KR101452286B1 - Gdf5 발현 세포를 mtx 및 제오신이 포함된 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법 - Google Patents

Gdf5 발현 세포를 mtx 및 제오신이 포함된 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 GDF5 발현 세포를 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 MTX 및 제오신이 함유된 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 GDF5를 발현하는 세포를 단일클론으로 배양 및 대량 증식시키는 방법에 관한 것이다.

Description

GDF5 발현 세포를 MTX 및 제오신이 포함된 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법{METHOD FOR CULTURING CELL EXPRESSING GDF5 AS SINGLE CLONE IN SERUM FREE MEDIUM WITH MTX AND ZEOCIN}
본 발명은 GDF5 발현 세포를 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 MTX 및 제오신이 함유된 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 GDF5를 발현하는 세포를 단일클론으로 배양 및 대량 증식시키는 방법에 관한 것이다.
세포주를 개발하는 과정에는 형질도입 또는 MTX(methotrexate: 메토트렉세이트) 유전자 증폭과 같은 다양한 기법들이 사용되며, 이에 따라 특성이 다양한 세포들이 생성되거나 증식된다. 이 때, 여러가지 특성을 갖는 다양한 세포들이 혼재되어 있기 때문에, 상기 세포들 중에서 원하는 단백질을 발현하는 능력이 가장 높거나 세포 생존율, 세포수 등의 특성이 우수한 하나의 특정 세포를 선별하여 이를 대량 증식시키는 것이 요구된다. 이와 같이 하나의 단일 세포를 분리하여 단일클론으로 배양 및 증식시킬 수 있는 방법은 세포의 생존율 및 발현되는 단백질의 특성 등을 정확하게 확인하기 위하여 선행적으로 반드시 필요하다. 따라서, 원하는 세포를 단일클론으로 선별할 수 있는 방법을 개발하는 것은 당업계에 중요한 기술적 과제로 남아 있다.
본 발명에서는 GDF5 단백질과 이를 발현하는 성질이 우수한 세포가 가장 큰 관심대상이다. 상기 GDF5(Growth Differentiation Factor 5: 성장분화인자5)는 골 또는 연골의 발생학적 기능에 있어서 중요한 역할을 담당하는 골유도단백질 중 하나로서, 최근에 조직손상 또는 상처를 치료하기 위한 목적으로 그 중요성이 부각되고 있다.
CloneMedia-CHO 배지는 clone fix 기기와 함께 사용되는 젤 유형의 배지로서, 6-웰 플레이트에 적정수의 세포를 넣어 배양한 후, 항체반응을 통해 발현되는 형광의 강도로 기계가 picking하는 용도로 사용되던 배지이다. 그러나, 상기 배지와 함께 사용되는 clone fix와 같은 기기는 매우 고가(6억 이상)이며, 여기에 적용할 수 있는 GDF5에 대한 항체가 없다는 단점이 있다. 또한, 6-웰 플레이트에서 배양할 경우 육안에 의해 각 클론들의 식별은 가능하였지만, 기계를 사용하지 않고 단일클론으로 분리하는 것은 거의 불가능하였다.
또한, GDF5 단백질을 발현하는 세포를 배양할 수 있는 배지로서 CD OptiCHO 배지가 사용될 수 있다는 것이 알려져 있으며, 상기 배지는 GIBCO사에서 제품번호 12681-011로 시판되며, CD(Chemically Defined), PF(Protein Free) 또는 AOF(Animal Origin Free) 배지라고도 지칭된다. 이 배지에는 기본적으로 동물 세포가 생존하는데 필요한 소량의 필수요소만 첨가되어 있으며, L-글루타민은 함유되어 있지 않다. 상기 CD OptiCHO 배지는 CHO 세포의 배양 및 성장을 위해 사용되는 무혈청 배지이지만, 실제로는 혈청을 사용하지 않으면 하나의 단일 세포가 배양되지 않는다는 점이 확인되었다. 이 때, 배양배지에 동물에서 유래된 성분(예컨대, 혈청)이 함유되어 있다는 점 때문에 많은 문제점들이 발생한다. 예를 들어, 혈청을 포함하는 배양배지의 배양상청액으로부터 유래된 생성물을 정제하는 데에는 추가적인 시간과 노력이 소요되며, 원하는 정도로 정제가 되지 않을 수 있다. 또한, 소태아혈청과 같은 성분은 고가이기 때문에 세포를 단일클론으로 선별하는 과정의 비용을 전체적으로 증가시키는 요인이 된다. 뿐만 아니라, 동물로부터 유래된 혈청은 크로이펠츠 야곱병 또는 스크래피와 같이 광우병 관련 프리온 등의 바이러스에 감염될 가능성이 있기 때문에, 혈청 함유 배지에서 배양되는 세포는 안전성이 충분하게 보장되지 못한다는 단점이 있다. 더욱이, 혈청에는 미확인된 다양한 성분들이 포함되어 있기 때문에, 원인과 효과 사이의 정확한 관계가 도출되지 않을 수 있다. 특히, 세포를 단일클론으로 선별하고 배양하는 과정에서 혈청의 사용이 바람직하지 않은 이유는, 배치(batch)마다 혈청의 조성이 달라지기 때문에 실험의 재현성을 얻기가 어렵다는 점이다. 즉, 동일한 세포를 같은 성분의 배지에서 배양한다고 하더라도, 그 배양의 결과는 다르게 나타나는 것이 일반적이다. 이러한 이유들 때문에, 세포를 단일클론으로 선별하고 배양하는 과정에서 무혈청 배지를 사용할 필요성이 존재한다.
