JP2003510087A - アポトーシス阻害剤を用いた組換えタンパク質の作成方法 - Google Patents
アポトーシス阻害剤を用いた組換えタンパク質の作成方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、アポトーシス阻害剤を用いた、宿主細胞のインビトロ培養における組換えタンパク質の作成及び生産の改善された方法を提供する。本方法での一又は複数のアポトーシス阻害剤の使用は、細胞培養物のアポトーシスを減少し、所望する組換えタンパク質の生産性を顕著に向上させることができる。
Description
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、一般的に、一又は複数のアポトーシス阻害剤を用いて組換えタンパ
ク質を作成する改良された方法に関する。
ク質を作成する改良された方法に関する。
【０００２】
(発明の背景)
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死のバランスによ
り部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞
死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病
理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロール
された状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的
又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば
、Barrら, Bio/Technology, 12：487-493(1994)；Stellerら, Science, 267：14
45-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選
択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itohら,Cell,
66：233-243(1991)］。 細胞培養及びバイオリアクターにおける細胞数のコントロールもまた、細胞増
殖と細胞死の間のバランスである。バイオリアクターにおける細胞死がアポトー
シスプロセスでありうることを示す文献での報告がある[Suzuki E.,ら, Cytotec
nology, 23:55-59(1997); Al-Rubeai, M.及びSingh R. P, Curr. Opin. Biotech
, 9:152-156(1998)]。アポトーシスプロセスを栄養欠乏[Franek F.及びChladkov
a-Sramkova K., Cytotechnology, 18:113-117(1995); Mercille S.及びMassie B
., Biotechnol. Bioeng., 44:720-726(1994)]、血清欠乏[Singh R. P.,ら, Biot
echnol. Bioeng., 44:1140-1154(1994); Singh R. P.,ら, Biotechnol. Bioeng.
, 44:720-726(1994); Zanghi A.,ら, Biotech. Bioeng., 64:108-119(1999)]又
はバイオリアクターの細胞培養の他の制御パラメータにより促進しうることを記
載しているが、バイオリアクター機構、必要な培養パラメータの十分な理解の不
足、又は他の不明瞭な原因のために十分に制御されない。
り部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞
死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病
理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロール
された状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的
又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば
、Barrら, Bio/Technology, 12：487-493(1994)；Stellerら, Science, 267：14
45-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選
択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itohら,Cell,
66：233-243(1991)］。 細胞培養及びバイオリアクターにおける細胞数のコントロールもまた、細胞増
殖と細胞死の間のバランスである。バイオリアクターにおける細胞死がアポトー
シスプロセスでありうることを示す文献での報告がある[Suzuki E.,ら, Cytotec
nology, 23:55-59(1997); Al-Rubeai, M.及びSingh R. P, Curr. Opin. Biotech
, 9:152-156(1998)]。アポトーシスプロセスを栄養欠乏[Franek F.及びChladkov
a-Sramkova K., Cytotechnology, 18:113-117(1995); Mercille S.及びMassie B
., Biotechnol. Bioeng., 44:720-726(1994)]、血清欠乏[Singh R. P.,ら, Biot
echnol. Bioeng., 44:1140-1154(1994); Singh R. P.,ら, Biotechnol. Bioeng.
, 44:720-726(1994); Zanghi A.,ら, Biotech. Bioeng., 64:108-119(1999)]又
はバイオリアクターの細胞培養の他の制御パラメータにより促進しうることを記
載しているが、バイオリアクター機構、必要な培養パラメータの十分な理解の不
足、又は他の不明瞭な原因のために十分に制御されない。
【０００３】
現在理解されているように、アポトーシス又は細胞死プログラムは、少なくと
も３つの重要な要素−活性化因子、阻害剤、及びエフェクターを含み；線虫(C.
elegans)において、これらの成分はそれぞれ３つの遺伝子、Ｃｅｄ-４、Ｃｅｄ-
９及びＣｅｄ-３によりコードされている［Steller, Science, 267：1445(1995)
；Chinnaiyanら, Science, 275：1122-1126(1997); Wangら, Cell, 90:1-20(199
7)］。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの２つ、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏ１
(ＣＤ９５)は、アポトーシス性細胞死を活性化することができる［Chinnaiyan及
びDixit, Current Biology, 6：555-562(1996)；Fraser及びEvan, Cell; 85：78
1-784(1996)］。また、ＴＮＦＲ１は転写因子、ＮＦ-ＫＢの活性化を媒介するこ
とも知られている［Tartagliaら, Cell, 74：845-853(1993)；Hsuら, Cell, 84
：299-308(1996)］。ある程度のＥＣＤ相同性に加えて、これら２つのレセプタ
ーは、死ドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(Ｉ
ＣＤ)での相同性を共有する［Tartagliaら, 上掲；Nagata, Cell, 88：355(1997
)］。また、死ドメインはアポトーシスを調節するいくつかの後生動物タンパク
質、すなわちＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤ及びＲＩＰと称されるショウジ
ョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)及び哺乳動物タンパク質中においても見
出されている［Cleaveland及びIhle, Cell, 81：479-482(1995)］。
も３つの重要な要素−活性化因子、阻害剤、及びエフェクターを含み；線虫(C.
elegans)において、これらの成分はそれぞれ３つの遺伝子、Ｃｅｄ-４、Ｃｅｄ-
９及びＣｅｄ-３によりコードされている［Steller, Science, 267：1445(1995)
；Chinnaiyanら, Science, 275：1122-1126(1997); Wangら, Cell, 90:1-20(199
7)］。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの２つ、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏ１
(ＣＤ９５)は、アポトーシス性細胞死を活性化することができる［Chinnaiyan及
びDixit, Current Biology, 6：555-562(1996)；Fraser及びEvan, Cell; 85：78
1-784(1996)］。また、ＴＮＦＲ１は転写因子、ＮＦ-ＫＢの活性化を媒介するこ
とも知られている［Tartagliaら, Cell, 74：845-853(1993)；Hsuら, Cell, 84
：299-308(1996)］。ある程度のＥＣＤ相同性に加えて、これら２つのレセプタ
ーは、死ドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(Ｉ
ＣＤ)での相同性を共有する［Tartagliaら, 上掲；Nagata, Cell, 88：355(1997
)］。また、死ドメインはアポトーシスを調節するいくつかの後生動物タンパク
質、すなわちＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤ及びＲＩＰと称されるショウジ
ョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)及び哺乳動物タンパク質中においても見
出されている［Cleaveland及びIhle, Cell, 81：479-482(1995)］。
【０００４】
リガンド結合及びレセプターの集団化に際して、ＴＮＦＲ１及びＣＤ９５はＦ
ＡＤＤを死誘導シグナル伝達複合体に補充すると考えられる。ＣＤ９５はＦＡＤ
Ｄに直接結合するとされており、ＴＮＦＲ１はＦＡＤＤにＴＲＡＤＤを介して間
接的に結合する［Chinnaiyanら, Cell, 81: 505-512 (1995); Boldinら, J. Bio
l. Chem., 270: 387-391 (1995); Hsuら, 上掲; Chinnaiyanら, J. Biol. Chem.
, 271: 4961-4965 (1996)］。ＦＡＤＤは、Ｃｅｄ-３関連プロテアーゼ、ＭＡＣ
Ｈ-α／ＦＬＩＣＥ（カスパーゼ８）を死シグナル伝達複合体に補充するアダプ
タータンパク質として提供されると報告されている［Boldinら, Cell, 85: 803-
815 (1996)；Muzioら, Cell, 85:817-827(1996)］。ＭＡＣＨ-α／ＦＬＩＣＥは
、インターロイキン-１β変換酵素（ＩＣＥ）及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａを含む
アポトーシス性プロテアーゼのカスケードを作動させるトリガーであることがわ
かり、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実行させ得る［Fraser及びEvan
, 上掲］。 プログラム細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ｃｅｄ-３、及び哺乳動物のＩＬ-
１-変換酵素、ＩＣＥに関連したシステインプロテアーゼファミリーのメンバー
の活性に関与していることが最近開示された。ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａ
プロテアーゼの活性を、牛痘ウイルス遺伝子、ｃｒｍＡの産物により阻害するこ
とができる［Rayら, Cell, 69：597-604(1992)；Tewariら, Cell, 81：801-809(
1995)］。最近の研究では、ＣｒｍＡがＴＮＦＲ１-及びＣＤ９５-誘発細胞死を
阻害し得ることが示されている［Enariら, Nature, 375：78-81(1995)；Tewari
ら, J. Biol. Chem., 270：3255-3260(1995)］。
ＡＤＤを死誘導シグナル伝達複合体に補充すると考えられる。ＣＤ９５はＦＡＤ
Ｄに直接結合するとされており、ＴＮＦＲ１はＦＡＤＤにＴＲＡＤＤを介して間
接的に結合する［Chinnaiyanら, Cell, 81: 505-512 (1995); Boldinら, J. Bio
l. Chem., 270: 387-391 (1995); Hsuら, 上掲; Chinnaiyanら, J. Biol. Chem.
, 271: 4961-4965 (1996)］。ＦＡＤＤは、Ｃｅｄ-３関連プロテアーゼ、ＭＡＣ
Ｈ-α／ＦＬＩＣＥ（カスパーゼ８）を死シグナル伝達複合体に補充するアダプ
タータンパク質として提供されると報告されている［Boldinら, Cell, 85: 803-
815 (1996)；Muzioら, Cell, 85:817-827(1996)］。ＭＡＣＨ-α／ＦＬＩＣＥは
、インターロイキン-１β変換酵素（ＩＣＥ）及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａを含む
アポトーシス性プロテアーゼのカスケードを作動させるトリガーであることがわ
かり、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実行させ得る［Fraser及びEvan
, 上掲］。 プログラム細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ｃｅｄ-３、及び哺乳動物のＩＬ-
１-変換酵素、ＩＣＥに関連したシステインプロテアーゼファミリーのメンバー
の活性に関与していることが最近開示された。ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａ
プロテアーゼの活性を、牛痘ウイルス遺伝子、ｃｒｍＡの産物により阻害するこ
とができる［Rayら, Cell, 69：597-604(1992)；Tewariら, Cell, 81：801-809(
1995)］。最近の研究では、ＣｒｍＡがＴＮＦＲ１-及びＣＤ９５-誘発細胞死を
阻害し得ることが示されている［Enariら, Nature, 375：78-81(1995)；Tewari
ら, J. Biol. Chem., 270：3255-3260(1995)］。
【０００５】
Tewariらにより最近概説されているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２及びＣＤ
４０は、転写因子、ＮＦ-ＫＢの活性化を通して、炎症誘発性及び同時刺激性サ
イトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Te
wariら, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。ＮＦ-ＫＢは、そのサ
ブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含有する二量体転写因子のファミリーの原型であ
る［Vermaら, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. Rev. Immu
nol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、ＮＦ-ＫＢはＩＫＢ阻害剤
ファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してＩＫＢの不活性
化の際に、放出されたＮＦ-ＫＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して
遺伝子転写を活性化する。 このような伝達経路の最近の説明については、例えばAshkenaziら, Science,
281:1305-1308(1998); Nagata, Cell, 88:355-365(1997)参照。 データとして、カスパーゼ阻害剤の効果と培養した組換え細胞での抗アポトー
シス遺伝子の発現に関して矛盾する報告がある。例えば、Murrayら, Biotech. B
ioeng., 51:298-304(1996)にはＮＳＯ骨髄腫細胞のｂｃｌ-２の過剰発現は培養
細胞の衰退期特性に影響しなかったことを記載している。対照的に、他の研究者
は、ｂｃｌ-２が細胞培養条件下で異なる細胞株の死を防止するのに効果的であ
りうることを発見した[例えば、Itohら, Biotechnol. Bioeng., 48:118-122(199
5); Mastrangeloら, TIBTECH, 16:88-95(1998); Simpsonら, Biotechnol. Bioen
g., 54:1-16(1997); Singhら, Biotechnol. Bioeng., 52:166-175(1996)]。Gosw
amiら, Biotechnol. Bioeng., 62:632-640(1999)には、カスパーゼ阻害剤、ｚ-
ＶＡＤ-ｆｍｋがＣＨＯ細胞の無血清培養において生存を実質的に延長すること
ができないことを彼らは発見したと報告している。
４０は、転写因子、ＮＦ-ＫＢの活性化を通して、炎症誘発性及び同時刺激性サ
イトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Te
wariら, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。ＮＦ-ＫＢは、そのサ
ブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含有する二量体転写因子のファミリーの原型であ
る［Vermaら, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. Rev. Immu
nol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、ＮＦ-ＫＢはＩＫＢ阻害剤
ファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してＩＫＢの不活性
化の際に、放出されたＮＦ-ＫＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して
遺伝子転写を活性化する。 このような伝達経路の最近の説明については、例えばAshkenaziら, Science,
281:1305-1308(1998); Nagata, Cell, 88:355-365(1997)参照。 データとして、カスパーゼ阻害剤の効果と培養した組換え細胞での抗アポトー
シス遺伝子の発現に関して矛盾する報告がある。例えば、Murrayら, Biotech. B
ioeng., 51:298-304(1996)にはＮＳＯ骨髄腫細胞のｂｃｌ-２の過剰発現は培養
細胞の衰退期特性に影響しなかったことを記載している。対照的に、他の研究者
は、ｂｃｌ-２が細胞培養条件下で異なる細胞株の死を防止するのに効果的であ
りうることを発見した[例えば、Itohら, Biotechnol. Bioeng., 48:118-122(199
5); Mastrangeloら, TIBTECH, 16:88-95(1998); Simpsonら, Biotechnol. Bioen
g., 54:1-16(1997); Singhら, Biotechnol. Bioeng., 52:166-175(1996)]。Gosw
amiら, Biotechnol. Bioeng., 62:632-640(1999)には、カスパーゼ阻害剤、ｚ-
ＶＡＤ-ｆｍｋがＣＨＯ細胞の無血清培養において生存を実質的に延長すること
ができないことを彼らは発見したと報告している。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、組換え細胞培養及びタンパク質作成における一又は複数のアポトー
シス阻害剤の使用が、細胞培地でのアポトーシスを顕著に減少させ、組換えタン
パク質作成技術を改良するという出願人の発見に基づく。本出願に開示される方
法は、例えば、細胞培養における細胞生存度の延長、又は細胞培地からの組換え
タンパク質の産生の改善又は向上に役立つ。本発明により提供される更なる改善
点を、以下の説明に記載する。 一実施態様では、本発明は、一又は複数のアポトーシス阻害剤を用いた組換え
タンパク質の作成の方法を提供する。本方法は、（ａ）アポトーシス阻害剤をコ
ードする遺伝子を含むベクターの提供、（ｂ）対象とするタンパク質をコードす
る遺伝子を含むベクターの提供、（ｃ）宿主細胞の提供、（ｄ）工程（ａ）及び
（ｂ）に言及するベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、（ｅ）細胞培
地の提供、（ｆ）対象とするタンパク質及びアポトーシス阻害剤を発現するのに
十分な条件下の細胞培地での、形質転換又は形質移入した宿主細胞の培養、及び
（ｇ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象とするタンパク質の回収又は精製
、の工程を含む。場合によっては、さらに本発明は、細胞培地に更なるアポトー
シス阻害剤を混合する工程を含む。本方法において、アポトーシス阻害剤及び対
象とするタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子は、単一のベクターに挿入さ
れうるか（例えば、単一のベクターに共に形質移入される）、また或いは、２つ
別々のベクターに挿入されうる。好ましくは、アポトーシス阻害剤及び対象とす
るタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子は、２つの別々のベクターに挿入さ
れ、それぞれのベクターは他のベクターとは異なるタイプの選択マーカーを有す
る。場合によっては、対象とするタンパク質の一過性発現及びアポトーシス阻害
剤の安定した又は一過性発現を提供する。場合によっては、アポトーシス阻害剤
をコードする遺伝子は、カスパーゼ９-ＤＮタンパク質又はバキュロウィルスｐ
３５をコードする遺伝子を含む。
シス阻害剤の使用が、細胞培地でのアポトーシスを顕著に減少させ、組換えタン
パク質作成技術を改良するという出願人の発見に基づく。本出願に開示される方
法は、例えば、細胞培養における細胞生存度の延長、又は細胞培地からの組換え
タンパク質の産生の改善又は向上に役立つ。本発明により提供される更なる改善
点を、以下の説明に記載する。 一実施態様では、本発明は、一又は複数のアポトーシス阻害剤を用いた組換え
タンパク質の作成の方法を提供する。本方法は、（ａ）アポトーシス阻害剤をコ
ードする遺伝子を含むベクターの提供、（ｂ）対象とするタンパク質をコードす
る遺伝子を含むベクターの提供、（ｃ）宿主細胞の提供、（ｄ）工程（ａ）及び
（ｂ）に言及するベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、（ｅ）細胞培
地の提供、（ｆ）対象とするタンパク質及びアポトーシス阻害剤を発現するのに
十分な条件下の細胞培地での、形質転換又は形質移入した宿主細胞の培養、及び
（ｇ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象とするタンパク質の回収又は精製
、の工程を含む。場合によっては、さらに本発明は、細胞培地に更なるアポトー
シス阻害剤を混合する工程を含む。本方法において、アポトーシス阻害剤及び対
象とするタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子は、単一のベクターに挿入さ
れうるか（例えば、単一のベクターに共に形質移入される）、また或いは、２つ
別々のベクターに挿入されうる。好ましくは、アポトーシス阻害剤及び対象とす
るタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子は、２つの別々のベクターに挿入さ
れ、それぞれのベクターは他のベクターとは異なるタイプの選択マーカーを有す
る。場合によっては、対象とするタンパク質の一過性発現及びアポトーシス阻害
剤の安定した又は一過性発現を提供する。場合によっては、アポトーシス阻害剤
をコードする遺伝子は、カスパーゼ９-ＤＮタンパク質又はバキュロウィルスｐ
３５をコードする遺伝子を含む。
【０００７】
他の実施態様では、本方法は、（ａ）対象とするタンパク質をコードする遺伝
子を含むベクターの提供、（ｂ）アポトーシス阻害剤をコードするＤＮＡを含む
宿主細胞の提供、（ｃ）工程（ａ）に言及するベクターでの宿主細胞の形質転換
又は形質移入、（ｄ）細胞培地の提供、（ｅ）対象とするタンパク質及びアポト
ーシス阻害剤を発現するのに十分な条件下の細胞培地での形質転換又は形質移入
した宿主細胞の培養、及び（ｆ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象とする
タンパク質の回収又は精製、の工程を含む。場合によっては、アポトーシス阻害
剤をコードする遺伝子は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれうる。場合に
よっては、本方法は、培地に更なるアポトーシス阻害分子を混合する更なる工程
を含む。場合によっては、本方法は、対象とするタンパク質の一過性発現及びア
ポトーシス阻害剤の安定した又は一活性発現を提供する。 他の実施態様では、本方法は（ａ）対象とするタンパク質をコードする遺伝子
を含むベクターの提供、（ｂ）宿主細胞の提供、（ｃ）工程（ａ）に言及するベ
クターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、（ｄ）細胞培地の提供、（ｅ）ア
ポトーシス阻害剤の提供、（ｆ）培地へのアポトーシス阻害剤の混合、（ｇ）対
象とするタンパク質を発現するのに十分な条件下の細胞培地での形質転換又は形
質移入した宿主細胞の培養、及び（ｈ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象
とするタンパク質の回収又は精製、の工程を含む。場合によっては、本方法は対
象とするタンパク質の一過性発現を提供する。
子を含むベクターの提供、（ｂ）アポトーシス阻害剤をコードするＤＮＡを含む
宿主細胞の提供、（ｃ）工程（ａ）に言及するベクターでの宿主細胞の形質転換
又は形質移入、（ｄ）細胞培地の提供、（ｅ）対象とするタンパク質及びアポト
ーシス阻害剤を発現するのに十分な条件下の細胞培地での形質転換又は形質移入
した宿主細胞の培養、及び（ｆ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象とする
タンパク質の回収又は精製、の工程を含む。場合によっては、アポトーシス阻害
剤をコードする遺伝子は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれうる。場合に
よっては、本方法は、培地に更なるアポトーシス阻害分子を混合する更なる工程
を含む。場合によっては、本方法は、対象とするタンパク質の一過性発現及びア
ポトーシス阻害剤の安定した又は一活性発現を提供する。 他の実施態様では、本方法は（ａ）対象とするタンパク質をコードする遺伝子
を含むベクターの提供、（ｂ）宿主細胞の提供、（ｃ）工程（ａ）に言及するベ
クターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、（ｄ）細胞培地の提供、（ｅ）ア
ポトーシス阻害剤の提供、（ｆ）培地へのアポトーシス阻害剤の混合、（ｇ）対
象とするタンパク質を発現するのに十分な条件下の細胞培地での形質転換又は形
質移入した宿主細胞の培養、及び（ｈ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象
とするタンパク質の回収又は精製、の工程を含む。場合によっては、本方法は対
象とするタンパク質の一過性発現を提供する。
【０００８】
他の実施態様において、本方法は（ａ）アポトーシス阻害剤をコードする遺伝
子を含むベクターの提供、（ｂ）対象とするタンパク質をコードする遺伝子を含
むベクターの提供、（ｃ）宿主細胞の提供、（ｄ）工程（ａ）及び（ｂ）に言及
するベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、（ｅ）細胞培地の提供、（
ｆ）対象とするタンパク質及びアポトーシス阻害剤を発現するのに十分な条件下
の細胞培地での形質転換又は形質移入した宿主細胞の培養、及び（ｇ）宿主細胞
及び／又は細胞培地の凍結及びそれに続く解凍、の工程を含む。場合によっては
、本方法は、さらに工程（ｅ）又は（ｆ）の培地に更なるアポトーシス阻害剤を
