JP2018068279A - タンパク質発現のための細胞株におけるアミド化アミノ酸形成の減少 - Google Patents

Abstract

【課題】ペプチドアミド化活性を減少させる方法を提供する。【解決手段】ペプチドアミド化活性が減少している細胞株、およびその使用により、ペプチドアミド化活性を減少させる。【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質発現のための細胞株におけるアミド化アミノ酸形成の減少に関する。

タンパク質は主に、そのアミノ酸配列（一次構造）によって特徴付けられるが、翻訳後修飾などの他の側面もまた、例えば二次、三次および四次構造に影響を及ぼすことによって、タンパク質の特性に寄与する。これらの翻訳後修飾のいくつかは、生物薬剤の安全性および有効性を含む、後のタンパク質活性に重要な役割を果たす。

タンパク質の不均一性に関する１つの主要な側面は、例えばアスパラギンのようなアミノ酸の脱アミド化によるか、グリコシル化によるか、またはＮ末端グルタミンのピログルタメートへのプロセシングによって形成される酸性変異体、および例えばアミド化アミノ酸、特にＣ末端プロリンアミド残基を含む塩基性変異体を含む、電荷パターンである。

しかし、Ｃ末端プロリンアミドのようなアミド化アミノ酸の形成は、いくつかの場合、例えば望ましくない不均一性の供給源として、あるいは前記変異体がタンパク質活性または免疫原性に潜在的に影響を及ぼす場合、あるいは産生しようとするタンパク質中のアミド化アミノ酸、例えばプロリンアミドの量が参照タンパク質よりもより高いかまたはより低い場合、望ましくない。

非常に制御可能な物理化学的条件下で産生される低分子薬剤とは対照的に、タンパク質、特に生物療法として用いられるタンパク質（生物薬剤）の産生は、該産生に生存細胞培養系を利用するため、非常に複雑な事柄であり、制御が困難である。したがって、一定の製品品質および一定の高収率を提供して、産生プロセスの効率を増加させ、産生されるタンパク質の生理学的活性および得られる薬剤の安全性を増加させ、そして／または微調整し、そして／または産生されるタンパク質の翻訳後特徴を参照タンパク質のものとマッチさせるためには、産生されるタンパク質の特に翻訳後修飾を制御することを可能にするツールボックスが手近にあることが重要である。

本発明の目的は、これらの必要性に取り組む手段および方法を提供することである。

目的は、本発明の独立クレームにしたがった方法および手段で叶えられる。従属クレームは、好ましい態様に関する。数値によって区切られた値の範囲は、前記の区切りの値を含むことが理解されると理解されるものとする。

本発明を詳細に記載する前に、本発明は、記載するデバイスまたは手段の特定の構成要素部分、あるいは記載する方法のプロセス工程に限定されないことが理解されるものとし、これはこうしたデバイスまたは手段および方法が多様でありうるためである。本明細書で用いる専門用語は、特定の態様のみを記載する目的のためのものであり、そして限定されることを意図しないことが理解されるものとする。本明細書および付随する請求項において用いられるような、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、背景が明らかに別に指示しない限り、単数および／または複数の指示対象が含まれることに留意すべきである。数値によって区切られたパラメータ範囲が与えられている場合、範囲はこれらの限界値を含むと考えられることがさらに理解されるものとする。

本発明の第一の側面にしたがって、ペプチドアミド化活性が減少している、タンパク質発現のための細胞を提供する。

本明細書において、用語「細胞」はまた、そこから得られる細胞株も含むものとする。さらに、こうした細胞または細胞株から得られる動物、細胞に基づく発現プラットフォームは、こうした用語によって提供される保護に含まれるものとする。

本明細書において、用語「タンパク質発現のための」は、本発明の細胞が、産業プロセスにおけるタンパク質発現に適していることを示す。これには、同種および／または異種タンパク質発現が含まれる。本発明の細胞が産業プロセスにおけるタンパク質発現に適しているという事実は、元々、ペプチドアミド化活性が減少しているが、それ自体、そしてさらなる修飾、単離または処理を伴わずには、産業プロセスにおけるタンパク質発現に適していない、天然環境で生じる細胞が、存在していたとしても、本発明の細胞の新規性を予測しないことを意味する。

ペプチドアミド化は、多くの生物活性ペプチドが経る、広範で、しばしば本質的な翻訳後修飾である。ペプチドアミド化は、例えば、神経内分泌ペプチドを活性α−アミド化産物に触媒するよう働く。

しかし、ペプチドアミド化は、いくつかの場合、例えば望ましくない不均一性の供給源として、あるいは前記変異体がタンパク質活性または免疫原性に潜在的に影響を及ぼす場合、あるいは産生しようとするタンパク質中のアミド化アミノ酸、例えばプロリンアミドの量が参照タンパク質よりもより高いかまたはより低い場合、望ましくない。

本発明の細胞の好ましい態様において、ペプチドアミド化活性減少は
ａ）ペプチドα−アミド化を触媒する酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害または減少；
ｂ）ペプチドα−アミド化を触媒する機能不全または不活性酵素、あるいは活性が減少している、ペプチドアミド化を触媒する酵素の発現；および／または
ｃ）ペプチドα−アミド化を触媒する酵素の活性の阻害または減少
によって達成されている。

本発明の別の側面にしたがって、所定の細胞において、ペプチドアミド化活性を減少させる方法であって
ａ）ペプチドα−アミド化を触媒する酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害または減少；
ｂ）ペプチドα−アミド化を触媒する機能不全または不活性酵素、あるいは活性が減少している、ペプチドアミド化を触媒する酵素の発現；および／または
ｃ）ペプチドα−アミド化を触媒する酵素の活性の阻害または減少
からなる群より選択される少なくとも１つの工程を含む、前記方法を提供する。

本発明の好ましい態様にしたがって、ペプチドアミド化活性減少は、ペプチドα−アミド化を触媒する酵素をコードする遺伝子に関する
・遺伝子サイレンシング、
・遺伝子ノックダウン、
・遺伝子ノックアウト、
・ドミナントネガティブ構築物の送達、
・条件付き遺伝子ノックアウト、および／または
・遺伝子改変
からなる群より選択される少なくとも１つの工程によって達成されているか、または達成可能である。

用語「遺伝子発現」は、本明細書において、ｍＲＮＡへのＤＮＡ転写、ｍＲＮＡプロセシング、非コードｍＲＮＡ成熟、ｍＲＮＡ排出、翻訳、タンパク質フォールディングおよび／またはタンパク質輸送からなる群より選択される少なくとも１つの工程を含むよう意図される。

遺伝子の遺伝子発現の阻害または減少は、限定されるわけではないが、例えば特異的プロモーター関連リプレッサーの使用による、所定のプロモーターの部位特異的突然変異誘発による、プロモーター交換による、ＤＮＡ転写の阻害または減少、あるいは例えばＲＮＡｉ誘導性転写後遺伝子サイレンシングによる、翻訳の阻害または減少を含む、遺伝子発現に直接干渉する方法を指す。

ペプチドα−アミド化を触媒する機能不全または不活性酵素、あるいは活性が減少している、ペプチドアミド化を触媒する酵素の発現は、例えば、コード遺伝子内の部位特異的またはランダム突然変異誘発、挿入または欠失によって達成可能である。

ペプチドアミド化を触媒する酵素の活性の阻害または減少は、例えば、タンパク質発現前の、またはそれと同時の、それぞれの酵素に対する阻害剤の投与またはこうした阻害剤とのインキュベーションによって達成可能である。こうした阻害剤の例には、限定されるわけではないが、阻害性ペプチド、抗体、アプタマー、融合タンパク質、または前記酵素に対する抗体模倣体、あるいはそのリガンドまたは受容体、あるいは阻害性ペプチドまたは核酸、あるいは類似の結合活性を持つ小分子が含まれる。