한편, 본 발명자들이 실험해본 결과에 따르면, 혈청이 함유되어 있지 않은 상태로 CD OptiCHO 배지를 사용할 경우에는 96-웰 플레이트에 약 50 내지 100개의 세포를 넣어야만 군집이 형성되었다는 점이 입증되었다. 이 때, 동물에서 유래된 성분 없이 세포를 단일클론으로 배양할 수는 있지만, 50 내지 100개의 세포로부터 형성된 군집은 본 발명에서 목적하는 단일클론으로 볼 수 없다.
본 발명자들은 전술한 종래의 기술적 문제점을 해결하기 위하여 무혈청 배지에서 GDF5 발현 세포들을 단일클론으로 효과적으로 배양시키고 산업적 규모로 대량 증식시킬 수 있는 방법을 찾기 위해 노력하였다. 그 결과, 후술하는 바와 같이, 특정 구성을 갖는 배지를 사용할 때 비로소 원하는 GDF5 단백질을 발현하는 세포들 중 우수한 세포만을 단일클론으로 배양할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명은 GDF5 단백질 발현 CHO 세포를 단일클론으로 배양하는 방법에 관한 것으로서, 하기 단계를 포함한다:
(a) L-글루타민을 포함하는 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 혼합하는 단계;
(b) 상기 a) 단계에서 획득한 배지에 MTX 및 제오신을 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 b) 단계에서 획득한 배지에서 GDF5 단백질 발현 CHO 세포를 배양하여 단일클론 세포를 획득하는 단계.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 방법은 c) 단계에서 획득한 단일클론 세포 중에서 GDF5 단백질의 생산성 및 세포생존율 중 하나 이상이 가장 우수한 단일클론 세포를 선별하는 d) 단계를 더 포함한다. 이 때, GDF5 단백질의 생산성 및/또는 세포생존율이 가장 우수한 단일클론 세포를 선별하는 방법은 당업계에 이미 잘 알려져 있으며, 통상의 기술자라면 적합한 방법을 선택하여 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 방법은 d) 단계에서 선별한 단일클론 세포를 부유배양하여 증식시키는 e) 단계를 더 포함한다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 c) 단계에서 배양하는데 사용되는 GDF5 단백질 발현 CHO 세포는 MTX에 의한 유전자 증폭 과정을 별도로 거치지 않은 것이다.
바람직하게는, 상기 GDF5 단백질 발현 CHO 세포는 PACE 유전자가 형질도입된 것이다. 이 때, 본 발명에 따른 방법에 의해 배양된 단일클론 세포에서 발현되는 것은 활성형 GDF5 단백질이다. 특히, 상기 활성형 GDF5 단백질의 크기는 26kDa 내지 28kDa, 주로 약 27kDa이다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 모든 배지에는 혈청이 포함되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서 L-글루타민을 포함하는 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지는 1:1의 부피비로 혼합되며, 상기 L-글루타민의 농도는 1mM 내지 20mM, 특히 8mM이고, 상기 MTX의 농도는 50nM 내지 2μM, 특히 50nM이고, 상기 제오신의 농도는 50μg/ml 내지 500μg/ml, 특히 300μg/ml 내지 500μg/ml이다. 본 발명에서, MTX 및 제오신의 농도는 숙주세포의 종류에 따라 적절하게 조정될 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예와 도면에 의해 더욱 상세하게 설명될 것이다. 다만, 본 발명의 권리범위는 하기의 실시예에 의해 제한되지 않으며, 당업자라면 본 발명의 의미 내에서 다양한 변형들을 수행할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 방법에서는 GDF5 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 배지에 혈청이 첨가되지 않으므로 인체에 대한 안전성이 보장될 수 있다. 뿐만 아니라, 배지에 혈청이 포함되어 있지 않기 때문에 부착배양과 대량 생산을 위한 부유배양 사이에 세포가 별도로 적응할 기간이 필요하지 않으므로 세포주를 개발하는데 평균적으로 약 6개월 이상의 기간을 단축시킬 수 있으며, 추후 생체내에서의 사용에 필요한 승인을 받기 위해 혈청의 영향을 확인하는 비용과 시간이 별도로 필요하지 않다.
또한, 본 발명에 따른 방법에서는 GDF5 단백질을 발현하는 세포가 단일클론으로 배양되고 대량증식될 수 있으므로, 우수한 특정 세포만을 선별하여 그것만 별도로 배양시키는 것이 가능해졌다. 뿐만 아니라, 세포가 폴리클로날 군집으로 배양될 경우에는 군집 내 일부 세포들의 성질이 변질됨에 따라 세포에서 생산되는 단백질의 질과 양에도 영향을 미치게 되지만, 본 발명의 방법에 따르면 성질이 균질한 세포들만 대량으로 배양할 수 있기 때문에 성질의 변화 없이 우수한 세포를 계속 유지시킬 수 있다는 장점을 얻을 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 따르면 강한 독성을 나타내는 제오신과 MTX에 대해 내성을 갖는 세포가 단일클론으로 선별될 수 있고, 이어서 부유배양을 통해 대량증식될 수 있다. 이러한 장점은 우수한 특정 세포를 선별하는 과정에서 처리되는 제오신에 의해 악영향을 받지 않도록 해주며, 또한 부유배양시에 유전자 증폭을 위해 처리되는 MTX에 의해 악영향을 받지 않도록 해준다. 이와 같은 결과는 종래에 필요했던 노력과 시간(예컨대, 제오신 및 MTX를 처리함에 따라 급격하게 하락한 세포의 생존율을 회복시키는데 걸리는 노력과 시간, 제오신 및 MTX에 의해 변성이 일어났는지 여부를 확인하고 변성이 일어났다면 단일클론 선별을 다시 수행해야 하는 노력과 시간 등)을 매우 유의적으로 줄여줄 수 있다.