混合する工程を含む。本方法において、アポトーシス阻害剤及び対象とするタン
パク質をコードするそれぞれの遺伝子は、単一のベクターに挿入されても、或い
は２つの別々のベクターに挿入されてもよい。好ましくは、アポトーシス阻害剤
及び対象とするタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子は、２つの別々のベク
ターに挿入され、それぞれのベクターは他のベクターとは異なるタイプの選択マ
ーカーを有する。場合によっては、本方法は、対象とするタンパク質の一過性発
現及びアポトーシス阻害剤の安定した又は一過性の発現を提供する。
子を含むベクターの提供、（ｂ）対象とするタンパク質をコードする遺伝子を含
むベクターの提供、（ｃ）宿主細胞の提供、（ｄ）工程（ａ）及び（ｂ）に言及
するベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、（ｅ）細胞培地の提供、（
ｆ）対象とするタンパク質及びアポトーシス阻害剤を発現するのに十分な条件下
の細胞培地での形質転換又は形質移入した宿主細胞の培養、及び（ｇ）宿主細胞
及び／又は細胞培地の凍結及びそれに続く解凍、の工程を含む。場合によっては
、本方法は、さらに工程（ｅ）又は（ｆ）の培地に更なるアポトーシス阻害剤を
混合する工程を含む。本方法において、アポトーシス阻害剤及び対象とするタン
パク質をコードするそれぞれの遺伝子は、単一のベクターに挿入されても、或い
は２つの別々のベクターに挿入されてもよい。好ましくは、アポトーシス阻害剤
及び対象とするタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子は、２つの別々のベク
ターに挿入され、それぞれのベクターは他のベクターとは異なるタイプの選択マ
ーカーを有する。場合によっては、本方法は、対象とするタンパク質の一過性発
現及びアポトーシス阻害剤の安定した又は一過性の発現を提供する。
【０００９】
他の実施態様では、本方法は、（ａ）対象とするタンパク質をコードする遺伝
子を含むベクターの提供、（ｂ）アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含む
ベクターの提供、（ｃ）工程（ａ）に言及するベクターでの宿主細胞の形質転換
又は形質移入、（ｄ）細胞培地の提供、（ｅ）対象とするタンパク質及びアポト
ーシス阻害剤を発現するのに十分な条件下の培地での形質転換又は形質移入した
宿主細胞の培養、及び（ｆ）宿主細胞及び／又は細胞培地の凍結、及びそれに続
く解凍、の工程を含む。場合によっては、アポトーシス阻害剤をコードする遺伝
子は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれうる。場合によっては、本方法は
、さらに培地に更なるアポトーシス阻害分子を混合する工程を含む。場合によっ
ては、本方法は、対象とするタンパク質の一過性発現及びアポトーシス阻害剤の
安定した又は一過性の発現を提供する。 他の実施態様において、本方法は、（ａ）対象とするタンパク質をコードする
遺伝子を含むベクターの提供、（ｂ）宿主細胞の提供、（ｃ）工程（ａ）に言及
するベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、（ｄ）細胞培地の提供、（
ｅ）アポトーシス阻害剤の提供、（ｆ）培地へのアポトーシス阻害剤の混合、（
ｇ）対象とするタンパク質を発現するのに十分な条件下の細胞培地での宿主細胞
の培養、及び（ｈ）宿主細胞及び／又は細胞培地の凍結及びそれに続く解凍、の
工程を含む。場合によっては、本方法は対象とするタンパク質の一過性発現を提
供する。
子を含むベクターの提供、（ｂ）アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含む
ベクターの提供、（ｃ）工程（ａ）に言及するベクターでの宿主細胞の形質転換
又は形質移入、（ｄ）細胞培地の提供、（ｅ）対象とするタンパク質及びアポト
ーシス阻害剤を発現するのに十分な条件下の培地での形質転換又は形質移入した
宿主細胞の培養、及び（ｆ）宿主細胞及び／又は細胞培地の凍結、及びそれに続
く解凍、の工程を含む。場合によっては、アポトーシス阻害剤をコードする遺伝
子は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれうる。場合によっては、本方法は
、さらに培地に更なるアポトーシス阻害分子を混合する工程を含む。場合によっ
ては、本方法は、対象とするタンパク質の一過性発現及びアポトーシス阻害剤の
安定した又は一過性の発現を提供する。 他の実施態様において、本方法は、（ａ）対象とするタンパク質をコードする
遺伝子を含むベクターの提供、（ｂ）宿主細胞の提供、（ｃ）工程（ａ）に言及
するベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、（ｄ）細胞培地の提供、（
ｅ）アポトーシス阻害剤の提供、（ｆ）培地へのアポトーシス阻害剤の混合、（
ｇ）対象とするタンパク質を発現するのに十分な条件下の細胞培地での宿主細胞
の培養、及び（ｈ）宿主細胞及び／又は細胞培地の凍結及びそれに続く解凍、の
工程を含む。場合によっては、本方法は対象とするタンパク質の一過性発現を提
供する。
【００１０】
また更なる実施態様において、本発明は、一又は複数のアポトーシス阻害剤の
使用及びトランスフェクション試薬の増加した濃度がトランスフェクション効率
の増大に用いることができる、改善されたトランスフェクション方法を提供する
。 また更なる実施態様において、本発明は、ここに記載される方法の何れかに従
って生産された、対象タンパク質を提供する。対象とするタンパク質は、哺乳動
物のタンパク質又は非哺乳動物のタンパク質を含んでいてもよく、場合によって
はレセプター又はリガンドを含んでいてもよい。本発明の一実施態様では、対象
とするタンパク質は、それ自体がインビトロ又はインビボで哺乳動物又は非哺乳
動物のアポトーシスを誘発する能力のあるタンパク質、例えばＡｐｏ-２リガン
ド／ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンド、又はＴＮＦ-αを含みうる。
使用及びトランスフェクション試薬の増加した濃度がトランスフェクション効率
の増大に用いることができる、改善されたトランスフェクション方法を提供する
。 また更なる実施態様において、本発明は、ここに記載される方法の何れかに従
って生産された、対象タンパク質を提供する。対象とするタンパク質は、哺乳動
物のタンパク質又は非哺乳動物のタンパク質を含んでいてもよく、場合によって
はレセプター又はリガンドを含んでいてもよい。本発明の一実施態様では、対象
とするタンパク質は、それ自体がインビトロ又はインビボで哺乳動物又は非哺乳
動物のアポトーシスを誘発する能力のあるタンパク質、例えばＡｐｏ-２リガン
ド／ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンド、又はＴＮＦ-αを含みうる。
【００１１】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
「アポトーシス阻害剤」という用語は、ここで、培養細胞のアポトーシスの減
少又は抑制を与える、又はアポトーシス促進剤に対する培養細胞の抵抗性を与え
るインビトロ細胞培地に発現又は存在する分子又は物質を指して使用される。ア
ポトーシス阻害剤はタンパク質又はタンパク質様分子、又は有機又は無機の分子
を含みうる。アポトーシス阻害剤は、細胞内に、細胞外に、又は培養細胞の細胞
表面（膜）に存在（及び／又は機能）しうる。本発明により考慮される好ましい
アポトーシス阻害剤は、これに限定されないが、カスパーゼ９ドミナントネガテ
ィブ（カスパーゼ９-ＤＮ）変異、ｂｃｌ-２、バキュロウィルスｐ３５を含む。
カスパーゼ９Ｓ（Seol, D. W. ら, J. Biol. Chem., 274, 2072-2076(1999)）、
ｃｒｍＡ、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ、ｚ-ＤＥＶＤ-ｆｍｋ、Ｂ-Ｄ-ｆｍｋ及びｚ-ＹＶ
ＡＤ-ｆｍｋ、及びその変異体を含む。好ましくは、アポトーシス阻害剤は、細
胞の細胞内細胞死経路の下流に位置する一又は複数のカスパーゼ、例えばカスパ
ーゼ３に作用するものである。場合によっては、アポトーシス阻害剤は、有効量
で、このようなアポトーシス阻害剤を含まないコントロール細胞培養と比較して
少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さら
により好ましくは９５％まで細胞培地のアポトーシスを減少又は縮小しうる。こ
のような細胞培養のアポトーシス又はアポトーシス活性は、ここに記載されるよ
うなアッセイを用いて測定し、決定することができる。場合によっては、アポト
ーシス阻害剤は、有効量で、このようなアポトーシス阻害剤を含まないコントロ
ール細胞培養と比較して、少なくとも１倍、、好ましくは少なくとも２倍まで対
象とする組換えタンパク質の生産性を促進又は増加させうる。場合によっては、
アポトーシス阻害剤は、有効量で、このようなアポトーシス阻害剤を含まないコ
ントロール細胞培養に比較して、好ましくは１倍、より好ましくは２倍まで一過
性トランスフェクションにおけるトランスフェクション効率を促進又は増大しう
る。
少又は抑制を与える、又はアポトーシス促進剤に対する培養細胞の抵抗性を与え
るインビトロ細胞培地に発現又は存在する分子又は物質を指して使用される。ア
ポトーシス阻害剤はタンパク質又はタンパク質様分子、又は有機又は無機の分子
を含みうる。アポトーシス阻害剤は、細胞内に、細胞外に、又は培養細胞の細胞
表面（膜）に存在（及び／又は機能）しうる。本発明により考慮される好ましい
アポトーシス阻害剤は、これに限定されないが、カスパーゼ９ドミナントネガテ
ィブ（カスパーゼ９-ＤＮ）変異、ｂｃｌ-２、バキュロウィルスｐ３５を含む。
カスパーゼ９Ｓ（Seol, D. W. ら, J. Biol. Chem., 274, 2072-2076(1999)）、
ｃｒｍＡ、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ、ｚ-ＤＥＶＤ-ｆｍｋ、Ｂ-Ｄ-ｆｍｋ及びｚ-ＹＶ
ＡＤ-ｆｍｋ、及びその変異体を含む。好ましくは、アポトーシス阻害剤は、細
胞の細胞内細胞死経路の下流に位置する一又は複数のカスパーゼ、例えばカスパ
ーゼ３に作用するものである。場合によっては、アポトーシス阻害剤は、有効量
で、このようなアポトーシス阻害剤を含まないコントロール細胞培養と比較して
少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さら
により好ましくは９５％まで細胞培地のアポトーシスを減少又は縮小しうる。こ
のような細胞培養のアポトーシス又はアポトーシス活性は、ここに記載されるよ
うなアッセイを用いて測定し、決定することができる。場合によっては、アポト
ーシス阻害剤は、有効量で、このようなアポトーシス阻害剤を含まないコントロ
ール細胞培養と比較して、少なくとも１倍、、好ましくは少なくとも２倍まで対
象とする組換えタンパク質の生産性を促進又は増加させうる。場合によっては、
アポトーシス阻害剤は、有効量で、このようなアポトーシス阻害剤を含まないコ
ントロール細胞培養に比較して、好ましくは１倍、より好ましくは２倍まで一過
性トランスフェクションにおけるトランスフェクション効率を促進又は増大しう
る。
【００１２】
「対象とするタンパク質」という用語は、調査、診断又は治療の目的に使用さ
れうるあらゆるタンパク質を意味する。対象とするタンパク質は、哺乳動物タン
パク質又は非哺乳動物のタンパク質を含んでいてもよく、場合によってはレセプ
ター又はリガンドを含んでいてもよい。対象とするタンパク質の例は、これに限
らないが、例えばレニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホ
ルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポ
タンパク質；α-１-抗トリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロ
インシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴ
ン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォンウィルブランド因子等の
凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活
性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ
-ＰＡ）等のプラスミノーゲンアクチベーター；ボンベシン；造血成長因子；腫
瘍壊死因子α及びβ、ＣＤ４０リガンドのような、ＴＮＦ及びＴＮＦレセプター
（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバー；Ａｐｏ-２リガンド／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４
、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３、ＯＰＧ、Ｆａｓリガンド；エンケフ
ァリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expres
sed and secreted(正常なＴ細胞発現及び分泌での調節)）；ヒトマクロファージ
炎症性タンパク質（ＭＩＰ-１-α）；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；
ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウ
スゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼ等の菌タンパク質；ＤＮａｓ
ｅ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４のような細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原(ＣＴＬＡ)；イ
ンヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子
のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤ
ＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-
５、又はＮＴ-６）、又はＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板誘導成長因子（Ｐ
ＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の繊維芽成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）
；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、又は
ＴＧＦ-β５を含む、ＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)
；インシュリン様成長因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ）；ｄｅｓ
(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質；
ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０等のＣＤタンパク質；エリスロ
ポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロ
ン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例
えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；トロンボポエチン（ＴＰＯ
）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ-１からＩＬ-１０；スーパーオキ
シドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイ
ルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部、ｇｐ１２０等；輸送タンパク
質；ホーミングレセプター；アドレシン(addressin)；調節タンパク質；インテ
グリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、Ｖ
ＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４
レセプター；及び上に列挙したポリペプチドの何れかの変異体及び／又は断片；
並びにＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及
びＣＤ３４のような様々なタンパク質に対する抗体；ＥｒｂＢレセプターファミ
リーのメンバー、例えばＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レ
セプター；細胞接着分子、例えばＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０.９５、ＶＬＡ
-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びそのα又はβサブユニットを何れか含むαｖ／
β３インテグリン(例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体)；
成長因子、例えばＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプタ
ー；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ；
Ａｐｏ-２（ＤＲ５）、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３等のＡｐｏ-２Ｌ
レセプター；及び上記同定した抗体の変異体及び／又は断片等々の分子が含まれ
る。本発明の一実施態様では、対象とするタンパク質は、それ自身がインビトロ
又はインビボで哺乳動物又は非哺乳動物細胞のアポトーシスを誘発することので
きるタンパク質、例えばＡｐｏ-２リガンド／ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンド、又
はＴＮＦ-αを含みうる。
れうるあらゆるタンパク質を意味する。対象とするタンパク質は、哺乳動物タン
パク質又は非哺乳動物のタンパク質を含んでいてもよく、場合によってはレセプ
ター又はリガンドを含んでいてもよい。対象とするタンパク質の例は、これに限
らないが、例えばレニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホ
ルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポ
タンパク質；α-１-抗トリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロ
インシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴ
ン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォンウィルブランド因子等の
凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活
性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ
-ＰＡ）等のプラスミノーゲンアクチベーター；ボンベシン；造血成長因子；腫
瘍壊死因子α及びβ、ＣＤ４０リガンドのような、ＴＮＦ及びＴＮＦレセプター
（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバー；Ａｐｏ-２リガンド／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４
、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３、ＯＰＧ、Ｆａｓリガンド；エンケフ
ァリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expres
sed and secreted(正常なＴ細胞発現及び分泌での調節)）；ヒトマクロファージ
炎症性タンパク質（ＭＩＰ-１-α）；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；
ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウ
スゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼ等の菌タンパク質；ＤＮａｓ
ｅ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４のような細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原(ＣＴＬＡ)；イ
ンヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子
のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤ
ＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-
５、又はＮＴ-６）、又はＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板誘導成長因子（Ｐ
ＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の繊維芽成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）
；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、又は
ＴＧＦ-β５を含む、ＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)
；インシュリン様成長因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ）；ｄｅｓ
(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質；
ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０等のＣＤタンパク質；エリスロ
ポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロ
ン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例
えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；トロンボポエチン（ＴＰＯ
）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ-１からＩＬ-１０；スーパーオキ
シドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイ
ルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部、ｇｐ１２０等；輸送タンパク
質；ホーミングレセプター；アドレシン(addressin)；調節タンパク質；インテ
グリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、Ｖ
ＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４
レセプター；及び上に列挙したポリペプチドの何れかの変異体及び／又は断片；
並びにＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及
びＣＤ３４のような様々なタンパク質に対する抗体；ＥｒｂＢレセプターファミ
リーのメンバー、例えばＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レ
セプター；細胞接着分子、例えばＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０.９５、ＶＬＡ
-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びそのα又はβサブユニットを何れか含むαｖ／
β３インテグリン(例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体)；
成長因子、例えばＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプタ
ー；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ；
Ａｐｏ-２（ＤＲ５）、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３等のＡｐｏ-２Ｌ
レセプター；及び上記同定した抗体の変異体及び／又は断片等々の分子が含まれ
る。本発明の一実施態様では、対象とするタンパク質は、それ自身がインビトロ
又はインビボで哺乳動物又は非哺乳動物細胞のアポトーシスを誘発することので
きるタンパク質、例えばＡｐｏ-２リガンド／ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンド、又
はＴＮＦ-αを含みうる。
【００１３】
「単離された」とは、ここで開示された種々の対象とするタンパク質を記述す
るために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は
回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、対象とするタ
ンパク質の診断又は治療的な使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホル
モン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施
態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用す
ることにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得る
のに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を
用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性のために精
製されうる。対象とするタンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在し
ないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイトのタンパク質
が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの
精製工程により調製される。 「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコ
ントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレータ配列、及び
リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
るために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は
回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、対象とするタ
ンパク質の診断又は治療的な使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホル
モン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施
態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用す
ることにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得る
のに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を
用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性のために精
