KR102451374B1 - 단백질을 안정화시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 세포를 배양하고, 산물을 발현하고/하거나 산물을 회수하는 동안 하나 이상의 단계에서 산물을 발현하는 세포의 온도를 저하시킴으로써, 세포성 대사의 산물, 예를 들어, 단백질의 양을 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다.
Description
관련 출원
본 출원은 2016년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 62/348595를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 배양된 세포에서 발현된, 세포성 산물, 예를 들어, 폴리펩티드의 해리를 억제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
재조합 치료용 단백질과 같은 세포성 산물은 세포 발현 시스템, 예를 들어, 포유동물 세포 발현 시스템에서 흔히 발현된다. 수백종의 시판 승인된 바이오 의약품이 포유동물 세포주에서 발현된다. 그러나, 그들의 생산과 관련된 높은 비용은 세계 보건 비용을 증가시키는 원인이 된다. 산물 해리 현상은 세포 배양물에서 성장한 세포로부터 발현된 단백질 또는 폴리펩티드의 예상되는 안정성 또는 활성보다 더 낮은 것을 유발할 수 있다. 이들 현상은 무손상 산물의 존재도가 낮은 폴리펩티드 산물의 해리의 존재를 밝혀내는 비-환원성 SDS 전기영동 검정을 통하여 검출된다. 다른 품질 관리 시험은 폴리펩티드 해리 현상을 밝혀내지 못한다.
더욱이, 산물 해리 현상은 발현된 단백질의 기능과 안정성에 손상을 입힐 수 있다. 따라서, 배양된 세포에서 발현된 폴리펩티드의 해리를 억제하는 방법을 개발 및 생산할 필요가 있다.
본 개시내용은 부분적으로, 하기에 확인된 수많은 조치가 발현된 산물, 예를 들어, 폴리펩티드의 해리를 억제할 수 있다는 발견 내용에 근거한다.
한 측면에서, 본 발명은
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되고,
그에 의해 안정화된 산물, 예를 들어, 단리된, 안정화된 단백질을 생산하는 것
을 포함하는, 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
생산 배양물의 지수 성장 후 배양 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 제공하고, 예를 들어, 이를 확립하고,
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되고,
그에 의해 안정화된 산물, 예를 들어, 단리된, 안정화된 단백질을 생산하는 것
을 포함하는, 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
생산 배양물의 지수 성장 후 배양 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 제공하고, 예를 들어, 이를 확립하고, 여기서 생산 시기의 시작부터 생산 시기의 종료까지의 용존 산소 장력 (DOT)은 40% 초과 내지 70% 공기 포화도의 범위 내에 있고;
생산 시기의 종료 시 생산 배양물을, 세포주가 배양되었거나 또는 통상적으로 배양되는 온도보다 더 낮은 온도인 T수거 온도로 냉각시키고;
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터 세포가 분리될 때까지 공기 또는 O2 기체를 생산 배양물 내로 스파징함으로써 DOT를 40% 초과 내지 500% 미만 공기 포화도의 범위로 증가시키고;
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되고,
그에 의해 안정화된 산물, 예를 들어, 단리된, 안정화된 단백질을 생산하는 것
을 포함하는, 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(i) 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차에서 산물, 예를 들어, 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포를 포함하는 생산 배양물, 예를 들어, 지수 성장 후 배양물을 제공하고, 예를 들어, 이를 확립하고;
(ii) 지수 성장 후 배양 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고;
(iii) 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되는 것
을 포함하는, 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산하는 방법을 특징으로 하며,
여기서 이러한 방법은 하기를 포함한다:
a. 지수 성장 시기가 발생된 후에 생산 배양물을, 세포주가 배양되었거나 또는 통상적으로 배양되는 온도보다 더 낮은 온도인 30℃ 내지 33℃의 온도로 냉각시키는 것;
b. 생산 시기의 시작부터 생산 시기의 종료까지 40% 초과 공기 포화도 내지 70% 이하 공기 포화도의 용존 산소 장력 (DOT)이 되도록 생산 배양물에 산소공급하는 것;
c. 생산 배양물 중에 또는 그에 전이 금속을 제공하고, 예를 들어, 부가하며, 여기서 전이 금속 이온은 Zn2 +, Mn4 +, Cu2 +, Fe3 +, Co2 +, Cr3 +, 및/또는 Ni2 +로부터 선택되는 것;
d. 데히드로아스코르브산 또는 아스코르브산, 또는 데히드로아스코르브산 또는 아스코르브산 변형 구성성분을 상기 생산 배양물에 제공하는, 예를 들어, 부가하는 것;
e. 글루타티온, 예를 들어, 산화된 및/또는 환원된 글루타티온, 또는 글루타티온 변형 구성성분을 상기 생산 배양물에 제공하는, 예를 들어, 부가하는 것; 또는
f. 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리를 위해 생산 배양물을, T생산보다 더 낮은 온도인 12℃-18℃의 온도 T수거로 냉각시키는 것,
그에 의해 안정화된 산물, 예를 들어, 단리된, 안정화된 단백질, 또는 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질의 제제를 생산하는 것.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 안정화된 단백질 또는 안정한 단백질의 제제를 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 안정화된 단백질 또는 안정화된 단백질의 제제를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산할 수 있는 생물반응기를 특징으로 하며, 여기서 이러한 생물반응기는 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산할 수 있는 생물반응기를 특징으로 하며, 여기서 이러한 생물반응기는
생산 배양물의 지수 성장 후 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 제공할 수 있고, 예를 들어, 이를 확립할 수 있고;
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산할 수 있는 생물반응기를 특징으로 하며, 여기서 이러한 생물반응기는
생산 배양물의 지수 성장 후 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 제공할 수 있고, 예를 들어, 이를 확립할 수 있고, 여기서 생산 시기의 시작부터 생산 시기의 종료까지의 용존 산소 장력 (DOT)은 40% 초과 공기 포화도 내지 70% 공기 포화도의 범위 내에 있고;
생산 시기의 종료 시 생산 배양물을, 세포주가 배양되었거나 또는 통상적으로 배양되는 온도보다 더 낮은 온도인 T수거 온도로 냉각시킬 수 있고;
생물반응기로부터 생산 배양물이 제거될 때까지 공기 또는 O2 기체를 생산 배양물 내로 스파징함으로써 DOT를 40% 초과 공기 포화도 내지 500% 미만 공기 포화도의 범위로 증가시킬 수 있고;
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산할 수 있는 생물반응기를 특징으로 하며, 여기서 이러한 생물반응기는
(i) 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차에서 산물, 예를 들어, 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포를 포함하는 생산 배양물, 예를 들어, 지수 성장 후 배양물을 제공할 수 있고, 예를 들어, 이를 확립할 수 있고;
(ii) 지수 성장 후 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고;
(iii) 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되고;
여기서, 상기 생물반응기는 추가로
a. 지수 성장 시기가 발생된 후에 생산 배양물을, 세포주가 배양되었거나 또는 통상적으로 배양되는 온도보다 더 낮은 온도인 30℃ 내지 33℃의 온도로 냉각시킬 수 있고;
b. 생산 시기의 시작부터 생산 시기의 종료까지 40% 초과 내지 70% 이하 공기 포화도의 용존 산소 장력 (DOT)이 되도록 생산 배양물에 산소공급할 수 있고;
c. 생산 배양물 중에 또는 그에 전이 금속 이온을 제공할 수 있고, 예를 들어, 부가할 수 있으며, 여기서 전이 금속 이온은 Zn2 +, Mn4 +, Cu2 +, Fe3 +, Co2 +, Cr3 +, 및/또는 Ni2 +로부터 선택되고;
d. 데히드로아스코르브산 또는 아스코르브산, 또는 데히드로아스코르브산 또는 아스코르브산 변형 구성성분을 상기 생산 배양물에 제공할 수 있고, 예를 들어, 부가할 수 있고;
e. 글루타티온, 예를 들어, 산화된 및/또는 환원된 글루타티온, 또는 글루타티온 변형 구성성분을 상기 생산 배양물에 제공할 수 있고, 예를 들어, 부가할 수 있고;
f. 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리를 위해 생산 배양물을, T생산보다 더 낮은 온도인 12℃-18℃의 온도 T수거로 냉각시킬 수 있다.
실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 본원에 개시된 생물반응기는, 예를 들어 성장 시기 동안, 예를 들어, 지수 성장 시기 동안 생산 배양물 중에서의 보다 유리한 산화환원 전위를 증진시키기 위한 수많은 조건 중 임의의 것, 예를 들어, 공급물/보충물의 존재 또는 물리화학적 조건을 유지하는 것을 포함하고 이와 같이 유지할 수 있다. 전형적으로, 상기 조건은, 예를 들어, 적어도 부분적으로는 나중 스테이지, 예를 들어, 수거 스테이지 또는 수거 후 스테이지에서 유지된다. 한 예로서, 특정 조건은 세포가 수거 단계 및 수거 후 스테이지 내로 유입될 때 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질의 생산을 최적화하는 수준으로 유지되고, 임의로 상기 산물이 배경 프로세스 및 세포성 불순물로부터 단리될 때까지 유지된다.
실시양태에서, 공급물 또는 보충물은, 예를 들어, 생산 배양물 중의 200 내지 400 μM 범위의 Zn2 + 이온의 잔류 농도 및 10 내지 100 μM 범위의 Mn2 + 및 Cu2 + 이온의 잔류 농도를 각각 제공하는 수준 하의 Zn2+, Mn2+ 및 Cu2+ 염을 포함한다.
실시양태에서, 생산 배양물의 용존 산소 장력 (DOT)은 적어도 40% 내지 70%의 공기 포화도를 유지한다.
실시양태에서, 생산 배양물은 초기에는, 제1 온도, 예를 들어, 36℃ 내지 37℃로 유지하고, 예를 들어, 미리 결정된 온도로 이동시키고, 예를 들어, 일단 생산 배양물이 성장 시기에서 벗어나기 시작하면, 제2 온도, 전형적으로 더 낮은 온도, 예를 들어, 30℃ 내지 33℃ 하로 이동시킨다. 실시양태에서 생산 배양물의 온도는 초기에는 36℃ 내지 37℃ 하로 제어되지만, 일단 생산 배양물이 성장 시기에서 벗어나기 시작하면, 전형적으로 15일의 생산 지속 기간 중 제5일 내지 제7일에 온도가 30℃ 내지 33℃ 하로 제어된다.
실시양태에서, 상기 방법 또는 생물반응기는 상기 기재된 하나 이상의 조건의 사용을 통하여, 비교적 더 산화적인 전위, 예를 들어, 안정화된 산물의 생산을, 예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%만큼 증가시키는 산화적 전위를 향하도록 생산 배양물의 산화환원 전위를 유지하는 것을 포함하거나 또는 이와 같이 유지할 수 있다. 대체 수단을 또한 사용하여, 더 산화적인 전위를 향하도록 산화환원 전위를 변형시킬 수 있고, 이는 온도 및 DOT와 조합하여, 산화 촉진제 대사물, 예컨대 데히드로아스코르브산/아스코르브산, 글루타티온/글루타티온-SH, 및 시스테인/시스틴을 상승시키기 위한 세포성 대사의 변경 또는 매질 구성성분에 영향을 미치는 다른 산화환원 전위를 포함한다.
실시양태에서, 상기 방법 또는 생물반응기는 세포에 의해 발현된 후속 산물이 해리되지 못하게 하기 위해 적절한 프로세스 변화에 영향을 미치는 생산 배양물 내에서의 세포의 산화환원 전위에 있어서의 변화를 감지하기 위하여, 산화환원 전위-표시 표지, 예를 들어, 염료 또는 분자 프로브를 사용하는 것을 포함하거나 또는 이를 사용할 수 있다. 실시양태에서, 상기 방법 또는 생물반응기는 산화환원 전위 인-라인 모니터링 프로브, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 메틀러 토레도(Mettler Toledo) 프로브를 사용하는 것을 포함하거나 또는 이를 사용할 수 있다.
실시양태에서, 상기 방법은 효소적 활성 (예를 들어, 글루타티온 리덕타제, 티오레독신, 티오레독신 리덕타제) 및/또는 산물 해리 반응에 관여하고 세포주에 의해 발현된 보조인자 및 관련 대사 산물 (예를 들어, 펜토스 포스페이트 경로와 연관된 보조인자 및 관련 대사 산물, 예를 들어, 글루코스-6-포스페이트, NADPH, NADP+, 6-포스포노글루코락톤, 6-포스포글루코네이트, 또는 리불로스-5-포스페이트)의 존재도를 프로빙하는 분석법을 사용하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 효소적 활성 및 보조인자 및 관련 대사 산물의 존재도를 프로빙하는 것은 추가 프로세싱 동안 산물 해리를 증진시키지 않는 세포성 인자의 감소되었거나 또는 바람직한 수준을 갖는 세포주 및 클론을 선별하기 위해 사용된다.
실시양태에서, 상기 방법 또는 생물반응기는 심층 여과 또는 원심분리 및 심층 여과 단계를 사용하여, 배양된 세포를 산물 함유 상청액으로부터 분리하기 전에 상기 배양된 세포를 15 ± 3℃로 냉각시키는 것을 포함하거나 또는 냉각시킬 수 있다.
실시양태에서, 일단 생산 배양물이 수거 단계를 개시하기 위한 표적 온도에 도달하게 되면, 상기 방법 또는 생물반응기는, 예를 들어, 프로세스 제어를 통하여, 생산 배양물의 산소공급을 길항시키는 것으로 예상되는 모든 요소를 반드시 최소화하는 것을 포함하거나 또는 최소화할 수 있다. 실시양태에서, 상기 방법 또는 생물반응기는 활성인 경우에 스파징된 질소 기체 흐름을 억제하거나, 활성인 경우에 요구에 따라 알칼리 제어를 억제하거나, 활성인 경우에 요구에 따라 CO2 기체 흐름 제어를 억제하거나, 또는 활성인 경우에 공급물 적용을 억제하는 것을 포함하거나 또는 이와 같이 억제할 수 있다.
실시양태에서, 일단 생산 배양물이 수거 단계를 개시하기 위한 표적 온도에 도달하게 되면, 상기 방법 또는 생물반응기는, 예를 들어, 프로세스 제어를 통하여, 생산 배양물의 산소공급을 증진시키는 것으로 예상되는 모든 요소를 반드시 최대화하고/하거나 활성화시키는 것을 포함하거나 또는 반드시 최대화하고/하거나 활성화시킬 수 있다. 실시양태에서, 상기 방법 또는 생물반응기는 하기 중 하나 이상을 포함하거나 또는 그와 같이 할 수 있다: 활성이 아닌 경우에 스파징된 공기 기체 흐름을 활성화시키는 것; 활성이 아닌 경우에 스파징된 산소 기체 흐름을 활성화시키는 것; 활성이 아닌 경우에 헤드 스페이스 압력을 활성화시키는 것; 활성이 아닌 경우에 헤드 스페이스 공기 및/또는 산소 흐름을 활성화시키는 것; 수거 작동 시 배수되는 동안에 세포 배양물이 여전히 잘 혼합되고 통기되도록 보장하는 것; 생물반응기 수거 라인이 수거 작동 동안 목적하는 유속을 붕괴시키고 방해하는 것을 견디게 해주는 내부 보어 크기 및 벽 강도를 기준으로 설계되도록 보장하는 것; 필터 정화 단계 동안 필터의 봉쇄 및 오염을 피하게 해주는 심층 필터 면적을 최적화함으로써, 필터 하우징 내에서의 세포 배양물의 체류 시간을 증가시키는 것; 및 무세포 상청액이 잘 통기되고 혼합된 수집 용기 (스틸 또는 일회용)에 수집되도록 보장하는 것. 실시양태에서, 특정 방법에 사용하기 위한 수거 용기는 하기 중 하나 또는 둘 다를 통하여 우수한 표면 산소공급을 증진시키는 것을 보장하도록 설계된다: 여과물을 용기 벽 아래로 캐스케이드하도록 강제하는 용기 벽 쪽으로 향한 내부 노즐을 설계함으로써 수집된 여과물을 용기 벽 표면 위로 충돌시키는 것; 및 여과물 수집 전에 수집 용기를, >40% 초과 공기 포화도 내지 ≤ 500% 공기 포화도로 수집된 여과물의 산소공급을 증진시키기 위해 공기 또는 공기 및 산소의 임의의 소정의 블렌드로 구성된 기체상의 환경으로 채울 수 있는 능력.
실시양태에서, 생물반응기와 세포 정화 단계 사이의 흐름 경로 및 세포 정화 단계와 상청액 수집 용기, 예를 들어, 수거 용기 사이의 흐름 경로는 산화환원, DOT 및 pH 센서를 이용하여 모니터링하는 것이 제안된다. 부가적으로, 생물반응기 내의 파라미터는 상기 두 가지 흐름 경로 또는 상청액 수집 용기, 예를 들어, 수거 용기 내에서의 산화환원, DOT 및 pH를 변경시키도록 조정될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 특정 세포를 포함하고 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포주를 제공하는 것을 포함하는, 상기 세포에 의한 산물, 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 생산 배양물은 산물, 예를 들어, 폴리펩티드의 발현을 허용해 주는 조건 하에 배양되고, 생산 배양물은 세포주가 배양되었거나 또는 통상적으로 배양되는 온도보다 더 낮은 온도인 30℃ 내지 33℃로 냉각시킴으로써, 산물, 예를 들어, 폴리펩티드를 만든다. 생산 배양물을 T수거 온도, 예를 들어, 15℃로 추가 냉각시키는 것은 생산 시기의 종료 시 일어난다.
실시양태에서, 산물은 2개 이상의 시스테인 잔기, 예를 들어, 제1, 제2, 제3 및 제4 또는 그 초과의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다. 실시양태에서, 천연 형태의 폴리펩티드는 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기 사이에 술프히드릴 결합을 포함한다. 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기 사이에 술프히드릴 결합을 포함한다. 실시양태에서, T수거는 배양물 중의 용존 산소의 소모를 감소시키기에 충분히 낮으므로, 세포성 인자 (효소와 대사물 둘 다)의 활성화를 방지시키고 디술피드 결합의 해리를 억제시키기에 충부한 용존 산소가 상청액에서 이용 가능해 진다. 실시양태에서, T수거는 참조 수준, 예를 들어, 달리 유사한 프로세스로부터 수득되긴 하지만 T수거로 냉각시키지 않았던 경우의 해리의 수준과 비교 시, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90%만큼 디술피드 결합의 해리를 방지시키기에 충분히 낮다.
실시양태에서, 상기 방법은 발현된 폴리펩티드를, T수거에서 배양된 세포로부터 분리하는 것을 포함한다.
실시양태에서, 상기 방법은 폴리펩티드를 발현하는 세포주를 T수거로 냉각시킨 경우에 발현된 폴리펩티드를 정제하는 것을 포함한다.
실시양태에서, 세포주는 제1 온도인 T배양에서 배양한 다음, 연속해서 지수 성장 후 시기에 온도 T생산 (예를 들어, 30℃ 내지 33℃)으로 냉각시키고, 생산 시기의 종료 시 수거 온도 T수거 (예를 들어, 12℃-18℃)로 추가 냉각시킨다. 실시양태에서, T배양은 T생산보다 더 높다. 실시양태에서, T생산은 T수거보다 더 높다.
실시양태에서, 37℃의 T배양에서 전형적으로 배양된 세포는 35℃, 34℃, 33℃, 32℃, 31℃, 또는 30℃ 미만의 T생산에 놓아둔다. 실시양태에서, 배양물은 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 10℃, 9℃, 8℃, 7℃, 5℃, 또는 4℃, 또는 15℃ 미만, 주위 온도 미만, 및/또는 실온 미만의 T수거로 추가 냉각시킨다. 실시양태에서, T수거는 6-24℃ 미만이다. 실시양태에서, T수거는 15+/-3℃이다.
예를 들어, 실시양태에서, T생산은 T배양보다 적어도 1℃, 3℃, 또는 6℃ 더 낮다.
예를 들어, 실시양태에서, T수거는 T생산보다 적어도 2℃, 5℃, 또는 8℃ 더 낮다.
실시양태에서, 배양된 세포는 T수거에서 상청액으로부터 분리된다.
실시양태에서, 폴리펩티드를 T수거에서 상청액의 또 다른 구성성분으로부터 분리하는 분리 단계가 수행된다.
실시양태에서, 예를 들어, 상청액의 한 구성성분으로서의 폴리펩티드가 T수거에서 필터에 적용된다.
실시양태에서, 생물반응기의 내용물은 T수거로 냉각시킨다.
실시양태에서, 세포 배양물은, 이러한 세포 배양물을 T수거로 되게 하는데 적합한 온도에서, 유체, 예를 들어, 물을 포함하는 구성원, 예를 들어, 냉각 재킷과의 접촉에 의해 냉각시킨다.
실시양태에서, 상기 방법은 T배양, T생산 및/또는 T수거 동안 영양소 또는 산소를 제공하는 것을 추가로 포함한다.
실시양태에서, 세포 배양물은 T배양, T생산 및/또는 T수거 동안 진탕시킨다.
실시양태에서, 상기 방법은 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
실시양태에서, 세포 또는 그의 산물은 T수거에서 수거 용기 내에 있다.
실시양태에서, 폴리펩티드는 표 1 및 2에 제공된 폴리펩티드, 또는 그의 변이체 중 하나이다.
