KR20170124618A - 단백질 발현을 위한 세포 라인들에서 아미드화된 아미노산들의 형성 감소 - Google Patents

단백질 발현을 위한 세포 라인들에서 아미드화된 아미노산들의 형성 감소 Download PDF

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레크 파마슈티칼스 디.디.
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Abstract

본원 발명은 주어진 세포 라인에서 펩타이드 아미드화 활성을 감소시키는 방법, 감소된 펩타이드 아미드화 활성을 갖는 세포 라인들, 그리고 이의 용도들에 대한 것이다.

Description

단백질 발현을 위한 세포 라인들에서 아미드화된 아미노산들의 형성 감소{Reduction of formation of amidated amino acids in cell lines for protein expression}
본원 발명은 단백질 발현을 위한 세포 라인들에서 아미드화된 아미노산들의 형성 감소에 관련된다.
비록 단백질들은 그들의 아미노산 서열 (1차 구조)에 의하여 주로 특성화되지만, 번역-후 변형들과 같은 다른 측면들 또한 예를 들면 2차, 3차 및 4차 구조에 영향을 미침으로써 단백질의 특성에 공헌한다. 이들 번역-후 변형들의 일부는 생물의약 약물들의 안전성 및 효능을 포함하는 추후의 단백질 활성에 중요한 역할을 한다.
단백질의 이종성에 대한 하나의 주요 측면은, 예를 들면, 아스파라긴 같은 아미노산들의 탈아미드화에 의하여, 글리코실레이션에 의하여 또는 N-말단 글루타민을 파이로글루타메이트(pyroglutamate)로 프로세싱함으로써 형성되는 산성 변형체들, 그리고 예를 들면, 아미드화된 아미노산들, 특히 C-말단 프롤린 아미드 잔기들과의, 염기성 변형체들을 포함하는 하전 패턴(charge pattern)이다.
C-말단 프롤린 아미드과 같은 아미드화된 아미노산들의 형성은, 그러나, 일부 경우, 예컨대, 원치 않는 이종성의 근원으로서, 또는 상기 변형체들이 단백질 활성 또는 면역원성에 영향을 미칠 가능성이 있는 경우, 또는 생성되는 단백질에서 아미드화된 아미노산들, 예컨대, 프롤린 아미드의 용량이 기준(reference) 단백질에서 보다 높거나 또는 낮은 경우 바람직하지 않다.
상당히 제어 가능한 물리화학적 조건들 하에서 제조되는 소분자 약물들과 반대로, 단백질들, 특히 생물요법제 (바이오약물)로서 사용되는 단백질들, 의 생산은 제어가 어려운 매우 복잡한 일인데, 이는 그 생산이 살아있는 세포 배양 시스템을 이용하기 때문이다. 그러므로, 생산되는 단백질의 특히 번역-후 변형들을 제어하도록 하는 연장을 마련하는 것이, 일정한 제품의 품질 및 일정한 높은 산출율을 제공하도록 하기 위하여, 생산 공정의 효율을 증가시키기 위하여, 생산되는 단백질의 생리학적 활성 및 전달되는 약물의 안전성을 증가시키고 및/또는 미세 조정하기 위하여, 및/또는 생산되는 단백질의 번역-후 특징들을 기준 단백질의 특징들에 매치되도록 하기 위하여, 중요하다.
본원 발명의 목적은 이러한 요구에 부응하는 수단들과 방법들을 제공하는 것이다.
상기 목적은 본원 발명의 독립 청구항들에 따른 방법들 및 수단들과 부합한다. 종속 청구항들은 바람직한 실시예들에 대한 것이다. 수치들에 의하여 경계 지워진 수치 범위들은 상기 경계 값들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[본 발명의 요약]
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 장치들 또는 수단들, 또는 개시된 방법들의 공정 단계들의 특정 구성 요소 부분들로 제한되지 않으며, 따라서 장치들 또는 수단들 및 방법들은 다양화될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한 본원 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예들을 설명하기 위한 목적일 뿐, 제한하고자 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 달리 명확히 지시되지 않는 한, 단수 형태들은 단수 및/또는 복수 지시물들을 포함한다. 나아가 수치 값들로 한정된 파라미터 범위가 제공되는 경우, 그 범위들은 그들의 한계 값들을 포함하는 것으로 간주됨을 이해하여야 한다.
본원 발명의 일 측면에 따르면, 감소된 펩타이드 아미드화 활성을 갖는 단백질 발현을 위한 세포가 제공된다.
본 명세서에서 사용되는, "세포"라는 용어는 또한 그로부터 유도되는 세포 라인들을 포괄한다. 나아가, 그러한 세포들 또는 세포 라인들로부터 얻어진 동물들, 세포-기초 발현 플랫폼들이 그러한 용어에 의하여 제공되는 보호에 의하여 커버될 것이다.
본 명세서에서 사용되는, "단백질 발현을 위한"이라는 용어는 본 발명에 따른 세포가 산업적 공정에서 단백질 발현에 적합함을 내포한다. 이것은 동종 및/또는 이종 단백질 발현 모두를 포함한다. 본 발명에 따른 세포가 산업적 공정에서 단백질 발현에 적합하다는 사실은, 만일 실재한다면, 본성에 의하여 감소된 펩타이드 아미드화 활성을 가지지만, 그에 따라, 추가의 변형, 분리 또는 처치 없이는 산업적 공정에서 단백질 발현을 위하여 적합하지 않은 자연 환경에서 존재하는 세포들이 본원 발명에 따른 세포들의 신규성을 예측하지 못함을 의미한다.
펩타이드 아미드화는 광범위한, 종종 많은 생물 활성 펩타이드들에 의하여 수행되는 종종 필수적인 번역 후 변형이다. 펩타이드 아미드화는 예를 들면, 뉴로엔도크린 펩타이드들을 활성 α-아미드화 된 생성물들로 촉매 하는데 작용한다.
펩타이드 아미드화는 그러나 일부 경우들, 예컨대, 원치 않는 이종성의 근원으로서, 또는 상기 변형체들이 단백질 활성 또는 면역원성에 영향을 미칠 가능성이 있는 경우, 또는 제조되는 단백질에서, 아미드화된 아미노산들, 예컨대, 프롤린 아미드의 용량이 기준 단백질에서보다 높거나 또는 낮은 경우에는 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 세포의 바람직한 일 실시예에서 감소된 펩타이드 아미드화 활성은
a) 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소;
b) 기능 장애, 또는 불활성 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 펩타이드 아미드화 촉매 효소의 발현; 및/또는
c) 펩타이드α-아미드화 촉매 효소의 활성의 억제 또는 감소
에 의하여 달성된다.
본 발명의 다른 측면에서, 주어진 세포에서 펩타이드 아미드화 활성을 감소시키는 방법은 다음으로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단계를 포함한다.
a) 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소;
b) 기능 장애, 또는 불활성 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 펩타이드 아미드화 촉매 효소의 발현; 및/또는
c) 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소의 활성의 억제 또는 감소.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 감소된 펩타이드 아미드화 활성은 다음으로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단계에 의하여 달성된 것이거나 달성될 수 있다.
펩타이드 α-아미드화 촉매 효소를 코딩하는 유전자에 대한
- 유전자 침묵,
- 유전자 넉-다운,
- 유전자 넉-아웃,
- 우성 음성 구조체(dominant negative 구조체)의 전달(delivery),
- 조건적 유전자 넉-아웃, 및/또는
- 유전자 변이
본 명세서에서 사용되는, "유전자 발현"이라는 용어는, DNA의 mRNA로의 전사, mRNA 가공, 비-코딩 mRNA 성숙, mRNA 이동(export), 번역, 단백질 폴딩 및/또는 단백질 수송(transport)으로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단계를 포괄하는 것으로 의도된다.
유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소는 유전자 발현을 직접적으로 간섭하는 방법들을 지시하며, 이는 다음으로 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 특이적 프로모터-관련 억제자들의 사용에 의한, 주어진 프로모터의 위치 특이적 돌연변이 유발에 의한, 프로모터 교환(exchange)에 의한 DNA 전사의 억제 또는 감소, 또는 예컨대, RNAi 유도 전사-후 유전자 침묵에 의한, 번역의 억제 또는 감소를 포괄한다.
기능 장애, 또는 불활성 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 펩타이드 아미드화 촉매 효소의 발현은, 예를 들면, 코딩 유전자 내의 위치 특이적 또는 무작위 돌연변이 유발, 삽입 또는 결실에 의하여 달성될 수 있다.
펩타이드 아미드화 촉매 효소의 활성의 억제 또는 감소는, 예를 들면, 단백질 발현 전에 또는 동시에 각자의 효소에 대한 억제제의 투여 또는 억제제와 배양시키는 것에 의하여 달성될 수 있다. 그러한 억제제들의 예시는, 이하로 제한되는 것은 아니나, 억제 펩타이드, 항체, 압타머(aptamer), 융합 단백질 또는 상기 효소에 대한 항체 모방체, 또는 리간드 또는 그의 수용체, 또는 억제 펩타이드 또는 핵산, 또는 유사한 결합 활성을 갖는 소분자를 포함한다.
효소를 억제하는 다른 방법은, PAM 특이적 이온 보조 인자 (예컨대, CuSO4의 형태로)인 구리, PAM에 대한 전자 공여체로서 작용하는, 아스코르베이트, 분자 산소, 카탈라아제 및 당해분야의 통상의 기술자에게 현재까지 알려진 여타의 것들, 또는 미래에 발견될 것들과 같은 매체에서 효소의 특이적 보조 인자들의 감소이다.