한편, GDF5 단백질은 구조상 크게 시그널 펩티드(signal peptide), 프로펩티드(propeptide) 및 성숙 도메인(mature domain)의 세 부분으로 나누어진다. 활성을 갖는 GDF5의 형태는 세포내 소기관 ER에서 골지체로 전달되는 과정에서 시그널 펩티드와 프로펩티드가 절단되고 남은 성숙 도메인만 이중결합된 이량체 형태이다. 여기서 GDF5의 시그널 펩티드와 프로펩티드를 절단하는 효소는 PACE(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)이며, PACE 절단 부위로 추정되는 RNNR은 각각 아미노산 위치 331번과 332번 사이, 381번과 382번 사이의 2곳에 존재한다. PACEsol에 의해 절단된 후 번역후변형(post translational modification)을 받은 GDF5 단백질은 활성형으로 이중결합된 형태를 가지며, 그 크기는 비환원된(non-reduced) 상태에서 26kDa 내지 28kDa(주로 27kDa)이고 환원된(reduced) 상태에서 약 15kDa이다. 다만, PACE 단백질은 세포내에 매우 미미한 양으로 존재하기 때문에, 세포내에서 GDF5가 발현된다고 하더라도 활성형 GDF5로 존재하지 않고 비활성형 GDF5로 존재하는 경우가 많다. 이와 같은 비활성형 GDF5는 산업적 또는 의료적으로 직접 사용할 수 없기 때문에, 비활성형태를 이용가능한 활성형태로 전환시키기 위해서는 개별적인 과정이 별도로 요구되므로 비용 및 시간 측면에서 매우 불리하다. 그러나, 본 발명에 따르면, 비활성형 GDF5 단백질의 발현량을 최소화시키고 활성형 GDF5 단백질의 발현량을 최대화시킨 세포를 단일클론으로 증식 및 선별할 수 있으므로, 산업적으로 매우 유리하다.
본 명세서에 첨부된 도면들 중에서, 도 2a 내지 도 3c에 도시되어 있는 사진은 모두 라이카(LEICA) 형광 현미경으로 관찰한 이미지에 해당한다.
도 1a는 hGDF5 단백질의 아미노산 서열을 나타내며, hGDF5의 염기 서열은 NCBI Gene ID: 8200과 같다. 도 1a에 도시된 hGDF5 단백질의 아미노산 서열에서 파란색으로 표시된 부분은 활성형 hGDF5의 성숙 도메인을 나타내고, 빨간색으로 표시된 부분은 PACEsol에 의해 절단되는 부위를 나타낸다.
도 1b는 hGDF5를 세포내 형질전환시키는 전체 도식도를 나타낸다. 도 1b의 좌측 도식도 A에서, hGDF5를 Topo/Optivec에 형질도입시킨 후 MTX 증폭을 통해 hGDF5를 발현시킨다. 도 1b의 우측 도식도 B에서, PACEsol을 추가로 형질전환시켜 활성형 hGDF5 단백질의 발현량을 증가시킨다.
도 1c는 비활성 형태의 GDF5 단백질이 활성 형태의 GDF5 단백질로 가공되는 과정에 대한 도식도를 나타낸다. 도 1c에서, GDF5 단백질에서 PACEsol에 의해 절단될 수 있는 부위와 함께, 이에 따라 생성되는 활성 형태의 GDF5의 크기가 도시되어 있다. 여기서, 약 27kDa의 위치에서 관찰되는 밴드는 성숙 도메인 2개가 결합된 이량체에 상응하는 것이며, 이는 활성 형태의 GDF5 단백질을 나타낸다.
도 2a는 MTX 유전자 증폭 단계를 거친 후 선별된 단일클론 세포를 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지에 웰 당 1개씩 파종하여 부착배양하고, 7일 경과 후 단일클론이 군집을 이루는지를 보여주는 현미경 사진이다(X10 배율). 각 단일클론 세포마다 성장속도에서 차이를 보이지만, 비슷한 형태로 자라는 것이 확인되었다.
도 2b는 MTX 유전자 증폭 단계를 거친 후 선별된 단일클론 세포를 2μM MTX가 첨가된 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지에 웰 당 1개씩 파종하여 부착배양하고, 7일 경과 후 단일클론이 군집을 이루는지를 보여주는 현미경 사진이다(X10 배율). 각 단일클론 세포마다 성장속도에서 차이를 보이지만, 비슷한 형태로 자라는 것이 확인되었다.
도 2c는 MTX 유전자 증폭 단계를 거친 후 선별된 단일클론 세포를 500μg/ml 제오신이 첨가된 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지에 웰 당 1개씩 파종하여 부착배양하고, 7일 경과 후 단일클론이 군집을 이루는지를 보여주는 현미경 사진이다(X10 배율). 각 단일클론 세포마다 성장속도에서 차이를 보이지만, 비슷한 형태로 자라는 것이 확인되었다.
도 2d는 MTX 유전자 증폭 단계를 거친 후 선별된 단일클론 세포를 2μM MTX 및 500μg/ml 제오신이 첨가된 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지에 웰 당 1개씩 파종하여 부착배양하고, 7일 경과 후 단일클론이 군집을 이루는지를 보여주는 현미경 사진이다(X10 배율). 각 단일클론 세포마다 군집의 개수에서 차이를 보이지만, 일단 군집이 형성된 세포의 성장속도는 서로 유사하였으며 군집이 잘 성장하는 것이 확인되었다.
