수축 및 세포핵의 응축으로 시작작은 소체 내로 세포의 단편화로 종료멤브레인 결합된 소포(아폽토시스 소체) 형성bcl-2 패밀리의 단백질 관련 공동 형성으로 인해 미토콘드리아가 누출성이 됨.
생화학적 특징 이온 항상성 조절 상실에너지 필요 없음(수동적 과정, 4℃에서 발생)DNA의 무작위 분해(아가로스 겔 전기영동 후 DNA의 도말)후세포용해성 DNA 무사분열(=사멸의 후기 이벤트) 활성화 및 효소적 단계를 포함한 밀착 조절된 과정에너지(ATP)-의존성(능동적 과정, 4℃에서 발생하지 않음)DNA의 비-무작위 단일- 및 올리고뉴클레오솜 길이 무사분열(아가루소 겔 전기영동 후 래더 패턴)미토콘드리아에 의한 세포질 내로의 다양한 인자(사이토크롬 C, AIF)의 전세포용해성 DNA 무사분열 방출카스파제 연쇄반응의 활성화멤브레인 비대칭의 변경(즉, 세포질에서 멤브레인의 세포외 측면으로의 포스파티딜-세린의 전위)
생리학적 유의성 인접 세포 그룹에 영향 미침비-생리적 방해에 의해 야기됨(보체 공격, 세포용해성 바이러스, 저체온증, 저산소증, 허혈, 대사성 독물)대식세포에 의한 식균 작용유의적인 염증 반응 개체 세포에 영향 미침생리적 자극에 의해 유도됨(생장 인자의 결핍, 호르몬 환경의 변화)인접 세포 또는 대식세포에 의한 식균 작용염증 반응 없음
아폽토시스 뿐만 아니라 아폽토시스에 의한 세포 사멸의 다양한 분석 방법을 상세히 기술한 하기 문헌이 참고되었다: Schwartzman, R. A. and Cidlowski, J. A. (1993). Endocrine Rev. 14, 133; Vermes, I. and Haanan, C. (1994). Adv. Clin. Chem. 31, 177; Berke, G. (1991). Immunol. Today 12, 396; Krahenbuhl, O. and Tschopp, J. (1991). Immunol. Today12, 399; Van Furth, R. and Van Zwet, T. L. (1988). J. Immunol; Methods 108, 45. Cohen, J. J. (1993) Apoptosis. Immunol. Today14, 126; Savill, J. S. et al. (1989). J. Clin. Invest. 83, 865; Wyllie, A. H. (1980). Nature 284, 555; Leist, M. et al. (1994) Biochemica No. 3, 18-20; Fraser, A. and Evan, G. (1996) Cell 85, 781-784; Duke, R. C. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,6361; Duke, R. C. & Cohen, J. J. (1986). Lymphokine Res. 5, 289; Trauth, B. C. et al. (1994) Eur. J. Cell. Biol. 63, 32,Suppl 40; Matzinger, P. (1991). J. Immunol; Methods 145, 185; Kaeck, M. R. (1993); Anal. Biochem. 208, 393; Prigent, P. et al. (1993). J. Immunol; Methods 160, 139; Huang, P. & Plunkett, W. (1992); Anal. Biochem. 207, 163Bortner , C. D. et al. (1995) Trends Cell Biol. 5, 21; Gold, R. et al. (1994); Lab. Invest. 71, 219.
아폽토시스 및 세포 매개 세포독성은 멤브레인 붕괴 전 게놈 DNA의 분리된 단편으로의 분열을 특징으로 한다. 따라서 아폽토시스는 예를 들어 DNA 래더의 존재를 관찰함으로서 DNA 무사분열을 측정함으로서 분석된다. DNA 단편은 예를 들어 세포군 유래 "래더"(사다리의 "단"으로서 180 bp 배수를 지닌)로서 또는 예를 들어 ELISA를 통한 히스톤 복합된 DNA 단편의 정량화에 의해 분석된다. 이러한 분석방법은 뉴클레오솜을 검출하는 1-단계 샌드위치 면역분석을 신뢰한다. 본 절차는 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고 상청액(인큐베이션 동안 멤브레인을 통해 누출된 괴사성 세포 유래 DNA를 포함)을 채취하는 단계를 포함한다. 세포는 세포용해 완충액에 재현탁되고 인큐베이트된다. 세포용해 후 손상되지 않은 세포핵이 원심분리에 의해 펠렛화된다. 일정량의 상청액이 미량 역가판의 스트렙토아비딘-코팅된 웰로 옮겨지고 상청액 내 뉴클레오솜이 2개의 단일클론 항체인 항-히스톤(비오틴-표지된) 및 항-DNA(퍼옥시다제-컨쥬게이트된)와 결합된다. 하체-뉴클레오솜 복합체는 스트렙토아비딘에 의해 미량 역가판에 결합된다. 고정된 항체-히스톤 복합체는 면역-반응성이 아닌 세포 구성성분을 제거하기 위해 3회 세척되고 표본은 퍼옥시다제 기판(ABTS)으로 인큐베이트된다. 이후 착색된 생성물(따라서 고정된 항체-히스톤 복합체)의 함량은 분광계로 측정된다.
여러 프로테아제는 아폽토시스 초기 단계에 관련된다. 따라서 아폽토시스는 카스파제, 예를 들어 카스파제 3와 같은 아폽토시스-유도된 프로테아제의 활성을 분석하는 대신 또는 이에 추가로 그 존재를 검출함으로서 분석된다. 카스파제 활성은 예를 들어 카스파제를 포획하고 적당한 기질의 단백질 가수분해성 분열을 측정함으로서 세포 용해질의 시험관 내 효소 분석과 같은 다른 방법으로 분석될 수 있다. 더욱이 카스파제는 PARP(폴리-ADP-리보스-폴리머-아제)과 같은 생체 내 카스파제 기질 분열의 검출에 의해 분석된다. 분열된 PARP 단편은 항 PARP 항체와 같은 적당한 항체로 검출된다. 프로테아제 분석방법 및 DNA 무사분열 분석방법은 세포군 내 아폽토시스를 분석하는데 특히 적당하다.
ISNT 및 TUNEL 효소 표지 분석방법과 같은 개체 세포 내 아폽토시스의 연구 방법도 유용하다. 상기 주지된 바와 같이 광범위한 DNA 분해는 아폽토시스의 초기 단계에서 빈번하게 발생하는 특징적 이벤트이다. DNA의 분열은 이중-나선의 낮은 분자량 DNA 단편(단일- 및 올리고뉴클레오솜)뿐만 아니라 높은 분자량-DNA로 분열된("틈(nick)") 단일 나선을 생성한다. TUNEL에서 이러한 DNA 나선 분열은 적당히 변형된 뉴클레오타이드(X-dUTP, X = 비오틴, DIG 또는 형광물질)로 자유 3'-OH 말단을 효소적 표지함으로서 검출된다. 적당한 표지 효소는 ISNT의 경우("원위치 틈 번역) DNA 중합효소(틈 번역) 및 TUNEL("TdT-매개 X-dUTP 틈 및 표지"; Huang, P. & Plunkett, W., 1992, Anal. Biochem. 207, 163; Bortner , C. D. et al., 1995, Trends Cell Biol. 5, 21)의 경우 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소(말단 표지)를 포함한다.
또한 아폽토시스는 새로운 당 잔기의 노출시키는 세포 표면 당단백질의 측쇄 유래 말단 시알산 잔기의 소실; 트롬보스포딘(thrombospondin)과 같은 대식세포-분비된 점착성 분자에 대한 수용체로 작용하는 표면 당단백질의 출현; 및 멤브레인 표면의 소수성과 전하 모두를 변화시키는 세포 멤브레인 인지질 내 비대칭의 소실을 포함한 멤브레인 변경을 측정함으로서 분석된다. 특히 인간 항응고 아넥신 V는 35∼36 킬로달톤으로, 포스파티딜세린(PS)에 대해 높은 친화성을 지닌 Ca2+-의존성 인지질-결합 단백질이다. 정상적 활성 세포에서 PS는 세포막의 세포질 표면상에 위치한다. 그러나 아폽토시스 세포에서 PS는 플라스마 멤브레인의 내부에서 외부 내엽으로 전위되어 PS를 세포외 환경에 노출시킨다. 따라서 아넥신 V는 아폽토시스 세포 표면 상에 비대칭적으로 노출된 포스파티딜세린을 검출하는데 이용된다(Homburg, C. H. E. et al. 1995, Blood 85, 532; Verhoven, B. et al., 1995, J. Exp. Med. 182, 1597). 더욱이 DAPI, 에티듐 브로마이드 및 요오드화프로피듐 등과 같은 DNA 염색은 활성 및 비-활성 세포를 구별하는 차별적 염색에 이용된다; 따라서 투과된 아폽토시스 세포는 낮은 분자량 DNA을 누출시키고 "하위-G 1 피크" 또는 "A 0" 세포(G 1 세포 보다 낮은 DNA 염색을 지닌 DNA)의 검출이 예를 들어 유세포 분석에 의해 검출된다. 아폽토시스의 형태학적 변화 특성도 이러한 방식으로 검출된다.
항체의 이용에 의한 ced-3, ced-4, ced-9(Ellis, H. M. and Horvitz, H. R., 1986, Cell 44, 817-829; Yuan, J. Y. and Horvitz, H. R., 1990, Dev. Biol. 138, 33-41; Hentgartner, M. O., Ellis, R. E. and Horvitz, H. R., 1992, Nature 356, 494-499.), Fas(CD95/Apo-1; Enari et al., 1996, Nature 380, 723-726), Bcl-2(Baffy, G. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 6511-6519; Miyashita, T. and Reed, J. C., 1993, Blood 81, 151-157; Oltvai, Z. N., Milliman, C. L. and Korsmeyer, S. J., 1993, Cell 74, 609-619), p53 (Yonish-Rouach, E. et al., 1991, Nature 352, 345-347) 등과 같은 아폽토시스-관련 단백질의 검출도 아폽토시스를 분석하는데 이용된다.
뉴클레오타이드 벡터
폴리뉴클레오타이드는 재조합 복제 가능 벡터 내로 도입될 수 있다. 벡터는 적합성 숙주 세포 내 핵산을 복제하는데 이용된다. 따라서 또다른 실시태양에서 본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 복제 가능 벡터 내로 도입시키고, 상기 벡터를 적합성 숙주 세포 내로 도입시키고, 벡터의 복제를 야기하는 조건 하에서 숙주 세포를 생장시킴으로서 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포에서 회수된다. 적당한 숙주 세포는 E. coil와 같은 박테리아, 효모, 포유류 세포주 및 예를 들어 곤충 Sf9 세포와 같은 다른 진핵성 세포주를 포함한다.
바람직하게는 벡터 내 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에 의해 코딩 서열의 발현을 제공하는 것이 가능한 조절 서열에 실시 가능하게 결합된다 즉 벡터는 발현 벡터이다. "실시 가능하게 결합된"이라는 용어는 기술된 구성성분은 의도된 방식으로 기능하도록하는 관계에 있음을 의미한다. 코딩 서열에 "실시 가능하게 결합된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열에 적합한 조건 하에서 달성되는 방식으로 라이게이트된다.
조절 서열은 예를 들어 전사 수치가 전사 조절제에 더욱 반응성인 조절 서열에 의해 검출되도록 하기 위해 또다른 전사 조절 요소의 첨가에 의해 변형된다.
벡터는 단백질 발현을 제공하기 위해 하기 기술된 바와 같이 적당한 숙주 세포 내로 형질전환되거나 트랜스펙트된다. 이러한 과정은 단백질을 암호화하는 코딩 서열의 벡터에 의해 발현을 제공하는 조건 하에서 상기 기술된 바와 같이 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로는 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
벡터는 예를 들어 복제 기원, 선택적으로는 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위한 프로모터 및 선택적으로는 프로모터의 조절제가 제공되는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자, 예를 들어 박테리아 플라스미드의 경우 암피실린 저항성 유전자 또는 포유류 벡터용 네오마이신 저항성 유전자를 포함한다. 벡터는 예를 들어 숙주 세포를 트랜스펙트시키거나 형질전환시키는데 이용된다.
단백질을 암호화하는 서열에 실시 가능하게 결합된 조절 서열은 프로모터/인핸서 및 다른 발현 조절 신호를 포함한다. 이들 조절 서열은 발현 벡터가 이용되도록 고안된 숙주 세포에 적합하도록 선택된다. "프로모터"라는 용어는 당분야에 잘 알려져 있고 최소 프로모터에서 상류 요소 및 인핸서를 포함한 프로모터까지 광범위한 크기 및 복잡성의 핵산을 포함한다.
원핵성 프로모터 및 다른 진핵성 세포에서 기능적인 프로모터가 이용되나 프로모터는 일반적으로 포유류 세포 내에서 기능적인 프로모터에서 선택된다. 프로모터는 일반적으로 바이러스 또는 진핵세포성 유전자의 프로모터 서열에서 유래된다. 예를 들어 프로모터는 발현이 발생하는 세포의 게놈에서 유래된다. 진핵세포성 프로모터에 있어서 이들은 편재 방식(α-액틴, β-액틴, 튜블린의 프로모터와 같은) 또는 대안으로 조직-특이적 방식(피루브산 키나제에 대한 유전자의 프로모터와 같은)으로 기능하는 프로모터이다. 또한 이들은 특정 자극에 반응하는 프로모터, 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체에 결합하는 프로모터이다. 또한 바이러스성 프로모터, 예를 들어 몰로니(Moloney) 쥐과 백혈병 바이러스 장 말단 반복서열(MMLV LTR) 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터 또는 인간 거대세포바이러스(CMV) IE 프로모터가 이용된다.
또한 이형적 유전자의 발현 수치가 세포의 반감기 동안 조절될 수 있도록 프로모터가 유도성이 되는 것이 유리하다. 유도성은 프로모터를 이용하여 수득되는 발현 수치가 조절될 수 있음을 의미한다.
더욱이 이들 프로모터의 어떠한 것도 또다른 조절 서열 예를 들어 인핸서 서열의 첨가에 의해 변형된다. 또한 상기 기술된 2개 이상의 다른 프로모터 유래의 서열 요소를 포함한 키메라 프로모터도 이용된다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 폴리펩타이드의 발현
생물학적으로 활성인 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 크리세툴루스 그리세우스 FAIM, FADD, PDCD6 또는 레퀴엠 폴리뉴클레오타이드 서열은 조절 서열이 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시할 수 있도록 조절 서열에 결합된다. 이후 조절 서열의 조절 하에서 폴리펩타이드의 발현이 발생 가능하게 된다. 선택적으로는 이렇게 생성된 폴리펩타이드는 정제된다.
바람직하게는 조절 서열은 FAIM, FADD, PDCD6 또는 레퀴엠 폴리뉴클레오타이드이 자연적으로 결합되지 않은 것이다.