酵素を阻害する他の方法は、培地中の酵素の特定の補因子の減少であり、例えば、ＰＡＭ特異的イオン補因子（例えばＣｕＳＯ_４の形で）である銅、ＰＡＭの電子供与体として作用するアスコルベート、分子酸素、カタラーゼおよび当業者に今日知られる他のもの、または将来発見されるであろうものがある。

遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックダウンおよび遺伝子ノックアウトは、遺伝子修飾を通じるか、あるいはｍＲＮＡ転写物または遺伝子のいずれかに相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドでの処理によるかいずれかで、遺伝子の発現を減少させる技術を指す。ＤＮＡの遺伝子修飾を行う場合、結果はノックダウンまたはノックアウト生物である。遺伝子発現変化が、ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチド結合または遺伝子への一時的結合によって引き起こされる場合、これは染色体ＤＮＡの修飾を伴わない遺伝子発現の一時的変化を生じ、そして一過性ノックダウンと呼ばれる。

上記用語によってもまた含まれる一過性ノックダウンにおいて、活性遺伝子または転写物へのこのオリゴヌクレオチドの結合は、転写のブロッキングを通じた発現減少（遺伝子結合の場合）、ｍＲＮＡ転写物の分解（例えば小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＲＮアーゼＨ依存性アンチセンス）、あるいはｍｉＲＮＡなどの、他の機能性ＲＮＡの成熟に用いられるｍＲＮＡ翻訳、プレ−ｍＲＮＡスプライシング部位またはヌクレアーゼ切断部位のいずれかのブロッキング（例えばモルホリノオリゴまたは他のＲＮアーゼＨ独立アンチセンスによる）を通した発現減少を引き起こす。他のアプローチは、ｓｈＲＮＡ（ＲＮＡ干渉を通じて、遺伝子発現をサイレンシングするために使用可能な堅固なヘアピンターンを作製するＲＮＡ配列である、低分子ヘアピンＲＮＡ）、ｅｓｉＲＮＡ（エンドリボヌクレアーゼでの長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の切断から生じるｓｉＲＮＡオリゴの混合物である、エンドリボヌクレアーゼが調製するｓｉＲＮＡ）の使用、またはＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化を伴う。

遺伝子サイレンシング、ノックダウンまたはノックアウトを実行する他のアプローチが、それぞれの文献から当業者に知られ、そして本発明の背景において、これらの適用はルーチンと見なされる。

遺伝子ノックアウトは、遺伝子発現が完全にブロッキングされる、すなわちそれぞれの遺伝子が動作不能であるか、またはさらに除去される技術を指す。この目的を達成する方法論的アプローチは多様であり、そして当業者に知られる。例は、所定の遺伝子に関してドミナントネガティブである突然変異体の産生である。こうした突然変異体は、部位特異的突然変異誘発（例えば欠失、部分的欠失、挿入または核酸置換）によって、適切なトランスポゾンの利用によって、またはそれぞれの文献から当業者に知られ、したがって本発明の背景におけるその適用がルーチンと見なされる他のアプローチによって、産生可能である。当業者が本発明の背景において有用と見なすであろう新規開発技術の１つの例は、ターゲティング化ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によるノックアウトである。それぞれのキットは、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、「コンポＺＲノックアウトＺＦＮ」として提供される。別のアプローチは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用を含む。

ドミナントネガティブ構築物の送達は、例えばトランスフェクションによる、機能不全酵素をコードする配列の導入を伴う。機能不全酵素の遺伝子発現が野生型酵素の天然発現を封じ、次に、それぞれの酵素活性の有効な生理学的欠損を導くように、前記コード配列は、強いプロモーターに機能的にカップリングされる。

条件付き遺伝子ノックアウトは、組織または時間特異的方式で、遺伝子発現のブロッキングを可能にする。これは、例えば、関心対象の遺伝子周囲に、ｌｏｘＰ部位と呼ばれる短い配列を導入することによって行われる。再び、他のアプローチがそれぞれの文献から当業者に知られ、そして本発明の背景において、これらの適用はルーチンと見なされる。

１つの他のアプローチは、機能不全遺伝子産物または活性が減少した遺伝子産物を導きうる、遺伝子改変である。このアプローチは、フレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異（すなわち未成熟停止コドンの導入）、あるいは全遺伝子産物を機能不全にするか、または活性減少を引き起こす、アミノ酸置換を導く突然変異を伴う。こうした遺伝子改変は、例えば、非特異的（ランダム）突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発のいずれかの突然変異誘発（例えば欠失、部分的欠失、挿入または核酸置換）によって産生可能である。

遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、ドミナントネガティブ構築物の送達、条件付き遺伝子ノックアウト、および／または遺伝子改変の実際の適用を記載するプロトコルは、当業者に一般に入手可能であり、そしてそのルーチン内である。本明細書に提供する技術的解説は、したがって、ペプチドα−アミド化を触媒する酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害または減少を、あるいはペプチドα−アミド化を触媒する機能不全もしくは不活性酵素、または減少した活性でペプチドアミド化を触媒する酵素の発現を導く、すべてのありうる方法に関して、完全に有効となる。

本発明の別の好ましい態様にしたがって、細胞は真核細胞である。用語「真核細胞」は、限定されるわけではないが、例えば昆虫細胞のような動物細胞、植物細胞および真菌細胞を含む。したがって、本発明の好ましい態様は、細胞が動物細胞および／または植物細胞であると規定する。

本発明のさらに別の好ましい態様にしたがって、細胞は哺乳動物細胞である。本発明のさらに別の好ましい態様にしたがって、細胞は：
・ベビーハムスター腎臓細胞（例えばＢＨＫ２１）
・チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ、またはＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻）
・マウス骨髄腫細胞（例えばＳＰ２／０またはＮＳ０）
・ヒト胚性腎臓細胞（例えばＨＥＫ−２９３）
・ヒト網膜由来細胞（例えばＰＥＲ−Ｃ６）、および／または
・羊膜細胞（例えばＣＡＰ）
からなる群より選択される少なくとも１つである。

別の好ましい態様にしたがって、細胞は組換え細胞である。本明細書において、用語「組換え細胞」は、細胞のクローン拡大において取り込まれたままであるように安定に取り込まれているか、または細胞（または細胞集団）内に一過性に導入されているかいずれかの、外因性および／または異種核酸が取り込まれている細胞を指す。こうした外因性および／または異種核酸は、発現しようとする異種タンパク質をコードしてもよいし、あるいはペプチドα−アミド化を触媒する酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害もしくは減少、またはペプチドα−アミド化を触媒する機能不全もしくは不活性酵素、もしくは活性が減少したペプチドアミド化を触媒する酵素の発現を達成してもよい。

好ましくは、ペプチドアミド化を触媒する酵素は、ペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）である。ＰＡＭは、連続して作用してペプチドのＣ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）およびアルファ−アミド化を触媒する２つの酵素活性を含有する、多機能タンパク質である。ペプチジルグリシン・アルファ−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）は、反応の第一の段階を触媒し、そして銅（Ｃｕ）、または銅イオン、アスコルベート、および分子酸素に依存する。亜鉛依存性ペプチジルアミド−グリコール酸リアーゼ（ＰＡＬ）は、反応の第二の段階、この時点でＣ末端にあるプロリンのプロリンアミドへのアミド化を触媒する。両酵素によって触媒されるプロセスの反応スキームに関しては、図９を参照されたい。実際の遺伝子または酵素は、もちろん、タンパク質発現に用いられる細胞に応じる。