유전자 침묵, 유전자 넉-다운 그리고 유전자 넉-아웃은 유전적 변형을 통하여 또는 mRNA 전사물 또는 유전자 중 어느 하나에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 처치함으로써, 그에 의하여 유전자의 발현이 감소되는 기술들을 지시한다. 만약 DNA의 유전적 변형이 행해졌다면, 결과는 넉-다운 또는 넉-아웃 생물이다. 만약 유전자 발현의 변화가 올리고뉴클레오타이드가 mRNA에 결합하거나 또는 일시적으로 유전자에 결합함으로써 야기되었다면, 이것은 크로모좀 DNA의 변형 없이 유전자 발현의 일시적 변화를 초래하며 일시적(transient) 넉-다운으로 지시된다.
상기 용어에 의하여 포괄되는, 일시적 넉-다운에서, 이 올리고뉴클레오타이드의 활성 유전자 또는 이의 전사물들에의 결합은, 전사의 차단 (유전자-결합의 경우에), mRNA 전사물의 분해 (예컨대 미세 간섭 RNA (siRNA) 또는 RNase-H 의존 안티센스에 의하여) 또는 mRNA 번역, 프리-mRNA 접합 부위들(splicing sites) 또는 여타의 기능성 RNAs 가령 miRNA 의 성숙을 위하여 사용되는 뉴클레아제 분열 부위들(cleavage sites) 중 어느 하나의 차단 (예컨대, 몰폴리노 올리고스(Morpholino oligos) 또는 여타의 RNase-H 독립 안티센스에 의하여)을 통하여 감소된 발현을 일으킨다. 여타의 접근 방식들은 shRNA (작은 헤어핀 RNA, 이는 RNA 간섭을 통하여 유전자 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있는 타이트 헤어핀 턴(tight hairpin turn)을 만드는 RNA의 서열이다.), esiRNA (엔도리보뉴클레아제로 제조된 siRNAs, 이는 긴 이중-가닥 RNA (dsRNA)을 엔도리보뉴클레아제로 분할함으로써 유도되는 siRNA 올리고스의 혼합물이다.), 또는 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC)의 활성화의 이용과 연관된다.
유전자 침묵, 넉-다운 또는 넉-아웃을 수행하는 여타의 접근 방법은 각각의 문헌으로부터 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 본원 발명의 맥락에서 그들의 적용은 일상적인 것으로 고려된다.
유전자 넉-아웃은 그에 의하여 유전자의 발현이 완전히 차단되는, 즉 각자의 유전자가 작동 불가능하거나, 또는 심지어 제거되는, 기술들을 지시한다. 이 목적을 달성하기 위한 방법론적 접근 방식은 다양하며 통상의 기술자들에게 공지되어 있다. 예시들은 주어진 유전자에 대하여 우세하게 음성인 돌연변이체의 생성이다. 그러한 돌연변이체는 부위 지향적 돌연변이유발(예컨대, 결실, 부분적 결실, 삽입 또는 핵산 치환)에 의하여, 적절한 트렌스포존들(transposons)의 사용에 의하여, 또는 각각의 문헌으로부터 통상의 기술자에게 공지된 여타의 접근 방식에 의하여 생성될 수 있으며, 본원 발명의 맥락에서 그들의 적용은 따라서 일상적인 것으로 고려된다. 본원 발명의 맥락에서 유용한 것으로 통상의 기술자가 고려할 수 있는 새로이 개발된 기술의 하나의 예시는 표적화된 징크 핑거 뉴클레아제들의 사용에 의한 넉-아웃이다. 각각의 키트는 Sigma Aldrich에서 "CompoZR 넉아웃 ZFN"으로서 제공된다. 여타의 접근 방법은 TALENs (Transcription activator-like effector nucleases)의 사용을 포괄한다.
우성 음성 구조체의 전달은 기능 장애 효소를 코딩하는 서열을, 예컨대, 형질감염에 의하여 도입하는 것에 관련된다. 상기 코딩 서열은 기능 장애 효소의 유전자 발현이 야생 타입 효소의 자연적 발현을 지배하고, 이는 차례로 각각의 효소 활성의 효과적인 생리학적 결손에 이르도록 하는 방식으로 강한 프로모터에 기능적으로 연결된다.
조건적 유전자 넉-아웃은 조직- 또는 시간-특이적 방식으로 유전자 발현을 억제하도록 한다. 이것은, 예를 들면, loxP라 불리는 짧은 서열을 관심 대상의 유전자 주변 부위들에 도입함으로써 행하여 진다. 역시나, 여타의 접근 방법은 각각의 문헌으로부터 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 본원 발명의 맥락에서 그들의 적용은 일상적인 것으로 고려된다.
하나의 다른 접근법은 기능 장애 유전자 생성물 또는 감소된 활성을 갖는 유전자 생성물에 이르도록 할 수 있는 유전자 변이 이다. 이 접근 방식은 프레임 시프트(frame shift) 돌연변이들, 넌센스 돌연변이들 (즉, 미성숙 스톱 코돈(premature stop codon)의 도입) 또는 전체 유전자 생성물 기능 장애, 또는 감소된 활성을 일으키는 아미노산 치환을 유도하는 돌연변이들의 도입에 관련된다. 그러한 유전자 변이는 예를 들면 비특이적 (무작위) 돌연변이유발 또는 위치 지향 돌연변이유발 중 어느 하나의 돌연변이유발 (예컨대, 결실, 부분적 결실, 삽입 또는 핵산 치환), 의하여 생성될 수 있다.
유전자 침묵, 유전자 넉-다운, 유전자 넉-아웃, 우성 음성 구조체의 전달, 조건적 유전자 넉-아웃, 및/또는 유전자 변이의 실질적 적용을 설명하는 프로토콜들은 통상의 기술자에게 일반적으로 이용될 수 있으며, 일상적인 것이다. 본원 명세서에서 제공되는 기술적 교시는 따라서 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소, 또는 기능 장애, 또는 불활성 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 펩타이드 아미드화 촉매 효소의 발현에 이르게 하는 모든 상상할 수 있는 방법들에 관하여 구동된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에 따르면, 세포는 진핵 세포이다. "진핵 세포"라는 용어는, 이하로 제한되는 것은 아니나, 예컨대 곤충 세포들 같은 동물 세포들, 식물 세포들 및 진균(fungal) 세포들을 포괄한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시예는 세포가 동물 세포 및/또는 식물 세포인 것을 제공한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 상기 세포는 포유류 세포이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 상기 세포는 다음으로 구성된 그룹으로부터 하나 이상이 선택된다:
- 어린 햄스터 신장 세포들 (예컨대, BHK21)
- 중국 햄스터 난소 세포들 (예컨대, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB, 또는 CHO-dhfr-)
- 마우스 골수종 세포들 (예컨대, SP2/0 또는 NS0)
- 인간 배아 신장 세포들 (예컨대, HEK-293)
- 인간-레티나-유래-세포들 (예컨대, PER-C6), 및/또는
- 양수 세포들 (예컨대, CAP)
여타의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 세포는 재조합 세포이다. 본 명세서에서 사용되는, "재조합 세포" 라는 용어는, 외인성 및/또는 이종 핵산이 편입된, 세포들의 클론 팽창에서 편입된 상태로 유지되도록 안정하게 편입되거나, 또는 세포 (또는 세포들의 집단)에 일시적으로 도입된, 세포를 지시하는데 사용된다. 그러한 외인성 및/또는 이종 핵산은 발현될 이종 단백질을 코딩할 수 있거나, 또는 이것은 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소, 또는 기능 장애, 또는 불활성 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 펩타이드 아미드화 촉매 효소의 발현에 영향을 미칠 수 있다.
바람직하게는, 펩타이드 아미드화 촉매 효소는 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 (PAM)이다. PAM은 펩타이드들의 C-말단 절단(truncation) 및 알파-아미드화를 촉매하기 위하여 순차로 작용하는 두 효소 활성들을 함유하는 다기능 단백질이다. 펩티딜글라이신 알파-하이드록실레이팅 모노옥시게나아제 (PHM)는 반응의 제1 단계를 촉매하며 구리 (Cu), 또는 구리 이온들, 아스코르베이트, 및 분자 산소에 의존적이다. 아연 의존적 펩티딜아미도-글리콜레이트 라이에이즈 (PAL)는 이제 C-말단 프롤린을 프롤린 아미드로 아미드화 하는 반응의 제 2 단계를 촉매한다. 두 효소 모두에 의하여 촉매되는 공정의 반응 모식도는 도 9를 참조한다. 실제 유전자 또는 효소는 물론 단백질 발현을 위하여 사용되는 세포에 따른다.
그러한 유전자 또는 효소의 하나의 예시는 인간 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 (NCBI 유전자 데이터베이스에 따른 유전자 ID: 5066)이며, 이의 유전자는 촉매 활성을 갖는 두 효소적으로 활성인 도메인들을 갖는 다기능 단백질을 암호화 한다: (i) 펩티딜글라이신 알파-하이드록실레이팅 모노옥시게나아제 (PHM) 및 (ii) 펩티딜-알파-하이드록시글라이신 알파-아미드화 라이에이즈 (PAL). 이들 촉매 도메인들은 뉴로엔도크린 펩타이드를 활성 알파-아미드화된 생성물들로 촉매하기 위하여 순차적으로 작용한다. 이 유전자에 대하여 상이한 아이소형들(isoforms)을 인코딩하는 다중의 교대로 분할된 전사물 변형체들이 개시되어 있으나, 전 길이의 서열들의 일부는 아직 알려져 있지 않다. 이 유전자는 5q14-q21에 위치한다. 단백질 발현을 위하여 사용되는 세포가 인간 세포 (예컨대, HEK, PER-C6 또는 CAP)인 경우, 바람직하게는 (i) 상기 유전자의 유전자 발현이 억제되거나 또는 감소된, 또는 (ii) 기능 장애 또는 불활성 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 효소가 발현되거나, 또는 (iii) 상기 효소의 활성이 억제되거나 또는 감소되는 것이 제공된다.