製されうる。対象とするタンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在し
ないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイトのタンパク質
が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの
精製工程により調製される。 「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコ
ントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレータ配列、及び
リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００１４】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」てい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに
作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響
を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位
は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に
結合している。一般的に、「作用可能に結合する」とは、結合されたＤＮＡ配列
が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。し
かし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部
位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、
通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリ
ンカーが使用される。 ここで使用されるように、「細胞」、「株化細胞」及び「細胞培養物」なる表
現は相互に交換可能に用いられ、これら全ての表記は後代を含む。従って、「形
質転換体」及び「形質転換細胞」は、初代対象細胞と何度転換したかに関わらず
それから由来した培養を含む。
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに
作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響
を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位
は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に
結合している。一般的に、「作用可能に結合する」とは、結合されたＤＮＡ配列
が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。し
かし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部
位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、
通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリ
ンカーが使用される。 ここで使用されるように、「細胞」、「株化細胞」及び「細胞培養物」なる表
現は相互に交換可能に用いられ、これら全ての表記は後代を含む。従って、「形
質転換体」及び「形質転換細胞」は、初代対象細胞と何度転換したかに関わらず
それから由来した培養を含む。
【００１５】
細胞培養の「増殖期」は、細胞が一般に急速に分裂する指数関数的な細胞増殖
期（対数期）を意味する。この期間、細胞は一定期間、通常１−４日間、細胞増
殖が最大となる条件下で培養される。宿主細胞の増殖サイクルの測定は、大した
経験が無くても、想定される特定の宿主細胞について決定することができる。「
細胞増殖が最大となる期間及びこのような条件」等は、特定の細胞株が細胞増殖
及び分裂に最適であると決定されたこれらの培養条件を意味する。増殖期の間、
細胞を、必要な添加物を含む栄養培地で、一般に約３０−４０℃、好ましくは約
３７℃、湿潤状態、調節された雰囲気、例えば特定の細胞株にとって至適増殖が
達成されるような状態で培養する。細胞は、約１から４日、通常は２から３日の
期間、増殖期が維持される。 細胞培養の「遷移期」は、生産期の培養状態に関わる期間を意味する。遷移期
の間、環境因子、例えばｐＨ、イオン濃度、及び温度は増殖状態から生産状態に
遷移しうる。 細胞培養の「生産期」は、細胞増殖が一定になっている期間を意味する。生産
期の間、対数細胞増殖が終わり、タンパク質産生が始まる。この期間、一般に連
続したタンパク質産生を維持し、さらに所望のタンパク質産生を達成するために
培地が補充される。
期（対数期）を意味する。この期間、細胞は一定期間、通常１−４日間、細胞増
殖が最大となる条件下で培養される。宿主細胞の増殖サイクルの測定は、大した
経験が無くても、想定される特定の宿主細胞について決定することができる。「
細胞増殖が最大となる期間及びこのような条件」等は、特定の細胞株が細胞増殖
及び分裂に最適であると決定されたこれらの培養条件を意味する。増殖期の間、
細胞を、必要な添加物を含む栄養培地で、一般に約３０−４０℃、好ましくは約
３７℃、湿潤状態、調節された雰囲気、例えば特定の細胞株にとって至適増殖が
達成されるような状態で培養する。細胞は、約１から４日、通常は２から３日の
期間、増殖期が維持される。 細胞培養の「遷移期」は、生産期の培養状態に関わる期間を意味する。遷移期
の間、環境因子、例えばｐＨ、イオン濃度、及び温度は増殖状態から生産状態に
遷移しうる。 細胞培養の「生産期」は、細胞増殖が一定になっている期間を意味する。生産
期の間、対数細胞増殖が終わり、タンパク質産生が始まる。この期間、一般に連
続したタンパク質産生を維持し、さらに所望のタンパク質産生を達成するために
培地が補充される。
【００１６】
ここで使用される「発現」又は「発現する」という用語は、宿主細胞内で生じ
る転写又は翻訳を意味する。宿主細胞での産生遺伝子の発現レベルは、細胞に存
在している対応するｍＲＮＡの量か、又は細胞に産生される産生遺伝子によりコ
ードされるタンパク質の量の何れかに基づいて決定されうる。例えば、産生遺伝
子から転写されたｍＲＮＡはノーザンハイブリダイゼーションにより定量するこ
とができる。Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-
7.57(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)参照。産生遺伝子によりコー
ドされるタンパク質は、タンパク質の生物活性をアッセイすることにより、又は
そのような活性と異なるもののアッセイ、例えばタンパク質に反応する能力のあ
る抗体を用いて、ウェスタンブロッティング又はラジオイムノアッセイを使用す
ることにより、どちらかで定量することができる。例えばSambrook等, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88(Cold Spring Harbor Labora
tory Press, 1989)参照。 「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典
型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡ
の分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴
う、哺乳動物又は非哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形
態を指す。この活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析、アネキシ
ンＶ結合、又はＤＮＡ電気泳動法等、従来から知られ、さらにここに記載されて
いる方法により決定し測定することができる。
る転写又は翻訳を意味する。宿主細胞での産生遺伝子の発現レベルは、細胞に存
在している対応するｍＲＮＡの量か、又は細胞に産生される産生遺伝子によりコ
ードされるタンパク質の量の何れかに基づいて決定されうる。例えば、産生遺伝
子から転写されたｍＲＮＡはノーザンハイブリダイゼーションにより定量するこ
とができる。Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-
7.57(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)参照。産生遺伝子によりコー
ドされるタンパク質は、タンパク質の生物活性をアッセイすることにより、又は
そのような活性と異なるもののアッセイ、例えばタンパク質に反応する能力のあ
る抗体を用いて、ウェスタンブロッティング又はラジオイムノアッセイを使用す
ることにより、どちらかで定量することができる。例えばSambrook等, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88(Cold Spring Harbor Labora
tory Press, 1989)参照。 「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典
型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡ
の分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴
う、哺乳動物又は非哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形
態を指す。この活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析、アネキシ
ンＶ結合、又はＤＮＡ電気泳動法等、従来から知られ、さらにここに記載されて
いる方法により決定し測定することができる。
【００１７】
ＩＩ．本発明の方法
細胞培養で増殖したの細胞は、培養の開始の日のうちに生存度が下がり始める
。細胞生存度の低下は、バッチスケール培養又はバイオリアクターで比較的多く
細胞を培養する場合に、特に問題となりうる。例えば回分式（バッチ）培養で増
殖されたＣＨＯ細胞は、４日という早さで細胞生存度が低下し始め、その後培養
が終了するまで生存度の急降下が持続しうる。このような培養細胞が死ぬ機構は
、壊死又はアポトーシスのどちらかによりうる。ＴＵＮＥＬ及びアネキシン／Ｐ
Ｉ結合アッセイを用いて、出願人は、回分式培養で増殖されたＣＨＯ細胞のうち
約８０％が壊死よりもむしろアポトーシスにより死にうることを開示した。ここ
に記載されるように、出願人は、驚くべきことにこのようなアポトーシスを著し
く減少させる方法を発見した。
。細胞生存度の低下は、バッチスケール培養又はバイオリアクターで比較的多く
細胞を培養する場合に、特に問題となりうる。例えば回分式（バッチ）培養で増
殖されたＣＨＯ細胞は、４日という早さで細胞生存度が低下し始め、その後培養
が終了するまで生存度の急降下が持続しうる。このような培養細胞が死ぬ機構は
、壊死又はアポトーシスのどちらかによりうる。ＴＵＮＥＬ及びアネキシン／Ｐ
Ｉ結合アッセイを用いて、出願人は、回分式培養で増殖されたＣＨＯ細胞のうち
約８０％が壊死よりもむしろアポトーシスにより死にうることを開示した。ここ
に記載されるように、出願人は、驚くべきことにこのようなアポトーシスを著し
く減少させる方法を発見した。
【００１８】
本出願人により開示される方法は、組換えタンパク質生産のための様々な用途
及び改善がある。第１に、培養物の宿主細胞生存度（及び発酵の間）を延ばすこ
とにより、当該分野の技術者は、対象とするタンパク質の生産及び生産性を増大
することができる。これは細胞培養実施の効率を改善し、その結果費用を節減す
ることができる。さらに出願人は、本出願の方法の一又は複数のアポトーシス阻
害剤の使用が、細胞培養物に含まれるブチラート又はＴＳＡのような薬剤の潜在
的な悪影響から守りうることを発見した。また、ここでの方法は、発現及び回収
した対象とするタンパク質の質を向上させることができる。発現及び回収された
対象とするタンパク質の質は、当該分野で既知の技術、例えばＳＤＳ-ＰＡＧＥ
等を用いて評価するすることができる。組換え細胞培養での細胞死の発生は、死
んだ細胞からの様々な活性タンパク質、例えばプロテアーゼ[Lao. M.,ら, Cytot
echnology, 22:43-52(1996); Teige, M.,ら, J. Biothecnol., 34:101-105(0994
)]、シアリダーゼ又はβ-ガラクトシダーゼのようなグリコシダーゼ[Gramer M.
J.及びGoochee C. F., Biotecnol. Prog., 9:366-373(1999)]、又はプロリンイ
ソメラーゼ[Schmid, Current Biology, 5:933-944(1995)]の放出を生じる。これ
ら及び他のこのようなタンパク質は、時に例えば所望しない分裂、糖修飾（糖タ
ンパク修飾）[Wittwer A.,及びHoward, S.C., Biochem., 29:4175-4180(1990);
Hart, Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023(1992); Goochee,ら, Bio/Technolog
y, 9:1347-1355(1991)]、又はタンパク質構造修飾（例えば折り畳み又は凝集）
により、発現した所望の組換えタンパク質の産物の質又は機能を低下させる能力
がある。細胞培養でのアポトーシスの減少又は阻害により、本方法は、培地のこ
のような悪影響を及ぼすプロテアーゼの数又は存在を減少させ、発現した対象と
するタンパク質をタンパク質分解から保護することができる。
及び改善がある。第１に、培養物の宿主細胞生存度（及び発酵の間）を延ばすこ
とにより、当該分野の技術者は、対象とするタンパク質の生産及び生産性を増大
することができる。これは細胞培養実施の効率を改善し、その結果費用を節減す
ることができる。さらに出願人は、本出願の方法の一又は複数のアポトーシス阻
害剤の使用が、細胞培養物に含まれるブチラート又はＴＳＡのような薬剤の潜在
的な悪影響から守りうることを発見した。また、ここでの方法は、発現及び回収
した対象とするタンパク質の質を向上させることができる。発現及び回収された
対象とするタンパク質の質は、当該分野で既知の技術、例えばＳＤＳ-ＰＡＧＥ
等を用いて評価するすることができる。組換え細胞培養での細胞死の発生は、死
んだ細胞からの様々な活性タンパク質、例えばプロテアーゼ[Lao. M.,ら, Cytot
echnology, 22:43-52(1996); Teige, M.,ら, J. Biothecnol., 34:101-105(0994
)]、シアリダーゼ又はβ-ガラクトシダーゼのようなグリコシダーゼ[Gramer M.
J.及びGoochee C. F., Biotecnol. Prog., 9:366-373(1999)]、又はプロリンイ
ソメラーゼ[Schmid, Current Biology, 5:933-944(1995)]の放出を生じる。これ
ら及び他のこのようなタンパク質は、時に例えば所望しない分裂、糖修飾（糖タ
ンパク修飾）[Wittwer A.,及びHoward, S.C., Biochem., 29:4175-4180(1990);
Hart, Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023(1992); Goochee,ら, Bio/Technolog
y, 9:1347-1355(1991)]、又はタンパク質構造修飾（例えば折り畳み又は凝集）
により、発現した所望の組換えタンパク質の産物の質又は機能を低下させる能力
がある。細胞培養でのアポトーシスの減少又は阻害により、本方法は、培地のこ
のような悪影響を及ぼすプロテアーゼの数又は存在を減少させ、発現した対象と
するタンパク質をタンパク質分解から保護することができる。
【００１９】
ここでの方法は、さらにトランスフェクションの間の細胞の生存度及びトラン
スフェクション効率を向上させるために用いることができる。様々なトランスフ
ェクション技術で使用される試薬、例えばリポフェクタミン又はＤＭＲＩＥ-Ｃ
（Ｇｉｂｃｏ）は、高濃度で使用される場合に、細胞に比較的毒性がありうる。
しかしながら、高濃度でのトランスフェクション試薬の使用は、高いトランスフ
ェクション効率を達成するために特に役立ちうる。アポトーシス阻害剤の発現及
び／又は細胞培地への直接のアポトーシス阻害剤の添加は、このような高濃度の
トランスフェクション試薬が選択される場合であっても細胞死を減少又は抑制す
るのに用いることができる。この方法におけるアポトーシス阻害剤の使用は、対
象とする組換えタンパク質の高い生産性と高いトランスフェクション効率を達成
することができる。 開示される方法は、さらにそれ自体がアポトーシスを促進するタンパク質であ
るような対象とするタンパク質の発現にも使用することができる。Ａｐｏ-２リ
ガンド／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓリガンドの様なこのようなタンパク質は、細胞で
発現したとき、アポトーシスを誘発することができる。本方法に従うと、アポト
ーシス阻害剤の存在は、このようなアポトーシス活性を阻害し、対象とするタン
パク質の発現を改善させうる。
スフェクション効率を向上させるために用いることができる。様々なトランスフ
ェクション技術で使用される試薬、例えばリポフェクタミン又はＤＭＲＩＥ-Ｃ
（Ｇｉｂｃｏ）は、高濃度で使用される場合に、細胞に比較的毒性がありうる。
しかしながら、高濃度でのトランスフェクション試薬の使用は、高いトランスフ
ェクション効率を達成するために特に役立ちうる。アポトーシス阻害剤の発現及
び／又は細胞培地への直接のアポトーシス阻害剤の添加は、このような高濃度の
トランスフェクション試薬が選択される場合であっても細胞死を減少又は抑制す
るのに用いることができる。この方法におけるアポトーシス阻害剤の使用は、対
象とする組換えタンパク質の高い生産性と高いトランスフェクション効率を達成
することができる。 開示される方法は、さらにそれ自体がアポトーシスを促進するタンパク質であ
るような対象とするタンパク質の発現にも使用することができる。Ａｐｏ-２リ
ガンド／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓリガンドの様なこのようなタンパク質は、細胞で
発現したとき、アポトーシスを誘発することができる。本方法に従うと、アポト
ーシス阻害剤の存在は、このようなアポトーシス活性を阻害し、対象とするタン
パク質の発現を改善させうる。
【００２０】
さらに、本方法は、凍結／保存／解凍の段階を経た細胞の生存度を増加するの
に使用することができる。これらの段配の間、一般に細胞は生存度が低下する。
細胞で発現した（又は細胞培地に添加した）アポトーシス阻害剤の存在は、細胞
生存度の増大させ、及び細胞の等分物又はバイアル間の細胞生存度の違いを減少
又は排除することを助けとなる。 本発明に従う方法は、以下にさらに詳細に記載される。 対象とするタンパク質をコードするＤＮＡは、様々な供給源、例えばそのｍＲ
ＮＡを有し、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられる組織からのあらゆ
るｃＤＮＡライブラリから得られうる。対象とするタンパク質をコードする遺伝
子はまた、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成によって得てもよ
い。このようなｃＤＮＡ又はゲノムライブラリの選択プローブを用いたスクリー
ニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New Y
ork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されるような標準的
な方法を用いて実施してもよい。対象とするタンパク質をコードする遺伝子を単
離するための代わりの方法は、ＰＣＲ法[Sambrookら,上掲; Dieffenbachら, PCR
Primer : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)
]の使用である。
に使用することができる。これらの段配の間、一般に細胞は生存度が低下する。
細胞で発現した（又は細胞培地に添加した）アポトーシス阻害剤の存在は、細胞
生存度の増大させ、及び細胞の等分物又はバイアル間の細胞生存度の違いを減少
又は排除することを助けとなる。 本発明に従う方法は、以下にさらに詳細に記載される。 対象とするタンパク質をコードするＤＮＡは、様々な供給源、例えばそのｍＲ
ＮＡを有し、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられる組織からのあらゆ
るｃＤＮＡライブラリから得られうる。対象とするタンパク質をコードする遺伝
子はまた、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成によって得てもよ
い。このようなｃＤＮＡ又はゲノムライブラリの選択プローブを用いたスクリー
ニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New Y
ork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されるような標準的
な方法を用いて実施してもよい。対象とするタンパク質をコードする遺伝子を単
離するための代わりの方法は、ＰＣＲ法[Sambrookら,上掲; Dieffenbachら, PCR
Primer : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)
]の使用である。
【００２１】
様々な対象とするタンパク質は、特に上に示されており、それらの各遺伝子配
列は一般的に知られ、公的に入手可能である。 また、様々なアポトーシス阻害剤をコードする遺伝子が、文献[例えばClem R.
J. ら, Science, 254, 1388-1390(1991); Duan, H.ら, J. Biol. Chemistry, 2
71, 16720-16724(1996); Pan, G.ら, J. Biol. Chemistry, 273, 5841-5845(199
8); Vaux, D.L.ら, Science, 258, 1955-1957(1998); Tsujimotoら, Proc. Natl
. Acad. Sci., 83:5214-5218(1986)参照]に記載されている。本発明の方法は、
単一のアポトーシス阻害剤コード化遺伝子の使用、並びに二又はそれ以上のアポ
トーシス阻害剤コード化遺伝子の組み合わせの使用が考えられる。潜在的に、宿
主細胞での二又はそれ以上の型のアポトーシス阻害剤の発現は、細胞培養でアポ
トーシスを制御するのに便利である。当該分野の技術者は、宿主細胞により発現
されるアポトーシス阻害剤の質又は量を、例えばアポトーシス阻害剤とされる抗
体を用いたウェスタンブロット分析によりモニターすることができる。アポトー
シス阻害剤の質及び量、並びにその発現のタイミングは、例えば誘導プロモータ
ーでベクターを選択することにより調節又はモニターすることができる。
列は一般的に知られ、公的に入手可能である。 また、様々なアポトーシス阻害剤をコードする遺伝子が、文献[例えばClem R.
J. ら, Science, 254, 1388-1390(1991); Duan, H.ら, J. Biol. Chemistry, 2
71, 16720-16724(1996); Pan, G.ら, J. Biol. Chemistry, 273, 5841-5845(199
8); Vaux, D.L.ら, Science, 258, 1955-1957(1998); Tsujimotoら, Proc. Natl
. Acad. Sci., 83:5214-5218(1986)参照]に記載されている。本発明の方法は、
単一のアポトーシス阻害剤コード化遺伝子の使用、並びに二又はそれ以上のアポ
トーシス阻害剤コード化遺伝子の組み合わせの使用が考えられる。潜在的に、宿
主細胞での二又はそれ以上の型のアポトーシス阻害剤の発現は、細胞培養でアポ
トーシスを制御するのに便利である。当該分野の技術者は、宿主細胞により発現
されるアポトーシス阻害剤の質又は量を、例えばアポトーシス阻害剤とされる抗
体を用いたウェスタンブロット分析によりモニターすることができる。アポトー
シス阻害剤の質及び量、並びにその発現のタイミングは、例えば誘導プロモータ
ーでベクターを選択することにより調節又はモニターすることができる。
【００２２】
特許請求した方法での使用のためのアポトーシス阻害剤を選択する場合、当該
分野の技術者は、様々なアポトーシス阻害分子が細胞死を導く伝達経路の異なる
細胞内成分に作用することを理解しているはずである。細胞死に関わる経路は、
哺乳動物インターロイキン-１β変換酵素（カスパーゼ１）及びＣｅｄ-３、線虫
（C. elegans）の遺伝子の生産物に関連する、カスパーゼと呼ばれるシステイン
プロテアーゼのファミリーを含む。このようなカスパーゼ分子は少なくとも２つ
の異なるレベルで作用できると考えられている。開始カスパーゼは、細胞が圧さ
れ、損傷を受け、アポトーシスにより細胞死を惹起するシグナルのいくつかの形
態を受けたことを示す、刺激に対して活性化する典型的な「上流」分子である。
このような上流カスパーゼの例は、カスパーゼ８である。次いで開始カスパーゼ
は、順に、分裂し、カスパーゼ３のような「下流」カスパーゼの他のファミリー
を活性化することができる。アポトーシス刺激の性質並びに細胞のタイプにより
、伝達経路の一部のみが細胞死の伝達機構及び遂行に関与しうる。例えば、ある
アポトーシス阻害剤、例えばＣｒｍＡは、カスパーゼ、例えば下流に位置するカ
スパーゼ８等に作用すると考えられ、通常リガンドに結合する死レセプターによ
り直接活性化される。他のアポトーシス阻害剤は、細胞内伝達経路の下流に位置
する他のカスパーゼに作用すると考えられる。従って、選択された細胞の細胞死
機構に効果的に関わる（例えば、活性化するようにシグナル伝達に関わる）これ
らの分子の阻害剤は、ここに記載されるようなアポトーシス阻害剤として効果が
ありうると考えられる。しかしながら、出願人は、当該分野の技術者はこのよう
な伝達経路において細胞が細胞死に「関連づけされる」ポイントがあり、いった
ん伝達経路が細胞が細胞死に関連づけされるポイントにシグナルを伝達すると、
ここに記載されるように、「関連づけされた」細胞のアポトーシスを抑制又は妨
害に影響しないことを理解しているだろうと記している。
分野の技術者は、様々なアポトーシス阻害分子が細胞死を導く伝達経路の異なる
細胞内成分に作用することを理解しているはずである。細胞死に関わる経路は、
哺乳動物インターロイキン-１β変換酵素（カスパーゼ１）及びＣｅｄ-３、線虫
（C. elegans）の遺伝子の生産物に関連する、カスパーゼと呼ばれるシステイン
プロテアーゼのファミリーを含む。このようなカスパーゼ分子は少なくとも２つ
の異なるレベルで作用できると考えられている。開始カスパーゼは、細胞が圧さ
れ、損傷を受け、アポトーシスにより細胞死を惹起するシグナルのいくつかの形
態を受けたことを示す、刺激に対して活性化する典型的な「上流」分子である。
このような上流カスパーゼの例は、カスパーゼ８である。次いで開始カスパーゼ
は、順に、分裂し、カスパーゼ３のような「下流」カスパーゼの他のファミリー
を活性化することができる。アポトーシス刺激の性質並びに細胞のタイプにより
、伝達経路の一部のみが細胞死の伝達機構及び遂行に関与しうる。例えば、ある
アポトーシス阻害剤、例えばＣｒｍＡは、カスパーゼ、例えば下流に位置するカ
スパーゼ８等に作用すると考えられ、通常リガンドに結合する死レセプターによ
り直接活性化される。他のアポトーシス阻害剤は、細胞内伝達経路の下流に位置
する他のカスパーゼに作用すると考えられる。従って、選択された細胞の細胞死
機構に効果的に関わる（例えば、活性化するようにシグナル伝達に関わる）これ
らの分子の阻害剤は、ここに記載されるようなアポトーシス阻害剤として効果が
ありうると考えられる。しかしながら、出願人は、当該分野の技術者はこのよう
な伝達経路において細胞が細胞死に「関連づけされる」ポイントがあり、いった
ん伝達経路が細胞が細胞死に関連づけされるポイントにシグナルを伝達すると、
ここに記載されるように、「関連づけされた」細胞のアポトーシスを抑制又は妨
害に影響しないことを理解しているだろうと記している。
【００２３】
サイトカイン応答修飾因子、ＣｒｍＡは、いくつかのシステムでアポトーシス
を阻害すると報告された牛痘ウィルスから同定された３８ｋＤａのセルピン(ser
pin)である[Gagliardiniら, Science, 263:826-828(1994); Tewariら, J. Biol.