실시양태에서, 폴리펩티드는 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 예를 들어, IgG1 항체, 또는 이러한 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 실시양태에서, 항체 코딩된 폴리뉴클레오티드 내의 1개 이상의 시스테인은 또 다른 아미노산으로 대체된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 시스테인은 1개 이상의 세린 잔기로 대체된다.
실시양태에서, 세포주는 포유동물 세포로부터 유래된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 산물을 특정 세포에서 생산하는 방법을 특징으로 한다. 실시양태에서, 이러한 산물은 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드이다.
본원에 기재된 방법 또는 조성물 중 임의의 것을 사용하여 생산될 수 있는 산물의 예는 재조합 산물, 또는 적어도 하나의 부분 또는 모이어티가 유전 공학의 결과인 산물을 포함한다. 본원에 기재된 재조합 산물은 진단 또는 치료 목적에 유용하다. 한 실시양태에서, 산물은 폴리펩티드, 예컨대 항체 분자 (예를 들어, 이중특이적 또는 다중포맷 항체 분자), 융합 단백질, 또는 단백질-접합체를 포함한다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은, 예를 들어, 상업적 또는 치료적 용도로 다량으로 또는 충분한 품질로 생산하기 어려운 산물, 예컨대 차세대 생물제제 (예를 들어, 융합 단백질, 이중특이적 또는 다중포맷 항체 분자, 다량체성 단백질, 및 글리코실화된 단백질)에 특히 유용할 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 산물을 생산하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 세포는 이러한 산물을 발현한다. 한 실시양태에서, 상기 세포는 본원에 기재된 산물, 예를 들어, 표 1, 2, 3 또는 4로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 산물의 부가의 예는 "산물"이란 제목의 섹션에 기재된다.
이러한 실시양태에서, 세포의 전술된 특징 중 임의의 것의 증가 또는 감소는 변형을 갖지 않은 세포와의 비교에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 생물반응기는 온도 저하의 영향을 받지 않은 세포와 비교 시 산물의 생산을 증가시켜 준다. 생산 증가는 세포에 의해 생산된 산물의 증가된 양, 수율 또는 수량 및/또는 증가된 생산 속도로 특징지을 수 있으며, 여기서 생산 속도는 시간 경과에 따른 산물의 양과 동일하다. 한 실시양태에서, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 생산은, 예를 들어, 온도 저하의 영향을 받지 않은 세포에 의한 생산과 비교 시 1배, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배만큼 증가된다.
본원에 기재된 방법 및 생물반응기는 또한, 온도 저하의 영향을 받지 않은 세포와 비교 시 개선된 산물의 품질을 유발할 수 있다. 산물의 품질에 있어서의 개선은 하기 중 하나 이상으로 특징지을 수 있다: 해리 (예를 들어, 폴리펩티드의 덜 활성 형태로의 해리 상의 감소); 응집 (예를 들어, 응집체 또는 응집 상의 감소); 적절한 폴딩 또는 어셈블리 (예를 들어, 미스폴딩되거나 또는 언폴딩된 산물; 또는 부분적으로 어셈블리되거나 또는 디스어셈블리된 산물의 감소); 번역 후 변형 (예를 들어, 글리코실화 불균질성, 더 높은 백분율의 목적하거나 또는 미리 결정된 번역 후 변형 상의 증가 또는 감소); 단편화 (예를 들어, 단편화 상의 감소); 디술피드 결합 스크램블링 (예를 들어, 디술피드 결합 스크램블링에 기인한 원하지 않는 이소형 또는 구조의 감소). 한 실시양태에서, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 품질은, 예를 들어, 온도 저하의 영향을 받지 않은 세포에 의해 생산된 산물의 품질과 비교 시, 예를 들어, 1배, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배만큼 증가된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 산물을 생산하는 방법은 폴리펩티드의 안정성 또는 활성을 증강시키는 하나 이상의 부가 단계를 이용하여 수행될 수 있다. 이들은 ER 프로세싱 능력 (ER 확장) 또는 분비를 개선시키는 변형을 세포 내로 도입하는 단계; 상기 세포, 또는 세포의 자손으로부터, 또는 상기 세포, 또는 세포의 자손에 의해 컨디셔닝된 배지로부터 산물을 수득하는 단계; 이러한 산물을 적어도 하나의 세포성 또는 배지 구성성분으로부터 분리하는 단계; 및/또는, 예를 들어, 활성에 대해 또는 구조적 모이어티의 존재에 대해 상기 산물을 분석하는 단계를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 PD1, BiP, ERO, 또는 XBP1을 코딩하는 핵산을 도입함으로써 ER 프로세싱 능력 (또는 ER 확장)을 개선시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 SNARE 기구 또는 분비 경로에 수반되는 다른 기구를 조정함으로써, 예를 들어, SNARE 구성성분을 코딩하는 핵산을 도입함으로써, 분비 능력 또는 분비 속도를 개선시키기 위한 부가의 단계를 추가로 포함한다.
산물
본원에 기재된 방법에 적합한 산물은 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 단백질; 핵산 분자, 예를 들어, DNA 또는 RNA 분자; 다량체성 단백질 또는 복합체; 지질-캡슐화된 입자, 예를 들어, 바이러스 유사 입자, 소포, 또는 엑소솜; 또는 다른 분자를 포함한다. 실시양태에서, 산물은 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드이다. 예를 들어, 재조합 폴리펩티드는 단백질; 또는 복잡하고/하거나 비-자연 구조를 갖는 단백질, 예컨대 차세대 생물제제, 예를 들어, 이중특이적 항체 분자, 융합 단백질, 또는 글리코실화된 단백질을 발현하기 어려울 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 산물을 생산하는 방법은 이러한 산물, 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 조성물, 제제, 생물반응기, 또는 방법 중 임의의 것에서, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 또는 항체 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 이중특이적 항체 분자, 예를 들어, BiTE (이중특이적 T 세포 인게이저), DART (이중 친화도 재표적화 또는 재유도 T 세포)이다.
한 실시양태에서, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드는 표 1, 표 2, 표 3, 또는 표 4로부터 선택된다.
실시양태에서, 산물은 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 한 실시양태에서, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 세포의 염색체 게놈 내로 통합된다. 또 다른 한편으론, 산물은 세포에 의해 일시적으로 발현된다. 한 실시양태에서, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 세포의 염색체 게놈 내로 통합되지 않는다.
숙주 세포
본원에는 본원에 기재된 산물을 생산하기 위한 세포 및 이러한 세포를 조작하는 방법이 제공된다.
본원에 기재된 조성물, 제제, 또는 방법 중 임의의 것에서, 세포는 진핵 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 또는 식물 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 설치류 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. CHO 세포의 예는 CHOK1, CHOK1SV, 포텔리젠트(Potelligent) CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, CHOZN, 또는 CHO 유래 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 조성물, 제제, 또는 방법 중 임의의 것에서, 세포는 HeLa, HEK293, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK, VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, EB66, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, 및 CHOZN으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포 이외의 진핵 세포, 예를 들어, 곤충, 식물, 효모, 또는 조류 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다.
본원에 기재된 방법 또는 세포, 예를 들어, 조작된 세포 중 임의의 것에서, 세포는 산물, 예를 들어, 재조합 산물, 예를 들어, 이중특이적 항체, 융합 단백질, 또는 글리코실화된 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 차세대 생물제제를 발현하거나 또는 그를 포함한다.
본원에 기재된 방법 또는 세포, 예를 들어, 조작된 세포 중 임의의 것에서, 세포는 CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, CHOZN, 또는 CHO 유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CHO 세포이다.
조성물 및 제제
한 측면에서, 본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 방법에 의해 만들어진 본원에 기재된 산물의 제제를 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 이러한 제제 중의 산물의 중량 또는 수를 기준으로 적어도 70, 80, 90, 95, 98 또는 99%가 적절하게 폴딩되거나 어셈블리된다. 한 실시양태에서, 상기 제제 중의 산물의 중량 또는 수를 기준으로 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만이 응집된다. 한 실시양태에서, 상기 제제 중의 산물의 중량 또는 수를 기준으로 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만이 산물의 단편이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 세포, 예를 들어, 세포와 이러한 세포에 의해 생산된 산물을 포함하는 혼합물을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 상기 혼합물은 산물의 중량 또는 수를 기준으로, 상기 개시된 프로세스 파라미터를 수반하지 않는 경우에 관찰되는 것보다 더 높은 농도, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 또는 30% 더 높은 농도 하의 산물을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 혼합물 중의 산물의 중량 또는 수를 기준으로 적어도 70, 80, 90, 95, 98 또는 99%가 적절하게 폴딩되거나 어셈블리된다. 한 실시양태에서, 상기 혼합물 중의 산물의 중량 또는 수를 기준으로 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만이 응집된다. 한 실시양태에서, 상기 혼합물 중의 산물의 중량 또는 수를 기준으로 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만이 산물의 단편이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 온도 저하 변형의 영향을 받은 세포의 배양에 의해 컨디셔닝된 배지의 제제를 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 산물은 중량 또는 수를 기준으로, 상기 변형을 수반하지 않는 경우에 관찰되는 것보다 더 높은 농도, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 또는 30%, 100% 더 높은 농도로 상기 제제에 존재한다. 한 실시양태에서, 제제 중의 산물의 중량 또는 수를 기준으로 적어도 70, 80, 90, 95, 98 또는 99%가 적절하게 폴딩되거나 어셈블리된다. 한 실시양태에서, 상기 제제 중의 산물의 중량 또는 수를 기준으로 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만이 응집된다. 한 실시양태에서, 상기 제제 중의 산물의 중량 또는 수를 기준으로 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만이 산물의 단편이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 등가의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있긴 하지만, 적합한 방법 및 물질이 아래에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 또한, 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 표제, 소제목 또는 넘버링되거나 또는 문자가 있는 요소, 예를 들어, (a), (b), (i) 등은 단지 읽기 쉽게 하기 위해 제시된 것이다. 본 명세서에서 표제 또는 넘버링되거나 또는 문자가 있는 요소를 사용하더라도 단계 또는 요소가 알파벳순으로 수행될 필요가 없거나 또는 단계 또는 요소가 반드시 서로 분리되어 있어야 할 필요는 없다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 온도, 산소 용해도, 및 산소 활용률 (OUR)의 상관성를 도시한다.
도 2는 생물반응기, 1차 회수 인클로저, 및 저장 장치에서 폴리펩티드 해리를 최소화하기 위한 완화 방안의 도식적 표현이다.
도 3은 완화의 부재 하에 및 세포를 냉각시키는 것을 포함하는 완화를 수반하는, 수거 산소공급을 수반한 경우 및 수반하지 않는 경우의 2개의 생물반응기의 수거 프로파일을 도시한다.
도 4는 IgG1 모노클로날 항체에 대한 완화를 수반하지 않는 경우 (왼쪽 패널) 및 완화를 수반한 경우 (오른쪽 패널)에 제조된 비-환원성 SDS 폴리아크릴아미드 겔 샘플을 나타낸다.
도 5는 기준선 상류 프로세스 및 미량 영양소의 볼루스 부가 또는 미량 영양소의 연속 부가를 이용하는 최적화된 상류 프로세스에 대한 배양 지속 기간에 걸친 생산 배양물 산화환원 전위의 그래프를 도시한다.
도 6은 경과 시간, 표지화 스테이지 및 전이점에 따른, 세포성 산소 요구에 대한 공기 및 산소의 스파징 흐름 (sLPM) 및 생산 배양물 온도의 그래프를 도시한다.
도 7a 및 7b는 스파징된 공기 및 산소가 수거 동안 생산 배양물에 고정되는 경우 (도 7a) 및 스파징된 공기 및 산소가 수거 동안 생산 배양물에 고정되어 배양물의 DOT를 ~200% 공기 포화도 최대로 제한하는 경우 (도 7b)의 배양물의 제어 프로파일의 예를 도시한다.
도 8a 및 8b는 배양물 흐름, 부품 및 기능이 표지된 예시적인 생물반응기 및 수거 용기의 다이아그램 (도 8a) 및 도 8a의 수거 용기의 원을 두른 헤드 스페이스 영역의 표지된 도식적 확대도 (도 8b)이다.
도 9는 예시적인 수거 용기의 다이아그램을 도시한다.
도 2는 생물반응기, 1차 회수 인클로저, 및 저장 장치에서 폴리펩티드 해리를 최소화하기 위한 완화 방안의 도식적 표현이다.
도 3은 완화의 부재 하에 및 세포를 냉각시키는 것을 포함하는 완화를 수반하는, 수거 산소공급을 수반한 경우 및 수반하지 않는 경우의 2개의 생물반응기의 수거 프로파일을 도시한다.
도 4는 IgG1 모노클로날 항체에 대한 완화를 수반하지 않는 경우 (왼쪽 패널) 및 완화를 수반한 경우 (오른쪽 패널)에 제조된 비-환원성 SDS 폴리아크릴아미드 겔 샘플을 나타낸다.
도 5는 기준선 상류 프로세스 및 미량 영양소의 볼루스 부가 또는 미량 영양소의 연속 부가를 이용하는 최적화된 상류 프로세스에 대한 배양 지속 기간에 걸친 생산 배양물 산화환원 전위의 그래프를 도시한다.
도 6은 경과 시간, 표지화 스테이지 및 전이점에 따른, 세포성 산소 요구에 대한 공기 및 산소의 스파징 흐름 (sLPM) 및 생산 배양물 온도의 그래프를 도시한다.
도 7a 및 7b는 스파징된 공기 및 산소가 수거 동안 생산 배양물에 고정되는 경우 (도 7a) 및 스파징된 공기 및 산소가 수거 동안 생산 배양물에 고정되어 배양물의 DOT를 ~200% 공기 포화도 최대로 제한하는 경우 (도 7b)의 배양물의 제어 프로파일의 예를 도시한다.
도 8a 및 8b는 배양물 흐름, 부품 및 기능이 표지된 예시적인 생물반응기 및 수거 용기의 다이아그램 (도 8a) 및 도 8a의 수거 용기의 원을 두른 헤드 스페이스 영역의 표지된 도식적 확대도 (도 8b)이다.
도 9는 예시적인 수거 용기의 다이아그램을 도시한다.
본 개시내용은 세포 배양물을 냉각시킴으로써 특정 산물을 보다 고 수율로 수득하기 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다. 따라서, 세포는 현재의 생산 방법으로부터 수득된 수율 및 품질과 비교 시 개선된 품질을 나타낸다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한, 재조합 산물을 생산하기 위해 현재 사용되고 있는 세포 발현 시스템과 비교 시, 개선된 생산성, 산물 품질, 강건함, 및/또는 배양 생육력을 수반한 세포 또는 세포주를 조작하는데 유용하다.
상기 방법은 차세대 생물제제를 생산하는데 적합하다. 이들 방법이 환자에게 치료 효능을 지속적으로 제공함에 따라, 치료용으로 높은 수준의 품질을 갖는 다량의 차세대 생물학적 산물에 대한 수요뿐만 아니라 생산 세포주의 효율적인 개발 및 효율적인 생산 수단이 단계적으로 확대될 것이다. 더욱이, 많은 차세대 생물제제가 관련 기술분야에 공지된 통상적인 발현 기술을 사용해서는 통상적인 세포주에서 발현 및 생산되기가 어렵다. 현재의 방법은 이들 산물을 다량으로 생산하고 임상용에 필요한 높은 수준의 품질로 생산하는데 충분하지 않다. 본원에 기재된 냉각 방법이 이러한 장애물들을 극복해 준다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 등가의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 및/또는 시험에 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재된다. 본 발명을 설명하고 청구하는데 있어서, 그것이 정의되는 방법에 따라서 다음 용어가 사용될 것이며, 여기서 특정 정의가 제공된다.
또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특별한 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다.
단수 형태는 그 대상물의 하나 또는 둘 이상 (즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 한 예로서, "세포"는 하나의 세포 또는 둘 이상의 세포를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "해리"는 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기 사이의 환원을 통한 및 폴리펩티드 사이의 환원을 통한, 디술피드 결합의 절단 또는 해리를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내부에서 자연적으로 생산되거나 또는 그로부터의 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부에서 생산되거나 또는 그 내로 도입된 임의의 물질을 지칭한다. 따라서, "외인성 핵산"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부에서 생산되거나 또는 그 내로 도입되는 핵산을 지칭한다. 실시양태에서, 외인성 핵산의 서열은 이러한 외인성 핵산이 도입되는 유기체, 세포, 조직, 또는 시스템 내부에서 자연적으로 생산되지 않거나, 또는 자연적으로 발견되지 않을 수 있다. 실시양태에서, 비-자연적으로 발생하는 산물, 또는 비-자연적으로 발생하는 부분을 함유하는 산물이 본원에 기재된 숙주 세포와 관련해서 외인성 물질이다.
본원에 사용된 바와 같은 "이종"은 상이한 종으로부터의 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내로 도입될 때, 하나의 종으로부터의 임의의 물질을 지칭한다. 실시양태에서, 이종 물질은 또한, 하나 또는 다수의 종으로부터의 부분 또는 비-자연적으로 발생하는 부분을 포함하는 물질을 포괄한다. 한 예로서, 핵산이 융합 단백질을 코딩하며, 여기서 융합 단백질의 일부분이 인간이고, 융합 단백질의 일부분이 박테리아이며, 융합 단백질의 일부분이 비-자연적으로 발생하며, 상기 핵산이 인간 세포 내로 도입되는 실시양태에서, 상기 핵산은 이종 핵산이다.
본원에서 상호 교환적으로 사용된 바와 같은 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합에 의해, 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야만 하고, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 한 실시양태에서, 단백질은 2개 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 폴리펩티드로 구성될 수 있으며, 각각의 폴리펩티드는 공유 또는 비공유 결합/상호 작용에 의해 또 다른 것과 연합된다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 상기 용어는 관련 기술분야에서, 예를 들어, 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로서 흔히 지칭되기도 하는 짧은 쇄와, 관련 기술분야에서 단백질 (이에는 많은 유형이 있다)로서 일반적으로 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다.
"재조합 산물"은 세포 또는 무세포 시스템에 의해 생산될 수 있는 산물을 지칭한다. 이러한 산물은 분자, 핵산, 폴리펩티드, 또는 그의 임의의 혼성체일 수 있다. 재조합 산물은 산물의 생산 또는 발현을 제어하는 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 산물의 적어도 하나의 구성성분이 유전 공학에 의해 형성된 것이다. 재조합 산물을 생성하거나 또는 재조합 산물을 코딩하는 구축물을 생성하기 위해 본원에 사용된 바와 같은 유전 공학은 관련 기술분야에 공지된 재조합 DNA 발현 기술 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology]에 기재된 바와 같음); 부위 지정, 주사, 또는 무작위 돌연변이유발; CRISPR 전략; 및 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 전략을 포괄한다. 한 실시양태에서, 재조합 산물은 재조합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 재조합 산물은 자연적으로 발생하는 산물이다. 한 실시양태에서, 재조합 산물은 비-자연적으로 발생하는 산물, 예를 들어, 합성 산물이다. 한 실시양태에서, 재조합 산물의 일부분이 자연적으로 발생하는 반면, 재조합 산물의 또 다른 부분이 비-자연적으로 발생한다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 산물의 제1 부분은 하나의 자연적으로 발생하는 분자인 반면, 재조합 산물의 또 다른 부분은 제1 부분과 상이한 또 다른 자연적으로 발생하는 분자이다. 일부 실시양태에서, 재조합 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드)은 안정화된 산물이다. 안정화된 산물은 적절한 폴딩과 결합 배열, 예를 들어, 정확하게 쌍을 이룬 디술피드 결합의 가능성을 증가시키고 멀티-서브유닛 폴리펩티드의 해리의 가능성을 감소시키는 조건 하에, 세포, 예를 들어, 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 산물이다. 일부 실시양태에서, 안정화된 산물은 안정화된 단백질이다. 안정화된 단백질은 적절한 단백질 폴딩과 결합 배열, 예를 들어, 적절한 디술피드 결합 배열의 가능성을 증가시키고 멀티-서브유닛 폴리펩티드의 해리의 가능성을 감소시키는 조건 하에 세포에 의해 생산된 단백질이다. 예를 들어, 안정화된 단백질은 비-안정화된 단백질을 생산하기 위해 사용된 온도 및 산소공급 수준과 비교하여 산화 환경을 유발하는 온도 및 산소공급 수준에서 생산될 수 있어, 정확한 디술피드 결합을 보유할 가능성을 증가시키고 멀티-서브유닛 폴리펩티드가 서로 해리될 수 있는 가능성을 감소시켜 준다. 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질은 또한 단리될 수 있으며, 예를 들어, 적절한 폴딩과 결합 배열을 증진시키는 조건 하에 세포 또는 세포 배양물로부터 일련의 분리/크로마토그래피 단계에 의해 정제될 수 있다. 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질의 제제는 적절한 폴딩과 결합 배열의 가능성을 증가시키고 멀티-서브유닛 폴리펩티드의 해리의 가능성을 감소시키는 조건 하에, 예를 들어, 세포, 예를 들어, 재조합 숙주 세포로부터 제조된 제제이다. 예를 들어, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질의 제제는 정확한 디술피드 결합을 수반한 산물, 예를 들어, 단백질을 포함할 가능성이 더 많고, 해리된 산물, 예를 들어, 단백질, 예를 들어, 멀티-서브유닛 폴리펩티드의 해리된 서브유닛을 포함할 가능성이 더 적다. 산물, 예를 들어, 항체의 해리 주제에 대한 더 많은 심층 논의에 관해서는, 예를 들어, 문헌 [Wai Keen Chung et al. 2017, Michael W Handlogten et al. 2017, and Brian Mullan et al. 2011]을 참조할 수 있다.
