JP7453151B2 - 液体培地の調製方法 - Google Patents

Description

本発明は液体培地の調製方法、該調製方法により調製された液体培地、該調製方法により調製された液体培地を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた所望の品質を有するポリペプチドの製造方法および該製造方法を用いて製造される所望の品質を有するポリペプチドに関する。

近年、生理活性物質、中でもポリペプチド、糖蛋白質または抗体を有効成分として含む、種々のバイオ医薬品が認可され、さらに多くの候補物質が開発中である。

低分子医薬品と比較してバイオ医薬品の製造コストが高いことは、医薬産業における課題である。これまでに、細胞培養に用いられる液体培地において、一部成分の補強、新規成分の追加や高濃度化などの液体培地の改良により、バイオ医薬品の生産性向上を達成し、コスト削減を図る取り組みがなされてきている。細胞培養に用いられる液体培地には、細胞増殖及びバイオ医薬品の有効成分である生理活性物質の産生に必要な複数の栄養分を十分量含有している必要がある。一般的に、細胞培養に用いられる液体培地には、成分として、アミノ酸類、核酸類、糖類、脂質類、ビタミン類、金属類、無機塩類およびそれらの誘導体等が含まれ、これらの成分が液体培地中に溶解した状態で細胞に利用され、細胞の増殖、生存および生理活性物質の生産に利用される。

細胞培養に用いられる液体培地の組成または成分の一部は、産生されるバイオ医薬品の有効成分の品質に影響を与えることが知られている。バイオ医薬品としての目標品質を満たすため、バイオ医薬品の有効成分の品質に影響する培地成分の特定または組成の最適化が液体培地の開発において重要である。特に、細胞培養に用いられる液体培地に含まれる金属類は極めて微量である一方で、生産される生理活性物質の生産性または品質に影響することが報告されている（非特許文献１）。例えば、細胞培養に用いられる液体培地に含まれる銅の濃度が細胞増殖もしくは生産性、または産生される抗体の品質に影響を与えることが知られている（非特許文献２）。

このような背景から、バイオ医薬品の生産性を向上させ、所望の品質のバイオ医薬品を生産させるために、生理活性物質の生産に最適な液体培地を調製することに対する要求は増している。

一方、バイオ医薬品を製造する上では、細胞を用いた培養を適切に実施し、製品の安全性を確保するために、細胞培養に用いられる培地の無菌性を担保する必要がある。このため、液体培地を培養に利用するに際し、例えば０．２μｍの孔径を有する膜でろ過すること等により無菌性を確保することが一般的に行われる。最近では、微生物除去だけでなくマイコプラズマ除去を目的とした０．１μｍ膜を用いたろ過工程の利用が推奨され、潜在的ウイルスを除去可能なろ過膜の開発も進められるようになってきている（非特許文献３）。

D. Bruhlmann et al., Biotechnology Progress, 2015, 31, 615-629 T. Kaschak et al., mAbs, 2011, 6, 577-583 R. J. Hay et al., Nature, 1989, 339, 487-488

液体培地は粉末培地を溶媒に溶解させて調製されるが、溶解工程において培地成分の一部が溶媒に溶解していないと、その不溶成分はろ過工程で除去されることになる。従って、液体培地の調製工程においては、培地の組成がろ過工程の前後で変化しないように、ろ過工程の前に、培地成分を溶媒に効果的に溶解させなければならない。

本発明者らは、特に大規模に液体培地の調製を行うと、溶媒への培地成分の溶解性が低下し、ろ過前後で培地の成分が変化することを見出した。また、大規模に調製された液体培地を用いてポリペプチドの製造を行うと、ポリペプチド由来の不純物であるバリアントの量が増加することを初めて見出した。

すなわち本発明は、培地成分を溶媒に効果的に溶解させた液体培地の調製方法、該調製方法により調製された液体培地、該調製方法により調製された液体培地を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた所望の品質を有するポリペプチドの製造方法および該製造方法を用いて製造される所望の品質を有するポリペプチドに関する。

本発明者らは、所望の量の成分を含む培地の調製方法を鋭意検討した。その結果、液体培地の調製工程において、培地調製時の酸素濃度を制御することで、効果的に培地成分を溶媒中に溶解させ、所望の成分および量を含む液体培地を調製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、以下に関する。
１．粉末培地を酸素存在下で溶媒に溶解する工程を含む、液体培地の調製方法。
２．前記粉末培地が銅またはその誘導体を含む、前記１に記載の液体培地の調製方法。
３．前記銅またはその誘導体が、銅の単体、酸化物、塩またはその水和物である、前記２に記載の液体培地の調製方法。
４．前記銅またはその誘導体が、硫酸銅（ＩＩ）五水和物、塩化銅（ＩＩ）二水和物、塩化銅（Ｉ）もしくは硝酸銅（ＩＩ）三水和物またはこれらの混合物である前記２または３に記載の液体培地の調製方法。
５．システイン、シスチンまたはそれらの誘導体を添加する工程を含む、前記１～４のいずれか１に記載の液体培地の調製方法。
６．以下の（ｉ）および（ｉｉ）から選ばれる少なくともいずれか１つの操作を含む、前記１～５のいずれか１に記載の液体培地の調製方法；
（ｉ）酸素を含む気体を上面通気させ、前記気体と前記溶媒とを接触させる操作、および
（ｉｉ）前記酸素を含む気体を前記溶媒中にスパージする操作。
７．前記溶媒を撹拌する操作を含む、前記１～６のいずれか１に記載の液体培地の調製方法。
８．前記粉末培地を酸素存在下で前記溶媒に溶解する工程の後に、更に膜ろ過の工程を含む、前記１～７のいずれか１に記載の液体培地の調製方法。
９．前記膜ろ過の前後で前記液体培地中の銅濃度が実質的に変化しないことを特徴とする、前記８に記載の液体培地の調製方法。
１０．前記膜ろ過に用いるろ過膜の孔径が１ｎｍから１００μｍである、前記８または９に記載の液体培地の調製方法。
１１．前記溶媒又は前記液体培地中の溶存酸素濃度を測定する工程を含む、前記１～１０のいずれか１に記載の液体培地の調製方法。
１２．前記液体培地の調製前または調製中に、前記溶媒又は前記液体培地中の溶存酸素濃度を測定する工程を含む、前記１～１１のいずれか１に記載の液体培地の調製方法。
１３．前記液体培地の調製時において、前記溶媒が飽和溶存酸素量の２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の酸素を含む、前記１～１２のいずれか１に記載の液体培地の調製方法。
１４．前記溶媒の量が１０～１００００Ｌである、前記１～１３のいずれか１に記載の液体培地の調製方法。
１５．前記１～１４のいずれか１に記載の調製方法により調製された液体培地。
１６．前記１５に記載の液体培地を用いる細胞の培養方法。
１７．前記細胞がポリペプチドを発現する細胞である、前記１６に記載の細胞の培養方法。
１８．前記ポリペプチドが抗体である、前記１７に記載の細胞の培養方法。
１９．前記細胞が動物細胞である、前記１６～１８のいずれか１に記載の細胞の培養方法。
２０．前記動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、前記１９に記載の細胞の培養方法。
２１．前記細胞が遺伝子組換え細胞である、前記１６～２０のいずれか１に記載の細胞の培養方法。
２２．所望のポリペプチドを発現する細胞を、前記１５に記載の液体培地中で培養し、培養物中に該ポリペプチドを生産蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
２３．前記ポリペプチドが抗体である、前記２２に記載のポリペプチドの製造方法。
２４．前記細胞が動物細胞である、前記２２または２３に記載のポリペプチドの製造方法。
２５．前記動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、前記２４に記載のポリペプチドの製造方法。
２６．前記細胞が遺伝子組換え細胞である、前記２２～２５のいずれか１に記載のポリペプチドの製造方法。
２７．前記２２～２６のいずれか１に記載の製造方法を用いて製造されたポリペプチド。
２８．ポリペプチドを発現する細胞を培養する工程において、前記１５に記載の液体培地を使用する、該ポリペプチド由来のバリアントの生成を制御する方法。
２９．前記ポリペプチドが抗体である、前記２８に記載のバリアントの生成を制御する方法。
３０．前記バリアントが、Ｃ末端プロリンがアミド化された抗体である、前記２９に記載のバリアントの生成を制御する方法。
３１．前記細胞が動物細胞である、前記２８～３０のいずれか１に記載のバリアントの生成を制御する方法。
３２．前記動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、前記３１に記載のバリアントの生成を制御する方法。
３３．前記細胞が遺伝子組換え細胞である、前記２８～３２のいずれか１に記載のバリアントの生成を制御する方法。