그러한 유전자 또는 효소에 대한 여타의 예시는 중국 햄스터 (Cricetulus griseus), 이들로부터 CHO 세포들 (중국 햄스터 난소 세포들)이 유도될 수 있음, 와 같은 햄스터의 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 이다. 비록 각각의 발현 서열 태그들(ESTs)이 열거되어 있는 독점적 데이터베이스들이 존재하기는 하지만, 각각의 유전자 서열은 아직 공공의 데이터베이스들에 공개되어 있지 않다.
단백질 발현을 위하여 사용되는 세포가 햄스터 세포 (예컨대, BHK 또는 CHO 또는 CAP)인 경우에, 바람직하게는 (i) 상기 유전자의 유전자 발현이 억제되거나 또는 감소된, 또는 (ii) 기능 장애 또는 불활성 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 효소가 발현되거나, 또는 (iii) 상기 효소의 활성이 억제되거나 또는 감소되는 것이 제공된다.
그러한 유전자 또는 효소에 대한 여타의 예시는 쥣과의 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 (유전자 ID: 18484)이며, 이의 유전자는 촉매 활성들을 갖는 두 효소적으로 활성인 도메인들을 갖는 다기능성 단백질을 암호화 한다: (i) 펩티딜글라이신 알파-하이드록실레이팅 모노옥시게나아제 (PHM) 및 (ii) 펩티딜-알파-하이드록시글라이신 알파-아미드화 라이에이즈 (PAL). 이들 촉매 도메인들은 뉴로엔도크린 펩타이드들을 활성 알파-아미드화된 생성물들로 촉매하기 위하여 순차적으로 작용한다. 이 유전자에 대하여 상이한 아이소형들(isoforms)을 인코딩하는 다중의 교대로 분할된 전사물 변형체들이 개시되어 있으나, 일부 전체 길이의 서열들은 아직 알려저 있지 않다. 이 유전자는 1D; 1 57.5 cM에 위치한다.
단백질 발현에 사용된 세포가 마우스 세포 (예컨대, SP2/0 또는 NS0)인 경우에 바람직하게는 (i) 상기 유전자의 유전자 발현이 억제되거나 또는 감소되거나, 또는 (ii) 기능 장애 또는 불활성 효소, 또는 감소된 활성을 갖는 효소가 발현되거나, 또는 (iii) 상기 효소의 활성이 억제되거나 또는 감소되는 것이 제공된다.
여타의 예시들은 단백질 발현을 위하여 사용된 세포가 곤충 세포인 경우 곤충 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 COOH-터미날 인터액터 단백질-1 (유전자 IDs는 예를 들면 5567876, 6053618 또는 6043293이다)을 포함한다.
단백질 발현을 위한 여타의 가능성 있는 세포들 (이스트들, 식물들, 섬유성 진균들, 또는 심지어 박테리아 같은 것들에서)에 존재하는 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 또한 본원 발명의 보호 범위에 의하여 포괄될 것이다. 마찬가지로, 펩타이드 아미드화 할 수 있는, 특히 프롤린 아미드 형성할 수 있는, 여타의 효소들 또한 본원 발명의 보호 범위에 의하여 포괄될 것이다. 본원 발명의 교시의 이들 효소들에 대한 이전에는 여하한 추가적인 발명적 단계가 개입되지 않는다.
본원 발명의 여하한 전술한 측면들 및 실시예들에 따른 세포 또는 방법에서, 상기 펩타이드 아미드화 촉매 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현은 RNA 간섭 (RNAi)에 의하여 억제되거나, 또는 감소된다.
RNAi는 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에 의하여 제어되며 세포의 세포질에서 짧은 이중-가닥 RNA 분자들에 의하여 개시되는, 여기서 그들은 촉매성 RISC 성분 알고너트(Argonaut)과 상호작용함, RNA-의존 유전자를 침묵시키는 공정이다. RNAi 경로는 동물들을 포함하여 많은 진핵 생물들에서 발견되며 긴 이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자들을 siRNAs라 불리는 ~20 뉴클레오타이드들의 짧은 단편들로 자르는 효소 다이서(Dicer)에 의하여 개시된다. 각각의 siRNA는 두개의 단일-가닥 ssRNAs, 즉 패신저(passenger) 가닥 및 가이드(guide) 가닥으로 풀린다. 패신저 가닥은 분해될 것이며, 가이드 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체로 편입된다.
유전자 조작에서 유전자 침묵의 목적을 위하여, RNA는 세포질로 직접 유입되며 효소에 의하여 짧은 단편들로 분열된다. 개시 dsRNA 또한 게놈에서 RNA-코딩 유전자들로부터 발현되는 pre-microRNAs에서와 같이, 내인성 (세포 내에서 기원함)일 수 있다. 그러한 유전자들로부터의 일차 전사물들은 먼저 핵에서 pre-miRNA의 특징적 스템-루프 구조를 형성하도록 가공되며 이후 다이서에 의하여 분열되도록 세포질로 이송된다. 따라서, 두 dsRNA 경로들, 외인성 및 내인성임, 이 RISC 복합체에서 통합된다.
바람직하게는, 긴 이중-가닥 RNAs (dsRNAs; 대체로 >200 nt)들이 상기 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 침묵시키는데 사용된다. 도입에 따라, dsRNAs는 다이서에 의하여 20-25 뉴클레오타이드의 작은 간섭 RNAs (siRNAs)로 분해된다 (개시 단계). 이후, siRNAs는 RISCs로 어셈블되며, 공정에서 풀린다(unwinding).
siRNA 가닥들은 이어서 RISCs를 상보적 RNA 분자들로 가이드하고, 여기서 그들은 분열되고 동족(cognate) RNA를 파괴한다 (이펙터(effecter) 단계). 동족 RNA의 분해는 siRNA 가닥에 의하여 결합된 영역의 중앙 가까이 일어난다. 포유류의 배양된 세포들에서, RNAi는 대체로 siRNAs의 이용에 의하여 유도된다. 배양된 세포들에서 siRNAs를 생산하기 위하여 두가지의 일반적 방법이 존재한다: 합성 siRNAs의 전달, 그리고 세포 내에서 siRNAs로 가공되는 짧은 헤어핀 RNA 서열들 (shRNA)을 발현하는 DNA 구조체의 도입. 본원 발명의 맥락에서 사용되는 각각의 siRNAs 및 shRNAs이 실시예 부분에 개시되어 있다.
만약 RNA 간섭 (RNAi)이 다음 세대 세포들에서 또한 각각의 세포 라인에서 수립될 수 있는 유전자 발현의 비-일시적 억제에 이르도록 한다면, 그 결과는 넉다운 또는 넉아웃 세포 또는 세포 라인이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 펩타이드 아미드화 촉매 효소는 C-말단 프롤린 아미드 잔기들의 형성을 촉매한다.
많은 인간 면역글로불린들의 중쇄는, 그의 C-말단 (예컨대, 불변 영역에)에, -Pro-Gly-Lys-COOH (한 글자 코드: PGK)로 구성되는 서열 모티프를 가지며, 여기서C-말단 Lys는 종종 염기성 카르복시펩티다아제의 제거 대상이며, 따라서 C-말단에 -Pro-Gly-COOH를 남긴다.
많은 단백질 발현 시스템들에서, 이 서열 모티프는, 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제, 이는 예를 들면 C-말단 펩티딜-프롤일-글라이신을 펩티딜-프롤일-α-하이드로옥시글라이신으로, 그리고 이후 펩티딜-프롤린-α-아미드 및 글라이옥실레이트로 변환시킴, 과 같은 펩타이드 α-아미드화를 촉매하는 효소의 표적이다. (도 9 및 각각의 설명 참조).
C-말단 프롤린 아미드 잔기들의 형성은 따라서 종종, Fc 영역을 갖는 3작용성 항체 및 면역독소들, 에타네르셉트(etanercept) 또는 아프리버셉트 (aflibercept) 같은 인간 면역글로불린의 Fc 영역을 갖는 수용체-면역글로불린 융합 단백질들, 또는 IgG같은 중쇄 불변 영역을 포함하는 모노클로날 항체들 및 그의 유도체들의 단백질 발현에서 관찰된다.
본 발명의 여타의 측면에 따르면, 동종 단백질 발현을 위한 여하한 전술한 청구항들에 따른 세포의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 여타의 측면에 따르면, 이종 단백질 발현을 위한 여하한 전술한 청구항들에 따른 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서 사용되는, "이종 단백질 발현" 이라는 용어는, 발현이 일어나는 ("숙주 세포", 또는 "발현 시스템") 세포에 이질인(foreign) 유전자, 핵산 또는 cDNA의 단백질 발현을 지시할 것이다. 이종 ('상이한 생물로부터 유래됨'을 의미하는)은 종종 이전된 단백질이 처음에는 상이한 세포 타입 또는 상이한 종들로부터 유도되거나 클론 되었으며, 코딩하는 유전 물질 ("cDNA")이 얻어지고 이는 이후 숙주 세포로 이전된다는 사실을 지시한다. 이전되는 유전 물질은 전형적으로 수여 세포가 cDNA를 단백질로서 발현하는 것을 장려하는 형태 내에 있을 것이다 (즉, 이는 발현 벡터의 일부이다). 외래 유전 물질을 수여 세포로 전달하기 위한 방법은 형질감염 및 형질도입을 포함한다. 수여 세포 타입의 선택은 종종 단백질의 기능을 상세히 시험하기 위한 실험적 요구에 기초하며, 그리고, 무엇보다도 (i) DNA 전달의 용이함, (ii) 약학적으로 유효한 형태, 기능으로 단백질을 생산할 수 있는 능력, (iii) 단백질 산출량, 및 이와 유사한 것들에 대한 이종 발현 시스템들로서 알려진 가장 유효한 수여체들이 여타의 것들 중에서 선택된다.