따라서 본 발명은 크리세툴루스 그리세우스 FAIM, FADD, PDCD6 또는 레퀴엠 폴리뉴클레오타이드 서열이 조절 서열이 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시할 수 있도록 조절 서열에 결합된 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포를 제공하고, 상기 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 세포를 배양하고, 선택적으로는 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함한 폴리펩타이드의 제조 방법을 기술한다.
또한 본 발명은 (a) 조절 서열이 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시할 수 있도록 크리세툴루스 그리세우스 FAIM, FADD, PDCD6 또는 레퀴엠 폴리뉴클레오타이드를 조절 서열에 결합시키는 단계; (b) 상기 조절 서열의 조절 하에서 발현 서열로부터 폴리펩타이드 발현을 가능하게 하는 단계; 및 (c) 선택적으로는 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함한 폴리펩타이드의 제조 방법을 기술한다.
특히 각각의 핵산 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적당한 발현 벡터 즉 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 포함한 벡터 내로 삽입된다.
또한 본 발명은 상기한 어떠한 방법에 의해서도 제조된 폴리펩타이드를 제공한다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 방법은 하기에 나타나 있다. 이들 방법은 증가된 세포 활성을 달성하기 위해 폴리펩타이드의 상향-조절, 예를 들어 cgFADD의 상향-조절이 요구되는 여기서 기술된 방법 및 조성물의 실시태양에 이용하기 적당함이 인식될 것이다.
발현된 폴리펩타이드를 제공하는 방법의 하나는 발현 벡터 즉 선택적으로 인핸서와 같은 다른 조절 서열과 함께 조절 가능한 프로모터를 포함하고, 발현 벡터 내로 클론된 목적 폴리펩타이드를 암호화하는 서열에 실시 가능하게 결합된 벡터(예를 들어 플라스미드)에 의한 것이다.
당업자에게 잘 알려진 방법은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠을 암호화하는 서열 및 적당한 전사 및 번역 조절 요소를 포함한 발현 벡터를 구축하는데 이용된다. 이들 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 Sambrook, J. et al.(1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ch. 4, 8, and 16-17, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.) 및 Ausubel, F. M. et al.(1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)에 기술되어 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠을 암호화하는 서열을 포함하고 발현하는데 이용된다. 이들은 재조합 박테리오파지로 형질전환된 박테리아, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터와 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들어 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 또는 담배 모자이크 바이러스(TMV) 또는 박테리아 발현 벡터(예를 들어 Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 어떠한 적당한 숙주 세포도 이용된다.
"제어 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역 영역이다(즉, 인핸서, 프로모터 및 5' 및 3' 비번역 영역). 이러한 요소는 강도 및 특이성이 다양하다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라 구성적 및 유도성 프로모터를 포함한 어떠한 수의 적당한 전사 및 번역 요소도 이용된다. 예를 들어 박테리아 시스템 내에서 클론시 BLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.)의 하이브리드 lacZ 프로모터 또는 PSPORT1 플라스미드(GIBCO/BRL) 등과 같은 유도성 프로모터가 이용된다. 바큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터는 곤충 세포에 이용된다. 식물 세포 게놈(예를 들어 열 충격, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스(예를 들어 바이러스 프로모터 또는 리더 서열)에서 유래된 프로모터 또는 인핸서는 벡터 내로 클론된다.
포유류 세포 시스템에서 포유류 유전자 유래 또는 포유류 바이러스 유래 프로모터가 바람직하다. cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암화하는 서열의 다수 카피를 포함한 세포주를 생성하는 것이 요구되는 경우 SV40 또는 EBS 기반 벡터가 적당한 선택 가능 마커와 함께 이용된다.
박테리아 시스템에서 다수의 발현 벡터가 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠에 대해 의도된 이용에 따라 선택된다. 예를 들어 다량의 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠이 항체 유도를 위해 필요한 경우 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 발현 수치를 지시하는 벡터가 이용된다. 이러한 벡터는 하이브리드 단백질이 생성되도록 β-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 하위 7개 잔기에 대한 서열과 함께 프레임 내에 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열이 벡터 내로 라이게이트된 BLUESCRIPT(Stratagene) 또는 pIN 벡터(Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)도 글루타티온 S-전이효소(GST)와 함께 융합 단백질로서 외부 폴리펩타이드를 발현하는데 이용된다. 일반적으로 이러한 융합 단백질은 용해성이고 글루타티온-아가로서 비드로의 흡착 후 자유 글루타티온의 존재시 용출에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이러한 시스템 내에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 인자 XA 프로테아제 분열 사이트를 포함하도록 고안되어 클론된 목적 폴리펩타이드가 GST 모이어티로부터 마음대로 방출될 수 있다.
효모 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)에서 알파 인자, 알코올 산화효소 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함한 많은 벡터가 이용된다. 참고를 위해 Ausubel(상동) and Grant et al. (1987; Methods Enzymol. 153:516-544) 참조.
식물 발현 벡터가 이용되는 경우 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열의 발현은 어떠한 수의 프로모터에 의해서도 조종된다. 예를 들어 CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 단독으로 또는 TMV 유래 오메가 리더 서열과 결합하여 이용된다(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). 대안으로 RUBISCO의 작은 서브유니트 또는 열 충격 프로모터와 같은 식물 프로모터가 이용된다(Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). 이들 컨스트럭트는 직접적 DNA gud 또는 병원체-매개된 트랜스펙션에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 많은 일반적으로 이용 가능한 문헌에 기술되어 있다(예를 들어 Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196).
또한 곤충 시스템은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 발현시키는데 이용된다. 예를 들어 이러한 하나의 시스템에서 아우토그라파 칼리포니아(Autographa californica) 세포핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcNPV)이 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 내 또는 트리코플루시아 라베(Trichoplusia larvae) 세포 내에서 외부 유전자를 발현하는 벡터로서 이용된다. cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비-필수 영역 내로 클론되고 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 놓인다. cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성화시키고 외피 단백질이 결핍된 재조합 바이러스를 생성할 것이다. 이후 재조합 바이러스는 예를 들어 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠이 발현되는 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 라베 세포를 감염시키는데 이용된다(Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).
포유류 숙주 세포 내에서 많은 바이러스-기반 발현 시스템이 이용된다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용되는 경우 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열은 후기 프로모터 및 3벌 리더 서열로 구성된 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내로 라이게이트된다. 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 영역 내 삽입은 감염된 숙주 세포 내 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 발현하는 것이 가능한 바이러스 세포를 수득하는데 이용된다(Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). 더욱이 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서와 같은 전사 인핸서는 포유류 숙주 세포 내 발현을 증가시키는데 이용된다.
따라서 예를 들어 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 단백질은 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포 또는 점착성 dhfr CHO 세포 내에서 발현된다. 수용체 발현을 최대화하기 위해 일반적으로 5' 및 3' 비번역 영역(UTR) 모두가 pCDN 또는 pCDNA3 벡터 내로의 삽입 전 수용체 cDNA에서 제거된다. 세포는 리포펙틴에 의해 개별적 수용체 cDNA로 트랜스펙트되고 400 mg/ml G418의 존재시 선택된다. 선택 3주 후 개별적 클론은 채취되고 추가 분석을 위해 확장된다. 벡터 단독으로 트랜스펙트된 HEK293 또는 CHO 세포는 음성 대조군으로 작용한다. 개별적 수용체를 안정적으로 발현하는 세포주를 분리하기 위해 약 24개 클론이 일반적으로 선택되고 노던 블럿 분석에 의해 분석된다. 일반적으로 분석된 G418-저항성 클론의 약 50%에서 수용체 mRNA가 검출 가능하다.
또한 인간 인공 염색체(HAC)는 플라스미드에 포함되고 발현될 수 있는 것보다 큰 단편의 DNA를 전달시키는데 이용된다. 치료 목적으로 약 6 kb∼10 Mb의 HAC가 구축되고 종래의 전달 방법(리포솜, 다가양이온 아미노 폴리머 또는 수포)을 통해 전달된다.
또한 특정 개시 신호가 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열의 더욱 효과적인 번역을 달성하는데 이용된다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열 및 그의 개시 코돈 및 상류 서열이 적당한 발현 벡터 내로 삽입된 경우 어떠한 추가적인 전사 또는 번역 조절 신호도 필요 없다. 그러나 코딩 서열 또는 그의 단편만이 삽입된 경우 ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 더욱이 개시 코돈은 전체 삽입의 번역을 보증하기 위해 정확한 리딩 프레임이어야 한다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합서 모두의 다양한 기원이다. 발현 효율은 문헌 내에 기술된 바와 같이 사용되는 특정 세포 시스템에 적당한 인핸서의 포함에 의해 증가된다(Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
더욱이 숙주 세포주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 방식으로 발현 단백질을 처리할 수 있는 능력에 대해 선택된다. 이러한 폴리펩타이드의 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 단백질의 "전구" 형태를 분열시키는 후-번역적 처리도 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 촉진시키는데 이용된다. 후-번역적 활성에 대한 특정 세포 기구 및 특징적 메커니즘을 지닌 다른 숙주 세포(예를 들어 CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Bethesda, Md.)으로부터 입수 가능하고 외부 단백질의 정확한 변형 및 처리를 보증하는데 선택된다.
장기간 고수율의 재조합 단백질 생성을 위해 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 안정하게 발현하는 것이 가능한 세포주는 동일하거나 개별적인 벡터 상에 바이러스 복제 기원 및/또는 내인성 발현 요호 및 선택 가능 마커 유전자를 포함한 발현 벡터를 이용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후 세포는 선택 배지로 변환되기 전 풍부화 배지 내에서 약 1∼2일간 생장된다. 선택 가능 마커의 목적은 선택에 저항성을 부여하는 것이고 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 생장 및 회수를 가능하게 한다. 안정하게 형질전환된 세포의 저항성 클론은 세포 형태에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식된다.
어떠한 수의 선택 시스템도 형질전환 세포주를 회수하는데 이용된다. 이들은 각각 tk- 또는 apr- 세포에 이용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자(Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실전이효소 유전자(Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 항대사물질, 항생제 또는 제초제 저항성이 선택의 근거로서 이용될 수 있다. 예를 들어 dhfr은 메토트렉세이트(methotrexate)(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70)에 대한 저항성을 부여하고; npt는 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 대한 저항성을 부여하고(Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); als 또는 pat는 각각 클로르설푸론(chlorsulfuron) 및 포스피노트리신(phosphinotricin) 아세틸전이효소에 대한 저항성을 부여한다(Murry, 상동). 예를 들어 세포가 트립토판 대신 인돌을 이용하게 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신 히스톨을 이용하게 하는 hisD와 같은 추가적인 선택 가능 유전자가 개시되었다(Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). 최근 안토시아닌, β-글루크로니다제 및 그의 기질 GUS 및 루시페라제 및 그의 기질 루시페린과 같은 가시성 마커의 이용이 대중성을 획득하였다. 이들 마커는 형질전환체를 확인할 뿐만 아니라 특정 벡터 시스템에 의한 일시적 또는 안정적 단백질 발현 함량을 정량화하는데 이용될 수 있다(Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
마커 유전자 발현의 존재/부재가 목적 유전자도 존재함을 나타내나 유전자의 존재 및 발현은 확인될 필요가 있다. 예를 들어 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열이 마커 유전자 서열 내로 삽입된 경우 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암화하하는 서열을 포함한 형질전환 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 대안으로 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절 하에서 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열과 일렬로 위치할 수 있다. 유도 또는 선택에 반응한 마커 유전자의 발현은 일반적으로 일렬 유전자의 발현이 잘 됨을 나타낸다.
대안으로 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 알려진 다양한 절차에 의해 확인된다. 이들 절차는 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 및 단백질 생물학적분석 또는 핵산 또는 단백질 서열의 검출 및/또는 정량화를 위한 멤브레인, 용액 또는 칩 기반 기술을 포함한 면역분석 기술을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재는 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 또는 프로브 또는 단편 또는 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 단편을 이용한 증폭에 의해 검출될 수 있다. 핵산 증폭 기반 분석방법은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 포함한 형질전환체를 검출하기 위해 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열에 기반한 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고머의 이용을 포함한다.
단백질에 특이적인 폴리클론 또는 단일클론 항체를 이용한 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜은 당분야에 알려져 있다. 이러한 기술의 예는 효소-연관 면역흡착법(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 형광 활성화 세포 분리법(FACS)을 포함한다. cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 상의 2개의 비-간섭 에피토프에 반응성인 단일클론 항체를 이용한 2-사이트 단일클론-기반 면역분석법이 바람직하나 경쟁적 결합 분석방법도 이용된다. 이들 및 다른 분석방법은 예를 들어 Hampton, R. et al.(1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, Section IV, APS Press, St Paul, Minn.) 및 Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216) 등과 같이 당분야에 기술되어 있다.
매우 다양한 표지 및 컨쥬게이션 기술이 당업자에게 알려져 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 이용된다. cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 관련 서열을 검출하기 위한 표지 혼성화 또는 PCR 프로브의 제조 방법은 올리고표지법, 틈 번역, 말단-표지법 또는 표지된 뉴클레오타이드를 이용한 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열 또는 그의 단편은 mRNA 프로브의 제조를 위해 프로모터 내로 클론된다. 이러한 벡터는 당분야에 알려져 있고 통상적으로 이용 가능하고 T7, T3 또는 SP6와 같은 적당한 RNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 시험관 내에서 RNA 프로브를 합성하는데 이용된다. 이들 절차는 Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo, Mich.), Promega(Madison, Wis.) 및 U.S. Biochemical Corp.(Cleveland, Ohio)에 의해 제공되는 것과 같은 다양한 통상적으로 이용 가능한 키트를 이용하여 수행된다. 검출을 용이하게 하기 위해 이용되는 적당한 수용체 분자 또는 표지는 방사핵, 효소, 형광물질, 화학발광제 또는 색소 작용제뿐만 아니라 기질, 보조인자, 저해제, 자기 입자 등을 포함한다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양물로부터 단백질의 발현 및 회수에 적당한 조건 하에서 배양된다. 형질전환 세포에 의해 생성된 단백질은 세포막에 위치하고 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 분비되거나 세포내에 포함된다. 당업자에게 이해되는 바와 같이 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 원핵성 또는 진핵성 세포막을 통해 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 분비를 지시하는 신호 서열을 포함하도록 고안된다. 다른 구축은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 암호화하는 서열을 용해성 단백질의 정제를 촉진시킬 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 결합시키는데 이용된다. 이러한 정체 촉진 도메인은 고정된 금속 상의 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트 펩타이드, 고정된 면역글로불린 상의 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 확장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, Wash)에 이용되는 도메인을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 정제 도메인과 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 암호화 서열 사이의 인자 XA 또는 엔테로키나제(Invitrogen, San Diego, Calif.)에 특이적인 것과 같은 분열 가능한 링커 서열의 포함은 정제를 촉진시키는데 이용된다. 이러한 발현 벡터의 하나는 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 및 티오레독신 또는 엔테로키나제 분열 사이트에 앞선 6개 히스티딘 잔기를 암호화하는 핵산을 포함한 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMIAC; described in Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) 상의 정제를 촉진시키고 엔테로키나제 분열 사이트는 융합 단백질로부터 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 포함한 벡터의 논의는 Kroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)에 제공된다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 단편뿐만 아니라 전체 길이 폴리펩타이드는 재조합 제조뿐만 아니라 고형상 기술을 이용한 직접적 펩타이드 합성에 의해서도 제조된다(Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행된다. 자동화 합성은 예를 들어 Applied Biosystems 431A 펩타이드 합성기(Perkin Elmer)를 이용하여 달성된다. cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 다양한 단편은 개별적으로 합성된 후 결합되어 전체 길이 분자를 생성한다.