驚くべきことに本発明者らは、細胞培養用液体培地の調製方法において、粉末培地を酸素存在下で溶媒に溶解する工程を含むことで、培地調製時の酸素濃度を制御して、効果的に培地成分を溶媒中に溶解させ、所望の成分および量を含む液体培地を調製できることを初めて見出した。さらに本発明者らは、得られた所望の成分および量を含む液体培地を細胞培養に使用し、所望の品質を有するポリペプチドを製造できることを見出した。

すなわち本発明により、培地成分を溶媒中に効果的に溶解させる液体培地の調製方法、該調製方法により調製された液体培地、該調製方法により調製された液体培地を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた所望の品質を有するポリペプチドの製造方法および該製造方法を用いて製造される所望の品質を有するポリペプチドを提供することができる。

図１Ａは、粉末培地を水に添加後、空気を通気しながら所定の時間撹拌することにより調製された培地の銅濃度を示す。図１Ａにおいて、黒い棒グラフはろ過前の培地の銅濃度、白い棒グラフはろ過後の培地の銅濃度を示す。 図１Ｂは、粉末培地を水に添加後、窒素を通気しながら所定の時間撹拌することにより調製された培地の銅濃度を示す。図１Ｂにおいて、黒い棒グラフはろ過前の培地の銅濃度、白い棒グラフはろ過後の培地の銅濃度を示す。 図２は、各溶存酸素濃度条件で調製された液体培地の銅濃度を示す。黒い棒グラフはろ過前の培地の銅濃度、白い棒グラフはろ過後の培地の銅濃度を示す。 図３は、各溶存酸素濃度条件で調製された液体培地を用いて抗体生産細胞の培養を行い、得られた抗体のＢａｓｉｃ Ｐｅａｋｓの割合を表す。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、粉末培地を酸素存在下で溶媒に溶解する工程を含む、液体培地の調製方法に関する。

本発明における培地は、市場で入手可能な培地から適宜選択でき、また２種類以上の培地を混合してもかまわない。さらに文献に記載された公知の培地等も選択できる。これらの培地に所望の栄養因子を適宜選択して添加することもできる。さらに、所望の栄養因子を適宜選択した成分で培地を構成してもかまわない。

本発明における培地は、合成培地、半合成培地または天然培地のいずれでもよい。例えば、基礎培地、血清含有培地、無血清培地、動物由来成分を含まない培地、無蛋白質培地または完全合成培地等が挙げられ、好ましくは無血清培地、無蛋白質培地または完全合成培地が挙げられる。

本発明における基礎培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science, 122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ (ＤＭＥＭ）培地［Virology, 8, 396 (1959)］、１９９培地［Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)］、Ｆ１２培地（ＬＴＩ社製）［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965)］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［J. Experimental Medicine, 147, 923 (1978)］、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地（インビトロジェン社製）、などの市販培地、またはこれらの改変培地や混合培地等が挙げられ、好ましくはＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地またはハイブリドーマＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）等が挙げられる。

本発明における血清含有培地としては、例えば、基礎培地に、ウシ、ウマ等の哺乳類動物血清、ニワトリ等の鳥類動物血清、ブリ等の魚類動物血清、または、上記血清の分画物の内、1種以上の血清、または血清分画物を添加したものが挙げられる。
本発明における無血清培地としては、基礎培地に、血清の代替物である栄養因子、生理活性物質等を添加させたものが挙げられる。

本発明における動物由来成分を含まない培地において、動物由来成分の代わりに添加される物質としては、遺伝子組換え法で製造された生理活性物質、加水分解物または動物由来原料を含まない脂質等が挙げられる。

本発明における無蛋白培地としては、例えば、ＡＤＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ、ハイクローン社製）、ＣＤ－Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地（インビトロジェン社製）、ＣＤ－ＣＨＯ培地（インビトロジェン社製）、ＩＳ－ＣＤ－ＣＨＯ培地（アーバイン・サイエンティフィック社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ－ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）等が挙げられる。

本発明における培地としては、例えば、微生物培養用の培地、昆虫細胞培養用の培地、酵母細胞培養用の培地、植物細胞培養用の培地または動物細胞培養用の培地等が挙げられ、好ましくは動物細胞培養用の培地が用いられる。

本発明における細胞培養用の培地としては、細胞培養に適した培地であればいずれも用いることができるが、好ましくは動物細胞培養用の培地が挙げられ、さらに好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養用の培地が挙げられる。

本発明における培地としては、特に制限はないが、例えば、拡大培養培地、基本（初発）培地、フィード（流加）培地または還流用培地等が挙げられる。

本発明における粉末培地は、粉末形態で存在する培地であればいずれも用いることができる。本発明における粉末培地には顆粒形態で存在する培地も含まれる。

本発明における粉末培地の製造方法は特に限定はないが、好ましくは、乾燥成分のディスクミル、ボールミル、ピンミル等のような混合プロセスによる製造方法、または事前に作られた液体培地の凍結乾燥による製造方法等が挙げられる。

本発明における顆粒形態で存在する粉末培地の製造方法は特に限定されないが、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）等が挙げられる。また、細粒化した成分に、更に天然糊料、合成糊料、糖類、及び油脂類からなる群から選択された少なくとも１種類の素材を溶解した溶液を噴霧し乾燥させる工程が含まれてもよい。

本発明における液体培地としては、特に限定されるものではないが、好ましくは細胞等を培養することができる培地が挙げられる。本発明における液体培地は、粉末培地を溶媒に溶解することにより調製される。

液体培地を調製するために用いられる溶媒は、粉末培地が溶解すればいずれも用いることができるが、例えば水、または予め栄養因子および／もしくは緩衝成分等を含む水溶液等が挙げられる。また、液体培地をさらに溶媒として用いることもできる。

液体培地を調製するために用いられる溶媒の量としては、目的のポリペプチドの生産に必要な所望の量の液体培地を調製するために適した量であれば特に限定されないが、所望の培養スケールまたは培養容器の大きさに応じて、１０Ｌ～１００００Ｌの範囲で調製する。

本発明における栄養因子は、糖類などの炭素源、アミノ酸などの窒素源が含まれ、特に糖類、アミノ酸、ビタミン、脂質、核酸、生理活性物質、脂肪酸、有機酸、蛋白質、加水分解物または金属もしくはその塩等が挙げられる。また、これらの化合物は、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩もしくはアンモニウム塩等の塩及び／または例えば水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。

本発明における糖類は、単糖、オリゴ糖、多糖のいずれでもよく、特に限定されない。さらにデオキシ糖、ウロン酸、アミノ糖または糖アルコール等の糖誘導体も含まれる。例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、リボース、アラビノース、リブロース、エリトロース、エリトルロース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、セドヘプツロース、マルトース、ラクトースまたはスクロース等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。

