CN104903447A - 在用于蛋白质表达的细胞系中减少酰胺化的氨基酸形成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在给定的细胞系中降低肽酰胺化的方法，具有肽酰胺化活性降低的细胞系及其相关应用。

Description

在用于蛋白质表达的细胞系中减少酰胺化的氨基酸形成
技术领域
本发明涉及一种在细胞系的蛋白质表达过程中减少酰胺化的氨基酸的形成的方法、细胞系及相关应用。
背景技术
虽然蛋白质主要是以其氨基酸序列(原始结构)来表征，但是，在其他方面，像众多的翻译后修饰等也对蛋白质的特征产生影响，如影响蛋白质的二级、三级或四级结构等。其中的一些翻译后修饰对新产生的蛋白的活性具有重要的影响，包括对生物制药生产的药物的安全性和功效产生影响等。
一种对蛋白质的异质性具有重要影响的因素是包括酸性变种在内的电荷模式(charge pattern)。这种电荷模式的形成的方式可以是，例如，像天冬酰胺等氨基酸的脱酰胺，糖基化或者通过N-末端谷氨酰胺形成焦谷氨酸，以及一些基本的变种，例如，酰胺化的氨基酸，特别是C-末端脯氨酸酰胺残基等。
酰胺化的氨基酸的形成，如C-末端脯氨酸酰胺，却是在某些情况下不愿看到，例如，当形成的酰胺化的氨基酸作为一种不受欢迎的异质性来源，或者氨基酸变异可能导致蛋白质的活性或免疫原性受影响，或者酰胺化的氨基酸的含量，例如脯氨酸酰胺的含量，在产生的蛋白质中比在参考蛋白中更高或更低。
相比较能够在高度可控的物理化学条件下产生的小分子药物，蛋白质尤其是作为生物治疗性质(生物制药)的蛋白质，因生产过程中使用的是活细胞培养系统，从而整个生产过程是高度复杂且难以控制的。因此，发展一种简便的、能够用于特别控制产生的蛋白质的翻译后修饰的工具箱是尤为重要的。通过该工具箱可以得到一种具有恒定的产品质量和恒定的高产量的蛋白质产品，并可以提高生产过程的效率，增加和/或微调生产的蛋白的生理活性及衍生出的药物的生物安全性，和/或使生产出的蛋白质的翻译后修饰的特性与参考蛋白匹配。
本发明的目的正是提供系统和方法以解决上述问题及需求。
本发明的独立权利要求记载的系统和方法能够解决上述问题及需求。从属权利要求则记载了优选的实施方案。可以理解，通过数值限定的数值范围是包括有端点数值的。
发明内容
在对本发明作详细介绍之前，本领域技术人员可以理解，本发明不仅仅限于文中特定部分所描述的器件或工具，或者方法部分所描述的方法流程，这些器件或工具及方法可以做若干变形。同样可以理解，文中的用词只是用于描述特定的实施例而已，并不用于限制本发明。此外，对于通过数值来限定的参数范围是包括数值端点值的。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种具有降低的肽酰胺化活性的用于蛋白质表达的细胞。
如本文中所述的，术语“细胞”同样包括由该细胞产生的细胞系。进一步，由该细胞或细胞系产生的动物以及基于细胞的表达平台同样属于本发明的保护范围之内。
如本文中所述的，术语“用于蛋白表达”一词是指根据本发明的细胞，其适于工业生产过程中的蛋白质表达，包括同源和/或异源的蛋白质表达。事实上，根据本发明的细胞适于工业生产的过程意味着，处于自然环境中的该细胞能够根据自身特性降低肽酰胺化活性，但是，正因为如此，并没有进行进一步修饰、隔离或处理，不适合工业生产过程的蛋白质表达，如果存在没有经过进一步修饰、隔离或处理的细胞，并且不适合工业生产过程的蛋白质表达，不会影响根据本发明的细胞的新颖性。
肽酰胺化是一种普遍存在的，往往是多种生物活性肽的翻译后修饰所必经的过程。肽酰胺化在诸如催化神经内分泌肽以激活α酰胺化产品的过程中发挥作用。
然而，在一些情况下，肽酰胺化却是不希望看到的，例如，当形成的酰胺化的氨基酸作为一种不受欢迎的异质性来源，或者氨基酸变异可能导致蛋白质的活性或免疫原性受影响，或者酰胺化的氨基酸的含量，例如脯氨酸酰胺的含量，在产生的蛋白质中比在参考蛋白中更高或更低。
在本发明细胞的一个优选的实施例中，降低的肽酰胺化活性是通过如下方法实现的：
a)抑制或降低编码用于催化肽α－酰胺化的酶的基因的基因表达；
b)表达功能异常或失活的用于催化肽α－酰胺化的酶，或者表达具有降低活性的用于催化肽酰胺化的酶；和/或
c)抑制或降低用于催化肽α－酰胺化的酶的活性。
根据本发明的另一方面，本发明还提供一种在给定细胞中降低肽酰胺化活性的方法，其包括如下步骤中的至少一步骤：
a)抑制或降低编码用于催化肽α－酰胺化的酶的基因的基因表达；
b)表达功能异常或失活的用于催化肽α－酰胺化的酶，或者表达具有降低活性的用于催化肽酰胺化的酶；和/或
c)抑制或降低用于催化肽α－酰胺化的酶的活性。
根据本发明的一个优选的实施例，降低的肽酰胺化活性是通过对编码催化肽α-酰胺化的酶的基因进行下述至少一种改造方式来实现的：
基因沉默(gene silencing)；
基因抑制(gene knock-down)；
基因敲除(gene knock-out)；
显性负构造体的引入(delivery of a dominant negative construct)；
条件性基因敲除(conditional gene knock-out)；和
基因变异(gene alteration)。
本文中的术语“基因表达”是指包括选自下列集合中的至少一种过程：DAN转录成mRNA，mRNA加工，非编码mRNA成熟、mRNA出核(mRNA export)、翻译、蛋白质折叠和/或蛋白质运输。
所述抑制或降低基因的基因表达是指直接干扰基因表达的方法，包括但不限于：抑制或降低DNA的转录，例如，通过使用特别设计的启动子相关抑制因子、通过给定启动子的位点特异性突变或通过启动子交换，或者抑制或降低翻译，例如，通过RNAi诱导的翻译后基因沉默等。
所述表达功能异常或失活的用于催化肽α-酰胺化的酶，或者表达已降低活性的催化肽酰胺化的酶能够通过例如对编码基因的特定位点或随机突变、插入或删除的方式来实现。
所述抑制或降低用于催化肽酰胺化的酶的活性可以通过例如在蛋白质表达之前或蛋白质表达的同时通过施加或孵育各自的酶的抑制剂来实现。这些酶的抑制剂包括但不限于：抑制肽(inhibitory peptide)、抗体(antibody)、适体(aptamer)、融合蛋白(fusion protein)或者所述酶的模拟抗体(antibody mimetic)，或者所述抑制肽、抗体、适体、融合蛋白或者所述酶的模拟抗体的片段或受体，或者核酸，或者具有类似结合活性的小分子物质。
其他的抑制酶的活性的方法包括降低培养基中酶的特异性辅助因子。这些酶的特异性辅助因子，例如铜，作为PAM特异性金属辅助因子(例如，以CuSO4的形式存在)；抗坏血酸盐，其充当PAM的电子给体；分子氧；过氧化氢以及其他本领域技术人员所熟知的或未来可能发现的物质。
基因沉默、基因抑制及基因敲除是指降低基因表达的手段。这些手段能够通过基因修饰，或者用具有与mRNA转录体与基因二者之一互补配对的寡核苷酸序列进行处理等方式实现。如果是基因修饰的手段，那么结果会产生一个基因抑制或基因敲除的生物体。如果基因表达的改变是因寡核苷酸序列与mRNA结合或者是因寡核苷酸序列暂时性的与基因结合，这会导致暂时性的基因表达改变，而染色体DNA却没有改变，这种手段称为暂态抑制(transientknock-down)。