"재조합 폴리펩티드"는 본원에 기재된 세포에 의해 생산될 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 재조합 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드의 발현을 제어하는 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 (세포 또는 전구 세포의) 유전 공학 또는 조작에 의해 형성된 것이다. 예를 들어, 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변경되며, 예를 들어, 이는 세포 내로 도입되었거나 또는 유전적으로 조작된 재배열의 산물이다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드의 서열은 폴리펩티드 또는 단백질의 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생하는 이소형과 상이하지 않다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리펩티드 또는 단백질의 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생하는 이소형의 서열과 상이하다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드와 세포는 동일한 종으로부터의 것이다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 세포의 내인성 게놈에 의해 코딩된 폴리펩티드와 동일하거나 또는 이와 실질적으로 동일하거나, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이하만큼 상이하다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드와 세포는 동일한 종으로부터의 것이며, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드이고 세포는 인간 세포이다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드와 세포는 상이한 종으로부터의 것이며, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드이고 세포는 비-인간, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, CHO, 다른 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물, 진균 또는 박테리아 세포이다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 세포에 대해 외인성이며, 달리 말하면, 세포는 제1 종으로부터의 것이고 재조합 폴리펩티드는 제2 종으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 합성 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-자연적으로 발생하는 공급원으로부터 유래된다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드 또는 단백질의 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생하는 이소형으로부터의 아미노산 서열에 있어서 상이하지 않는 인간 폴리펩티드 또는 단백질이다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20개 이하의 아미노산 잔기에서 인간 폴리펩티드 또는 단백질의 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생하는 이소형과 상이하다. 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 그의 아미노산 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 15% 이하에서 인간 폴리펩티드의 자연적으로 발생하는 이소형과 상이하다. 재조합 폴리펩티드의 일부분이 인간 폴리펩티드의 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생하는 이소형의 일부분으로부터 유래된 서열을 포함하는 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드의 일부분은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 또는 20개 이하의 아미노산 잔기만큼, 또는 그의 아미노산 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 15%만큼 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생하는 이소형의 상응하는 부분과 상이하다.
산소공급 수준 및 산소공급의 수준은 상호 교환적으로 사용되고, 본원에 사용된 바와 같이 다량의 액체 또는 기체 중의, 예를 들어, 배양물 중의 용존 산소의 수준을 지칭한다. 산소공급 수준은 용존 산소 장력 (DOT)의 단위, 예를 들어, 공기 포화도의 백분율 (예를 들어, 공기 중 산소의 수준의 백분율)의 관점에서 기재될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 생산 배양물은 성장 배지와 세포 (예를 들어, 적어도 하나의 세포), 예를 들어, 재조합 세포, 예를 들어, 산물, 예를 들어, 단백질, 세포성 인자, 예를 들어, 효소 및 대사물을 발현하는 재조합 숙주 세포의 혼합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생산 배양물은 세포 성장/분할 특징을 포함하는 하나 이상의 배양 시기 (예를 들어, 순차적 및/또는 중복되는 배양 시기)를 통하여 진행된다. 일부 실시양태에서, 생산 배양물이 상이한 시기를 통하여 진행됨에 따라, 생산 배양물의 처리는 본원에 기재된 바와 같이 변화된다. 본원에 사용된 바와 같은 생산 시기는 접종 하에 시작되고 특이적 기준 (예를 들어, 프로세스 또는 기간의 종료, 예를 들어, 10-30일, 예를 들어, 15-20일)에 도달할 때, 또는 특이적 세포 생육력 기준 (예를 들어, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10% 미만의 생육력, 예를 들어, 50% 미만의 생육력)에 도달할 때 종료하는 생산 배양물의 시기를 지칭한다. 생산 시기는 세포 성장 및/또는 분할이 기하급수적인 지수 성장 시기를 포함할 수 있다. 생산 시기는 지수 성장 시기 다음에 오는 성장 후 시기를 포함할 수 있고, 여기서 세포 성장 및/또는 분할은 성장 곡선의 선형 상 내에 있으며, 예를 들어, 세포 성장 및/또는 분할 속도는 지수 성장 시기와 비교하여 감소되었다. 일부 실시양태에서, 생산 상청액으로부터의 세포의 분리, 예를 들어, 수거, 및 추가의 분리 또는 정제 단계, 예를 들어, 수거 후는 생산 시기의 종료에 뒤따르는 시기이다.
본원에 사용된 바와 같은 산화환원 전위차는 둘 이상의 화합물, 예를 들어, 산물, 예를 들어, 안정화된 또는 비-안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 또는 비-안정화된 단백질의 산화환원 전위의 비교를 설명한다. 예를 들어, 안정화된 산물은 산화환원 전위 A를 가질 수 있는 반면, 비-안정화된 산물은 산화환원 전위 B를 가질 수 있으며; 이때, 안정화된 산물 내지 비-안정화된 산물의 산화환원 전위차는 A-B (A 마이너스 B)일 것이거나, 또는 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 산화환원 전위차는 B-A (B-A)일 것이다. 예를 들어 절대 음성 산화환원 전위가 더 높을 수록 더 환원적 환경이 되며, 본 발명의 목표는 본원에 개시된 방법에 의해 더 산화적인 환경을 창출함으로써 절대 음성 산화환원 전위를 감소시켜 양성 산화환원 전위를 향하도록 하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 작동적으로 커플링된다는 것은 용기들 사이의 관계를 설명한다. 실시양태에서, 배양 배지 또는 생산 배양물은 작동적으로 커플링된 용기들 간에 전달될 수 있다. 실시양태에서, 작동적으로 커플링된 용기들 사이의 배양물의 흐름은, 예를 들어, 펌프, 필터, 센서, 배양 조건을 유지 또는 변경시키기 위한 수단, 및/또는 액체의 흐름을 모니터링하기 위한 수단을 이용하여, 제어된 방식으로 발생된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 또는 본 개시내용의 생물반응기는 생산 배양물, 생산 배양물의 세포, 또는 생산 배양물로부터의 상청액을 상이한 시기 전반에 걸쳐 상이한 온도로 유지하는 것을 포함하거나 또는 유지할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 T배양은 생산 배양물의 세포가, 예를 들어, 성장 배지 내에서, 접종 시작부터 생산 시기의 종료까지 성장하여 단백질이 생산되는 생산 배양물을 생산하는 온도이다. 일부 실시양태에서, T배양은 30℃-38℃이다. 본원에 사용된 바와 같은 T생산은 생산 배양물이 지수 성장 후 시기 이후에 냉각되는 제1 온도이다. 일부 실시양태에서, T생산은 35℃, 34℃, 33℃, 32℃, 31℃, 또는 30℃ 미만, 예를 들어, 30℃-33℃이다. 본원에 사용된 바와 같은 T수거는 생산 배양물이 수거 (예를 들어, 상청액으로부터의 세포의 분리)에 앞서 냉각되는 제2 온도이다. 일부 실시양태에서, T수거는 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 10℃, 9℃, 8℃, 7℃, 6℃, 5℃, 또는 4℃이다. 한 실시양태에서, T수거는 12℃-18℃, 예를 들어, 15℃이다. 한 실시양태에서, T수거는 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃ 또는 24℃ 미만이다. 한 실시양태에서, T수거는 15℃±3℃이다.
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명이 특이적 측면과 관련하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 측면 및 변동이 본 발명의 진정한 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고안될 수 있다는 것이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 측면 및 등가 변동 모두를 포함하는 것으로 해석된다.
산물
본원에는 세포가 발현되는 온도를 저하시킴으로써 고 수율의 산물 및/또는 개선된 산물 품질 (예를 들어, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질)을 생산할 수 있는 세포 또는 무세포 발현 시스템을 조작 또는 제조하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 본원에 기재된 산물은 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 단백질; 다량체성 단백질 또는 복합체; 지질-캡슐화된 입자, 예를 들어, 바이러스 유사 입자, 소포, 또는 엑소솜; 또는 다른 분자를 포함한다. 실시양태에서, 산물은 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드이다. 실시양태에서, 산물은 엑소솜이다. 예를 들어, 재조합 폴리펩티드는 단백질, 또는 복잡하고/하거나 비-자연 구조를 갖는 단백질, 예컨대 차세대 생물제제, 예를 들어, 이중특이적 항체 분자, 융합 단백질, 또는 글리코실화된 단백질을 발현하기 어려울 수 있다.
실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 조성물에 의해 생성된 세포 또는 세포주는 의학적 병태, 장애 또는 질환의 치료에 유용한 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산한다. 의학적 병태, 장애 또는 질환의 예는 대사 질환 또는 장애 (예를 들어, 대사 효소 결핍증), 내분비 장애 (예를 들어, 호르몬 결핍증), 지혈의 조절이상, 혈전증, 조혈 장애, 폐 장애, 위장 장애, 자가면역 질환, 면역 조절이상 (예를 들어, 면역결핍증), 불임증, 이식, 암, 및 감염성 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
실시양태에서, 산물은 외인성 단백질, 예를 들어, 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 단백질이다. 한 실시양태에서, 이러한 단백질은 하나의 종으로부터의 것인 반면, 세포는 상이한 종으로부터의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 단백질은 비-자연적으로 발생하는 단백질이다.
다른 실시양태에서, 산물은 세포에 의해 내인성으로 발현되는 단백질이다. 한 실시양태에서, 산물은 내인성 또는 자연 수준에서 세포에 의해 내인성으로 발현되는 단백질이다. 본원에 기재된 본 방법 및 조성물은 내인성 산물, 예를 들어, 세포에 의해 자연적으로 생산되는 자연적으로 발생하는 산물의 생산 및 품질을 증가시키기 위해 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 산물, 예를 들어, 단백질을 코딩하는 외인성 핵산이 세포 내로 도입되고 이에 의해 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 세포에 의해 내인성으로 발현되는 산물의 발현을 증가시키는 외인성 핵산이 세포 내로 도입된다. 한 예로서, 외인성 핵산은 세포의 내인성 산물의 발현을 제어하는 프로모터를 활성화시키는 서열을 포함한다.
재조합 산물은 치료용 산물이거나, 또는 예를 들어, 약물 스크리닝에 유용한 진단용 산물일 수 있다. 치료 또는 진단용 산물은 항체 분자, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 융합 단백질, 호르몬, 시토카인, 성장 인자, 효소, 당단백질, 지단백질, 리포터 단백질, 치료용 펩티드, 또는 이들 중 임의의 것의 구조적 및/또는 기능적 단편 또는 혼성체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다른 실시양태에서, 치료용 또는 진단용 산물은 합성 폴리펩티드이며, 예를 들어, 여기서 전체 폴리펩티드 또는 그의 일부분은 임의의 자연적으로 발생하는 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 기재된 자연적으로 발생하는 폴리펩티드로부터 유래되지 않거나 또는 이러한 폴리펩티드에 대한 임의의 서열 또는 구조적 유사성을 갖는다.
한 실시양태에서, 재조합 산물은 항체 분자이다. 한 실시양태에서, 재조합 산물은 치료용 항체 분자이다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 산물은 진단용 항체 분자, 예를 들어, 영상화 기술 또는 진단 시험에 유용한 모노클로날 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 항체 분자는 항원과 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열이다. 실시양태에서, 항체 분자는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편이다. 항체 및 다중 포맷 단백질은 폴리클로날 또는 모노클로날, 다중 또는 단일 쇄, 또는 무손상 이뮤노글로불린일 수 있고, 자연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 이뮤노글로불린 분자의 사량체일 수 있다. 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 IgA, IgG, IgD, 또는 IgE 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 적어도 하나의 부분, 또는 그의 재조합 변이체를 지칭하고, 표적, 예컨대 항원에 대한 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하기에 충분한, 무손상 항체의 항원 결합 도메인, 예를 들어, 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, scFv 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb (VL 또는 VH), 낙타의 VHH 도메인; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 예컨대 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항원 결합 단편은 또한, 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 또한, 폴리펩티드, 예컨대 피브로넥틴 유형 III (Fn3)에 근거한 스캐폴드 내로 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기재하고 있는 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
실시양태에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, BOTOX, 미오블록, 뉴로블록, 디스포트 (또는 보툴리눔 신경독의 다른 혈청형), 알글루코시다제 알파, 답토마이신, YH-16, 융모성 고나도트로핀 알파, 필그라스팀, 세트로렐릭스, 인터류킨-2, 알데스류킨, 테세률린, 데니류킨 디프티톡스, 인터페론 알파-n3 (주사제), 인터페론 알파-nl, DL-8234, 인터페론, 순토리 (감마-1a), 인터페론 감마, 티모신 알파 1, 타소네르민, 디기Fab, 비페라TAb, 에키TAb, 크로Fab, 네시리티드, 아바타셉트, 알레파셉트, 레비프, 엡토테르미날파, 테리파라티드, 칼시토닌, 에타네르셉트, 헤모글로빈 글루타머 250 (소), 드로트레코긴 알파, 콜라게나제, 카르페리티드, 재조합 인간 표피 성장 인자, DWP401, 다르베포에틴 알파, 에포에틴 오메가, 에포에틴 베타, 에포에틴 알파, 데시루딘, 레피루딘, 비발리루딘, 노나코그 알파, 모노닌, 엡타코그 알파 (활성화됨), 재조합 인자 VIII+VWF, 리콤비네이트, 재조합 인자 VIII, 인자 VIII (재조합), 알픈메이트, 옥토코그 알파, 인자 VIII, 팔리페르민, 인디키나제, 테넥텝라제, 알텝라제, 파미텝라제, 레텝라제, 나텝라제, 몬텝라제, 폴리트로핀 알파, rFSH, hpFSH, 미카푼진, 페그필그라스팀, 레노그라스팀, 나르토라스팀, 세르모렐린, 글루카곤, 엑세나티드, 프람린티드, 이니글루세라제, 갈술파제, 류코트로핀, 몰그라모스티른, 트립토렐린 아세테이트, 히스트렐린 (히드론), 데스로렐린, 히스트렐린, 나파렐린, 류프롤리드 (ATRIGEL), 류프롤리드 (DUROS), 고세렐린, 에우트로핀, 소마트로핀, 메카세르민, 엔푸비르티드, Org-33408, 인슐린 글라르긴, 인슐린 글루리신, 인슐린 (흡입형), 인슐린 리스프로, 인슐린 데테르니르, 인슐린 (래피드미스트), 메카세르민 린파베이트, 아나킨라, 셀모류킨, 99mTc-압시티드, 미엘로피드, 베타세론, 글라티라머 아세테이트, 게폰, 사르그라모스팀, 옵렐베킨, 인간 백혈구 유래 알파 인터페론, 빌리브, 인슐린 (재조합), 재조합 인간 인슐린, 인슐린 아스파르트, 메카세닌, 로페론-A, 인터페론-알파 2, 알파페론, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파, 아보넥스의 재조합 인간 황체 형성 호르몬, 도르나제 알파, 트라페르민, 지코노티드, 탈티렐린, 디보테르미날파, 아토시반, 베캅레르민, 엡티피바티드, 제마이라, CTC-111, 산박-B, 옥트레오티드, 란레오티드, 안세스티른, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 라로니다제, 프레자티드 구리 아세테이트, 라스부리카제, 라니비주맙, 액티뮨, PEG-인트론, 트리코민, 재조합 인간 부갑상선 호르몬 (PTH) 1-84, 에포에틴 델타, 트랜스제닉 항트롬빈 III, 그란디트로핀, 비트라제, 재조합 인슐린, 인터페론-알파, GEM-21S, 바프레오티드, 이두르술파제, 옴나파트릴라트, 재조합 혈청 알부민, 세르톨리주맙 페골, 글루카르피다제, 인간 재조합 C1 에스테라제 억제제, 라노텝라제, 재조합 인간 성장 호르몬, 엔푸비르티드, VGV-1, 인터페론 (알파), 루시낙탄트, 아빕타딜, 이카티반트, 에칼란티드, 오미가난, 아우로그랍, 펙시가난아세테이트, ADI-PEG-20, LDI-200, 데가렐릭스, 신트레델린베수도톡스, 파블드, MDX-1379, ISAtx-247, 리라글루티드, 테리파라티드, 티파코긴, AA4500, T4N5 리포솜 로션, 카투막소맙, DWP413, ART-123, 크리살린, 데스모텝라제, 아메딥라제, 코리폴리트로핀알파, TH-9507, 테두글루티드, 디아미드, DWP-412, 성장 호르몬, 재조합 G-CSF, 인슐린, 인슐린 (테크로스피어), 인슐린 (AERx), RGN-303, 디아펩277, 인터페론 베타, 인터페론 알파-n3, 벨라타셉트, 경피 인슐린 패치, AMG-531, MBP-8298, 크세레셉트, 오페바칸, AIDSVAX, GV-1001, 림포스캔, 란피르나제, 리폭시산, 루수풀티드, MP52, 시풀류셀-T, CTP-37, 인세기아, 비테스펜, 인간 트롬빈, 트롬빈, 트랜스MID, 알피메프라제, 푸리카제, 테를리프레신, EUR-1008M, 재조합 FGF-I, BDM-E, 로티갑티드, ETC-216, P-113, MBI-594AN, 두라마이신, SCV-07, OPI-45, 엔도스타틴, 안지오스타틴, ABT-510, 바우만 버크 억제제, XMP-629, 99mTc-하이닉-아넥신 V, 카할라리드 F, CTCE-9908, 테베렐릭스, 오자렐릭스, 로르니뎁신, BAY-504798, 인터류킨4, PRX-321, 펩스칸, 이복타데킨, rh락토페린, TRU-015, IL-21, ATN-161, 시렌기티드, 알부페론, 비파식스, IRX-2, 오메가 인터페론, PCK-3145, CAP-232, 파시레오티드, huN901-DMI, SB-249553, 온코박스-CL, 온코박스-P, BLP-25, 세르박스-16, MART-1, gp100, 티로시나제, 네미피티드, rAAT, CGRP, 페그수네르셉트, 티모신베타4, 플리티뎁신, GTP-200, 라모플라닌, GRASPA, OBI-1, AC-100, 연어 칼시토닌 (엘리겐), 엑사모렐린, 카프로모렐린, 카르데바, 벨라페르민, 131I-TM-601, KK-220, T-10, 울라리티드, 데펠레스타트, 헤마티드, 크리살린, rNAPc2, 재조합 인자 V111 (PEG화 리포솜성), bFGF, PEG화 재조합 스타필로키나제 변이체, V-10153, 소노리시스 프롤리세, 뉴로박스, CZEN-002, rGLP-1, BIM-51077, LY-548806, 엑세나티드 (제어식 방출, 메디소르브), AVE-0010, GA-GCB, 아보렐린, ACM-9604, 리나클로티드아세테이트, CETi-1, 헤모스판, VAL, 급속 작용 인슐린 (주사제, 비아델), 인슐린 (엘리겐), 재조합 메티오닐 인간 렙틴, 피트라킨라, 멀티킨, RG-1068, MM-093, NBI-6024, AT-001, PI-0824, Org-39141, Cpn10, 타락토페린, rEV-131, rEV-131, 재조합 인간 인슐린, RPI-78M, 옵렐베킨, CYT-99007 CTLA4-Ig, DTY-001, 발라테그라스트, 인터페론 알파-n3, IRX-3, RDP-58, 타우페론, 담즙 염 자극된 리파제, 메리스파제, 알라린 포스파타제, EP-2104R, 멜라노탄-II, 브레멜라노티드, ATL-104, 재조합 인간 마이크로플라스민, AX-200, SEMAX, ACV-1, Xen-2174, CJC-1008, 디노르핀 A, SI-6603, LAB GHRH, AER-002, BGC-728, ALTU-135, 재조합 뉴라미니다제, Vacc-5q, Vacc-4x, Tat 톡소이드, YSPSL, CHS-13340, PTH(1-34) (노바솜), 오스타볼린-C, PTH 유사체, MBRI-93.02, MTB72F, MVA-Ag85A, FARA04, BA-210, 재조합 플라그 FIV, AG-702, OxSODrol, rBetV1, Der-p1/Der-p2/Der-p7, PR1 펩티드 항원, 돌연변이체 ras 백신, HPV-16 E7 리포펩티드 백신, 라비린틴, WT1-펩티드, IDD-5, CDX-110, 펜트리스, 노렐린, 시토Fab, P-9808, VT-111, 이크로캅티드, 텔베르민, 루핀트리비르, 레티쿨로스, rGRF, HA, 알파-갈락토시다제 A, ACE-011, ALTU-140, CGX-1160, 안지오텐신, D-4F, ETC-642, APP-018, rhMBL, SCV-07, DRF-7295, ABT-828, ErbB2-특이적 이뮤노톡신, DT3SSIL-3, TST-10088, PRO-1762, 콤보톡스, 콜레시스토키닌-B/가스트린-수용체 결합 펩티드, 111In-hEGF, AE-37, 트라스니주맙-DM1, 길항제 G, IL-12, PM-02734, IMP-321, rhIGF-BP3, BLX-883, CUV-1647, L-19 기반 ra, Re-188-P-2045, AMG-386, DC/1540/KLH, VX-001, AVE-9633, AC-9301, NY-ESO-1 (펩티드), NA17.A2 펩티드, CBP-501, 재조합 인간 락토페린, FX-06, AP-214, WAP-8294A, ACP-HIP, SUN-11031, 펩티드 YY [3-36], FGLL, 아타시셉트, BR3-Fc, BN-003, BA-058, 인간 부갑상선 호르몬 1-34, F-18-CCR1, AT-1100, JPD-003, PTH(7-34) (노바솜), 두라마이신, CAB-2, CTCE-0214, 글리코PEG화 에리트로포이에틴, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, JR-013, 인자 XIII, 아미노칸딘, PN-951, 716155, SUN-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, 테베렐릭스, EP-51216, hGH, OGP-I, 시푸비르티드, TV4710, ALG-889, Org-41259, rhCC10, F-991, 티모펜틴, r(m)CRP, 간 선택적 인슐린, 수발린, L19-IL-2 융합 단백질, 엘라핀, NMK-150, ALTU-139, EN-122004, rhTPO, 트롬보포이에틴 수용체 효능제, AL-108, AL-208, 신경 성장 인자 길항제, SLV-317, CGX-1007, INNO-105, 테리파라티드 (엘리겐), GEM-OS1, AC-162352, PRX-302, LFn-p24 융합물, EP-1043, gpE1, gpE2, MF-59, hPTH(1-34), 768974, SYN-101, PGN-0052, 아비스쿰닌, BIM-23190, 멀티-에피토프 티로시나제 펩티드, 엔카스팀, APC-8024, GI-5005, ACC-001, TTS-CD3, 혈관 표적화 TNF, 데스모프레신, 오네르셉트, 및 TP-9201이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아달리무맙 (HUMIRA), 인플릭시맙 (REMICADE)™, 리툭시맙 (RITUXAN™/MAB THERA™), 에타네르셉트 (ENBREL)™, 베바시주맙 (AVASTIN)™, 트라스투주맙 (HERCEPTIN)™, 페그릴그라스팀 (NEULASTA)™, 또는 바이오시밀러 및 바이오베터를 포함한 임의의 다른 적합한 폴리펩티드이다.