도 2e는 MTX 유전자 증폭 단계를 거친 후 선별된 단일클론 세포를 2μM MTX 및 500μg/ml 제오신이 첨가된 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지에서 증식하여 군집을 이루는 형태(상단부 사진)와 MTX 유전자 증폭 단계를 거친 단일클론 세포를 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지(단, MTX 및 제오신은 첨가되지 않음)에서 증식하여 군집을 이루는 형태(하단부 사진)를 비교한 것이다(X4 배율, 14일째 관찰). 상단부 사진과 하단부 사진 사이에는 각 클론마다 성장속도에서 차이를 보이지만, 단일클론 세포는 증식하여 군집을 잘 형성하는 것이 확인되었다.
도 3a는 hGDF5 및 PACEsol을 세포에 형질전환시키고 48시간이 경과한 후 MTX 유전자 증폭 단계를 거치지 않고 바로 단일클론을 선별하였으며, 이와 같이 선별된 단일클론을 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지에 웰 당 1개씩 파종하여 부착배양하고, 7일 경과 후 단일클론이 군집을 이루는지를 보여주는 현미경 사진이다(X4 배율). 각 단일클론 세포마다 성장속도에서 차이를 보이지만, 비슷한 형태로 자라는 것이 확인되었다.
도 3b는 hGDF5 및 PACEsol을 세포에 형질전환시키고 48시간이 경과한 후 MTX 유전자 증폭 단계를 거치지 않고 바로 단일클론을 선별하였으며, 이와 같이 선별된 단일클론을 50nM MTX가 첨가된 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지에 웰 당 1개씩 파종하여 부착배양하고, 7일 경과 후 단일클론이 군집을 이루는지를 보여주는 현미경 사진이다(X4 배율). 각 단일클론 세포마다 성장속도에서 차이를 보이지만, 비슷한 형태로 자라는 것이 확인되었다.
도 3c는 hGDF5 및 PACEsol을 세포에 형질전환시키고 48시간이 경과한 후 MTX 유전자 증폭 단계를 거치지 않고 바로 단일클론을 선별하였으며, 이와 같이 선별된 단일클론을 50nM MTX 및 500μg/ml 제오신이 첨가된 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지에 웰 당 1개씩 파종하여 부착배양하고, 7일 경과 후 단일클론이 군집을 이루는지를 보여주는 현미경 사진이다(X4 배율). 각 단일클론 세포마다 성장속도에서 차이를 보이지만, 비슷한 형태로 자라는 것이 확인되었다.
도 4a는 hGDF5 및 PACEsol을 세포에 형질전환시키고 48시간이 경과한 후 MTX 유전자 증폭 단계를 거치지 않고 바로 단일클론을 선별하였으며, 이와 같이 선별된 단일클론을 무혈청 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 비율로 조합한 배지에 웰 당 1개씩 파종하여 부착배양하고, 세포 생존율이 90% 이상이 되었을 때 부유배양으로 옮겼으며, 부유배양시에 세포 생존율이 정상에 가깝게 회복되는 제3계대에서 50nM의 MTX를 추가로 처리하였을 때, 단일클론 세포의 생존율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4b는 무혈청 CD OptiCHO 배지에 50nM MTX 및 500μg/ml 제오신을 첨가하였다는 점만 제외하고 상기 도 4a와 동일한 조건에서 측정한 단일클론 세포의 생존율을 그래프로 나타낸 것이다.
1. hGDF5 발현 벡터의 준비.
pUC57 벡터를 Genescript사에서 구입하여 PCR 방법에 의해 hGDF5 유전자를 증폭시켰다. 이어서, Qiagen gel extraction 키트를 이용하여 분리한 hGDF5 유전자를 pOptiVECTM-TOPO 벡터에 라이게이션한 후 클로닝하였다. 이와 같이 제조된 hGDF5 발현 벡터를 E.coli DH5α 세포에 형질도입하고, 이어서 E.coli DH5α 세포를 배양하여, hGDF5 유전자가 클로닝된 벡터들을 다량으로 준비하였다.
2. hGDF5 발현 벡터의 DNA를 CHO DG44 세포주에 형질도입함.
상기 1번 과정에서 준비된 hGDF5 발현 벡터의 DNA가 형질도입에 의해 숙주세포의 DNA에 잘 들어갈 수 있도록, PVU I 효소를 이용해 상기 벡터를 절단하여 선형화시켰다. 그 후, DNA cleanup 키트(QIAGEN사)를 사용하여 순수 분리하였다. 이와 같이 선형화되어 순수 분리된 10μg의 hGDF5 발현 벡터 DNA와 30μl의 리포펙타민 시약(INVITROGEN사)을 OptiPRO SFM 배지(GIBCO사) 내에서 혼합액을 만들고, CHO DG44 세포주(INVITROGEN사)와 함께 실온에서 인큐베이션하여 형질도입을 수행하였다.
형질도입을 수행한 시점으로부터 48시간의 배양 시간이 경과한 후, 세포 배양배지를 HT(hypoxanthine and thymidine) 영양성분이 결핍되고 8mM의 L-글루타민이 함유된 CD OptiCHO 배지(GIBCO사)로 교환하여 5x105 세포수/ml의 농도로 세포를 배양하였다. 세포의 생존율이 90% 이상 될 때까지 약 2~4주 동안 배양을 더 진행하였다.
3. PACEsol 발현 벡터의 준비.
인간 PACE 유전자의 NCBI mRNA 등록번호는 NM_002569로서, PACE의 오리지날 형태의 염기서열은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_002569에서 확인이 가능하하며, 이는 ATCC, open biosystems, origene, invitrogen 등과 같은 회사에서 클론의 형태로 상업적으로 구입이 가능하다. 본 발명에서 사용된 PACEsol 유전자는 인간 유래 HEK293 세포에서 PACE 유전자(Furin CDS)를 분리한 후 막관통 도메인(transmembrane domain) 영역과 세포질 꼬리(cytoplasmic tail) 영역을 제거한 변이 형태이다(본 출원인이 보유하고 있는 다른 특허출원 제10-2012-0128414호 참조).