在包括有上述介绍的术语的暂态抑制过程中，其中寡核苷酸序列与活性基因的结合或者与活性基因转录产物的结合会通过阻断转录(基因结合的情况)、mRNA转录产物的降解(通过小分子干扰RNA(siRNA)或者核糖核酸酶-H依赖的反义过程)或者通过阻断用于其他功能RNA(如miRNA)成熟的mRNA翻译、mRNA前体的剪切位点或核酸酶酶切位点(例如，通过吗啉代寡核苷酸(Morpholino oligos)或者其他核糖核酸酶-H依赖的反义过程(RNase-Hindependent antisense))的方式引起表达下降。其他的引起表达下降的手段还包括使用shRNA(小发夹RNA，small haipin RNA，一种紧致的发夹结构的RNA序列，能够通过RNA干扰途径来沉默基因表达)，使用esiRNA(Endoribonuclease-prepared siRNAs，核糖核酸内切酶制备的siRNA，是一种用核糖核酸内切酶对dsRAN(long double-stranded RAN，长双链RNA)剪切后产生的siRNA寡核苷酸的混合物)或者RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)的激活。
其他的本领域技术人员熟知的执行基因沉默、基因抑制或基因敲除的手段，在本文中不再赘述，这些手段在本发明中作为常规应用。
所述基因敲除是指基因表达被完全阻断的手段，例如，特定基因不起作用或者完全被移除。基因敲除的实现的方法有多种，这也是本领域技术人员所熟知的。例如一种对给定基因起主导性的负突变的产生等。这种突变能够通过合适的转座子或者通过本领域技术人员所熟知的其他方法来诱导的定点突变技术实现(例如，删除、部分缺失、插入或者核苷酸替换等)，在本文中不再赘述，这些应用在本发明中作为常规应用。本发明文中本领域技术人员认为非常有用的一种新发展的技术是通过使用有针对性的锌指核酸酶来诱导的基因敲除技术。相应的工具包由Sigma Aldrich公司提供的“CompoZR knockout ZFN”。另一种方法包括使用转录活化剂状效应核酸酶(Transcription activator-like effectornucleases，TALENS)。
所述显性负构造体的引入包括引入一编码功能失调酶的基因编码序列的过程，例如，通过转染技术实现。所述基因编码序列能够与强启动子功能性耦合，这样的话，该功能失调酶的基因表达超过了野生型酶的自然表达，这导致了相应的酶活性的有效生理缺陷。
所述条件性基因敲除能够以组织特异性或时间特异性的方式阻断基因表达。这可以通过在目的基因上引入loxP位点这种短序列来实现。同理，其他的本领域技术人员熟知方法在本文中不再赘述，这些方法应用在本发明中作为常规应用。
基因变异作为另一种途径可导致功能失调的基因产物或活性降低的基因产物的产生。这种途径包括引入移码突变、无义突变(例如，引入提前终止密码子)或者能够导致整个基因产物功能失调或活性降低的氨基酸替换的突变。这种基因变异可以例如通过诱变(例如，删除、部分缺失、插入或者核苷酸替换)来实现，也可以通过随机突变或者定点突变的方式来实现。
文中描述的基因沉默、基因抑制、基因敲除、显性负构造体的引入、条件性基因敲除和/或基因变异的实际应用都是本领域技术人员能够实现的，这些应用在本发明中作为常规应用。本文所提供的技术指导是完全包括所有能够想到的方法导致抑制或降低编码催化肽α-酰胺化酶的基因表达的，或者导致功能失调或无效的催化肽α-酰胺化酶表达，或者具有降低活性的催化肽酰胺化的酶的表达。
根据本发明的另一优选实施例，所述细胞是真核细胞。所述真核细胞包括但不限于：动物细胞(例如昆虫细胞)、植物细胞和真菌细胞。相应的，在本发明提供的一优选实施例中，该细胞是指动物细胞和/或植物细胞。
根据本发明的另一个优选实施例，所述细胞是指哺乳动物细胞。根据本发明的又一优选实施例，上述细胞包括选自下列细胞中的至少一种细胞：
幼仓鼠肾细胞(Baby hamster Kidney cells，例如BHK21)；
中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，例如CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DXB或CHO-dhfr)；
小鼠骨髓瘤细胞(Mouse myeloma cells，例如SP2/0或NS0)；
人类胚胎肾细胞(Human embryonic kidney cells，例如HEK-293)；
人类视网膜源性细胞(Human-retina-derived cells，例如PER-C6)；和/或
羊水细胞(Amniocyte cells，例如CAP)。
根据本发明的另一优选实施例，所述细胞是指重组细胞。如本文所述的，术语“重组细胞”用于表示有外源性和/或异源性的核酸耦合的细胞，这些外源性和/或异源性的核酸要么与细胞耦合稳定以在细胞系的克隆扩增过程中保持整合，要么核酸暂时性引入在细胞(或者细胞群)中。这种外源性和/或异源性的核酸能够编码异源蛋白质表达，或者能够对抑制或降低编码催化肽α-酰胺化酶的基因的基因表达过程产生影响，对表达功能异常或者功能失调的催化肽α-酰胺化酶的过程产生影响，或者对活性降低的催化肽酰胺化的酶产生影响。
优选的，催化肽酰胺化的酶是肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(peptidylglycinealpha-amidating monooxygenase，PAM)。PAM是一种多功能蛋白质，其包括两种酶活性即依次催化多肽的C-末端切断和α-酰胺化。肽酰甘氨酸α–羟基化单加氧酶(peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase，PHM)能够催化第一步的反应，并且依赖于铜、铜离子、抗坏血酸或分子氧。锌依赖的肽酰氨基-乙醇酸酶(peptidylamido-glycolate lyase，PAL)催化第二步的反应，使C-末端的脯氨酸酰胺化成脯氨酸酰胺。图9所示的即为上述两种酶催化的反应过程。实际的基因或酶还需要依赖于用于蛋白质表达的相应的细胞。
在一个实施例中，上述酶或基因是指人类肽酰甘氨酸-α酰胺化单加氧酶或其基因(根据NCBI基因数据库的基因编号是5066)。该基因编码一种具有两种催化活性的酶活性域的多功能蛋白质：(i)肽酰甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM)以及(ii)肽基-α-羟基甘氨酸的α-酰胺化裂解酶(peptidyl-alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyase，PAL)。这两个催化区域依次催化神经内分泌肽至活性α-酰胺化的产物。这种基因中编码不同亚型的多重可变剪接转录变体(multiple alternatively spliced transcript variants)已经被公开，但是其中一些的全长序列还未被公开。这个基因位于5q14-q21。如果用于蛋白表达的细胞是人类细胞(如HEK、PER-C6或者CAP)，优选的，需要提供：(i)所述基因的基因表达被抑制或降低，或者(ii)功能异常或失活的酶，或者活性降低的酶被表达出来，或者(iii)上述酶的活性被抑制或降低。