こうした遺伝子または酵素の一例は、ヒト・ペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＮＣＢＩ遺伝子データベースによる遺伝子ＩＤ：５００６）であり、この遺伝子は、触媒活性を持つ２つの酵素活性ドメイン：（ｉ）ペプチジルグリシン・アルファ−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）および（ｉｉ）ペプチジル−アルファ−ヒドロキシグリシン・アルファ−アミド化リアーゼ（ＰＡＬ）を有する多機能タンパク質をコードする。これらの触媒ドメインは連続して働いて、神経内分泌ペプチドを活性アルファ−アミド化産物に触媒する。異なるアイソフォームをコードする多数の選択的スプライシング転写物変異体がこの遺伝子に関して記載されてきているが、その全長配列のいくつかは未だに知られていない。該遺伝子は、５ｑ１４−ｑ２１に位置する。タンパク質発現のために用いられる細胞がヒト細胞（例えばＨＥＫ、ＰＥＲ−Ｃ６またはＣＡＰ）である場合、好ましくは、（ｉ）前記遺伝子の遺伝子発現が阻害されるかまたは減少するか、あるいは（ｉｉ）機能不全もしくは不活性酵素、または活性が減少した酵素が発現されるか、あるいは（ｉｉｉ）前記酵素の活性が阻害されるかまたは減少すると規定される。

こうした遺伝子または酵素の別の例は、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）が得られうるチャイニーズハムスター（クリセツルス・グリセウス（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））のようなハムスターのペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼである。それぞれの遺伝子配列は、公的データベースに未だに公表されていないが、それぞれの発現配列タグ（ＥＳＴ）が列挙される、私有データベースが存在する。

タンパク質発現のために用いる細胞がハムスター細胞（例えばＢＨＫまたはＣＨＯまたはＣＡＰ）である場合、好ましくは、（ｉ）前記遺伝子の遺伝子発現が阻害されるかまたは減少するか、あるいは（ｉｉ）機能不全もしくは不活性酵素、または活性が減少した酵素が発現されるか、あるいは（ｉｉｉ）前記酵素の活性が阻害されるかまたは減少すると規定される。

こうした遺伝子または酵素の別の例は、ネズミ・ペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ（遺伝子ＩＤ：１８４８４）であり、その遺伝子は、触媒活性を持つ２つの酵素的に活性であるドメイン：（ｉ）ペプチジルグリシン・アルファ−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）および（ｉｉ）ペプチジル−アルファ−ヒドロキシグリシン・アルファ−アミド化リアーゼ（ＰＡＬ）を有する、多機能タンパク質をコードする。これらの触媒ドメインは、連続して働いて、神経内分泌ペプチドを活性アルファ−アミド化産物に触媒する。異なるアイソフォームをコードする多数の選択的スプライシング転写物変異体がこの遺伝子に関して記載されてきているが、その全長配列のいくつかは未だに知られていない。該遺伝子は、１Ｄ； １ ５７．５ｃＭに位置する。

タンパク質発現のために用いる細胞がマウス細胞（例えばＳＰ２／０またはＮＳ０）である場合、好ましくは、（ｉ）前記遺伝子の遺伝子発現が阻害されるかまたは減少するか、あるいは（ｉｉ）機能不全もしくは不活性酵素、または活性が減少した酵素が発現されるか、あるいは（ｉｉｉ）前記酵素の活性が阻害されるかまたは減少すると規定される。

他の例は、タンパク質発現のために用いる細胞が昆虫細胞である場合の、昆虫ペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼＣＯＯＨ末端相互作用タンパク質−１（遺伝子ＩＤは、例えば、５５６７８７６、６０５３６１８または６０４３２９３）を含む。

タンパク質発現のための他の潜在的な細胞に（例えば酵母、植物、糸状菌、またはさらに細菌に）存在するペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼもまた、本発明の範囲内に含まれるものとする。同様に、ペプチドアミド化が可能な、特にプロリンアミド形成が可能な他の酵素もまた、本発明の範囲内に含まれるものとする。これらの酵素に対する本発明の解説の移行は、いかなるさらなる発明工程も伴わない。

ペプチドアミド化を触媒する前記酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって阻害されるかまたは減少する、本発明の前述の側面および態様いずれか記載の細胞または方法。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御され、そして細胞の細胞質中にある短い二本鎖ＲＮＡ分子によって開始され、細胞質で該分子が触媒性ＲＩＳＣ構成要素アルゴノートと相互作用する、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングプロセスである。ＲＮＡｉ経路は、動物を含む多くの真核生物で見られ、そして酵素ダイサーによって開始され、ダイサーは、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を、ｓｉＲＮＡと呼ばれる〜２０ヌクレオチドの短い断片に切断する。各ｓｉＲＮＡは、２つの一本鎖ｓｓＲＮＡ、すなわちパッセンジャー鎖およびガイド鎖に巻き戻される。パッセンジャー鎖は、分解され、そしてガイド鎖はＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体に取り込まれる。

遺伝子操作における遺伝子サイレンシング目的のため、ＲＮＡは細胞質に直接移入され、そして酵素によって短い断片に切断される。開始ｄｓＲＮＡはまたゲノムにおけるＲＮＡコード遺伝子から発現されるプレマイクロＲＮＡにおけるように、内因性（細胞で生じる）であってもよい。こうした遺伝子からの一次転写物はまず、プロセシングされて、核においてプレｍｉＲＮＡの特徴的なステム−ループ構造を形成し、そして次いで、ダイサーによって切断されるよう、細胞質に排出される。したがって、２つのｄｓＲＮＡ経路、外因性および内因性の経路が、ＲＩＳＣ複合体で収束する。

好ましくは、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：典型的には＞２００ｎｔ）を用いて、ペプチドα−アミド化を触媒する前記酵素をコードする遺伝子の発現をサイレンシングする。導入に際して、ｄｓＲＮＡは、ダイサーによって、２０〜２５ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される（開始工程）。次いで、ｓｉＲＮＡは、プロセスにおいてほどけてＲＩＳＣに組み立てられる。

ｓｉＲＮＡ鎖は、続いて、相補的ＲＮＡ分子にＲＩＳＣを導き、ＲＩＳＣは、同族ＲＮＡを切断し、そして破壊する（エフェクター工程）。同族ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ鎖によって結合される領域の中央で起こる。哺乳動物培養細胞において、ＲＮＡｉは、典型的には、ｓｉＲＮＡの使用によって誘導される。培養細胞においては、ｓｉＲＮＡを産生するための２つの一般的な方法：合成ｓｉＲＮＡの送達、および細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされる短いヘアピンＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ）を発現するＤＮＡ構築物の導入がある。本発明の背景で用いられるそれぞれのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを実験セクションに示す。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、次の世代の細胞においてもまた、それぞれの細胞株で確立可能である遺伝子発現の非一過性阻害を導く場合、結果は細胞または細胞株のノックダウンまたはノックアウトである。

本発明のさらに別の好ましい態様にしたがって、ペプチドアミド化を触媒する酵素は、Ｃ末端プロリンアミド残基の形成を触媒する。

多くのヒト免疫グロブリンの重鎖は、そのＣ末端（例えば定常領域）に、−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ（一文字コード：ＰＧＫ）からなる配列モチーフを有し、ここで、Ｃ末端Ｌｙｓは、しばしば、塩基性カルボキシペプチダーゼによる除去の対象であり、したがって、Ｃ末端にＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨが残る。

多くのタンパク質発現系において、この配列モチーフは、ペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼのような、ペプチドα−アミド化を触媒する酵素のターゲットであり、該酵素は例えば、Ｃ末端ペプチジル−プロリル−グリシンをペプチジル−プロリル−α−ヒドロオキシグリシンに変換し、そして次いで、ペプチジル−プロリン−α−アミドおよびグリオキシレートに変換する（図９およびそれぞれの説明を参照されたい）。