"재조합 단백질 발현" 이라는 용어는 대부분 "이종 단백질 발현" 이라는 용어와 중복된다. "재조합(recombinatnt)" 이라는 용어는 "새로운" (코딩) 유전물질이 발현 시스템, 예컨대, 세포로 도입된다는 사실을 시사한다. 그러한 과정은 재조합 핵산 (예컨대, 재조합 DNA)의 형성을 초래하며, 숙주는 따라서 재조합 숙주, 예컨대, 재조합 세포로 불리운다. 이 과정의 배경의 하나의 아이디어는 하나의 생물 (예컨대, 인간 단백질)로부터의 단백질을 여타의 생물, 예컨대, CHO 세포와 같은 세포-기초 단백질 발현 시스템에서 생산하는 것이다.
바람직하게는, 상기 단백질은 다음으로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단백질이다:
- 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체
- 융합 단백질,
- 항체 모방체, 및/또는
- 비-항체 단백질들
본 명세서에서 사용되는, "항체"라는 용어는, 면역글로불린들, 또는 그이 단편들 또는 유도체들에 관한 것일 수 있다. 특히 바람직하게는, 그러한 항체는 IgG, IgD, IgE, IgA 및/또는 IgM, 또는 그들의 단편 또는 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 본 명세서에서 사용되는, "단편"이라는 용어는 일부 경우에서, 표적 결합 능력들, 예컨대 다음을 보유하는 그러한 항체의 단편들을 지시할 것이다.
- CDR (상보성 결정 영역)
- 고도 가변 (hypervariable) 영역,
- 가변(variable) 도메인 (Fv)
- IgG 중쇄 (VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역들로 구성됨)
- IgG 경쇄 (VL 및 CL 영역들로 구성됨), 및/또는
- Fab 및/또는 F(ab)2
본 명세서에서 사용되는, "유도체"라는 용어는 공통 항체 컨셉, 예컨대, scFv,는 물론 이중(bi)-, 삼중(tri)- 또는 보다 높은 특이적 항체 구조체들, 항체-기초 융합 단백질들, 항체-약물 결합체들, 면역독소들 및 이와 유사한 것들과 구조적으로 상이하지만 여전히 일부 구조적 연관성을 갖는 단백질 구조체들을 지시할 수 있다.
"항체 모방체"라는 용어는 비-면역글로불린-기초 표적-결합 단백질 분자에 관련된다. 그러한 항체 모방체들은 예를 들면 안키린 반복(ankyrin repeat) 단백질들, C-타입 렉틴들 (lectins), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 A-도메인 단백질들, 트렌스페린들(transferrins), 리포칼린들(lipocalins), 피브로넥틴들(fibronectins), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 프로테아제 억제제들, 유비퀴틴(ubiquitin), 시스테인 노트들(cysteine knots) 또는 노틴들(knottins), 치오레독신(thioredoxin) A, 및 기타 등등, 으로부터 유도되며 그리고 각각의 문헌으로부터 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는, "융합 단백질"이라는 용어는, 예컨대, 인간 면역글로불린의 Fc 영역을 갖는 수용체-면역글로불린 융합 단백질들에 주로 관련될 수 있다.
바람직하게는, 본원 발명에 따른 세포들 및 방법들은 다음의 단백질 중 하나의 전부 또는 일부와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 단백질들의 (재조합) 생산에 적합하다: Flt3 리간드, CD40 리간드, 에리트로포이에틴 (EPO)과 같은 적혈구 생성 촉진 단백질들, 다비포이에틴 알파, 그리고 트롬보포이에틴을 포함하는 다비포이에틴, 칼시토닌, 렙틴, Fas 리간드, NF-kappa B (RANKL)의 수용체 활성제를 위한 리간드, 종양 괴사 인자 (TNF)-연관 세포자멸사-유도 리간드 (TRAIL), 흉선 간질-유래 림포포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 마스트 세포 성장 인자, 스템 세포 성장 인자, 상피 성장 인자, 케라티노사이트 성장 인자를 포함하는 성장 인자들, 메가케리오트(megakaryote) 성장 및 발생 인자, RANTES, 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린-유사 성장 인자들, 부갑상선 호르몬, α-인터페론, β-인터페론, 및 γ-인터페론을 포함하는 인터페론들, 신경 성장 인자, 뇌-유래 신경성장 인자, 시냅토태그민 (synaptotagmin)-유사 단백질들 (SLP1-5), 뉴로트로핀-3"글루카콘, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, 및 IL-18을 포함하는 인터류킨들, 콜로니 콜로니 자극 인자들, 림포톡신-p, 종양 괴사 인자 (TNF), 백혈병 억제 인자, 온코스타틴-M, 및 세포 표면 분자들 ELK 및 Hek에 대한 다양한 리간드들 (가령 eph-연관 키나아제 또는 LERKS에 대한 리간드들).
본 발명의 방법 및 수단들을 이용하여 생산될 수 있는 추가적 단백질들은 여하한 전술한 단백질들의 수용체, 여하한 전술한 단백질들의 그러한 수용체에 대한 길항제, 그리고 그러한 수용체들 또는 길항제들과 실질적으로 유사한 단백질들의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질들을 포함한다.
또한, 본 발명의 방법들 및 수단들을 이용하여 생산될 수 있는 단백질들은 분화 항원들 (CD 단백질들로 지시됨) 또는 이들 중 하나에 실질적으로 유사한 그들의 리간드들 또는 단백질들의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질들을 포함한다. 그러한 항원들의 예시들은 CD20, CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, 및 이에 대한 리간드들을 포함하는 분화 항원들이다.
효소적으로 활성인 단백질들 또는 그들의 리간드들 또한 본 발명의 방법들 및 수단들을 이용하여 생산될 수 있다. 예시들에는 다음의 단백질들, 또는 그들의 리간드들, 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질들을 포함하는 단백질들을 포함한다: 메탈로프로티나아제-디스인테그린 패밀리 멤버들, 키나아제들, 글루코세레브로시다아제, 수퍼옥사이드 디뮤타아제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인자 VIII, 인자 IX, 아포리포프로테인 E, 아포리포프로테인 A-1, 글로빈들, IL-2 길항제, 알파-1 안티트립신, TNF-알파 전환 효소, 전술한 효소들의 여하한 리간드들, 및 수많은 여타의 효소들 및 그들의 리간드들.
면책조항
전술한 상세한 실시예들에서 요소들 및 특징들의 특정한 조합은 예시적인 것에 불과하다; 본원의 여타의 교시와 이들 교시의 교환 및 치환 또한 명시적으로 의도된다. 당해 분야의 통상의 기술자들은 청구된 바와 같은 본 발명의 사상 및 보호범위로부터 이탈함이 없이 본원에서 개시된 것들의 변이들, 변형들 및 여타의 수행들이 일어날 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 위의 설명들은 예시로서 제공된 것에 불과하며 제한적으로 의도된 것이 아니다. 본 발명의 보호범위는 이하의 청구항들 및 이에 대한 균등물들에 의하여 정의된다. 나아가, 상세한 설명 및 청구항들에서 사용된 참조 기호들은 청구된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
[ 실시예들 및 도면들의 상세한 설명]
본 발명의 대상의 추가적 세부사항들, 특징들, 특성들 및 장점들이 종속항들에 개시되어 있으며, 예시적인 방식의 다음의 각각의 실시예들 및 도면들에 대한 설명은 본원 발명의 바람직한 실시예들을 보여준다. 그러나, 이들 그림들은 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한되는 것으로 이해되어서는 안 된다.
도면들
모든 도면들에서, 에러 바(error bars)들은 표준 편차를 나타낸다. 모든 도시된 결과들은 스튜던트의 T-테스트로 추가적으로 분석되었다 (이하 참조).
도 1: CHO K1 PD 세포들에서 siRNA (Invitrogen)를 이용한 PAM mRNA의 침묵. /1: 병렬 1, /2: 병렬 2, -K: 비 형질감염된 CHO K1 PD 세포들, +K: 스크램블된 siRNA (Ambion)로 형질감염된 CHO K1 PD 세포들.
도 2: CHO K1 PD 세포들에서 siRNA (Ambion)를 이용한 PAM mRNA의 침묵. /1: 병렬 1, /2: 병렬 2, -K: 비형질감염된 CHO K1 PD 세포들, +K: 스크램블된 siRNA (Ambion)로 형질감염된 CHO K1 PD 세포들.
도 1 및 2에 도시된 실험들은 Invitrogen 또는 Ambion에서 제공된 siRNA에 의한 PAM 유전자에 대한 침묵 효과를 평가하기 위하여 고안되었다. CHO K1 PD 세포들은 가장 강한 침묵 효과를 갖는 서열을 결정하기 위하여 siRNAs로 형질감염 되었다. 이것은 또한 PAM mRNA의 발현에서 % 감소를 계산함으로써 (표 9) 그리고 스튜던트의 t-테스트 (표 10)를 이용하여 증명되었다.
도 3: 클론 K25에서 shRNA를 이용한 PAM mRNA의 침묵. /1: 병렬 1, /2: 병렬 2, -K: 비 형질감염된 K25 세포들.
도 4: 클론 K62에서 shRNA 를 이용한 PAM mRNA의 침묵. /1: 병렬 1, /2: 병렬 2, -K: 비 형질감염된 K62 세포들.
도 5: CHO K1 PD 부모 세포 라인에서 shRNA를 이용한 PAM mRNA의 침묵. /1: 병렬 1, /2: 병렬 2, -K: 비 형질감염된 CHO K1 PD 세포들.