다른 적합한 폴리펩티드는 하기 및 US2016/0097074의 표 1에 열거된 것이다:
표 1
실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2에 제시된 바와 같은 호르몬, 혈액 응고/응고 인자, 시토카인/성장 인자, 항체 분자, 융합 단백질, 단백질 백신, 또는 펩티드이다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 생산될 수 있는 예시적인 재조합 산물은 아래의 표에 제공된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
표 2. 예시적인 산물
실시양태에서, 단백질은 다중특이적 단백질, 예를 들어, 표 3에 제시된 바와 같은 이중특이적 항체이다.
표 3: 이중특이적 포맷
실시양태에서, 산물은 표 4에 열거된 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 암 세포에 의해 발현된 항원이다. 일부 실시양태에서 재조합 또는 치료용 폴리펩티드는 종양 관련 항원 또는 종양 특이적 항원이다. 일부 실시양태에서, 재조합 또는 치료용 폴리펩티드는 HER2, CD20, 9-O-아세틸-GD3, βhCG, A33 항원, CA19-9 마커, CA-125 마커, 칼레티쿨린, 카르보안히드라제 IX (MN/CA IX), CCR5, CCR8, CD19, CD22, CD25, CD27, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD63, CD70, CC123, CD138, 암종 배아 항원 (CEA; CD66e), 데스모글레인 4, E-카데린 네오에피토프, 엔도시알린, 에프린 A2 (EphA2), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), ErbB2, 태아 아세틸콜린 수용체, 섬유모세포 활성화 항원 (FAP), 푸코실 GM1, GD2, GD3, GM2, 강글리오시드 GD3, 글로보 H, 당단백질 100, HER2/neu, HER3, HER4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체 1, 루이스-Y, LG, Ly-6, 흑색종 특이적 콘드로이틴-술페이트 프로테오글리칸 (MCSCP), 메소텔린, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, 뮐러리안 억제성 물질 (MIS) 수용체 유형 II, 혈장 세포 항원, 폴리 SA, PSCA, PSMA, 소닉 헤지호그 (SHH), SAS, STEAP, sTn 항원, TNF-알파 전구체, 및 그의 조합물로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 활성화 수용체이고, 2B4 (CD244), α4β1 인테그린, β2 인테그린, CD2, CD16, CD27, CD38, CD96, CDlOO, CD160, CD137, CEACAMl (CD66), CRTAM, CSl (CD319), DNAM-1 (CD226), GITR (TNFRSF18), 활성화 형태의 KIR, NKG2C, NKG2D, NKG2E, 하나 이상의 자연 세포독성 수용체, NTB-A, PEN-5, 및 그의 조합물로부터 선택되며, 임의로 여기서 β2 인테그린은 CD11a-CD 18, CD11b-CD 18, 또는 CD11c-CD 18을 포함하고, 임의로 여기서 활성화 형태의 KIR은 KIR2DS1, KIR2DS4, 또는 KIR-S를 포함하며, 임의로 여기서 자연 세포독성 수용체는 NKp30, NKp44, NKp46, 또는 NKp80을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 억제성 수용체이고, KIR, ILT2/LIR-l/CD85j, 억제성 형태의 KIR, KLRG1, LAIR-1, NKG2A, NKR-P1A, Siglec-3, Siglec-7, Siglec-9, 및 그의 조합물로부터 선택되며, 임의로 여기서 억제성 형태의 KIR은 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, 또는 KIR-L을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 활성화 수용체이고, CD3, CD2 (LFA2, OX34), CD5, CD27 (TNFRSF7), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD40L, CD84 (SLAMF5), CD137 (4-1BB), CD226, CD229 (Ly9, SLAMF3), CD244 (2B4, SLAMF4), CD319 (CRACC, BLAME), CD352 (Lyl08, NTBA, SLAMF6), CRTAM (CD355), DR3 (TNFRSF25), GITR (CD357), HVEM (CD270), ICOS, LIGHT, LTβR (TNFRSF3), OX40 (CD134), NKG2D, SLAM (CD150, SLAMF1), TCRα, TCRβ, TCRδγ, TIM1 (HAVCR, KIM1), 및 그의 조합물로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 억제성 수용체이고, PD-1 (CD279), 2B4 (CD244, SLAMF4), B71 (CD80), B7Hl (CD274, PD-L1), BTLA (CD272), CD160 (BY55, NK28), CD352 (Ly108, NTBA, SLAMF6), CD358 (DR6), CTLA-4 (CD152), LAG3, LAIR1, PD-1H (VISTA), TIGIT (VSIG9, VSTM3), TIM2 (TIMD2), TIM3 (HAVCR2, KIM3), 및 그의 조합물로부터 선택된다.
다른 예시적인 단백질은 문헌 [Leader et al., "Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification", Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7:21-39 (본원에 참조로 포함됨)]의 표 1-10에 기재된 임의의 단백질; 또는 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드의 임의의 접합체, 변이체, 유사체, 또는 기능적 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
다른 재조합 단백질 산물은 비-항체 스캐폴드 또는 대체 단백질 스캐폴드, 예컨대 DARPin, 애피바디 및 애드넥틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 비-항체 스캐폴드 또는 대체 단백질 스캐폴드는 1개 또는 2개, 또는 그 초과, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 초과의 상이한 표적 또는 항원을 인식하거나 또는 이와 결합하도록 조작될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 산물, 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 선별 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 선별성 마커는 글루타민 신테타제 (GS); 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 예를 들어, 메토트렉세이트 (MTX)에 대한 내성을 부여해 주는 효소; 프롤린, 또는 항생제 마커, 예를 들어, 항생제, 예컨대: 히그로마이신, 네오마이신 (G418), 제오신, 푸로마이신, 또는 블라스티시딘에 대한 내성을 부여해 주는 효소를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 선별 마커는 셀렉시스(Selexis) 선별 시스템 [예를 들어, 셀렉시스 SA로부터 상업적으로 이용가능한 SURE테크놀로지 플랫폼(SUREtechnology Platform)™ 및 셀렉시스 제네틱 엘리먼츠(Selexis Genetic Elements)™] 또는 카탈란트(Catalant) 선별 시스템을 포함하거나 또는 이와 화합성이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 본원에 기재된 재조합 산물을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포(들)를 확인하는데 유용한 선별 마커를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 선별 마커는 본원에 기재된 바와 같이, 재조합 산물을 코딩하는 핵산 서열을 게놈 내로 통합시킨 것을 포함하는 세포(들)를 확인하는데 유용하다. 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 통합된 세포(들)의 확인은 이러한 산물을 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주의 선별 및 조작에 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 산물은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 이하의 아미노산 잔기에서 표 1-4로부터의 폴리펩티드와 상이하다. 또 다른 실시양태에서, 산물은 그의 아미노산 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 15% 이하에서 표 2 또는 3으로부터의 폴리펩티드와 상이하다. 퍼센트 동일성을 결정하는 방법은 상기에 논의된다.
다른 재조합 산물은 비-항체 스캐폴드 또는 대체 단백질 스캐폴드, 예컨대, DARPin, 애피바디 및 애드넥틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
다른 예시적인 치료용 또는 진단용 단백질은 문헌 [Leader et al., "Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification", Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7:21-39]의 표 1-10에 기재되고, 문헌 [Walsh, "Biopharmaceutical benchmarks 2014", Nature Biotechnology, 2014, 32:992-1000] (각각 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같은 임의의 단백질; 또는 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드의 임의의 접합체, 변이체, 유사체 또는 기능적 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
환원 및 산화
전자가 특정 화합물로부터 기증되거나 또는 제거되는 환원 및 산화 반응 (산화환원 반응)은 생물학적 시스템에서 통상적이다. 일련의 조건 하에 산화환원 반응에서 전자를 포기하거나 또는 전자를 획득하는 경향은 특정 화합물의 산화환원 전위에 의해 설명될 수 있다. 산화환원 전위 (ΔE)는 볼트 (V) 또는 밀리볼트 (mV)로 측정된다. 산화환원 전위는 개별 화합물, 예를 들어, 단백질에 대해 계산될 수 있고, 이러한 경우에 산화환원 전위는 전자에 대한 상기 화합물의 친화성을 설명하며; 산화환원 전위가 더 양성일수록, 전자를 획득하는 경향이 더 커지고, 산화환원 전위가 더 음성일수록, 전자를 포기하는 경향이 더 커진다. 화합물 외에도, 용액, 세포 소기관, 및 세포 또한, 산화환원 전위로서 나타낸 전자를 획득 또는 상실하는 경향을 가질 수 있다.
세포는 그의 산화환원 전위를 조절하기 위해 여러 가지 시스템을 이용한다. 인간 내의 티오레독신 시스템은 2개의 단백질, 즉 Trx1 및 Trx2를 포함한다. Trx 단백질은 낮은 산화환원 전위를 가지며 단백질 디술피드 결합을 환원시키고; 이러한 환원 반응은 NADPH로부터의 전자를 이용하는 티오레독신 리덕타제 (TrxR)에 의해 촉매된다.
Trx-S2 + NADPH + H+ → Trx-(SH)2 + NADP+
단백질-S2 + Trx-(SH)2 → 단백질-(SH)2 + Trx-S2. 글루타레독신 시스템은 글루타레독신, 글루타티온, 및 NADPH 의존성 글루타티온 리덕타제로 이루어진다. 글루타레독신 시스템은 글루타티온을 사용하여 단백질 디술피드 결합을 환원시키고, 이 글루타티온은 NADPH의 소모에 따라 그의 환원된 상태로 되돌아간다. 글루타레독신은 디티올 메카니즘:
R-S2 + Grx-(SH)2 → R-(SH)2 + Grx-S2
Grx-S2 + 2GSH → Grx-(SH)2 + GSSG
또는 모노티올 메카니즘:
R-S-SG + Grx(SH)2 → R-SH + Grx-S-SG
Grx-S-SG + GSH → Grx-(SH)2 + GSSG
중 하나에 의해 단백질 티올 기를 환원시킨다.
산화환원 반응, 전위, 및 산화환원 반응/전위의 조절 또는 제어 방법에 관한 추가의 정보에 대해서는, 예를 들어, 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Holmgren et al. Biochem Soc Trans. 2005 Dec;33(Pt 6):1375-7; Nordberg and Arner. Free Radic Biol Med. 2001 Dec 1;31(11):1287-312; Ghezzi P. Biochem Soc Trans. 2005 Dec;33(Pt 6):1378-81; Ivarsson et al. Diabetes. 2005 Jul;54(7):2132-42; Sen, CK. Biochem Pharmacol 55 (11), 1747-1758. 1998 Jun 01; and May et al. J Biol Chem. 1997 Sep 5;272(36):22607-10;Molteni, S. N., et al. (2004). "Glutathione limits Ero1-dependent oxidation in the endoplasmic reticulum." Journal of Biological Chemistry 279(31): 32667-32673; Kojer, K. and J. Riemer (2014). "Balancing oxidative protein folding: The influences of reducing pathways on disulfide bond formation." Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 1844(8): 1383-1390; Hanschmann, E.-M., et al. (2013). "Thioredoxins, Glutaredoxins, and Peroxiredoxins-Molecular Mechanisms and Health Significance: from Cofactors to Antioxidants to Redox Signaling." Antioxidants & Redox Signaling 19(13): 1539-1605; Chakravarthi, S., et al. (2006). "The role of glutathione in disulphide bond formation and endoplasmic-reticulum-generated oxidative stress." EMBO Reports 7(3): 271-275; Flohe, L. (2013). "The fairytale of the GSSG/GSH redox potential." Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects 1830(5): 3139-3142; and Banhegyi, G., et al. (2007). "Stress on redox." FEBS Letters 581(19): 3634-3640 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)].
산화환원 전위는 세포에 의해 이용된 산화환원 조절 시스템과 독립적으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 용액 중 산소의 수준을 조정함으로써, 화합물, 예를 들어, 산물, 예를 들어, 단백질의 산화환원 전위를 조정할 수 있다. 용액 중 산소의 수준을 증가시키는 것, 예를 들어, 용액이 산화를 선호하게 만드는 것은 산물, 예를 들어, 단백질의 산화환원 전위를 증가시킨다. 산물, 예를 들어, 단백질의 산화환원 전위를 증가시키는 것은 산물, 예를 들어, 단백질의 디술피드 결합이, 더 낮은 산화환원 전위 하에서의 산물, 예를 들어, 단백질과 비교하여 환원될 가능성을 감소시킬 수 있다.
생산 적용
본원에 개시된 산물, 예를 들어, 산물 변이체의 제조 방법을 이용하여 생물반응기 또는 프로세싱 용기 또는 탱크, 또는 보다 일반적으로 임의의 공급원을 수반한 생물반응기 또는 프로세싱 용기 또는 탱크에서 사용하기 위한, 각종 산물을 생산할 수 있거나, 다양한 세포주를 평가할 수 있거나, 또는 다양한 세포주의 생산을 평가할 수 있다. 본원에 기재된 장치, 시설 및 방법은 원핵 및/또는 진핵 세포주를 포함한 목적하는 어떠한 세포주를 배양하는데에도 적합하다. 추가로, 실시양태에서, 상기 장치, 시설 및 방법은 현탁 세포 또는 고정-의존성 (부착) 세포를 배양하는데 적합하고, 제약 및 바이오의약품 산물 - 예컨대 폴리펩티드 산물 또는 세포 및/또는 바이러스, 예컨대 세포성 및/또는 바이러스 요법에 사용된 것의 생산을 위해 구성된 생산 작업에 적합하다.
언급된 바와 같이, 실시양태에서, 장치, 시설 및 방법은 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포 또는 하등 진핵 세포, 예컨대 예를 들어 효모 세포 또는 섬유상 진균 세포, 또는 원핵 세포, 예컨대 그램 양성 또는 그램 음성 세포 및/또는 진핵 또는 원핵 세포의 산물, 예를 들어, 대규모 방식으로 진핵 세포에 의해 합성된 단백질, 펩티드, 항생제, 아미노산의 생산을 허용해 준다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 상기 장치, 시설, 및 방법은 벤치 규모, 파일럿 규모 및 전체 생산 규모 용량을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 목적하는 용적 또는 생산 용량을 포함할 수 있다.
더욱이 및 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 상기 장치, 시설, 및 방법은 교반 탱크, 에어리프트, 섬유, 마이크로섬유, 속이 빈 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층, 고정층, 및/또는 분류층 생물반응기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 반응기(들)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "반응기" 또는 "생물반응기"는 발효기 또는 발효 유닛, 또는 임의의 다른 반응 용기를 포함할 수 있고, 용어 "반응기" 및 "생물반응기"는 "발효기"와 상호 교환적으로 사용된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 생물반응기 유닛은 하기 중 하나 이상, 또는 모두를 수행할 수 있다: 영양소 및/또는 탄소원의 공급, 적합한 기체 (예를 들어, 산소)의 주사, 발효 또는 세포 배양 배지의 유입 및 배출 흐름, 기체상과 액체상의 분리, 온도의 유지, 산소 및 CO2 수준의 유지, pH 수준의 유지, 진탕 (예를 들어, 교반), 및/또는 클리닝/멸균. 예시적인 반응기 유닛, 예컨대 발효 유닛은 유닛 내에 다수의 반응기를 함유할 수 있고, 예를 들어 유닛은 각각의 유닛 내에 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개, 또는 그 초과의 생물반응기를 가질 수 있고/있거나 특정 시설은 이러한 시설 내에 단일 또는 다수의 반응기를 갖는 다수의 유닛을 함유할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 생물반응기는 배치식, 반 공급 배치식, 공급 배치식, 관류, 및/또는 연속식 발효 프로세스에 적합할 수 있다. 임의의 적합한 반응기 직경이 사용될 수 있다. 실시양태에서, 생물반응기는 약 100 mL 내지 약 50,000 L의 용적을 가질 수 있다. 비제한적 예는 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터, 및/또는 50,000 리터의 용적을 포함한다. 부가적으로, 적합한 반응기는 다회용, 일회용, 일회용, 또는 비-일회용일 수 있고, 금속 합금, 예컨대 스테인레스 스틸 (예를 들어, 316 L 또는 임의의 다른 적합한 스테인레스 스틸) 및 인코넬, 플라스틱, 및/또는 유리를 포함한 임의의 적합한 재료로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응기는 원형, 예를 들어, 원통형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응기는 정사각형, 예를 들어, 직사각형일 수 있다. 정사각형 반응기는 일부 경우에, 원형 반응기에 비해 혜택, 예컨대 사용의 용이성 (예를 들어, 통상의 기술자에 의한 로딩 및 설정), 반응기 내용물의 더 큰 혼합 및 균질성, 및 더 낮은 바닥 면적을 제공할 수 있다.
실시양태에서 및 본원에 달리 언급되지 않는 한, 특정 제제의 제조 방법을 이용하여 사용하기 위한 본원에 기재된 장치, 시설, 및 방법은 또한, 달리 언급되지 않는 임의의 적합한 유닛 작업 및/또는 장비, 예컨대 이러한 산물의 분리, 정제, 및 단리를 위한 작업 및/또는 장비를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 시설 및 환경, 예컨대 전통적인 스틱 내장 시설, 모듈형, 모바일 및 임시 시설, 또는 임의의 다른 적합한 구조물, 시설, 및/또는 레이아웃을 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 모듈형 클린 룸을 사용할 수 있다. 부가적으로 및 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 장치, 시스템, 및 방법은 단일 장소 또는 시설에 들여 놓고/놓거나 수행될 수 있거나, 또는 또 다른 한편으론, 별도의 또는 다수의 장소 및/또는 시설에 들여 놓고/놓거나 수행될 수 있다.
비-제한적인 예로서 제한없이, 미국 공보 번호 2013/0280797; 2012/0077429; 2011/0280797; 2009/0305626; 및 미국 특허 번호 8,298,054; 7,629,167; 및 5,656,491 (이들 전문이 본원에 참조로 포함된다)에는 적합할 수 있는 시설, 장비, 및/또는 시스템의 예가 기재된다.
생물반응기 설정 및 조건
한 측면에서, 본 개시내용의 생물반응기 또는 본 개시내용의 방법에 의해 활용된 생물반응기는 일회용 생물반응기이다.
이러한 일회용 생물반응기는 바이오프로세스 컨테이너, 쉘, 적어도 하나의 진탕기, 적어도 하나의 스파저, 스파저(들) 및 헤드 스페이스 오버레이를 위한 적어도 하나의 기체 필터 유입 포트, 적어도 하나의 충전 포트, 적어도 하나의 수거 포트, 적어도 하나의 샘플 포트, 및 적어도 하나의 프로브를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 바이오프로세스 컨테이너를 포함하는 생물반응기에 관한 것이다. 이러한 바이오프로세스 컨테이너는 액체 불투과성 및 가요성 형상 부합 재료로 제조된다. 예를 들어, 상기 바이오프로세스 컨테이너는 가요성 필름, 예컨대 다층 필름으로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 이러한 필름은 폴리에틸렌 중합체, 예컨대 친수성 표면을 형성하도록 변형시킨 저밀도 폴리에틸렌으로 구성된다. 친수성 표면은 생물반응기 내의 세포 배양물과 접촉하기 위한 것이고 습윤성을 개선시킨다. 한 실시양태에서, 폴리에틸렌 중합체는 방사선 조사, 광 또는 플라스마 유도, 또는 산화의 영향을 받음으로써 변형된다.