Ｃ末端プロリンアミド残基の形成は、したがって、モノクローナル抗体および重鎖定常領域を含むその誘導体、例えばＩｇＧ、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を有する受容体−免疫グロブリン融合タンパク質、例えばエタネルセプトまたはアフリベルセプト、または免疫毒素およびＦｃ領域を有する三官能性抗体のタンパク質発現に頻繁に見られる。

本発明の別の側面にしたがって、相同性タンパク質発現に関する前述の請求項のいずれか記載の細胞の使用を提供する。

本発明のさらに別の側面にしたがって、異種タンパク質発現に関する前述の請求項のいずれか記載の細胞の使用を提供する

用語「異種タンパク質発現」は、本明細書において、発現が起こる細胞（「宿主細胞」または「発現系」）にとって外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）である、遺伝子、核酸またはｃＤＮＡのタンパク質発現を指すものとする。異種（「異なる生物由来」を意味する）は、しばしば、トランスファーするタンパク質を、まず、異なる細胞タイプまたは異なる種からクローンするかまたは得て、そしてコード遺伝物質（「ｃＤＮＡ」）を得て、これを次いで宿主細胞にトランスファーするという事実を指す。トランスファーされる遺伝物質は、典型的にはレシピエント細胞がｃＤＮＡをタンパク質として発現することを促進する形式でなければならない（すなわち発現ベクターに入れられる）。レシピエント細胞に外来遺伝物質をトランスファーするための方法には、トランスフェクションおよび形質導入が含まれる。レシピエント細胞タイプの選択は、しばしば、タンパク質の機能を詳細に調べる実験的必要性に基づき、そして異種発現系として知られる最も普及しているレシピエントを、とりわけ（ｉ）ＤＮＡをトランスファーする容易さ、（ｉｉ）薬学的に有効な型、機能のタンパク質を生成する能力、（ｉｉｉ）タンパク質収量等に関して選択する。

用語「組換えタンパク質発現」は、用語「異種タンパク質発現」と大部分重複する。用語「組換え」は、「新規の」コード遺伝物質が発現系、例えば細胞に導入されているという事実を示唆する。こうしたプロセスは、組換え核酸（例えば組換えＤＮＡ）の形成を生じ、そして宿主はしたがって、組換え宿主、例えば組換え細胞と呼ばれる。このプロセスの背後にある１つのアイディアは、別の生物において、例えば細胞に基づくタンパク質発現系、例えばＣＨＯ細胞において、１つの生物由来のタンパク質（例えばヒトタンパク質）を産生することである。

好ましくは、前記タンパク質は：
・抗体、あるいはその断片または誘導体
・融合タンパク質、
・抗体模倣体、および／または
・非抗体タンパク質
からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質である。

用語「抗体」は、本明細書において、免疫グロブリン、あるいはその断片または誘導体に関連するものとする。特に好ましくは、こうした抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ、あるいはその断片または誘導体からなる群より選択される。本明細書において、用語「断片」は、いくつかの場合、ターゲット結合能を保持するこうした抗体の断片、例えば
・ＣＤＲ（相補性決定領域）
・超可変領域、
・可変ドメイン（Ｆｖ）
・ＩｇＧ重鎖（ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）
・ＩｇＧ軽鎖（ＶＬおよびＣＬ領域からなる）、および／または
・Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）_２
を指すものとする。

本明細書において、用語「誘導体」は、一般的な抗体概念とは構造的に異なるが、なお何らかの構造的関連を有するタンパク質構築物、例えばｓｃＦｖ、ならびに二重特異性、三重特異性またはより高次の特異性の抗体構築物、抗体に基づく融合タンパク質、抗体−薬剤コンジュゲート、免疫毒素等を指すものとする。

用語「抗体模倣体」は、免疫グロブリンに基づかないターゲット結合性タンパク質分子に関する。こうした抗体模倣体は、例えば、アンキリンリピートタンパク質、Ｃ型レクチン、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＡドメインタンパク質、トランスフェリン、リポカリン、フィブロネクチン、クニッツドメインプロテアーゼ阻害剤、ユビキチン、システインノットまたはノッティン、チオレドキシンＡ等に由来し、そしてそれぞれの文献から当業者に知られる。

用語「融合タンパク質」は、本明細書において、主に、例えばヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を有する受容体−免疫グロブリン融合タンパク質に関するものとする。

好ましくは、本発明の細胞および方法は、以下のタンパク質の１つのすべてまたは一部に同一であるかまたは実質的に類似であるアミノ酸配列を含むタンパク質の（組換え）産生に適している：Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ダルベポエチン・アルファを含むダルベポエチン、およびトロンボポエチンのような赤血球生成刺激タンパク質、カルシトニン、レプチン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子に関するリガンド（ＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、胸腺間質由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、角化細胞増殖因子、巨核球増殖および発生因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、およびγ−インターフェロンを含むインターフェロン、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１−５）、ニューロトロフィン−３”グルカゴン、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１８を含むインターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン−ｐ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、ならびに細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋに関する多様なリガンド（例えば、ｅｐｈ関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳのリガンド）。

本発明の方法および手段を用いて産生可能なさらなるタンパク質には、上述のタンパク質いずれかに対する受容体、上述のタンパク質のいずれかのこうした受容体に対するアンタゴニスト、およびこうした受容体またはアンタゴニストに実質的に類似であるタンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含むタンパク質が含まれる。

また、本発明の方法および手段を用いて産生可能なタンパク質にはまた、分化抗原（ＣＤタンパク質と称される）またはそのリガンドあるいはこれらのいずれかに実質的に類似であるタンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含むタンパク質が含まれる。こうした抗原の例は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０を含む分化抗原、およびそれに対するリガンドである。

酵素的に活性であるタンパク質またはそのリガンドもまた、本発明の方法および手段を用いて産生可能である。例には，以下のタンパク質またはそのリガンド、あるいはこれらの一方に実質的に類似であるタンパク質の１つのすべてまたは部分を含むタンパク質が含まれる：メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリン・ファミリーメンバー、キナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−１、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−アルファ変換酵素、上述の酵素いずれかのリガンド、ならびに多くの他の酵素およびそのリガンド。
免責事項

上述の態様において、要素および特徴の特定の組み合わせは例示的のみであり；本出願において、これらの解説を他の解説と交換しそして置換することもまた、明らかに意図される。当業者が認識するであろうように、本明細書記載のものの変動、修飾、および他の実行は、請求されるような本発明の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、一般の当業者が思いつく可能性もある。したがって、前述の説明は例のみのためであり、そして限定と意図されない。本発明の範囲は、以下の請求項およびその同等物に定義される。さらに、説明および請求項中に用いられていた参照サインは、請求されるような本発明の範囲を限定しない。

本発明の目的のさらなる詳細、特徴、特性および利点を、下位クレーム、ならびに例示的な様式で本発明の好ましい態様を示すそれぞれの図および実施例の以下の説明に開示する。しかし、これらの図は、いかなる意味でも、本発明の範囲を限定すると理解してはならない。