本発明におけるアミノ酸としては、特に限定されないが、例えば、Ｌ－アラニン（Ａｌａ）、Ｌ－アルギニン（Ａｒｇ）、Ｌ－アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｌ－システイン（Ｃｙｓ）、Ｌ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｌ－グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｌ－ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｌ－リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ－メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｌ－プロリン（Ｐｒｏ）、Ｌ－セリン（Ｓｅｒ）、Ｌ－スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ－トリプトファン（Ｔｒｐ）またはＬ－バリン（Ｖａｌ）等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、シスチン等の多量体を用いてもよい。ペプチドまたはその多量体として添加してもよく、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システインまたはグルタチオン等が挙げられる。

本発明におけるビタミンとしては、特に限定されないが、例えば、ｄ－ビオチン、Ｄ－パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ－α－トコフェロール等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。

本発明における脂質としては、特に限定されないが、例えば、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸等が挙げられる。

本発明における生理活性物質としては、特に限定されないが、例えば、インシュリン、トランスフェリン、血清アルブミンまたは増殖因子を含む血清分画物等が挙げられる。これらの生理活性物質には遺伝子組換え技術または化学合成技術を用いて製造された生理活性物質も含まれる。

本発明における加水分解物としては、特に限定されないが、例えば、大豆、小麦、米、えんどう豆、綿実、魚または酵母抽出物等の加水分解物または抽出物等が挙げられる。具体的にはＳＯＹ ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ ＵＦ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２－１Ｋ３９８６、または９１０５２－５Ｋ３９８６）等が挙げられる。

本発明における金属としては、特に限定されないが、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、バナジウム、銅、カドミウム、ルビジウム、コバルト、ジルコニウム、ゲルマニウム、ニッケル、スズ、クロムまたはケイ素等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。

本発明における緩衝成分としては、特に限定されないが、例えば、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸等が挙げられる。

本発明における粉末培地または液体培地の成分には、銅、システイン、シスチンおよび／またはそれらの誘導体が含まれることが好ましい。

本発明における銅またはその誘導体としては、特に限定されないが、銅の単体、酸化物、および塩またはその水和物が挙げられる。銅の酸化物としては例えば酸化銅（Ｉ）または酸化銅（ＩＩ）が挙げられる。銅の塩としては、例えばシアン化銅（Ｉ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物、塩化銅（ＩＩ）二水和物、塩化銅（Ｉ）または硝酸銅（ＩＩ）三水和物などが挙げられ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物、塩化銅（ＩＩ）二水和物、塩化銅（Ｉ）または硝酸銅（ＩＩ）三水和物が好ましい。

銅またはその誘導体は、調製された液体培地中の濃度が１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、好ましくは１～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬになるように添加される。

本発明におけるシステインまたはそれらの誘導体としては、特に限定されないが、Ｌ－システイン、システイン塩酸塩、システイン塩酸塩一水和物、アセチルシステイン、グルタチオンなどが挙げられる。

本発明におけるシスチンまたはそれらの誘導体としては、特に限定されないが、Ｌ－シスチン、シスチン二塩酸塩、Ｌ－シスチン二ナトリウム塩などが挙げられる。

システイン、シスチンまたはそれらの誘導体は、調製された液体培地中の濃度が例えば１μｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬになるように添加される。

システイン、シスチンまたはそれらの誘導体は、その他の成分を含む粉末培地に添加した後、溶媒に溶解してもよいし、システイン、シスチンまたはそれらの誘導体を、その他の成分を含む粉末培地と別に溶媒に添加してもよい。システイン、シスチンまたはそれらの誘導体を、その他の成分を含む粉末培地と別に溶媒に添加する場合、システイン、シスチンまたはそれらの誘導体を、その他の成分を含む粉末培地より先に添加してもよいし、後に添加してもよい。

本発明の液体培地の調製において、酸素は、粉末培地を溶解させる容器の上面の空隙から酸素を含む気体を上面通気させ、該気体と溶媒または調製される液体培地を接触させることで供給してもよいし、酸素を含む気体を溶媒中または調製される液体培地中にスパージすることで供給してもよい。

前記酸素を含む気体としては、酸素を含有する限り特に限定されないが、例えば、純酸素、酸素と他の気体との混合物または空気などが挙げられる。前記酸素を含む気体が酸素と他の気体との混合物である場合、他の気体としては窒素、アルゴン、ヘリウムまたは二酸化炭素などが挙げられる。これらのうち１種類以上の気体と酸素を任意の混合比率で調製し供給する。

本発明の液体培地の調製時において、供給される酸素の濃度または量としては、例えば銅等の培地成分が十分溶解し、沈殿を発生しない量であれば特に限定はないが、溶媒または調製される液体培地が飽和溶存酸素量の２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％上、９９％以上または１００％の酸素を含むように調整することが好ましい。より好ましくは、飽和溶存酸素量の２０％以上、さらに好ましくは４０％以上になるように維持する。

溶媒または調製される液体培地中に含まれる酸素の量を維持する方法としては、連続的または断続的に酸素を含む気体を供給する方法が挙げられる。

本発明の液体培地の調製時には、溶媒または調製される液体培地は、酸素存在下で静置または撹拌される。保持または撹拌は、例えば銅等の粉末培地が完全に溶解しその濃度が安定に維持できる期間行う。具体的には１０分～１０日間であり、好ましくは３０分～２４時間、より好ましくは３０分～６時間の範囲で行う。

撹拌により粉末培地及び酸素を溶媒に溶解させることができる。前記攪拌は、撹拌翼を、例えば１～２００ｒｐｍの速度で回転させることにより行われる。また、酸素を含む気体を溶媒または調製される液体培地の下面から通気することによる、自発的な混合によっても、粉末培地及び酸素を溶解させることができる。

本発明の液体培地の調製時における酸素の供給量は、例えば１リットルあたりの溶媒または調製される液体培地に対して１～５００ｍＬ／分であり、好ましくは１０～１００ｍＬ／分である。溶媒または調製される液体培地に供給される酸素の濃度または量は、液体培地の調製前または調製中に、溶媒または調製される液体培地に含まれる溶存酸素濃度を、光学式またはポーラログラフ式などで測定することで容易に制御することが可能である。溶存酸素濃度を測定しながら、酸素濃度が適切に調節されていることを確認することで、銅等の粉末培地の溶解を判断することが可能である。

本発明の液体培地の調製において、粉末培地を溶媒に一度に添加してもよいし、複数回に分けて添加してもよい。また、溶媒を張り込んだ培地調製用容器に粉末を投入して溶解させてもよいし、培地調製用容器に先に粉末を投入した後に溶媒を添加してもよい。

調製された液体培地の用途は特に限定されるものではないが、更にろ過膜を用いてろ過した後に細胞培養に供することが出来る。すなわち、本発明の液体培地の調製方法は、粉末培地を酸素存在下で溶媒に溶解する工程後に、更に膜ろ過の工程を含んでもよい。

膜ろ過の方法としては、処理する液体培地を圧力により多孔質膜を透過させ、溶液中の微生物、成分、粒子または夾雑物等の望まない物質を除去する方法であれば、特に限定されないが、好ましくは、精密ろ過法、限外ろ過法、透析法、電気透析法または逆浸透法、更に好ましくは、精密ろ過法、限外ろ過法または透析法が挙げられる。特に好ましくは、精密ろ過法が挙げられる。

本発明おける膜としては、特に限定されないが、好ましくは、精密ろ過膜、限外ろ過膜、透析膜、電気透析膜または逆浸透膜が挙げられる。更に好ましくは、精密ろ過膜、限外ろ過膜または透析膜が挙げられる。特に好ましくは、精密ろ過膜が挙げられる。

膜ろ過に用いるろ過膜の孔径としては、液体培地を無菌化することができれば、特に限定されないが、好ましくは１ｎｍから１００μｍであり、さらに好ましくは、５ｎｍから１０μｍであり、より好ましくは１０ｎｍから１μｍである。特に好ましくは、０．１μｍから０．５μｍである。