이와 같이 준비된 변이 형태의 PACEsol 유전자와 Zeo(제오신 내성 유전자)가 포함된 pcDNA3.1/zeo(+) 벡터(INVITROGEN사)를 EcoRI 및 XbaI 제한효소로 각각 절단한 후, QIAGEN gel extraction 키트로 분리하여 전기영동에 의해 그 크기를 확인하였다. 이어서, 상기 준비된 PACEsol 유전자와 pcDNA3.1/zeo(+) 벡터를 라이게이션하여 클로닝하였다.
4. PACEsol 발현 벡터를 hGDF5 유전자가 도입된 CHO DG44 세포주에 형질도입함.
일반적으로, hGDF5 단백질 발현시 활성형 hGDF5가 검출되는 것 외에도, 프로 도메인이 절단되지 않은 형태의 비활성형 hGDF5가 검출될 뿐만 아니라, 정확하지 않은 크기에서 프로 도메인이 절단됨에 따라 정상적인 활성을 나타내지 못하는 hGDF5도 함께 검출된다. 이와 같이 부수적으로 발현되는 비활성형 hGDF5의 양을 감소시키고 정확한 크기의 성숙(mature) hGDF5 단백질의 발현을 유도하기 위하여, 본 발명자들은 후술하는 바와 같은 hGDF5 단백질 발현 세포에 대해 PACEsol 유전자를 형질전환시키고자 하였다.
이를 위해, 먼저 상기 2번 과정에서 준비된 hGDF5 유전자가 도입된 CHO DG44 세포주(INVITROGEN사)를 100mm dish에 파종하고, IMEM 배지(GIBCO사)에서 37℃ 및 5% CO2의 조건하에 세포를 배양하였다. 배양 결과 hGDF5 유전자가 도입된 CHO DG44 세포의 생존율이 90% 이상으로 나타났을 때, 이를 숙주세포로 사용하였다. 이어서, 상기 3번 과정에서 준비된 PACEsol 발현 벡터 2.5μg를 7.5μl의 리포펙타민 LTX(INVITROGEN사)와 함께 IMEM 배지(GIBCO사) 내에서 혼합액을 만들었으며, 이 혼합액을 상기 숙주세포가 배양되고 있는 배지에 천천히 첨가하여 형질도입을 수행하였다. 그 후, 37℃ 및 5% CO2의 조건하에 48시간 동안 배양하였다.
형질도입을 수행한 시점으로부터 48시간의 배양 시간이 경과한 후, 세포 배양배지를 300μg/ml의 제오신이 포함된 HT(hypoxanthine and thymidine) 영양성분이 결핍되고 8mM의 L-글루타민이 함유된 CD OptiCHO 배지(GIBCO사)로 교환하여 5x105 세포수/ml의 농도로 세포를 배양하였다. 세포의 생존율이 90% 이상 될 때까지 약 2~4주 동안 배양을 더 진행하였다. 그 결과, hGDF5 유전자 및 PACEsol 유전자가 함께 도입된 CHO 세포가 생성되었다.
5. MTX(methotrexate: 메토트렉세이트)를 이용한 hGDF5 유전자의 증폭.
상기 4번 과정에서 준비된 세포, 즉 PACEsol 유전자 및 hGDF5 유전자가 형질도입된 세포가 함유되어 있는 CD OptiCHO 배지에 MTX의 농도를 순차적으로 높여 첨가하면서 배양을 진행하였다. 여기서, MTX는 세포내에 도입된 GDF5 유전자를 증폭시키고 그 결과 목적하는 GDF5 단백질의 발현량을 증가시키기 위해 사용된다. 세포의 생존율이 90% 이상으로 확인되었을 때, MTX를 더 높은 수준의 다음 농도로 첨가하였다(50nM → 100nM → 250nM → 500nM → 750nM → 1μM → 2μM). 이와 같이 MTX의 농도를 순차적으로 높여가면서 첨가하는 이유는 MTX가 세포독성과 돌연변이를 유발시켜 단백질의 변성을 일으킬 수 있기 때문이며, 당업계에서는 MTX가 세포성장이 어느 정도 안정기에 들어간 건강한 세포에 처리해야 하는 것으로 여겨지고 있다.
최종 농도로 2μM의 MTX로 처리하여 hGDF5 유전자의 증폭을 유도하였다. 이와 같이 MTX를 이용하여 hGDF5 유전자가 증폭된 세포들은 PACEsol에 의해 본 발명에서 얻고자 하는 활성형 hGDF5 단백질(약 27kDa의 크기)을 발현한다.
그러나, 이러한 숙주세포들은 군집 형태를 나타내는 폴리클로날 군(polyclonal population)이기 때문에, 각각의 단일클론마다 세포생존율이 상이할 뿐만 아니라 hGDF5 단백질의 생산성도 상이하다. 따라서, 산업적 규모로 대량 증식 및 생산하기에 앞서, 각각의 단일클론들 중에서 세포생존율과 hGDF5 단백질의 생산성이 가장 우수한 단일클론 세포를 선택하는 과정이 필요하다.
6. 한계희석법에 의한 단일클론의 선별.
상기 5번 과정에서와 같이 MTX의 농도를 2μM까지 증가시키면서 hGDF5 유전자를 증폭시킨 세포들로 구성된 폴리클로날 군에서, 단일 클론 선별(single clone selection) 과정을 수행하였다.
기본배지의 조성은 CD OptiCHO 배지에 8mM(최종농도)의 L-글루타민만을 첨가한 것이며, 여기에는 혈청이 함유되어 있지 않다. 또한, 반고형 배지는 Genetix사에서 시판되는 CloneMedia-CHO 배지를 사용하였다.