全ての図において、エラーバーは標準偏差を示す。全ての示す結果をさらに、スチューデントＴ検定で分析した（以下を参照されたい）。

ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞に対するｓｉＲＮＡ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いたＰＡＭ ｍＲＮＡのサイレンシング。／１：平行１、／２：平行２、−Ｋ：非トランスフェクションＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞、＋Ｋ：スクランブル化ｓｉＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））でトランスフェクションしたＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞。 ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞に対するｓｉＲＮＡ（アンビオン）を用いたＰＡＭ ｍＲＮＡのサイレンシング。／１：平行１、／２：平行２、−Ｋ：非トランスフェクションＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞、＋Ｋ：スクランブル化ｓｉＲＮＡ（アンビオン）でトランスフェクションしたＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞。 図１および２に示す実験は、インビトロジェンまたはアンビオンによって提供されるｓｉＲＮＡによるＰＡＭ遺伝子に対するサイレンシング効果を評価するよう設計された。ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞をｓｉＲＮＡによってトランスフェクションして、最も強力なサイレンシング効果を持つ配列を決定した。これはまた、ＰＡＭ ｍＲＮＡの発現の％減少を計算し（表９）、そしてスチューデントｔ検定を用いる（表１０）ことによって証明された。 クローンＫ２５に対するｓｈＲＮＡを用いたＰＡＭ ｍＲＮＡのサイレンシング。／１：平行１、／２：平行２、−Ｋ：非トランスフェクションＫ２５細胞。 クローンＫ６２に対するｓｈＲＮＡを用いたＰＡＭ ｍＲＮＡのサイレンシング。／１：平行１、／２：平行２、−Ｋ：非トランスフェクションＫ６２細胞。 ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ親細胞株に対するｓｈＲＮＡを用いたＰＡＭ ｍＲＮＡのサイレンシング。／１：平行１、／２：平行２、−Ｋ：非トランスフェクションＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞。 ＣＨＯ ＳＳＦ３親細胞株に対するｓｈＲＮＡを用いたＰＡＭ ｍＲＮＡのサイレンシング。／１：平行１、／２：平行２、−Ｋ：非トランスフェクションＣＨＯ ＳＳＦ３細胞。 図３〜６に示す実験は、試験した細胞株に対して、異なるｓｈＲＮＡおよび異なる濃度のピューロマイシン（ピューロ）を用いて、ＰＡＭのｍＲＮＡ発現レベルを評価するよう設計された。ｓｈ６（単独で用いるかまたはｓｈ５と混合した場合）を、それぞれすべての細胞株に対して用いると、最高のサイレンシング効果が観察された。これはまた、ＰＡＭ ｍＲＮＡの発現の％減少を計算し（表１１）、そしてスチューデントｔ検定を用いる（表１２）ことによって証明された。５μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いると、発現レベルのわずかな減少のみが観察された。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに関するＰＡＭのサイレンシングを、それぞれ決定した。 ＰＡＭ ｍＲＮＡ発現レベルおよびｍＡｂプロリンアミド含量間の相関。／１：平行１、／２：平行２、−Ｋ：非トランスフェクションＫ２５およびＫ６２細胞。 ｐサイレンサー２．１−Ｕ６ピューロベクターの図。 ペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）によって触媒される反応。ＰＡＭは、連続して作用してペプチドのＣ末端一部切除およびアルファアミド化を触媒する２つの酵素活性を含有する、多機能タンパク質である。ペプチジルグリシン・アルファ−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）は、反応の第一の段階（ペプチジルグリシン（Ｃ末端）→ペプチジル−α−ヒドロオキシグリシン）を触媒し、そして銅（Ｃｕ）、または銅イオン、アスコルベート、および分子酸素に依存する。亜鉛依存性ペプチジルアミド−グリコール酸リアーゼ（ＰＡＬ）は、反応の第二の段階（ペプチジル−α−ヒドロオキシグリシン→ペプチド−α−アミドおよびグリオキシレート）を触媒する。図は、プリッゲ（Ｐｒｉｇｇｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７８， １３００−１３０５から採った。

１． ｓｉＲＮＡに基づく遺伝子サイレンシング

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、チャイニーズハムスター（クリセツルス・グリセウス）の卵巣由来の細胞株である。これらはしばしば、生物学的および医学的研究で用いられ、そして療法タンパク質の産生において商業的に用いられる。このため、ＣＨＯ細胞株において、ペプチドアミド化活性を減少させることが実験的に示された。

ＣＨＯ細胞におけるプロリンアミド形成に関与する酵素の正確な配列は、文献または公的データベースにおいて公表されていない。潜在的なヌクレオチド配列を私有ＣＨＯ ＥＳＴデータベースから抽出した。この配列情報に基づいて、ｓｉＲＮＡを構築し、そしてそのサイレンシング効果を評価した。ｓｉＲＮＡ結果に基づいて短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を構築し、そしてｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに対して遺伝子抑制を評価した。

Ｃ．グリセウス・ペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼヌクレオチド配列（表１）を決定した後、９および６のｓｉＲＮＡ配列を設計した。それぞれ、一方は高いプロリンアミドレベルを含有する産物を産生し、そして一方は低いプロリンアミドレベルを持つ産物を産生する、２つのＣＨＯ親細胞株および２つのｍＡｂ産生ＣＨＯ細胞株をトランスフェクションし、そして培養した後、サイレンシング効果を試験した。培養後、ｑＰＣＲによってＰＡＭ ｍＲＮＡレベルを決定し、そして最も強力な効果を持つ２つのサイレンサーをｓｈＲＮＡ設計のために選択した。ｓｈＲＮＡを用いた細胞のトランスフェクションおよび続く細胞培養後、ｍＲＮＡおよびＰＡＭレベルの両方を分析した。実験詳細を以下に提示する。
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ設計および調製

それぞれの設計ツールを利用して、ペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列を設計した。遺伝子配列に基づいて、異なる配列および長さのｓｉＲＮＡを設計した（９つはインビトロジェンにより、そして６つはアンビオンによる）（表２）。ｓｉＲＮＡ評価後、アンビオンのオンライン設計ツールを用いて、ｓｈＲＮＡを設計した。各ｓｈＲＮＡの２つの相補的オリゴヌクレオチドをメタビオン（Ｍｅｔｈａｂｉｏｎ）によって合成し（表３）、そして次いで、アニーリングさせて、社内で二本鎖オリゴヌクレオチドを生成した。続いて、アニーリングしたオリゴヌクレオチドをｐサイレンサー２．１−Ｕ６ピューロベクター（図８）にクローニングした。ＤＮＡ配列決定を実行して、オリゴヌクレオチド挿入物の配列を検証した。
ｓｉＲＮＡの再構成

ｓｉＲＮＡをＤＥＰＣ水中で再構成して、最終４０μＭ濃度にした。３０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを各平行ヌクレオフェクションに用いた。
ｐサイレンサーベクターへのヘアピンｓｉＲＮＡ挿入物のクローニング

各ｓｈＲＮＡに関する２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて、二本鎖オリゴヌクレオチドを生成した。続いて、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いて、アニーリングしたオリゴヌクレオチドをｐサイレンサー２．１−Ｕ６ピューロベクター内にクローニングした。全方法を以下のように行った：
１． およそ１００μｌのヌクレアーゼ不含水中に、ヘアピンｓｉＲＮＡテンプレートオリゴヌクレオチドを溶解する。
２． オリゴヌクレオチドをＴＥ中、およそ１μｇ／μｌに希釈する。
３． 以下のように５０μｌアニーリング混合物を合わせる（表４）：
４． ９０℃で３分間加熱し、次いで、３７℃インキュベーターに入れ、そして１時間インキュベーションする。
５． ５μｌのアニーリングしたヘアピンｓｉＲＮＡテンプレート挿入物を４５μｌのヌクレアーゼ不含水で希釈して、最終濃度８ｎｇ／μｌにする。
６． ２つの１０μｌ連結反応；挿入物を加えた連結および挿入物を加えない陰性対照をセットアップする。
各試験管に、以下の試薬（表５）を添加する：
７． １６℃で一晩インキュベーションする。
８． 形質転換のため、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター系（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）・カタログ番号：Ａ１３８０１）を用いる：
ａ）融解するまで、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９コンピテント細胞を氷槽中に置く。
ｂ）５０μｌの細胞を連結反応試験管に移し、そして３μｌの連結反応を各試験管に添加する。試験管を穏やかにはじいて、そして２０分間インキュベーションする。
ｃ）細胞を４２℃の水槽中で５０秒間熱ショック処理する。試験管を氷に直ちに２分間戻す。
ｄ）９５０μｌのＬＢ培地を形質転換反応に添加し、そして３７℃で振盪しながら１．５時間インキュベーションする（２２５ｒｐｍ）。
ｅ）１００μｌの各形質転換培養物をＬＢ／アンピシリンプレート上にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベーションする。
ｆ）ｓｉＲＮＡテンプレート挿入物ピッククローンでクローンを同定するため、プラスミドＤＮＡを単離し、そしてＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、〜６５ｂｐ ｓｉＲＮＡテンプレート挿入物の存在を確認する。
９． 以下の配列決定プライマーを用いて挿入物を配列決定する（表６）：