바이오프로세스 컨테이너는 상부, 하부 및 이들 사이에 적어도 하나의 측벽을 가질 수 있다. 바이오프로세스 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 속이 빈 인클로저를 규정할 수 있다. 속이 빈 인클로저는 임의의 적합한 용적, 예컨대 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터, 및/또는 50,000 리터를 가질 수 있다.
생물반응기는 재료를 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저 내로 공급하기 위한 적어도 하나의 유입 포트를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 진탕기와 커플링된 회전축을 포함하는 혼합 장치가 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저 내로 연장될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 회전축은 접을 수 있다. 예를 들어, 회전축은 이러한 회전축을 향해 접을 수 있거나 또는 폴딩가능한 친수성 중합체 재료로 제조된 적어도 하나의 임펠러를 포함할 수 있다.
생물반응기는 또한, 세로 방향으로 바이오프로세스 컨테이너의 측벽에 인접하여 연장되도록 구성된 적어도 하나의 배플을 포함할 수 있다. 배플은 혼합 장치에 의한 배양 배지의 혼합 동안 속이 빈 인클로저 내의 유체 흐름에 영향을 줄 만큼 충분한 양으로 측벽으로부터 방사상 내측으로 연장되는 형상을 가질 수 있다. 배플은 접을 수 있고/있거나 폴딩 가능할 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 배플은 팽창가능한 유체 블래더를 규정하여 배플이 팽창되고 수축될 수 있게 한다. 배플은 바이오프로세스 컨테이너와 일체형일 수 있으며, 이는 배플이 가요성 형상 형성 재료로 형성된다는 것을 의미한다. 또 다른 한편으론, 배플은 바이오프로세스 컨테이너로부터 분리될 수 있다. 배플은 속이 빈 인클로저 내부에 배치되도록 구성될 수 있거나 또는 속이 빈 인클로저 외부에 배치될 수 있다. 속이 빈 인클로저 외부에 배치되는 경우, 바이오프로세스 컨테이너의 측벽은 배플의 형상을 준수한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 배플은 외부 금속 쉘에 제거 가능하게 부착될 수 있다. 바이오프로세스 컨테이너는 배플의 형상을 준수하기 위하여 금속 쉘 내에 배치될 수 있다. 생물반응기는 한 실시양태에서, 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저의 원주 둘레에 이격된 약 2개 내지 약 6개의 배플을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 바이오프로세스 컨테이너는 특정 직경을 가지며, 하나 이상의 배플은 바이오프로세스 컨테이너의 직경의 약 3% 내지 약 20%, 예컨대 약 5% 내지 약 15%의 거리 내측으로 방사상 연장된다.
생물반응기는 적어도 하나의 스파저를 추가로 포함할 수 있다. 스파저는, 예를 들어, 세로방향 부분과 측방향 부분을 갖는 기체 튜브를 포함하는 밸러스트 스파저를 포함할 수 있다. 세로방향 부분은 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저 내로 수직으로 연장될 수 있다. 측방향 부분은 다른 한편으로는, 진탕기 아래의 세로방향 부분의 단부에 위치될 수 있다. 측방향 부분은 기체를 바이오프로세스 컨테이너 내에 함유된 배양 배지 내로 방출시키기 위한 복수개의 구멍을 규정할 수 있다. 한 실시양태에서, 복수개의 구멍이 뚫린다. 측방향 부분은 임의의 적합한 형상을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 측방향 부분은 회전축을 안정화시키기 위하여 혼합 장치의 회전축과 맞물리도록 구성될 수 있다. 이러한 회전축은 측방향 부분을 통하여 연장될 수 있거나 또는 측방향 부분으로 형성된 구성원을 수용하는 축 내에 들여 놓을 수 있다.
한 실시양태에서, 생물반응기는 제1 표면 아래 스파저 및 제2 표면 위 스파저를 포함한다. 표면 아래 스파저 내의 복수개의 구멍은 표면 위 스파저 상의 복수개의 구멍보다 더 크거나 더 작을 수 있다. 한 실시양태에서, 복수개의 구멍이 뚫린다.
한 실시양태에서, 생물반응기는 유체를 바이오프로세스 컨테이너 내로 공급하기 위하여 속이 빈 인클로저 내로 연장되는 적어도 하나의 공급 라인을 포함할 수 있다. 이러한 공급 라인은 진탕기에 인접하여 위치설정된 표면 아래 유체 출구를 포함할 수 있다. 유체 출구는 유체가 유체 출구로부터만 흐를 수 있게 해주고 그 반대 방향으로는 흐르지 못하게 하는 유체 제어 장치와 연합될 수 있다. 예를 들어, 유체 제어 장치는 한쪽 방향으로만 흐를 수 있는 밸브를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 생물반응기는 바이오프로세스 컨테이너의 상부에 위치설정된 공급 라인을 포함할 수 있다. 이러한 공급 라인은 바이오프로세스 컨테이너에 상주하는 일정 용적의 배양 배지 위에 위치설정된 표면 위 유체 배출물을 포함할 수 있다. 이러한 표면 위 유체 배출물은 유체 배출물을 통해 흐르는 유체가 바이오프로세스 컨테이너 내에 함유된 배양 배지와 직접적으로 접촉하게 만들도록 위치될 수 있다. 한 실시양태에서, 진탕기는 회전될 때 원주를 형성할 수 있고, 공급 라인의 표면 위 유체 배출물은 진탕기의 원주 위에 위치설정될 수 있으므로, 유체 배출물을 통해 흐르는 유체가 원주 내의 배양 배지와 접촉하게 된다.
생물반응기는 속이 빈 인클로저 내에 함유된 대량의 배양 배지를 표시하기 위하여 로드 셀과 작동적으로 연합하여 배치될 수 있다. 바이오프로세스 컨테이너의 하부는 배수를 촉진시키기 위한 돔 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 바이오프로세스 컨테이너는 바이오프로세스 컨테이너의 하부에 위치한 드레인 라인을 포함할 수 있다. 유체 수집 장치는 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저와 드레인 라인 사이에 위치설정될 수 있다. 유체 수집 장치는 바이오프로세스 컨테이너로부터 드레인 라인 내로의 유체의 와류를 유도시키도록 구성된 형상을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 드레인 라인은 속이 빈 인클로저의 용적에 비례하는 단면적을 갖는다. 예를 들어, 예시적인 목적을 위해, 드레인 라인은 속이 빈 인클로저의 용적 리터당 약 0.3 mm2 내지 약 0.7 mm2, 예컨대 약 0.4 mm2 내지 약 0.6 mm2의 단면적을 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 바이오프로세스 컨테이너는 유체를 바이오프로세스 컨테이너로 공급하기 위하여 복수개의 보급 라인과 연결하기 위한 복수개의 포트를 포함할 수 있다. 각각의 포트 및 상응하는 보급 라인은 사용자가 보급 라인을 각각의 포트에 연결하는 것을 도와주기 위한 매칭 표시기를 포함할 수 있다. 이러한 매칭 표시기는, 예를 들어, 색을 포함할 수 있어, 각각의 포트 및 상응하는 보급 라인이 색 코딩된다. 매칭 표시가 공급 라인 및 임의의 상응하는 포트, 및 스파저 및 임의의 상응하는 커넥터에 적용될 수 있다.
한 실시양태에서, 바이오프로세스 컨테이너는 범용 커넥터를 포함하는 포트를 포함할 수 있다. 이러한 포트는 제1 말단과 제2 말단을 가질 수 있다. 제1 말단은 각각의 보급 라인에 대한 재연결가능한 부착을 형성하기 위한 것일 수 있다. 각각의 보급 라인은 상응하는 포트로부터 상류에 위치설정된 유체 필터를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 생물반응기 시스템에 관한 것이다. 이러한 생물반응기 시스템은 액체 불투과성 및 가요성 형상 부합 재료로 제조된 바이오프로세스 컨테이너를 포함할 수 있다. 바이오프로세스 컨테이너는 상부, 하부 및 이들 사이에 적어도 하나의 측벽을 가질 수 있다. 바이오프로세스 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 속이 빈 인클로저를 규정할 수 있다. 바이오프로세스 컨테이너는 또한, 재료들을 속이 빈 인클로저 내로 공급하기 위한 복수개의 유입 포트를 포함할 수 있다. 드레인 라인은 유체를 배수하기 위하여 바이오프로세스 컨테이너의 하부에 위치설정될 수 있다. 혼합 장치가 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저 내로 연장될 수 있고, 적어도 하나의 진탕기와 커플링된 회전축을 포함할 수 있다.
상기 생물반응기 시스템은 속이 빈 인클로저 내의 적어도 하나의 파라미터를 모니터링하기 위하여 바이오프로세스 컨테이너와 작동적으로 연합되는 적어도 하나의 센서를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 센서는 pH 센서, 용존된 이산화탄소 센서, 용존 산소 센서, 산화환원 센서, 로드 셀, 온도 센서, 또는 타코미터를 포함할 수 있다. 제어기는 적어도 하나의 센서와 연통하여 배치될 수 있다. 제어기는 적어도 하나의 센서로부터의 정보를 수용하도록 구성될 수 있고, 이러한 정보에 근거하여, 속이 빈 인클로저 내에 함유된 배양 배지의 적어도 하나의 파라미터를 미리 설정된 한계치 내에 유지하기 위하여 유체 보급으로부터 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저 내로의 유체의 유속을 다양하게 하기 위해 유체 보급을 제어하도록 구성될 수 있다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 생물반응기 시스템은 바이오프로세스 컨테이너와 유체 연통하는 이산화탄소 기체 보급, 및 바이오프로세스 컨테이너와 또한 유체 연통하는 액체 알칼리 보급을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 센서는 pH 센서를 포함할 수 있고, 제어기는 pH를 선택적으로 저하시키기 위하여 이산화탄소 기체 보급으로부터 일정량의 이산화탄소 기체를 부가하거나 또는 pH를 선택적으로 증가시키기 위하여 액체 알칼리 보급으로부터 일정량의 알칼리를 부가함으로써 배양 배지의 pH 수준을 미리 설정된 한계치 내에서 조절하도록 설정될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 시스템은 둘 다 제어기와 연통하는 제1 pH 센서와 제2 pH 센서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 실시양태에서, 생물반응기 시스템은 산소 기체 보급을 포함할 수 있고, 적어도 하나의 센서는 용존 산소 센서를 포함할 수 있다. 제어기는 용존 산소 센서로부터 수용된 정보에 근거하여 일정량의 산소 기체를 산소 기체 보급으로부터 배양 배지로 주기적으로 부가함으로써 배양 배지 내의 용존 산소 수준을 미리 설정된 한계치 내에서 조절할 수 있다.
또한 또 다른 실시양태에서, 생물반응기 시스템은 이산화탄소 기체 보급을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 센서는 용존된 이산화탄소 센서를 포함한다. 제어기는 용존된 이산화탄소 센서로부터 수용된 정보에 근거하여 일정량의 이산화탄소 기체를 이산화탄소 기체 보급으로부터 배양 배지로 주기적으로 부가함으로써 배양 배지 내의 용존된 이산화탄소 수준을 미리 설정된 한계치 내에서 조절하도록 구성될 수 있다.
또한 또 다른 실시양태에서, 생물반응기 시스템은 바이오프로세스 컨테이너를 둘러싸는 열 재킷을 포함할 수 있다. 이러한 열 재킷은 가열된 유체 또는 냉각된 유체 중 적어도 하나와 유체 연통될 수 있다. 생물반응기 시스템은 바이오프로세스 컨테이너 내에 함유된 배양 배지의 온도를 감지하기 위한 온도 센서를 추가로 포함할 수 있다. 온도 센서는 제어기와 연통될 수 있다. 제어기는 온도 센서로부터의 정보를 수용하도록 구성될 수 있고, 이러한 정보에 근거하여, 배양 배지를 미리 설정된 온도 한계치 내에 유지하기 위하여 바이오프로세스 컨테이너 내에 함유된 배양 배지의 온도를 증가 또는 감소시키기 위하여 열 재킷 내로의 유체의 흐름을 제어하도록 구성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 생물반응기 시스템은 적어도 하나의 진탕기와 커플링된 회전축의 회전 속도를 모니터링하기 위한 타코미터를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 타코미터는 제어기와 연통될 수 있다. 제어기는 축을 회전시키는 모터와 연통될 수 있다. 제어기는 타코미터로부터 수용된 정보에 근거하여 미리 결정된 속도로 축을 회전시키는 방식으로 모터를 제어하도록 구성될 수 있다.
제어기는 하나 이상의 마이크로프로세서를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 제어기는 생물반응기 내의 다수의 파라미터를 제어하기 위해 다수의 센서로부터의 정보를 수용하도록 구성될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 센서 중 하나 이상은 바이오프로세스 컨테이너 내로 통합될 수 있고, 바이오프로세스 컨테이너와 함께 처분될 수 있다.
본 개시내용은 또한, 액체 불투과성 및 가요성 형상 부합 재료로 제조된 바이오프로세스 컨테이너를 포함하는 생물반응기에 관한 것이다. 바이오프로세스 컨테이너는 상부, 하부 및 이들 사이에 적어도 하나의 측벽을 가질 수 있다. 바이오프로세스 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 속이 빈 인클로저를 규정할 수 있다. 적어도 하나의 공급 라인은 유체를 바이오프로세스 컨테이너 내로 공급하기 위하여 속이 빈 인클로저 내로 연장될 수 있다.
한 실시양태에서, 공급 라인은 진탕기에 인접하여 위치설정된 표면 아래 유체 출구를 포함한다. 이러한 유체 출구는 유체가 유체 출구로부터만 흐를 수 있게 해주고 그 반대 방향으로는 흐르지 못하게 하는 유체 제어 장치와 연합될 수 있다.
대체 실시양태에서, 공급 라인은 바이오프로세스 컨테이너에 상주하는 일정 용적의 배양 배지 위에 위치설정된 표면 위 유체 배출물을 포함할 수 있다. 이러한 표면 위 유체 배출물은 유체 배출물을 통해 흐르는 유체가, 측벽과 접촉하지 않으면서도 바이오프로세스 컨테이너 내에 함유된 배양 배지와 직접적으로 접촉하게 만들도록 위치될 수 있다.
한 실시양태에서, 생물반응기는 표면 아래 유체 출구를 포함하는 제1 공급 라인 및 표면 위 유체 배출물을 포함하는 제2 공급 라인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 생물반응기는 표면 위 유체 배출물을 갖는 약 1개 내지 약 5개, 예컨대 약 2개 내지 약 3개의 공급 라인을 함유할 수 있다.
또한 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 일회용 생물반응기를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 액체 불투과성 및 가요성 형상 부합 재료로부터 바이오프로세스 컨테이너를 구축하는 단계를 포함한다. 바이오프로세스 컨테이너는 상부, 하부 및 이들 사이에 적어도 하나의 측벽을 가질 수 있다. 바이오프로세스 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 속이 빈 인클로저를 규정할 수 있다. 속이 빈 인클로저는 약 1-250 밀리리터, 250 밀리리터 내지 50 리터, 50 내지 800 리터, 또는 800-200,000 리터의 용적을 가질 수 있다. 바이오프로세스 컨테이너는 재료들을 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저 내로 공급하기 위한 복수개의 유입 포트를 포함한다. 각각의 유입 포트는 특정 직경을 갖는다.
혼합 장치가 속이 빈 인클로저 내로 삽입된다. 이러한 혼합 장치는 적어도 하나의 진탕기와 커플링된 회전축을 포함한다. 적어도 하나의 스파저가 또한, 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저 내로 삽입된다. 스파저는 세로방향 부분 및 측방향 부분을 갖는 기체 튜브를 포함한다. 세로방향 부분은 속이 빈 인클로저 내로 수직으로 연장된다. 측방향 부분은 진탕기 아래의 세로방향 부분의 단부에 위치한다. 측방향 부분은 바이오프로세스 컨테이너 내에 함유된 배양 배지 내로 기체를 방출시키기 위한 복수개의 구멍을 규정한다. 복수개의 구멍은 특정 직경을 갖는다.
드레인 라인이 바이오프로세스 컨테이너의 하부에 연결된다. 이러한 드레인 라인은 특정 단면적을 갖는다.
본 개시내용에 따라서, 유입 포트의 직경, 스파저 상의 복수개의 구멍의 직경, 및 드레인 라인의 단면적은 속이 빈 인클로저의 용적에 비례한다. 드레인 라인은, 예를 들어, 속이 빈 인클로저의 용적 리터당 약 0.3 mm2 내지 약 0.7 mm2의 단면적을 가질 수 있다.
본 개시내용은 또한, 액체 불투과성 및 가요성 형상 부합 재료로 제조된 바이오프로세스 컨테이너를 포함하는 생물반응기에 관한 것이다. 바이오프로세스 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 속이 빈 인클로저를 규정할 수 있고, 적어도 하나의 유입 포트를 포함할 수 있다. 복수개의 진탕기와 커플링된 회전축을 포함하는 혼합 장치는 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저 내로 연장될 수 있다.
본 개시내용에 따라서, 생물반응기는 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저와 유체 연통하는 세포 보유 챔버를 추가로 포함할 수 있다. 여과물 출구가 세포 보유 챔버와 유체 연통하여 배치될 수 있다. 이러한 여과물 출구는 액체에는 투과성이지만 배양 배지 내에 함유된 생물학적 재료에 대해서는 불투과성인 바이오필터를 포함한다. 여과물 출구는 액체를 세포 보유 챔버로부터 연속적으로 또는 주기적으로 제거하기 위한 것이다. 흐름 조절기는 관류 프로세스를 수행하기 위하여 배양 배지가 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저와 세포 보유 챔버 사이를 교대로 흐르도록 구성된다.
흐름 조절기는, 예를 들어, 가압 기체 공급원 및 진공 공급원과 연통될 수 있다. 흐름 조절기는 유체가 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저와 세포 보유 챔버 사이를 앞뒤로 재순환하기 위하여 세포 보유 챔버 내에 함유된 유체에 진공 또는 기체 압력을 교대로 가하도록 구성될 수 있다.
한 실시양태에서, 흐름 조절기는 압력을 가하는 것과 세포 보유 챔버 내에 함유된 유체에 흡인력을 가하는 것 사이에서 교대하는 왕복 운동 다이어프램을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한, 액체 불투과성 및 가요성 형상 부합 재료로 제조된 바이오프로세스 컨테이너를 포함하는 생물반응기에 관한 것이다. 바이오프로세스 컨테이너는 배양 배지를 수용하기 위한 속이 빈 인클로저를 규정한다. 적어도 하나의 진탕기와 커플링된 회전축을 포함하는 혼합 장치는 바이오프로세스 컨테이너의 속이 빈 인클로저 내로 연장될 수 있다. 본 개시내용에 따라서, 진탕기는 회전축 상으로 접을 수 있다. 예를 들어, 진탕기는 적어도 하나의 블레이드 요소를 포함하는 임펠러를 포함할 수 있다. 이러한 블레이드 요소는 회전축을 향해 폴딩 가능할 수 있다. 한 실시양태에서, 회전축은 제1 임펠러 및 제2 임펠러와 커플링되고, 양쪽 임펠러는 폴딩가능한 적어도 하나의 블레이드 요소를 포함할 수 있다. 리테이닝 링이 상기 축 상에 위치설정될 수 있다. 이러한 리테이닝 링은 진탕기를 혼합 동안 똑바로 선 자세로 유지하거나 또는 접히고 폴딩된 자세로 유지하기 위하여 진탕기 맞물린 위치 및 진탕기 맞물림 해제 위치를 각각 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 회전축은 축 슬리브에 의해 둘러싸인 금속 철근을 포함한다. 스테인레스 스틸로 제조될 수 있는 금속 철근은 함께 부착되어 있는 다수의 조각으로 제조될 수 있다. 철근의 상부는 모터와 자기적으로 맞물리기 위한 자기 구성원을 포함할 수 있다. 축 슬리브는 중합체성 재료로 구성될 수 있다. 이러한 축 상의 진탕기는 또한, 중합체성 재료, 예컨대 친수성 중합체로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 축 슬리브 및 진탕기는 방사선 조사, 광 또는 플라스마 유도, 또는 산화의 영향을 받음으로써 변형된 폴리에틸렌 중합체를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따르는 일회용 생물반응기 시스템은 하기를 포함한다: 일회용 세포 배양 바이오프로세스 컨테이너 ("SUB"), 작동 동안 SUB가 유지되는 재사용가능한 쉘, 및 SUB의 작동 및 연관된 서브-시스템 및 프로세스를 제어하는 제어기. 연관된 서스-시스템은 진탕 시스템, 배플 시스템, 스파저 시스템, 공급 시스템, 수거 시스템, 모니터링 시스템, 제어 시스템(들), 및 충전 시스템을 포함한다.
한 실시양태에서, SUB의 표면과 접촉하는 세포 배양물 및 이러한 표면과 접촉하는 프로세스 유체 각각은 바람직하게, 동물 유래 구성성분이 없다.