这种基因或酶的另一个例子是仓鼠的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶，如CHO细胞(Chinese hamster ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞)能够被传代的中国仓鼠(灰色链霉菌仓鼠Cricetulus griseus)。虽然存在记录有相应基因序列的标志物的(EST)专有数据库，但相应的基因序列还没有完全在公众数据库中公开。
如果用于蛋白表达的细胞是仓鼠细胞(例如BHK、CHO或CAP)，优选的：(i)所述基因的基因表达被抑制或降低，或者(ii)功能异常或失活的酶或者活性降低的酶被表达，或者(iii)所述酶的活性被抑制或降低。
所述基因或酶的另一个例子是鼠的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(基因编号：18484)，该基因编码两个具有催化活性的酶活性区域的多功能蛋白质：(i)肽酰甘氨酸α–羟基化单加氧酶(PHM)以及(ii)肽基-α-羟基甘氨酸的α-酰胺化裂解酶(peptidyl-alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyase，PAL)。这两个催化区域依次催化神经内分泌肽至活性α-酰胺化的产物。这种基因中编码不同亚型的多重可变剪接转录变体已经被公开，但是其中一些的全长序列还未被公开。该基因位于1D；1 57.5cM。
如果用于蛋白质表达的细胞是鼠细胞(例如SP2/0或NS0)，优选的提供：(i)所述基因的基因表达被抑制或降低，或者(ii)功能异常或失活的酶或者活性降低的酶被表达，或者(iii)所述酶的活性被抑制或降低的细胞。
对于用于蛋白质表达的细胞是昆虫细胞，其他例子包括昆虫肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶COOH-末端交互蛋白1(insect peptidylglycine alpha-amidatingmonooxygenase COOH-terminal interactor protein-1)(如基因编号为5567876、6053618及6043293的基因)。
其他潜在的用于蛋白质表达的细胞(如酵母细胞、植物、丝状真菌或者甚至细菌)中的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶同样应该包括在本发明的保护范围内。同理，其他能够催化肽酰胺化的酶，尤其是能够促进脯氨酸酰胺化形成的酶，都应该包括在本发明的保护范围内。
根据本发明任一上述方面和实施例所述的细胞或方法，其中，编码所述催化肽酰胺化的酶的基因的基因表达通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)的途径被抑制或降低。
RNA干扰是一种RNA依赖性的基因沉默途径，其是通过RNA诱导性沉默复合物(RISC)来控制的，并且由细胞质中短双链RNA分子发起，这些短的双链RNA分子能够在细胞质中与RISC成分Argonaut接触反应。RNA干扰途径广泛存在于包括动物细胞在内的众多真核细胞中，其是由Dicer酶发起。Dicer酶将长的双链RNA(dsRNA)剪切成20nt长度大小的小片段，即siRNA。每个siRNA都能够通过退火形成两个单链ssRNA，分别称为过客链(passenger strand)和指导链(guide strand)。其中，过客链会被降解，指导链与RNA诱导性沉默复合物相互作用。
为了在基因工程领域中使用基因沉默，RNA被直接导入到细胞质中并通过酶裂解成短片段。起始dsRNA同样可以是内源性的(即原产于该细胞中)，如基因组中的RNA编码基因表达的前微小RNA(pre-microRNA)一样。这些基因的初始转录产物首先在细胞核中被加工形成前体miRNA(pre-miRNA)的特定的茎-环结构，然后被运至细胞质中被Dicer剪切。因此，两种dsRNA途径，外源性的和内源性的，在RISC复合物中汇聚在一起。
优选的，长的双链RNA(dsRNA，典型的大于200nt)用于沉默编码催化肽α-酰胺化的所述酶的基因的表达。一经引入，dsRNA就由Dicer酶剪切成20-25nt的小分子干扰RNA(siRNA)(起始步骤)。然后，siRNA经退绕过程组装成RISC复合物。
siRNA链随后引导RISC复合物与RNA分子互补配对，并将同源RNA剪切、摧毁(效应阶段)。同源RNA的剪切发生在靠近siRNA链配对区域的中部位置。在哺乳动物细胞培养中，RNA干扰过程典型的就是通过使用siRNA来诱导的。有两种普遍使用的方法可用于在培养细胞中产生siRNA：引入合成的siRNA分子，以及在细胞内引入表达能够加工形成siRNA的短发夹结构RNA序列(shRNA)的DNA结构。本发明所用的相应的siRNA及shRNA见实验部分。
如果RNA干扰导致在相应的细胞及其后代细胞中均建立起非暂时性的基因表达抑制现象，此即产生了基因抑制或基因敲除的细胞或细胞系。
根据本发明的另一优选实施例，用于催化肽酰胺化的酶催化C-末端脯氨酸酰胺残基的形成。
多数人类免疫球蛋白的重链在C-末端(例如在恒定区)具有一结构为-Pro-Gly-Lys-COOH的序列片段(字母代码：PGK)，其中，C-末端的赖氨酸(Lys)往往被碱性羧肽酶去除，进而产生-Pro-Gly-COOH的C-末端。
在众多蛋白质表达系统中，上述C-末端的序列片段是催化肽α-酰胺化的酶的目标，像肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶一样，其能够将C-末端的肽基-脯氨酸-甘氨酸转变成肽基-脯氨酸-α-羟基甘氨酸(hydrooxiglycine)，再转变成肽基-脯氨酸-α-酰胺和乙醛酸(参图9及相应的描述)。
C-末端脯氨酸酰胺残基的形成普遍存在于蛋白质表达过程中，例如，在包含有重链恒定区域的单克隆抗体及其衍生物的蛋白质表达过程中，如IgG抗体，含有人类免疫球蛋白的Fc区域的受体-免疫球蛋白融合蛋白的蛋白质表达过程中，如etanercept或aflibercept，或者含有Fc区域的免疫毒素与三功能抗体的蛋白质表达过程中。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种根据前述权利要求中用于同源蛋白表达的细胞的应用。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种根据前述权利要求中用于异源蛋白表达的细胞的应用。