상기 기본배지인 CD OptiCHO 배지는 혈청이 함유되어 있지 않은 경우 hGDF5 유전자가 형질도입된 세포를 웰 당 1개씩 배양할 때 단일클론 군집으로 정상적으로 증식하지 못한다는 점이 본 발명자들의 실험을 통해 확인되었다. 또한, 반고형 배지에서도 hGDF5 유전자가 형질도입된 세포는 단일클론으로 증식될 수 없었다.
실험군으로서, (i) MTX 및 제오신이 첨가되지 않은 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군, (ii) MTX 배양 최종농도인 2μM의 MTX가 함유된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군, (iii) 500μg/ml의 제오신이 함유된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군, 및 (iv) MTX 배양 최종농도인 2μM의 MTX 및 500μg/ml의 제오신이 함유된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군을 사용하였다. 상기 제오신(Zeocin)은 INVITROGEN사에서 구입한 것(카탈로그 번호 R250-01, R250-05)을 사용하였으며, 이는 당업계에서 통상적으로 이용되는 PACEsol의 선택적 마커이다.
한계희석법으로서, 배양 중인 세포들 중 90% 이상의 생존율을 나타내는 세포에 대해 200μl 당 세포수가 1개가 될 때까지 1/10로 희석하였다. 이와 같이 희석된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 200μl씩 분주하였으며, 1주일~2주일 동안 어둡고 습도가 충분히 유지되는 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 세포를 배양하였다.
결과
(1) 첫번째 실험군의 경우(MTX 및 제오신이 첨가되지 않은 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군)
배양배지가 함유된 96-웰 플레이트에 세포를 1개씩 파종하고 이로부터 7일이 경과한 후 관찰하였을 때, 96-웰 플레이트마다 약 17~20개의 세포가 성장하는 것이 확인되었다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 세포를 1개씩 파종한 경우에도 군집이 잘 형성되며, 포도송이처럼 옆으로 퍼져나가는 형태가 관찰되었다.
(2) 두번째 실험군의 경우(2μM의 MTX가 처리된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군)
배양배지가 함유된 96-웰 플레이트에 세포를 1개씩 파종하고 이로부터 7일이 경과한 후 관찰하였을 때, 96-웰 플레이트마다 평균적으로 약 17개의 세포가 성장하는 것이 확인되었다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 세포를 1개씩 파종한 경우에도 군집이 잘 형성되며, 포도송이처럼 옆으로 퍼져나가는 형태가 관찰되었다.
(3) 세번째 실험군의 경우(500μg/ml의 제오신이 처리된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군)
배양배지가 함유된 96-웰 플레이트에 세포를 1개씩 파종하고 이로부터 7일이 경과한 후 관찰하였을 때, 96-웰 플레이트마다 평균적으로 약 20개의 세포가 성장하는 것이 확인되었다. 도 2c에 나타난 바와 같이, 세포를 1개씩 파종한 경우에도 군집이 잘 형성되며, 포도송이처럼 옆으로 퍼져나가는 형태가 관찰되었다. 특히, 상기 두번째 실험군에 비해, 세포의 군집 수가 더 많았으며 성장 속도도 더 빨랐다.
(4) 네번째 실험군의 경우(2μM의 MTX 및 500μg/ml의 제오신이 함께 처리된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군)
배양배지가 함유된 96-웰 플레이트에 세포를 1개씩 파종하고 이로부터 7일이 경과한 후 관찰하였을 때, 96-웰 플레이트마다 평균적으로 약 7~10개의 세포가 성장하는 것이 확인되었다. 도 2d에 나타난 바와 같이, 세포를 1개씩 파종한 경우에 세포가 성장하는 속도는 다른 실험군에 비해 느리고 그 수가 적었지만 7일째에 군집의 형성이 확인되었다. 도 2e에 나타난 바와 같이, 14일째에도 각 클론마다 성장하는 속도는 상이하지만, 형성된 군집은 옆으로 퍼져나가며 잘 자라는 것이 확인되었다. 이러한 실험 결과에 따르면, 세포 독성을 갖는 MTX 및 제오신을 동시에 배양배지에 처리한 경우에도, hGDF5 발현 세포는 단일클론으로서 성장 및 증식이 매우 잘 이루어졌음을 알 수 있다.