Chem., 270:3255-3260(1995)]。ＣｒｍＡは、カスパーゼ１及びカスパーゼ８の
阻害剤とされている[Nicholsonら, Nature, 376:37-43(1995); Zhouら, J.Biol.
Chem., 272:7797-7800(1997)]。出願人により実施されたいくつかの研究におい
て、ＣＨＯ ｄｈｆｒ＋細胞のＣｒｍＡの過剰発現は、バイオリアクターの環境
において細胞死を実質的に延長することができなかったこということが観察され
た。この結果は、出願人により選択されるこの特定のＣＨＯ細胞システムにおい
て、カスパーゼ１又はカスパーゼ８のどちらも、これらの特定の培養細胞の細胞
死経路の積極的には関与しないということを示唆した。従って、ここで記載する
ような所望の結果を達成するために、選択された宿主細胞の細胞死シグナル伝達
得経路の下流であるが、細胞が細胞死に関連づけされるポイントの前に作用する
アポトーシス阻害分子を選択することが好ましい。 対象とするタンパク質及びアポトーシス阻害剤をコードする核酸(例えば、ｃ
ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、発現のために複製可能なベクター内に挿入されて
もよい。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般
に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数の次のものを含む：シグ
ナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメン
ト、プロモーター、及び転写終結配列、それぞれ下に説明する。使用されうる任
意のシグナル配列、複製の原点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び
転写集結配列は当該分野で既知であり、WO97/25428にさらに詳細に記載されてい
る。
を阻害すると報告された牛痘ウィルスから同定された３８ｋＤａのセルピン(ser
pin)である[Gagliardiniら, Science, 263:826-828(1994); Tewariら, J. Biol.
Chem., 270:3255-3260(1995)]。ＣｒｍＡは、カスパーゼ１及びカスパーゼ８の
阻害剤とされている[Nicholsonら, Nature, 376:37-43(1995); Zhouら, J.Biol.
Chem., 272:7797-7800(1997)]。出願人により実施されたいくつかの研究におい
て、ＣＨＯ ｄｈｆｒ＋細胞のＣｒｍＡの過剰発現は、バイオリアクターの環境
において細胞死を実質的に延長することができなかったこということが観察され
た。この結果は、出願人により選択されるこの特定のＣＨＯ細胞システムにおい
て、カスパーゼ１又はカスパーゼ８のどちらも、これらの特定の培養細胞の細胞
死経路の積極的には関与しないということを示唆した。従って、ここで記載する
ような所望の結果を達成するために、選択された宿主細胞の細胞死シグナル伝達
得経路の下流であるが、細胞が細胞死に関連づけされるポイントの前に作用する
アポトーシス阻害分子を選択することが好ましい。 対象とするタンパク質及びアポトーシス阻害剤をコードする核酸(例えば、ｃ
ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、発現のために複製可能なベクター内に挿入されて
もよい。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般
に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数の次のものを含む：シグ
ナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメン
ト、プロモーター、及び転写終結配列、それぞれ下に説明する。使用されうる任
意のシグナル配列、複製の原点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び
転写集結配列は当該分野で既知であり、WO97/25428にさらに詳細に記載されてい
る。
【００２４】
このような遺伝子をベクターに挿入するための技術は、当該技術者によく知ら
れ、このような技術は、過度の経験無しに実施することができる。適したベクタ
ーの構築は標準的なライゲーション技術を使用することができる。単離されたプ
ラスミド又はＤＮＡ断片は、要求されるプラスミドを生成するために所望の形態
に分割され、調製され、及び再ライゲーションされる。当分野で既知の技術が使
用されうる。[例えばMessingら, Nucleic Acids Res., 9:309(1981); Maxamら,
Methods in Enzymology, 65:499(1980)参照]。 アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子及び対象とするタンパク質をコードす
る遺伝子は、（共に形質移入した）１つのベクターに挿入されるか、又は２つの
分離した、又は異なるベクターに挿入されてもよい。好ましくは、個々の遺伝子
は２つの分離したベクターに挿入される。このような各遺伝子は、典型的には選
択遺伝子を含み、また選択可能なマーカーと呼ばれる。典型的な選択遺伝子は、
（ａ）抗性物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、プロマイシ
ン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンに耐性を与え、（ｂ）栄養要求性
欠陥を補い、又は（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給する、タ
ンパク質をコードし、例えば桿菌(Bacilli)のＤ-アラニンラセマーゼをコードす
る遺伝子である。
れ、このような技術は、過度の経験無しに実施することができる。適したベクタ
ーの構築は標準的なライゲーション技術を使用することができる。単離されたプ
ラスミド又はＤＮＡ断片は、要求されるプラスミドを生成するために所望の形態
に分割され、調製され、及び再ライゲーションされる。当分野で既知の技術が使
用されうる。[例えばMessingら, Nucleic Acids Res., 9:309(1981); Maxamら,
Methods in Enzymology, 65:499(1980)参照]。 アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子及び対象とするタンパク質をコードす
る遺伝子は、（共に形質移入した）１つのベクターに挿入されるか、又は２つの
分離した、又は異なるベクターに挿入されてもよい。好ましくは、個々の遺伝子
は２つの分離したベクターに挿入される。このような各遺伝子は、典型的には選
択遺伝子を含み、また選択可能なマーカーと呼ばれる。典型的な選択遺伝子は、
（ａ）抗性物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、プロマイシ
ン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンに耐性を与え、（ｂ）栄養要求性
欠陥を補い、又は（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給する、タ
ンパク質をコードし、例えば桿菌(Bacilli)のＤ-アラニンラセマーゼをコードす
る遺伝子である。
【００２５】
哺乳動物細胞に適した選択可能なマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジン
キナーゼのようにコード化核酸を取り込むことのできる細胞を同定することので
きるものである。野生型ＤＨＦＲが使用される場合の適した宿主細胞は、ＤＨＦ
Ｒ活性のないＣＨＯ細胞株であり、Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77
:4216(1980)に記載されているようにして調製され、増殖される。酵母での使用
に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子であ
る[Stinchcombら, Nature, 282:39(1979); Kingsmanら, Gene, 7:141(1979); Ts
chemperら, Gene, 10:157(1980)]。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンでの増殖
能力のない酵母の突然変異株の選択マーカー、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７
６又はＰＥＰ４−１を提供する[Jones, Genetics, 85:12(1977)]。 アポトーシス阻害剤遺伝子を含む第１のベクター及び対象とするタンパク質を
コードする遺伝子を含む代２のベクターを使用する方法では、第１及び第２のベ
クターが異なる選択マーカを持つことが好ましい。例えば、アポトーシス阻害遺
伝子を含むベクターは、アンピシリン耐性を与える選択遺伝子を持ちうるが、対
象とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターはメトトレキセート耐性
を与える選択遺伝子を持ちうる。
キナーゼのようにコード化核酸を取り込むことのできる細胞を同定することので
きるものである。野生型ＤＨＦＲが使用される場合の適した宿主細胞は、ＤＨＦ
Ｒ活性のないＣＨＯ細胞株であり、Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77
:4216(1980)に記載されているようにして調製され、増殖される。酵母での使用
に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子であ
る[Stinchcombら, Nature, 282:39(1979); Kingsmanら, Gene, 7:141(1979); Ts
chemperら, Gene, 10:157(1980)]。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンでの増殖
能力のない酵母の突然変異株の選択マーカー、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７
６又はＰＥＰ４−１を提供する[Jones, Genetics, 85:12(1977)]。 アポトーシス阻害剤遺伝子を含む第１のベクター及び対象とするタンパク質を
コードする遺伝子を含む代２のベクターを使用する方法では、第１及び第２のベ
クターが異なる選択マーカを持つことが好ましい。例えば、アポトーシス阻害遺
伝子を含むベクターは、アンピシリン耐性を与える選択遺伝子を持ちうるが、対
象とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターはメトトレキセート耐性
を与える選択遺伝子を持ちうる。
【００２６】
発現ベクターはまた、通常、宿主生物によって認識され、前記の挿入核酸配列
に作用可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合し
た特定の核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺
伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位
置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典形的には、誘発的なクラ
ス及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、例え
ば、養分の存在あるいは不存在、温度変化などの培養条件のある変化に対応して
その制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時
点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターが
よく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源Ｄ
ＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入す
ることで、コード化ＤＮＡに作用的に結合している。 原核生物及び真核生物宿主に適したプロモーターは当該分野で知られており、
WO97/25428にさらに詳しく記載されている。 対象とするタンパク質をコードするＤＮＡの一過性発現を提供する発現ベクタ
ーが使用される。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くの複製
を蓄積し、次に発現ベクターにコードされる高レベルの所望のタンパク質を合成
するような、効率的に宿主細胞に複製できる発現ベクターの使用を含む[Sambroo
kら,上掲]。適した発現ベクター及び宿主細胞を含む一過性発現システムは、ク
ローン化したDNAによりコードされるタンパク質の簡便で明確な同定、並びにこ
のようなタンパク質の所望の生物学的又は生理学的特性のための敏速なスクリー
ニングを可能にする。
に作用可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合し
た特定の核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺
伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位
置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典形的には、誘発的なクラ
ス及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、例え
ば、養分の存在あるいは不存在、温度変化などの培養条件のある変化に対応して
その制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時
点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターが
よく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源Ｄ
ＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入す
ることで、コード化ＤＮＡに作用的に結合している。 原核生物及び真核生物宿主に適したプロモーターは当該分野で知られており、
WO97/25428にさらに詳しく記載されている。 対象とするタンパク質をコードするＤＮＡの一過性発現を提供する発現ベクタ
ーが使用される。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くの複製
を蓄積し、次に発現ベクターにコードされる高レベルの所望のタンパク質を合成
するような、効率的に宿主細胞に複製できる発現ベクターの使用を含む[Sambroo
kら,上掲]。適した発現ベクター及び宿主細胞を含む一過性発現システムは、ク
ローン化したDNAによりコードされるタンパク質の簡便で明確な同定、並びにこ
のようなタンパク質の所望の生物学的又は生理学的特性のための敏速なスクリー
ニングを可能にする。
【００２７】
宿主細胞を形質移入し、又は対象とするタンパク質の産生のための上述の発現
ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望
の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地
で培養する。 トランスフェクションは、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにか
かわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数のトランス
フェクションの方法が当業者に知られ、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレ
ーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたとき
に成功したトランスフェクションが一般に認められる。上記のように、アポトー
シス阻害遺伝子の使用（又は培地へのアポトーシス阻害分子の直接添加）は、ト
ランスフェクションの効果を改善しうる。このようなアポトーシス阻害剤の使用
は、トランスフェクション試薬、例えば（以下の実施例に記載されるような）リ
ポフェクタミン又はＤＭＲＩＥ-Ｃの増加した量の使用を許容しうる。
ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望
の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地
で培養する。 トランスフェクションは、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにか
かわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数のトランス
フェクションの方法が当業者に知られ、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレ
ーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたとき
に成功したトランスフェクションが一般に認められる。上記のように、アポトー
シス阻害遺伝子の使用（又は培地へのアポトーシス阻害分子の直接添加）は、ト
ランスフェクションの効果を改善しうる。このようなアポトーシス阻害剤の使用
は、トランスフェクション試薬、例えば（以下の実施例に記載されるような）リ
ポフェクタミン又はＤＭＲＩＥ-Ｃの増加した量の使用を許容しうる。
【００２８】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと
、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。
用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用
いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを
用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細
胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファ
シエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開の
WO89/05859に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加
えて、1991年1月10日に公開されたWO91/00358に記載されているように、超音波
処理を用いて植物をトランスフェクションすることもできる。このような細胞壁
のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457
(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換
の一般的な側面は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中の形質転換
は、典形的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしな
がら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクショ
ン、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレ
ン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもでき
る。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Metho
ds in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352
(1988)を参照のこと。
、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。
用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用
いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを
用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細
胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファ
シエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開の
WO89/05859に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加
えて、1991年1月10日に公開されたWO91/00358に記載されているように、超音波
処理を用いて植物をトランスフェクションすることもできる。このような細胞壁
のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457
(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換
の一般的な側面は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中の形質転換
は、典形的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしな
がら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクショ
ン、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレ
ン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもでき
る。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Metho
ds in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352
(1988)を参照のこと。
【００２９】
ここでのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主
細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、
限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、
例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公的に利用可能であ
り、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１，４４６)；大腸菌Ｘ１７
７６(ＡＴＣＣ３１，５３７)；大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７，３２５)及び
Ｋ５７７２(ＡＴＣＣ５３，６３５)；エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)
、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネ
ズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans
) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシ
リリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日発行
のＤＤ２６６，７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュー
ドモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物が適している。サッ
カロミセス セレビシエは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。 適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては
、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が
含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(
ＣＨＯ)及びＣＯＳ細胞を含む。多くの特異的な例は、ＳＶ４０によって形質転
換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１)；ヒト胚腎
臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、G
rahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-
ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (198
0))；ｄｐ１２．ＣＨＯ（1989年3月15日公開のEP307,247）、マウスのセルトリ
細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；ヒト肺細胞 (W138, A
TCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；及びマウス乳房腫
瘍細胞 (ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)を含む。適切な宿主細胞
の選択は当分野の技術の範囲内で判断される。
細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、
限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、
例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公的に利用可能であ
り、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１，４４６)；大腸菌Ｘ１７
７６(ＡＴＣＣ３１，５３７)；大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７，３２５)及び
Ｋ５７７２(ＡＴＣＣ５３，６３５)；エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)
、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネ
ズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans
) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシ
リリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日発行
のＤＤ２６６，７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュー
ドモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物が適している。サッ
カロミセス セレビシエは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。 適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては
、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が
含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(