또다른 발현 방법도 알려져 있고, 예를 들어 "유전자 활성화"로 알려진 방법은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 활성 또는 발현을 조절하는데 이용된다. 이러한 방법은 이에 참고문헌으로 포함된 미국 특허 제5,641,670호에 상세히 기술되어 있다. 본질적으로 유전자 활성화 방법은 세포 내 내인성 목적 유전자의 조절 또는 활성이 상동적 재조합을 통해 미리 선택된 사이트에서 하기를 포함한 적당한 DNA 컨스트럭트를 세포 게놈 내에 삽입시킴으로서 변화될 수 있다는 인식에 기반한다: (a) 타겟팅 서열; (b) 조절 서열; (c) 엑손 및 (d) 비대합(unpaired) 슬라이스-제공자 사이트에 있어서, 상기 타겟팅 서열은 요소 (b)∼(d)가 내인성 유전자에 실시 가능하게 연결되도록 요소 (a)∼(d)의 통합을 지시함을 특징으로 한다. DNA 컨스트럭트는 대안으로 하기를 포함한다: (a) 타겟팅 서열, (b) 조절 서열, (c) 엑손, (d) 슬라이스-제공자 사이트, (e) 인트론 및 (f) 슬라이스-수용자 사이트에 있어서, 상기 타겟팅 서열은 요소 (b)∼(f)가 내인성 유전자의 첫 번째 엑손에 실시 가능하게 결합되도록 요소 (a)∼(f)의 통합을 지시함을 특징으로 한다.
사용되는 타겟팅 서열은 DNA가 삽입되어야 하는 사이트를 참고로 선택된다. 두 배열 모두 타겟팅 이벤트는 DNA 전사체 및 내인성 세포 유전자를 타겟함으로서 도입된 서열의 융합 생성물인 새로운 전사 단위를 생성하는데 이용된다. 예를 들어 새로운 전사 단위의 형성은 전사적 침묵 유전자(트랜스펙션 전 세포 내엔서 발현되지 않는 유전자)가 상기 기술된 DNA 컨스트럭트를 숙주 세포 게놈 내로 도입시킴으로서 숙주 세포 내에서 활성화되도록 한다. 수득시 세포 내에서 발현되는 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠과 같은 내인성 유전자의 발현은 증가되거나 제거되는 것을 포함하여 감소된다는 측면에서 변화될 수 있거나 조절 또는 유도의 패턴은 유전자 활성화 방법의 이용을 통해 변화된다.
항체
이들 단백질의 활성을 조절하는데 이용되는 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠의 특이적 길항제는 단백질(들)에 대한 항체를 포함한다. 특히 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠에 결합하는 것이 가능하고, 바람직하게는 그의 생물학적 활성을 저해하는 것이 가능한 항체는 세포 활성을 증가시키기 위해 관련 단백질의 발현의 하향-조절시 이용에 적당하다.
따라서 본 발명은 특히 항-cgFAIM, 항-cgFADD, 항-cgPDCD6 및 항-cg레퀴엠 항체뿐만 아니라 이들의 제조 방법을 제공한다.
여기서 사용된 항체는 선택된 타겟에 결합하는 것이 가능한 완전한 항체 또는 항체 단편을 나타내고, Fv, ScFv, Fab' 및 F(ab')2, 단일클론 및 폴리클론 항체, 키메라를 포함한 설계된 항체, CDR-이식 및 인간화 항체 및 파지 디스플레이 또는 대안적 기술을 이용하여 제조된 인공적으로 선택된 항체를 포함한다. Fv 및 ScFv와 같은 작은 단편은 그의 작은 크기 및 결과적인 우수한 조직 분포로 인해 진단 및 치료 적용에 대한 유리한 특성을 지닌다.
여기서 기술된 항-cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 항체는 예를 들어 세포 환경 내에서 관련 단백질의 검출에 이용된다. 따라서 이들은 표지와 같은 효과기 단백질을 포함한 변화된 항체이다. 생체 내 또는 시험관 내에서 항체 분포의 이미지화를 가능하게 하는 표지가 특히 바람직하다. 이러한 표지는 배아 또는 세포괴 내에 용이하게 가시화가 가능한 방사성 표지 또는 금속 입자와 같은 방사선 비투과성의 표지이다. 더욱이 이들은 형광 표지 또는 조직 표면 상에서 가시화 가능한 다른 표지이다.
재조합 DNA 기술은 여기서 기술된 항체를 개선하는데 이용된다. 따라서 진단 또는 치료 적용시 그의 면역원성을 감소시키기 위해 키메라 항체가 구축된다. 더욱이 면역원성은 CDR 이식[유럽 특허 출원 제0 239 400호(Winter)] 및 선택적으로는 프레임워크 변형[EP 0 239 400]에 의해 항체를 인간화시킴으로서 최소화된다.
항-cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및 cg레퀴엠 항체는 동물 혈청에서 수득되거나 단일클론 항체 또는 그의 단편인 경우 세포 배양물에서 제조된다. 재조합 DNA 기술은 수립된 절차에 따라 박테리아, 바람직하게는 포유류 세포 배양물 내에서 항체를 제조하는데 이용된다. 선택된 세포 배양 시스템은 바람직하게는 항체 생성물을 분비한다.
따라서 본 발명은 적당한 리딩 프레임으로 항체 단백질을 암호화하는 두 번째 DNA 서열에 결합된 신호 펩타이드를 암호화하는 첫 번째 DNA 서열에 실시가능하게 결합된 프로모터를 포함한 발현 카세트를 포함한 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주 예를 들어 E. coli 또는 포유류 세포를 배양하고, 상기 단백질을 분리하는 단계를 포함한 항체의 제조 방법을 개시한다.
시험관 내 하이브리도마 세포 또는 포유류 숙주 세포의 증식은 예를 들어 선택적으로 우태아 혈청과 같은 포유류 혈청 또는 정상 마우스 복막 삼출 세포, 비장 세포, 골수 대식세포와 같은 공급자 세포, 2-아미노에탄올, 인슐린, 트랜스페린, 저밀도 지단백, 올레산 등과 같은 미량 요소 및 성장 유지 보충제로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM) 또는 RPMI 1640 배지와 같은 통상의 표준 배양 배지인 적당한 배양 배지에서 수행된다. 박테리아 세포 또는 효모 세포인 숙주 세포의 증식은 예를 들어 박테리아의 경우 LB, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific Broth, SOB, SOC, 2 x YT 또는 M9 최소 배지, 효모의 경우 YPD, YEPD, 최소 배지 또는 완전 최소 Dropout 배지와 같이 당분야에 알려진 적당한 배양 배지에서 유사하게 수행된다.
시험관 내 제조는 매우 순수한 항체 제제를 제공하고 다량의 원하는 항체를 제공하도록 증가시킬 수 있다. 박테리아 세포, 효모 도는 포유류 세포 배양 기술은 당분야에 알려져 있고 예를 들어 공수 반응기 내 또는 연속 교반 반응기 내 균질 현탁액 배양 또는 예를 들어 섬유, 미세캡슐 내 또는 아가로스 미세비드 또는 세라믹 카트리지 상에 고정되거나 포착된 세포 배양을 포함한다.
또한 다량의 원하는 항체는 생체 내에서 포유류 세포를 증식시킴으로서 수득될 수 있다. 이러한 목적으로 원하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 항체-생성 종양의 생장을 유발하도록 조직적합성 포유류 내로 주입된다. 선택적으로는 상기 동물은 주입 전 탄화수소 특히 프리스탄(테트라메틸-펜타데칸)과 같은 미네랄 오일로 프라임된다. 1∼2주 후 항체는 상기 포유류의 체액에서 분리된다. 예를 들어 적당한 골수종 세포와 Balb/c 마우스 유래 항체-생성 비장 세포의 융합에 의해 수득된 하이브리도마 세포 또는 원하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 Sp2/0에서 유래된 트랜스펙트된 세포는 선택적으로 프리스탄으로 전처리된 Balb/c 마우스에 복막내로 주입되고 1∼2주 후 동물에서 복수가 채취된다.
전술되거나 또다른 기술은 예를 들어 여기서 참고문헌에 포함된 Kohler and Milstein, (1975) Nature 256:495-497; US 4,376,110; Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor에서 논의된다. 재조합 항체 분자의 제조 기술은 상기 문헌 및 여기서 참고문헌에 포함된 EP 0623679; EP 0368684 및 EP 0436597에도 기술되어 있다.
세포 배양 상청액은 예를 들어 면역블럿팅에 의해, 샌드위치 분석방법 또는 도트-분석방법 또는 방사선면역측정법과 같은 효소 면역분석방법에 의해 선별된다.
항체의 분리를 위해 배양 상청액 또는 복수 내 면역글로불린이 예를 들어 황산암모늄으로의 침전, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 흡수성 물질에 대한 투석, 선택성 멤브레인을 통한 여과 등에 의해 농축된다. 필요하거나 바람직한 경우 항체는 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로즈에 대한 크로마토그래피 및/또는 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 또는 그의 단편 또는 단백질 A로의 친화성 크로마토그래피와 같은 (면역-)친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 크로마토그래피 방법에 의해 정제된다.
또한 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포가 제공된다. 바람직한 하이브리도마 세포는 유전적으로 안정적이고 원하는 특이성의 단일클론 항체를 분비하고 해동 및 재클론에 의해 급속-냉동 배양물로부터 달성될 수 있다.
또한 예를 들어 Balb/c 마우스와 같은 적당한 포유류가 하나 이상의 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드 또는 그의 항원 단편으로 면역되고; 면역된 포유류의 항체-생성 세포가 적당한 골수종 세포주 세포와 융합되고, 융합으로 수득된 하이브리드 세포가 클론되고 원하는 항체를 분비하는 세포 클론이 선택됨을 특징으로 하는 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠에 지시된 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주의 제조 방법이 포함된다. 예를 들어 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠으로 면역된 Balb/c 마우스의 비장 세포는 골수종 세포주 PAI 또는 골수종 세포주 Sp2/0-Ag14의 세포와 융합되고 수득된 하이브리드 세포는 원하는 항체의 선택을 위해 선별되고 양성 하이브리도마 세포가 클론된다.
Balb/c 마우스가 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠을 발현하는 10∼107 및 108개 세포 및 적당한 보조제를 수개월 예를 들어 2∼4개월 동안 여러 차례 예를 들어 4∼6회 피하 및/또는 복막내로 주입함으로서 면역되고, 면역된 마우스 유래 비장 세포가 최종 주입 2∼4일 후 채취되고 융합 프로모터, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜의 존재시 골수종 세포주 PAI 세포와 융합됨을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주의 제조 방법이 바람직하다. 바람직하게는 골수종 세포는 약 4000 분자량의 약 30∼50% 폴리에틸렌 글리콜을 함유한 용액 내에 3∼20배 과량의 면역된 마우스 유래 비장 세포와 융합된다. 융합 후 세포는 정상 골수종 세포가 원하는 하이브리도마 세포를 과도생장시키는 것을 방지하기 위해 일정 간격으로 예를 들어 HAT 배지와 같은 선택 배지로 보충된 전술된 바와 같은 적당한 배양 배지 내에서 확장된다.
또한 전술된 바와 같은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠에 지시되는 항체의 중쇄 변이 도메인 및/또는 경쇄 변이 도메인을 암호화하는 삽입서열을 포함한 재조합 DNA가 개시된다. 정의하면 이러한 DNA는 코딩 단일 나선 DNA, 상기 코딩 DNA와 그의 상보적 DNA로 구성된 이중 나선 DNA 또는 그 자체의 상보적(단일 나선) DNA를 포함한다.
더욱이 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠에 지시되는 항체의 중쇄 변이 도메인 및/또는 경쇄 변이 도메인을 암호화하는 DNA는 중쇄 변이 도메인 및/또는 경쇄 변이 도메인을 암호화하는 진성 DNA 서열을 지닌 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 DNA가 될 수 있다. 진성 DNA의 돌연변이는 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 하나 이상의 다른 아미노산으로 교환된 상기-기술된 항체의 중쇄 변이 도메인 및/또는 경쇄 변이 도메인을 암호화하는 DNA이다. 바람직하게는 상기 변형(들)은 항체의 중쇄 변이 도메인 및/또는 경쇄 변이 도메인의 CDR 외부이다. 또한 이러한 돌연변이 DNA는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 동일한 아미노산(들)을 암호화하는 새로운 코돈을 지닌 다른 뉴클레오타이드로 대체된 침묵 돌연변이를 의미한다. 또한 이러한 돌연변이 서열은 퇴화 서열이다. 퇴화 서열은 본래 암호화되는 아미노산 서열의 변화를 유발하지 않고 제한되지 않은 수의 뉴클레오타이드가 다른 뉴클레오타이드로 대체된다는 점에서 유전자 코드의 의미 내에서 퇴화된다. 이러한 퇴화 서열은 중쇄 쥐과 변이 도메인 및/또는 경쇄 쥐과 변이 도메인의 최적 발현을 수득하기 위해 다른 제한 사이트 및/또는 특정 숙주 특히 E. coli에 바람직한 특정 코돈 빈도로 인해 유용하다.
돌연변이라는 용어는 당분야에 알려진 방법에 따라 진성 DNA의 시험관 내 돌연변이유발에 의해 수득되는 DNA 돌연변이를 포함한다.
완전한 사량체 면역글로불린 분자의 조립 및 키메라 항체의 발현을 위해 중쇄 및 경쇄 변이 도메인을 암호화하는 재조합 DNA 삽입서열이 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 대응 DNA와 융합된 후 예를 들어 하이브리드 벡터 내로의 도입 후 적당한 숙주 세포 내로 전이된다.
예를 들어 γ1, γ2, γ3 또는 γ4, 바람직하게는 γ1 또는 γ4와 같은 인간 불변 도메인에 융합된 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠에 지시되는 항체의 중쇄 변이 도메인 및/또는 경쇄 변이 도메인을 암호화하는 삽입서열을 포함한 재조합 DNA가 개시된다. 유사하게는 인간 불변 도메인 κ 또는 λ, 바람직하게는 κ에 융합된 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠에 지시되는 항체의 경쇄 쥐과 변이 도메인을 암호화하는 삽입서열을 포함한 재조합 DNA도 개시된다.