ｓｈＲＮＡ発現構築物の単離および検証後、単一カッター制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩ（ＡＡＴ／ＡＴＴ）を用いて、これらを直線化した。３Ｕ／μｇＤＮＡ（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、カタログ番号：Ｒ０１３２Ｌ）でＳｓｐＩ酵素を用いて、反応あたり最大５０μｇのプラスミドＤＮＡを消化した。およその量の１０ｘ反応緩衝液およびＨ_２Ｏを反応に添加した。反応を３７℃で３時間インキュベーションした。消化後、層流キャビネットで、以下のプロトコルに記載するように、ＤＮＡ沈殿を行った：
１． １体積のイソプロパノール（３００μｌ）を添加する
２． 完全にボルテックスする
３． ２１，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離する
４． 上清を廃棄する
５． １体積の無菌氷冷７０％エタノールを注意深く添加する
６． 最大速度で１分間、４℃で遠心分離する
７． 上清を廃棄する
８． ペレットを室温で５〜３０分間風乾する（層流キャビネット中）
９． ５０μｌ無菌水中にＤＮＡを再懸濁する

次に、ナノドロップＮＤ−１０００を用いて、直鎖ＤＮＡの純度（Ｏ．Ｄ． ２６０／２８０ｎｍ）および濃度を決定した。
宿主細胞

研究中、４つの異なる細胞株（親ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤおよびＳＳＦ３細胞株、ならびに２つのｍＡｂ産生クローン、Ｋ２５およびＫ６２）を用いた。ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞株は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＣＬ−６１．３）から生じるＣＨＯ Ｋ１細胞株の下位集団である。元来の細胞株を血清不含懸濁培養に適応させ、そして３回連続して次第に希釈した植え付け密度での選択を経て、ＤＭ１２２培地中の血清不含サブクローニングの頻度を改善した。ＣＨＯ ＳＳＦ３細胞株は、ＤＵＫＸＢ１由来の血清不含適応細胞株である。ＤＵＫＸＢ１は、ＣＨＯ Ｋ１細胞由来であった。機能性ｄｈｆｒアレルはどちらもＣＨＯ Ｋ１中で連続して不活性化された。しかし、結果は、アレルの一方が不可逆的に不活性化されていないことを示した。連続血清不含培養は、予期せぬことに、元来、ジヒドロ葉酸レダクターゼ不全（ｄｈｆｒ⁻）であるＣＨＯ細胞において、低いジヒドロ葉酸レダクターゼ活性の発現を誘導した。

ｐＢＷ２０１７プラスミドベクターでのＳＳＦ３親細胞のトランスフェクションによって、Ｋ２５およびＫ６２を調製した。先の実験において、両クローンは、望ましくないプロリンアミド構造を含有するｍＡｂ産物を発現していることが示された。それぞれのｍＡｂ産物は、プロリンアミドの２つの極値を含有し、すなわちＫ２５によって産生されるｍＡｂに関しては低いプロリンアミド含量（４％）であり、そしてＫ６２によって産生されるｍＡｂに関しては高いプロリンアミド含量（１４％）であったため、Ｋ２５およびＫ６２を、サイレンシング実験に含めた。
ヌクレオフェクション

アマクサ（Ａｍａｘａ）ヌクレオフェクション系を、細胞トランスフェクション（ヌクレオフェクターキットＶ、カタログ番号：ＶＣＡ−１００３）に用いた。一度に５プール以下をトランスフェクションして、すべての必要な細胞操作に十分な時間があることを可能にした。詳細なプロトコルを以下に記載する：
１． トランスフェクション時、細胞は、生存度≧９０％で、最大２Ｅ６／ｍｌでなければならない。
２． ヌクレオフェクションあたり５Ｅ６細胞を用いる。
３． 細胞を計数し、そして５０ｍｌ遠心管中、９０ｘｇ、室温で１０分間遠心分離する。
４． 残りの培地を注意深く取り除き、そして溶液Ｖ（トランスフェクションあたり１００μｌ）中に細胞ペレットを再懸濁する。
５． ＤＮＡ（３０ｐｍｏｌ ｓｉＲＮＡ／ヌクレオフェクションまたは３μｇ／ヌクレオフェクションｓｈＲＮＡ）を添加し、そして穏やかに混合する。
６． ＤＮＡと混合した１００μｌの細胞懸濁物をトランスフェクションキュベットに添加し、アマクサ・ヌクレオフェクター・デバイスに入れる。
７． アマクサ・プログラムＵ２３を用いたヌクレオフェクションを通じて、細胞をトランスフェクションする。
８． キュベット内にいくつかの増殖培地を添加し、そして２０ｍｌ培地を含む１２５ｍｌ振盪フラスコ中に、細胞を注意深く移す。キュベットを新鮮な培地で１〜２回リンスし、そして振盪フラスコに添加する。振盪装置（１２０ｒｐｍ）中、３７℃、１０％ＣＯ_２で２４〜４８時間、細胞をインキュベーションする。
増殖培地

ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞を、哺乳動物細胞培養に適した培地、例えば８ｍＭ Ｌ−グルタミン（シグマ、カタログ番号：Ｇ７５１３）を補ったＤＭ１２２増殖培地中で培養した。ＣＨＯ ＳＳＦ３細胞を、８ｍＭ Ｌ−グルタミン（シグマ、カタログ番号：Ｇ７５１３）および１ｍｇ／Ｌインスリン（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、カタログ番号：１０１３１−０２７）を補ったＤＭ１２２増殖培地中で培養した。Ｋ２５およびＫ６２を、８ｍＭ Ｌ−グルタミン（シグマ、カタログ番号：Ｇ７５１３）、１ｍｇ／Ｌインスリン（ミリポア、カタログ番号：１０１３１−０２７）および１５０ｎＭメトトレキセート（メトトレキセート水和物、シグマ、カタログ番号：Ｍ８４０７）を補ったＤＭ１２２増殖培地中で培養した。さらに３μｇ／ｍｌおよび続いて５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号：Ａ１１１３８−０２）をさらに補った同じ培地中で、細胞選択工程を行った。
細胞の融解／凍結

７０％エタノール中、３７℃でバイアルを融解した。１ｍｌあたりおよそ１Ｅ５生存細胞の最初の細胞密度で、５０ｍｌのあらかじめ温めた培地を含有する２５０ｍｌ振盪フラスコに、細胞を１滴ずつ直接接種した。細胞を３７℃、１０％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで培養した。細胞を、生存度＞９０％の指数関数的増殖期に凍結した。バイアルあたり５〜１０Ｅ６生存細胞を、７．５％ＤＭＳＯを含有する馴化培地中で凍結した。まず、細胞培養を１８０ｇ、室温で５分間、遠心分離し、余分な上清を廃棄した。続いて、ＤＭＳＯを最終濃度７．５％まで添加した。細胞ペレットを穏やかに再懸濁した。凍結バイアルに１ｍｌの細胞懸濁物を満たし、そしてミスター・フロスティ（Ｍｒ． Ｆｒｏｓｔｙ）凍結ボックス中、−８０℃ディープフリーザーに移した。１ヶ月以内に、凍結バイアルを液体窒素容器に移した。
細胞の培養および取り扱い