상기 네번째 실험군에서, MTX 및 제오신을 배지에 첨가한 이유는 다음과 같다(이는 후술하는 7번 및 8번 과정에서 세번째 실험군에도 동일하게 적용됨):
본 발명에 따른 배지(즉, 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지)는 GDF5 단백질에 대한 특이성을 갖고 있기 때문에, 상기 실험결과에서 알 수 있듯이 MTX 및/또는 제오신의 첨가 유무와 무관하게 GDF5 단백질 발현 세포들은 단일클론으로 군집을 이루어 잘 자랄 수 있다. 그러나, 이와 같이 증식된 단일클론 세포들 중에서 대량 증식시키기 위해서는 선행적으로 특정 세포를 선별해야 하며, 이 때 PACEsol의 발현량이 우수하고 이에 따라 활성형 GDF5 단백질의 발현량이 우수한 특정 세포를 선별해내는 것이 필수적이다. 이와 같은 선별 과정에서 PACEsol의 선택적 마커인 제오신이 첨가되어야 하는데, 제오신은 박테리아, 균류, 효모, 식물 세포 및 포유류 세포에 대해 강한 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Calmels et al., 1991; Drocourt et al., 1990; Gatignol et al., 1987; Mulsant et al., 1988; Perez et al., 1989). 실제로, 우수한 세포를 선별하는 과정에서 제오신이 처리될 때 그 독성으로 인해 다수의 세포들이 사멸하였으며, 제오신을 처리한 후 살아남은 세포 중에는 변성이 일어난 세포가 다수 발견되었는데, 이와 같이 변성이 일어난 세포들을 배제해야 하는 과정이 추가로 요구되었다. 더욱이, 제오신의 독성으로부터 살아남은 세포의 경우에도, 산업적 규모로 대량증식시키기 위한 부유배양을 수행하기 전에 부착배양 상태에서 세포의 생존율을 90% 이상으로 올려야 하는데, 이 과정에는 상당한 시간이 소요되는 문제점이 발생하였다(본 명세서에는 관련 데이터를 나타내지 않음). 다른 한편으로는, 우수한 세포로 선별된 단일클론 세포 군집은 여전히 부착배양된 상태이기 때문에, 이를 산업적 규모로 대량 증식시키기 위해서는 부유배양시키는 과정이 필요하며, 이와 같이 부유배양시키는 과정에서 MTX가 추가로 처리된다. 여기서, MTX는 상기 선별된 세포의 GDF5 유전자를 더욱 증폭시키고 그 결과 GDF5 단백질의 발현량을 증가시키는 역할을 한다. 그러나, MTX는 제오신과 마찬가지로 세포에 대해 독성을 가지며 세포의 변성을 일으키는 문제점을 또한 발생시켰다(후술하는 8번 과정 및 표 1 참조). 결국, MTX 및/또는 제오신이 첨가된 다른 실험군들에 비해 MTX 및 제오신이 전혀 첨가되지 않은 첫번째 실험군에서 오히려 세포들의 성장속도가 더 빠르게 나타났으며 단일클론으로 배양하는 데에도 성공하였지만, 첫번째 실험군의 경우 우수한 특정 세포를 선별하는 과정에서 첨가되는 제오신으로 인해 문제점을 나타내었으며, 또한 산업적 규모로 대량증식시키기 위해 부유배양하는 과정에서 첨가되는 MTX로 인해 또다른 문제점을 나타내었다. 반면, 네번째 실험군은 단일클론 선별 과정과 부유배양 과정 모두에 대해 적합한 것으로 확인되었는데, 이는 세포를 배양하는 배지에 MTX 및 제오신을 첨가함으로써 이들의 독성에 내성이 있는 세포들만 살아남게 되는 결과를 가져왔고, 이러한 세포들 중에서도 단백질 발현량이 우수한 세포가 선별될 수 있었기 때문인 것으로 여겨졌다.
7. 상기 1번 내지 4번 과정을 수행한 후, 5번 과정을 생략하고 한계희석법에 의한 단일클론의 선별.
상기 1번 내지 4번 과정에 따라 형질전환된 세포의 폴리클로날 군에 대해 5번 과정(즉, MTX에 의한 유전자 증폭 과정)을 생략하고 바로 단일 클론 선별 과정을 수행하였다.
기본배지의 조성은 CD OptiCHO 배지에 8mM(최종농도)의 L-글루타민만을 첨가한 것이며, 여기에는 혈청이 함유되어 있지 않다. 또한, 반고형 배지는 Genetix사에서 시판되는 CloneMedia-CHO 배지를 사용하였다.
본 실험과정에서도 마찬가지로, 기본배지인 CD OptiCHO 배지는 혈청이 함유되어 있지 않은 경우 hGDF5 유전자가 형질도입된 세포를 웰 당 1개씩 배양할 때 단일클론 군집으로 정상적으로 증식하지 못하였다는 것이 본 발명자들에 의해 확인되었다. 이는 반고형 배지의 경우도 마찬가지였다.
실험군으로서, (i) MTX 및 제오신이 첨가되지 않은 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군, (ii) 50nM의 MTX가 함유된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군, 및 (iii) 50nM의 MTX 및 500μg/ml의 제오신이 함유된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군을 사용하였다.
한계희석법으로서, 배양 중인 세포들 중 90% 이상의 생존율을 나타내는 세포에 대해 200μl 당 세포수가 1개가 될 때까지 1/10로 희석하였다. 이와 같이 희석된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 200μl씩 분주하였으며, 1주일~2주일 동안 어둡고 습도가 충분히 유지되는 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
결과
(1) 첫번째 실험군의 경우(MTX 및 제오신이 첨가되지 않은 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군)
배양배지가 함유된 96-웰 플레이트에 세포를 1개씩 파종하고 이로부터 7일이 경과한 후 관찰하였을 때, 96-웰 플레이트마다 평균적으로 약 15개의 세포가 성장하는 것이 확인되었다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 세포를 1개씩 파종한 경우에도 군집이 잘 형성되는 것이 관찰되었다. 5번 과정(즉, MTX에 의한 유전자 증폭 과정)이 수행된 경우에 비해 세포들이 성장하는 속도는 다소 느렸으나, 잘 자라는 것이 확인되었다.
(2) 두번째 실험군의 경우(50nM의 MTX가 처리된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군)
배양배지가 함유된 96-웰 플레이트에 세포를 1개씩 파종하고 이로부터 7일이 경과한 후 관찰하였을 때, 96-웰 플레이트마다 평균적으로 약 10개의 세포가 성장하는 것이 확인되었다. 도 3b에 나타난 바와 같이, 세포를 1개씩 파종한 경우에도 군집이 잘 형성되는 것이 관찰되었다. 5번 과정(즉, MTX에 의한 유전자 증폭 과정)이 수행된 경우에 비해 세포들이 성장하는 속도는 다소 느렸으나, 잘 자라는 것이 확인되었다.