ＣＨＯ)及びＣＯＳ細胞を含む。多くの特異的な例は、ＳＶ４０によって形質転
換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１)；ヒト胚腎
臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、G
rahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-
ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (198
0))；ｄｐ１２．ＣＨＯ（1989年3月15日公開のEP307,247）、マウスのセルトリ
細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；ヒト肺細胞 (W138, A
TCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；及びマウス乳房腫
瘍細胞 (ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)を含む。適切な宿主細胞
の選択は当分野の技術の範囲内で判断される。
【００３０】
特定の宿主細胞で使用するための特定のアポトーシス阻害剤及び対象とするタ
ンパク質の選択は、当分野の従来技術で過度の経験無しにすることができる。 対象とするタンパク質を生産するのに使用される原核細胞は、一般に上掲のSa
mbrookらに記載されるような適した培地で培養してもよい。ＣＨＯを培養するの
に使用される培地の特定の形態は、以下の実施例にさらに記載される。対象とす
るタンパク質を生産するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培
養されうる。哺乳動物細胞のための適切な培養条件は、この分野で知られている
か（J. Immunol. Methods (1983) 56: 221-234）、又は当業者によって容易に決
定され（例えば、Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickw
ood, D. 及び Hames, B.D. eds. Oxford University Press, New Tork (1992)）
、選択する特定の宿主細胞により変化する。 商業的に入手可能な培地の例は、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(
(ＭＥＭ)、シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル
培地((DMEM)、シグマ)を含む。さらに、Ham及びWallace, (1979) Meth. Enz. 5
8:44; Barnes及びSato, (1980) Anal. Biochem. 102:255; 米国特許第4,767,704
号；同4,657,866号；同4,927,762号；同5,122,469号又は同4,560,655号；国際出
願公開WO90/03430；及びWO87/00195に記載された任意の培地を使用してもよい。
これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン
、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カル
シウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレ
オシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商
品名）薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と
して定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充す
ることができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な
濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選
ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らか
であろう。特定の細胞の必要な増殖因子は、例えばMammalian Cell Culture(Mat
her, J. P.編, Plenum Press, N. Y. (1984)、及びBarnes及びSato, (1980)Cell
, 22:649に記載されるように、過度の経験無しに容易に決定される。
ンパク質の選択は、当分野の従来技術で過度の経験無しにすることができる。 対象とするタンパク質を生産するのに使用される原核細胞は、一般に上掲のSa
mbrookらに記載されるような適した培地で培養してもよい。ＣＨＯを培養するの
に使用される培地の特定の形態は、以下の実施例にさらに記載される。対象とす
るタンパク質を生産するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培
養されうる。哺乳動物細胞のための適切な培養条件は、この分野で知られている
か（J. Immunol. Methods (1983) 56: 221-234）、又は当業者によって容易に決
定され（例えば、Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickw
ood, D. 及び Hames, B.D. eds. Oxford University Press, New Tork (1992)）
、選択する特定の宿主細胞により変化する。 商業的に入手可能な培地の例は、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(
(ＭＥＭ)、シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル
培地((DMEM)、シグマ)を含む。さらに、Ham及びWallace, (1979) Meth. Enz. 5
8:44; Barnes及びSato, (1980) Anal. Biochem. 102:255; 米国特許第4,767,704
号；同4,657,866号；同4,927,762号；同5,122,469号又は同4,560,655号；国際出
願公開WO90/03430；及びWO87/00195に記載された任意の培地を使用してもよい。
これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン
、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カル
シウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレ
オシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商
品名）薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と
して定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充す
ることができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な
濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選
ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らか
であろう。特定の細胞の必要な増殖因子は、例えばMammalian Cell Culture(Mat
her, J. P.編, Plenum Press, N. Y. (1984)、及びBarnes及びSato, (1980)Cell
, 22:649に記載されるように、過度の経験無しに容易に決定される。
【００３１】
組換え脊椎動物細胞培養での対象とするタンパク質の合成に適応化するのに適
切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625(198
1); Manteiら, Nature, 281:40-46(1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載
されている。一般に、哺乳動物細胞の培養の生産性を最大化するための原理、プ
ロトコール、及び実践的な技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practica
l Approach, M.Butler,編(IRL Press, 1991)。 培地に直接添加又は混合されるアポトーシス阻害剤の量は、例えば、使用され
るアポトーシス阻害分子のタイプ、宿主細胞のタイプ、培地状態等の様々な因子
に依存しうる。培地の添加又は混合されるアポトーシス阻害剤の所望の濃度の決
定は、当分野の技術範囲で、過度の経験無しに経験的に確認することができる。
好ましくは、培地に添加又は混合される有効量又は所望の濃度のアポトーシス阻
害剤は、アポトーシス阻害剤が宿主細胞に浸透する程度である。技術者は、異な
るアポトーシス阻害剤は宿主細胞への異なる浸透能力を有しうることを既に理解
しているはずで、従って宿主細胞へのこのような浸透が許容される濃度を選択す
る必要がある。典型的に、宿主細胞に対して不都合又は毒性がある範囲に近づく
濃度として望まれないアポトーシス阻害剤の濃度の上限範囲がある。以下の実施
例に記載されるように、出願人は、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋが約１００マイクロモルの
濃度で細胞培地に添加した場合にアポトーシスを阻害することができることこと
を発見した。例えばｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ、ｚ-ＤＥＶＤ-ｆｍｋ、Ｂ-Ｄ-ｆｍｋ、及
びｚ-ＹＶＡＤ-ｆｍｋのような様々なアポトーシス阻害化合物が、例えばPharmi
ngen及びEnzyme Systems, Livermore, CAのようなメーカーから入手可能である
。
切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625(198
1); Manteiら, Nature, 281:40-46(1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載
されている。一般に、哺乳動物細胞の培養の生産性を最大化するための原理、プ
ロトコール、及び実践的な技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practica
l Approach, M.Butler,編(IRL Press, 1991)。 培地に直接添加又は混合されるアポトーシス阻害剤の量は、例えば、使用され
るアポトーシス阻害分子のタイプ、宿主細胞のタイプ、培地状態等の様々な因子
に依存しうる。培地の添加又は混合されるアポトーシス阻害剤の所望の濃度の決
定は、当分野の技術範囲で、過度の経験無しに経験的に確認することができる。
好ましくは、培地に添加又は混合される有効量又は所望の濃度のアポトーシス阻
害剤は、アポトーシス阻害剤が宿主細胞に浸透する程度である。技術者は、異な
るアポトーシス阻害剤は宿主細胞への異なる浸透能力を有しうることを既に理解
しているはずで、従って宿主細胞へのこのような浸透が許容される濃度を選択す
る必要がある。典型的に、宿主細胞に対して不都合又は毒性がある範囲に近づく
濃度として望まれないアポトーシス阻害剤の濃度の上限範囲がある。以下の実施
例に記載されるように、出願人は、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋが約１００マイクロモルの
濃度で細胞培地に添加した場合にアポトーシスを阻害することができることこと
を発見した。例えばｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ、ｚ-ＤＥＶＤ-ｆｍｋ、Ｂ-Ｄ-ｆｍｋ、及
びｚ-ＹＶＡＤ-ｆｍｋのような様々なアポトーシス阻害化合物が、例えばPharmi
ngen及びEnzyme Systems, Livermore, CAのようなメーカーから入手可能である
。
【００３２】
アポトーシス阻害剤は、培地に直接添加してもよい。アポトーシス阻害剤は、
細胞の培養中の任意のポイントで添加されうる。場合によっては、アポトーシス
阻害剤は、細胞培養工程の初期（開始の時、０日目）に培地に加える。好ましく
は、このようなアポトーシス阻害剤は、細胞の培養中であるが、アポトーシスの
誘発が生じる前に培地に加えられ；典型的には、アポトーシスの誘発は、大量細
胞培養においては、培養の約３又は４日目に観察され、従って、アポトーシス阻
害剤は、好ましくは３又は４日目の前に添加されうる。場合によっては、アポト
ーシス阻害剤の所望される量は、例えば完全な発酵のために日単位で、細胞培養
の間中、又はその持続時間、加えられる。例としては、培養の５日間、アポトー
シス阻害剤を０日目と、その後培養が終了するまで２４時間毎に添加することが
できる。 本発明の一実施態様では、選択される宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、好ましくはｄ
ｐ１２．ＣＨＯ細胞であり、選択される培地は、例えば修正した濃度のいくつか
の成分、例えばアミノ酸類、塩類、糖、及びビタミンを有するＤＭＥＭ／ＨＡＭ
Ｆ-１２を基礎とした形態（ＤＭＥＭ及びＨＡＭ Ｆ１２培地の組成物で無血清
培地、American Type Culture Collection Catalogue of Cell Line and Hybrid
omas, 第６編, 1988, ページ346-349）（米国特許第5,122,469号に記載されるよ
うな培地の形態が特に適している）のような基礎培地成分を含み、場合によって
はグリシン、ヒポキサンチン、及びチミジン；組換えヒトインシュリン、加水分
解ペプトン、例えばPrimatone HS又はPrimatone RL（シェフィールド、英国）、
又はその等価物；細胞保護剤、例えばPluronic F68又は等価プルロニックポリオ
ール；ゲンタマイシン；及び微量元素を含む。好ましくは、選択細胞培地は無血
清である。
細胞の培養中の任意のポイントで添加されうる。場合によっては、アポトーシス
阻害剤は、細胞培養工程の初期（開始の時、０日目）に培地に加える。好ましく
は、このようなアポトーシス阻害剤は、細胞の培養中であるが、アポトーシスの
誘発が生じる前に培地に加えられ；典型的には、アポトーシスの誘発は、大量細
胞培養においては、培養の約３又は４日目に観察され、従って、アポトーシス阻
害剤は、好ましくは３又は４日目の前に添加されうる。場合によっては、アポト
ーシス阻害剤の所望される量は、例えば完全な発酵のために日単位で、細胞培養
の間中、又はその持続時間、加えられる。例としては、培養の５日間、アポトー
シス阻害剤を０日目と、その後培養が終了するまで２４時間毎に添加することが
できる。 本発明の一実施態様では、選択される宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、好ましくはｄ
ｐ１２．ＣＨＯ細胞であり、選択される培地は、例えば修正した濃度のいくつか
の成分、例えばアミノ酸類、塩類、糖、及びビタミンを有するＤＭＥＭ／ＨＡＭ
Ｆ-１２を基礎とした形態（ＤＭＥＭ及びＨＡＭ Ｆ１２培地の組成物で無血清
培地、American Type Culture Collection Catalogue of Cell Line and Hybrid
omas, 第６編, 1988, ページ346-349）（米国特許第5,122,469号に記載されるよ
うな培地の形態が特に適している）のような基礎培地成分を含み、場合によって
はグリシン、ヒポキサンチン、及びチミジン；組換えヒトインシュリン、加水分
解ペプトン、例えばPrimatone HS又はPrimatone RL（シェフィールド、英国）、
又はその等価物；細胞保護剤、例えばPluronic F68又は等価プルロニックポリオ
ール；ゲンタマイシン；及び微量元素を含む。好ましくは、選択細胞培地は無血
清である。
【００３３】
対象とするタンパク質は、様々な細胞培養条件下で宿主細胞を増殖することに
より生産されうる。例えば、タンパク質の大量又は小量の生産のための細胞培養
方法は、潜在的に、本発明に関連して役に立つ。これに限らないが、方法は流動
層バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、回転ボトル培養、又は撹拌タ
ンクバイオリアクターシステムを含む方法が、後者２つのシステムにおいて、マ
イクロキャリアがあっても無くても使用され、或いは回分式(batch)、流加式(fe
d-batch)、又は連続式(continuous)方式で作用しうる。 好ましい実施態様では、本発明の細胞培養は、撹拌タンクバイオリアクターシ
ステムで実施され、さらに流加式培養方法が用いられる。好ましいバイオリアク
ターシステムでは、バイオリアクターの大きさは、対象とするタンパク質の所望
の量を生産するのに十分な大きさ、より小さい（つまり、２リットル、４００リ
ットル）又はより大きい（つまり、２５，０００リットル、５０，０００リット
ル）バイオリアクターの容器も適しうるので、これに限らないが、例えば１，０
００リットル又は１２，０００リットルの大きさでありうる。好ましい流加式培
養では、哺乳動物細胞及び培地は、最初に培養容器に供給され、培養の終了の前
に周期的な細胞及び／又は生産物の採取があっても無くても、培養の間に培養物
に更なる培養栄養素が、連続して又は別々の増加で供給される。流加式培養は、
例えば、定期的に培養（細胞及び培地を含む）が取り除かれ、初期培地と交換さ
れた半連続式流加式培地を含みうる。流加式培地は、細胞培養の全ての成分（細
胞及び細胞培養栄養素を含む）が培養工程の初期に培養容器に供給された単なる
回分式培養と区別される。流加式培地は、工程の間であるが、上清が培養工程の
最後に培養容器から取り除かれない範囲で、潅流培養とは区別することができる
（潅流培養において、細胞は、例えば濾過、カプセル化、マイクロキャリア糖の
固着により培地で抑止され、培地は連続して又は断続的に取り入れられ、培養容
器から取り除かれる）。
より生産されうる。例えば、タンパク質の大量又は小量の生産のための細胞培養
方法は、潜在的に、本発明に関連して役に立つ。これに限らないが、方法は流動
層バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、回転ボトル培養、又は撹拌タ
ンクバイオリアクターシステムを含む方法が、後者２つのシステムにおいて、マ
イクロキャリアがあっても無くても使用され、或いは回分式(batch)、流加式(fe
d-batch)、又は連続式(continuous)方式で作用しうる。 好ましい実施態様では、本発明の細胞培養は、撹拌タンクバイオリアクターシ
ステムで実施され、さらに流加式培養方法が用いられる。好ましいバイオリアク
ターシステムでは、バイオリアクターの大きさは、対象とするタンパク質の所望
の量を生産するのに十分な大きさ、より小さい（つまり、２リットル、４００リ
ットル）又はより大きい（つまり、２５，０００リットル、５０，０００リット
ル）バイオリアクターの容器も適しうるので、これに限らないが、例えば１，０
００リットル又は１２，０００リットルの大きさでありうる。好ましい流加式培
養では、哺乳動物細胞及び培地は、最初に培養容器に供給され、培養の終了の前
に周期的な細胞及び／又は生産物の採取があっても無くても、培養の間に培養物
に更なる培養栄養素が、連続して又は別々の増加で供給される。流加式培養は、
例えば、定期的に培養（細胞及び培地を含む）が取り除かれ、初期培地と交換さ
れた半連続式流加式培地を含みうる。流加式培地は、細胞培養の全ての成分（細
胞及び細胞培養栄養素を含む）が培養工程の初期に培養容器に供給された単なる
回分式培養と区別される。流加式培地は、工程の間であるが、上清が培養工程の
最後に培養容器から取り除かれない範囲で、潅流培養とは区別することができる
（潅流培養において、細胞は、例えば濾過、カプセル化、マイクロキャリア糖の
固着により培地で抑止され、培地は連続して又は断続的に取り入れられ、培養容
器から取り除かれる）。
【００３４】
さらに、培養した細胞は、あらゆるスキーム、又は特定の宿主細胞に適した方
法、及び考慮される特定の生産計画に従って増殖されうる。従って、本発明は、
一段階の又は複数段階の培養方法が考えられる。一段階の培養では、宿主細胞は
培養環境中に播種され、本発明の方法の段階は細胞培養の一つの生産期の間に使
用される。或いは、複数段階の培養が考えられる。複数段階の培養では、細胞は
多くの段階又は期で培養されてもよい。例えば、細胞は、第１段階又は増殖期培
養で増殖してもよく、細胞は貯蔵していたものから取り出したものでもよく、促
進された増殖及び高い生存度に適した培地に播種される。細胞は宿主細胞培養物
に初期培地を添加することにより適した時間増殖期に維持されうる。 本発明の好ましい態様によると、流加式又は連続式細胞培養条件は、細胞培養
の増殖期の哺乳動物細胞の増殖を促進することを考案する。増殖期では、細胞を
増殖が最大になる条件下及び時間で増殖する。培養条件、例えば温度、ｐＨ、溶
解酸素（ｄＯ２）等は、特定の宿主で用いられるものであり、通常の技術者に明
らかであろう。一般にｐＨは、酸（例えば、ＣＯ２）又は塩基（例えば、Ｎａ２ ＣＯ３又はＮａＯＨ）のどちらかを用いて約６．５から７．５の間のレベルに調
節する。ＣＨＯ細胞の様な哺乳動物細胞に適した温度範囲は、３０から３８℃の
間、好ましくは約３７℃であり、適したｄＯ２は、空気飽和度の５−９０％の間
である。
法、及び考慮される特定の生産計画に従って増殖されうる。従って、本発明は、
一段階の又は複数段階の培養方法が考えられる。一段階の培養では、宿主細胞は
培養環境中に播種され、本発明の方法の段階は細胞培養の一つの生産期の間に使
用される。或いは、複数段階の培養が考えられる。複数段階の培養では、細胞は
多くの段階又は期で培養されてもよい。例えば、細胞は、第１段階又は増殖期培
養で増殖してもよく、細胞は貯蔵していたものから取り出したものでもよく、促
進された増殖及び高い生存度に適した培地に播種される。細胞は宿主細胞培養物
に初期培地を添加することにより適した時間増殖期に維持されうる。 本発明の好ましい態様によると、流加式又は連続式細胞培養条件は、細胞培養
の増殖期の哺乳動物細胞の増殖を促進することを考案する。増殖期では、細胞を
増殖が最大になる条件下及び時間で増殖する。培養条件、例えば温度、ｐＨ、溶
解酸素（ｄＯ２）等は、特定の宿主で用いられるものであり、通常の技術者に明
らかであろう。一般にｐＨは、酸（例えば、ＣＯ２）又は塩基（例えば、Ｎａ２ ＣＯ３又はＮａＯＨ）のどちらかを用いて約６．５から７．５の間のレベルに調
節する。ＣＨＯ細胞の様な哺乳動物細胞に適した温度範囲は、３０から３８℃の
間、好ましくは約３７℃であり、適したｄＯ２は、空気飽和度の５−９０％の間
である。
【００３５】
特定の時期には、細胞は、生産期又は段階の細胞培養物を播種するのに使用さ
れうる。或いは、上記のように、生産期又は段階は、播種又は増殖期又は段階と
連続していてもよい。 本発明に従うと、細胞培養の増殖期の間の細胞培養環境は制御される。ここで
開示された方法の工程によれば、培地中のアポトーシス阻害剤の濃度は、所望の
成分及び対象とするタンパク質の質が結果的に生じた細胞培養溶液で達成され、
維持されるように操作することができる。好ましい態様では、細胞培養の生産期
は、細胞培養の生産期のアポトーシス阻害剤の発現及び添加が関わる細胞培地の
転移層の前になる。アポトーシス阻害剤の濃度は、好ましくは重量モル浸透圧濃
度が細胞特定生産性に影響することができるので、生産期の重量モル浸透圧濃度
のような他の方法のパラメータに関してモニターされる。 前記したあらゆる方法において、細胞培地のブチラート又はＴＳＡのような所
望される量の試薬を含むことが望ましいことが考慮される。様々な形態のブチラ
ート又はその塩、例えば酪酸及び酪酸ナトリウム等が当分野において知られ、Si
gma Chemical Co.のような供給元から公的に入手可能である。ブチラートは、細
胞培養の生産性及びタンパク質発現を促進することが文献で報告されている[Art
sら, Biochem J., 310:171-176(1995); Gormanら, Nucleic Acids Res., 11:763
1-7648(1983); Krugh, Mol. Cell. Biochem., 42:65-82(1982); Lamotteら, Cyt
otechnology, 29:55-64(1999); Chotigeatら, Cytotechnology, 15:217-221(199
4)]。トリクロサンＡ（ＴＳＡ）は、ヒストン脱アセチラーゼの阻害剤であり、
細胞培養の生産性及びタンパク質発現の促進において、ブチラートと同様に作用
しうる。[Medinaら, Cancer Rsearch, 57:3697-3707(1997)]。ブチラートはタン
パク質発現にいくつかの潜在的な影響を有するが、また任意の濃度で、ブチラー
トが培養細胞のアポトーシスを誘発し、よって培養物の生存度並びに生細胞濃度
を減少することができることは当分野において、明らかとなっている。[Hagueら
, Int. J. Cancer, 55:498-505(1993); Calabresseら, Biochim. Biophys. Res.
Comm., 195:31-38(1993); Fillipovichら, Biochim. Biophys. Res. Comm., 19
8:257-265(1994); Medinaら, Cancer Research, 57:3697-3707(1997)]。本発明
の方法では、ブチラート又はＴＳＡの所望の量を、生産期の初期に細胞培養物に
添加してもよく、より好ましくは温度変化が行なわれた後に細胞培地に添加して
もよい。ブチラート又はＴＳＡは当分野の技術者により経験的に決定される所望
の量で添加されるが、好ましくはブチラートは約１から約２５ｍＭの濃度で、よ
り好ましくは約１から約６ｍＭの濃度で細胞培地に添加される。
れうる。或いは、上記のように、生産期又は段階は、播種又は増殖期又は段階と
連続していてもよい。 本発明に従うと、細胞培養の増殖期の間の細胞培養環境は制御される。ここで
開示された方法の工程によれば、培地中のアポトーシス阻害剤の濃度は、所望の
成分及び対象とするタンパク質の質が結果的に生じた細胞培養溶液で達成され、
維持されるように操作することができる。好ましい態様では、細胞培養の生産期
は、細胞培養の生産期のアポトーシス阻害剤の発現及び添加が関わる細胞培地の
転移層の前になる。アポトーシス阻害剤の濃度は、好ましくは重量モル浸透圧濃
度が細胞特定生産性に影響することができるので、生産期の重量モル浸透圧濃度
のような他の方法のパラメータに関してモニターされる。 前記したあらゆる方法において、細胞培地のブチラート又はＴＳＡのような所
望される量の試薬を含むことが望ましいことが考慮される。様々な形態のブチラ
ート又はその塩、例えば酪酸及び酪酸ナトリウム等が当分野において知られ、Si
gma Chemical Co.のような供給元から公的に入手可能である。ブチラートは、細
胞培養の生産性及びタンパク質発現を促進することが文献で報告されている[Art
sら, Biochem J., 310:171-176(1995); Gormanら, Nucleic Acids Res., 11:763
1-7648(1983); Krugh, Mol. Cell. Biochem., 42:65-82(1982); Lamotteら, Cyt
otechnology, 29:55-64(1999); Chotigeatら, Cytotechnology, 15:217-221(199
4)]。トリクロサンＡ（ＴＳＡ）は、ヒストン脱アセチラーゼの阻害剤であり、
細胞培養の生産性及びタンパク質発現の促進において、ブチラートと同様に作用
しうる。[Medinaら, Cancer Rsearch, 57:3697-3707(1997)]。ブチラートはタン
パク質発現にいくつかの潜在的な影響を有するが、また任意の濃度で、ブチラー
トが培養細胞のアポトーシスを誘発し、よって培養物の生存度並びに生細胞濃度
を減少することができることは当分野において、明らかとなっている。[Hagueら
, Int. J. Cancer, 55:498-505(1993); Calabresseら, Biochim. Biophys. Res.