또다른 실시태양에서 본 발명은 중쇄 변이 도메인 및 경쇄 변이 도메인이 간격 그룹에 의해 결합됨을 특징으로 하고, 선택적으로는 숙주 세포 내 항체의 처리를 촉진하는 신호 서열 및/또는 항체의 정제를 촉진하는 펩타이드 및/또는 분열 사이트 및/또는 펩타이드 간격자 및/또는 효과기 분자를 암호화하는 DNA를 포함한 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 DNA를 개시한다.
효과기 분자를 암호화하는 DNA는 진단 또는 치료 적용에 유용한 효과기 분자를 암호화하는 DNA를 의미한다. 따라서 독소 또는 효소 특히 전구약물의 활성화를 촉진시키는 것이 가능한 효소인 효과기 분자가 특히 나타난다. 이러한 효과기 분자를 암호화하는 DNA는 DNA를 암호화하는 자연 발생적 효소 또는 독소의 서열 또는 그의 돌연변이를 지니고 당분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
제형 및 투여
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 펩타이드 및 폴리펩타이드와 같은 펩타이드 및 폴리펩타이드, 핵산 및 폴리뉴클레오타이드 및 작용제 및 길항제 펩타이드 또는 소분자는 적당한 약제적 담체와 결합하여 제형화된다. 이러한 제형은 치료적 유효량의 폴리펩타이드 또는 화합물 및 약제적으로 수용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 제형은 투여 양식에 적당해야 하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한 본 발명은 하나 이상의 전술된 조성물 성분으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함한 약제적 팩 및 키트를 기술한다.
폴리펩타이드 및 다른 화합물은 단독으로 또는 치료 화합물과 같은 다른 화합물과 결합되어 이용된다.
약제적 조성물의 전신 투여의 바람직한 형태는 일반적으로 정맥 주사에 의한 주사를 포함한다. 피하, 근육내 또는 복막내와 같은 다른 주입 경로도 이용될 수 있다. 전신 투여를 위한 대안적 수단은 담즙산염 또는 푸시딘산 또는 다른 세정제와 같은 침투제를 이용한 점막 통과 및 경피 투여를 포함한다. 더욱이 창자용 또는 캡슐화 제형으로 제형화되는 경우 경구 투여도 가능하다. 이들 화합물의 투여는 연고, 페이스트, 겔 등의 형태로 국부화되거나 집중화된다.
필요한 투여량 범위는 펩타이드의 선택, 투여 경로, 제형 특성, 피험자 조건의 특성 및 진료 의사의 판단에 따라 달라진다. 그러나 적당한 투여량은 0.1∼100 ㎍/kg 피험체의 범위이다. 그러나 필요한 투여량의 광범위한 변동이 이용 가능한 화합물의 다양성 및 다양한 투여 경로의 차별적 효율의 측면에서 예측된다. 예를 들어 경구 투여는 정맥내 주사에 의한 투여보다 더 높은 투여량을 요구할 것으로 예측된다. 이들 투여량 수치의 변동은 당분야에서 잘 이해되는 바와 같이 최적화에 대한 표준 경험 관례를 이용하여 조정될 수 있다.
또한 치료에 사용되는 폴리펩타이드는 상기 기술된 "유전자 치료"로 표기되는 치료 양식에서 피험자 내에서 내생적으로 생성될 수 있다. 따라서 예를 들어 피험자 유래 세포는 예를 들어 레트로바이러스 플라스미드 벡터에 이용에 의해 생체 외에서 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드로 설계된다.
약제적 조성물
또한 본 발명은 치료적 유효량의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 벡터 또는 항체(cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드 등) 및 선택적으로는 약제적으로 수용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제(그의 결합을 포함)를 투여하는 것을 포함한 약제적 조성물을 제공한다.
약제적 조성물은 인간 또는 인간 내 동물 용도 및 수의 약물용이 되고 일반적으로 하나 이상의 약제적으로 수용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 치료적 이용을 위한 수용 가능한 담체 또는 희서제는 약제 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 약제적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 경로 투여 및 표준 약제적 실시에 관하여 선택될 수 있다. 약제적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제 이외에 어떠한 적당한 바인더(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 용해제(들)를 포함한다.
방부제, 안정화제, 염료 및 향미제가 약제적 조성물에 제공된다. 방부제의 예는 안식향산나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제도 이용된다.
다른 전달 시스템에 따라 다른 조성물/제형 필요조건이 존재한다. 예로서 여기서 기술된 약제적 조성물은 미니-펌프를 이용하여 또는 예를 들어 비강 스프레이 또는 흡입용 에어로졸 또는 섭취용 용액과 같은 점막 경로에 의해 또는 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하 경로에 의한 전달을 위해 조성물이 주사 형태로 제형화된 비경구 경로에 의해 전달되도록 제형화된다.
약제가 위장관 점막을 통해 점막으로 전달되는 경우 위장관을 통해 통과되는 동안 안정하게 유지될 수 있어야 한다; 예를 들어 단백질 가수분해성 분해에 저항적이고 산 pH에 안정하고 담즙의 세정 효과에 저항적이어야 한다.
적당한 경우 약제적 조성물은 흡입에 의해 좌약 또는 페서리의 형태로, 피부 패취의 이용에 의한 로션, 용약, 크림, 연고 또는 살포제의 국부적 형태로, 전분 또는 유당과 같은 부형제를 함유한 정제의 형태로, 또는 단독 또는 부형제와 결합된 캡슐 또는 오불(ovule) 내로 또는 향미제 또는 착색제를 함유한 엘릭서(elixir), 용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있거나 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하와 같이 비경구적으로 주입될 수 있다. 비경구 투여의 경우 조성물은 예를 들어 용액을 혈액과 등장성이 되도록 하기에 충분한 염 또는 모노사카라이드와 같은 다른 물질을 포함한 멸균 수용액의 형태로 최상으로 이용된다. 구강 또는 설하 투여의 경우 조성물은 통상의 방법으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태로 투여된다.
백신
또다른 실시태양은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 관련 질병으로부터 동물을 보호하기 위해 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 생성하기 적당한 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드 또는 그의 단편으로 포유류를 접종하는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 동물을 질병으로부터 보호하는 항체를 생성하는 이러한 면역 반응을 유도하기 위해 생체 내에서 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하는 벡터를 통해 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드를 전달하는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드 또는 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 유전자를 포함함을 특징으로 하는 포유류 숙주 내로 도입시 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드에 대한 포유류 내 면역 반응을 유도하는 면역/백신 제형(조성물)에 관한 것이다. 백신 제형은 적당한 담체를 더욱 포함한다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드가 위에서 분해되기 때문에 바람직하게는 비경구적으로(피하, 근육내, 정맥내, 피내 등 주사) 투여된다. 비경구 투여에 적당한 제형은 항산화제, 완충액, 세균발육저지제 및 제형을 수용자 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 포함한 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 또는 경화제를 포함한 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알과 같은 단위-투여량 또는 다수-투여량 용기 내에 존재하고 사용 직전에 멸균액 담체의 첨가만을 필요로하는 동결-건조 조건으로 보관된다. 또한 백신 제형은 오일-인 워터 시스템 및 당분야에 알려진 다른 시스템과 같은 제형의 면역원성을 증가시키기 위한 보조 시스템을 포함한다. 투여량은 백신의 특이적 활성에 따라 달라질 것이고 일상적 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
백신은 여기서 기술된 된 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 제조된다.
활성 성분(들)로서 면역원성 폴리펩타이드(들) 또는 펩타이드(들)을 포함한 백신의 제제는 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로 이러한 백신은 액체 용액 또는 현탁액과 같이 주사 가능하게 제조되고; 주사 전 액체 내 용액 또는 현탁액에 적당한 고형 형태로도 제조된다. 활성 면역원성 성분은 약제적으로 수용 가능하고 활성 성분에 적합한 부형제와 빈번하게 혼합된다. 적당한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합이다.
더욱이 바람직한 경우 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및/또는 백신의 유효성을 증진시키는 보조제와 같은 최소량의 보조 물질을 포함한다. 유효한 보조제의 예는 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로 표기됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 표기됨) 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 내 박테리아에서 추출된 3가지 구성성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 포함한 RIBI.
보조제 및 다른 약제의 또다른 실시예는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄칼륨(알룸), 황산베릴룸, 실리카, 카올린, 탄소, 워터-인-오일 에멀젼, 오일-인-워터 에멀젼, 무리밀 디펩타이드, 박테리아 내독소, 지질 X, 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)(프로피오노박테리움 아크네스(Propionobacterium acnes)), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 폴리리보뉴클레오타이드, 알긴산나트륨, 라놀린, 리소레시틴, 비타민 A, 사포닌, 리포솜, 레바미솔(levamisole), DEAE-덱스트란, 차단된 공중합체 또는 또다른 합성 보조제를 포함한다. 이러한 보조제는 예를 들어 Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) 또는Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)와 같은 다양한 공급원으로부터 통상적으로 이용 가능하다.
일반적으로 암피겐(Amphigen)(오일-인-워터), 알하이드로겔(Alhydrogel)(수산화알루미늄), 암피겐과 알하이드로겔의 혼합물과 같은 보조제가 이용된다. 수산화알루미늄만이 인체 이용에 승인된다.
면역원 및 보조제의 비율은 유효량으로 존재하는 한 광범위하게 변동될 수 있다. 예를 들어 수산화알루미늄은 백신 혼합물의 약 0.5%의 함량으로 존재할 수 있다(Al2O3 근거). 적당하게는 0.2∼200 ㎍/ml, 바람직하게는 5∼50 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 15 ㎍/ml의 범위로 최종 농도의 면역원을 포함하도록 제형화된다.
제형화 후 백신은 밀봉되고 4℃와 같은 저온에 저장되는 멸균 용기에 포함되거나 동결-건조된다. 동결건조는 안정화된 형태로 장기간 저장을 가능하게 한다.
백신은 통상적으로 피하 또는 근육 내 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 또다른 양식의 투여에 적당한 추가적인 제형은 좌약, 경우에 따라서 경구 투여를 포함한다. 좌약의 경우 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드와 같은 통상의 바인더 및 담체가 포함되고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2%의 범위로 활성 성분을 포함한 혼합물로 형성된다. 경구 제형은 예를 들어 약제 등급의 만니톨, 유당, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로즈, 탄산마그네슘과 같은 일반적으로 이용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 제형 도는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조 물질은 투여 전 예를 들어 현탁액으로서 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
환자로의 경구 투여용 캡슐, 정제 및 환약은 예를 들어 Eudragit "S", Eudragit "L", 아세트산셀룰로즈, 아세트산프탈산셀룰로즈 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈를 포함한 창자용 코팅으로 제공된다.
여기서 기술된 폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로 백신 내로 제형화된다. 약제적으로 수용 가능한 염은 산 첨가 염(펩타이드의 자유 아미노기로 형성된)을 포함하고 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 수산, 주석산 및 말레산과 같은 유기산으로 형성된다. 또한 자유 카르복실기로 형성된 염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제이철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘 및 프로카인과 같은 유기 염기에서 유래된다.
투여
일반적으로 의사는 개체 피험자에 가장 적당할 실질적인 투여량을 결정할 것이고 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 변동될 것이다. 투여량 이하는 평균 경우의 예시이다. 물론 더 높거나 낮은 투여량 범위가 적당한 개별적 경우도 존재할 수 있다.
여기서 기술된 약제적 및 백신 조성물은 직접적 주사에 의해 투여된다. 조성물은 비경구, 점막, 근육내, 정맥내, 피하, 안내 또는 경피 투여용으로 제형화된다. 일반적으로 각 단백질은 0.01∼30 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1∼10 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1∼1 mg/kg 체중의 투여량으로 투여된다.
"투여되는"이라는 용어는 바이러스 또는 비-바이러스 기술에 의한 전달을 포함한다. 바이러스 전달 메커니즘은 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 포진 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바큘로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 비-바이러스 전달 메커니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포솜, 면역리포솜, 리포펙틴, 양이온성 안면 양친매성 물질 및 그의 결합을 포함한다. 이러한 전달 메커니즘의 경로는 점막, 비강, 경구, 비경구, 위장관, 국부 또는 설하 경로를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"투여되는"이라는 용어는 비강 스프레이 또는 흡입용 에어로졸 또는 섭취 가능 용액과 같은 점막 경로; 정맥내, 근육내 또는 피하 경로와 같은 주사 가능 형태에 의해 전달되는 비경구 경로에 의한 전달을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"동시-투여되는"이라는 용어는 폴리펩타이드 및 보조제와 같은 추가 실재의 각각의 투여 사이트 및 시간이 면역체계의 필요한 조절이 달성되도록 하는 것임을 의미한다. 따라서 폴리펩타이드 및 보조제가 동일한 시간과 동일한 사이트에 투여되는 반면 보조제와 다른 시간과 다른 사이트에 폴리펩타이드를 투여하는 것에 장점이 존재한다. 폴리펩타이드 및 보조제는 동일한 전달 부형약 내에서 전달되다 - 폴리펩타이드 및 항원이 결합되거나 비결합되거나 유전적으로 결합되거나 비결합된다.
cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 및/또는 cg레퀴엠 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 항체 및 선택적으로 보조제는 단일 투여 또는 다수 투여로서 숙주 피험체에 개별적으로 투여되거나 동시-투여된다.
여기서 기술된 백신 조성물 및 약제적 조성물은 주사(비경구, 피하 및 근육내 주사를 포함), 비강내, 점막, 경구, 질내, 요도 또는 안구 투여와 같은 많은 다른 경로에 의해 투여된다.
여기서 기술된 백신 및 약제적 조성물은 통상적으로 피하 또는 근육내 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 또다른 양식의 투여에 적당한 추가적 제형은 좌약, 경우에 따라 경구 제형을 포함한다. 좌약의 경우 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드와 같은 통상의 바인더 및 담체가 포함되고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2%의 범위로 활성 성분을 포함한 혼합물로 형성된다. 경구 제형은 예를 들어 약제 등급의 만니톨, 유당, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로즈, 탄산마그네슘과 같은 일반적으로 이용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 제형 도는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조 물질은 투여 전 예를 들어 현탁액으로서 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
이하 본 발명은 예로서 수반된 도면에 나타난 바와 같이 바람직한 실시태양을 참고로 설명될 것이다.
(실시예 1) 세포주 및 세포 배양
CHO IFN-γ는 현탁액 내에서 생장하도록 개조된 중국 햄스터 난소 세포주이다. 이는 본래 디하이드록시폴레이트 환원효소 음성(DHFR-), Dukx 세포(Hyclone, Logan, UT)에서 유래되었다. CHO IFN-γ는 DHFR 및 인간 인터페론-γ에 대한 유전자로 동시 트랜스펙트되었다(Scahill et al. 1983).