도 6: CHO SSF3 부모 세포 라인에서 shRNA를 이용한 PAM mRNA의 침묵. /1: 병렬 1, /2: 병렬 2, -K: 비 형질감염된 CHO SSF3 세포들.
도 3-6에 도시된 실험들은 테스트 된 세포 라인들에서 상이한 shRNAs 및 상이한 농도의 퓨로마이신 (PURO)을 이용한 PAM의 mRNA 발현 수준을 평가하기 위하여 고안되었다. 가장 높은 침묵 효과는 모든 세포 라인들 각각에서 sh6 (만약 단독으로 사용되거나 또는 sh5와의 믹스에서)를 이용하여 관찰되었다. 이것은 또한 PAM mRNA의 발현에서 % 감소를 계산함으로써 (표 11) 그리고 스튜던트의 t-테스트 (표 12)를 이용하여 입증되었다. 오직 소수의 발현 수준의 감소만이 5㎍ /ml 퓨로마이신을 사용하여 관찰되었다. PAM의 침묵은 각각 mRNA 및 단백질 수준에 대하여 측정되었다.
도 7: PAM mRNA 발현 수준 및 mAb 프롤린 아미드 함량 사이의 상호관계. /1: 병렬 1, /2: 병렬 2, -K: 비 형질감염된 K25 및 K62 세포들.
도 8: p사일렌서 2.1-U6 퓨로 벡터의 차트
도 9: 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 (PAM)에 의하여 촉매되는 반응. PAM은 펩타이드들의 C-말단 절단(truncation) 및 알파-아미드화를 촉매하기 위하여 순차적으로 작용하는 2가지 효소 활성들을 함유하는 다기능성 단백질이다. 펩티딜글라이신 알파-하이드록실레이팅 모노옥시게나아제 (PHM)는 반응의 제 1 단계 (펩티딜글라이신 (C-말단)→펩티딜-α-하이드로옥시글라이신)를 촉매하며 그리고 구리 (Cu), 또는 구리 이온들, 아스코르베이트, 및 분자 산소에 의존적이다. 아연 의존 펩티딜아미도-글리콜레이트 라이에이즈 (PAL)는 반응의 제 2 단계 (펩티딜-α-하이드로옥시글라이신 → 펩타이드-α-아미드 및 글리옥실레이트)를 촉매한다. 도면들은 Prigge et al., Science (1997) 278, 1300-1305로부터 얻었다.
실시예들
1. siRNA 기초 유전자 침묵
중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들은 중국 햄스터 (Cricetulus griseus)의 난소로부터 유래된 세포 라인이다. 그들은 생물학적 및 의학적 연구에 그리고 상업적으로 치료적 단백질들의 생산에 종종 사용된다. 이러한 이유로, CHO 세포 라인에서 펩타이드 아미드화 활성을 감소시키는 것이 실험적으로 입증되었다.
CHO 세포들에서 프롤린 아미드 형성을 책임지는 효소의 정확한 서열은 문헌 또는 공공 데이터베이스들에 공개되어 있지 않다. 가능성 있는 뉴클레오타이드 서열들이 독점 CHO EST 데이터베이스로부터 추출되었다. 이 서열 정보에 기초하여, siRNAs가 구성되었으며, 그리고 그들의 침묵 효과가 평가되었다. 짧은 헤어핀 RNAs (shRNAs)이 siRNA 결과들을 기초로 구성되었으며, 그리고 유전자 억제가 mRNA 및 단백질 수준에 대하여 평가되었다.
C. griseus 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 뉴클레오타이드 서열 (표 1)의 결정 후, 9 및 6 siRNA 서열들이 디자인되었다. 침묵 효과가 두 CHO 부모 세포 라인들의 배양 및 두 mAb 생산g CHO 세포 라인들, 각각 하나는 높은 그리고 하나는 낮은 프롤린 아미드 수준을 함유하는 생성물을 생성함, 의 형질감염 및 배양 후 테스트 되었다. 배양 후, PAM mRNA 수준이 qPCR로 측정되었고 가장 강력한 효과를 갖는 두 사일렌서들(silencers)이 shRNA 디자인을 위하여 선택되었다. shRNA를 이용한 세포들의 형질감염 및 뒤이은 세포 배양 후, mRNA 및 PAM 수준 모두가 분석되었다. 실험의 세부사항들은 이하에 제공된다.
Figure pat00001
표 1: 독점 CHO EST 데이터베이스로부터 추출된 PAM 유전자 서열
siRNA 및 shRNA 디자인 및 제조
펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 (PAM) 유전자에 대한 siRNA 서열들을 디자인하기 위하여 각각의 디자인 도구들이 사용되었다. 유전자 서열에 기초하여 상이한 서열들 및 길이들의 siRNAs 가 디자인 되었다 (Invitrogen에 의하여 9개 및 Ambion 에 의하여 6개) (표 2). siRNA 평가 후, shRNAs가 Ambion의 온라인 디자인 도구를 이용하여 디자인 되었다. 각각의 shRNA에 대한 두개의 상보적 올리고뉴클레오타이드들이 Methabion (표 3)에 의하여 합성되었으며 그리고 이후 하우스에서(in house) 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드들을 생성하기 위하여 어닐링 되었다. 그 후에, 어닐링된 올리고뉴클레오타이드들이 p사일렌서 2.1-U6 퓨로 벡터 내로 클론되었다 (도 8). DNA 시퀀싱이 올리고뉴클레오타이드 인서트의 서열을 입증하기 위하여 수행되었다.
Figure pat00002
표 2: siRNAs의 뉴클레오타이드 서열들
Figure pat00003
표 3: shRNAs의 뉴클레오타이드 서열들
siRNA의 재구성
siRNAs가 DEPC 워터에서 최종 40μM 농도로 재구성되었다. 30 pmol의 siRNA가 각각의 병렬(parallel) 뉴클레오펙션(nucleofection)에 사용되었다.
p사일렌서 벡터로 헤어핀 siRNA 인서트들의 클로닝
각각의 shRNA에 대한 두 상보적 올리고뉴클레오타이드들이 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드들을 생성하기 위하여 어닐링 되었다. 그 후에, 어닐링된 올리고뉴클레오타이드들이 p사일렌서 2.1-U6 퓨로 벡터 내로 BamHI 및 HindIII 제한 부위들을 이용하여 클론되었다. 전체 절차는 다음과 같이 수행되었다:
1. 헤어핀 siRNA 템플레이트 올리고뉴클레오타이드들을 대략 100㎕의 뉴클레아제-유리수(free water)에 녹인다.
2. 올리고뉴클레오타이드들을 대략 TE내의 1 ㎍/㎕로 희석한다.
3. 50㎕ 어닐링 혼합물을 다음과 같이 어셈블 한다 (표 4):
Figure pat00004
표 4: siRNAs의 어닐링
4. 혼합물을 90℃로 3분 동안 가열 후, 37℃ 배양기에 배치하고 1 시간 동안 배양한다.
5. 5 ㎕의 어닐링된 헤어핀 siRNA 템플레이트 인서트를 45㎕ 뉴클레아제 유리수로 최종 농도 8 ng/㎕로 희석한다.
6. 두개의 10㎕ 라이게이션(ligation) 반응들을 설정한다; 플러스 인서트 라이게이션 및 마이너스 인서트 음성 대조군.
각각의 튜브에, 다음의 시약들을 첨가한다 (표 5):
Figure pat00005
표 5: 라이게이션 반응들
7. 16℃에서 하룻밤동안 배양한다.
8. 형질전환을 위하여 pGEM-T Easy 벡터 시스템을 사용한다 (Promega, Cat. No.: A13801):
a) E. coli JM109 컴피턴트 세포들을 녹을 때까지 아이스 바스에 배치한다.
b) 50 ㎕의 세포들을 라이게이션 반응 튜브들로 이동하고 3 ㎕의 라이게이션 반응을 각각의 튜브에 첨가한다. 튜브들을 부드럽게 튕기고 20분 동안 배양한다.
c) 세포들을 50초 동안 워터 바스에서 42℃에서 히트-쇼크(Heat-shock) 한다. 즉시 튜브들을 2분 동안 얼음으로 돌려보낸다.
d) 950㎕의 LB 배지를 형질전환 반응들에 첨가하고 흔들면서 1.5시간 동안 37℃에서 배양한다 (225 rpm).
e) 100㎕의 각각의 형질전환 배양을 LB/앰피실린 플레이트들에 배치하고 하룻밤동안 37℃에서 배양한다.
f) siRNA 템플레이트 인서트를 갖는 클론들을 확인하기 위하여 클론들을 고르고, 플라스미드 DNA를 분리하고, ~65 bp siRNA 템플레이트 인서트의 존재를 확인하기 위하여 BamHI 및 HindIII로 분해한다.
9. 다음의 시퀀싱 프라이머들을 이용하여 인서트를 서열화 한다 (표 6):
Figure pat00006
표 6: 시퀀싱 프라이머들
shRNA 발현 구조체들의 분리 및 확인 후, 그들은 단일 커터(single cutter) 제한 엔도뉴클레아제 SspI (AAT/ATT)를 사용하여 선형화(linearised)되었다. 반응 당 최대 50㎍의 플라스미드 DNA가 3 U/㎍ DNA로 SspI 효소를 이용하여 소화되었다.(New England Biolabs, Cat. No.: R0132L) 대략적 용량으로 10×반응 버퍼 및 H2O가 반응에 첨가되었다. 이 반응은 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 소화 후, DNA 침전(precipitation)이 아래 프로토콜에 설명된 바와 같이 라미나 공기-유동 캐비넷(laminar air-flow cabinet)에서 무균 조건 하에서 수행되었다:
1. 1 볼륨의 이소프로판올 (300 ㎕) 추가
2. 완전히 볼텍싱함
3. 30분 동안 21,000 g로 4℃에서 원심분리
4. 상청액 버림
5. 조심스럽게 1 볼륨의 멸균, 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 첨가
6. 1분 동안 최고 속도로, 4℃에서 원심분리
7. 상청액 버림
8. 펠렛을 실온(RT)에서 5-30분 동안 공기 건조. (라미나에서(in laminar))
9. DNA를 50㎕ 멸균수에 재현탁.
다음에, 선형 DNA 의 순도 (O.D. 260/280 nm) 및 농도가 NanoDrop ND-1000를 이용하여 측정되었다.