Comm., 195:31-38(1993); Fillipovichら, Biochim. Biophys. Res. Comm., 19
8:257-265(1994); Medinaら, Cancer Research, 57:3697-3707(1997)]。本発明
の方法では、ブチラート又はＴＳＡの所望の量を、生産期の初期に細胞培養物に
添加してもよく、より好ましくは温度変化が行なわれた後に細胞培地に添加して
もよい。ブチラート又はＴＳＡは当分野の技術者により経験的に決定される所望
の量で添加されるが、好ましくはブチラートは約１から約２５ｍＭの濃度で、よ
り好ましくは約１から約６ｍＭの濃度で細胞培地に添加される。
【００３６】
所望のタンパク質の発現は、適切に標識されたプローブを用いて、例えば、Ｅ
ＬＩＳＡ、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロ
ット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205(1980)］、ドッ
トブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、
直接サンプル中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も
一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の技術、
例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドも
また使用することができる。ビオチンは、次いで例えば放射性ヌクレオチド、蛍
光剤又は酵素のような多種多様な標識で標識されうるアビジン又は抗体への結合
部位として働く。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識す
ることができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識してアッセイを
実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果表面の二本
鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量するための、細
胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培地又は体液のアッセイといった
免疫学的方法によって測定してもよい。免疫組織化学的染色技術では、細胞サン
プルを、典型的には脱水と固定によって調製し、続いて結合した遺伝子産物に対
し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能なも
の、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネセンス標識等である。
ＬＩＳＡ、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロ
ット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205(1980)］、ドッ
トブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、
直接サンプル中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も
一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の技術、
例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドも
また使用することができる。ビオチンは、次いで例えば放射性ヌクレオチド、蛍
光剤又は酵素のような多種多様な標識で標識されうるアビジン又は抗体への結合
部位として働く。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識す
ることができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識してアッセイを
実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果表面の二本
鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量するための、細
胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培地又は体液のアッセイといった
免疫学的方法によって測定してもよい。免疫組織化学的染色技術では、細胞サン
プルを、典型的には脱水と固定によって調製し、続いて結合した遺伝子産物に対
し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能なも
の、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネセンス標識等である。
【００３７】
免疫組織化学染色及び／又は液体サンプルのアッセイに使用できる抗体は、モ
ノクローナルでもポリクローナルでもよく、あらゆる哺乳動物で調製されうる。 通常、実質的に均一である調製物を得るために、組換え細胞タンパク質又はポ
リペプチドからの対象とするタンパク質を回収又は精製することが必要である。
第１段階として、培地又はライセートは、特定の細胞片を取り除くために遠心分
離されうる。その後、対象とするタンパク質は、タンパク質及びポリペプチドの
溶解した夾雑物から、適した精製方法の例である次の方法で：イオン交換カラム
での分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例え
ばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；タンパク質Ａセファロースカラム、クロマ
トフォーカシングでのクロマトグラフィー；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウ
ム沈殿；及び例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過により精製される
。 回収又は精製した対象とするタンパク質は、典型的に一又は複数の次の方法：
ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、トリプシン消化の質量分
析、糖タンパク分析及び活性アッセイにより分析されうる。 以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに
取り込む。
ノクローナルでもポリクローナルでもよく、あらゆる哺乳動物で調製されうる。 通常、実質的に均一である調製物を得るために、組換え細胞タンパク質又はポ
リペプチドからの対象とするタンパク質を回収又は精製することが必要である。
第１段階として、培地又はライセートは、特定の細胞片を取り除くために遠心分
離されうる。その後、対象とするタンパク質は、タンパク質及びポリペプチドの
溶解した夾雑物から、適した精製方法の例である次の方法で：イオン交換カラム
での分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例え
ばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；タンパク質Ａセファロースカラム、クロマ
トフォーカシングでのクロマトグラフィー；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウ
ム沈殿；及び例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過により精製される
。 回収又は精製した対象とするタンパク質は、典型的に一又は複数の次の方法：
ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、トリプシン消化の質量分
析、糖タンパク分析及び活性アッセイにより分析されうる。 以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに
取り込む。
【００３８】
（実施例）
実施例で言及されている全ての他の制限酵素は、New England Biolabsから購
入し、製造者の使用説明に従い使用した。実施例に言及される全ての他の商業的
に入手可能な試薬は、別記していなければ、製造者の使用説明書に従って使用し
た。ＡＴＣＣ登録番号により次の実施例及び明細書全体を通して特定している細
胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，マナサス，バー
ジニア(American Type Culture Collection, Mannasas, Virginia)である。
入し、製造者の使用説明に従い使用した。実施例に言及される全ての他の商業的
に入手可能な試薬は、別記していなければ、製造者の使用説明書に従って使用し
た。ＡＴＣＣ登録番号により次の実施例及び明細書全体を通して特定している細
胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，マナサス，バー
ジニア(American Type Culture Collection, Mannasas, Virginia)である。
【００３９】
実施例１
バイオリアクターのアポトーシス細胞死
無血清に適合させたＣＨＯ（ｄｈｆｒ＋）細胞をスケールアップし、２リット
ルのバイオリアクターに１００万細胞／ｍｌで蒔いた（ｎ＝２）。細胞培地は組
換えヒトインシュリン及び微量元素を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基
礎にした培地とした。細胞を３７℃、２７５ｒｐｍの撹拌設定で増殖した。ｐＨ
を７．２に維持し、実験の間、自動的に調節した。バイオリアクターを酸素と空
気の混合物でスパージした。これは、治療用タンパク質の大量生産の間の条件を
真似たモデルシステムである。 次のパラメータを測定するためにサンプルを毎日採った：細胞生存度、カスパ
ーゼ活性（Clontech）、ＤＮＡ断片化及びアネキシン／ＰＩ結合（Chemicon）。
Ｆｉｇ．１Ａは５日の間に（トリパンブルーエクスクルージョンにより）測定さ
れた細胞生存度を示す。Ｆｉｇ．１Ｂは、培養の５日の間の細胞生存度の減少が
アポトーシスの結果であることを示す。
ルのバイオリアクターに１００万細胞／ｍｌで蒔いた（ｎ＝２）。細胞培地は組
換えヒトインシュリン及び微量元素を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基
礎にした培地とした。細胞を３７℃、２７５ｒｐｍの撹拌設定で増殖した。ｐＨ
を７．２に維持し、実験の間、自動的に調節した。バイオリアクターを酸素と空
気の混合物でスパージした。これは、治療用タンパク質の大量生産の間の条件を
真似たモデルシステムである。 次のパラメータを測定するためにサンプルを毎日採った：細胞生存度、カスパ
ーゼ活性（Clontech）、ＤＮＡ断片化及びアネキシン／ＰＩ結合（Chemicon）。
Ｆｉｇ．１Ａは５日の間に（トリパンブルーエクスクルージョンにより）測定さ
れた細胞生存度を示す。Ｆｉｇ．１Ｂは、培養の５日の間の細胞生存度の減少が
アポトーシスの結果であることを示す。
【００４０】
実施例２
ＣＨＯ細胞のカスパーゼ９のドミナントネガティブ効果
発現構築：Ｃ末端をＦＬＡＧタグしたカスパーゼ９ドミナントネガティブ（「
カスパーゼ９-ＤＮ」）ｃＤＮＡ（Duan, H.ら, J. Biol. Chemistry, 271, 1672
0-16724(1996); Pan, G.ら, J.Biol. Chemistry, 273, 5841-5845(1998)）を次
に記載するようにして、ｍｐｓｖスプライスドナーにサブクローンした：２ｕｇ
のｍｐｓｖベクター（Genentech, Inc.）を総量２０ｕｌ中、５ＵのＥｃｏＲＩ
及び５ＵのＢａｍＨＩ（Boehringer Mannheim）さらに２ｕｌのバッファーＡ（B
oehringer Mannheim）で、３７℃にして１時間消化した。２ｕｇのカスパーゼ９
-ＤＮ／ｐｃＤＮＡ３構築物を、総量２０ｕｌ中、５ＵのＨｉｎｄＩＩＩ及び５
ＵのＸｂａＩと２ｕｌのバッファーＢ（Boehringer Mannheim）で、３７℃にし
て１時間消化した。インキュべーションの後、１ｕｌの１ｍＭ ｄＮＴＰ（Clont
ech）及び０．２Ｕのクレノーポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を各反応物
に添加し、インキュベーションをさらに１５分、３７℃で続けた。 等分した各消化物は、１％のアガロースゲル電気泳動で分析した。１．２ｋｂ
ｐのカスパーゼ９-ＤＮ ｃＤＮＡ及び直線化した９．７ｋｂｐのｍｐｓｖベクタ
ーをゲルから取り出し、GeneClean（Bio101, Inc.）を用いて、製造者の使用説
明に従って精製した。 カスパーゼ９-ＤＮ及びｍｐｓｖベクターのライゲーション：５０ｎｇのベク
ター及び４２ｎｇの挿入物を総量２０ｕｌ中、１０ｕｌの２Ｘラーゲーションバ
ッファー及び１ｕｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼで、室温で５分間ライゲートした（B
oehringer Mannheim）。
カスパーゼ９-ＤＮ」）ｃＤＮＡ（Duan, H.ら, J. Biol. Chemistry, 271, 1672
0-16724(1996); Pan, G.ら, J.Biol. Chemistry, 273, 5841-5845(1998)）を次
に記載するようにして、ｍｐｓｖスプライスドナーにサブクローンした：２ｕｇ
のｍｐｓｖベクター（Genentech, Inc.）を総量２０ｕｌ中、５ＵのＥｃｏＲＩ
及び５ＵのＢａｍＨＩ（Boehringer Mannheim）さらに２ｕｌのバッファーＡ（B
oehringer Mannheim）で、３７℃にして１時間消化した。２ｕｇのカスパーゼ９
-ＤＮ／ｐｃＤＮＡ３構築物を、総量２０ｕｌ中、５ＵのＨｉｎｄＩＩＩ及び５
ＵのＸｂａＩと２ｕｌのバッファーＢ（Boehringer Mannheim）で、３７℃にし
て１時間消化した。インキュべーションの後、１ｕｌの１ｍＭ ｄＮＴＰ（Clont
ech）及び０．２Ｕのクレノーポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を各反応物
に添加し、インキュベーションをさらに１５分、３７℃で続けた。 等分した各消化物は、１％のアガロースゲル電気泳動で分析した。１．２ｋｂ
ｐのカスパーゼ９-ＤＮ ｃＤＮＡ及び直線化した９．７ｋｂｐのｍｐｓｖベクタ
ーをゲルから取り出し、GeneClean（Bio101, Inc.）を用いて、製造者の使用説
明に従って精製した。 カスパーゼ９-ＤＮ及びｍｐｓｖベクターのライゲーション：５０ｎｇのベク
ター及び４２ｎｇの挿入物を総量２０ｕｌ中、１０ｕｌの２Ｘラーゲーションバ
ッファー及び１ｕｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼで、室温で５分間ライゲートした（B
oehringer Mannheim）。
【００４１】
形質転換：MaxEfficiency DH5alfa適格細胞（Gibco BRL）を製造者の使用説明
に従って２ｕｌのライゲーション混合物で形質転換した。次いで、形質転換した
細胞をカルベニシリン含有ＬＢプレートに蒔いた。コロニーを無作為に選び取り
、正しい構築物を含むコロニーを同定するために制限消化により分析した。コロ
ニー＃３０が更なる研究に選ばれた。 トランスフェクション：Ｅ２５産生ＣＨＯ ＤＰ１２細胞[本出願の中で示され
るように、「Ｅ２５」はヒトＩｇＧに対するヒト化モノクローナル抗体を発現す
る形質移入したＣＨＯ細胞を意味する：Prestaら, J. Immunology, 151:2623-26
32(1993)参照]をｍｐｓｖ／カスパーゼ９-ＤＮ及びｍｐｓｖベクターを用いたト
ランスフェクションで選択した。トランスフェクションをLipofectAMINE Plus
試薬（Gibco BRL）を用いて行い、次の用にして実施した： 懸濁液中で増殖したＥ２５細胞を、血清含有培地でのトランスフェクションの
２４時間前に、６０ｍｍ組織培養皿に蒔いた。トランスフェクションのためのＤ
ＮＡを分光測定で定量した。２ｕｇのＤＮＡを２５０ｕｌの無血清培地及び８ｕ
ｌのＰｌｕｓ試薬と混合し、室温で１５分間インキュベートした。１２ｕｌの試
薬を２５０ｕｌの無血清培地と混合し、混合物に直接添加し、その後、室温で１
５分間インキュベーションした。細胞の上の培地を、５ｍｌの新しい無血清培地
と換え、トランスフェクション混合物を皿に添加した。トランスフェクションの
３時間後、培地を血清含有培地と交換した。トランスフェクションの２４時間後
、それぞれのトランスフェクションした皿を５皿に分割し、淘汰圧が５ｕｇ／ｍ
ｌのプロマイシンの添加により適用された。形質移入したクローン（プロマイシ
ン耐性）が、トランスフェクションの後、約２週間で出現し始めた。いくつかの
クローンを、ウエスタンブロットによるカスパーゼ９-ＤＮ発現の分析に選択し
た。
に従って２ｕｌのライゲーション混合物で形質転換した。次いで、形質転換した
細胞をカルベニシリン含有ＬＢプレートに蒔いた。コロニーを無作為に選び取り
、正しい構築物を含むコロニーを同定するために制限消化により分析した。コロ
ニー＃３０が更なる研究に選ばれた。 トランスフェクション：Ｅ２５産生ＣＨＯ ＤＰ１２細胞[本出願の中で示され
るように、「Ｅ２５」はヒトＩｇＧに対するヒト化モノクローナル抗体を発現す
る形質移入したＣＨＯ細胞を意味する：Prestaら, J. Immunology, 151:2623-26
32(1993)参照]をｍｐｓｖ／カスパーゼ９-ＤＮ及びｍｐｓｖベクターを用いたト
ランスフェクションで選択した。トランスフェクションをLipofectAMINE Plus
試薬（Gibco BRL）を用いて行い、次の用にして実施した： 懸濁液中で増殖したＥ２５細胞を、血清含有培地でのトランスフェクションの
２４時間前に、６０ｍｍ組織培養皿に蒔いた。トランスフェクションのためのＤ
ＮＡを分光測定で定量した。２ｕｇのＤＮＡを２５０ｕｌの無血清培地及び８ｕ
ｌのＰｌｕｓ試薬と混合し、室温で１５分間インキュベートした。１２ｕｌの試
薬を２５０ｕｌの無血清培地と混合し、混合物に直接添加し、その後、室温で１
５分間インキュベーションした。細胞の上の培地を、５ｍｌの新しい無血清培地
と換え、トランスフェクション混合物を皿に添加した。トランスフェクションの
３時間後、培地を血清含有培地と交換した。トランスフェクションの２４時間後
、それぞれのトランスフェクションした皿を５皿に分割し、淘汰圧が５ｕｇ／ｍ
ｌのプロマイシンの添加により適用された。形質移入したクローン（プロマイシ
ン耐性）が、トランスフェクションの後、約２週間で出現し始めた。いくつかの
クローンを、ウエスタンブロットによるカスパーゼ９-ＤＮ発現の分析に選択し
た。
【００４２】
ウエスタンブロット分析：選択クローンを選び取り、２４穴プレートに移動し
た。コンフルエントのとき、各ウェルからの細胞をＰＢＳで洗浄し、１００ｕｌ
の溶解バッファー（ＰＢＳ中３％ＮＰ４０）に３分間溶解した。ライセートを１
２，０００ｘｇで３分間遠心分離した。上清を採取し、減少した２ｘＳＤＳ添加
液（Novex）の等量と混合し、３分間煮沸した。サンプルを−２０℃で保存した
。等分したライセートをMicro BCAタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce）を
用いて、全タンパク質濃度を測定するためのタンパク質アッセイにかけた。 全タンパク質の３ｕｇに相当する等分したライセートは、１０％のＳＤＳトリ
ス-グリシンゲル（Novex）にロードし、１時間半実施した。タンパク質を製造者
の説明に従ってイモビロンＰ転移膜に移した。 膜をウサギ抗カスパーゼ９血清（Pharmingen）、続いてＨＲＰコンジュゲート
したヤギ抗ウサギ抗血清でプローブし、ＥＣＬウェスタンブロット検定試薬（Am
ersham）を用いて伸展させた。クローンを、カスパーゼ９-ＤＮ高並びに低発現
のクローン（クローン２及び１４）をさらに特徴付けするために選択した。Ｆｉ
ｇ．２参照。
た。コンフルエントのとき、各ウェルからの細胞をＰＢＳで洗浄し、１００ｕｌ
の溶解バッファー（ＰＢＳ中３％ＮＰ４０）に３分間溶解した。ライセートを１
２，０００ｘｇで３分間遠心分離した。上清を採取し、減少した２ｘＳＤＳ添加
液（Novex）の等量と混合し、３分間煮沸した。サンプルを−２０℃で保存した
。等分したライセートをMicro BCAタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce）を
用いて、全タンパク質濃度を測定するためのタンパク質アッセイにかけた。 全タンパク質の３ｕｇに相当する等分したライセートは、１０％のＳＤＳトリ
ス-グリシンゲル（Novex）にロードし、１時間半実施した。タンパク質を製造者
の説明に従ってイモビロンＰ転移膜に移した。 膜をウサギ抗カスパーゼ９血清（Pharmingen）、続いてＨＲＰコンジュゲート
したヤギ抗ウサギ抗血清でプローブし、ＥＣＬウェスタンブロット検定試薬（Am
ersham）を用いて伸展させた。クローンを、カスパーゼ９-ＤＮ高並びに低発現
のクローン（クローン２及び１４）をさらに特徴付けするために選択した。Ｆｉ
ｇ．２参照。
【００４３】
スタウロスポリンでのアポトーシスの誘発：カスパーゼ９-ＤＮを（それぞれ
）高及び低レゲルで発現するクローン２及び１４をスピナーの無血清培地での増
殖に適合させた。クローンをスピナーに１００万細胞／ｍｌで播種し、アポトー
シス誘発剤、スタウロスポリン（Sigma）を最終濃度１ｕＭで添加した。等分し
た培地はいくつかのアッセイにより：アポトーシス細胞の％を測定するためのア
ネキシン／ＰＩ（Chemicon）及び製造者の使用説明に従うカスパーゼ３活性（Cl