CHO IFN-γ는 4 mM 글루타민, 20 mM 글루코즈 및 0.25 μM 메토트렉사트(Sigma, St. Louis, MO)로 보충된 무-글루코즈/글루타민 HyQ CHO MPS 배지에서 유지된다.
(실시예 2) 총 RAN 추출 및 첫 번째 나선 cDNA 합성
총 RNA는 Trizol(Invitrogen)을 이용하여 CHO K1 세포에서 추출된다. 모든 역전사 시약은 Promega사에서 구입된다. 전체 길이 cDNA는 1x 역전사 완충액, 10 mM의 각각의 dNTP 및 25 단위의 재조합 RNAsin 리보뉴클레아제 저해제를 함유한 반응 혼합물 내에서 42℃로 1시간 동안 Moloney Murine Leukaemia Virus 역전사효소를 이용하여 합성된다.
(실시예 3) 유전자 특이적 PCR
CHO K1 총 RNA로부터 제조된 cDNA는 유전자 특이적 PCR에 대한 주형으로 이용된다. 모든 PCR 시약은 Promega사에서 구입된다.
(실시예 4) 크리세툴루스 그리세우스 FAIM의 유전자 특이적 클로닝
FAIM의 코딩 영역은 5' PCR 프라이머, 5'-GCCGCGAGAGCTGCTGACTACGTCGTGG-3' 및 3' PCR 프라이머, 5'-GTTACTGTG-GTGAGATATGAATGGGTTTGG-3'을 이용하여 증폭된다. PCR 반응 혼합물은 1 ㎕의 cDNA 주형, 1x 반응 완충액, 200 μM의 각각의 dNTP, 2.0 mM MgCl2, 1 μM의 각각의 프라이머 및 Taq DNA 중합효소 혼합물(총 5U)을 포함한다. PCR 조건은 하기와 같다: 94℃ 5분간, 94℃ 1분간 31 사이클, 58℃ 1분간 및 72℃ 2분간 및 10분간 72℃에서 최종 연장. 이후 PCR 생성물은 서열분석을 위해 pCR-TOPO(Invitrogen, Grand Island, NY) 내로 서브클론된다.
크리세툴루스 그리세우스 FAIM(cgFAIM)
cgFAIM의 서열은 서열번호: 1 및 서열번호: 5에 나타나 있다. 크리세툴루스 그리세우스 서열은 179-아미노산 단백질을 암호화한다.
CD95 또는 APO-1로도 알려진 Fas는 수용체-매개 아폽토시스 경로에 중요한 역할을 하는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리 유래 수용체이다. TNF 수용체 패밀리의 세포외 영역은 시스테인-풍부 서브도메인의 2∼6 반복서열을 지닌다. Fas 활성화는 카스파제 8의 올리고머화를 통해 세포내 신호전달 연쇄반응을 개시한다. 카스파제 8은 효과기 카스파제의 연쇄반응-유사 활성화에 중요한 개시제 카스파제 중의 하나로 나타났다(Srinivasula et al. 1996). 또한 Fas는 카스파제 9 및 다른 효과기 카스파제의 활성화를 유발하는 미토콘드리아 사이토크롬 c가 방출되도록 하는 것으로 나타났다(Li et al. 1997).
Fas 아폽토시스 저해 분자(Fas apoptosis inhibitory molecule, FAIM)은 Fas 유도 아폽토시스에 대해 저항성을 부여할 수 있는 유도성 단백질로 판명되었다(Schneider et al. 1999; Rothstein et al. 2000). sIg 신호와 함께 B 세포 내 FAIM 발현은 Fas 사살을 차단할 수 있고 카스파제 3의 활성화 전에 Fas 신호전달 경로 내 단계를 차단함으로서 이루어짐이 나타났다(Schneider et al. 1999). FAIM은 광범위하게 발현되는 FAIM-S 및 뇌조직 특이적인 FAIM-L의 2개의 대안적으로 스플라이스된 형태로 존재하는 것으로 나타났다(Zhong et al, 2001). 또한 FAIM 서열은 다른 종 내에 높게 보존되고 이는 중요한 계통 발생적 역할을 나타낸다.
(실시예 5) 크리세툴루스 그리세우스 FADD의 유전자 특이적 클로닝
FADD의 부분적 코딩 영역은 5' PCR 프라이머 5'-CCATGGACCCATTCCTGGTGC-3' 및 3' PCR 프라이머 5'-TTCTTCCACCAGGTCAGC-CACC-3'을 이용하여 증폭된다. PCR 반응 혼합물은 1 ㎕의 cDNA 주형, 1x 반응 완충액, 200 μM의 각각의 dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 μM의 각각의 프라이머 및 Taq DNA 중합효소 혼합물(총 5U)을 포함한다.
PCR 조건은 하기와 같다: 94℃ 5분간, 94℃ 1분간 31 사이클, 55℃ 1분간 및 72℃ 2분간 및 10분간 72℃에서 최종 연장. 이후 PCR 생성물은 서열분석을 위해 pCR-TOPO(Invitrogen, Grand Island, NY) 내로 서브클론된다.
크리세툴루스 그리세우스 FADD(cgFADD)
cgFADD 서열은 서열번호: 2 및 서열번호: 6에 나타나 있다.
FADD는 CD95(Fas/APO-1)와 종양 괴사 인자(TNF) 수용체-유도 아폽토시스 모두의 일반적인 매개제이다(Chinnaiyan et al 1996). 사멸 및 사멸 효과기 도메인 모두를 포함한 FADD는 Fas 진입시 카스파제 8 활성화의 중요한 매개제이다(Chinnaiyan et al. 1995). 본 발명은 FADD의 사멸 효과기 도메인이 아닌 아폽토시스 수용체 결합 사멸 도메인만을 포함한 인공적으로 설계된 FADD 분자인 FADD DN의 이용에 의한 cgFADD 발현의 조절을 기술한다. 이는 사멸-유도 신호전달 복합체로 카스파제를 동원함으로서 더욱 하류의 아폽토시스 연쇄반응 활성화를 유발하는 효과기 도메인이다. 여기서 기술된 방법은 설계된 형태의 FADD 즉 우세 음성의 과-발현 및 이러한 설계된 분자의 이용이 고유 FADD와 경쟁하여 아폽토시스 연쇄반응을 분열시킴으로서 카스파제 동원을 방지시킬 수 있다.
(실시예 6) 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6의 유전자 특이적 클로닝
PDCD6의 부분적 코딩 영역은 5' PCR 프라이머 5'-GCCCATGGCTGCCTACTCCTA-3' 및 3' PCR 프라이머 5'-AATCCAGCCATCCTGAT-CCGT-3'을 이용하여 증폭된다. PCR 반응 혼합물은 1 ㎕의 cDNA 주형, 1x 반응 완충액, 200 μM의 각각의 dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 μM의 각각의 프라이머 및 Taq DNA 중합효소 혼합물(총 5U)을 포함한다.
PCR 조건은 하기와 같다: 94℃ 5분간, 94℃ 1분간 31 사이클, 52℃ 1분간 및 72℃ 2분간 및 10분간 72℃에서 최종 연장. 이후 PCR 생성물은 서열분석을 위해 pCR-TOPO(Invitrogen, Grand Island, NY) 내로 서브클론된다. 수득된 PCR 생성물은 정제되고 pCR 2.1-Topp 벡터 내로 클론되고 서열분석된다. 3'-RACE 프라이머는 5'-CAGCGGGTTGATAAAGACAGGAGTGGAGTG-3'이다.
3'-RACE PCR 생성물은 에티듐 브로마이드를 함유한 1% 아가로스 겔 내의 전기영동에 의해 분리되고 서열분석을 위해 pCR-TOPO(Invitrogen, Grand Island, NY) 내로 클론되기 전 관련 밴드가 절제되고 및 Qiagen 키트로 겔이 추출된다.
크리세툴루스 그리세우스 PCDC6(cgPDCD6)
cgPDCD6의 서열은 서열번호: 3 및 서열번호: 7에 나타나 있다. 크리세툴루스 그리세우스 서열은 191-아미노산 단백질을 암호화한다.
아폽토시스-연관 유전자 2(ALG-2)로도 알려진 PDCD6은 펜타-EF-핸드 단백질 패밀리에 속하는 칼슘-결합 단백질을 암호화한다. 이는 수용체-, Fas- 및 글루코코르티코이드-유도 아폽토시스에 참여한다는 보고가 존재한다(Vito et al. 1996; Krebs & Klemenz, 2000 and Jung et al., 2001). 또한 Jang et al. 2002는 ALG-2 결핍이 TCR, FAS 또는 덱타메타손 신호에 의해 유도되는 아폽토시스 차단의 부재를 유발함을 입증하였다.
(실시예 7) 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠의 유전자 특이적 클로닝
레퀴엠의 부분적 코딩 영역은 5' PCR 프라이머 5'-ATG-GCGGCTGTGGTGGAGAAT-3' 및 3' PCR 프라이머 5'-GGAGTTCTGGTTCTGGTAG-ATGG-3'을 이용하여 증폭된다. PCR 반응 혼합물은 1 ㎕의 cDNA 주형, 1x 반응 완충액, 200 μM의 각각의 dNTP, 2.0 mM MgCl2, 1 μM의 각각의 프라이머 및 Taq DNA 중합효소 혼합물(총 5U)을 포함한다.
PCR 조건은 하기와 같다: 94℃ 5분간, 94℃ 1분간 60 사이클, 44℃ 1분간 및 72℃ 2분간 및 10분간 72℃에서 최종 연장. 이후 PCR 생성물은 서열분석을 위해 pCR-TOPO(Invitrogen, Grand Island, NY) 내로 서브클론된다. 수득된 PCR 생성물은 정제되고 pCR 2.1-Topp 벡터 내로 클론되고 서열분석된다. 3'-RACE 프라이머는 5'-GCCTCAGTTACCACTATGCCCATTCCCACC-3'이다.
3'-RACE PCR 생성물은 에티듐 브로마이드를 함유한 1% 아가로스 겔 내의 전기영동에 의해 분리되고 서열분석을 위해 pCR-TOPO(Invitrogen, Grand Island, NY) 내로 클론되기 전 관련 밴드가 절제되고 및 Qiagen 키트로 겔이 추출된다.
크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠(cg레퀴엠)
cg레퀴엠의 서열은 서열번호: 4 및 서열번호: 8에 나타나 있다. 크리세툴루스 그리세우스 서열은 391-아미노산 단백질을 암호화한다.
ubi-4로도 알려진 레퀴엠은 골수세포 내 카스파제 활성화에 필수적인 징크 핑거(zinc finger) 유전자이다(Gabig et al. 1994). 레퀴엠이 생존 인자 철회 후 아폽토시스 반응에 필요한 전사 인자를 암호화하는 것으로 나타났다(Gabig et al. 1994). 더욱이 Gabig et al.(1998)은 이후 쥐과 골수세포 및 인간 K562의 세포질 및 세포핵 하위세포 분획 모두에서 본 단백질을 검출하였고 이는 본 단백질이 전사 인자와 별개의 기능을 지님을 나타내었다.
(실시예 8) 크리세툴루스 그리세우스 FAIM 발현 벡터 구축
요약적으로 pCR-TOPO(Invitrogen, Grand Island, NY) 내로 클론된 FAIM 유전자 특이적 PCR 유래의 검증된 PCR 생성물이 pcDNA3.1(+)(Invitrogen) 내로 서브클론되고 다시 서열분석된다. 이후 최종 플라스미드 pcDNA3.1(+)FAIM은 Maxi Plasmid Purification Kit(Qiagen, Hilden, 독일)을 이용하여 정제되고 그 농도가 CHO IFN-γ로의 트랜스펙션을 위해 정량화된다.
상세하게는 인공 kozak 서열 및 링커 영역을 지닌 cgFAIM이 5'-PCR 프라이머인 5'-GAATTC GCCACC ATGACAGATCTTGTAGC-3' 및 3'-PCR 프라이머인 5'- GAATTC GTGAACACATTTAATTACCA-3'을 이용하여 생성된다. 밑줄친 서열은 EcoRI 제한 사이트로 구성되고 이탤릭체 서열은 FAIM의 '인-프레임' 발현을 촉진시키는 인공 kozak 서열로 구성된다. cgFAMI의 도입 영역은 굵은체이다.
PCR 반응 혼합물은 1 ㎕의 pCR2.1-TOPO cgFAIM 주형, 1x 반응 완충액, 200 μM의 각각의 dNTP, 2.0 mM MgCl2, 1 μM의 각각의 프라이머 및 Taq DNA 중합효소 혼합물(총 5U)을 포함하였다. PCR 조건은 하기와 같다: 94℃ 5분간, 94℃ 1분간 60 사이클, 44℃ 1분간 및 72℃ 2분간 및 10분간 72℃에서 최종 연장.
이후 검증된 PCR 생성물은 37℃에서 약 4시간 동안 EcoRI 제한 효소로 분해되어 추가 라이게이션을 위한 접착 말단을 지닌 cgFAIM 삽입서열이 생성된다. 또한 블랭크 pcDNA3.1(+) 벡터(Invitrogen)도 37℃에서 약 4시간 동안 EcoRI 제한 효소로 분해된다. 이후 EcoRI 분해된 cgFAIM 삽입서열은 12 ㎕의 삽입서열을 3 ㎕의 벡터, 2 ㎕의 무-Dnase 물, 2 ㎕의 10x T4 DNA 리가제 완충액(Invitrogen) 및 1 ㎕의 T4 DNA 리가제(3U/㎕)(Invitrogen) 내에 참가시킴으로서 EcoRI 분해된 pcDNA3.1(+) 내로 라이게이트된다. 이후 이러한 라이게이션 혼합물은 실온에서 16시간 동안 인큐베이트된다.
이후 라이게이션 혼합물 10 ㎕가 플라스미드 증식을 위해 적당한 DH5α 박테리아 세포 내로 형질전환된다. 선택용 암피실린을 지닌 LB 한천 내에 배양함으로서 양성 형질전환체가 선택된다. 이후 플라스미드 추출은 pcDNA3.1(+) 발현 벡터 내로 삽입된 cgFAIM 서열을 검증하기 위해 다양한 서열분석용 DH5α 상에서 수행된다. 이후 검증된 클론 유래의 플라스미드 pcDNA3.1(+)cgFAIM은 Maxi Plasmid Purification Kit(Qiagen, Hilden, 독일)을 이용하여 정제되고 CHO IFN-γ 내로의 트랜스펙션을 위해 그 농도가 정량화된다.