(3) 세번째 실험군의 경우(50nM의 MTX 및 500μg/ml의 제오신이 함께 처리된 무혈청 기본배지를 반고형 배지와 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 단일 클론을 부착배양한 군)
배양배지가 함유된 96-웰 플레이트에 세포를 1개씩 파종하고 이로부터 14일이 경과한 후 관찰하였을 때, 96-웰 플레이트마다 평균적으로 약 7~10개의 세포가 성장하는 것이 확인되었다. 도 3c에 나타난 바와 같이, 세포를 1개씩 파종한 경우 군집의 수가 적고 클론마다 성장하는 속도가 상이하였으나, 잘 자라는 것이 확인되었다. 상기 실험 결과들을 고려해볼 때, 세포 독성을 갖는 MTX 및 제오신을 동시에 배양배지에 처리한 경우, 유전자를 증폭시키기 위한 MTX를 농도를 증가시키면서 첨가하는 과정을 생략하더라도, hGDF5 발현 세포는 단일클론으로서 성장 및 증식이 매우 잘 이루어졌다.
8. 단일클론으로 배양된 세포의 대량 증식.
상기 7번 과정에서 3개의 실험군 모두 세포들이 단일클론으로 잘 성장하였으나, 두번째 실험군과 세번째 실험군에 비해 첫번째 실험군(세포 배양배지에 MTX 및 제오신이 첨가되지 않음)에서 세포의 성장 속도가 상대적으로 더 빨랐다.
다만, 단일클론으로 선별하여 부착배양된 세포를 산업적 규모로 대량 증식시키기 위해서는 부유배양을 하는 것이 필수적이다. 따라서, 상기 7번 과정에서 3개의 실험군이 모두 부유배양에 적합한지 여부를 확인하기 위하여 본 실험을 수행하였다.
먼저, 부착배양하여 군집을 이룰 수 있을 만큼 증식시킨 단일클론 세포주들을 부유배양시키고, 세포 생존율이 회복되는 것으로 관찰되는 제3계대에서 50nM의 MTX를 추가로 처리하였다. 그 후 제10계대까지 단일클론 세포의 생존율을 측정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
단일클론 세포의 생존율(%)
클론 번호 제1
계대		 제3
계대		 제4
계대		 제5
계대		 제6
계대		 제7
계대		 제8
계대		 제9
계대		 제10
계대


첫번째 실험군		 1번 45.7 95.1 42.8 22.0 23.9 30.4 56.5 67.3 88.2
2번 58.1 88.5 42.5 25.9 29.6 55.9 76.6 88.9 96.0
3번 65.3 94.2 53.9 25.1 19.9 25.0 39.0 63.4 85.2
4번 37.8 88.1 47.3 20.7 20.9 19.2 17.8 20.5 24.1
5번 53.8 95.2 58.2 53.8 59.8 72.8 82.4 86.9 91.3
6번 39.5 86.6 37.9 19.4 19.4 17.4 19.6 33.6 54.1
7번 56.6 94.1 44.9 18.4

세번째 실험군		 1번 18.1 44.4 55.2 48.8 72.4 82.2 81.7 91.6 89.5
2번 66.5 96.3 85.8 92.5 88.4 91.7 93.3 92.9 93.3
3번 56.1 96.9 53.1 57.7 78.6 77.6 86.7 95.1 95.5
4번 89.6 86.8 85.8 87.3 88.4
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 첫번째 실험군의 경우 부유 상태에서 50nM의 MTX를 추가로 처리하였을 때 세포 생존율이 급격히 하락하였으며, 생존율이 약 17%까지 감소하는 클론도 확인되었다. 또한, 하락한 세포 생존율이 회복되는 속도도 느리게 나타났다.
반면, 세번째 실험군의 경우 부유 상태에서 50nM의 MTX를 추가로 처리하였을 때 세포 생존율이 하락하기는 하였으나 약 44% 미만으로 감소하지 않았다. 또한, 하락한 세포 생존율은 매우 유의적으로 빠르게 회복되었다. 이는 산업적 규모로 대량 증식시키기 위한 부유배양에 훨씬 더 적합하다는 것을 보여준다.
특히, 본 실험에서 세번째 실험군은 부유배양시에 MTX를 적용하더라도 선별된 세포들이 MTX의 독성 또는 변성에 대해 내성을 나타내므로, MTX에 의해 GDF5 유전자를 증폭시키는 중간 과정(본 실시예에서는 상기 5번 과정)을 별도로 거칠 필요 없이 부유배양을 진행하는 동시에 MTX를 처리하여 유전자를 증폭시킬 수 있게 되므로 시간과 비용 면에서 큰 이익을 얻을 수 있다.

Claims (7)

  1. GDF5(Growth Differentiation Factor 5: 성장분화인자5) 단백질 발현 CHO 세포를 단일클론으로 배양하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) L-글루타민을 포함하는 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지를 혼합하는 단계;
    (b) 상기 a) 단계에서 획득한 배지에 MTX(methotrexate: 메토트렉세이트) 및 제오신을 첨가하는 단계; 및
    (c) 상기 b) 단계에서 획득한 배지에서 GDF5 단백질 발현 CHO 세포를 배양하여 단일클론 세포를 획득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계에서 획득한 단일클론 세포 중에서 GDF5 단백질의 생산성 및 세포생존율 중 하나 이상이 가장 우수한 단일클론 세포를 선별하는 d) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 d) 단계에서 선별한 단일클론 세포를 부유배양하여 증식시키는 e) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계에서 배양하는데 사용되는 GDF5 단백질 발현 CHO 세포는 MTX에 의한 유전자 증폭 과정을 별도로 거치지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법에서 사용되는 모든 배지에는 혈청이 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    L-글루타민을 포함하는 CD OptiCHO 배지와 반고형 배지는 1:1의 부피비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-글루타민의 농도는 1mM 내지 20mM이고, 상기 MTX의 농도는 50nM 내지 2μM이고, 상기 제오신의 농도는 50μg/ml 내지 500μg/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
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