ontech）によりアポトーシスの分析をした。Ｆｉｇ．３及び４参照。 ２リットルのバイオリアクターの生存度におけるカスパーゼ９-ＤＮ発現の効
果：無血清に適合した、カスパーゼ９-ＤＮ発現クローン２及び１４、ベクター
コントロール及び非形質転換Ｅ２５細胞をスケールアップし、２リットルのバイ
オリアクターに１００万細胞／ｍｌで播種した（ｎ＝２）。細胞培地を、組換え
ヒトインシュリン及び微量元素を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基礎と
した培地である。細胞を３７℃、２７５ｒｐｍの撹拌設定で増殖した。ｐＨを７
．２に維持し、実験の間、自動的に調節した。バイオリアクターを酸素と空気の
混合物でスパージした。これは、治療用タンパク質の大量生産の間の条件を真似
たモデルシステムである。
）高及び低レゲルで発現するクローン２及び１４をスピナーの無血清培地での増
殖に適合させた。クローンをスピナーに１００万細胞／ｍｌで播種し、アポトー
シス誘発剤、スタウロスポリン（Sigma）を最終濃度１ｕＭで添加した。等分し
た培地はいくつかのアッセイにより：アポトーシス細胞の％を測定するためのア
ネキシン／ＰＩ（Chemicon）及び製造者の使用説明に従うカスパーゼ３活性（Cl
ontech）によりアポトーシスの分析をした。Ｆｉｇ．３及び４参照。 ２リットルのバイオリアクターの生存度におけるカスパーゼ９-ＤＮ発現の効
果：無血清に適合した、カスパーゼ９-ＤＮ発現クローン２及び１４、ベクター
コントロール及び非形質転換Ｅ２５細胞をスケールアップし、２リットルのバイ
オリアクターに１００万細胞／ｍｌで播種した（ｎ＝２）。細胞培地を、組換え
ヒトインシュリン及び微量元素を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基礎と
した培地である。細胞を３７℃、２７５ｒｐｍの撹拌設定で増殖した。ｐＨを７
．２に維持し、実験の間、自動的に調節した。バイオリアクターを酸素と空気の
混合物でスパージした。これは、治療用タンパク質の大量生産の間の条件を真似
たモデルシステムである。
【００４４】
次のパラメータを測定するためにサンプルを毎日採った：細胞生存度、細胞濃
度、アポトーシス、カスパーゼ３活性、グルコース消費、重量モル浸透圧濃度、
乳酸産生及びＥ２５力価。Ｆｉｇ．５−８参照。 結果は、Ｅ２５を発現するＣＨＯ細胞でのカスパーゼ９の安定した発現を示す
。安定した発現は、結果的にアポトーシス誘発剤、スタウロスポリンに対する細
胞の耐性を生じる。耐性は、カスパーゼ９-ＤＮの発現レベルに比例する。バイ
オリアクターの環境で、高発現クローン１４は、生存度及び生存数の中程度の伸
びのみを示した低発現クローン２と比較して、細胞生存度及び生細胞数の劇的な
伸びを示した。生存度の延長は、コントロールと比較したクローン１４のカスパ
ーゼ３活性の遅れた開始に反映している。培地中に分泌されたＥ２５抗体の量の
アッセイで、意外な結果が得られた。カスパーゼ９-ＤＮクローン１４はクロー
ン２よりも優れたバイオリアクターでの生存度の延長を生じるが、クローン１４
は、対象とするタンパク質（Ｅ２５抗体）を少なく産生する。データは、アポト
ーシス阻害剤の高発現が同時に細胞死を遅延せず、及び対象とするタンパク質の
生産を増加しないことを示唆した。
度、アポトーシス、カスパーゼ３活性、グルコース消費、重量モル浸透圧濃度、
乳酸産生及びＥ２５力価。Ｆｉｇ．５−８参照。 結果は、Ｅ２５を発現するＣＨＯ細胞でのカスパーゼ９の安定した発現を示す
。安定した発現は、結果的にアポトーシス誘発剤、スタウロスポリンに対する細
胞の耐性を生じる。耐性は、カスパーゼ９-ＤＮの発現レベルに比例する。バイ
オリアクターの環境で、高発現クローン１４は、生存度及び生存数の中程度の伸
びのみを示した低発現クローン２と比較して、細胞生存度及び生細胞数の劇的な
伸びを示した。生存度の延長は、コントロールと比較したクローン１４のカスパ
ーゼ３活性の遅れた開始に反映している。培地中に分泌されたＥ２５抗体の量の
アッセイで、意外な結果が得られた。カスパーゼ９-ＤＮクローン１４はクロー
ン２よりも優れたバイオリアクターでの生存度の延長を生じるが、クローン１４
は、対象とするタンパク質（Ｅ２５抗体）を少なく産生する。データは、アポト
ーシス阻害剤の高発現が同時に細胞死を遅延せず、及び対象とするタンパク質の
生産を増加しないことを示唆した。
【００４５】
しかしながら、他の２リットルのバイオリアクターアッセイで、細胞培養を、
以下の変化：（１）カスパーゼ９発現クローン１４及びＥ２５コントロール細胞
を１００万細胞／ｍｌで蒔いた；及び（２）培地を無血清の、インシュリン及び
微量原子を有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基礎とした（培地の栄養供給を向
上させるために使用される）濃縮培地にしたことを除いて、上記するのと同様に
実施した。細胞培養物を３７℃で１時間増殖し、次いで温度を３３℃に変えた。
３日目、培養物のｐＨをｐＨ７．１５からｐＨ７．０に変え、最大の増殖を維持
するのに十分な栄養素を供給するために、培養物に濃縮したＤＭＥＭ／Ｈａｍ
Ｆ-１２、グルコース及びタンパク質加水分解培地をフィーディングした。 結果をＦｉｇ．１７及び１８に示した。グラフに示されるように、カスパーゼ
９-ＤＮ発現は、結果的に生存度の延長と生細胞濃度の増加、並びにコントロー
ルに比較した対象とするタンパク質（Ｅ２５抗体）の高い力価を生じた。栄養素
の限定の無い流加式培養の条件下において、データは、生存度の増加及び生細胞
濃度の増加が、生産物の力価の顕著な増大が伴うことを示した。
以下の変化：（１）カスパーゼ９発現クローン１４及びＥ２５コントロール細胞
を１００万細胞／ｍｌで蒔いた；及び（２）培地を無血清の、インシュリン及び
微量原子を有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基礎とした（培地の栄養供給を向
上させるために使用される）濃縮培地にしたことを除いて、上記するのと同様に
実施した。細胞培養物を３７℃で１時間増殖し、次いで温度を３３℃に変えた。
３日目、培養物のｐＨをｐＨ７．１５からｐＨ７．０に変え、最大の増殖を維持
するのに十分な栄養素を供給するために、培養物に濃縮したＤＭＥＭ／Ｈａｍ
Ｆ-１２、グルコース及びタンパク質加水分解培地をフィーディングした。 結果をＦｉｇ．１７及び１８に示した。グラフに示されるように、カスパーゼ
９-ＤＮ発現は、結果的に生存度の延長と生細胞濃度の増加、並びにコントロー
ルに比較した対象とするタンパク質（Ｅ２５抗体）の高い力価を生じた。栄養素
の限定の無い流加式培養の条件下において、データは、生存度の増加及び生細胞
濃度の増加が、生産物の力価の顕著な増大が伴うことを示した。
【００４６】
実施例３
カスパーゼ阻害剤ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋのアポトーシスへの効果
懸濁液で増殖したＣＨＯ（ｄｈｆｒ＋）細胞を、６０ｍｍの組織培養皿に１０
０万細胞／ｍｌで蒔いた。細胞培地を、組換えヒトインシュリンと微量元素を含
む無血清培地ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基礎とした培地とした。０日目の培養
物の生存度は、９６％であった。２つのプレートをトリパンブルー排除により生
存度を、アネキシン／ＰＩ結合（Clontech）により生細胞濃度をそれぞれの日に
分析した。実験は１０日間実施した。カスパーゼの化学阻害剤、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍ
ｋ（Enzyme Systems Products）を１００ｍＭ（１０００ｘ）ストックするため
にＤＭＳＯに溶解し、４ｕｌを４ｍｌの培養物を含む６０ｍｍ皿に添加した。阻
害剤を、実験の開始から４８時間後（アポトーシスの始まる前に）に添加し、新
しい等分したｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ阻害剤を２４時間後とに添加した。コントロール
は、何の添加もしない培養と、ＤＭＳＯのみを添加した培養にした。 結果は、Ｆｉｇ．９−１０に示す。 化学的化合物、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ、は、カスパーゼ阻害剤であり、１００ｕＭ
の濃度で培養物に加えたとき、カスパーゼ３活性の抑制及び細胞生存度の延長を
生じた。
０万細胞／ｍｌで蒔いた。細胞培地を、組換えヒトインシュリンと微量元素を含
む無血清培地ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基礎とした培地とした。０日目の培養
物の生存度は、９６％であった。２つのプレートをトリパンブルー排除により生
存度を、アネキシン／ＰＩ結合（Clontech）により生細胞濃度をそれぞれの日に
分析した。実験は１０日間実施した。カスパーゼの化学阻害剤、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍ
ｋ（Enzyme Systems Products）を１００ｍＭ（１０００ｘ）ストックするため
にＤＭＳＯに溶解し、４ｕｌを４ｍｌの培養物を含む６０ｍｍ皿に添加した。阻
害剤を、実験の開始から４８時間後（アポトーシスの始まる前に）に添加し、新
しい等分したｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ阻害剤を２４時間後とに添加した。コントロール
は、何の添加もしない培養と、ＤＭＳＯのみを添加した培養にした。 結果は、Ｆｉｇ．９−１０に示す。 化学的化合物、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ、は、カスパーゼ阻害剤であり、１００ｕＭ
の濃度で培養物に加えたとき、カスパーゼ３活性の抑制及び細胞生存度の延長を
生じた。
【００４７】
実施例４
ＣＨＯ細胞でのバキュロウィルスｐ３５の発現
発現構築：バキュロウィルスｐ３５ｃＤＮＡ（Beidler, D.ら, J. Biol. Chem
istry, 270, 16526-16528(1995); Clem, R. J. ら, Science, 254, 1388-1390(1
991)）を次のように：２ｕｇのＣＰＣベクター（Genentech, Inc.）を３７℃で
２時間、高バッファー（Boehringer Mannheim）に７ＵのＥｃｏＲＩと７ＵのＸ
ｂａＩを含有する２５ｕｌでの消化により直線化して、ＣＰＣスプライスドナー
ベクターにｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）からサブクローニングした。バ
キュロウィルスｐ３５ｃＤＮＡを、同じ制限酵素でｐｃＤＮＡ３ベクター（Invi
trogen）から切り取った。等分した各反応物を、臭化エチジウムを含む１％のア
ガロースゲルでの電気泳動により分析した。直線化したＣＰＣベクター（９．７
ｋｂｐ）及びｐ３５ｃＤＮＡ（０．９ｋｂｐ）に対応するバンドをゲルから取り
出し、GeneClean（Bio 101, Inc.）を用いて、製造者の使用説明に従って単離し
た。 ライゲーション：５０ｎｇのベクター及び２５ｎｇのｐ３５ｃＤＮＡを、全反
応物量２０ｕｌ中の１０ｕｌのＴ４ライゲーションバッファー、及び１ｕｌのＴ
４ＤＮＡリガーゼ（Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim）と混合し
た。反応物は室温で５分間インキュベートした。
istry, 270, 16526-16528(1995); Clem, R. J. ら, Science, 254, 1388-1390(1
991)）を次のように：２ｕｇのＣＰＣベクター（Genentech, Inc.）を３７℃で
２時間、高バッファー（Boehringer Mannheim）に７ＵのＥｃｏＲＩと７ＵのＸ
ｂａＩを含有する２５ｕｌでの消化により直線化して、ＣＰＣスプライスドナー
ベクターにｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）からサブクローニングした。バ
キュロウィルスｐ３５ｃＤＮＡを、同じ制限酵素でｐｃＤＮＡ３ベクター（Invi
trogen）から切り取った。等分した各反応物を、臭化エチジウムを含む１％のア
ガロースゲルでの電気泳動により分析した。直線化したＣＰＣベクター（９．７
ｋｂｐ）及びｐ３５ｃＤＮＡ（０．９ｋｂｐ）に対応するバンドをゲルから取り
出し、GeneClean（Bio 101, Inc.）を用いて、製造者の使用説明に従って単離し
た。 ライゲーション：５０ｎｇのベクター及び２５ｎｇのｐ３５ｃＤＮＡを、全反
応物量２０ｕｌ中の１０ｕｌのＴ４ライゲーションバッファー、及び１ｕｌのＴ
４ＤＮＡリガーゼ（Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim）と混合し
た。反応物は室温で５分間インキュベートした。
【００４８】
形質転換：１００ｕｌの最大効力のＤＨ５ａｌｆａ適格細胞（Boehringer Man
nheim）を２ｕｌのライゲーション混合物と混合し、氷上で３０分間インキュベ
ートした。細胞に４２℃で４５秒間、熱ショックを与え、その後に氷上で２分間
インキュベーションした。０．９ｍｌのＬＢ培地を細胞に添加し、３７℃で１時
間、撹拌しながらインキュベートした。１００ｕｌの形質転換細胞をカルベニシ
リンを含有するＬＢ寒天培地に蒔いた。４つのクローンを無作為に選び取り、４
ｍｌのＬＢ＋カルベニシリンで一晩増殖させた。プラスミドをQIAprep Spin Min
iprep Kit（Qiagen）を用いて、製造所の使用説明に従いこれらのコロニーから
単離した。単離したプラスミドを、正しい構築物を認知するために分析的な消化
にかけた。 ＣＨＯ細胞でのバキュロウィルスｐ３５の発現：２％のウシ胎児血清（Gibco
）、組換えヒトインシュリン及び微量元素を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ培地で増殖し
たＣＨＯ（ｄｈｆｒ＋）細胞を、２００万細胞／１００ｍ組織培養皿で形質移入
の４８時間前に蒔いた。LipofectAMINEプラス試薬（Gibco BRL）をトランスフェ
クションに使用し、製造者の使用説明に従って実施した。ＣＨＯ細胞をｐ３５／
ＣＰＣ構築物と、コントロールとしてＣＰＣベクターのみで形質移入した。各タ
イプの１つの形質転換プレートを、一過性形質移入体でのｐ３５発現のレベルを
アッセイするためにトランスフェクションのの値２４時間後に回収した（１：１
０００希釈での抗ｐ３５ウサギポリクローナル血清を用いたウェスタンブロット
）。他の形質移入プレートをさらに増殖し、淘汰圧（５ｕｇ／ｍｌプロマイシン
）をトランスフェクションの４８時間後に用いた。約２週間後、プロマイシンに
対するコロニー耐性が発達し、無血清増殖に適合し、更なる分析のためにスケー
ルアップした。
nheim）を２ｕｌのライゲーション混合物と混合し、氷上で３０分間インキュベ
ートした。細胞に４２℃で４５秒間、熱ショックを与え、その後に氷上で２分間
インキュベーションした。０．９ｍｌのＬＢ培地を細胞に添加し、３７℃で１時
間、撹拌しながらインキュベートした。１００ｕｌの形質転換細胞をカルベニシ
リンを含有するＬＢ寒天培地に蒔いた。４つのクローンを無作為に選び取り、４
ｍｌのＬＢ＋カルベニシリンで一晩増殖させた。プラスミドをQIAprep Spin Min
iprep Kit（Qiagen）を用いて、製造所の使用説明に従いこれらのコロニーから
単離した。単離したプラスミドを、正しい構築物を認知するために分析的な消化
にかけた。 ＣＨＯ細胞でのバキュロウィルスｐ３５の発現：２％のウシ胎児血清（Gibco
）、組換えヒトインシュリン及び微量元素を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ培地で増殖し
たＣＨＯ（ｄｈｆｒ＋）細胞を、２００万細胞／１００ｍ組織培養皿で形質移入
の４８時間前に蒔いた。LipofectAMINEプラス試薬（Gibco BRL）をトランスフェ
クションに使用し、製造者の使用説明に従って実施した。ＣＨＯ細胞をｐ３５／
ＣＰＣ構築物と、コントロールとしてＣＰＣベクターのみで形質移入した。各タ
イプの１つの形質転換プレートを、一過性形質移入体でのｐ３５発現のレベルを
アッセイするためにトランスフェクションのの値２４時間後に回収した（１：１
０００希釈での抗ｐ３５ウサギポリクローナル血清を用いたウェスタンブロット
）。他の形質移入プレートをさらに増殖し、淘汰圧（５ｕｇ／ｍｌプロマイシン
）をトランスフェクションの４８時間後に用いた。約２週間後、プロマイシンに
対するコロニー耐性が発達し、無血清増殖に適合し、更なる分析のためにスケー
ルアップした。
【００４９】
２リットルのバイオリアクターでの生存度へのｐ３５発現の効果：ｐ３５及び
ベクターコントロールを発現する無血清適合クローンをスケールアップし、２リ
ットルのバイオリアクターに１００万細胞／ｍｌで蒔いた（ｎ＝２）。細胞培地
を組換えヒトインシュリン及び微量元素を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２
を基礎とした培地とした。細胞を３７℃、２７５ｒｐｍの撹拌設定で増殖した。
ｐＨを７．２に維持し、実験の間、自動的に調節した。バイオリアクターを酸素
と空気の混合物でスパージした。これは、治療用タンパク質の大量生産の間の条
件を真似たモデルシステムである。次のパラメータを測定するためにサンプルを
毎日採った：細胞生存度、細胞濃度、アポトーシス、カスパーゼ３活性、グルコ
ース消費、重量モル浸透圧濃度及び乳酸産生。 結果は、Ｆｉｇ．１１−１２に示す。 結果は、アポトーシス阻害剤、バキュロウィルスｐ３５が、ＣＨＯ細胞で発現
した場合にバイオリアクターの環境中の生存度の延長を引き起こすことを示す。
ベクターコントロールを発現する無血清適合クローンをスケールアップし、２リ
ットルのバイオリアクターに１００万細胞／ｍｌで蒔いた（ｎ＝２）。細胞培地
を組換えヒトインシュリン及び微量元素を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２
を基礎とした培地とした。細胞を３７℃、２７５ｒｐｍの撹拌設定で増殖した。
ｐＨを７．２に維持し、実験の間、自動的に調節した。バイオリアクターを酸素
と空気の混合物でスパージした。これは、治療用タンパク質の大量生産の間の条
件を真似たモデルシステムである。次のパラメータを測定するためにサンプルを
毎日採った：細胞生存度、細胞濃度、アポトーシス、カスパーゼ３活性、グルコ
ース消費、重量モル浸透圧濃度及び乳酸産生。 結果は、Ｆｉｇ．１１−１２に示す。 結果は、アポトーシス阻害剤、バキュロウィルスｐ３５が、ＣＨＯ細胞で発現
した場合にバイオリアクターの環境中の生存度の延長を引き起こすことを示す。
【００５０】
実施例５
カスパーゼ９-ＤＮを用いた増加したトランスフェクション効率及び一過性トラ
ンスフェクションでのＥ２５抗体の発現 無血清適合ＣＨＯ ＤＰ１２細胞を、いくつかの成分濃度を修正し、組換えヒ
トインシュリン、微量元素及び血清を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ-１２を基礎とし
た培地の未処理の１２穴組織培養プレートに１，５００万細胞／ｍｌで蒔いた。
トランスフェクションをＤＭＲＩＥ-Ｃ（Gibco BRL）を用いて、製造者の使用説
明に従って実施した。カスパーゼ９-ＤＮ発現クローン１４を、ＣＨＯ ＤＰ１２
細胞及びＥ２５細胞（ＣＨＯ ＤＰ１２、Ｅ２５を発現）であるコントロールの
次に形質移入した。 レッドシフトしたＧＦＰ発現ベクター（Quantum Biotechnologies Inc.）をＤ
Ｎａｓｅ発現ベクターとともに形質移入した[Shak, S.ら, (1990), Proc Natl.
Acad. Sci USA, 87:9188-9192]。トランスフェクションの２４時間後、プロピジ
ウムヨウ素を等分した培養物に加え、生存トランスフェクション効率をFACSCali
bur（Becton Dickinson）でのフローサイトメトリーで分析した。トランスフェ
クションの５日後、培地のサンプルをＥＬＩＳＡを用いたＤＮａｓｅ力価分析に
かけた。 データは、トランスフェクション試薬、我々の実験ではＤＭＲＩＥ-Ｃが、高
い濃度（約６ｕｌ）で使用された時に細胞に毒性を与えうることを示す（Ｆｉｇ
．１３）。Ｆｉｇ．１４では、カスパーゼ９-ＤＮクローン１４が、（試験した
ＤＭＲＩＥの全ての濃度において）コントロールより高い全体及び生存トランス
フェクション効率を示す。クローン１４のトランスフェクション効率はトランス
フェクション試薬の量とともに増加し、濃縮した両コントロールでは既にトラン
スフェクション効率の減少を示し始める、１２ｕｌのＤＭＲＩＥ-Ｃで最大に達
する。クローン１４のトランスフェクション効率は、ここで試験した量のＤＭＲ
ＩＥ-Ｃよりも多く使用される時にさらに増大する可能性がある。クローン１４
のトランスフェクション効率の増大は、培養物の特定の生産性（ＤＮａｓｅ力価
／全ＬＤＨ）に反映し、ＤＮａｓｅ力価では（Ｆｉｇ．１５、１６）、両方とも
コントロールに比較して４倍にまで増加した。
ンスフェクションでのＥ２５抗体の発現 無血清適合ＣＨＯ ＤＰ１２細胞を、いくつかの成分濃度を修正し、組換えヒ
トインシュリン、微量元素及び血清を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ-１２を基礎とし
た培地の未処理の１２穴組織培養プレートに１，５００万細胞／ｍｌで蒔いた。
トランスフェクションをＤＭＲＩＥ-Ｃ（Gibco BRL）を用いて、製造者の使用説
明に従って実施した。カスパーゼ９-ＤＮ発現クローン１４を、ＣＨＯ ＤＰ１２
細胞及びＥ２５細胞（ＣＨＯ ＤＰ１２、Ｅ２５を発現）であるコントロールの
次に形質移入した。 レッドシフトしたＧＦＰ発現ベクター（Quantum Biotechnologies Inc.）をＤ
Ｎａｓｅ発現ベクターとともに形質移入した[Shak, S.ら, (1990), Proc Natl.