ｓｉＲＮＡ実験のため、ヌクレオフェクションを用いて、ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、そして４日間培養した。第４日、ｑＰＣＲ分析のため、細胞ペレットを収集した。ｓｈＲＮＡ実験のため、ヌクレオフェクションを用いて、すべての４つの細胞株（ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ、ＣＨＯ ＳＳＦ３、Ｋ２５およびＫ６２）をｓｈＲＮＡでトランスフェクションした。２−２−３日スケジュールで、適切なあらかじめ温めた培地中、１ｍｌあたり２〜３Ｅ５細胞で細胞をスプリットして、指数関数的細胞増殖を維持した。適切な細胞密度および生存度に到達した後、細胞を分割し、そしてさらに４つの別個の工程でプロセシングした：
１． ｑＰＣＲのため、試料を収集した（細胞ペレット）
２． ３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有する１０日バッチを接種した（１０日後、ＣＥＸ分析のため、上清を収集した）
３． 各細胞培養の３つの細胞バイアルを凍結した
４． ５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有する培地中で、細胞をさらに培養した。

５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて、適切な細胞密度および生存度に到達した後、工程１、２、３を反復した。

１２５ｍｌ振盪フラスコ中で細胞を培養した。インキュベーション条件：ＤＭ１２２培地に関して、３７℃、１２５および２５０ｍｌ振盪フラスコに関して、９０〜１１０ｒｐｍ、および１０％ＣＯ_２
ピューロマイシン選択

ピューロマイシンを用いた抗生物質選択が、トランスフェクション後の第一の選択工程であった。最終濃度３ｍｇ／ｍｌで、ピューロマイシンを用いて、すべてのトランスフェクションプールを選択した。細胞生存度が６０％を超えたトランスフェクション２日後に、ピューロマイシンを細胞培養に添加した。各プールが少なくとも８５％細胞生存度に到達した後、本発明者らは、５ｍｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いた選択に進行した。
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成

ＲＮＡ単離前に、１０ｎｇのルシフェラーゼＲＮＡ（プロメガ、カタログ番号：Ｌ４５６１）を５Ｅ６細胞に添加した。自動化ワークステーションＱＩＡキューブ上で、ＲＮイージーミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号：７４１０４）を用いて、総ＲＮＡ（ｔｏｔＲＮＡ）を単離した。単離後、ナノドロップ上で、ｔｏｔＲＮＡ濃度を測定した。続いて、ＤＮアーゼＩ（アンビオン、カタログ番号：ＡＭ１９０６）を５μｇのｔｏｔＲＮＡ（表７）に添加し、そしてインキュベーションした（２５分３７℃、１０分７５℃）。ＤＮアーゼ処理後、スーパースクリプトＶＩＬＯキット（インビトロジェン、カタログ番号：１１７５４−０５０）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。
ｑＰＣＲ

ｍＲＮＡレベル決定のため、タックマン（ＴａｑＭａｎ）化学反応に基づくｑＰＣＲ法を用いた（タックマン・マスターミックス、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号：４３２６７０８およびアッセイバイデザイン、アプライドバイオシステムズ、カタログ番号：４３３１３４８、表８を参照されたい）。絶対定量を用いてＰＡＭ ｍＲＮＡ発現レベルを計算し、そして細胞あたり、ならびに参照遺伝子ＡＣＴＢ（β−アクチン）あたりのｍＲＮＡ転写物の数として表した。ＡＣＴＢ遺伝子あたりの計算の場合、単離ゲノムＤＮＡを用いて標準曲線を構築し、そしてＡＣＴＢ ｍＲＮＡコピー数の決定に用いた。ＰＡＭおよびＡＣＴＢのｍＲＮＡの間の比を決定した。細胞あたりのｍＲＮＡコピー数を計算した際、ルシフェラーゼＤＮＡを用いて標準曲線を構築し、そしてルシフェラーゼに対するｍＲＮＡコピー数を決定した。次いで、ＰＡＭおよびＬＵＣのｍＲＮＡの間の比を計算し、そして細胞あたりのＰＡＭのｍＲＮＡレベルを決定した（図１〜６を参照されたい）
カチオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）

分析ＨＰＬＣクロマトグラフィ系を用いて、ＣＥＸによって、プロテインＡ精製したｍＡｂを分析した。この方法を用いると、Ｌｙｓおよびプロリンアミドは同じピークに溶出した。カルボキシペプチダーゼを用いた産物Ｃ末端処理によって、プロリンアミドの量をさらに決定した。同じＣＥＸ分析を続けて、残ったピークはプロリンアミドの量を示す。
実験結果

この研究の目的は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡによって、ＰＡＭ遺伝子に対するサイレンシング効果を評価することであった。それぞれ、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに対するＰＡＭのサイレンシングを決定した。ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤ細胞をｓｉＲＮＡによってトランスフェクションして、最も強力なサイレンシング効果を持つ配列を決定した（図１〜２および表９〜１０）。

上に示す結果から（図１〜２および表９）、本発明者らは、インビトロジェンｓｉＲＮＡを用いるとＰＡＭ ｍＲＮＡ発現の最大９０％の減少があり、そしてアンビオンｓｉＲＮＡを用いると最大７５％の減少があると結論づけ可能であった。スチューデントｔ検定（表１０）を実行して、どのｓｉＲＮＡが陰性対照と有意に異なるかを決定した。結果は、パーセント相違の計算後に得られるものと同じ観察を示す（より低いＰ値は、陰性対照に比較した発現の相違がより大きいことを示す）。これらの結果に基づいて、２つのｓｉＲＮＡ配列を選択し、そしてｓｈＲＮＡベクターを構築した（ＰＡＭに関して、ｓｉ５、ｓｉ６）。ｓｈＲＮＡ設計限界のため、アンビオンｓｉＲＮＡ由来の配列のみをｓｈＲＮＡ構築に用いた。ＰＡＭのサイレンシングを評価するため、２つの親細胞株ＣＨＯ Ｋ１ ＰＤおよびＳＳＦ３、ならびに２つのｍＡｂ産生クローン（産物に関して低いプロリンアミド含量のＫ２５および高い含量のＫ６２）をそれぞれ２つのｓｈＲＮＡ各々で、そして両方の混合物でトランスフェクションした。２つの異なる濃度のピューロマイシンで、連続して、トランスフェクション細胞の選択を行った（図３〜６）。産生されたｍＡｂのＣＥＸ分析によってタンパク質レベルに関してＰＡＭのサイレンシングをさらに評価し、そしてｍＲＮＡレベルへの相関を決定した（図７）。

図３〜６に関する結果は、試験する細胞株に対する異なるｓｈＲＮＡおよび異なる濃度のピューロマイシン（ピューロ）を用いた、ＰＡＭのｍＲＮＡ発現レベルを示す。最高のサイレンシング効果は、それぞれ、すべての細胞株に対して、ｓｈ６（単独で用いた場合またはｓｈ５と混合して）を用いると観察された。これはまた、ＰＡＭ ｍＲＮＡの発現の％減少を計算し（表１１）、そしてスチューデントｔ検定を用いる（表１２）ことによっても証明された。５μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いると、発現レベルの小規模な減少のみが観察された。

図７の結果は、ｍＲＮＡおよびＰＡＭ修飾ｍＡｂの間の相関を示す。この相関はまた、ピアソン関数（ピアソン相関係数は０．５５と決定された）を計算することによってもまた示された。
２． ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いることによる、ＣＨＯ細胞におけるターゲティング化遺伝子ノックアウト

ＺＦＮを設計して、高い特異性で選択した遺伝子座をターゲティングすることも可能である。これらのヌクレアーゼの一過性発現に際して、ターゲット遺伝子はまずＺＦＮによって切断され、そして次いで、天然であるが不完全なＤＮＡ修復プロセスである非相同末端連結によって修復される。これはしばしば、突然変異体（ヌル）アレルの生成を生じる。こうしたアプローチは、例えば、サンティアゴ（Ｓａｎｔｉａｇｏ）ら、２００８（「操作ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いることによる、哺乳動物細胞におけるターゲティング化遺伝子ノックアウト」、ＰＮＡＳ ２００８年４月１５日、１０５巻１５号）に記載される。