숙주 세포들
네 가지의 상이한 세포 라인들이 연구에 사용되었다 (부모 CHO K1 PD 및 SSF3 세포 라인들 및 두 가지 mAb 생산 클론들, K25 및 K62). CHO K1 PD 세포 라인은 ATCC (Cat. No. CCL-61.3)로부터 기원한 CHO K1 세포 라인의 부차 집단(subpopulation)이다. 오리지날 세포 라인이 혈청 없는 현탁액 배양에 적응(adapted) 되었으며 DM122 배지 내의 혈청-없는 서브클로닝의 빈도를 향상시키기 위하여 점점 묽어지는 씨딩 밀도로 3번의 연속적인 선택 라운드를 거쳤다. CHO SSF3 세포 라인은 DUKXB1로부터의 혈청 없는 적응된 세포 라인이다. DUKXB1는 CHO K1 세포들로부터 유래 되었다. 양쪽 모두의 기능적 dhfr 대립유전자들이 CHO K1에서 순차적으로 불활성화되었다. 그러나, 결과들은 대립유전자들의 하나가 비가역적으로 불활성화되지 않음을 보여 주였다. 연속적인 혈청 없는 배양은 예상치 못하게 원리 디하이드로폴레이트 리덕타아제 결손 (dhfr-) CHO 세포들에서 낮은 디하이드로폴레이트 리덕타아제 활성의 발현을 유도하였다.
K25 및 K62는 SSF3 부모 세포들을 pBW2017 플라스미드 벡터로 형질감염 시킴으로써 준비되었다. 앞서의 실험들에서, 양쪽 모두의 클론들이 원치 않는 프롤린 아미드 구조들을 함유하는 mAb 생성물을 발현함이 나타났다. K25 및 K62가 침묵 실험들에 포함되었는데, 이는 각각의 mAb 생성물들이 두 가지의 프롤린 아미드의 극단적 값들, 즉 K25에 의하여 생성된 mAb에서 낮은 프롤린 아미드 함량 (4 %) 그리고 K62에 의하여 생성된 mAb에서 높은 프롤린 아미드 함량 (14 %)을 함유하였기 때문이다.
뉴클레오펙션 ( Nucleofection )
Amaxa 뉴클레오펙션 시스템이 세포 형질감염을 위하여 사용되었다. (Nucleofector 키트 V, Cat. No.: VCA-1003). 모든 필요한 세포 조작들을 위하여 충분한 시간을 확보하기 위하여 한번에 5 풀들(pools)이하가 형질감염된다. 상세한 프로토콜이 다음에 개시된다:
1. 형질감염 시에, 세포들은 생존도 ≥90 %로 2E6/ml까지 되어야 한다.
2. 5E6 세포들이 각 뉴클레오펙션 당 사용되었다.
3. 세포들을 카운트하고 90×g로, 10분 동안, 실온(RT)에서 50 ml 원심분리 튜브에서 원심분리한다.
4. 주의깊게 배지의 나머지를 제거하고 세포 펠렛을 용액 V에 재현탁 한다 (형질감염 당 100 μl)
5. DNA (30 pmol siRNA/뉴클레오펙션 또는 3 μg/뉴클레오펙션 shRNA)을 첨가하고 부드럽게 섞는다.
6. DNA와 혼합된 100μl의 세포 현탁액을 형질감염 큐벳(cuvette)에 첨가하고, 그것을 Amaxa Nucleofector 장치에 배치한다.
7. 세포들을 Amaxa 프로그램 U 23을 이용하여 뉴클레오펙션을 통하여 형질감염시킨다.
8. 성장 배지를 조금 큐벳에 첨가하고 세포들을 주의깊게 20 ml 배지가 있는 125 ml 쉐이킹 플라스크로 옮긴다. 큐벳을 신선한 배지 1-2×로 린스하고 이것을 쉐이킹 플라스크에 첨가한다. 세포들을 24-48시간 동안 37℃, 10 % CO2에서 쉐이커(120 rpm)에서 배양한다 .
성장 배지
CHO K1 PD 세포들은 포유류 세포들의 배양에 적합한 배지, 가령 8 mM L-글루타민(Sigma, Cat. No.: G7513)이 보충된 DM122 성장 배지 에서 배양되었다. CHO SSF3 세포들은 8mM L-글루타민(Sigma, Cat. No.: G7513) 및 1mg/L 인슐린 (Millipore, Cat. No.: 10131-027)이 보충된 DM122 성장 배지에서 배양되었다. K25 및 K62은8 mM L-글루타민 (Sigma, Cat. No.: G7513), 1 mg/L 인슐린 (Millipore, Cat. No.: 10131-027) 및 150 nM 메토트렉세이트 (메토트렉세이트 하이드레이트, Sigma, Cat. No.: M8407)가 보충된 DM122 성장 배지에서 배양되었다. 세포 선택 단계들은 추가적으로 3㎍/ml로 그리고 그 후에 5㎍/ml의 퓨로마이신 (Gibco, Cat. No.: A11138-02)으로 보충된 동일한 배지에서 수행되었다.
세포들의 해동(thawing)/냉동(freezing)
바이알들은 70 % 에탄올로 37℃에서 해동되었다. 세포들은 ml 당 cca. 1E5의 생존 가능 세포들의 초기 세포 밀도로 50 ml 미리-덥힌 배지를 함유하는 250 ml 쉐이킹 플라스크들로 직접적으로 액적으로 접종되었다. 세포들은 37℃, 10 % CO2, 120 rpm으로 배양되었다. 세포들은 생존도 > 90 %에서의 지수 성장기에서 동결되었다. 바이알 당 5-10E6 생존 가능 세포들이 7.5 % DMSO를 함유하는 조건화 배지에서 동결되었다. 먼저 이 세포 배양이 180 g, 5분, 실온(RT)에서 원심분리되었고, 여분의 상청액이 버려졌다. 그 후에 DMSO가 최종 농도 7.5 %로 첨가되었다. 세포 펠렛들이 부드럽게 재현탁되었다. 냉동(Cryo)-바이알들이 1ml의 세포 현탁액으로 충전되었으며 -80℃의 저온 냉동고 안의 Mr. Frosty cryo box 내로 이동하였다. 1개월 이내에, 상기 동결된 바이알들은 액체 질소 용기로 이동되었다.
세포들의 배양 및 취급
siRNA 실험들을 위하여 CHO K1 PD 세포들이 siRNAs로 뉴클레오펙션을 이용하여 형질감염되었고 4일간 배양되었다. 4일째 날에, 세포 펠렛들이 qPCR 분석을 위하여 수집되었다. shRNA 실험들을 위하여 모든 네가지 세포 라인들 (CHO K1 PD, CHO SSF3, K25 and K62)이 shRNAs로 뉴클레오펙션을 이용하여 형질감염되었다. 세포들은 지수 세포 성장을 유지하기 위하여 적당한 미리-덥힌 배지 내에 ml당 2-3E5 세포들로 2-2-3-일 스케줄로 분리되었다. 적당한 세포 밀도 및 생존도에 도달한 후 세포들은 나뉘었으며 4가지 개별적 단계들로 가공되었다:
1. 샘플들이 qPCR을 위하여 수집되었다 (세포 펠렛들)
2. 3㎍/ml의 퓨로마이신을 함유하는 10일 배치가 접종되었다 (10일 후 상청액들이 CEX 분석을 위하여 수집되었다)
3. 각각의 세포 배양의 3 세포 바이알들이 동결되었다.
4. 세포들은 5㎍/ml의 퓨로마이신을 함유하는 배지에서 더 배양되었다.
5㎍/ml의 퓨로마이신을 이용하여 적당한 세포 밀도 및 생존도에 도달한 후 단계 1, 2, 및 3이 반복되었다.
세포들은 125 ml 쉐이킹 플라스크들에서 배양되었다. 배양 조건들: 37℃, 90-110 rpm에서 125 및 250 ml 쉐이킹 플라스크들 그리고 10 % CO2, DM122 배지
퓨로마이신 선택
퓨로마이신을 이용하는 항생제 선택이 형질감염 후 제 1 선택 단계였다. 모든 형질감염된 풀들이 최종 농도3 mg/ml의 퓨로마이신을 이용하여 선택되었다. 퓨로마이신은 세포 생존도가 60 %를 초과했을 때 형질감염 2일 후 세포배양에 첨가되었다. 각각의 풀이 적어도 85 % 세포 생존도에 도달한 후, 우리는 5 mg/ml의 퓨로마이신을 이용하여 선택을 속행하였다.
RNA 분리 및 cDNA 합성
10 ng의 루시페라아제 RNA (Promega, Cat. No.: L4561)가 RNA 분리 전에 5E6 세포들에 첨가되었다. 총 RNA (totRNA)가 RNeasy미니 키트를 이용하여 (Qiagen, Cat. No.: 74104) 자동화된 작업대 QIAcube에서 분리되었다. 분리 후, totRNA 농도가 NanoDrop에서 측정되었다. 이어서, DNase I (Ambion, Cat. No.: AM1906)가 5㎍의 totRNA에 첨가되었고 (표 7) 배양되었다(25분 37℃, 10분 75℃). DNase 처리 후 RNA가 cDNA로 SuperScript VILO 키트 (Invitrogen, Cat. No.: 11754-050)를 이용하여 전사되었다.