如本文中所述的“异源蛋白质表达”是指外援的基因、核酸或cDNA在细胞(宿主细胞或表达系统)中表达。异源(即来自于不同的生物体)常常是指转移的蛋白质最初是克隆自或源自不同的细胞类型或不同物种，并且编码的遗传物质(cDNA)在获得后被转移至宿主细胞。被转移的遗传物质必须是在一个能够使受体细胞表达cDNA成蛋白质的格式内(例如，该遗传物质被整合在一表达载体内)。将外援遗传物质转移进受体细胞的方法包括转染和转导。受体细胞类型的选择往往是基于能够检测蛋白功能细节的实验需要，并且从众多表达系统中选出的最普通的受体细胞即异源表达系统需满足：(i)易于转移DNA，(ii)能够将蛋白质生产药物有效形式及具有药物有效功能，(iii)良好的蛋白质产率等。
术语“重组蛋白质的表达”基本上与术语“异源蛋白质的表达”一个意思。术语“重组”暗示表达系统中已引入有“新”的编码遗传物质，该表达系统例如可以是细胞。该过程导致重组核酸的形成(例如重组DNA)，并且宿主细胞可称为重组宿主，例如重组细胞。关于该过程的一个方法是在一个生物体(例如，像CHO细胞一样的基于细胞的蛋白质表达系统)中生产另一个生物体具有的蛋白质(例如人类蛋白质)。
优选的，所述蛋白质至少包括选自下列蛋白中的一种：
抗体或其片段或其衍生物；
融合蛋白；
抗体模拟物；和/或
非抗体蛋白质。
如本文中所述的术语“抗体”，是指与免疫球蛋白或其片段或其衍生物相关的物质。特别优选的，该抗体选自IgG、IgD、IgE、IgA和/或IgM，或者这些抗体的片段或衍生物。如本文所述，术语“片段”是指在某些情况下该抗体保留有目标结合能力的片段，例如：
CDR(complementarity determining region，互补决定区)；
高变区(hypervariable region)；
可变区(Fv)；
IgG重链(包括VH、CH1、铰链(hinge)、CH2及CH3区域)；
IgG轻链(包括VL及CL区域)；和/或
Fab和/或F(ab)2。
如本文所述的术语“衍生物”是指蛋白质结构与常见的抗体概念在结构上不同但仍然有一些结构上的关系，例如scF，以及两(bi-)、三(tri-)或者更高特异性的抗体结构、基于抗体的融合蛋白、抗体药物偶联物、免疫毒素等。
术语“抗体类似物”是指非免疫球蛋白基础的靶结合蛋白质分子。一些抗体类似物例如是从锚蛋白重复蛋白(ankyrin repeat proteins)、C型凝集素(C-typelectins)、金黄色葡萄球菌的结构域蛋白(A-domain proteins of Staphylococcusaureus)、铁传递蛋白(transferrins)、Lipocalin蛋白质(lipocalins)、纤维连接蛋白(fibronectins)、Kunitz结构域的蛋白酶抑制剂(Kunitz domain proteaseinhibitors)、泛素蛋白(ubiquitin)、半胱氨酸结或花边(cysteine knots orknottins)、硫氧还蛋白A(thioredoxin A)以及本领域技术人员从相应文献中能够了解到的物质。
如本文所述的术语“融合蛋白”主要与例如含有人类免疫球蛋白Fc区域等受体-免疫球蛋白融合蛋白相关的蛋白。
优选的，根据本发明的细胞及方法适合于含有氨基酸序列的(重组的)蛋白质生产。该氨基酸序列包含等同于或基本相似于以下某一蛋白质的全部或部分：Flt3配体(Flt3ligand)、CD40配体(CD40ligand)、像红细胞生成素一样的红细胞生产促进蛋白(erythropoiesis stimulating proteins like erythropoietin，如EPO)、包括α-达贝泊汀(darbepoetin alfa)的达贝泊汀(darbepotein)，以及促血小板生成素(thrombopoietin)、降血钙素(calcitonin)、瘦蛋白(leptin)、Fas配体(Fas ligand)、NF-kappaB受体激活体配体(ligand for receptor activatorof NF-kappa B，RANKL)，肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡引导配体(TRAIL)，胸腺基质衍生的淋巴细胞生成素(thymic stroma-derived lymphopoietin)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)，包括肥大细胞生长因子(mast cell growth factor,)、干细胞生长因子(stem cell growthfactor)、表皮生长因子(epidermal growth factor)，角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor)，megakaryote生长和发育因子(megakaryote growthand development factor)、RANTES、生长激素(growth hormone)、胰岛素(insulin)、胰岛素调理素(insulin)、胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactor)、甲状旁腺激素(parathyroid hormone)在内的生长因子(growth factor)，包括α-干扰素(α-interferon)、β-干扰素(β-interferon)及γ干扰素(γ-interferon)在内的干扰素，神经生长因子(nerve growth factor)，脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor)、突触结合样蛋白(synaptotagmin-likeprotein，如SPL1-5)、神经营养因子-3“胰高血糖素(neurotrophin-3"glucagon)，包括IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17及IL-18在内的白细胞介素(interleukin)，集落刺激因子(colony stimulating factor)，淋巴毒素-P(lymphotoxin-p)，肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)、抑瘤素-M(oncostatin-M)以及多种细胞表面分子ELK和Hek的配体(例如弗相关(eph-related kinases)激酶或LERKS相关的配体等)等。
进一步，能够通过本发明的系统和方法来生产的蛋白质包括由全部或部分的任一上述提到的蛋白质的受体及其拮抗剂的氨基酸序列构成的蛋白质，以及与该受体或其拮抗剂基本相似的蛋白质。
同样，能够通过本发明的系统和方法来生产的蛋白质包括由全部或部分的分化抗原(differentiation antigen，称为CD蛋白质)或者其配体或者基本相似的蛋白质的氨基酸序列构成的蛋白质。这些抗原的例子包括例如CD20、CD22、CD27、CD30、CD39、CD40及相应的配体的分化抗原。