본 개시내용의 한 측면에 따라서, 일회용 생물반응기가 제공된다. 일회용 생물반응기는 바이오프로세스 컨테이너, 쉘, 적어도 하나의 진탕기, 적어도 하나의 스파저, 스파저(들) 및 헤드 스페이스 오버레이를 위한 적어도 하나의 기체 필터 유입 포트, 적어도 하나의 충전 포트, 적어도 하나의 수거 포트, 적어도 하나의 샘플 포트, 및 적어도 하나의 프로브를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일회용 생물반응기는 또한, 일회용 생물반응기 (SUB) 시스템과 함께 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 일회용 및 처분가능한 가요성 생물반응기 바이오프로세스 컨테이너, 가요성 생물반응기 바이오프로세스 컨테이너를 유지하도록 구성된 SUB 쉘, 진탕기, 스파저, 복수개의 포트, 및 SUB 시스템과 연합된 복수개의 파라미터를 제어하도록 구성된 적어도 하나의 제어기를 포함할 수 있으므로, SUB 시스템은 유사한 크기의 스테인레스 스틸 생물반응기에서 생산될 수 있는 생체 재료에 상응하는 생체 재료를 생산한다.
본 개시내용에 따라서, 회전축은 상부 임펠러 및 하부 임펠러와 커플링될 수 있다. 상부 임펠러와 하부 임펠러 둘 다는 중합체 재료로 제조될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 상기 임펠러는 3-D 프린트될 수 있다. 상부 임펠러와 하부 임펠러는 둘 다 친수성 표면을 규정할 수 있다. 예를 들어, 이들 임펠러를 형성하기 위해 사용된 중합체 재료는 친수성 중합체를 포함할 수 있거나, 또는 표면이 친수성이 되도록 표면 변형시킨 중합체를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 예를 들어, 상부 임펠러 및 하부 임펠러는 폴리올레핀 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌으로 제조된다. 한 실시양태에서, 저밀도 폴리에틸렌이 사용될 수 있다. 저밀도 폴리에틸렌은 친수성 표면을 형성하기 위해 방사선 조사, 광 또는 플라스마 유도, 또는 산화의 영향을 받음으로써 변형될 수 있다.
상부 임펠러는 히드로호일 임펠러를 포함할 수 있다. 하부 임펠러는 다른 한편으로는, 4개의 피치된-블레이드된 높은 고형성 임펠러를 포함할 수 있다. 임펠러 대 탱크 직경 비는 약 0.35 내지 약 0.55, 예컨대 약 0.44 내지 약 0.46일 수 있다. 상부 임펠러 및 하부 임펠러는 약 0.1 내지 약 0.9의 동력 수 (Np)를 가질 수 있고, 약 0.4 내지 약 0.9의 흐름 계수 (Nq)를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 생물반응기는 미국 특허 9,670,446 (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같은 생물반응기이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 생물반응기는 미국 특허 9,670,446에 기재된 생물반응기의 일부 또는 특징을 포함한다.
한 실시양태에서, 생물반응기는 수거 용기, 예를 들어, 수거 용기와 작동적으로 커플링될 수 있다. 이러한 수거 용기는 배양물과 기체 (예를 들어, 배양물을 통기시키기 위함)를 혼합하는 수단, 예를 들어, 배양물의 적정 산소공급을 보장하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 수거 용기는, 예를 들어, 생물반응기로부터 수거 용기 내에 침착되었던 상청액, 및 기체, 예를 들어, 공기, 산소, 또는 공기 및 산소의 혼합물을 포함하는 헤드 스페이스를 포함한다. 실시양태에서, 수거 용기는 헤드 스페이스 기체, 예를 들어 공기 또는 산소 또는 공기 및 산소 기체 혼합물을 사용하여 배양 상청액에 산소공급하기 위한 표면 통기를 이용한다. 표면 통기는 상청액을 J-튜브 유입 포트로부터 수거 용기 벽 아래로 캐스케이딩 또는 유동시키고, 헤드 스페이스와 접촉하여 상청액 액상 표면으로부터 캐스케이딩 또는 유동시키는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 이동 또는 캐스케이드 결과, 배양물의 산소공급 수준이 증가된다.
상기 수거 용기는 적어도 하나의 혼합기, 헤드 스페이스 오버레이를 위한 적어도 하나의 기체 필터 유입 포트, 용기 벽쪽으로 향한 내부 J-튜브가 장착된 적어도 하나의 충전 포트, 적어도 하나의 수거 포트, 적어도 하나의 샘플 포트, 적어도 하나의 온도 프로브, 적어도 하나의 산화환원 프로브, 적어도 하나의 DOT 프로브, 및 적어도 하나의 pH 프로브, 적어도 하나의 온도 제어, 적어도 하나의 기체 흐름, 예를 들어, 적어도 하나의 공기 흐름 제어 및 적어도 하나의 O2 흐름 제어를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 수거 용기는 40% 초과 공기 포화도 내지 500% 이하 공기 포화도의 범위로 DOT를 유지하는 공기/O2의 헤드 스페이스 기체 혼합물을 포함한다.
실시양태에서, 생물반응기 또는 수거 용기는 산화환원 프로브, 예를 들어, 인-라인 산화환원 프로브, 예를 들어, 메틀러 토레도 인-라인 산화환원 프로브를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법 또는 생물반응기 또는 수거 용기는 배양물 중의 또는 배양물 또는 배양 상청액의 세포 중의 산화환원 전위를 제공 또는 유지하기 위한 티오레독신 또는 글루타티온/글루타레독신 시스템의 구성성분을 제공하는 것, 예를 들어, 부가하거나, 또는 조절하는 것, 예를 들어, 이러한 구성성분의 활성/존재도를 증가 또는 감소시키는 것을 포함하거나 또는 이와 같이 할 수 있다. 티오레독신 및 글루타티온/글루타레독신 시스템 및 그의 구성성분은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Holmgren et al. Biochem Soc Trans. 2005 Dec;33(Pt 6):1375-7; Nordberg and Arner. Free Radic Biol Med. 2001 Dec 1;31(11):1287-312; Ghezzi P. Biochem Soc Trans. 2005 Dec;33(Pt 6):1378-81; Ivarsson et al. Diabetes. 2005 Jul;54(7):2132-42; Sen, CK. Biochem Pharmacol 55 (11), 1747-1758. 1998 Jun 01; and May et al. J Biol Chem. 1997 Sep 5;272(36):22607-10] 참조; 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시양태에서, 방법 또는 생물반응기 또는 수거 용기는 GILT (감마-인터페론-유도성 리소좀 티올 리덕타제)를 제공하는 것, 예를 들어, 부가하거나, 또는 조절하는 것, 예를 들어, GILT의 활성/존재도를 증가 또는 감소시키는 것을 포함하거나 또는 이와 같이 할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Rausch and Hastings. Mol Immunol. 2015 Dec;68(2 Pt A):124-8. doi: 10.1016/j.molimm.2015.06.008. Epub 2015 Jun 23; and Hastings and Cresswell. Antioxid Redox Signal. 2011 Aug 1; 15(3): 657-668] 참조; 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 실시양태에서, 방법 또는 생물반응기 또는 수거 용기는 성장 배양물에 아스코르브산, 데히드로아스코르브산, 또는 아스코르브산 또는 데히드로아스코르브산 변형 구성성분을 제공하는 것, 예를 들어, 부가하는 것을 포함하거나, 또는 이와 같이 할 수 있다. 아스코르브산 및 데히드로아스코르브산의 산화환원 전위 조절 특성은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Winkler et al. Free Radic Biol Med. 1994 Oct;17(4):333-49] 참조; 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시양태에서, 방법 또는 생물반응기는 생산 배양물에 세포내 작용제를 제공하는 것, 예를 들어, 산화환원 전위-표시 표지, 예를 들어, 산화환원-감수성 염료 또는 분자 프로브를 부가하는 것을 포함하거나, 또는 이와 같이 할 수 있다. 이러한 산화환원 전위-표시 표지는 배양물 또는 배양물 내의 세포의 산화환원 전위를 모니터링하는데 유용할 수 있다. 산화환원 전위-표시 표지는 2,2'-비피리딘 (Ru 착물), 니트로펜안트롤린 (Fe 착물), N-페닐안트라닐산, 1,10-펜안트롤린 철(II) 술페이트 착물 (페로인), N-에톡시크리소이딘, 2,2'-비피리딘 (Fe 착물), 5,6-디메틸펜안트롤린 (Fe 착물), o-디아니시딘, 소듐 디페닐아민 술포네이트, 디페닐벤지딘, 디페닐아민, 비올로겐, 소듐 2,6-디브로모페놀-인도페놀, 소듐 2,6-디클로로페놀-인도페놀, 소듐 o-크레솔 인도페놀, 티오닌 (라우트 바이올렛), 메틸렌 블루, 인디고테트라술폰산, 인디고트리술폰산, 인디고 카르민 (인디고디술폰산), 인디고모노 술폰산, 페노사프라닌, 사프라닌, 뉴트랄 레드, 본원에 포함된 임의의 문헌에 개시된 표지, 및 문헌 [Schwarzlaender M et al., Antioxid Redox Signal. 2016 May 1;24(13):680-712 (그 전문이 본원에 참조로 포함된다)]에 개시된 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, 방법 또는 생물반응기 또는 수거 용기는 생산 배양물에 세포외 작용제, 예를 들어, 대사물, 본원에 기재된 바와 같은 전이 상태 금속 이온을 제공하는 것을 포함하거나 또는 이와 같이 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 생물반응기(들)는 하기 원리에 따라서 설정될 수 있다:
- 생산 배양물을 수거하는 동안 생물반응기의 기능적 설정은 생물반응기에서 나가는 배양물에 산소가 잘 공급되고 용존 산소를 후속 프로세싱 단계로 운반하는 것을 보장하는데 중요하다. 일단 세포 배양물이 수거 단계를 개시하기 위한 표적 온도에 도달하면 생산 배양물의 산소공급에 길항할 것으로 예상되는 모든 프로세스 제어가 반드시 억제된다. 이는 활성인 경우에 스파징된 질소 기체 흐름을 억제하는 것, 활성인 경우에 요구에 따라 CO2 기체 흐름 제어를 억제하는 것, 활성인 경우에 요구에 따라 알칼리 제어를 억제하는 것, 및 활성인 경우에 공급물 적용을 억제하는 것을 포함할 수 있다.
- 질소 스파징 기체 흐름은 산소에 대한 세포 요구가 낮을 때 용존 산소 장력 (DOT)을 설정값으로 제어하기 위한 밸러스트로서 통상적으로 사용되지만, 생산 스테이지의 과정 동안 활동적으로 흐르게 유지될 수 있다. 질소는 또한, 에어리프트 생물반응기에서 이러한 용기에서의 혼합을 유지하기 위한 캐리어 밸러스트로서 사용된다. 그러나, 질소 스파징 기체를 사용하는 경우, 이는 수거 단계 동안 생산 배양물을 통기시키기 위해 사용되는 스파징된 기체의 산소 조성을 희석시키지 못하도록 억제시켜야만 하는데, 이는 이것이 배양물 중의 용존 산소, DOT가 100% 공기 포화도 (공기만을 스파징하는 경우) 또는 예상된 최대 DOT (공기 및 산소의 블렌드를 스파징하는 경우)에 도달하지 못하게 할 것이기 때문이다. 따라서, 스파징된 질소는 공기 단독의 소정의 스파징 또는 공기-산소 혼합물의 스파징에 대해 예상되는 최대 용존 산소 농도를 제한한다. CO2 기체 흐름은 제어 범위 위로 상승하는 프로세스 pH에 반응하여 생산 배양물 내로 스파징된다. CO2 기체 흐름 스파징이 활성인 경우, 이는 또한, 스파징 기체의 산소 조성을 희석시켜, 결국에는 공기 단독의 소정의 스파징 또는 공기-산소 혼합물의 스파징에 대해 예상되는 최대 용존 산소 농도를 제한한다. 따라서, 생산 배양물의 수거 동안의 그의 불활성화가 통기 스파징 기체의 희석을 방지시킨다.
- 제어 범위 아래로 떨어지는 프로세스 pH에 반응하여 생산 배양물에 알칼리 용액을 부가하는 것은 생산 배양물의 배양 동안 엄격한 pH 제어에 필요하다. 그러나, 지속적으로 작동 용적이 감소하고 알칼리 용액이 과다 투여되기 때문에 생산 배양물이 수거되는 동안 알칼리 용액의 적용으로 더 큰 세포 손상 및 세포 사멸의 잠재적 위험이 있다. 배양물이 활발하게 성장하고 대사하는 동안 생산 배양물에 공급물을 적용하는 것이 필요하다. 그러나, 수거 동안 지속적으로 감소하는 작동 용적은 생물반응기의 혼합 움직임에 영향을 미치고, 불충분하게 혼합된 용기에서 창출된 미세 환경 및 공급물의 비-생리학적 성질 (높은 삼투성 및 높거나 또는 낮은 pH)로 인하여 공급물 용액의 적용으로 더 큰 세포 손상 및 세포 사멸이 유발된다.
- 일단 생산 배양물이 수거 단계를 개시하기 위한 표적 온도에 도달하면 생산 배양물의 산소공급을 증진시킬 것으로 예상되는 모든 프로세스 제어가 반드시 활성화된다. 이는 활성이 아닌 경우에 스파징된 공기 및/또는 산소 기체 흐름의 활성화, 활성이 아닌 경우에 헤드 스페이스 공기 및/또는 산소 흐름의 활성화, 및 최종적으로 활성이 아닌 경우에 헤드 스페이스 압력의 활성화를 포함할 수 있다. 요구에 따른 공기 및/또는 산소 스파징 흐름은 일단 생산 배양물이 성장하는 것을 중지하거나, 또는 수거 준비를 갖추고 냉각될 때 매우 낮아지거나 또는 심지어 중지될 수 있다. 다양한 연속식 고정 유속 하에 공기 및 산소 스파징을 지속적으로 적용하는 것이 생산 배양물에 산소공급하고; 생산 배양물이 용존 산소를 세포 정화 필터 하우징 또는 원심 분리기 및 생물반응기기와 필터 하우징 또는 원심 분리기 사이의 흐름 경로 및 필터 하우징 또는 원심 분리기와 상청액 수집 용기 (예를 들어, 수거 용기) 사이의 흐름 경로 내로 운반하는 것을 보장하는데 결정적이다. 헤드 스페이스 또는 오버레이 통기는 전형적으로, 생산 배양물의 배양 동안 활성이고, 생물반응기 헤드 스페이스가 대사 CO2 기체를 반드시 지속적으로 스파징하도록 한다. 수거 동안 생산 배양물의 지속된 오버레이 통기는 스파징 기체로 달성된 것보다 비록 더 느림에도 불구하고 배양물의 표면 산소공급을 증진시키지만, 생산 배양물이 생물반응기로부터 소모되는 동안 거품이 생성되는 것을 피하게 해준다.
- 헤드 스페이스 압력으로 작동될 수 있는 생물반응기의 경우 및 생산 배양물의 배양 동안 압력을 사용하여 액체 상 (배양물) 내로의 기체의 더 큰 용해도를 지원하거나 또는 생물반응기 내에서 양성 압력을 유지하여 용기의 멸균 경계를 가로지르는 환경적 오염물의 진입을 방지시키는 경우에는, 이것이 수거 동안 유지되도록 하는 것이 권장된다. 실제로 수거가 압력에 의해 구동되는 경우, 생물반응기를 가압하는데 사용되는 기체가 공기 또는 공기 및 산소의 혼합 블렌드이면, 배양물 산소공급이 지원될 것이다. 그러나, 수거가 펌프에 의해 구동된다면, 헤드 스페이스 압력은 전형적으로 사용되지 않는다. 이러한 상황 하에서, 헤드 스페이스 압력을 공기 또는 공기/산소 기체 혼합물과 함께 사용하는 것이, 배양물이 수거 작업 동안 필요한 작업 규모에 따라 필요한 빠른 속도로 흐를 때 배양물 산소공급을 지원하고 수거 튜빙이 펌프 헤드의 흡인 헤드 상류 하에 붕괴되는 것을 방지하는데 유익하다.
- 일회용 생물반응기의 경우, 높은 유속에서 펌프 헤드의 상류에서 생성되는 흡인 하의 붕괴에 저항하는 내부 보어 크기 및 벽 강도를 기준으로 수거 라인을 설계하는 것이, 수거 유속이 튜브 폐색을 방해하지 않도록 보장하는데 중요하다. 튜브 폐색의 영향은 수거 유속을 제한하는 것뿐만 아니라 더 큰 세포 사멸 및 세포 용해 및 배양물로부터의 용존 산소의 탈기를 증진시킬 수 있다. 튜브 폐색 충격은 더 느린 유속에서 하우징 내의 체류 시간을 증가시키는 것을 통하여 필터 하우징으로 저산소상태/무산소상태 환경에 세포 및 산물을 노출시킬 수 있고, 수축된 개구부를 통과하는 더 큰 세포 사멸 및 세포 용해를 통한 세포내 인자의 방출을 증진시킬 수 있고, 흡인 영역 내에서의 탈기에 의해 용존 산소를 배양물로부터 제거하여 더 적은 양의 용존 산소가 배양물에 의해 필터 하우징 내로 운반될 수 있는 잠재력을 갖는다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 산물 안정성에 대한 이들 부정적인 영향을 피한다.
수거 튜빙의 내부 직경 및 사용되는 펌프의 선택은 심층 필터 또는 심층 필터와 커플링된 원심 분리기에 의한 세포 정화 단계에 대한 프로세스 용적 처리량 (필터 면적당 프로세스 상청액의 리터, L/m2)을 달성하기 위해 필요한 유속을 획득하도록 선택된다. 수거 라인의 구축 재료는 펌프 헤드의 상류에서 생성되는 흡인 헤드에서의 붕괴에 저항할 수 있는 강성을 가질 필요가 있다. 수거 튜빙의 구축에 사용될 흔히 사용되는 백금 경화 실리콘 또는 C-플렉스와 같은 재료가 제안된다. 편조된 튜빙의 사용이, 흔히 사용되는 재료에 대한 대안으로서 간주될 수 있다.
- 일부 실시양태에서, 방법 또는 생물반응기는 필터 정화 단계 동안 필터의 봉쇄 및 오염을 피하게 해주는 심층 필터 면적을 최적화하는 것을 포함하거나 또는 이와 같이 최적화할 수 있고; 그에 의해 필터 하우징 내에서의 세포 배양물의 체류 시간을 최소화하는 것은 생산 배양물의 산소공급을 보장하는 필수 단계이며, 배양물이 상청액으로서 흘러나가기 전에 필터 하우징에 흘러 들어가 상주하고 있는 동안 생물반응기로부터 운반되는 용존 산소는 소진되지 않는다. 더욱이, 유속은 정화 단계 (필터 하우징)와 상청액 수집 용기 (예를 들어, 수거 용기) 사이의 상청액의 체류 시간을 최소화하도록 적정해야 한다.
세포 정화 필터 (1차, 2차 및 3차) 면적은 필터를 가로지르는 플럭스 (L/m2/h) 또는 여과물 품질 [미립자의 파과를 통함]의 손실 없이 요구되는 프로세스 용적 처리량이, 1차 또는 스테이지 1 필터의 하류에 있는 2차 또는 스테이지 2 및 3차 또는 스테이지 3 필터의 성능에 강력한 영향을 미치는 정도로 반드시 충족되도록 최적화된다. 부가적으로, 최적의 세포 정화를 위해 선택된 필터 면적 및 필터 유형은 필터 오염 및 임박한 필터 봉쇄를 의미하는 상이한 필터 스테이지 사이의 더 높은 압력차를 피해야만 한다. 따라서, 일련으로 커플링된 상이한 필터를 가로지르는 플럭스의 감소는 필터 하우징 내의 체류 시간을 증가시킬 것이고, 필터 하우징 내의 상청액 중의 용존 산소의 더 많은 소모/소진을 유발시켜 상청액에서 저산소상태를 유발할 것으로 예상된다. 1차 스테이지 필터와 2차 스테이지 필터 사이의 더 높은 압력차의 형성은 또한, 활성일 때 산물을 탈안정화시키는 세포성 인자의 방출 및 더 높은 세포 용해를 증진시키므로 문제가 된다.
- 일부 실시양태에서, 방법 또는 생물반응기는 무세포 상청액이 잘 통기되고 혼합된 수거 용기 (스틸 또는 일회용)에서 수집되는 것을 보장하는 것을 포함하거나 또는 이와 같이 보장할 수 있다. 수거 용기는 하기를 통하여 우수한 표면 산소공급을 반드시 증진시키도록 설계된다: 여과물을 용기 벽 아래로 캐스케이드하도록 강제하는 용기 벽 쪽으로 향한 내부 노즐을 설계함으로써 수집된 여과물을 용기 벽 표면 위로 충돌시키는 것; 및/또는 여과물 수집 전에 수거 용기를, >40% 초과 공기 포화도 내지 ≤ 500% 공기 포화도로 수집된 여과물의 산소공급을 증진시키기 위해 공기 또는 공기 및 산소의 임의의 소정의 블렌드로 구성된 기체상의 환경으로 채울 수 있는 능력.