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표 7: DNase I 처리 및 cDNA 합성
qPCR
TaqMan 화학에 기초한 qPCR 방법이 mRNA 수준 측정에 사용되었다. (TaqMan MasterMix, 어플라이드 바이오 시스템즈, Cat. No.: 4326708 및 디자인, 어플라이드 바이오 시스템즈, Cat. No.: 4331348에 의한 분석, 표 8 참조). PAM mRNA 발현 수준이 절대 정량을 이용하여 계산되었고 세포 당은 물론 기준 유전자 ACTB (β-액틴) 당 mRNA 전사물들의 수로서 표현되었다. ACTB 유전자 당 계산하는 경우 표준 곡선이 분리된 게놈 DNA를 이용하여 구성되었고 ACTB mRNA 카피 수를 측정하는데 사용되었다. ACTB 및 PAM의 mRNA 사이의 비율이 측정되었다. mRNA 카피 수가 세포 당 계산되는 경우, 표준 곡선은 루시페라아제 DNA를 이용하여 구성되었으며 루시페라아제에 대한 mRNA 카피 수가 측정되었다. LUC와 PAM의 mRNA 사이의 비율이 이후에 계산되었으며, 그리고 세포 당 PAM의 mRNA 수준이 측정되었다(도 1 - 6 참조)
Figure pat00008
표 8: qPCR 프라이머들 및 프로브들의 뉴클레오타이드 서열들
양이온 교환 크로마토그래피 ( CEX )
단백질 A 정제된 mAbs가 CEX에 의하여 분석 HPLC 크로마토그래피 시스템을 이용하여 분석되었다. 이 방법을 이용하여 Lys 및 프롤린 아미드가 동일한 피크에서 용리된다. 프롤린 아미드의 용량이 추가로 카르복시펩티다아제로 생성물 C-말단 처치에 의하여 측정되었다. 동일한 CEX 분석에 따라, 나머지 피크는 프롤린 아미드의 용량을 제공한다.
실험 결과들
이 연구의 목표는 siRNA 및 shRNA에 의한 PAM 유전자에 대한 침묵 효과를 평가하는 것이다. PAM의 침묵은 각각 mRNA 및 단백질 수준에 대하여 측정되었다. CHO K1 PD 세포들이 가장 강력한 침묵 효과를 갖는 서열을 결정하여 위하여 siRNAs에 의하여 형질감염되었다. (도 1 - 2 및 표 9-10).
Figure pat00009
표 9: ACTB 또는 LUC 당 당 계산되는 경우 침묵 효과의 %차이
Figure pat00010
표 10: 스튜던트의 t-테스트
위에 나타난 결과들로부터 (도 1 - 2 및 표 9) 우리는 Invitrogen siRNAs을 이용하여 PAM mRNA의 발현의 90 %까지의 감소가 있으며 그리고 Ambion siRNAs를 이용하여 75 %까지의 감소가 있다고 결론내릴 수 있다. 스튜던트의 t-테스트 (표 10)가 어떤 siRNA가 음성 대조군과 현저하게 상이한지를 결정하기 위하여 수행되었다. 그 결과들은 퍼센트 차이 계산(calculation percentual difference) 후 얻어진 바와 같은 동일한 관찰 결과들을 나타낸다. (보다 낮은 p-값이 음성 대조군과 비교하여 보다 큰 발현의 차이를 제공한다). 이들 결과들에 기초하여 두 가지 siRNA 서열들이 선택되었으며 그리고 shRNA 벡터들이 구성되었다 (PAM에 대하여 si6, si5). shRNA 디자인 제약들로 인하여 Ambion사(社)의 siRNAs로부터의 서열들만이 shRNA 구성에 사용되었다. PAM의 침묵을 평가하기 위하여 두 부모 세포 라인들 CHO K1 PD 및 SSF3 그리고 두 mAb 생산 클론들 (생성물에서 프롤린 아미드의 낮은 함량의 K25 및 높은 함량의K62)이 각각의 두 shRNAs 각각 그리고 양쪽 모두의 혼합물로 형질감염 되었다. 형질감염된 세포들의 선택은 연속적인 퓨로마이신의 두 상이한 농도들로 수행되었다 (도 3 - 6). PAM의 침묵은 추가로 생산된 mAb의 CEX 분석에 의한 단백질 수준에 대하여 평가되었으며 mRNA 수준에 대한 상관 관계가 측정되었다 (도 7).
도 3-6의 결과는 테스트된 세포 라인들에 대하여 상이한 shRNAs 및 상이한 농도들의 퓨로마이신 (PURO)을 이용한 PAM의 mRNA 발현 수준을 나타낸다. 가장 높은 침묵 효과가 모든 세포 라인들 각각에서 sh6 (만약 단독으로 사용되거나 또는 sh5과의 믹스에서)를 사용하여 관찰되었다. 이것은 또한 PAM mRNA의 발현에서 % 감소를 계산함으로써 (표 11) 그리고 스튜던트의 t-테스트를 이용하여 (표 12) 입증되었다. 오직 소수의 발현 수준의 감소가 5㎍/ml 퓨로마이신를 사용하여 관찰되었다.
Figure pat00011
표 11: ACTB당 또는 LUC당 계산된 % 차이 침묵 효과
Figure pat00012
표 12: 스튜던트의 t-테스트
도 7의 결과들은 mRNA와 PAM 변형된 mAb 사이의 상관 관계를 나타낸다. 이 상관 관계는 또한 피어슨 함수(Pearson's function)를 계산 함으로써 나타났다. (피어슨의 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)는 0.55로 측정되었다).
2. CHO 세포들에서 징크 핑거 뉴클레아제들( ZFNs )을 사용함에 의한 표적화된 유전자 넉아웃
ZFNs은 높은 특이성으로 선택된 좌위(locus)를 표적화 하도록로 디자인될 수 있다. 이들 뉴클레아제들의 일시적 발현에 따라 표적 유전자가 먼저 ZFNs에 의하여 분열되고 이후 천연의-그러나 불완전한- DNA 복구 공정, 비상동 말단 결합 (nonhomologous end joining), 에 의하여 복구된다. 이것은 종종 돌연변이 (null) 대립유전자들의 발생을 초래한다. 그러한 접근 방식은 예를 들면 Santiago et al, 2008 ("Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-fingernucleases", PNAS April 15, 2008 vol. 105 no. 15)에 기재되어 있다.
PAM 유전자 좌위를 표적하는 부위-특이적 징크-핑거뉴클레아제들이 디자인되고 표적 부위들에 대한 DNA 결합에 대하여 시험관 내에서(in vitro) 스크린된다. ZFNs의 뉴클레아제 기능은 DNA-결합 징크-핑거단백질들에 연결된 엔도뉴클레아제 FokI의 촉매 도메인에 의하여 부여된다.
ZFNs의 각각의 쌍을 발현하는 플라스미드들은 CHO 세포들 내로 형질감염된다. 세포들의 각각의 풀에서 표적 부위에서 ZFN-매개 파괴(disruption)의 빈도가 CEL-I 뉴클레아제를 이용하여 측정된다.
PAM -/- 세포 라인들은 CHO 세포들을 ZFN 쌍으로 형질감염시키고 이후 단일-세포 유래 PAM-결손 세포 라인들을 얻기 위하여 클로닝 단계(예를 들면 제한 희석, ClonePixTM [Molecular Devices Ltd., UK] 또는 유성 세포분석 솔팅)를 수행함으로써 생성된다. 클로닝 후(평균 웰 당 하나의 세포), 분리물들이 CEL-I 분석법 또는 qPCR 분석을 사용하여 PAM 유전자 파괴에 대하여 분석되었다. 각각의 세포 라인에서 돌연변이 대립유전자들의 정확한 서열, 그리고 따라서 유전 형질, 이 표적 좌위를 PCR-증폭시키고 PCR 생성물을 클로닝하거나, 또는 사용 가능한 제 2 세대 시퀀싱 기술들을 사용함으로써 측정되었다.
3. TALENS로 유전자 표적화
TALENs는 FokI 뉴클레아제에 커플링된 어셈블된 DNA-결합 모티프들로 구성된 신규한 융합 단백질들이다. DNA-결합 모티프들은 박테리아 속 Xanthomonas에서 식물 병원체들에 의하여 분비되는 단백질로부터 온다.
커스텀(custom) TALEN의 어셈블리, 또는 TAL 이펙터 구조체가 예컨대, Cermak et al, 2011 ("Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting"; Nucl. Acids Res. 39 (12))에 기재되어 있으며, 다음의 두 단계들에 관련된다: (i) 반복 모듈들(repeat modules)을 1-10 반복서열들(repeats)의 중간 어레이들(intermediary arrays) 내로 어셈블리 하며, 그리고 (ii) 중간 어레이들을 최종 구조체를 만들기 위하여 백본(backbone) 내로 결합시키는 것. 이 공정의 세부 사항들은 Cermak et al. 2011에 개시되어 있다.
TALENs을 디자인하기 위한 소프트웨어는 온라인 도구로서 사용 가능하다 (TAL Effector-Nucleotide Targeter, TALE-NT; http://boglabx.plp.iastate.edu/TALENT/). 이 도구는 표적화될 관심 대상의 유전자 예컨대, PAM 유전자의 DNA 서열들을 입력하는 윈도우를 제공한다. 이 소프트웨어는 15 내지 30bp 길이이며 스페이서로 분리되는 TALEN 인식 부위들의 세트를 확인한다. 디폴트(default) 스페이서 길이들은 15bp 및 18-30bp이지만, 여타의 길이들은 사용자에 의하여 특정될 수 있다. 또한, 버튼들은 사용자가 디자인 가이드라인들을 개별적으로 배제할 수 있도록 허용한다.