酶促活性蛋白及其配体同样能够通过本发明的系统和方法来生产。这样的例子包括以下全部或部分蛋白质的一种、其配体或与该蛋白或配体基本相似的蛋白：金属蛋白酶去整合素家族成员(metalloproteinase-disintegrin familymember)、激酶(kinase)、葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、组织纤维酶原激活剂(tissue plasminogenactivator)、VIII因子(Factor VIII)、IX因子(Factor IX)、载脂蛋白E(apolipoprotein E)、载脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1)、球蛋白(globin)、IL-2拮抗剂(IL-2antagonist)、α-1抗胰蛋白酶(alpha-1antitrypsin)、肿瘤坏死因子α转化酶(TNF-alpha Converting Enzyme)、任一上述提到的酶的配体以及其他众多的酶及其配体。
声明：
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
附图说明
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
在所有附图中，误差条表示标准偏差。附图中所有显示的结果都进一步由学生t试验(Student’s T-test)(见下文)分析。
图1表示在CHO K1PD细胞中使用siRNA(Invitrogen公司)来沉默PAMmRNA的结果示意图，其中，“/1”表示平行试验1，“/2”表示平行试验2，“-K”为未转染的CHO K1PD细胞，“+K”为转染有阴性对照siRNA(Ambion)的CHOK1PD细胞。
图2表示在CHO K1PD细胞中使用siRNA(Ambion公司)来沉默PAMmRNA的结果示意图，其中，“/1”表示平行试验1，“/2”表示平行试验2，“-K”为未转染的CHO K1PD细胞，“+K”为转染有阴性对照siRNA(Ambion)的CHOK1PD细胞。
图1和图2所示的实验是用来评价Invitrogen或Ambion公司提供的siRNA对PAM基因的沉默效应。通过转染siRNA来确定CHO K1PD细胞的具有最强沉默效应的序列。这同样通过检测PAM mRNA表达量降低的百分率(参表9)以及学生t试验(参表10)来证明。
图3表示在K25克隆体上使用shRNA来沉默PAM mRNA的结果示意图，其中，“/1”表示平行试验1，“/2”表示平行试验2，“-K”为未转染的K25细胞。
图4表示在K62克隆体上使用shRNA来沉默PAM mRNA的结果示意图，其中，“/1”表示平行试验1，“/2”表示平行试验2，“-K”为未转染的K62细胞。
图5表示在CHO K1PD亲代细胞系上使用shRNA来沉默PAM mRNA的结果示意图，其中，“/1”表示平行试验1，“/2”表示平行试验2，“-K”为未转染的CHO K1PD细胞。
图6表示在CHO SSF3亲代细胞系上使用shRNA来沉默PAM mRNA的结果示意图，其中，“/1”表示平行试验1，“/2”表示平行试验2，“-K”为未转染的CHO SSF3细胞。
图3～6所示的实验是为了在测试细胞系上使用不同的shRNA和不同浓度的嘌呤毒素(puromycin PURO)来评测PAM mRNA的表达水平。观察到的最强的沉默效应是分别在所有细胞系中使用sh6(单独使用或者与sh5混合使用)产生的。这同样通过检测PAM mRNA表达量降低的百分率(参表11)以及学生t试验(参表12)被证明。观察到当使用5μg/ml的嘌呤毒素只有少量的表达水平降低。PAM的沉默是通过在mRNA水平与蛋白质水平分别确定的。
图7表示PAM的mRNA表达水平和mAb脯氨酸酰胺含量的相关性研究。其中，“/1”表示平行试验1，“/2”表示平行试验2，“-K”为未转染的K25和K62细胞。
图8为pSilencer 2.1-U6puro载体结构示意图。
图9表示由肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(peptidylglycine alpha-amidatingmonooxygenase，PAM)催化的反应过程。PAM是一种多功能蛋白质，其包括两种酶活性即依次催化多肽的C-末端切断和α-酰胺化。肽酰甘氨酸α–羟基化单加氧酶(peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase，PHM)能够催化第一步的反应(肽酰甘氨酸(C末端)->肽基-α-羟基甘氨酸(hydrooxiglycine))，并且依赖于铜、铜离子、抗坏血酸或分子氧。锌依赖的肽酰氨基-乙醇酸酶(peptidylamido-glycolate lyase，PAL)催化第二步的反应(肽基-α-羟基甘氨酸→肽-α-酰胺和乙醛酸(glyoxylate))。图摘自Prigge et al.,Science(1997)278,1300–1305。
具体实施方式
一、基于siRNA的基因沉默
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是一种源自中国仓鼠(灰色链霉菌仓鼠Cricetulusgriseus)的卵巢的细胞系。CHO细胞经常用于生物及医学研究以及商业化的治疗性蛋白质的生产过程中。基于此，本实施方式通过实验检测CHO细胞系中多肽酰胺化活性的降低。在CHO细胞中负责脯氨酸酰胺化形成的酶的详细序列还没有在文献或公共数据库中发表。潜在的核苷酸序列已从专有的CHO EST数据库中被提取出来。基于这些序列信息，构建siRNA并评测其沉默效应。基于siRNA的评测结果，构建短发夹结构的RNA(shRNA)，并且在mRNA与蛋白质水平评价基因抑制效果。
在测定灰色链霉菌仓鼠肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶核酸序列(表1)之后，分别设计9个和6个siRNA序列。转染之后培养两个CHO亲代细胞系及两个产生单克隆抗体的CHO细胞系并测试沉默效应，其中，一个产生的产物含有高脯氨酸酰胺水平，另一产生的产物含有低脯氨酸酰胺水平。培养之后，通过qPCR检测PAM mRNA水平，并且筛选出两个效果最好的沉默子用于shRNA设计。用shRNA进行转染并接着进行细胞培养，分析mRNA及PAM的水平。实验细节如下所述：
表1 提取自专用的CHO EST数据库的PAM基因序列
siRNA及shRNA的设计和制备
利用设计工具针对肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)的基因设计siRNA序列。基于上述基因序列，设计不同序列及长度的siRNA(其中，9个是由Invitrogen公司设计，6个是由Ambion公司设计)(如表2所示)。在对设计的siRNA进行评测之后，使用Ambion公司的在线设计系统设计shRNA。使用Methabion为每个shRNA分别设计互补的寡核苷酸(表3)，然后在室温下退火形成双链寡核苷酸。紧接着，将退火形成的双链寡核苷酸克隆进pSilencer 2.1-U6puro载体中，如图8所示。检测插入的寡核苷酸的序列。
表2 siRNA的核苷酸序列
名称 siRNA寡核苷酸 SEQ ID No
siRNA_1 CAGUUGUGUGUGGCAGACAGGGAAA 2
siRNA_2 CGGAUCCAAUGUUUCAGAACUGACA 3