本発明に用いる膜の材質としては、特に限定されないが、例えば、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニル－ポリアクリロニトリル共重合体、ポリスルフォン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、セラミックス、ポリビニルアルコール、ポリビニルデンジフルオライド、セルロースの酢酸－硝酸混合エステル、ポリテトラフルオロエチレン、アルミナ、スチレン－ジビニルベンゼン共重合体、テトラフルオロエチレン等またはそれらの誘導体等が挙げられる。好ましくは、ポリエーテルスルホンまたはポリフッ化ビニリデン等が挙げられる。

ポリエーテルスルホンまたは、その誘導体を用いたろ過膜の具体例としては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標） ＰＬＵＳ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．２２μｍまたは０．４５μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ カートリッジ フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＲ カートリッジ フィルター (Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、スーポアＥＢＶ（Ｐａｌｌ社製）、スーポア ＥＫＶ（Ｐａｌｌ社製、カタログ番号：ＡＢ３ＥＫＶ７ＰＨ４）、スーポアライフ２００（Ｐａｌｌ社製）、ザルトポア（登録商標）２（膜構造：２層膜、孔径：０．２＋０．１、０．４５＋０．２、または０．８＋０．４５μｍ）（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ザルトポア（登録商標）２ ＸＬＧ（膜構造：２層膜、孔径：０．８＋０．２μｍ）（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ザルトポア（登録商標）２ ＸＬＩ（膜構造：２層膜、孔径：０．３５＋０．２μｍ）（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ザルトポア２ ハイフロー（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）またはＰＥＳメンブレンカートリッジフィルター ＴＣＳ（孔径：０．２０、または０．４５μｍ）（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）等が挙げられる。

ポリフッ化ビニリデンまたは、その誘導体を用いたろ過膜の具体例としては、Ｄｕｒａｐｒｅ（登録商標） Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．１０、０．２２、０．４５、０．６５、または５．０ｍｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｄｕｒａｐｏｒｅ ＩＩ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＧＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｄｕｒａｐｏｒｅ ＩＩ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｆｉｌｔｅｒ ＣａｒｔｒｉｄｇｅＶＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、フロロダイン（登録商標）ＩＩ－ＤＦＬＰ（Ｐａｌｌ社製）、フロロダインＩＩ－ＤＢＬＰ（Ｐａｌｌ社製）、フロロダインＩＩ－ＤＪＬＰ（Ｐａｌｌ社製）、ウルチポアＶＦ－ＤＶ２０（Ｐａｌｌ社製）またはウルチポアＶＦ－ＤＶ５０（Ｐａｌｌ社製）等が挙げられる。

ポリエーテルスルホンまたはその誘導体とポリフッ化ビニリデンまたはその誘導体を組み合わせたろ過膜の具体例としては、Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ（登録商標） ＥＸ Ｇｒａｄｅ ＥＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｐａｌｌ社製、カタログ番号：ＡＢ３ＵＥＤＦ７ＰＨ４）等が挙げられる。

ポリエーテルスルホンまたは、ポリフッ化ビニリデン以外の膜材質を用いたろ過膜としては、Ｏｍｎｉｐｏｒｅ (登録商標） Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．１、０．２、０．４５、１．０、５．０、または１０μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ＭＦ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標） Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．０２５、０．０５、０．１、０．２２、０．３、０．４５、０．６５、０．８、１．２、３、５、または８μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｎｙｌｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．２０、または５．０μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ウルチポアＮ６６（孔径：０．２、または０．４５μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、ポジダイン（登録商標）（孔径：０．１０、０．２０、０．３、または０．４５μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、バラファインＶＦＳＰ（孔径：０．２、または０．４５μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、バラファインＶＦＳＥ（孔径：０．０２、０．１、または０．２μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、バラファイン ＶＦＳＧ（孔径：０．０２、０．１、または０．２μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、ザルトロン（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、アセテートメンブレンカートリッジフィルター ＴＣＲ（孔径：０．２０、０．４５、または８．０μｍ）（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）またはユミクロンカートリッジフィルター（孔径：０．２、０．４、０．６、０．９、または２．５μｍ）（ユアサメンブレンシステム社製）等が挙げられる。

また、本発明に用いるろ過膜としては、例えば、マイレクス（Ｍｉｌｌｅｘ）フィルターユニット (Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）の様に、１枚からなるろ過膜構造を取ってもよく、また、０．５／０．２μｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ Ｄｉｓｋ Ｗ／Ｔｙｐａｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＨＧＥＰ０２５５０）の様に１枚以上のプレフィルターが付属されることにより、２層以上の構造の膜または２枚以上の膜を組合せてもよい。

本発明において調製される液体培地は、膜ろ過の前後で液体培地中の成分濃度が実質的に変化しないことを特徴とする。膜ろ過の前後で液体培地中の成分濃度が実質的に変化しないとは、具体的には例えば、該成分が銅である場合、膜ろ過前の液体培地中の銅濃度に対する膜ろ過後の液体培地中の銅濃度の比率が、好ましくは０．７～１．３、より好ましくは０．８～１．２、さらに好ましく最も好ましくは０．９～１．１であることをいう。

また、本発明は前記調製された液体培地を用いる細胞の培養方法に関する。

本発明における細胞としては、真核細胞および原核細胞のいずれでもよく、例えば、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫類もしくは植物等由来の細胞、細菌、大腸菌もしくは枯草菌等の微生物、細菌、大腸菌もしくは枯草菌等微生物由来の細胞、または酵母等もしくは酵母等由来の細胞が挙げられる。好ましくは哺乳類に属する動物細胞、より好ましくはヒトもしくはサル等の霊長類に由来する動物細胞またはマウス、ラットもしくはハムスター等のげっ歯類に由来する動物細胞、最も好ましくはチャイニーズハムスター卵巣組織由来であるＣＨＯ細胞が挙げられる。

本発明における哺乳類に属する細胞としては、好ましくは骨髄腫細胞、卵巣細胞、腎臓細胞、血球細胞、子宮細胞結合組織細胞、乳腺細胞、胚性網膜芽細胞またはこれらの細胞に由来する細胞等が挙げられるが、より好ましくは骨髄腫細胞、骨髄腫細胞に由来する細胞、卵巣細胞または卵巣細胞に由来する細胞から選ばれる細胞が挙げられる。

例えば、ヒト細胞株であるＨＬ－６０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－２４０）、ＨＴ－１０８０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－１２１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－２）、２９３（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１２０６０２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４３２）、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ－１［Cytotechnology, 1, 151 (1988)］、ＮＭ－Ｆ９（ＤＳＭ ＡＣＣ２６０５、国際公開２００５／０１７１３０号）もしくはＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．９６０２２９４０、米国特許第６８５５５４４号明細書）、サル細胞株であるＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－１６５１）及びＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５１）、マウス細胞株であるＣ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６１６）、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１５８１）もしくはＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）ＮＳ０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１８２７）、ラット細胞株であるＹ３ Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６３１）、ＹＯ (ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０１）もしくはＹＢ２／０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６６２）、ハムスター細胞株であるＣＨＯ細胞もしくはＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１０）、またはイヌ細胞であるＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－３４）等が挙げられる。

鳥類に属する細胞としては、例えばニワトリ細胞株ＳＬ－２９ (ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－２９）等が挙げられる。魚類に属する細胞としては、例えばゼブラフィッシュ細胞株ＺＦ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－２０５０）等が挙げられる。昆虫類に属する細胞としては、例えば蛾 (Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１７１１）等が挙げられる。また、ワクチン製造に使用される初代培養細胞としては、例えば、初代サル腎細胞、初代ウサギ腎細胞、初代ニワトリ胎児細胞、初代ウズラ胎児細胞等が挙げられる。