Acad. Sci USA, 87:9188-9192]。トランスフェクションの２４時間後、プロピジ
ウムヨウ素を等分した培養物に加え、生存トランスフェクション効率をFACSCali
bur（Becton Dickinson）でのフローサイトメトリーで分析した。トランスフェ
クションの５日後、培地のサンプルをＥＬＩＳＡを用いたＤＮａｓｅ力価分析に
かけた。 データは、トランスフェクション試薬、我々の実験ではＤＭＲＩＥ-Ｃが、高
い濃度（約６ｕｌ）で使用された時に細胞に毒性を与えうることを示す（Ｆｉｇ
．１３）。Ｆｉｇ．１４では、カスパーゼ９-ＤＮクローン１４が、（試験した
ＤＭＲＩＥの全ての濃度において）コントロールより高い全体及び生存トランス
フェクション効率を示す。クローン１４のトランスフェクション効率はトランス
フェクション試薬の量とともに増加し、濃縮した両コントロールでは既にトラン
スフェクション効率の減少を示し始める、１２ｕｌのＤＭＲＩＥ-Ｃで最大に達
する。クローン１４のトランスフェクション効率は、ここで試験した量のＤＭＲ
ＩＥ-Ｃよりも多く使用される時にさらに増大する可能性がある。クローン１４
のトランスフェクション効率の増大は、培養物の特定の生産性（ＤＮａｓｅ力価
／全ＬＤＨ）に反映し、ＤＮａｓｅ力価では（Ｆｉｇ．１５、１６）、両方とも
コントロールに比較して４倍にまで増加した。
【００５１】
実施例６
凍結培地の解凍後の生存度及び生細胞数へのカスパーゼ９-ＤＮの効果
２ｘ１０６細胞のカスパーゼ９-ＤＮ発現クローン１４及びＥ２５コントロー
ル細胞を、凍結用培地（修正したＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２中、１ｇ／Ｌのメチ
ルセルロース及び１０％ＤＭＳＯ）で凍結し、−８０℃で長期間保存した。実験
の日に凍結細胞のバイアルを冷凍庫から取り出し、３７℃で解凍して、先に温め
ておいた成長培地（修正したＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２）とともにスピナーに添
加した。細胞を８日間培養し、生存度及び生細胞濃度を分析した。 結果はＦｉｇ．１９及び２０に示す。結果は、カスパーゼ９-ＤＮ発現細胞が
コントロールＥ２５細胞よりも高い生存度及び生細胞数を維持したことを示す。
従って、ＣＨＯ細胞でのカスパーゼ９-ＤＮの発現が、凍結細胞培養物を解凍し
たときの生存度及び生細胞濃度に有利な効果があった。
ル細胞を、凍結用培地（修正したＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２中、１ｇ／Ｌのメチ
ルセルロース及び１０％ＤＭＳＯ）で凍結し、−８０℃で長期間保存した。実験
の日に凍結細胞のバイアルを冷凍庫から取り出し、３７℃で解凍して、先に温め
ておいた成長培地（修正したＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２）とともにスピナーに添
加した。細胞を８日間培養し、生存度及び生細胞濃度を分析した。 結果はＦｉｇ．１９及び２０に示す。結果は、カスパーゼ９-ＤＮ発現細胞が
コントロールＥ２５細胞よりも高い生存度及び生細胞数を維持したことを示す。
従って、ＣＨＯ細胞でのカスパーゼ９-ＤＮの発現が、凍結細胞培養物を解凍し
たときの生存度及び生細胞濃度に有利な効果があった。
【００５２】
実施例７
カスパーゼ９-ＤＮ発現細胞はブチラートに対する耐性を示す
次の研究は、カスパーゼ９-ＤＮ発現がブチラートの潜在的に不利な効果に対
する細胞の耐性に影響するかどうかを検査するために行なわれた。 カスパーゼ９-ＤＮ発現クローン１４及びＥ２５コントロール細胞を６０ｍｍ
組織培養皿に１ｘ１０６細胞／ｍｌで蒔いた。各皿には４ｍｌの培地が入ってい
た。培養物をインシュリンと微量元素を有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基礎
とした濃縮培地で３７℃で増殖した。培養物を２日目に３３℃に温度変化させ、
ブチラートを様々な最終濃度（０、１、２、３、５、１０ｍＭ）で３日目に加え
た（ｎ＝２）。培養物の生存度及び力価を毎日アッセイした。 結果をＦｉｇ．２１及び２２に示す。結果は、Ｅ２５コントロール細胞がカス
パーゼ９-ＤＮ発現細胞よりも早く生存度が低下することを示した（Ｆｉｇ．２
１参照、７日目及び９日目）。これは対象とするタンパク質の力価に反映する。
Ｆｉｇ．２２に示した力価は、カスパーゼ９-ＤＮ細胞が培養物への０ブチラー
ト添加よりも１、２、３、及び５ｍＭのブチラートで高い力価を与えたこと枝を
示した。言い換えると、Ｅ２５コントロールの力価は１及び２ｍＭのブチラート
のみで改善した。結果は、カスパーゼ９-ＤＮ発現がブチラートの不利な影響か
ら細胞を保護し、生存度を延ばし、高い力価を生じさせることができた。
する細胞の耐性に影響するかどうかを検査するために行なわれた。 カスパーゼ９-ＤＮ発現クローン１４及びＥ２５コントロール細胞を６０ｍｍ
組織培養皿に１ｘ１０６細胞／ｍｌで蒔いた。各皿には４ｍｌの培地が入ってい
た。培養物をインシュリンと微量元素を有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ-１２を基礎
とした濃縮培地で３７℃で増殖した。培養物を２日目に３３℃に温度変化させ、
ブチラートを様々な最終濃度（０、１、２、３、５、１０ｍＭ）で３日目に加え
た（ｎ＝２）。培養物の生存度及び力価を毎日アッセイした。 結果をＦｉｇ．２１及び２２に示す。結果は、Ｅ２５コントロール細胞がカス
パーゼ９-ＤＮ発現細胞よりも早く生存度が低下することを示した（Ｆｉｇ．２
１参照、７日目及び９日目）。これは対象とするタンパク質の力価に反映する。
Ｆｉｇ．２２に示した力価は、カスパーゼ９-ＤＮ細胞が培養物への０ブチラー
ト添加よりも１、２、３、及び５ｍＭのブチラートで高い力価を与えたこと枝を
示した。言い換えると、Ｅ２５コントロールの力価は１及び２ｍＭのブチラート
のみで改善した。結果は、カスパーゼ９-ＤＮ発現がブチラートの不利な影響か
ら細胞を保護し、生存度を延ばし、高い力価を生じさせることができた。
【Ｆｉｇ．１Ａ】 ２リットルのバイオリアクターで増殖したＣＨＯ細胞の
細胞生存度を表すグラフを示す。データは、バイオリアクターで増殖した細胞が
３日という早さで生存度が減少し始めうることを示し、続いてしばしば次の日の
生存度が劇的に落ち込む。
細胞生存度を表すグラフを示す。データは、バイオリアクターで増殖した細胞が
３日という早さで生存度が減少し始めうることを示し、続いてしばしば次の日の
生存度が劇的に落ち込む。
【Ｆｉｇ．１Ｂ】 ＣＨＯ細胞（Ｆｉｇ．１Ａ及び実施例１で言及される）
で実施される３つのアポトーシスアッセイ：カスパーゼ３活性、ＤＮＡ断片化及
びアネキシン／ＰＩ結合（原形質膜（「ＰＭ」）の変化）の結果を表すグラフを
示す。カスパーゼの活性は３日目、生存度の落ち込みが検出された日（Ｆｉｇ．
１Ａ）に初めて検出された。
で実施される３つのアポトーシスアッセイ：カスパーゼ３活性、ＤＮＡ断片化及
びアネキシン／ＰＩ結合（原形質膜（「ＰＭ」）の変化）の結果を表すグラフを
示す。カスパーゼの活性は３日目、生存度の落ち込みが検出された日（Ｆｉｇ．
１Ａ）に初めて検出された。
【Ｆｉｇ．２】 カスパーゼ９-ＤＮ形質移入クローンのライセートのウェ
スタンブロット分析を示す。ｍｐｓｖベクター（単独）で形質移入したクローン
をコントロールとして使用した。ブロットをウサギ抗カスパーゼ９抗血清（Phar
mingen）でプローブし、化学発光を用いて分析した。
スタンブロット分析を示す。ｍｐｓｖベクター（単独）で形質移入したクローン
をコントロールとして使用した。ブロットをウサギ抗カスパーゼ９抗血清（Phar
mingen）でプローブし、化学発光を用いて分析した。
【Ｆｉｇ．３】 カスパーゼ９-ＤＮクローン２及び１４、並びにコントロ
ール（Ｅ２５形質移入していない細胞及びｍｐｓｖベクター形質移入細胞）がア
ポトーシス誘発剤、スタウロスポリン（１マイクロモル）とインキュベートした
分析の結果を示す。サンプルを採り、細胞の生細胞の％を分析した。
ール（Ｅ２５形質移入していない細胞及びｍｐｓｖベクター形質移入細胞）がア
ポトーシス誘発剤、スタウロスポリン（１マイクロモル）とインキュベートした
分析の結果を示す。サンプルを採り、細胞の生細胞の％を分析した。
【Ｆｉｇ．４】 １マイクロモルのスタウロスポリンでの誘発の２４時間後
に得られた細胞サンプルのカスパーゼ３活性の分析を示す。
に得られた細胞サンプルのカスパーゼ３活性の分析を示す。
【Ｆｉｇ．５−８】 スケールアップし、２リットルのバイオリアクターに
１００万細胞／ｍｌで蒔いたカスパーゼ９-ＤＮ発現クローン２及び１４、並び
にコントロールのアッセイ結果を示す。毎日サンプルを採り、生存度（Ｆｉｇ．
５）、生細胞数（Ｆｉｇ．６）、カスパーゼ３の活性（Ｆｉｇ．７）及び培地に
分泌された対象とするタンパク質（Ｅ２５抗体）の濃度（Ｆｉｇ．８）を分析し
た。
１００万細胞／ｍｌで蒔いたカスパーゼ９-ＤＮ発現クローン２及び１４、並び
にコントロールのアッセイ結果を示す。毎日サンプルを採り、生存度（Ｆｉｇ．
５）、生細胞数（Ｆｉｇ．６）、カスパーゼ３の活性（Ｆｉｇ．７）及び培地に
分泌された対象とするタンパク質（Ｅ２５抗体）の濃度（Ｆｉｇ．８）を分析し
た。
【Ｆｉｇ．９−１０】 ＣＨＯ細胞を６０ｍｍ皿に播種し、カスパーゼ阻害
剤、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋに暴露した（１００マイクロモルの濃度で細胞培地に加え
た、播種の４８時間後）アッセイの結果を示す。ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ阻害剤をその
後２４時間毎に培地に加えた。毎日サンプルを採り、カスパーゼ３活性（Ｆｉｇ
．９）及び％生細胞（Ｆｉｇ．１０）を分析した。
剤、ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋに暴露した（１００マイクロモルの濃度で細胞培地に加え
た、播種の４８時間後）アッセイの結果を示す。ｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ阻害剤をその
後２４時間毎に培地に加えた。毎日サンプルを採り、カスパーゼ３活性（Ｆｉｇ
．９）及び％生細胞（Ｆｉｇ．１０）を分析した。
【Ｆｉｇ．１１−１２】 ２リットルのバイオリアクターで増殖したバキュ
ロウィルスｐ３５発現クローンのアッセイ結果を示し、細胞生存度（Ｆｉｇ．１
１）及びカスパーゼ３活性（Ｆｉｇ．１２）を毎日検定した。コントロールはベ
クター、ｃｐｃで形質移入したクローンである。
ロウィルスｐ３５発現クローンのアッセイ結果を示し、細胞生存度（Ｆｉｇ．１
１）及びカスパーゼ３活性（Ｆｉｇ．１２）を毎日検定した。コントロールはベ
クター、ｃｐｃで形質移入したクローンである。
【Ｆｉｇ．１３】 様々な濃度のトランスフェクション試薬、ＤＭＲＩＥ-
Ｃの細胞生存度における効果の棒グラフを示す。
Ｃの細胞生存度における効果の棒グラフを示す。
【Ｆｉｇ．１４】 カスパーゼ９-ＤＮクローン１４とコントロール、ＣＨ
Ｏ ＤＰ１２細胞とＥ２５抗体発現ＣＨＯ ＤＰ１２細胞について得られる、全体
及び生存トランスフェクション効率の比較を示す。
Ｏ ＤＰ１２細胞とＥ２５抗体発現ＣＨＯ ＤＰ１２細胞について得られる、全体
及び生存トランスフェクション効率の比較を示す。
【Ｆｉｇ．１５】 カスパーゼ９-ＤＮクローン１４とコントロール、ＣＨ
Ｏ ＤＰ１２細胞及びＥ２５抗体発現ＣＨＯ ＤＰ１２細胞について得られる特定
の生産性（ＤＮａｓｅ力価／全体ＬＤＨ）の比較を示す。
Ｏ ＤＰ１２細胞及びＥ２５抗体発現ＣＨＯ ＤＰ１２細胞について得られる特定
の生産性（ＤＮａｓｅ力価／全体ＬＤＨ）の比較を示す。
【Ｆｉｇ．１６】 カスパーゼ９-ＤＮクローン１４とコントロール、ＣＨ
Ｏ ＤＰ１２細胞及びＥ２５抗体発現ＣＨＯ ＤＰ１２細胞について得られたＤＮ
ａｓｅ力価の比較を示す。
Ｏ ＤＰ１２細胞及びＥ２５抗体発現ＣＨＯ ＤＰ１２細胞について得られたＤＮ
ａｓｅ力価の比較を示す。
【Ｆｉｇ．１７及び１８】 温度変化、濃縮培地及び栄養を有する２リット
ルのバイオリアクターで増殖したカスパーゼ９-ＤＮ及びＥ２５コントロールの
生存度及び力価を示す。
ルのバイオリアクターで増殖したカスパーゼ９-ＤＮ及びＥ２５コントロールの
生存度及び力価を示す。
【Ｆｉｇ．１９及び２０】 冷凍バイアルからスピナーに播種したＥ２５コ
ントロール及びカスパーゼ９-ＤＮクローン１４の培地生存度及び生細胞数を示
す。データはトリパンブルー排除により得た。
ントロール及びカスパーゼ９-ＤＮクローン１４の培地生存度及び生細胞数を示
す。データはトリパンブルー排除により得た。
【Ｆｉｇ．２１及び２２】 ブチラートによる発現の誘発におけるＥ２５コ
ントロール細胞及びカスパーゼ９-ＤＮクローン１４の生存度及びＥ２５力価を
示す。
ントロール細胞及びカスパーゼ９-ＤＮクローン１４の生存度及びＥ２５力価を
示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，
ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 バン デ ゴール，ジェイナ．
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404，
フォスター シティ，セイント トーマス
レーン 512
(72)発明者 ハミルトン，ロバート，ダブリュ
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94070，
サン カルロス，ベイビュー ドライブ
11
(72)発明者 ディクスィット，ヴィッシュド
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94022，
ロス アルトス ヒルズ，シェイディー
オークス コート 26750
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 DA02 DA06 FA20
GA11 HA20
4B064 AG01 CA02 CA10 CC03 CC24
CD30
4B065 AA26X AA91X AB01 AC14
BA02 BB40
4C084 AA06 BA44 DA01 DB01 DC01
ZC01
4H045 AA20 FA72 FA74
Claims (37)
- 【請求項１】 一又は複数のアポトーシス阻害剤を用いた組換えタンパク質
の作成の方法であって、 （ａ）アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含むベクターの提供、 （ｂ）対象とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの提供、 （ｃ）宿主細胞の提供、 （ｄ）工程（ａ）及び（ｂ）のベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、 （ｅ）細胞培地の提供、 （ｆ）対象とするタンパク質及びアポトーシス阻害剤を発現するのに十分な条件
下の細胞培地での形質転換又は形質移入した宿主細胞の培養、及び場合によって
は （ｇ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象とするタンパク質の回収又は精製
、 の工程を含む方法。 - 【請求項２】 工程（ｅ）又は（ｆ）の細胞培地に更なるアポトーシス阻害
剤を混合する工程をさらに含む、請求項１の方法。 - 【請求項３】 工程（ａ）のベクター及び工程（ｂ）のベクターが同じベク
ターである、請求項１の方法。 - 【請求項４】 工程（ａ）及び（ｂ）のベクターが２つの別々のベクターで
ある、請求項１の方法。 - 【請求項５】 工程（ａ）及び（ｂ）のベクターが異なる抗生物質耐性選択
マーカーである、請求項４の方法。 - 【請求項６】 宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１の方法。
- 【請求項７】 宿主細胞が大腸菌である、請求項１の方法。
- 【請求項８】 工程（ａ）のアポトーシス阻害遺伝子がカスパーゼ９ドミナ
ントネガティブタンパク質又はバキュロウィルスｐ３５をコードする、請求項１
の方法。 - 【請求項９】 宿主細胞を対象とするタンパク質の一過性発現のための条件
下で培養する、請求項１の方法。 - 【請求項１０】 対象とするタンパク質が哺乳動物又は非哺乳動物細胞のア
ポトーシスを誘発する能力のあるタンパク質である、請求項１の方法。 - 【請求項１１】 前記細胞培地が無血清培地である、請求項１の方法。
- 【請求項１２】 前記細胞培地がブチラートを含む、請求項１の方法。
- 【請求項１３】 工程（ｆ）の後に、宿主細胞及び／又は細胞培地を凍結し
、続いて解凍する、請求項１の方法。 - 【請求項１４】 一又は複数のアポトーシス阻害剤を用いた組換えタンパク
質の作成の方法であって、 （ａ）対象とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの提供、 （ｂ）アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含む宿主細胞の提供、 （ｃ）工程（ａ）のベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、 （ｄ）細胞培地の提供、 （ｅ）対象とするタンパク質及びアポトーシス阻害剤を発現するのに十分な条件
下の細胞培地での、形質転換又は形質移入した宿主細胞の培養、及び場合によっ
ては （ｆ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象とするタンパク質の回収又は精製
、 の工程を含む方法。 - 【請求項１５】 アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子が宿主細胞のゲノ
ムに安定して組み込まれている、請求項１４の方法。 - 【請求項１６】 工程（ｄ）又は（ｅ）の細胞培地に更なるアポトーシス阻
害分子を混合する工程をさらに含む、請求項１４の方法。 - 【請求項１７】 宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１４の方法。
- 【請求項１８】 宿主細胞が大腸菌である、請求項１４の方法。
- 【請求項１９】 工程（ｂ）のアポトーシス阻害遺伝子がカスパーゼ９ドミ
ナントネガティブタンパク質又はバキュロウィルスｐ３５をコードする、請求項
１４の方法。 - 【請求項２０】 前記細胞培地がブチラートを含む、請求項１４の方法。
- 【請求項２１】 工程（ｅ）の後に、宿主細胞及び／又は細胞培地を凍結し
、続いて解凍する、請求項１４の方法。 - 【請求項２２】 一又は複数のアポトーシス阻害剤を用いた組換えタンパク
質の作成の方法であって、 ａ）対象とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの提供、 ｂ）宿主細胞の提供、 ｃ）工程（ａ）のベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、 ｄ）細胞培地の提供、 ｅ）アポトーシス阻害剤の提供、 ｆ）細胞培地へのアポトーシス阻害剤の混合、 ｇ）対象とするタンパク質を発現するのに十分な条件下の細胞培地での宿主細胞
の培養、及び場合によっては ｈ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象とするタンパク質の回収又は精製、
の工程を含む方法。 - 【請求項２３】 宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２２の方法。
- 【請求項２４】 アポトーシス阻害剤が有機又は無機分子を含む、請求項２
２の方法。 - 【請求項２５】 アポトーシス阻害剤がｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋを含む、請求項２
４の方法。 - 【請求項２６】 工程（ｇ）の後に、宿主細胞及び／又は細胞培地を凍結し
、続いて解凍する、請求項２２の方法。 - 【請求項２７】 細胞培地で対象とするタンパク質を得る方法であって、 （ａ）カスパーゼ９ドミナントネガティブタンパク質及びバキュロウィルスｐ３
５からなる群から選択されるアポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含むベク
ターの提供、 （ｂ）対象とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの提供、 （ｃ）宿主細胞の提供、 （ｄ）工程（ａ）及び（ｂ）のベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、 （ｅ）細胞培地の提供、 （ｆ）対象とするタンパク質、及び対象とするタンパク質の産生を増加する効果
がある量のアポトーシス阻害剤を発現するのに十分な条件下の細胞培地での、形
質転換又は形質移入した宿主細胞の培養、及び場合によっては （ｇ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象とするタンパク質の回収又は精製
、 の工程を含む方法。 - 【請求項２８】 前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２７の方法。
- 【請求項２９】 前記細胞培地が無血清培地である、請求項２７の方法。
- 【請求項３０】 工程（ｆ）の後に、宿主細胞及び／又は細胞培地を凍結し
、続いて解凍する、請求項２７の方法。 - 【請求項３１】 細胞培地の宿主細胞生存度を延ばす方法であって、 （ａ）カスパーゼ９ドミナントネガティブタンパク質及びバキュロウィルスｐ３
５からなる群から選択されるアポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含むベク
ターの提供、 （ｂ）対象とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの提供、 （ｃ）宿主細胞の提供、 （ｄ）工程（ａ）及び（ｂ）のベクターでの宿主細胞の形質転換又は形質移入、 （ｅ）細胞培地の提供、 （ｆ）目的のタンパク質、及び細胞培養における宿主細胞の生存度を延ばすのに
効果のある量のアポトーシス阻害剤を発現するのに十分な条件下の細胞培地での
、形質転換又は形質移入した宿主細胞の培養、及び場合によっては （ｇ）宿主細胞及び／又は細胞培地からの対象とするタンパク質の回収又は精製
、 の工程を含む方法。 - 【請求項３２】 アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含むベクターが
誘導プロモーターを含む、請求項３１の方法。 - 【請求項３３】 請求項１の方法に従って生産された対象タンパク質を含む
組成物。 - 【請求項３４】 請求項１４の方法に従って生産された対象タンパク質を含
む組成物。 - 【請求項３５】 請求項２２の方法に従って生産された対象タンパク質を含
む組成物。 - 【請求項３６】 請求項２７の方法に従って生産された対象タンパク質を含
む組成物。 - 【請求項３７】 請求項３１の方法に従って生産された対象タンパク質を含
む組成物。
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