siRNA_3 CCAAUGUUUCAGAACUGACACCAAA 4
siRNA_4 GAGAGAGAUUAAACAUGCGUCAUUU 5
siRNA_5 CAUGCGUCAUUUGGGAGAAAUGUAU 6
siRNA_6 UGGGAGAAAUGUAUUCGCAAUUUCA 7
siRNA_7 GGGAGAAAUGUAUUCGCAAUUUCAU 8
siRNA_8 CACACGAACACGGUGUGGAAGUUCA 9
siRNA_9 CAAAGAAACCGAGGCAGUUGUUGAA 10
siRNA_1 CAGUAAAUGGGAAGCCUUATT 11
siRNA_2 AGGCAGUUGUUGAAUCCAATT 12
siRNA_3 AACAGAAACUGAUCAAAGATT 13
siRNA_4 CAAGAGAAACAGAAACUGATT 14
siRNA_5 GAACUGACACCAAAGAAUUTT 15
siRNA_6 UUUCAGAACUGACACCAAATT 16
表3 shRNA的核苷酸序列
siRAN的重组
在DEPC水(DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，DEPC water)中对构建的siRNA进行重组处理，使终浓度为40μM。两组平行的核转染分别使用30pmol的siRNA。
将克隆的发夹siRNA插入至pSilencer载体
针对每个shRNA设计的互补的寡核苷酸与相应的shRNA经退火产生双链寡核苷酸。紧接着，在BamHI及HindIII限制性内切位点之间将退火寡核苷酸克隆至pSilencer 2.1-U6puro载体中。整个过程如下：
1、将发夹siRNA的模板寡核苷酸溶于100μl左右的无核酸酶的水中。
2、将上述寡核苷酸在TE中稀释至浓度为1μg/μl左右。
3、配置50μl如下表4中所述的退火混合液：
表4 siRNA的退火
体积 成分
2μl siRNA模板寡核苷酸的正链溶液
2μl siRNA模板寡核苷酸的反义链溶液
46μl 1×DNA退火溶液
4、将混合物在90℃加热3min，然后放置在37℃培养箱中培养1h。
5、用45μl无核酸酶的水稀释5μl退火后的发夹siRNA模板插入体，使终浓度为8ng/μl。
6、设置两个10μl连接反应体系，其中一个作为阳性插入连接体系(阳性对照组)，另一个作为阴性对照体系(阴性对照组)。
两组的配方如下表5所示：
表5 连接反应体系
7、16℃孵育过夜。
8、使用pGEM-T Easy Vector System(Promega,Cat.No.:A13801(表示Promega公司产品，目录号为A13801，下同))进行转化：
a)将大肠杆菌JM109感受态细胞放置在冰浴中，直到解冻。
b)在连接反应试管中加入50μl细胞溶液，并每管加入3μl连接反应液。轻轻敲打试管后孵育20分钟。
c)在42℃水浴中热激细胞50s，然后迅速将试管转移至冰上2min。
d)向转染体系中加入950μl LB培养液，并在37℃的摇床(225rpm)上孵育1.5h。
e)每个转染体系取100μl至LB/氨卡青霉素板上，并在37℃孵育过夜。
f)识别出含有siRNA模板插入体的克隆，挑选出该克隆，分离质粒DNA，用BamHI和HindIII限制性内切酶消化，以确认是否存在～65bp的siRNA模板插入体。
9、使用下列测序引物对插入体进行测序(表6)：
表6 测序引物
对shRNA表达结构进行隔离和鉴定之后，使用单刀限制性内切酶(singlecutter restriction endonuclease)SspI(AAT/ATT)进行酶切形成线性序列。每个反应体系取不超过50μg的质粒DNA，根据3U/μg DNA的量使用SspI酶消化该质粒DNA(New England Biolabs,Cat.No.:R0132L)。向反应体系中加入适量的10×反应缓冲液和水。在37℃孵育3h。消化后，按照下述步骤流程在空气层流柜产生的无菌条件下使DNA沉淀下来：
1.加入一倍体积的异丙醇(300μl)；
2.彻底震荡；
3.在4℃下以21,000转离心30min；
4.弃上清；
5.小心加入一倍体积的无菌、冰冷的70％乙醇溶液；
6.在4℃下以最大速率离心1min；
7.弃上清；
8.室温下使用空气干燥5～30min(在空气层流柜)；
9.将得到的DNA沉淀用50μl无菌水重悬。
然后，使用NanoDrop ND-1000检测仪检测线性DNA的纯度(O.D.260/280nm)和浓度。
宿主细胞
本实施方式研究了四种不同细胞系(亲代CHO K1PD与SSF3细胞系以及两个单克隆抗体产生克隆K25与K62)。CHO K1PD细胞系是来自于美国ATCC保藏中心(目录号No.CCL-61.3)的CHO K1细胞系的亚群。将原始细胞系置于无血清悬浮培养体系培养，在越来越稀的接种密度下进行连续3轮的筛选以在DM122培养基中的提高无血清亚克隆出现的概率。CHO SSF3细胞系是一种源自DUKXB1的适于无血清的细胞系。DUKXB1源自CHO K1细胞系。两个功能性的dhfr等位基因在CHO K1中相继失活。然而，实验结果证明其中一个等位基因并不是不可逆的失活。实验观察到持续性的无血清培养体系在原始二氢叶酸还原酶缺陷的(dhfr)CHO细胞系中意外诱导表达了低活性二氢叶酸还原酶。
K25与K62细胞系是通过对SSF3亲代细胞系转染pBW2017质粒载体后制备得到的。前述实验部分已经阐明，两个克隆细胞系均能够表达含有不需要的脯氨酸酰胺结构的单克隆抗体产物。K25与K62被列入沉默实验是因为相应的单克隆抗体产物含有脯氨酸酰胺的两个极端值，例如，由K25产生的含有低脯氨酸酰胺含量的单克隆抗体(4％)以及由K62产生的含有高脯氨酸酰胺含量的单克隆抗体(14％)。
核转染
使用Amaxa的核转染系统进行细胞转染(Nucleofector kit V,Cat.No.:VCA-1003)。每次转染时不超过5池，以保证足够的时间对每个池的细胞进行操作。详细操作流程如下：
1.转染时，细胞应该达到2*E6个/ml，存活率大于等于90％。
2.每个转染体系含有5*E6个细胞。
3.对细胞进行计数，并在室温下50ml的离心管中以90转/min的转速离心10分钟。
4.小心移除剩余的培养液，按照每个体系100μl的体积量将余下的细胞沉淀在溶液V中重悬。
5.加入DNA并轻轻混匀(按照30pmol siRNA每体系或者3μg shRNA每体系的加入量加入)
6.向转染管中加入混有DNA的100μl细胞悬液，再将转染管放置在AmaxaNucleofector仪器上。
7.使用Amaxa program U 23进行细胞转染。
8.向转染管中加入一些生长培养基，小心将细胞转移至含有20ml培养基的125ml的摇瓶中。用新鲜培养基冲洗转染管1-2次，并将冲洗后的溶液加入摇瓶中。将细胞至于37℃，10％CO2的环境中，以120rpm的转速在摇床上孵育24-48h。
生长培养基