本発明におけるＣＨＯ細胞としては、チャイニーズハムスター (Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）の卵巣組織から樹立された株化細胞であればいかなる細胞も包含される。その具体的な例としては、Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958)、Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 60, 1275 (1968)、Genetics, 55, 513 (1968)、Chromosoma, 41, 129 (1973)、Methods in Cell Science, 18, 115 (1996)、Radiation Research, 148, 260 (1997)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)、Proc. Natl.Acad. Sci. 60, 1275 (1968)、Cell, 6, 121 (1975)またはMolecular Cell Genetics, Appendix I,II, 883-900等の文献に記載されているＣＨＯ細胞を挙げることができる。また、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に登録されているＣＨＯ－Ｋ１株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７８１）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ－（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－９０９６）、市販のＣＨＯ－Ｓ株 (Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社 Ｃａｔ＃１１６１９）、ＣＨＯ／ＤＧ４４［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)］またはこれら株を様々な培地に馴化させた亜株なども具体的な例として挙げることができる。

また、本発明における細胞としては、物質を生産する能力の有無は特に限定されず、例えば、体細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより得られたｉＰＳ細胞等の幹細胞、ヒトを含む哺乳動物ドナーから採取した精子もしくは卵子細胞、または物質を産生する細胞の他、物質を産生するようになった融合細胞等が挙げられる。特に好ましくは、物質を産生する細胞、または物質を産生するようになった融合細胞等が挙げられる。更に好ましくは、物質を産生する動物細胞または物質を産生するようになった動物由来の融合細胞等が挙げられ、例えば、所望の物質が抗体である場合には、Ｂ細胞等の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合細胞であるハイブリドーマ等が挙げられる。また、変異処理により物質を産生するようになった細胞または物質の発現量を上昇させるような変異処理を施した細胞等も本発明の細胞に含まれる。

本発明における変異処理により物質を産生するようになった細胞としては、例えば、所望の物質を生産出来るようにする為に、修飾酵素等に変異を導入した細胞等が挙げられる。例えば、所望の物質が糖蛋白質である場合に、該糖蛋白質中の糖鎖の構造を変化させるために、種々の糖鎖修飾酵素に変異が導入された細胞等が挙げられる。

さらに、本発明における物質を産生する細胞としては、所望の物質が産生出来ればいずれの細胞であってもよく、例えば、該物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された細胞も含まれる。該形質転換された細胞は、例えば該物質の生産に関与するＤＮＡとプロモーターを含む組換え体ベクターを、宿主となる細胞に導入することによって得ることができる。

本発明における物質の生産に関与する遺伝子としては、例えば、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、糖蛋白質または抗体等の物質をコードするＤＮＡ、物質の生合成に関わる酵素または蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。

本発明におけるプロモーターとは、細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のイミディエイトアーリー（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターまたはＳＲαプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサー等をプロモーターと共に用いてもよい。

本発明における組換え体ベクターは、所望のベクターを用いて調製できる。ベクターとしては、細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報、Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Nature, 329, 840 (1987)］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］またはｐＡＧＥ２１０等が挙げられる。

本発明における宿主となる細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが出来、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)、Virology, 52, 456 (1973)］等が挙げられる。

本発明における形質転換細胞としては、例えば、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞７－９－５１（ＦＥＲＭ ＢＰ－６６９１）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ ＢＰ－７０５４）、抗ＣＣＲ４ヒト化抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８７５９（ＦＥＲＭ ＢＰ－８１２９）及びＫＭ８７６０（ＦＥＲＭ ＢＰ－８１３０）、７０９ ＬＣＡ－５００Ｄ（ＦＥＲＭ ＢＰ－８２３９）、抗ＩＬ－５受容体α鎖キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ７３９９（ＦＥＲＭ ＢＰ－５６４９）、抗ＩＬ－５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８３９９（ＦＥＲＭ ＢＰ－５６４８）及びＫＭ９３９９（ＦＥＲＭ ＢＰ－５６４７）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８９６６（ＦＥＲＭ ＢＰ－５１０５）、ＫＭ８９６７（ＦＥＲＭ ＢＰ－５１０６）、ＫＭ８９６９（ＦＥＲＭ ＢＰ－５５２７）、ＫＭ８９７０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５５２８）、抗ＣＤ２０抗体を生産する形質転換株Ｍｓ７０４－ＣＤ２０（ＦＥＲＭ ＢＰ－１００９２）及びアンチトロンビンＩＩＩを生産する形質転換細胞Ｍｓ７０５－ｐＫＡＮ－ＡＴＩＩＩ（ＦＥＲＭ ＢＰ－８４７２）等が挙げられる。

本発明における細胞を培養する方法としては、例えば、バッチ培養、リピートバッチ培養、ローリングシード培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養等、用いる細胞に適した方法が挙げられ、好ましくはフェドバッチ培養が用いられる。通常ｐＨ６～８、３０～４０℃等の条件下で、例えば、フェドバッチ培養では３～２０日間、パーフュージョン培養では３～６０日間、培養を行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシンまたはペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌等は通常の細胞の培養に用いられる方法を用いることが出来る。

本発明における培養方法の培養量は、細胞培養用プレートを用いた通常０．１ｍＬ～１０ｍＬのごく微量な培養量でも、三角フラスコ等を用いた通常１０～１０００ｍＬの少量の培養量でも、ジャー等の培養槽等を用いた通常１～２００００Ｌの商用生産に用いることが出来る大量の培養量でも、いかなる培養量でもよい。

また、本発明は、所望のポリペプチドを発現する細胞を、前記調製された液体培地中で培養し、培養物中に該ポリペプチドを生産蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法、または該製造方法を用いて製造されたポリペプチドに関する。

本発明におけるポリペプチドとしては、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればいかなるものでもよいが、好ましくは真核細胞由来のポリペプチドが挙げられ、さらに好ましくは動物細胞由来のポリペプチド、例えば、哺乳動物細胞由来のポリペプチドが挙げられる。また、本発明のポリペプチドとしては、例えば、所望のポリペプチドと他のポリペプチドとを融合させた融合ペプチド等の人工的に改変されたポリペプチドであってもよいし、部分断片からなるポリペプチドであってもよい。例えば、生理活性を有するポリペプチドが挙げられる。

本発明におけるポリペプチドとしては、例えば、蛋白質、糖蛋白質、抗体またはこれらの部分断片からなるポリペプチド等が挙げられる。

本発明のポリペプチドとしては、例えば、酵素の活性を調節するポリペプチドまたは酵素の構造を保持するポリペプチド等も含まれる。酵素の活性を調節するポリペプチドとしては、具体的には、糖蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するポリペプチド等が挙げられる。アゴニストとしては、糖蛋白質の活性を亢進する活性を有するポリペプチドであればいかなるものでもよく、具体的には、ソマトスタチン誘導体、ソマトロビン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、グルカゴン、インスリン、インスリン様成長因子または性腺刺激ホルモン等が挙げられる。アンタゴニストとしては、糖蛋白質の活性を抑制する活性を有するポリペプチドであればいかなるものでもよく、具体的には、ペグビソマトン等が挙げられる。

本発明における蛋白質または糖蛋白質としては、例えば、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）［J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977)］、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）［Nature, 369 533 (1994)］、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩ、血液凝固因子ＸＩＩ、プロトロンビン複合体、フィブリノゲン、アルブミン、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子 (ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニ－刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）［J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983)］マクロファ－ジコロニ－刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）［J. Exp. Med., 173, 269 (1992)］、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子 (ＧＭ－ＣＳＦ）［J. Biol. Chem., 252, 1998 (1977)］、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）［Science, 193, 1007 (1976)］、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）［J. Leuc. Biol., 55, 280 (1994)］、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、ＤＮａｓｅＩ、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン、トランスフェリンもしくはこれらの誘導体またはこれらの部分断片等が挙げられる。