한 실시양태에서, 수거 용기는 스테인레스 스틸 수거 용기이다. 상청액 수집 방법 및 수거 용기의 설계는 수거 단계 동안 산물을 보호하는 접근법의 최종 요소이다. 현재에는, 수거된 상청액이 혼합기가 장착된 재킷이 달린 스테인레스 스틸 용기에 수집되어, 이와 같이 수집된 상청액이 지속적으로 혼합된다. 수거된 상청액은 내부 'J' 튜브가 장착된 헤드 스페이스 포트를 통해 수거 용기 내로 배출되어, 상청액의 스트림이 용기의 벽 위로 향하게 하고, 그로부터 상청액이 탱크의 하부에서 수집하기 위해 벽 아래로 캐스케이드된다. 부가적으로, 이러한 스테인레스 스틸 용기는 용기 멸균 경계를 가로지르는 환경 오염물의 진입을 방지하기 위해 스팀-인-플레이스 멸균된 후에 용기가 대기압 이상으로 압력을 유지하도록 멸균 공기로 채워진다. 이들 용기에 수집된 수거 상청액은 가압된 공기의 대기 하에 용기 벽 아래로 캐스케이드됨에 따라 산소공급된다고 가정된다. 상청액의 추가 산소공급은 수집된 상청액 위의 헤드 스페이스와의 표면 접촉을 통해 일어난다.
또 다른 실시양태에서, 수거 용기는 일회용 수거 용기이다. 일회용 상청액 수거 용기는 감마 조사된 진공 백이다. 상청액 수집 동안, 수집된 상청액 위에 기체상의 헤드 스페이스가 형성되지 않도록 상기 백에 진공을 채우고 옮긴다. 이들 봉지는 진탕기를 가지지 않으므로 수집된 상청액은 혼합될 수 없고, 상기 봉지는 수집된 상청액을 가열 또는 냉각시킬 수 없는 재킷 없는 플라스틱 또는 스테인레스 스틸 쉘에 설치된다. 일단 상기 봉지에 상청액이 채워지면, 이를 14일 이하 동안 +5℃ 저장소에 옮긴다. 수거 후 즉시 또는 14일 유지 기간 이내에 1차 포획 단계를 이용하여 정제 프로세스를 시작할 수 있다.
생산 배양물의 산소공급을 수거 단계 동안 40% 초과 공기 포화도 내지 500% 미만 공기 포화도의 범위 내의 DOT로 반드시 유지하도록 하는 접근법은, 정화 단계 내로 및 이러한 단계를 가로질러 운반될 것으로 예상되는 용존 산소를 생산 배양물에 '로드'할 예정이므로, 상청액이 수집될 때 이는 산물 해리를 증진시킬 수 있는 세포성 인자의 활성화를 방지하기에 충분한 용존 산소를 갖는다. 수거 용기는 수거된 상청액이 14일 이하 동안 +5℃ 저장 하에 유지되는 동안 반드시 잘 산소공급된 상태로 지속적으로 유지되도록 설계된다. 이는 수집되고, 예를 들어, 표면 통기에 의해 +5℃ 저장 하에 유지되는 동안 반드시 상청액에 지속적으로 산소공급하는 용기 설계에 의해 달성된다. 한 실시양태에서, 수거 용기 설계는 하기 특징을 포함한다:
- 상기 용기 또는 일회용 백은 수집된 상청액이 표면 통기를 통하여 산소공급할 수 있기에 충분한 축방향 벌크 혼합을 제공하는 진탕기/혼합기를 갖는다.
- 상기 용기 또는 일회용 백 쉘은 용기 내용물의 온도가, 예를 들어, 실온으로부터 4 h 이내에 +5℃에 도달할 수 있게 해주고 유사한 지속 기간 이내에 +5℃로부터 실온까지 가열시키는 적절한 크기의 열 순환기로 재킷 처리된다.
- 상기 용기 또는 일회용 백 쉘에는 공기, 산소 또는 산소 강화 기체로 헤드 스페이스 통기를 허용하기 위해 적절한 크기의 공기 및 산소 기체 질량 흐름 제어기가 장착된다.
- 상기 용기 또는 일회용 백 및 쉘에는 작업 규모에 적절한 유속 하에 공기 및 산소 기체에 적합한 오버레이 기체 필터, 및 작업 규모에 적절한 유속 하에 공기 및 산소 기체에 적합한 출구 기체 배기 필터가 장착되어, 헤드 스페이스를 가로지르는 공기 및 산소의 지속적인 흐름을 허용해주어 상청액 여과물 수집 전에 수거 용기를 공기 또는 공기 및 산소의 임의의 소정의 블렌드로 구성된 기체상의 환경으로 채워, 상청액 여과물 수집 동안 및 일단 수집이 완료되면 상청액 여과물의 산소공급을 >40% 초과 공기 포화도 내지 ≤ 500% 공기 포화도로 증진시킨다.
- 상기 용기 또는 일회용 백 및 쉘에는, 압력이 작업 규모 및 용기 설계에 대한 안전 한계치를 초과하는 경우에 헤드 스페이스 기체를 중지시키기 위한 압력 센서 및 안전 연동장치가 장착된다.
- 상기 용기 또는 일회용 백 및 쉘에는 pH, DOT, 산화환원 및 온도에 대한 프로세스 센서 포트가 장착된다. 용기 또는 백 내의 프로브 위치는 작업 규모에 적절한 가장 낮은 작동 용적 하에서의 모니터링을 허용한다.
- 상기 용기 또는 일회용 백에는 컨테이너의 상부에 부가 포트가 장착되어 있으며, 내부 노즐이 장착된 포트는 용기 벽 위로 액체의 흐름을 유도하고 액체가 용기 벽 아래로 캐스케이드하는 것을 증진시킨다.
세포 및 세포 배양물
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 산물, 예를 들어, 재조합 산물, 예를 들어, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산하는 세포 또는 세포주를 조작하거나 또는 만들기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 개선된, 예를 들어, 감소된 해리, 증가된 생산성 및/또는 산물 품질을 수반한 세포 또는 세포주를 조작하거나 또는 만들기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
실시양태에서, 세포는 포유동물 또는 비-포유동물 세포, 예를 들어, 곤충 세포, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 고세균 세포, 예를 들어, 아르카에아(Archaea)의 종으로부터의 세포, 또는 박테리아 세포이다. 실시양태에서, 세포는 인간, 마우스, 래트, 차이니즈 햄스터, 시리아 햄스터, 원숭이, 유인원, 개, 오리, 말, 앵무새, 흰족제비, 어류 또는 고양이로부터의 것이다. 실시양태에서, 세포는 동물 세포이다. 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포 또는 설치류 세포, 예를 들어, 햄스터 세포, 마우스 세포, 또는 래트 세포이다. 실시양태에서, 세포는 원핵 세포, 예를 들어, 박테리아 세포이다. 실시양태에서, 세포는 악티노박테리아(Actinobacteria)의 종, 예를 들어, 미코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)이다.
한 실시양태에서, 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO 유래 세포이다. CHO GS 녹아웃 세포 (예를 들어, GSKO 세포)는, 예를 들어, CHO-K1 SV GS 녹아웃 세포이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어, 포텔리젠트® CHOK1 SV [론자 바이오로직스, 인크.(Lonza Biologics, Inc.)]이다.
또 다른 실시양태에서, 세포는 HeLa, HEK293, HT1080, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (새끼 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, CHO-K1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DUXB11, 및 CHOZN, 또는 그로부터 유래된 임의의 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 세포 중 임의의 것의 분화된 형태이다. 한 실시양태에서, 세포는 배양 중인 임의의 1차 세포로부터 유래된 세포이다.
실시양태에서, 세포는 산물, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 산물을 생산하는, 본원에 기재된 세포 중 어느 하나이다. 실시양태에서, 세포는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 표 2 또는 3으로부터 선택된 재조합 폴리펩티드를 발현하는, 본원에 기재된 세포 중 어느 하나이다.
실시양태에서, 세포 배양은 배치식 배양, 공급-배치식 배양, 인출 및 충전식 배양, 또는 연속식 배양으로서 수행된다. 실시양태에서, 세포 배양은 부착식 배양이다. 실시양태에서, 세포 배양은 현탁 배양이다. 한 실시양태에서, 세포 또는 세포 배양물은 재조합 폴리펩티드의 발현을 위해 생체 내에 놓아두며, 예를 들어, 모델 유기체 또는 인간 대상체 내에 놓아둔다.
예를 들어, 상기 방법은 포유동물 세포의 대규모 배양 및 번식을 위한 대규모 생물반응기, 예를 들어, 적어도 2개의 임펠러를 갖는 생물반응기, 대규모 생물반응기 시스템 및 방법에서 수행된다. 실시양태에서, 생물반응기는 2011/0312087에 기재된 바와 같은 생물반응기이다.
실시양태에서, 세포는 USSN 62/242,758 (이의 내용은 그 전문이 본원에 포함된다)에 개시된 바와 같은 생물반응기에서 배양된다. 본원에는 적어도 하나의 생물반응기의 제어를 위한 시스템 및 방법, 다른 세포 배양 관련 장비, 및 이들의 임의의 조합을 함유하는 시스템이 개시된다. 예를 들어, 생물반응기 제어를 위한 시스템 및 방법은 복수개의 생물반응기 및 다른 유형의 배양 관련 장비, 예컨대 발효, 수거를 위한 장비, 미세여과 및 정제를 위한 장비 (예를 들어, 액체 크로마토그래피 스키드 시스템), 완충제 제조, 배지 제조 등을 제어하는 것을 포함할 수 있다. 복수개의 생물반응기 및 다른 유형의 배양 관련 장비는 플랜트 내에 위치될 수 있고, 이러한 장비의 제어는 플랜트-와이드 제어 시스템 ("PWCS")으로서 공지될 수 있다.
실시양태에서, 상기 방법은 일회용의 처분가능한 기술의 적어도 한 부분, 예를 들어, USSN 62/246,478 (이의 내용은 그 전문이 본원에 포함된다)에 기재된 것을 사용하여 배치식 제조와 연속식 제조 둘 다를 제공하는 제조 시설에서 수행된다. 실시양태에서, 상기 제조 시설은 활성 제약 성분 ("API")의 생산을 위한 것이다.
냉각은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 더 큰 반응기는 전형적으로, 물 재킷을 가질 것이며, 이를 통해 열 조절된 물이 통과하여 배양물 온도를 제어한다. 실시양태에서, 프로세스 냉수 보급이 재킷에 전달되어 실질적이고 신속한 냉각을 얻는다. 실시양태에서, 냉동 유닛을 사용하여 열을 제거한다. 냉각은 배양할 때 (즉, 세포 수를 증가시키거나, 또는 세포 배양물로부터 목적하는 산물의 생산을 유도시킨다) 또는 생산 시기의 종료 시 생산 배양물을 냉각시킬 때, 또는 세포를 수거할 때 하나 이상의 목적하는 시간에 수행될 수 있다. 유기체들은 이들이 성장하는 최적의 온도가 상이하기 때문에, 냉각 온도는 냉각 단계 이전의 단계(들)의 비교적 더 높은 온도에 근거하여 선택될 것이다. 실시양태에서, 배양된 세포의 냉각은 세포성 산소 소모율을 저하시키도록 수행되므로, 수거 스트림은 수거 프로세스를 통하여 여전히 산소공급된다.
포유동물 세포주의 경우, 배양 프로세스 온도 변화는 전형적으로, 27-35℃ (예를 들어, 27, 28, 29, 30, 31 또는, 32, 33, 34 또는 35℃)이다. 일부 실시양태에서, 온도는 지수 성장 후 시기에 30-33℃로 감소된다. 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 생산 시기 후에 온도를 12-18℃, 예를 들어, 15℃로 떨어뜨리는 것은 특이적 산소 소모율을 10배 저하시키는 것으로 여겨진다.
실시양태에서, 배양 배지에는 혈청이 없다.
포유동물 세포주에 적합한 다른 배지 및 배양 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,633,162에 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 실험실 플라스크 또는 저밀도 세포 배양을 위한 및 특별한 세포 유형의 필요에 적응시킨 표준 세포 배양 배지의 예는, 예를 들어: 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 배지 (문헌 [Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p. 519 f. 1967]), L-15 배지 (문헌 [Leibovitz, A. et al., Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963]), 둘벡코 변형 이글 배지 (DMEM), 이글 최소 필수 배지 (MEM), 햄 F12 배지 (문헌 [Ham, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sc.53, p288 ff. 1965]); 또는 알부민, 트랜스페린 및 레시틴이 결여된 이스코브스 변형된 DMEM (문헌 [Iscoves et al., J. Exp. med. 1, p. 923 ff., 1978])이다. 예를 들어, 햄 F10 또는 F12 배지는 CHO 세포 배양을 위해 특별히 설계되었다. CHO 세포 배양에 특별히 적응시킨 다른 배지는 EP-481 791에 기재되어 있다. 다른 적합한 배양 방법이 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이는 활용된 숙주 세포와 재조합 폴리펩티드 산물에 좌우될 수 있다. 세포에 의해 발현될 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 발현 및 생산에 적합한 조건을 결정하거나 또는 최적화하는 것은 통상의 기술자의 기술 수준 내에 있다.
생산되거나 또는 분비된, 예를 들어, 배양 배지 내로 분비된 산물의 양, 수준, 또는 수량을 정량화하기 위한 검정은 단백질 정량화 검정, 예컨대 브래드포드(Bradford) 단백질 검정, SDS-PAGE 분석, 면역블롯팅, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 및 예를 들어, 나노 드롭 장치를 사용하는 자동화 수단을 포함한다. 증가된 단백질 생산을 측정하기 위한 다른 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 재조합 단백질 생산 상의 증가는 ELISA에 의해 조직 배양 배지 내에서의 농도를 측정함으로써 소규모로 결정될 수 있다 (Smales et al. 2004 Biotechnology Bioengineering 88:474-488). 이는 또한, 예를 들어 배지 중의 재조합 모노클로날 항체 (mAb) 농도의 고 처리량 결정을 위하여, 포르테바이오(ForteBio) 옥텟에 의해 정량적으로 결정될 수 있거나 (문헌 [Mason et al. 2012 Biotechnology Progress 28:846-855]), 또는 단백질 A HPLC에 의해 대규모로 결정될 수 있다 (Stansfield et al. 2007 Biotechnology Bioengineering 97:410-424). 산물, 예를 들어, 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드의 생산을 결정하기 위한 다른 방법은 세포 중의 산물, 특히 재조합 폴리펩티드의 특이적 생산 속도 (qP) 및/또는 생육성 세포 농도에 필수적인 (IVC) 시간을 지칭할 수 있다. 실시양태에서, 생산을 결정하는 방법은 qP를 결정하는 것과 IVC를 결정하는 것의 조합을 포함한다. 배양 배지 중의 폴리펩티드의 농도로서 정의되는 재조합 폴리펩티드 생산 또는 생산성은 문헌 [Porter et al. 2010 Biotechnology Progress 26:1446-1455]에 따라서 계산된, 이들 두 파라미터 (qP 및 IVC)의 함수이다. 단백질 생산을 측정하는 방법이 또한, 본원에 제공된 실시예 내의 추가 세부사항에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개선된 산물 품질을 수반한 세포를 생성한다. 한 실시양태에서, 산물의 품질의 개선은, 예를 들어, 온도 저하의 영향을 받지 않은 세포에 의해 생산된 산물의 양, 수준, 또는 수량과 비교 시, 산물 품질에 있어서의 증가, 예를 들어, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%, 또는 그 초과의 증가; 또는 산물 품질에 있어서의 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배, 또는 그 초과의 증가를 유발한다. 이러한 산물 품질에 있어서의 증가는, 예를 들어, 하기 중 하나 이상에 의해 예시될 수 있다:
i) 디술피드 결합 스크램블링의 증가 또는 감소 (예를 들어, 항체 분자 산물에 대하여, 예를 들어, 증가되거나 또는 감소된 디술피드 결합 스크램블링에 대한 결과로서 목적하는 이소형 또는 구조의 증가 또는 감소);
ii) 비-응집된 산물의 양 또는 수량의 증가 (또는 응집된 산물의 양 또는 수량의 감소);
iii) 적절하게 폴딩되거나 어셈블리된 산물의 양 또는 수량의 증가 (또는 미스폴딩되거나, 언폴딩되거나, 부분적으로 어셈블리되거나 또는 비-어셈블리된 산물의 양 또는 수량의 감소), 또는 적절하게 폴딩되거나 어셈블리된 산물 대 언폴딩되거나, 미스폴딩되거나, 부분적으로 어셈블리되거나 또는 비-어셈블리된 산물의 비의 증가;
iv) 완전한 길이의 산물의 양 또는 수량의 증가 (또는 산물의 단편화의 감소);
v) 목적하는 번역 후 변형의 증가 (또는 변형되지 않거나 또는 부정확하게 변형된 산물의 감소);
vi) 글리칸 불균질성의 증가 또는 감소 (예를 들어, 글리코실화된 산물에 대함); 및/또는
vii) 기능적 산물의 양 또는 수량의 증가 (또는 비-기능적 또는 기능 장애를 일으킨 산물의 양 또는 수량의 감소), 또는 기능적 산물 대 비-기능적 또는 기능 장애를 일으킨 산물의 비의 증가.
본원에 기재된 바와 같이 생성된 세포 또는 세포주의 산물 품질, 예를 들어, 산물 품질의 개선을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 발현된 재조합 폴리펩티드 산물의 1차 서열의 충실도를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 질량 분광분석법이다. 적절하게 폴딩된 산물, 예를 들어, 발현된 재조합 폴리펩티드의 양 또는 농도의 증가는 원편광 이색성에 의해 또는 발현된 재조합 폴리펩티드의 내재적 형광을 평가함으로써 결정될 수 있다. 기능적 산물의 양 또는 농도의 증가는 재조합 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 실체에 따라서 다양한 기능적 검정을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 항체는 ELISA 또는 다른 면역친화 검정에 의해 시험될 수 있다. 산물 품질에 있어서의 증가를 결정하는, 예를 들어, 응집, 번역 후 변형, 디술피드 결합 스크램블링을 결정하는 다른 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 고 성능 액체 크로마토그래피, 동적 광 산란 (DLS) 접근법, 및 단백질 전기영동 (PAGE) 방법에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 산물의 발현, 예를 들어, 산물의 전사, 번역, 및/또는 분비, 또는 산물의 품질, 예를 들어, 1차 서열의 적절한 폴딩 및/또는 충실도를 개선시키기 위한 부가의 단계를 수행할 수 있다. 이러한 부가의 단계는 산물 발현 또는 산물 품질을 개선시키는 작용제를 도입하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 산물 발현 또는 산물 품질을 개선시키는 작용제는 작은 분자, 폴리펩티드, 또는 단백질 폴딩을 개선시키는 폴리펩티드, 예를 들어, 샤프롱 단백질을 코딩하는 핵산일 수 있다. 실시양태에서, 단백질 폴딩에 도움이 되는 작용제는 샤프롱 단백질, 예를 들어, BiP, PD1, 또는 ERO1을 코딩하는 핵산을 포함한다 (Chakravarthi & Bulleid 2004; Borth et al. 2005; Davis et al. 2000). 산물의 수율 및 품질을 개선시키는 다른 부가의 단계는 전사 인자, 예컨대 XBP1 및 ATF6의 과다발현 (문헌 [Tigges & Fussenegger 2006; Cain et al. 2013; Ku et al. 2008]) 및 렉틴 결합 샤프롱 단백질, 예컨대 칼넥신 및 칼레티쿨린의 과다발현을 포함한다 (Chung et al. 2004). 본원에 기재된 단백질 폴딩, 산물 품질, 및 산물 수율에 도움이 되거나 또는 이를 개선시키는 작용제의 과다발현은 이러한 작용제를 코딩하는 외인성 핵산의 도입에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산물 발현 또는 산물 품질을 개선시키는 작용제는 산물의 발현 또는 산물의 품질을 증가시키기 위해 세포 배양물에 부가될 수 있는 작은 분자이며, 예를 들어, DMSO이다. 한 실시양태에서, 세포가 통상적으로 성장되는 온도보다 더 낮은 온도, 예를 들어, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃ 더 낮은 온도에서 세포를 유지하는 것이, 산물의 해리를 저하시키거나 또는 없앰으로써 산물의 품질을 개선시킬 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것은 높은 생산성을 가지거나 또는 높은 품질 산물을 생산하는 세포를 확인하기 위한 부가의 선별 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, FACs 선별을 활용하여, 목적하는 특징, 예를 들어, 단백질 폴딩 단백질, 예를 들어, 샤프롱의 보다 높은 발현을 수반한 특이적 세포를 선별할 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 재조합 폴리펩티드 산물을 회수 또는 회복하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 재조합 폴리펩티드가 세포로부터 분비되는 실시양태에서, 상기 방법은 세포, 세포 집단, 또는 세포가 배양된 배양 배지로부터 재조합 폴리펩티드를 회복, 수집, 또는 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 재조합 폴리펩티드가 세포 내에 있는 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드 산물의 정제는 세포에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드가 하기 중 임의의 것 중 하나 이상으로부터 분리되는 것을 포함한다: 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 핵산, 숙주 세포 지질, 및/또는 숙주 세포로부터의 다른 부스러기.
실시양태에서, 본원에 기재된 프로세스는 실질적으로 순수한 단백질 산물을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은, "실질적으로 순수한"이란 발열성 물질이 실질적으로 없고/없거나, 핵산이 실질적으로 없고/없거나 숙주 세포로부터의 내인성 세포성 단백질 효소 및 구성성분, 예컨대 폴리머라제, 리보솜 단백질, 및 샤프롱 단백질이 실질적으로 없다는 것을 의미한다. 실질적으로 순수한 단백질 산물은 숙주 세포로부터의 오염성 내인성 단백질, 핵산, 또는 다른 거대 분자를, 예를 들어, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만 함유한다.