CHO K1PD细胞系培养在一合适的用于哺乳动物细胞培养的培养基中，例如补充有8mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)(Sigma，Cat.No.:G7513)的DM122生长培养基。CHO SSF3细胞系培养在补充有8mM L-谷氨酰胺(Sigma，Cat.No.:G7513)以及1mg/L胰岛素(Millipore，Cat.No.:10131-027)的DM122生长培养基中。K25与K62细胞系培养在补充有8mM L-谷氨酰胺(Sigma，Cat.No.:G7513)、1mg/L胰岛素(Millipore，Cat.No.:10131-027)以及150nM methotrexate(氨甲喋呤水合物，Sigma，Cat.No.:M8407)的DM122生长培养基中。细胞筛选步骤是在先补充添加3μg/mL的嘌呤毒素并接着添加5μg/ml的嘌呤毒素(Gibco，Cat.No.:A11138-02)的上述相应的培养基中进行的。
细胞解冻和冻结
将小瓶细胞液在37℃的70％乙醇中解冻。直接将细胞按照为1*E5个活细胞/ml的初始细胞密度逐滴添加至250ml的含有50ml预热的培养基的摇瓶中。在37℃、10％CO2的环境中以120rpm的转速在摇床上培养。将细胞冻结在活力大于90％的指数生长期。在含有7.5％DMSO的条件培养基中将细胞冻存，每瓶含有5-10*E6个细胞。首先将细胞培养物离心，在室温下，将细胞以180g的速率离心5min，弃上清。接着，加入终浓度为7.5％的DMSO，将细胞轻轻重悬。将细胞悬液分装在1ml的冷冻小瓶中，并转移到Mr.Frosty cryo box的-80℃的深度冷藏环境中。在一个月内，将冷冻小瓶转移到液氮容器中。
细胞培养环境及处理手段
使用核转染技术对siRNA实验用的CHO K1PD细胞进行siRNA转染，并培养四天。在第四天，收集细胞沉淀进行qPCR分析。使用核转染技术对shRNA实验用的四种细胞系(CHO K1PD、CHO SSF3、K25及K62)进行转染。细胞分裂按照2-2-3天的流程，以2～3*E5个/ml的密度在合适的预热的培养基中保持指数生长。达到适当的细胞密度和活力后，将培养细胞分成四组并按照如下四个分开的实验流程进行处理：
1.收集样品进行qPCR(细胞沉淀)；
2.将细胞接种在含有3μg/ml的嘌呤毒素的培养基上培养10天(10天后，收集上清液进行CEX分析)；
3.每个细胞培养基分成3瓶进行冷冻保存；
4.将细胞进一步培养在含有5μg/ml嘌呤毒素的培养基中。
当达到合适的细胞密度和活力后，使用5μg/ml的嘌呤毒素培养基重复上述步骤1、2和3。
在125ml的摇瓶中进行细胞培养。孵育条件：37℃，125及250ml的摇瓶，90-110rpm，DM122培养基，10％CO2的环境。
嘌呤毒素选择
转染后的第一步筛选即使用嘌呤毒素(puromycin)进行抗生素选择。抗生素选择时，使用终浓度为3mg/ml的嘌呤毒素对每个转染体系进行选择。转染后2天，当细胞活力超过60％时，将嘌呤毒素添加到细胞培养基中。当每个转染体系的细胞活力超过85％时，使用5mg/ml的嘌呤毒素进行追加选择。
RNA分离及cDNA合成
RNA分离之前向5*E6个细胞的培养体系中加入10ng RNA荧光素酶(Promega,Cat.No.:L4561)。在自动化的工作站QIAcube上使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Cat.No.:74104)分离总RNA(totRNA)。分离后，使用NanoDrop分析仪检测totRNA的浓度。接着，向5μg totRNA(表7)中加入DNaseI(Ambion,Cat.No.:AM1906)并进行孵育(37℃25min，75℃10min)。DNase处理之后，使用SuperScript VILO kit将RNA转录成cDNA(Invitrogen,Cat.No.:11754-050)。
表7 DNase I处理及cDNA合成
qPCR
使用基于TaqMan化学的qPCR方法确定mRNA的表达水平(TaqManMasterMix,Applied Biosystems,Cat.No.:4326708and Assay by design,AppliedBiosystems,Cat.No.:4331348，参表8)。PAM mRNA的表达水平使用绝对定量的方法来计算，并被表示为每个细胞也即每个参考基因ACTB(β-actin)的mRNA转录物的数量。在计算每个ACTB基因时，使用分离的基因组DNA构建标准曲线，并用该标准曲线确定ACTB mRNA的拷贝数目。确定PAM与ACTB的mRNA表达比值。当计算出每个细胞的mRNA拷贝数后，使用荧光素酶标记的DNA构建标准曲线，并确定用于荧光素酶的mRNA拷贝数。计算PAM与LUC的mRNA表达比值并确定每个细胞的PAM mRNA表达水平(参图1～6)。
表8 qPCR引物及探针的核苷酸序列
阳离子交换色谱法(Cation Exchange Chromatography，CEX)
通过使用分析型HPLC色谱系统的CEX来分析蛋白A提纯的单克隆抗体(mAb)。通过使用这种方法，赖氨酸和脯氨酸酰胺被洗脱在相同的峰值内。再通过对产品的C末端使用羧基肽酶(carboxypeptidase)进行处理以确定脯氨酸酰胺的量。接着进行相同的CEX分析，留下的峰值即脯氨酸酰胺的表达量。
实验结果
本研究的目的是通过使用siRNA和shRNA评价PAM基因的沉默效应。PAM基因的沉默效应可通过mRNA及蛋白质表达水平分别来确定。使用siRNA转染CHO K1PD细胞来确定最有效的沉默效应的序列(图1～2及表9～10)。
表9 计算每个ACTB及每个LUC时的沉默效应区别
表10 学生t试验(Student’s t-Test)
从上述结果(图1～2及表9)可以看出当使用Invitrogen公司的siRNA时，PAM mRNA的表达有超过90％的下降，当时使用Ambion公司的siRNA时，PAM mRNA的表达有超过75％的下降。使用学生t-试验(表10)确定哪些siRNA与阴性对照显著不同。结果显示与计算百分率不同的计算结果相同(与阴性对照组相比较，较低的p-值(p-value)表明表达上的较大区别)。基于上述结果，选出两种siRNA序列并构建shRNA载体(用于PAM的si5及si6)。由于shRNA的设计限制，仅有源于Ambion公司的siRNA的序列用于shRNA构建。为了评价PAM的沉默效应，对两个亲代细胞系CHO K1PD及SSF3细胞以及两种单克隆抗体产生克隆(其中，K25产品具有低的脯氨酸酰胺含量，K62产品具有高的脯氨酸酰胺含量)分别转染两种shRNA及两种shRNA的混合。连续使用两种不同浓度的嘌呤毒素用于筛选转染细胞(图3～6)。PAM的沉默效应进一步通过产生的单克隆抗体的CEX分析等蛋白质表达水平的分析来评价，并确定了其与mRNA表达水平的关系(图7)。
图3～6的实验结果示出了对试验细胞系使用不同shRNA和不同浓度的嘌呤毒素(PURO)的PAM的mRNA表达水平。使用sh6(单独使用或者与sh5混合使用)的所有细胞系都能够单独观察到最强的沉默效应，该结果同样可以通过计算PAM的mRNA的表达下降的百分率(表11)及学生t-试验(表12)来予以证明。使用5μg/ml的嘌呤毒素只观察到轻微的表达水平的降低。