(실시예 9) 크리세툴루스 그리세우스 FADD 우세 음성 발현 벡터 구축
kozak 서열을 지닌 인공 FADD 우세 음성(FADD DN) 단편은 5'-PCR 프라이머인 5'-GATATCGGATCC GCCACC-ATGGCC TTTGACATTGTATGCGACAATGTGGGG-3' 및 3'-PCR 프라이머인 5'-CCCGGG-CTCGAG TGCCTCCC-TTCCACCAGGTCAG-3'를 이용하여 생성된다. 밑줄친 서열은 각각 BamHI 및 XhoI 제한 사이트로 구성되고 이탤릭체는 cgFADD 우세 음성의 '인프레임' 발현을 촉진하는 인공 kozak 및 시작 코돈으로 구성된다. cgFADD의 도입되는 코딩 영역은 굵은체이다.
PCR 반응 혼합물은 1 ㎕의 cDNA 주형, 1x 반응 완충액, 200 μM의 각각의 dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 μM의 각각의 프라이머 및 Taq DNA 중합효소 혼합물(총 5U)을 포함하였다. pCR-TOPO에 서브클론된 부분적 FADD 서열은 주형으로 이용된다. PCR 조건은 하기와 같다: 94℃ 5분간, 94℃ 1분간 31 사이클, 50℃ 1분간 및 72℃ 2분간 및 10분간 72℃에서 최종 연장.
이후 검증된 PCR 생성물은 37℃에서 약 4시간 동안 BamHI 및 XhoI 제한 효소로 분해되어 추가 라이게이션을 위한 접착 말단을 지닌 cgFADD DN 삽입서열이 생성된다. 또한 블랭크 pcDNA3.1(+) 벡터(Invitrogen)도 37℃에서 약 4시간 동안 BamHI 및 XhoI 제한 효소로 분해된다. 이후 BamHI/XhoI 분해된 cgFADD DN 삽입서열은 12 ㎕의 삽입서열을 3 ㎕의 벡터, 2 ㎕의 무-Dnase 물, 2 ㎕의 10x T4 DNA 리가제 완충액(Invitrogen) 및 1 ㎕의 T4 DNA 리가제(3U/㎕)(Invitrogen) 내에 참가시킴으로서 BamHI/XhoI 분해된 pcDNA3.1(+) 내로 라이게이트된다. 이후 이러한 라이게이션 혼합물은 실온에서 16시간 동안 인큐베이트된다.
이후 라이게이션 혼합물 10 ㎕가 플라스미드 증식을 위해 적당한 DH5α 박테리아 세포 내로 형질전환된다. 선택용 암피실린을 지닌 LB 한천 내에 배양함으로서 양성 형질전환체가 선택된다. 이후 플라스미드 추출은 pcDNA3.1(+) 발현 벡터 내로 삽입된 cgFADD DN 서열을 검증하기 위해 다양한 서열분석용 DH5α 상에서 수행된다. 이후 검증된 클론 유래의 플라스미드 pcDNA3.1(+)FADD 우세 음성은 Maxi Plasmid Purification Kit(Qiagen, Hilden, 독일)을 이용하여 정제되고 CHO IFN-γ 내로의 트랜스펙션을 위해 그 농도가 정량화된다.
(실시예 10) 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6 억제 벡터 구축
올리고 삽입서열은 수득된 cgPDCD6 서열을 기반으로 고안된다. 올리고 삽입서열 고안은 다른 유전자에 대한 어떠한 유의적 상동성도 배제하기 위해 BLAST를 이용하여 게놈 데이터베이스와 비교된다. 5' 올리고 삽입서열인 5'-GATCCCGTGAGCTTCAGCAAGCATTATTCAAGAGATAATGCTTGCTGAAGC-TCATTTTTTGGAAA-3'이 3' 올리고 삽입서열에 어닐(anneal)된 후 5'-AGCTTTTCCAAAAAATGAGCTTCAGCAAGCATTATCTCTTGAATAATGCTTGCTGAAGCTCACG-3'이 합성된 후 HindⅢ/BglⅡ 분해된 pSUPER.neo 벡터(OligoEngine, Seattle, WA) 내로 라이게이트된다.
4 ㎕의 어닐된 올리고 삽입서열은 3 ㎕의 HindⅢ/BglⅡ 분해된 pSUPER.neo, 13 ㎕의 무-Dnase 물, 2 ㎕의 10x T4 DNA 리가제 완충액(Invitrogen) 및 1 ㎕의 T4 DNA 리가제(3U/㎕)(Invitrogen) 내에 첨가된다. 이후 이러한 라이게이션 혼합물은 실온에서 16시간 동안 인큐베이트된다.
이후 라이게이션 혼합물 10 ㎕가 플라스미드 증식을 위해 적당한 DH5α 박테리아 세포 내로 형질전환된다. 선택용 암피실린을 지닌 LB 한천 내에 배양함으로서 양성 형질전환체가 선택된다. 이후 플라스미드 추출은 pSUPER.neo 발현 벡터 내로 삽입된 cgPDCD6 siRNA 서열 검증하기 위해 다양한 서열분석용 DH5α 상에서 수행된다. 이후 검증된 클론 유래의 플라스미드 pSUPER.neo cgPDCD6 siRNA은 Maxi Plasmid Purification Kit(Qiagen, Hilden, 독일)을 이용하여 정제되고 CHO IFN-γ 내로의 트랜스펙션을 위해 그 농도가 정량화된다.
(실시예 11) 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠 억제 벡터 구축
올리고 삽입서열은 수득된 레퀴엠 서열을 기반으로 고안된다. 5' 올리고 삽입서열인 5'-GATCCCGTGAGCTTCAGCAAGCATTATTCAAGAGATAATGCTTGCTGAAGC-TCATTTTTTGGAAA-3'이 3' 올리고 삽입서열에 어닐된 후 5'-AGCTTTTCCAAAAAATGAGCTTCAGCAAGCATTATCTCTTGAATAATGCTTGCTGAAGCTCACG-3'이 합성된 후 HindⅢ/BglⅡ 분해된 pSUPER.neo 벡터(OligoEngine, Seattle, WA) 내로 라이게이트된다.
4 ㎕의 어닐된 올리고 삽입서열은 3 ㎕의 HindⅢ/BglⅡ 분해된 pSUPER.neo, 13 ㎕의 무-Dnase 물, 2 ㎕의 10x T4 DNA 리가제 완충액(Invitrogen) 및 1 ㎕의 T4 DNA 리가제(3U/㎕)(Invitrogen) 내에 첨가된다. 이후 이러한 라이게이션 혼합물은 실온에서 16시간 동안 인큐베이트된다.
이후 라이게이션 혼합물 10 ㎕가 플라스미드 증식을 위해 적당한 DH5α 박테리아 세포 내로 형질전환된다. 선택용 암피실린을 지닌 LB 한천 내에 배양함으로서 양성 형질전환체가 선택된다. 이후 플라스미드 추출은 pSUPER.neo 발현 벡터 내로 삽입된 cg레퀴엠 siRNA 서열 검증하기 위해 다양한 서열분석용 DH5α 상에서 수행된다. 이후 검증된 클론 유래의 플라스미드 pSUPER.neo cg레퀴엠 siRNA은 Maxi Plasmid Purification Kit(Qiagen, Hilden, 독일)을 이용하여 정제되고 CHO IFN-γ 내로의 트랜스펙션을 위해 그 농도가 정량화된다.
(실시예 12) 트랜스펙션 및 선택
트랜스펙션은 리포렉타민 시약(Invitrogen)을 이용하여 수행된다. 세포는 웰 당 50만개 세포를 지닌 6-웰 플레이트 내에서 밤새 생장되고 다음날 웰 당 약 1 ㎍의 선형화 플라스미드로 트랜스펙트된다. 리포펙타민-DNA 복합체는 3:1 리포펙타민(㎕) 대 DNA(㎍) 비율로 제조사의 지침에 따라 제조된다.
안정한 세포를 생성하기 위해 세포는 배지가 1000 ㎍/mL의 게네티신(Geneticin)을 함유한 선택 배지로 교환되기 전 24시간 동안 생장된다. 선택 배지 내 트랜스펙트되지 않은 세포는 1주일 내에 사멸하므로 세포는 4주간 선택 배지에서 유지된다.
(실시예 12A) 안정하게 도입되는 단일 세포 클론
안정하게 도임되는 단일 세포 클론은 각 웰 내 하나의 세포만이 존재하는 96-웰 플레이트 내로 세포의 연속 희석에 의해 수득된다. 웰은 광학현미경 하에서 조사되고 단일 세포만을 포함한 것이 표시된다. 이후 단일 클론은 진탕 플라스크 배양물 내에 첨가되기 전 24-웰 플레이트 및 6 웰 플레이트 내로 확장된다.
(실시예 12B) 일괄 배양 및 유가 배양
0.4 L의 초기 작용 부피의 배양 배지가 5.0 L 바이오리액터(bioreactor)(B. Braun, Melsungen, 독일) 내 2.5×105 세포/mL의 분주 밀도로 접종된다. 일괄 배양은 20 mM 글루코즈, 4 mM 글루타민으로 보충된 무-글루코즈/글루타민 HyQ CHO MPS 배지(Hyclone, Logan, UT)를 이용하여 수행되고 유가 배양은 4 mM 글루코즈 및 0.5 mM 글루타민으로 보충된다. 용해된 산소 농도는 50% 공기 포화로 유지되고 배양 pH는 기체 혼합물 및/또는 7.5%(w/v) NaHCO3 용액(Sigma)으로 간헐적 CO2 첨가를 이용하여 7.15로 유지된다.
유가 작용은 변형된 온라인 역동적 공급 전략을 이용하여 수행된다(Lee et al., 2003). 관련된 제어 영양분 수치 농도의 온라인 모니터는 자동화된 무균 온라인 표본추출 루프를 이용하여 1.5시간마다 수행된다. 기본 유가 배양용 공급 배지는 10 g/L의 대두 단백질 가수분해물, Hysoy(Quest International, Hoffman Estate, IL), 10 mL/L의 화학적으로 한정된 지질(Gibco BRL,Grand Island, NY), 1 mg/L의 d-비오틴(Sigma), 2 mM L-아스파르트산, 2mM L-아스파라긴, 4 mM L-시스테인, 1 mM L-글루탐산, 1 mM L-메티오닌 및 5 mM L-세린(Sigma)으로 보충된 1x 염으로 주문 제형화된 10x 무-칼슘, 무-글루코즈 및 무-글루타민 DMEM/F12로 제조된다.
기본 공급 배지는 100 mM의 글루타민(Sigma) 및 500 mM의 글루코즈(Sigma)로 더욱 보충된다. 1.5시간마다 잔류 글루타민 농도의 자동화된 온라인 측정이 수행된다. 잔류 글루타민 농도가 세트포인트 조절 농도 이하로 감소되면 공급 주입이 배양 글루타민 농도를 0.3 mM로 증가시키는 공급 배지로 달성된다.
(실시예 13) 실시간 PCR을 이용한 유전자 발현 정량화
약 1000만개 세포가 안정한 세포로부터 채취되고 총 RNA가 TrizolTM 시약(Invitrogen)을 이용하여 추출된다. 이후 RNA 표본은 GeneQuantTM Pro RNA/DNA Calculator(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 이용하여 정량화된다. RNA 함량은 260∼280 nm의 흡광비를 이용하여 측정되고 1.8 이상의 비율은 충분한 순도의 RNA 표본으로 간주된다.
정량적 실시간 PCR은 트랜스펙션 실험 후 유전자의 상대적 과-발현 또는 억제를 확인하는데 이용된다. 전사체 카피의 표준 곡선을 생성하기 위해 정량화된 FAIM, FADD, PDCD6 또는 레퀴엠을 포함한 pCR-TOPO(Invitrogen) 플라스미드가 연속적으로 희석되고 정량적 실시간 PCR에 이용된다.
FAIM 전사체용 정량적 실시간 PCR은 5'-프라이머 5'-TGGAGCTGCGAAAACCAAAG-3' 및 3'-프라이머 5'-AAACTCGCCTGCTGTCTCCAT-3'를 이용하여 수행된다. FADD 우세 음성 전사체용 정량적 실시간 PCR은 5'-프라이머 5'-GATATCGGATCCGCCACCATGG-3' 및 3'-프라이머 5'-TGCCTCCCTTCCACCAG-GTCAG-3'을 이용하여 수행된다. PDCD6 전사체용 정량적 실시간 PCR은 5'-프라이머 5'-CAGCGGGTTGATAAAGACAGG-3' 및 3'-프라이머 5'-GCCAGCCTTG-TTTTCTCGG-3'을 이용하여 수행된다. Requiem 전사체용 정량적 실시간 PCR은 5'-프라이머 5'-TGGAGTAGCCCAGAGCAATTG-3' 및 3'-프라이머 5'-tcgacgctttttacgccag-3'을 이용하여 수행된다.
이후 각 표본은 β-액틴 전사체 발현에 대해 표준화된다. β-액틴 전사체용 정량적 실시간 PCR은 5'-프라이머 5'-AGCTGAGAGGGAAATTGTGCG-3' 및 3'-프라이머 5'-GCAACGG-AACCGCTCATT-3'을 이용하여 수행된다. 최종적으로 트랜스펙트된 세포 내 표준화된 정량적 유전자 발현은 무효 벡터 트랜스펙트된 세포 내 표준화된 정량적 유전자 발현으로 나뉘어져 표준화된 상대 유전자 발현을 제공한다.
(실시예 14) 아폽토시스 분석방법
에티듐 브로마이드/아크리딘 오렌지 분석방법이 채취된 표본 내 세포를 아폽토시스 또는 비-아폽토시스 개체군으로 분류하는데 이용된다. 에티듐 브로마이드(Sigma) 및 아크라딘 오렌지(Sigma) 원액 100 ㎍/mL 이 PBS 용액(Sigma) 내에 준비된다.
약 1×106 세포가 표본으로부터 표본추출되고 1:1 에티듐 브로마이드:아크리딘 오렌지 원액 100 ㎕ 내에 재현탁되고 실온에서 5분간 인큐베이트된다. 이후 표본은 유리 슬라이드 상에 로드되고 약 400개 세포가 형광현미경 하에서 조사된다.
이후 이에 따라 세포핵 응축의 아폽토시스 형태를 지닌 세포가 분류된다. 형태 분석에 추가로 카스파제 2, 3, 8 및 9 활성이 제조사의 지침에 따라 BD ApoAlertTM Caspase Assay Plates(BD Biosciences Clontech, CA)를 이용하여 측정된다. 카스파제의 활성화는 아폽토시스의 생화학적 증명으로 간주된다.
(실시예 15) IFN-γ 정량화
연속적으로 희석된 상청액 표본의 IFN-γ 농도는 효소-연관 면역흡착법(ELISA)(HyCult Biotechnology, Uden, Netherlands)을 이용하여 분석된다. 높은 활성(>95%) 및 낮은 활성(70∼80%) 동안 최대 IFN-γ 농도를 지닌 표본은 면역친화성 정제 및 N-당화 특성화가 수행된다.