PAM 유전자를 표적하는 TALENs의 쌍의 하나가 XhoI 및 AflII를 이용하여 포유류 발현 벡터 pCDNA3.1(-) (Invitrogen) 내로 서브클론된다. 이들 효소들은 pTAL3 또는 pTAL4로부터 전체 TALEN을 삭제하며 코딩 서열을 CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터의 제어 하에 둔다. 결과물인 플라스미드들은 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민2000 (Invitrogen)을 사용하여 형질감염에 의하여 HEK293T 세포들로 도입된다. 세포들은 형질감염 72 시간 후 수집되며 게놈 DNA가 분리되며 Hpy188I로 분해된는데, 이는 TALEN 표적 부위의 스페이서 서열에 끼어든다. 소화 후, 표적 부위를 포괄하는 염색체 단편이 PCR로 증폭된다. 그 후, PCR 생성물들은 Hpy188I로 소화되고 TOPO TA 벡터 (Invitrogen) 내로 클론된다. PCR 생성물의 전-길이를 함유하는 독립 클론들은 분열 부위에서 돌연변이들을 평가하기 위하여 서열화된다.
SEQUENCE LISTING <110> LEK Pharmaceuticals d.d. <120> Reduction of formation of amidated amino acids in cell lines for protein expression <130> SD 42432 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 672 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 gggagtgctc ctaagccagg ccagttcagt gttcctcaca gtttggccct tgtgcctcat 60 ttggaccagt tgtgtgtggc agacagggaa aatggccgga tccaatgttt cagaactgac 120 accaaagaat ttgtgagaga gattaaacat gcgtcatttg ggagaaatgt attcgcaatt 180 tcatatatat caggtttgct ctttgcagta aatgggaagc cttactttgg agaccatgaa 240 cctgtgcaag gctttgtgat gaacttttcc agtggggaaa ttatagatgt cttcaagcca 300 gtacgcaagc actttgacat gcctcacgat gtggttgcct ctgacgatgg gaatgtgtac 360 attggagacg cacacacgaa cacggtgtgg aagttcaccc tgactgaaaa aatggagcat 420 cgatcggtta aaaaggcagg cattgaggct caggaaatca aagaaaccga ggcagttgtt 480 gaatccaaaa tggagaacaa acccacctcc tcagaattgc agaagatgca agagaaacag 540 aaactgatca aagagccagg ttcgggagtg cccgtggttc tcattacaac ccttctggtt 600 attcctgtgg ttgtcctgct ggccattgtc atgtttattc ggtggaaaaa atcaagggcc 660 tttggaggaa aa 672 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_1 <400> 2 caguugugug uggcagacag ggaaa 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_2 <400> 3 cggauccaau guuucagaac ugaca 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_3 <400> 4 ccaauguuuc agaacugaca ccaaa 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_4 <400> 5 gagagagauu aaacaugcgu cauuu 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_5 <400> 6 caugcgucau uugggagaaa uguau 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_6 <400> 7 ugggagaaau guauucgcaa uuuca 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_7 <400> 8 gggagaaaug uauucgcaau uucau 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_8 <400> 9 cacacgaaca cgguguggaa guuca 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_9 <400> 10 caaagaaacc gaggcaguug uugaa 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_1 <400> 11 caguaaaugg gaagccuuat t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_2 <400> 12 aggcaguugu ugaauccaat t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_3 <400> 13 aacagaaacu gaucaaagat t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_4 <400> 14 caagagaaac agaaacugat t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_5 <400> 15 gaacugacac caaagaauut t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA_6 <400> 16 uuucagaacu gacaccaaat t 21 <210> 17 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH5_HLPAM <400> 17 gatccgaact gacaccaaag aattctcaag agaaattctt tggtgtcagt tctgtttttt 60 ggaaa 65 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH6_HLPAM <400> 18 gatccgtttc agaactgaca ccaaactcaa gagatttggt gtcagttctg aaacattttt 60 tggaaa 66 <210> 19 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA_Bottom Strand Oligonucleotide <400> 19 agcttttcca aaaaacagaa ctgacaccaa agaatttctc ttgagaattc tttggtgtca 60 gttcg 65 <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA_Bottom Strand Oligonucleotide SH6_HLPAM <400> 20 agcttttcca aaaaatgttt cagaactgac accaaatctc ttgagtttgg tgtcagttct 60 gaaacg 66 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward sequencing primer <400> 21 aggcgattaa gttgggta 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse sequencing primer <400> 22 taatacgact cactataggg 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PAM <400> 23 ggccggatcc aatgtttcag aa 22 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer ACTB <400> 24 agccacgctc ggtcag 16 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer LUC <400> 25 ctgatttttc ttgcgtcgag ttt 23 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PAM <400> 26 tcccaaatga cgcatgttta atctct 26 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer ACTB <400> 27 catcctgcgt ctggacct 18 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer LUC <400> 28 gagttgtgtt tgtggacgaa gtac 24 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe PAM <400> 29 ctgacaccaa agaattt 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ACTB <400> 30 ccgggacctg acagact 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe LUC <400> 31 tccggtaaga cctttcg 17

Claims (22)

  1. 감소된 펩타이드 아미드화 활성을 갖는 단백질 발현을 위한 세포,
    여기서, 상기 세포에서 감소된 펩타이드 아미드화 활성은 다음 중 적어도 어느 하나에 의하여 달성됨을 특징으로 함:
    a) 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소; 및
    b) 기능 장애, 또는 불활성 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소, 또는 감소된 활성을 가지며,
    상기 펩타이드 아미드화 촉매 효소는 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 (PAM)인 펩타이드 아미드화 촉매 효소의 발현.
  2. 주어진 세포에서 펩타이드 아미드화 활성을 감소시키는 방법으로서, 여기서 상기 방법은 다음으로 구성된 그룹에서 하나 이상의 단계를 포함함:
    a) 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 발현의 억제 또는 감소; 및
    b) 기능 장애, 또는 불활성인 펩타이드 α-아미드화 촉매 효소, 또는 감소된 활성을 가지며,
    상기 펩타이드 아미드화 촉매 효소는 펩티딜글라이신 알파-아미드화 모노옥시게나아제 (PAM)인 펩타이드 아미드화 촉매 효소의 발현.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 감소된 펩타이드 아미드화 활성은 이하로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단계에 의하여 달성됨을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 세포:
    펩타이드 α-아미드화를 촉매 효소를 코딩하는 유전자에 대한,
    - 유전자 침묵,
    - 유전자 넉-다운,
    - 유전자 넉-아웃,
    - 우성 음성 구조체(dominant negative 구조체)의 전달(delivery),
    - 조건적 유전자 넉-아웃, 및
    - 유전자 변이.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 세포는 진핵 세포임을 특징으로 하는 세포.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 세포는 동물 세포 및 식물 세포 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 하는 세포.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 세포는 포유류 세포임을 특징으로 하는 세포.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 세포는 재조합 세포임을 특징으로 하는 세포.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 세포는 다음으로 구성된 그룹에서 하나 이상이 선택됨을 특징으로 하는 세포:
    - 어린 햄스터 신장 세포들
    - 중국 햄스터 난소 세포들
    - 마우스 골수종 세포들
    - 인간 배아 신장 세포들
    - 인간-레티나- 유래-세포들 및
    - 양수 세포들
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드 아미드화 촉매 효소를 위한 유전자 코딩의 유전자 발현이 RNA 간섭 (RNAi)에 의하여 억제되거나, 또는 감소되는 것을 특징으로 하는 세포.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드 아미드화 촉매 효소는 C-말단 프롤린 아미드 잔기들의 형성을 촉매함을 특징으로 하는 세포.
  11. 동종(homologous) 단백질 발현을 위하여 사용되는 제 1항에 따른 세포.
  12. 이종 단백질 발현을 위하여 사용되는 제 1항에 따른 세포.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 단백질은 다음으로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단백질임을 특징으로 하는 세포:
    - 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체
    - 융합 단백질,
    - 항체 모방체, 및
    - 비-항체 단백질들.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 단백질은 다음으로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단백질임을 특징으로 하는 세포:
    - 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체
    - 융합 단백질,
    - 항체 모방체, 및
    - 비-항체 단백질들.
  15. 제 2항에 있어서,
    상기 감소된 펩타이드 아미드화 활성은 이하로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단계에 의하여 달성됨을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법:
    펩타이드 α-아미드화를 촉매 효소를 코딩하는 유전자에 대한,
    - 유전자 침묵,
    - 유전자 넉-다운,
    - 유전자 넉-아웃,
    - 우성 음성 구조체(dominant negative 구조체)의 전달(delivery),
    - 조건적 유전자 넉-아웃, 및
    - 유전자 변이.
  16. 제 2항에 있어서,
    상기 세포는 진핵 세포임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 2항에 있어서,
    상기 세포는 동물 세포 및 식물 세포 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 2항에 있어서,
    상기 세포는 포유류 세포임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 2항에 있어서,
    상기 세포는 재조합 세포임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 2항에 있어서,
    상기 세포는 다음으로 구성된 그룹에서 하나 이상이 선택됨을 특징으로 하는 방법:
    - 어린 햄스터 신장 세포들
    - 중국 햄스터 난소 세포들
    - 마우스 골수종 세포들
    - 인간 배아 신장 세포들
    - 인간-레티나- 유래-세포들 및
    - 양수 세포들
  21. 제 2항에 있어서,
    상기 펩타이드 아미드화 촉매 효소를 위한 유전자 코딩의 유전자 발현이 RNA 간섭 (RNAi)에 의하여 억제되거나, 또는 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 2항에 있어서,
    상기 펩타이드 아미드화 촉매 효소는 C-말단 프롤린 아미드 잔기들의 형성을 촉매함을 특징으로 하는 방법.
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