本発明における抗体としては、抗原結合活性を有する抗体であればいかなるものでもよく、例えば、腫瘍関連抗原を認識する抗体もしくはその抗体断片、アレルギーもしくは炎症に関連する抗原を認識する抗体もしくはその抗体断片、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体もしくはその抗体断片、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体もしくはその抗体断片、またはウイルスもしくは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体もしくはその抗体断片等が挙げられる。

本発明における腫瘍関連抗原としては、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２２７、ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＡＲＰ４）、ａｕｒｏｒａ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－ＤＣ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ２（ＢＳＴ２）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ９（ＣＡ９）、ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃｃ－ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ７、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１（ＣＦＲ－１）、ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－Ｍｙｃ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＴＡ、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）、ＣＴＬＡ－４、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－１８、ＤＦ３、Ｅ－ｃａｔｈｅｒｉｎ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲ４（ＨＥＲ４）、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＰＣＲ）、ｅｐｈｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｅｐｈ）、ＥｐｈＡ２、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ－２（ＥＴ２）、ＦＡＭ３Ｄ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ １（ＦｃＲＨ１）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ８（ＦＧＦ８）、ＦＧＦ８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ １０（ＦＺＤ１０）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４（ＦＺＤ－４）、Ｇ２５０、Ｇ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ（ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２もしくはＧＭ３等）、ｇｌｏｂｏ Ｈ、ｇｐ７５、ｇｐ８８、ＧＰＲ－９－６、ｈｅｐａｒａｎａｓｅ Ｉ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ (ＨＧＦ）、ＨＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＬＡ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ－ＤＲ等）、ＨＭ１．２４、ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ（ＨＭＦＧ）、ｈＲＳ７、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０（ｈｓｐ９０）、ｉｄｉｏｔｙｐｅ ｅｐｉｔｏｐｅ、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ＩＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ－６もしくはＩＬ－１５等）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－６ＲもしくはＩＬ－１５Ｒ等）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－４（ＩＲＴＡ－４）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ １、ＫＤＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＳ１／４、ｌａｍｐ－１、ｌａｍｐ－２、ｌａｍｉｎｉｎ－５、Ｌｅｗｉｓ ｙ、ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ ｘ、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＴＢＲ）、ＬＵＮＸ、ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ（ＭＣＳＰ）、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＩＣＡ、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＩＳＩＩＲ）、ｍｕｃｉｎ、ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ）、Ｎｅｃｌ－５、Ｎｏｔｃｈ１、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ－４（ＰＦ－４）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＴＨｒＰ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＲＨＡＭＭ）、ＲＯＢＯ１、ＳＡＲＴ３、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ４Ｂ（ＳＥＭＡ４Ｂ）、ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ）、ＳＭ５－１、ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－７２（ＴＡＧ－７２）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）、ＴＧＦ－ｂｅｔａ、Ｔｈｙ－１、Ｔｉｅ－１、Ｔｉｅ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ １（ＴＩＭ－１）、ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ（ｈＴＦ）、Ｔｎ ａｎｔｉｇｅｎ、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＦ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＲＡＩＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＲ４もしくはＤＲ５等）、ｓｙｓｔｅｍ ＡＳＣ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２（ＡＳＣＴ２）、ｔｒｋＣ、ＴＲＯＰ－２、ＴＷＥＡＫ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｎ１４、ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２もしくはＶＥＧＦＲ３等）、ｖｉｍｅｎｔｉｎまたはＶＬＡ－４等が挙げられる。

本発明における抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよく、抗体のクラスとしては、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）、及びイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）が挙げられるが、好ましくはＩｇＧである。更にＩｇＧのサブクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４が挙げられる。

本発明における抗体には、抗体の一部分を含む部分断片等が含まれ、例えば、Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ、ｓｃＦｖ）及びジスルフィド安定化抗体 (ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ、ｄｓＦｖ）、または抗体のＦｃ領域を含む融合蛋白質等が挙げられる。

本発明における抗体としては、例えば、動物に抗原を免疫し、免疫された動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体、または遺伝子組換え技術により作製された抗体が含まれる。遺伝子組換え技術により作製された抗体は、例えば、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主である細胞へ導入することにより取得することができる。具体的には例えば、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体等を挙げることができる。

本発明におけるヒト型キメラ抗体としては、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域 (以下、重鎖はＨ鎖、可変領域はＶ領域として、それぞれＨＶまたはＶＨとも称す）及び抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖として、それぞれＬＶまたはＶＬとも称す）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域として、ＣＨとも称す）及びヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体が挙げられる。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスターまたはラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。

ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するヒト以外の動物細胞由来のハイブリドーマよりＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主となる細胞へ導入することにより発現させ、得ることができる。

ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと称す）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。

本発明におけるヒト化抗体としては、例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト型相同性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと称す）のアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植して作製されたＣＤＲ移植抗体等が挙げられる。

ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主となる細胞へ導入することにより発現させ、得ることができる。

ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。

本発明におけるヒト抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ、不死化およびクローニングして得られる、ヒト抗体を産生するリンパ球を培養および精製し、得ることができる。

また、本発明におけるヒト抗体は、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片をファージ表面に発現させたヒト抗体ファージライブラリーを得、該ライブラリーより、固相化した抗原に対する結合活性を指標にして、抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収し、該抗体断片より、２本の完全なＨ鎖及び二本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へ変換することで得ることが出来る。

さらに、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれたヒト抗体産生トランスジェニック動物動物から、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法等により得られるヒト抗体産生ハイブリドーマからも得ることができる。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを得、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得することができる。

ヒト抗体産生ハイブリドーマより、ＶＬ及びＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、適宜上述の方法等により野生型 (以下、ＷＴと記載する）の１以上のアミノ酸残基をＣｙｓ残基に置換させたヒト抗体のＣＬ及びＣＨをコードするＤＮＡを有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入し、宿主となる細胞へ導入することにより発現させ、ヒト抗体を得ることができる。
または、ヒト抗体産生ハイブリドーマより、ＶＬ及びＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＬ及びＣＨをコードするＤＮＡを有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入し、さらに適宜上述の方法等によりＷＴの１以上のアミノ酸残基をＣｙｓ残基に置換してヒト抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、ヒト抗体を得ることもできる。

ヒト抗体に用いるＷＴのＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。

本発明における抗体としては、例えば、以下の抗体が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。

腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＤ２抗体［Anticancer Res., 13, 331 (1993)］、抗ＧＤ３抗体［Cancer Immunol. Immunother., 36, 260 (1993)］、抗ＧＭ２抗体［Cancer Res., 54, 1511 (1994)］、抗HER2抗体［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992)、米国特許第５７２５８５６号明細書］、抗ＣＤ５２抗体［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992)］、抗ＭＡＧＥ抗体［British J. Cancer, 83, 493 (2000)］、抗ＨＭ１．２４抗体［Molecular Immunol., 36, 387 (1999)］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［Cancer, 88, 2909 (2000)］、抗ｂＦＧＦ抗体、抗ＦＧＦ－８抗体［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911 (1989)］、抗ｂＦＧＦＲ抗体、抗ＦＧＦ－８Ｒ抗体［J. Biol. Chem., 265, 16455 (1990)］、抗ＩＧＦ抗体［J. Neurosci. Res., 40, 647 (1995)］、抗IGF-IR抗体［J. Neurosci. Res., 40, 647 (1995)］、抗ＰＳＭＡ抗体［J. Urology, 160, 2396 (1998)］、抗VEGF抗体［Cancer Res., 57, 4593 (1997)］、抗ＶＥＧＦＲ抗体［Oncogene, 19, 2138 (2000)、国際公開第１９９６/３００４６号］、抗ＣＤ２０抗体［Curr. Opin. Oncol., 10, 548 (1998)、米国特許第５７３６１３７号明細書］、抗ＣＤ１０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体（国際公開第１９９６/４０２０１０号）、抗Ａｐｏ－２Ｒ抗体（国際公開第１９９８／５１７９３号）、抗ＡＳＣＴ２抗体（国際公開第２０１０／００８０７５号）、抗ＣＥＡ抗体［Cancer Res., 55 (23 suppl): 5935s-5945s, (1995)］、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗Ａ３３抗体等が挙げられる。

アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗インターロイキン6抗体［Immunol. Rev., 127, 5 (1992)］、抗インターロイキン6受容体抗体［Molecular Immunol., 31, 371 (1994)］、抗インターロイキン５抗体［Immunol. Rev., 127, 5(1992)］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［Cytokine, 3, 562 (1991)］、抗インターロイキン４受容体抗体［J. Immunol. Methods, 217, 41 (1998)］、抗腫瘍壊死因子抗体［Hybridoma, 13, 183 (1994)］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［Molecular Pharmacol., 58, 237 (2000)］、抗ＣＣＲ４抗体［Nature, 400, 776, (1999)］、抗ケモカイン抗体（Peri et al., J. Immunol. Meth., 174, 249, 1994）または抗ケモカイン受容体抗体［J. Exp. Med., 186, 1373 (1997)］等が挙げられる。

循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［J. Immunol., 152, 2968 (1994)］、抗血小板由来増殖因子抗体［Science, 253, 1129 (1991)］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［J. Biol. Chem., 272, 17400 (1997)］、抗血液凝固因子抗体［Circulation, 101, 1158 (2000)］、抗ＩｇＥ抗体、抗αＶβ３抗体またはα４β７抗体等が挙げられる。

ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体［Structure, 8, 385 (2000)］、抗ＣＤ４抗体［J. Rheumatology, 25, 2065 (1998)］、抗CCR5抗体または抗ベロ毒素抗体［J. Clin. Microbiol., 37, 396 (1999)］等が挙げられる。

本発明のポリペプチドの製造方法としては、例えば、細胞内にポリペプチドを生産させる直接発現方法または細胞外にポリペプチドを分泌生産させる方法（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いることができる。

本発明のポリペプチドは、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)］、日本国特開平５－３３６９６３号公報または国際公開第１９９４／２３０２１号等に記載の方法を利用することにより、宿主細胞外へ積極的に分泌させることができる。即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、所望のポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドを結合させた形で発現させることにより、所望のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることが出来る。

また、日本国特開平２－２２７０７５号公報に記載されている、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用することにより、ポリペプチドの生産量を上昇させることもできる。

本発明の方法により製造されるポリペプチドは、例えば、通常のポリペプチドの単離精製法等を用いて単離精製することが出来る。

所望のポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザーまたはダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のペプチドまたは蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－セファロースＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、プロテインＡ、プロテインＧ等を含むレジンを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法または等電点電気泳動等の電気泳動法等を、単独あるいは組み合わせて用いることにより、粗精製標品または精製標品を得ることができる。

所望のポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドを回収することができる。即ち、該培養物を上述と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上述と同様の単離精製法を用いることにより、粗精製標品または精製標品を得ることができる。

また、本発明は、ポリペプチドを発現する細胞を培養する工程において、前記調製された液体培地を使用する、該ポリペプチド由来のバリアントの生成を制御する方法に関する。
本発明におけるポリペプチド由来のバリアントとしては、特に限定されないが、例えば、所望のポリペプチド由来の修飾体、糖化体、酸化体、ハイマンノース体等の糖鎖修飾体、重合体または分解物等が挙げられる。

例えば、液体培地中の銅の存在下において、ペプチジルグリシンαーアミド化モノオキシゲナーゼにより、アミド化されたプロリンが生成することが知られている（K.A. Johnson et al., Anal Bochem 2007）。また、ハイマンノース体、糖化体、酸化体、重合体、分解物等も液体培地中の銅の濃度により制御可能なバリアントである［Tailoring Recombinant Protein Quality by Rational Media DesignBiotechnol. Prog. 31 (3), 615-629, 2015］。

本発明の調製された液体培地を用いることで、これらのバリアントの生成量、含有量が任意の含有率で調節でき、例えば液体培地中の銅の濃度により変化する所望のポリペプチド由来のバリアントの生成を制御することができる。

本発明におけるポリペプチド由来のバリアントの量は、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる分離方法を用いて測定することができる。例えば、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにより抗体を分析する場合、通常、主ピークより早く溶出されるピークは、ｐＩ値が低い酸性バリアントを含み、酸性ピーク（以後ａｃｉｄｉｃ ｐｅａｋｓとも称する）と呼ばれる。また、主ピークより後に溶出される成分はｐＩ値が高い塩基性バリアントを含み、塩基性ピーク（以後ｂａｓｉｃ ｐｅａｋｓとも称する）と呼ばれる。

以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

［実施例１］培地調製時の酸素の有無による銅濃度への影響
粉末培地を含む液体培地調製時における、培地中の酸素濃度の、調製ろ過後の培地中の銅濃度への影響を評価した。

培地調製は以下の手順により行った。
まず２つの調製容器に純水をそれぞれ加えた。一方には下面から空気を通気して、溶存酸素濃度を飽和させた。もう一方は下面から窒素を通気して、溶存酸素を系外へ排除した。これらにアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地Ａ（富士フイルム和光純薬工業社製）６．６４５ｇ／Ｌ、Ｌ（＋）－グルタミン（ＳＩＧＭＡ社製）０．５１０ｇ／Ｌ、ＳＯＹ ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ ＵＦ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）１．２５０ｇ／Ｌ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ－６８ １０％ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｄｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０．０ｍＬ／Ｌ、塩化ナトリウム（富田製薬社製）２．５３５ｇ／Ｌ、粉末培地Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｄｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）８．１３７ｇ／Ｌ、粉末培地Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｄｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．１２５ｍＬ／Ｌおよび粉末培地Ｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｄｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）６．７６８ｇ／Ｌを添加し、約６０分間攪拌した。さらに２．３８０ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）を加えて、約１０分間攪拌した後、純水を加え２．５Ｌとした。

次に、調製した液体培地について、空気もしくは窒素を通気しながら攪拌を続け、攪拌０分後、６０分後、１８０分後に調製中の培地を採取し、孔径０．１μｍのフィルターでろ過を行った。ろ過前およびろ過後の培地中の銅濃度をＩＣＰ－ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて分析した。

その結果、図１（Ａ）に示すように、空気を通気した調製培地では攪拌を続けてもフィルターろ過前およびろ過後の銅濃度は変化が見られず、攪拌１８０分後のろ過前銅濃度が１１．５ｎｇ／ｍＬに対して、ろ過後の銅濃度は１０．９ｎｇ／ｍＬであった。一方、図１（Ｂ）に示すように、窒素を通気して酸素を除去した状態で調製した培地では、撹拌１８０分後のろ過前の銅濃度が１１．４ｎｇ／ｍＬに対して、ろ過後の銅濃度は６．６ｎｇ／ｍＬとなり約半分の濃度に低下することが明らかとなった。

以上から、培地調製時に溶存酸素濃度が低いとフィルターろ過後の培地中の銅濃度が低下することを明らかにした。

［実施例２］培地中の銅を溶解させるための酸素供給量の評価
粉末培地を含む液体培地調製時における培地中の溶存酸素濃度の、調製ろ過後の培地中の銅濃度に与える影響を評価した。