ＰＡＭ遺伝子座をターゲティングする部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼを設計し、そしてそのターゲット部位へのＤＮＡ結合に関してインビトロでスクリーニングする。ＺＦＮのヌクレアーゼ機能は、ＤＮＡ結合性ジンクフィンガータンパク質に連結されたエンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインによって与えられる。

ＺＦＮの各対を発現するプラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクションする。各細胞プールにおける、ターゲット部位でのＺＦＮ仲介性破壊の頻度を、ＣＥＬ−Ｉヌクレアーゼを用いることによって決定する。

ＣＨＯ−Ｓ細胞をＺＦＮ対でトランスフェクションして、そして次いで、限界希釈でプレーティングして、単細胞由来ＰＡＭ不全細胞株を得ることによって、ＰＡＭ^−／−細胞株を生成する。希釈クローニング（平均１ウェルあたり１つの細胞）後、ＣＥＬ−Ｉアッセイを用いて、ＰＡＭ遺伝子破壊に関して単離体を分析する。各細胞株における突然変異体アレルの正確な配列、およびしたがって遺伝子型は、ターゲット遺伝子座をＰＣＲ増幅し、そしてＰＣＲ産物をクローニングすることによって、決定される。
３． ＴＡＬＥＮでの遺伝子ターゲティング

ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩヌクレアーゼにカップリングした、集合したＤＮＡ結合モチーフからなる、新規融合タンパク質である。ＤＮＡ結合モチーフは、細菌、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）中の植物病原体によって分泌されるタンパク質に由来する。

カスタムＴＡＬＥＮ、またはＴＡＬエフェクター構築物の集合は、例えばセルマック（Ｃｅｒｍａｋ）ら、２０１１（ＤＮＡターゲティングのためのカスタムＴＡＬＥＮおよび他のＴＡＬエフェクターに基づく構築物の効率的な設計および集合）に記載され、そして２つの工程を伴う：（ｉ）リピートモジュールを、１〜１０リピートの中間アレイに集合させ、そして（ｉｉ）中間アレイを、最終構築物を作るバックボーンに参加させる。このプロセスの詳細は、セルマックら、２０１１に記載される。

ＴＡＬＥＮを設計するソフトウェアが、オンラインツール（ＴＡＬエフェクター−ヌクレオチドターゲター、ＴＡＬＥ−ＮＴ；ｈｔｔｐ：／／ｂｏｇｌａｂｘ．ｐｌｐ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ＴＡＬＥＮＴ／）として使用のために利用可能である。該ツールは、ターゲティングしようとする関心対象の遺伝子、例えばＰＡＭ遺伝子のＤＮＡ配列を入力するためのウィンドウを提供する。該ソフトウェアは、長さ１５〜３０ｂｐの間であり、そしてスペーサーによって分離されているＴＡＬＥＮ認識部位のセットを同定する。デフォルトスペーサー長は、１５ｂｐおよび１８〜３０ｂｐであるが、他の長さが使用者によって特定されてもよい。さらに、ボタンによって、使用者が設計指針を個々に除外することが可能である。

ＰＡＭ遺伝子をターゲティングするＴＡＬＥＮ対の１つを、ＸｈｏＩおよびＡｆｌＩＩを用いて、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（−）（インビトロジェン）にサブクローニングする。これらの酵素は、ｐＴＡＬ３またはｐＴＡＬ４から全ＴＡＬＥＮを切除し、そしてコード配列をＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターの調節下に置く。製造者のプロトコルにしたがって、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いたトランスフェクションによって、生じたプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入する。トランスフェクション７２時間後に細胞を収集し、そしてゲノムＤＮＡを単離し、そしてＴＡＬＥＮターゲット部位のスペーサー配列中で切断するＨｐｙ１８８Ｉで消化する。消化後、ターゲット部位を含む染色体断片を、ＰＣＲによって増幅する。完了後、４μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと、反応を７２℃で２０分間インキュベーションする。次いで、ＰＣＲ産物をＨｐｙ１８８Ｉで消化し、そしてＴＯＰＯ ＴＡベクター（インビトロジェン）中にクローニングした。全長ＰＣＲ産物を含有する独立クローンを配列決定して、切断部位での突然変異を評価した。

Claims (15)

1. ペプチドアミド化活性が減少している、タンパク質発現のための細胞。
2. ａ）ペプチドα−アミド化を触媒する酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害または減少；
   ｂ）ペプチドα−アミド化を触媒する機能不全または不活性酵素、あるいは活性が減少している、ペプチドアミド化を触媒する酵素の発現；および／または
   ｃ）ペプチドα−アミド化を触媒する酵素の活性の阻害または減少
   によって、ペプチドアミド化活性減少が達成されている、請求項１記載の細胞。
3. 所定の細胞において、ペプチドアミド化活性を減少させる方法であって
   ａ）ペプチドα−アミド化を触媒する酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害または減少；
   ｂ）ペプチドα−アミド化を触媒する機能不全または不活性酵素、あるいは活性が減少している、ペプチドアミド化を触媒する酵素の発現；および／または
   ｃ）ペプチドα−アミド化を触媒する酵素の活性の阻害または減少
   からなる群より選択される少なくとも１つの工程を含む、前記方法。
4. ペプチドアミド化活性減少が、ペプチドα−アミド化を触媒する酵素をコードする遺伝子に関する
   ・遺伝子サイレンシング、
   ・遺伝子ノックダウン、
   ・遺伝子ノックアウト、
   ・ドミナントネガティブ構築物の送達、
   ・条件付き遺伝子ノックアウト、および／または
   ・遺伝子改変
   からなる群より選択される少なくとも１つの工程によって達成されている、請求項１〜３のいずれか一項記載の細胞または方法。
5. 細胞が真核細胞である、請求項１〜４のいずれか記載の細胞または方法。
6. 細胞が動物細胞および／または植物細胞である、請求項１〜５のいずれか記載の細胞または方法。
7. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜６のいずれか記載の細胞または方法。
8. 細胞が組換え細胞である、請求項１〜７のいずれか記載の細胞または方法。
9. 細胞が：
   ・ベビーハムスター腎臓細胞（例えばＢＨＫ２１）
   ・チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ、またはＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻）
   ・マウス骨髄腫細胞（例えばＳＰ２／０またはＮＳ０）
   ・ヒト胚性腎臓細胞（例えばＨＥＫ−２９３）
   ・ヒト網膜由来細胞（例えばＰＥＲ−Ｃ６）、および／または
   ・羊膜細胞（例えばＣＡＰ）
   からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜８のいずれか記載の細胞または方法。
10. ペプチドアミド化を触媒する酵素が、ペプチジルグリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）である、請求項１〜９のいずれか記載の細胞または方法。
11. ペプチドアミド化を触媒する前記酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって阻害されるかまたは減少している、請求項１〜１０のいずれか記載の細胞または方法。
12. ペプチドアミド化を触媒する酵素が、Ｃ末端プロリンアミド残基の形成を触媒する、請求項１〜１１のいずれか記載の細胞または方法。
13. 同種タンパク質発現のための請求項１〜１２のいずれか記載の細胞の使用。
14. 異種タンパク質発現のための前述の請求項１〜１３のいずれか記載の細胞の使用。
15. 前記タンパク質が：
    ・抗体、あるいはその断片または誘導体
    ・融合タンパク質、
    ・抗体模倣体、および／または
    ・非抗体タンパク質
    からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質である、請求項１３または１４記載の使用。