(실시예 16) 유전자 발현 검출용 실시간 PCR
세포내 타겟된 유전자의 발현을 측정하기 위해 정량적 실시간 PCR이 수행된다. 실시간 PCR은 전사체 수치의 민감한 검출 방법으로 간주된다.
유전자 발현 분석은 pcDNA3.1(+) Faim으로 트랜스펙트된 세포가 pcDNA3.1(+) 블랭크로 트랜스펙트된 세포보다 3배 이상까지 FAIM을 과발현함을 나타낸다. pcDNA3.1(+) FADD 우세 음성으로 트랜스펙트된 세포는 4배까지 FADD 우세 음성을 과-발현한다(도 1). 또한 도 1에 나타난 데이터는 siRNA가 유전자 발현을 억제하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 나타낸다. pSUPER PDCD6 siRNA로의 트랜스펙션은 약 60%까지 PDCD6 발현 억제를 유발하고 pSUPER Requiem siRNA는 70%까지 레퀴엠 발현을 억제할 수 있다(도 1).
(실시예 17) 크리세툴루스 그리세우스 FAIM의 유전자 타겟에 의해 부여되는 아폽토시스 저항성
세포는 FAIM 발현 벡터(실시예 8) 및 대조군으로서 블랭크 벡터로 트랜스펙트되고, 아폽토시스에 대한 저항성이 분석된다.
블랭크 벡터로만 트랜스펙트된 세포와 비교시 FAIM을 과-발현하는 세포는 장기간 동안 고활성 세포 밀도를 유지시킬 수 있다(도 2a). 또한 FAIM 과-발현을 지닌 세포는 활성이 95% 이하로 저하되기 시작하기 전 적어도 24시간 이상까지 활성의 유의적인 연장을 나타낸다(도 2b). 또한 아폽토시스 세포의 비율은 FAIM 과-발현을 지니지 않은 대조군 세포보다 유의적으로 더 낮다(도 2d). 또한 카스파제 2 및 3 활성의 증가는 대조군 세포와 비교시 약 24시간까지 지연된다(도 6b). 이는 FAIM 과-발현이 세포 배양 과정시 아폽토시스를 억제하는데 매우 효과적일 수 있음을 나타내었다.
(실시예 18) 크리세툴루스 그리세우스 FADD의 유전자 타겟에 의해 부여되는 아폽토시스 저항성
세포는 FADD 발현 벡터(실시예 9) 및 대조군으로서 블랭크 벡터로 트랜스펙트되고, 아폽토시스에 대한 저항성이 분석된다.
블랭크 벡터로만 트랜스펙트된 세포와 비교시 FADD 우세 음성을 과-발현하는 세포는 장기간 동안 고활성 세포 밀도를 유지시킬 수 있다(도 3a). 또한 FADD 우세 음성 과-발현을 지닌 세포는 활성이 95% 이하로 저하되기 시작하기 전 약 24시간까지 활성의 유의적인 연장을 나타낸다(도 3b). 또한 아폽토시스 세포의 비율은 FADD 우세 음성 과-발현을 지니지 않은 대조군 세포보다 유의적으로 더 낮다(도 3d). 또한 카스파제 2, 3 및 8 활성의 증가도 유의적으로 지연된다(도 6c). 데이터는 카스파제 2 및 8 활성만이 배양시 144시간 후 증가되고 카스파제 3 활성은 유의적으로 억제됨을 나타내었다. 이는 FADD 신호전달의 타겟팅이 세포 배양 과정시 아폽토시스를 효과적으로 억제함을 나타낸다.
(실시예 19) 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6의 유전자 타겟에 의해 부여되는 아폽토시스 저항성
세포는 PDCD6 발현 벡터(실시예 10) 및 대조군으로서 블랭크 벡터로 트랜스펙트되고, 아폽토시스에 대한 저항성이 분석된다.
블랭크 siRAN 벡터로만 트랜스펙트된 세포와 비교시 PDCD6 억제를 지닌 세포는 장기간 동안 고활성 세포 밀도를 유지시킬 수 있다(도 4a). 또한 PDCD6 억제를 지닌 세포는 활성 소실 속도의 유의적인 감소를 나타낸다(도 4b). 또한 아폽토시스 세포의 비율은 PDCD6 억제를 지니지 않은 대조군 세포보다 유의적으로 더 낮다(도 4d). 또한 카스파제 2, 3, 8 및 9 활성의 증가도 유의적으로 지연된다(도 6d). 데이터는 카스파제 2, 3 및 8 활성만이 배양시 144시간 후 증가되고 카스파제 9 활성은 항상 참고물질 지점 이하임을 나타내었다. 이는 PDCD6 신호전달의 타겟팅이 세포 배양 과정시 아폽토시스를 효과적으로 억제함을 나타낸다.
(실시예 20) 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠의 유전자 타겟에 의해 부여되는 아폽토시스 저항성
세포는 레퀴엠 발현 벡터(실시예 11) 및 대조군으로서 블랭크 벡터로 트랜스펙트되고, 아폽토시스에 대한 저항성이 분석된다.
블랭크 siRAN 벡터로만 트랜스펙트된 세포와 비교시 레퀴엠 억제를 지닌 세포는 장기간 동안 고활성 세포 밀도를 유지시킬 수 있다(도 5a). 또한 레퀴엠 억제를 지닌 세포는 활성 소실 속도의 유의적인 감소를 나타낸다(도 5b). 또한 아폽토시스 세포의 비율은 레퀴엠 억제를 지니지 않은 대조군 세포보다 유의적으로 더 낮다(도 5d). 또한 카스파제 2, 3 및 9 활성의 증가도 유의적으로 지연된다(도 6e). 데이터는 카스파제 활성이 대조군보다 유의적으로 낮음을 나타내었다. 이는 레퀴엠 신호전달의 타겟팅이 세포 배양 과정시 아폽토시스를 효과적으로 억제함을 나타낸다.
(실시예 21) 재조합 단백질 생성량의 개선
도 7은 유전자 타겟팅이 최종 생성물 생성량의 측면에서 세포 배양 과정을 개선시킴을 나타낸다.
FAIM 과-발현을 지닌 세포는 대조군 세포에서 나타나는 일반적인 2.3 mg/L 생성량과 비교시 3.3 mg/L까지 인터페론 감마 생성을 가능하게 한다.
FADD 신호전달의 타겟팅은 5.0 mg/L까지의 인터페론 감마 생성 농도를 가능하게 하고 이는 200% 이상의 증가를 나타낸다(도 7b).
최종 재조합 단백질 생성량의 유효한 증가와 결합된 아폽토시스 유도에 대해 설계된 세포의 증가된 강건성은 FADD, FAIM, PDCD6 및 레퀴엠의 유전자 타겟팅이 세포 배양 시스템 내 생체치료제 생성을 개선시키기 위한 효과적인 신규한 전략임을 나타낸다.
(실시예 22) 유가 배양시 활성 증가 및 증가된 활성 배양 밀도
실험은 설계된 아폽토시스 저항성 세포주의 다른 일괄 및 유가 배양 스트레스/영양분 환경 조건 하에서 유가 배양을 수행하는 능력을 측정하기 위해 수행된다.
도 8a는 레퀴엠 또는 PDCD6 억제를 지닌 안정하게 도입된 CHO IFN-γ 세포주의 활성 세포 밀도를 나타낸다. PDCD6 및 레퀴엠 억제는 유가 배양 동안 활성 세포 밀도의 유의적인 증가를 가능하게 한다.
어떠한 아폽토시스 타겟팅도 없는 세포에서 일반적으로 나타나는 5×106 세포/mL와 비교시 9×106 세포/mL 정도로 높은 활성 세포 밀도가 달성될 수 있다.
실험은 FADD DN 또는 FAIM 과-발현을 나타내는 안정하게 도입된 CHO IFN-γ로 반복되고 유사한 결과가 관찰된다.
이는 레퀴엠 또는 PDCD6 억제 또는 FAIM 및 FADD DN 과발현에 의한 아폽토시스 저항성 설계는 세포 생장을 저해하는 인자(들)에 대한 그의 강건성으로 인해 배양 활성의 연장을 가능하게 할 뿐만 아니라 더욱 더 높은 활성 세포 밀도로 생장할 수 있는 능력을 부여함을 입증한다.
(실시예 23) 유가 배양시 증가된 재조합 단백질 생성량
도 9a는 유전자 타겟팅이 인터페론 감마 생성 및 생성량의 더욱 유의적인 증가를 가능하게 함을 나타낸다.
안정하게 억제된 레퀴엠 또는 PDCD6을 지닌 세포는 정상 유가 배양시 일반적으로 나타나는 20 ㎍/mL과 비교시 각각 49 및 41 ㎍/mL까지 인터페론 감마 생성을 제공한다. 이는 재고합 단백질 생성량의 200% 이상의 증가를 나타낸다.
실험은 FAIM을 과발현하는 세포로 반복되고 유사한 결과가 관찰된다.
(실시예 24) 변형된 CHO 세포주 내 재조합 인간 IFN-γ의 증가된 시알화 - 시알산 함량 분석
IFN-γ를 발현하는 변형된 CHO 세포주가 상기 기술된 바와 같이 모 CHO 세포주로부터 제조된다.
재조합 IFN-γ는 중간-실험 생장기 및 최대 IFN-γ 농도가 높은 활성(>95%) 및 낮은 활성(70∼80%) 동안 검출될 때 채취된 표본으로부터 정제된다.
이후 IFN-γ의 시알산 함량은 Wong et al.(2005a), Biotechnol Bioeng 89: 164-177)에 기술된 바와 같이 변형된 티오바르비투르산(thiobarbituric acid)을 이이용하여 측정된다.
(실시예 25) 변형된 CHO 세포주 내 재조합 인간 IFN-γ의 증가된 시알화 - 결과
도 10은 변형된 CHO IFN-γ 세포주 및 모 CHO IFN-γ 세포주에 대해 유가 배양 동안 3가지 시점 즉 중간-실험기(>95% 활성), 정지기(>95% 활성) 및 사멸기(70∼80% 활성)에서 채취된 재조합 인간 IFN-γ의 시알화를 나타낸다.
후자의 경우 재조합 인간 IFN-γ의 시알산 함량은 배양이 중간-실험기(2.9 몰 SA/몰 IFN-γ)에서 정지기(2.2 몰 SA/몰 IFN-γ)에서 사멸기(2.1 몰 SA/몰 IFN-γ)로 진행됨에 따라 감소되었다.
이와 대조적으로 4개의 변형된 CHO IFN-γ 세포주에 대해 3가지 시점에서 채취된 IFN-γ의 시알산 함량은 유지되고 2.7∼3.5 몰 SA/몰 IFN-γ의 범위로 시알화 증가를 나타내었다.
이들 결과는 아폽토시스-저항성 CHO 세포의 또다른 잠재적 이익이 배양 활성의 소실에 관계없이(70∼80%) 연장된 배양 시간 동안 단백질 당화 품질의 유지/증가임을 나타낸다. 이는 낮은 정도의 시알화가 단백질-기반 약물의 생체 내 반감기를 감소시킬 수 있기 때문에(Varki, 1993, Biotechnol Bioeng 43:423-428; Gramer et al., 1995, Glycobiology 3:97-130 ) 생체치료제 제조에 이용되는 세포주에 대한 현저한 장점이다.
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이러한 문헌 내에 기술된 각각의 출원 및 심사중인 각각의 출원 및 특허를 포함한 상기 출원 및 특허 각각에 인용되거나 참고된 문헌("출원 인용 문헌") 및 각각의 출원 및 특허 및 출원 인용 문헌에 인용되거나 기술된 제조사 지침 또는 카달로그는 참고문헌에 포함된다. 더욱이 본 문헌에 인용된 모든 문헌, 본 문헌에 인용된 문헌에 인용되고 참고된 모든 문헌 및 본 문헌에 인용되거나 기술된 생성물에 대한 제조사 지침 또는 카달로그는 참고문헌에 포함된다.
본 발명에 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 결합하여 기술되나 청구된 본 발명이 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로 분자생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방법의 다양한 변형은 청구범위 내에 존재한다.