培地調製は以下の手順により行った。

まず４つの調製容器に純水を加えた。１つには下面から空気を通気し、溶存酸素濃度を飽和させた。他の３つは窒素と酸素の混合ガスを通気して溶存酸素濃度をそれぞれ４０％、２０％または０％にした。そしてそれぞれの調整容器に、溶存酸素濃度が維持されるよう空気、または窒素と酸素の混合ガスを通気し続けながらアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地Ａ（富士フイルム和光純薬工業社製）６．６４５ｇ／Ｌ、Ｌ（＋）－グルタミン（ＳＩＧＭＡ社製） ０．５１０ｇ／Ｌ、ＳＯＹ ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ ＵＦ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製） １．２５０ｇ／Ｌ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ－６８ １０％ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｄｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） １０．０ｍＬ／Ｌ、塩化ナトリウム（富田製薬社製） ２．５３５ｇ／Ｌ、粉末培地Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｄｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ８．１３７ｇ／Ｌ、粉末培地Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｄｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ０．１２５ｍＬ／Ｌおよび粉末培地Ｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｄｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）６．７６８ｇ／Ｌを添加し、約６０分間攪拌した。さらに２．３８０ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）を加えて、約１０分間攪拌した後、純水を加え２．５Ｌとした。

次に、調製した液体培地について、溶存酸素濃度が維持されるように空気、または窒素と酸素の混合ガスを通気しながら攪拌を続け、原料投入２４０分後に調製中の培地を採取し、孔径０．１μｍのフィルターでろ過を行った。ろ過前およびろ過後の培地中の銅濃度をＩＣＰ－ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて分析した。

結果を図２に示す。調製培地の溶存酸素濃度が０％の条件ではろ過後培地の銅濃度は１．４ｎｇ／ｍＬだったのに対して、溶存酸素濃度が２０％、４０％および１００％（大気飽和状態）の条件ではろ過後培地の銅濃度はそれぞれ８．５、１２．０および１０．９ｎｇ／ｍＬになった。

以上の結果から、培地調製時に溶存酸素濃度が４０％よりも低くなるとフィルターろ過後の培地中の銅濃度が低下することを明らかにした。

［実施例３］培地中銅濃度と産生抗体の品質との関係
培地調製中の溶存酸素濃度によってろ過後の培地中の銅濃度が変化した培地を用いて、調製された抗体の品質を確認し、濃度依存的にバリアントの含量を調整できることを明らかにした。

実施例２で調製した４種類の液体培地を用いてＩｇＧ型モノクローナル抗体を産生するＣＨＯ細胞の培養を行い、抗体を調製した。培地調製と分析は以下の手順により行った。

抗体遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞を、実施例３で調製したそれぞれの培地に播種し、アミノ酸およびブドウ糖などの添加物を加えながらフェドバッチ培養を行い、目的の抗体を産生させた。培養終了後に細胞を除去して、培養上清を回収して抗体を精製した。精製した抗体は陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを用いて高速液体クロマトグラフィーにてバリアントを検出した。陽イオン交換クロマトグラフィーによって検出されたバリアントの内、塩基性バリアントを含むピーク（ｂａｓｉｃ ｐｅａｋｓ）について、培地中の銅濃度との相関を比較した。

結果を図３に示す。溶存酸素濃度を１００％（大気飽和状態）、４０％および２０％に維持して調製した培地（各培地中の銅濃度：それぞれ１０．９、１２．０および８．５ ｎｇ／ｍＬ）を用いた場合、ｂａｓｉｃ ｐｅａｋｓの割合はそれぞれ１３．０％、１３．５％および１２．４％であり、大きな違いはなかった。一方で、溶存酸素濃度を０％に維持して調製した培地（培地中の銅濃度：１．４ｎｇ／ｍＬ）を用いた場合、ｂａｓｉｃ ｐｅａｋｓの割合は１０．０％まで低下した。

以上から、培地調製中の溶存酸素濃度が変動することでろ過後培地の銅濃度が変動し、銅濃度依存的に動物細胞によって産生される抗体のｂａｓｉｃ ｐｅａｋｓの割合が低下すること、および銅濃度に応じてｂａｓｉｃ ｐｅａｋｓの割合を調節できることを明らかにした。

本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１８年１１月２日付けで出願された米国仮出願（ＵＳ６２/７５４７９３）に基づいており、その全体が引用により援用される。

本発明により、銅およびシステイン、シスチンまたはそれらの誘導体を含む粉末培地を溶媒に溶解する際に膜ろ過の前後で液体培地中の銅濃度が実質的に変化しない調製方法が提供された。該調製方法により調製された液体培地、該調製方法により調製された液体培地を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、該製造方法を用いて製造される生理活性物質、該調製方法により調製された液体培地を膜ろ過する方法、溶存酸素の供給量を調節することで銅が膜ろ過で除去されない方法又は、液体培地を調製し、膜ろ過し、および該液体培地を用いて細胞を培養し、生理活性物質を製造する方法が提供された。

Claims (29)

1. 粉末培地を酸素存在下で溶媒に溶解する工程を含む、液体培地の調製方法であって、
   酸素を含む気体を前記溶媒中にスパージする操作を含む、液体培地の調製方法。
2. 前記粉末培地が銅またはその誘導体を含む、請求項１に記載の液体培地の調製方法。
3. 前記銅またはその誘導体が、銅の単体、酸化物、塩またはその水和物である、請求項２に記載の液体培地の調製方法。
4. 前記銅またはその誘導体が、硫酸銅（ＩＩ）五水和物、塩化銅（ＩＩ）二水和物、塩化銅（Ｉ）もしくは硝酸銅（ＩＩ）三水和物またはこれらの混合物である請求項２または３に記載の液体培地の調製方法。
5. システイン、シスチンまたはそれらの誘導体を添加する工程を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の液体培地の調製方法。
6. 前記溶媒を撹拌する操作を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の液体培地の調製方法。
7. 前記粉末培地を酸素存在下で前記溶媒に溶解する工程の後に、更に膜ろ過の工程を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の液体培地の調製方法。
8. 前記膜ろ過に用いるろ過膜の孔径が１ｎｍから１００μｍである、請求項７に記載の液体培地の調製方法。
9. 前記溶媒又は前記液体培地中の溶存酸素濃度を測定する工程を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の液体培地の調製方法。
10. 前記液体培地の調製前または調製中に、前記溶媒又は前記液体培地中の溶存酸素濃度を測定する工程を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の液体培地の調製方法。
11. 前記液体培地の調製時において、前記溶媒が飽和溶存酸素量の２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の酸素を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の液体培地の調製方法。
12. 前記溶媒の量が１０～１００００Ｌである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の液体培地の調製方法。
13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の調製方法により調製された液体培地を用いる細胞の培養方法。
14. 前記細胞がポリペプチドを発現する細胞である、請求項１３に記載の細胞の培養方法。
15. 前記ポリペプチドが抗体である、請求項１４に記載の細胞の培養方法。
16. 前記細胞が動物細胞である、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
17. 前記動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１６に記載の細胞の培養方法。
18. 前記細胞が遺伝子組換え細胞である、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
19. 所望のポリペプチドを発現する細胞を、請求項１～１２のいずれか１項に記載の調製方法により調製された液体培地中で培養し、培養物中に該ポリペプチドを生産蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
20. 前記ポリペプチドが抗体である、請求項１９に記載のポリペプチドの製造方法。
21. 前記細胞が動物細胞である、請求項１９または２０に記載のポリペプチドの製造方法。
22. 前記動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２１に記載のポリペプチドの製造方法。
23. 前記細胞が遺伝子組換え細胞である、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
24. ポリペプチドを発現する細胞を培養する工程において、請求項１～１２のいずれか１項に記載の調製方法により調製された液体培地を使用する、該ポリペプチド由来のバリアントの生成を制御する方法。
25. 前記ポリペプチドが抗体である、請求項２４に記載のバリアントの生成を制御する方法。
26. 前記バリアントが、Ｃ末端プロリンがアミド化された抗体である、請求項２５に記載のバリアントの生成を制御する方法。
27. 前記細胞が動物細胞である、請求項２４～２６のいずれか１項に記載のバリアントの生成を制御する方法。
28. 前記動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２７に記載のバリアントの生成を制御する方法。
29. 前記細胞が遺伝子組換え細胞である、請求項２４～２８のいずれか１項に記載のバリアントの生成を制御する方法。

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