表11 计算每个ACTB及每个LUC时的沉默效应差异百分率
表12 学生t-试验
图7的结果示出了mRNA与PAM修饰的单克隆抗体的相互关系。该相互关系也可通过计算Pearson函数(Pearson’s function)予以示出(Pearson相关系数确定为0.55)。
二、使用锌指核酸酶(ZFN)敲除CHO细胞系中的目标基因
锌指核酸酶能够设计成高特异性的靶向选择的位点。在这些核酸酶的瞬时表达过程中，目标基因首先被ZFN剪切，然后通过一个自然的但非完善的DNA修复过程进行修复将非同源末端连接。这常常导致突变体(空)等位基因的产生。该过程例如在Santiago et al,2008("Targeted gene knockout in mammaliancells by using engineered zinc-finger nucleases",PNAS April 15,2008vol.105no.15)文献中有描述。
设计靶向PAM基因位点的位点特异性的ZFN，并在体外筛选使DNA结合到靶位点。ZFN的核酸酶功能能够被核酸内切酶FokI的催化区域赋予，该催化区域能够连接到DNA结合锌指蛋白上。
将表达各对ZFN的质粒转染进CHO细胞。通过使用CEL I核酸酶来确定ZFN对每池细胞的靶位点介导的干扰频率。
PAM-/-细胞系的产生是首先通过对CHO-S细胞转染ZFN对，然后进行有限稀释以得到源自PAM缺陷型细胞系的单个细胞。稀释克隆后(平均每个池一个细胞)，分离物通过CEL-I分析方法分析PAM基因破坏情况。每个细胞系的突变型等位基因的确切序列以及因此产生的基因型通过PCR扩增靶位点及PCR产物的克隆来确定。
三、TALENS基因打靶
TALEN是一种新的融合蛋白，包括耦合到FokI核酸酶的组装的DNA结合基序。该DNA结合基序来源于植物病原体黄单胞菌属细菌分泌的蛋白。
传统的TALEN的组装或者TAL效应子的构建已有文献报道，如Cermak etal,2011(Efficient design and assembly of custom TALEN and other TALeffector-based constructs for DNA targeting；Nucl.Acids Res.39(12))，主要包括两个步骤：(i)将重复模块组装成1-10个重复的中介阵列，以及(ii)将中介阵列连接起来形成骨架以得到最终结构。详细的步骤流程记载在Cermak etal.2011一文中。
用于设计TALEN的软件作为一种在线工具是可供实验者使用的(TALEffector-Nucleotide Targeter,TALE-NT；http://boglabx.plp.iastate.edu/TALENT/)。该在线工具提供了一种输入靶向目标基因的DNA序列的窗口，例如，PAM基因。该软件能够识别长度在15～30bp之间并被空格分开的TALEN识别位点模式。默认间隔长度为15bp和18-30bp，其他长度的也可以由用户自行指定。进一步，该软件还有设有按钮供用户逐个排除设计指南。
使用Xho I及AflII两种限制性内切酶将靶向PAM基因的TALEN对中的一个酶切后亚克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.1(-)(Invitrogen)上。这些酶能够切除源自pTAL3或pTAL4的整个TALEN，并把编码序列连接至CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)启动子的控制之下。产生的质粒通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)并遵循操作指南转染进HEK293T细胞中。转染72小时后收集细胞，并用Hpy188I将基因组DNA分离和消化。Hpy188I能够在TALEN靶标位点之间的间隔序列处切开基因组DNA。消化后，PCR扩增含有靶标位点的染色体片段。接着，用Hpy188I消化PCR产物并克隆进TOPO TA载体(Invitrogen)上。对含有全长PCR产物的独立克隆进行测序以在剪切位点评估突变。

Claims (15)

1.一种用于蛋白质表达的细胞，其具有降低的肽酰胺化活性。
2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述降低的肽酰胺化活性是通过如下方式实现的：
a)抑制或降低编码用于催化肽α－酰胺化的酶的基因的基因表达；
b)表达功能异常或失活的用于催化肽α－酰胺化的酶，或者表达具有降低活性的用于催化肽酰胺化的酶；和/或
c)抑制或降低用于催化肽α－酰胺化的酶的活性。
3.一种用于在给定细胞中降低肽酰胺化活性的方法，该方法包括选自下列集合中的至少一步骤：
a)抑制或降低编码用于催化肽α－酰胺化的酶的基因的基因表达；
b)表达功能异常或失活的用于催化肽α－酰胺化的酶，或者表达具有降低活性的用于催化肽酰胺化的酶；和
c)抑制或降低用于催化肽α－酰胺化的酶的活性。
4.如上述任一权利要求所述的细胞或方法，其特征在于，降低的肽酰胺化活性是通过对编码催化肽α-酰胺化的酶的基因进行下述至少一种改造方式来实现的：
基因沉默；
基因抑制；
基因敲除；
显性负构造体的引入；
条件性基因敲除；和
基因变异。
5.如上述任一权利要求所述的细胞或方法，其特征在于，所述细胞是指真核细胞。
6.如上述任一权利要求所述的细胞或方法，其特征在于，所述细胞是指动物细胞和/或植物细胞。
7.如上述任一权利要求所述的细胞或方法，其特征在于，所述细胞是指哺乳动物细胞。
8.如上任一权利要求所述的细胞或方法，其特征在于，所述细胞是指重组细胞。
9.如上述任一权利要求所述的细胞或方法，其特征在于，所述细胞是选自下述集合中的至少一种：
幼仓鼠肾细胞(例如BHK21)；
中国仓鼠卵巢细胞(例如CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DXB或CHO-dhfr)；
小鼠骨髓瘤细胞(例如SP2/0或NS0)；
人类胚胎肾细胞(例如HEK-293)；
人类视网膜源细胞(例如PER-C6)；和
羊水细胞(例如CAP)。
10.如上述任一权利要求所述的细胞或方法，其特征在于，用于催化肽酰胺化的酶是肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)。
11.如上述任一权利要求所述的细胞或方法，其特征在于，用于催化肽酰胺化的所述酶的编码基因的基因表达是通过RNA干扰(RNAi)的方式被抑制或降低。
12.如上述任一权利要求所述的细胞或方法，其特征在于，用于催化肽酰胺化的酶催化C-末端脯氨酸酰胺残基的形成。
13.如上述任一权利要求所述的细胞在同源蛋白的表达上的用途。
14.如上述任一权利要求所述的细胞在异源蛋白的表达上的用途。
15.如权利要求13或14所述的用途，其中，所述蛋白质是选自如下集合中的至少一种蛋白质：
抗体或其片段或其衍生物；
融合蛋白；
抗体类似物；和
非抗体蛋白质。
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