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Oligonucleotide primer <400> 12 cccgggctcg agtgcctccc ttccaccagg tcag 34 <210> 13 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Suppression vector insert <400> 13 gatcccgtga gcttcagcaa gcattattca agagataatg cttgctgaag ctcatttttt 60 ggaaa 65 <210> 14 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Suppression vector insert <400> 14 agcttttcca aaaaatgagc ttcagcaagc attatctctt gaataatgct tgctgaagct 60 cacg 64 <210> 15 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Suppression vector insert <400> 15 gatcccgcgg atccttgaac ctgatttcaa gagaatcagg ttcaaggatc cgcttttttg 60 gaaa 64 <210> 16 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Suppression vector insert <400> 16 agcttttcca aaaaagcgga tccttgaacc tgattctctt gaaatcaggt tcaaggatcc 60 gcgg 64 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 17 gccgcgagag ctgctgacta cgtcgtgg 28 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 18 gttactgtgg tgagatatga atgggtttgg 30 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aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 3900 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 3960 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 4020 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 4080 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 4140 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 4200 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 4260 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 4320 aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 4380 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtttt tttgtttgca agcagcagat 4440 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 4500 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 4560 cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 4620 aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 4680 atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 4740 cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 4800 tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 4860 atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 4920 taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 4980 tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 5040 gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 5100 cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 5160 cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 5220 gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 5280 aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 5340 accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 5400 ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 5460 gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 5520 aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 5580 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tc 5632 <210> 39 <211> 4758 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plasmid <400> 39 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660 ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcatcccc gatccttatc 720 gctatcgatt cacacaaaaa accaacacac agatgtaatg aaaataaaga tattttattg 780 cggccatcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc atttcgaacc ccagagtccc 840 gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg 900 ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 960 cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 1020 aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 1080 acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 1140 gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 1200 gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 1260 agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 1320 tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 1380 tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 1440 cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 1500 accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 1560 tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 1620 ccatcttgtt caatcatggt ggctctagcc ttaagttcga gactgttgtg tcagaagaat 1680 caagctgatc tgagtccggt aagctagctt gggctgcagg tcgaaaggcc cggagatgag 1740 gaagaggaga acagcgcggc agacgtgcgc ttttgaagcg tgcagaatgc cgggcctccg 1800 gaggaccttc gggcgcccgc cccgcccctg agcccgcccc tgagcccgcc cccggaccca 1860 ccccttccca gcctctgagc ccagaaagcg aaggagcaaa gctgctattg gccgctgccc 1920 caaaggccta cccgcttcca ttgctcagcg gtgctgtcca tctgcacgag actagtgaga 1980 cgtgctactt ccatttgtca cgtcctgcac gacgcgagct gcggggcggg ggggaacttc 2040 ctgactaggg gaggagtaga aggtggcgcg aaggggccac caaagaacgg agccggttgg 2100 cgcctaccgg ccggtggatg tggaatgtgt gcgaggccag aggccacttg tgtagcgcca 2160 agtgcccagc ggggctgcta aagcgcatgc tccagactgc cttgggaaaa gcgcctcccc 2220 tacccggtag aattcgaacg ctgacgtcat caacccgctc caaggaatcg cgggcccagt 2280 gtcactaggc gggaacaccc agcgcgcgtg cgccctggca ggaagatggc tgtgagggac 2340 aggggagtgg cgccctgcaa tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa tcaccataaa 2400 cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt atgagaccac agatcccgtg 2460 agcttcagca agcattattc aagagataat gcttgctgaa gctcattttt tggaaaagct 2520 tatcgatacc gtcgacctcg agggggggcc cggtacccag cttttgttcc ctttagtgag 2580 ggttaattgc gcgcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 2640 cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 2700 aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 2760 acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 2820 ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 2880 gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 2940 caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 3000 tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 3060 gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 3120 ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 3180 cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 3240 tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 3300 tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 3360 cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 3420 agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 3480 agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 3540 gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 3600 aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 3660 ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 3720 gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 3780 taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 3840 tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 3900 tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 3960 gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 4020 gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 4080 ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 4140 cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 4200 tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 4260 cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 4320 agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 4380 cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 4440 aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 4500 aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 4560 gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 4620 gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 4680 tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 4740 ttccccgaaa agtgccac 4758 <210> 40 <211> 4756 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plasmid <400> 40 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660 ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcatcccc gatccttatc 720 gctatcgatt cacacaaaaa accaacacac agatgtaatg aaaataaaga tattttattg 780 cggccatcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc atttcgaacc ccagagtccc 840 gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg 900 ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 960 cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 1020 aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 1080 acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 1140 gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 1200 gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 1260 agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 1320 tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 1380 tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 1440 cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 1500 accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 1560 tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 1620 ccatcttgtt caatcatggt ggctctagcc ttaagttcga gactgttgtg tcagaagaat 1680 caagctgatc tgagtccggt aagctagctt gggctgcagg tcgaaaggcc cggagatgag 1740 gaagaggaga acagcgcggc agacgtgcgc ttttgaagcg tgcagaatgc cgggcctccg 1800 gaggaccttc gggcgcccgc cccgcccctg agcccgcccc tgagcccgcc cccggaccca 1860 ccccttccca gcctctgagc ccagaaagcg aaggagcaaa gctgctattg gccgctgccc 1920 caaaggccta cccgcttcca ttgctcagcg gtgctgtcca tctgcacgag actagtgaga 1980 cgtgctactt ccatttgtca cgtcctgcac gacgcgagct gcggggcggg ggggaacttc 2040 ctgactaggg gaggagtaga aggtggcgcg aaggggccac caaagaacgg agccggttgg 2100 cgcctaccgg ccggtggatg tggaatgtgt gcgaggccag aggccacttg tgtagcgcca 2160 agtgcccagc ggggctgcta aagcgcatgc tccagactgc cttgggaaaa gcgcctcccc 2220 tacccggtag aattcgaacg ctgacgtcat caacccgctc caaggaatcg cgggcccagt 2280 gtcactaggc gggaacaccc agcgcgcgtg cgccctggca ggaagatggc tgtgagggac 2340 aggggagtgg cgccctgcaa tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa tcaccataaa 2400 cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt atgagaccac agatcccgcg 2460 gatccttgaa cctgatttca agagaatcag gttcaggatc cgcttttttg gaaaagctta 2520 tcgataccgt cgacctcgag ggggggcccg gtacccagct tttgttccct ttagtgaggg 2580 ttaattgcgc gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 2640 ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 2700 tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 2760 ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 2820 gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 2880 gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 2940 ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 3000 ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 3060 cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 3120 ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 3180 tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 3240 gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 3300 tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 3360 gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 3420 tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 3480 ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 3540 agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 3600 gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 3660 attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 3720 agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 3780 atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 3840 cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 3900 ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 3960 agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 4020 tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 4080 gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 4140 caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 4200 ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 4260 gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 4320 tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 4380 tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 4440 cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 4500 cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 4560 gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 4620 atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 4680 agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 4740 ccccgaaaag tgccac 4756 <210> 41 <211> 78 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 41 Phe Asp Ile Val Cys Asp Asn Val Gly Arg Asp Trp Lys Arg Leu Ala 1 5 10 15 Arg Gln Leu Lys Val Ser Glu Ala Lys Ile Asp Gly Ile Glu Glu Arg 20 25 30 Tyr Pro Arg Ser Leu Ser Glu Gln Val Arg Glu Ala Leu Arg Val Trp 35 40 45 Lys Ile Ala Glu Arg Glu Lys Ala Thr Val Ala Gly Leu Val Lys Ala 50 55 60 Leu Arg Ala Cys Arg Leu Asn Leu Val Ala Asp Leu Val Glu 65 70 75 <210> 42 <211> 234 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 42 tttgacattg tatgcgacaa tgtggggaga gattggaaga gactggcccg ccagctgaaa 60 gtgtctgagg ccaaaattga tgggattgag gagaggtacc cccgaagcct gagtgagcag 120 gtaagggagg ctctgagagt ctggaagatt gccgagaggg agaaagccac ggtggctgga 180 ctggtaaagg cacttcgggc ctgccggctg aacctggtgg ctgacctggt ggaa 234 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 43 gaattcgcca ccatgacaga tcttgtagc 29 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 44 gaattcgtga acacatttaa ttacca 26

Claims (29)

  1. 세포의 아폽토시스를 매개하는 것이 가능하고, 하기에서 선택된 서열을 포함한 분리된 폴리펩타이드:
    (a) 서열번호: 1에 나타난 서열과 적어도 97% 이상 서열 동일성을 지닌 cgFAIM 서열;
    (b) 서열번호: 2에 나타난 서열과 적어도 69% 이상 서열 동일성을 지닌 cgFADD 서열;
    (c) 서열번호: 3에 나타난 서열과 적어도 89% 이상 서열 동일성을 지닌 cgPDCD6 서열;
    (d) 서열번호: 4에 나타난 서열과 적어도 90% 이상 서열 동일성을 지닌 cg레퀴엠 서열;
    (e) 상기한 (a)∼(d) 중 어느 하나의 적어도 15개 이상의 인접 잔기의 단편인 서열
  2. 서열번호: 1에 나타난 cgFAIM 서열; 서열번호: 2에 나타난 cgFADD 서열; 서열번호: 3에 나타난 cgPDCD6 서열; 서열번호: 4에 나타난 cg레퀴엠 서열에서 선택되고, 세포의 아폽토시스를 매개하는 것이 가능한 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) 서열을 포함한 분리된 폴리펩타이드
  3. 바람직하게는 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7 및 서열번호: 8로 구성된 군에서 선택되고, 제 1항 또는 제 2항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한 분리된 폴리뉴클레오타이드
  4. 하기에서 선택된 서열을 포함한 분리된 폴리뉴클레오타이드:
    (a) 서열번호: 5에 나타난 서열과 적어도 90% 이상 서열 동일성을 지닌 cgFAIM 서열;
    (b) 서열번호: 6에 나타난 서열과 적어도 90% 이상 서열 동일성을 지닌 cgFADD 서열;
    (c) 서열번호: 7에 나타난 서열과 적어도 93% 이상 서열 동일성을 지닌 cgPDCD6 서열;
    (d) 서열번호: 8에 나타난 서열과 적어도 89% 이상 서열 동일성을 지닌 cg레퀴엠 서열;
    (e) 상기한 (a)∼(d) 중 어느 하나의 적어도 15개 이상의 인접 잔기의 단편인 서열
    또는 이에 상보적이거나, 스트린전트 조건 하에서 이에 혼성화하는 것이 가능하거나 유전자 코드 결과로서 이에 대해 퇴화된 서열
  5. 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하는 것이 가능한 조절 서열에 실시 가능하게 결합된 제 3항 또는 제 4항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 포함한 발현 서열
  6. 제 5항에 있어서, 발현 벡터임을 특징으로 하는 발현 서열
  7. 세포에 노출시 세포에 의한 cgFAIM, cgFADD, cgPDCD6 또는 cg레퀴엠의 발현을 조절하는 것이 가능함을 특징으로 하는 제 3항 또는 제 4항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함한 벡터
  8. 제 7항에 있어서, 크리세툴루스 그리세우스 FAIM 서열 또는 그의 일부를 포함하고, 세포 내에서 cgFAIM, 바람직하게는 pcDNA3.1(+) FAIM(서열번호: 37)의 상향-조절을 달성하는 것이 가능함을 특징으로 하는 벡터
  9. 제 7항에 있어서, 크리세툴루스 그리세우스 FADD 서열 또는 그의 일부를 포함하고, 세포 내에서 cgFADD, 바람직하게는 pcDNA3.1(+) FADD DN(서열번호: 38)의 하향-조절을 달성하는 것이 가능함을 특징으로 하는 벡터
  10. 제 7항에 있어서, 크리세툴루스 그리세우스 PDCD6 서열 또는 그의 일부를 포함하고, 세포 내에서 cgPDCD6, 바람직하게는 pSUPER.neo.PDCD6 siRNA(서열번호: 39)의 하향-조절을 달성하는 것이 가능함을 특징으로 하는 벡터
  11. 제 7항에 있어서, 크리세툴루스 그리세우스 레퀴엠 서열 또는 그의 일부를 포함하고, 세포 내에서 cg레퀴엠, 바람직하게는 pSUPER.neo.레퀴엠 siRNA(서열번호: 40)의 하향-조절을 달성하는 것이 가능함을 특징으로 하는 벡터
  12. 바람직하게는 세포 내로 형질전환됨을 특징으로 하는 제 5항 또는 제 6항에 따른 발현 서열 또는 제 7항 내지 제 11항에 따른 벡터를 포함한 세포
  13. 약제적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 제 1항 또는 제 2항에 따른 폴리펩타이드, 제 3항 또는 제 4항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제 5항 또는 제 6항에 따른 발현 서열, 제 7항 내지 제 11항에 따른 벡터 또는 제 12하에 따른 세포를 포함한 약제적 조성물
  14. (a) 제 3항 또는 제 4항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 것이 가능한 조절 서열을 포함한 발현 서열을 제공하는 단계;
    (b) 상기 조절 서열의 조절 하에서 상기 발현 서열로부터 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 단계;
    (c) 선택적으로는 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계
    를 포함한 폴리펩타이드의 제조 방법
  15. 제 14항에 있어서, 상기 발현 서열은 세포에 의한 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하기 위해 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포 내로 트랜스펙트되는 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 방법
  16. 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포 내에서 서열번호: 1에 나타난 서열을 지닌 cgFAIM 폴리펩타이드 또는 서열번호: 5에 나타난 서열을 지닌 cgFAIM 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하고, 바람직하게는 상향-조절하는 단계를 포함한 방법
  17. 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포 내에서 서열번호: 2에 나타난 서열을 지닌 cgFADD 폴리펩타이드 또는 서열번호: 3에 나타난 서열을 지닌 cgPDCD6 폴리펩타이드, 서열번호: 4에 나타난 서열을 지닌 cg레퀴엠 폴리펩타이드 또는 서열번호: 6에 나타난 서열을 지닌 cgFADD 폴리뉴클레오타이드, 서열번호: 7에 나타난 서열을 지닌 cgPDCD6 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호: 8에 나타난 서열을 지닌 cg레퀴엠 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하고, 바람직하게는 하향-조절하는 단계를 포함한 방법
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 상기 세포에 노출시키고, 바람직하게는 상기 세포를 상기 벡터로 트랜스펙트시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
  19. 변형되지 않은 세포와 비교시 서열번호: 1에 나타난 서열을 지닌 폴리펩타이드 또는 서열번호: 5에 나타난 서열을 지닌 폴리뉴클레오타이드의 발현을 상향-조절하도록 변형되고, 바람직하게는 유전적으로 설계된 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포
  20. 변형되지 않은 세포와 비교시 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4에 나타난 서열을 지닌 폴리펩타이드 또는 서열번호: 6, 서열번호: 7 또는 서열번호: 8에 나타난 서열을 지닌 폴리뉴클레오타이드의 발현을 하향-조절하도록 변형되고, 바람직하게는 유전적으로 설계된 세포, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포
  21. 제 19항 또는 제 20항에 따른 세포 또는 그의 자손을 포함한 세포주, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스 세포주
  22. 제 19항 또는 제 20항에 따른 세포 또는 그의 자손 또는 제 21항에 따른 세포주를 포함한 세포 배양물
  23. 제 19항 또는 제 20항에 따른 세포 또는 그의 자손을 포함한 형질전환 비-인간 동물, 바람직하게는 크리세툴루스 그리세우스
  24. 폴리펩타이드의 발현이 변형되지 않은 세포와 비교시
    (ⅰ) 세포의 세포 활성이 증가되거나 증진되고, 바람직하게는 아폽토시스 세포가 감소되고;
    (ⅱ) 세포의 단백질 생성량, 바람직하게는 재조합적으로 발현되는 단백질 생성량이 증가되거나 증진되고;
    (ⅲ) 세포에 의한 발현 단백질의 당화, 바람직하게는 시알화가 증가되거나 증진됨을 특징으로 하는
    제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 방법, 제 12항, 제 19항 또는 제 20항에 따른 세포, 제 21항에 따른 세포주, 제 22항에 따른 세포 배양물, 제 23항에 따른 형질전환 비-인간 동물
  25. 단백질, 바람직하게는 이형적 단백질, 더욱 바람직하게는 외인성 유도 서열 유래 단백질, 가장 바람직하게는 재조합 단백질, 바람직하게는 인터페론 감마의 생성을 위한 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 방법, 제 19항 또는 제 20항에 따른 세포, 제 21항에 따른 세포주, 제 22항에 따른 세포 배양물 또는 제 23항에 따른 형질전환 비-인간 동물의 이용
  26. 제 19항 또는 제 20항에 따른 세포를 제공하고, 상기 세포를 재조합 단백질의 발현이 가능한 발현 벡터로 트랜스펙트시키고, 상기 세포 내에서 재조합 단백질의 발현을 유발하는 단계를 포함한 재조합 단백질, 바람직하게는 인터페론 감마의 제조 방법
  27. 서열번호: 9를 지닌 cgFADD 우세 음성 서열을 포함한 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 서열번호: 10 또는 그의 단편, 상동체, 변이체 또는 유도체
  28. 제 25항 또는 제 26항에 따른 방법에 의해 생성 가능하고, 변형되지 않은 세포에서 생성 가능한 폴리펩타이드와 비교시 증가된 시알화를 지님을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 재조합 단백질, 더욱 바람직하게는 인터페론 감마
  29. 제 28항에 있어서, 상기 시알화는 2.9 몰 시알산 / 생성된 폴리펩타이드 몰 이상, 바람직하게는 약 3.5 몰 시알산 / 생성된 폴리펩타이드 몰임을 특징으로 하는 폴리펩타이드
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