산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 회수 및 정제 방법은 관련 기술분야에 널리 확립되어 있다. 재조합 폴리펩티드 산물을 회수하는 경우에는, 물리적 또는 화학적 또는 물리화학적 방법이 사용된다. 이러한 물리적 또는 화학적 또는 물리화학적 방법은 여과 방법, 원심분리 방법, 초원심분리 방법, 추출 방법, 동결 건조 방법, 침전 방법, 크로마토그래피 방법 또는 그의 둘 이상의 방법의 조합일 수 있다. 실시양태에서, 크로마토그래피 방법은 크기 배제 크로마토그래피 (또는 겔 여과), 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 및/또는 다중 모드 크로마토그래피 중 하나 이상을 포함한다.
실시양태에서, 온도 저하는 pH를 저하시키면서 온도를 저하시키는 것, 티오레독신 억제제, 예를 들어, 금속 이온과 조합된다. 실시양태에서, 이러한 조합 처리는 상기 기재된 바와 같은 생물반응기에서 수행된다.
넘버링된
실시양태
본 발명은 하기 넘버링된 단락 중 임의의 것에서 정의될 수 있다.
1. 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산하는 방법이며,
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되고,
그에 의해 안정화된 산물, 예를 들어, 단리된, 안정화된 단백질을 생산하는 것
을 포함하는 방법.
2. 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산하는 방법이며,
생산 배양물의 지수 성장 후 배양 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 제공하고, 예를 들어, 이를 확립하고,
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되고,
그에 의해 안정화된 산물, 예를 들어, 단리된, 안정화된 단백질을 생산하는 것
을 포함하는 방법.
3. 생산 배양물로부터의 세포의 분리 동안 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 초과 내지 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500% 이하 공기 포화도, 예를 들어, 40% 초과 내지 500% 이하 범위 내의 용존 산소 장력 (DOT)을 확립하는 것을 추가로 포함하는, 단락 1 또는 2의 방법.
4. 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산하는 방법이며,
생산 배양물의 지수 성장 후 배양 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 제공하고, 예를 들어, 이를 확립하고, 여기서 생산 시기의 시작부터 생산 시기의 종료까지의 용존 산소 장력 (DOT)은 40% 초과 내지 70% 공기 포화도의 범위 내에 있고;
생산 시기의 종료 시 생산 배양물을, 세포주가 배양되었거나 또는 통상적으로 배양되는 온도보다 더 낮은 온도인 T수거 온도로 냉각시키고;
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터 세포가 분리될 때까지 공기 또는 O2 기체를 생산 배양물 내로 스파징함으로써 DOT를 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 초과 내지 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500% 이하 공기 포화도, 예를 들어, 40% 초과 내지 500% 이하 공기 포화도의 범위로 증가시키고;
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되고,
그에 의해 안정화된 산물, 예를 들어, 단리된, 안정화된 단백질을 생산하는 것
을 포함하는 방법.
5. 생산 배양물 중에 또는 그에 전이 금속을 제공하는 것, 예를 들어, 부가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 전이 금속 이온은 Zn2 +, Mn4 +, Cu2 +, Fe3 +, Co2 +, Cr3 +, 및/또는 Ni2+로부터 선택되는 것인, 단락 1 내지 4 중 어느 하나의 방법.
6. DOT가 하기로 이루어진 군: 활성인 경우에 스파징된 질소 기체 흐름을 억제하는 것, 활성인 경우에 요구에 따라 알칼리 제어를 억제하는 것, 활성인 경우에 요구에 따라 CO2 기체 흐름 제어를 억제하는 것, 활성인 경우에 공급물 부가를 억제하는 것, 활성이 아닌 경우에 헤드 스페이스 압력을 활성화시키는 것, 및 활성이 아닌 경우에 공기/O2의 헤드 스페이스 흐름을 활성화시키는 것으로부터 선택된 하나 이상의 작용에 의해 추가로 유지되는 것인, 단락 1 내지 5 중 어느 하나의 방법.
7. 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산하는 방법이며,
(i) 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차에서 산물, 예를 들어, 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포를 포함하는 생산 배양물, 예를 들어, 지수 성장 후 배양물을 제공하고, 예를 들어, 이를 확립하고;
(ii) 성장 후 배양 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고;
(iii) 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지하고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되는 것
을 포함하며, 여기서:
a. 지수 성장 시기가 발생된 후에 생산 배양물을, 세포주가 배양되었거나 또는 통상적으로 배양되는 온도보다 더 낮은 온도인 30℃ 내지 33℃의 온도로 냉각시키는 것;
b. 생산 시기의 시작부터 생산 시기의 종료까지 40% 초과 내지 70% 이하 공기 포화도의 용존 산소 장력 (DOT)이 되도록 생산 배양물에 산소공급하는 것;
c. 생산 배양물 중에 또는 그에 전이 금속을 제공하고, 예를 들어, 부가하며, 여기서 전이 금속은 Zn2+, Mn4+, Cu2+, Fe3+, Co2+, Cr3+, 및/또는 Ni2+로부터 선택되는 것;
d. 데히드로아스코르브산 또는 아스코르브산, 또는 데히드로아스코르브산 또는 아스코르브산 변형 구성성분을 상기 생산 배양물에 제공하는, 예를 들어, 부가하는 것;
e. 글루타티온, 예를 들어, 산화된 및/또는 환원된 글루타티온, 또는 글루타티온 변형 구성성분을 상기 생산 배양물에 제공하는, 예를 들어, 부가하는 것; 또는
f. 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리를 위해 생산 배양물을, T생산보다 더 낮은 온도인 12℃-18℃의 온도 T수거로 냉각시키는 것,
그에 의해 안정화된 산물, 예를 들어, 단리된, 안정화된 단백질, 또는 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질의 제제를 생산하는 것
을 포함하는 방법.
8. a, b, 및 f를 포함하는, 단락 7의 방법.
9. a, c, 및 f를 포함하는, 단락 7의 방법.
10. b 및 c를 포함하는, 단락 7의 방법.
11. a, b, c, 및 f를 포함하는, 단락 7의 방법.
12. 생산 배양물이 적어도 10%, 적어도 30%, 또는 30% 내지 70% 공기 포화도의 산소공급 수준을 갖는 것인, 단락 1 내지 11 중 어느 하나의 방법.
13. 산소공급 수준이 40% 초과 내지 70% 이하 공기 포화도인, 단락 12의 방법.
14. 전이 금속이 Zn2 +, Mn2 +, 및/또는 Cu2 +인, 단락 4 내지 13 중 어느 하나의 방법.
15. Zn2 +이 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 또는 250 내지 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 550, 600, 650, 700, 또는 1000 μM, 예를 들어, 200-400 μM의 농도로 존재하는 것인, 단락 4 내지 14 중 어느 하나의 방법.
16. Mn2 +이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 또는 50 내지 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 또는 200 μM, 예를 들어, 10-100 μM의 농도로 존재하는 것인, 단락 4 내지 15 중 어느 하나의 방법.
17. Cu2 +가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 또는 50 내지 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 또는 200 μM, 예를 들어, 10-100 μM의 농도로 존재하는 것인, 단락 4 내지 16 중 어느 하나의 방법.
18. Zn2 +이 200 내지 400 μM의 농도로 존재하고, Mn2 +이 10-100 μM의 농도로 존재하며, Cu2 +가 10-100 μM의 농도로 존재하는 것인, 단락 4 내지 17 중 어느 하나의 방법.
19. 안정화된 단백질이 N번째 시스테인 잔기 및 N+1번째 시스테인 잔기를 포함하며, 여기서 N = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과, 예를 들어, N = 1 또는 N = 3인, 단락 1 내지 18 중 어느 하나의 방법.
20. 천연 형태의 안정화된 단백질이 N번째 시스테인 잔기와 N+1번째 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함하는 것인, 단락 19의 방법.
21. i) N = 1, 및 천연 형태의 폴리펩티드가 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함하거나;
ii) N = 3, 및 천연 형태의 폴리펩티드가 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함하거나; 또는
iii) N = 3, 및 천연 형태의 폴리펩티드가 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함하고, 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함하는 것인
단락 20의 방법.
22. 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질의 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99 중량%가, 예를 들어, 크기 분리, 예를 들어, 겔 전기영동, 예를 들어, 비-환원성 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같이, 미리 결정된 상태, 예를 들어, 천연 입체형태로 존재하는 것인, 단락 1 내지 21 중 어느 하나의 방법.
23. 산물이 항체이고, 이러한 항체의 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99 중량%가, 예를 들어, 크기 분리, 예를 들어, 겔 전기영동, 예를 들어, 비-환원성 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같이, 미리 결정된 상태, 예를 들어, 천연 입체형태로 존재하는 것인, 단락 1 내지 22 중 어느 하나의 방법.
24. 산물이 항체이고, 이러한 항체의 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99 중량%가 각각 경쇄 가변 영역을 포함하는 2개의 쇄 및 각각 중쇄 가변 영역을 포함하는 2개의 쇄를 포함하는 사량체인, 단락 1 내지 23 중 어느 하나의 방법.
25. T수거가 디술피드 결합의 해리를 억제하기에 충분히 낮은 것인, 단락 4 내지 24 중 어느 하나의 방법.
26. T수거에서 생산 배양물로부터 세포를 분리하는 것을 포함하는, 단락 4 내지 25 중 어느 하나의 방법.
27. 세포주가 제1 온도인 T배양에서 배양되고, T수거에서 수거되는 것인, 단락 4 내지 26 중 어느 하나의 방법.
28. T수거가 T배양보다 적어도 19℃ 내지 25℃ 더 낮은 것인, 단락 27의 방법.
29. T수거가 12℃-18℃, 예를 들어, 15℃인, 단락 4 내지 28 중 어느 하나의 방법.
30. T배양이 30℃-38℃인, 단락 27 내지 29 중 어느 하나의 방법.
31. 예를 들어, 상청액의 구성성분으로서의 단백질이 T수거에서 필터에 적용되는 것인, 단락 4 내지 30 중 어느 하나의 방법.
32. 세포가 생물반응기에서 배양되는 것인, 단락 1 내지 31 중 어느 하나의 방법.
33. 생물반응기의 내용물이 생산 시기 후에 T수거로 냉각되는 것인, 단락 32의 방법.
34. 세포 배양물이, 이러한 세포 배양물을 T수거로 되게 하는데 적합한 온도에서, 유체, 예를 들어, 물을 포함하는 구성원, 예를 들어, 냉각 재킷과의 접촉에 의해 냉각되는 것인, 단락 32의 방법.
35. 생물반응기가 1-250 밀리리터, 250 밀리리터 내지 50 리터, 50 내지 800 리터, 또는 800-200,000 리터의 용적을 갖는 것인, 단락 32 내지 34 중 어느 하나의 방법.
36. 생물반응기가 일회용 생물반응기, 예를 들어, 세포 배양물의 인큐베이션을 허용하고, 그 후에, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 처분되도록 설계된 생물반응기인, 단락 32 내지 35 중 어느 하나의 방법.
37. 생물반응기가 바이오프로세스 컨테이너, 쉘, 적어도 하나의 진탕기, 적어도 하나의 스파저, 스파저(들) 및 헤드 스페이스 오버레이를 위한 적어도 하나의 기체 필터 유입 포트, 적어도 하나의 충전 포트, 적어도 하나의 수거 포트, 적어도 하나의 샘플 포트, 및 적어도 하나의 프로브를 포함하는 것인, 단락 32 내지 36 중 어느 하나의 방법.
38. 생물반응기가 하나 이상의 파라미터, 예를 들어, pH, 용존 산소 장력 (DOT), 또는 온도를 모니터링 및 유지하기 위한 프로세스 및 프로브를 포함하는 것인, 단락 32 내지 37 중 어느 하나의 방법.
39. 생물반응기가 적어도 4000 L의 용적 및 적어도 하나의 상부 임펠러 및 적어도 하나의 하부 임펠러를 갖는 자기-지지형 생체 적합성 탱크이며, 여기서 적어도 하나의 상부 임펠러는 히드로호일 임펠러이고, 여기서 상부 임펠러와 하부 임펠러 사이의 임펠러 간격 (Ds)은 적어도 1.229x하부 임펠러의 직경 (D하부)이고 최대 2xD하부이며, 여기서 상부 임펠러 위의 액체 높이 (Do)는 적어도 0.3x상부 임펠러의 직경 (D상부)이고 최대 2.5xD상부이며, 여기서 탱크 하부와 하부 임펠러의 중앙선 사이의 하부 클리어런스 (Dc)는 적어도 0.35xD하부인, 단락 32 내지 37 중 어느 하나의 방법.
40. 생물반응기가 수거 용기와 작동적으로 커플링되는 것인, 단락 32 내지 39 중 어느 하나의 방법.
41. 수거 용기가 저장소 배양물 위에 헤드 스페이스를 포함하거나 또는 제공하도록 구성되며, 예를 들어, 여기서 헤드 스페이스는 기체, 예를 들어, 공기 또는 산소, 또는 기체들, 예를 들어, 공기 또는 공기 및 산소의 혼합물을 포함하는 것인, 단락 40의 방법.
42. 수거 용기가 J-튜브 포트를 통해 헤드 스페이스 내로의 상청액의 수집을 허용하도록 구성되어 상청액이 수거 용기의 벽(들) 아래로 이동 또는 캐스케이드되는 것인, 단락 41의 방법.
43. 상청액이 수거 용기의 표면, 예를 들어, 헤드 스페이스 내의 벽 상에 전달되고, 표면을 따라, 저장소 배양물로 다시 흐르는 것인, 단락 42의 방법.
44. 수거 용기 내에서의 상청액 이동 또는 캐스케이드가 상청액의 산소공급 수준에 있어서의 증가를 유발하는 것인, 단락 43의 방법.
45. 상청액의 DOT가 표면 통기를 통하여 수거 용기 내에서, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 초과 내지 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500% 이하 공기 포화도, 예를 들어, 40% 초과 내지 500% 이하 공기 포화도의 범위로 유지되는 것인, 단락 40 내지 44 중 어느 하나의 방법.
46. 수거 용기가 저장소 배양물을 5℃ 내지 8℃의 온도로 추가 냉각시키는 냉각 장치 및 메카니즘을 포함하는 것인, 단락 40 내지 45 중 어느 하나의 방법.
47. 수거 용기가 축방향 혼합할 수 있는 혼합기 장치 및 pH 적정제 부가 포트를 포함하는 것인, 단락 40 내지 46 중 어느 하나의 방법.
48. 수거 용기가 적어도 하나의 헤드 스페이스 기체 유입 포트 및 적어도 하나의 기체 배출 포트를 포함하는 것인, 단락 40 내지 47 중 어느 하나의 방법.
49. 수거 용기가 공기 및 O2 혼합물을 제공하는 적어도 하나의 공기 흐름 제어기 및 적어도 하나의 O2 흐름 제어기를 추가로 포함하는 것인, 단락 40 내지 48 중 어느 하나의 방법.
50. 수거 용기가 상청액의 DOT, 산화환원, 온도 및 pH를 검출하는 센서를 포함하는 것인, 단락 40 내지 49 중 어느 하나의 방법.
51. DOT, 산화환원, 온도 및 pH 센서 출력이 스파징 속도, 헤드 스페이스, 및 분리에 앞서 생물반응기 생산 배양물 내로의 공급물 또는 보충물 부가에 있어서의 변화; 및 수거 용기 내로의 pH 적정제의 부가를 실시하는데 사용되는 것인, 단락 50의 방법.
52. DOT, 산화환원, 온도 및 pH 센서 출력이 수거 용기 내로의 pH 적정제의 부가를 실시하는데 사용되는 것인, 단락 50의 방법.
53. 폐색에 대해 저항성인 튜빙을 사용하여 생물반응기가 수거 용기에 연결되는 것인, 단락 40 내지 52 중 어느 하나의 방법.
54. 폐색에 대해 저항성인 튜빙이 편조된 것인, 단락 53의 방법.
55. 생물반응기와 수거 용기 사이의 흐름 경로가 DOT 및 산화환원 센서/프로브의 설치를 포함하는 것인, 단락 40 내지 54 중 어느 하나의 방법.
56. DOT 및 산화환원 센서/프로브 출력이 스파징 속도, 헤드 스페이스, 및 수거에 앞서 생물반응기 생산 배양물 내로의 공급물 또는 보충물 부가에 있어서의 변화를 실시하는데 사용되는 것인, 단락 55의 방법.
57. 생물반응기가, 이러한 생물반응기의 헤드 스페이스를 규정하는 표면에 배양물을 전달하도록 구성된 요소, 예를 들어, 라인 또는 노즐을 포함하는 것인, 단락 40 내지 56 중 어느 하나의 방법.
58. 생물반응기가, 이러한 생물반응기의 헤드 스페이스를 규정하는 표면에 배양물을 전달하도록 구성된 제2 요소, 예를 들어, 라인 또는 노즐을 포함하는 것인, 단락 40 내지 57 중 어느 하나의 방법.
59. 산화환원 전위를 유지할 목적으로 단백질을 단리하는 동안 배양물 내의 세포의 산화환원 전위를 모니터링하는 것을 추가로 포함하는, 단락 1 내지 58 중 어느 하나의 방법.
60. 산화환원 전위를 모니터링하는 것이 인-라인 모니터링 프로브, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 메틀러 토레도를 사용하는 것을 포함하는 것인, 단락 59의 방법.
61. 산화환원 전위를 모니터링하는 것이 산물 안정성에 영향을 미치는 세포성 인자의 산화환원 상태를 평가하는 것을 포함하는 것이며, 여기서 세포성 인자는 글루타티온/환원된 글루타티온 경로, 티오레독신/환원된 티오레독신 경로, 또는 펜토스 포스페이트 경로의 효소 또는 대사 보조인자 (예를 들어, 글루타티온 리덕타제, 티오레독신, 글루코스-6-포스페이트, NADPH, NADP+, 6-포스포노글루코락톤, 6-포스포글루코네이트, 또는 리불로스-5-포스페이트)를 손상시킬 수 있는 것인, 단락 58의 방법.
62. 재조합 숙주 세포가 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO 유래 세포인, 단락 1 내지 61 중 어느 하나의 방법. CHO GS 녹아웃 세포 (예를 들어, GSKO 세포)는, 예를 들어, CHO-K1SV GS 녹아웃 세포 (론자 바이오로직스, 인크.)이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어, 포텔리전트® CHOK1 SV (론자 바이오로직스, 인크.)이다.
63. 재조합 숙주 세포가 CHO-GSKO 세포이며, CHOXceed 세포 CHO GS 녹아웃 세포 (예를 들어, GS-CHO 세포)가, 예를 들어, CHO-K1SV GS 녹아웃 세포 (론자 바이오로직스, 인크.)인, 단락 1 내지 61 중 어느 하나의 방법. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어, 포텔리전트® CHOK1 SV (론자 바이오로직스, 인크.)이다.
64. 재조합 숙주 세포가 HeIa, HEK293, HT1080, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (새끼 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, 및 CHOZN, 또는 그로부터 유래된 임의의 세포인, 단락 1 내지 61 중 어느 하나의 방법.
65. 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 안정화된 단백질.
66. 단락 65의 안정화된 단백질을 포함하는 제약 조성물.
67. 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함하는, 단락 66의 제약 조성물.
68. 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산할 수 있는 생물반응기이며, 여기서 생물반응기는 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되는 것인 생물반응기.
69. 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산할 수 있는 생물반응기이며, 여기서 생물반응기는
생산 배양물의 지수 성장 후 배양 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 제공할 수 있고, 예를 들어, 이를 확립할 수 있고,
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되는 것인
생물반응기.
70. 생산 배양물로부터의 세포의 분리 동안 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 초과 내지 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500% 이하 공기 포화도, 예를 들어, 40% 초과 내지 500% 이하 공기 포화도의 범위 내의 용존 산소 장력 (DOT)을 확립할 수 있는, 단락 68 또는 69의 생물반응기.
71. 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산할 수 있는 생물반응기이며, 여기서 생물반응기는
생산 배양물의 지수 성장 후 배양 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 제공할 수 있고, 예를 들어, 이를 확립할 수 있고, 여기서 생산 시기의 시작부터 생산 시기의 종료까지의 용존 산소 장력 (DOT)은 40% 초과 내지 70% 공기 포화도의 범위 내에 있고;
생산 시기의 종료 시 생산 배양물을, 세포주가 배양되었거나 또는 통상적으로 배양되는 온도보다 더 낮은 온도인 T수거 온도로 냉각시킬 수 있고;
생물반응기로부터 생산 배양물이 제거될 때까지 공기 또는 O2 기체를 생산 배양물 내로 스파징함으로써 DOT를 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 초과 내지 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500% 이하 공기 포화도, 예를 들어, 40% 초과 내지 500% 이하 공기 포화도의 범위로 증가시킬 수 있고;
생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되는 것인
생물반응기.
72. 추가로 생산 배양물 중에 또는 그에 전이 금속을 제공할 수 있으며, 예를 들어, 부가할 수 있으며, 여기서 전이 금속은 Zn2 +, Mn4 +, Cu2 +, Fe3 +, Co2 +, Cr3 +, 및/또는 Ni2 +로부터 선택되는 것인, 단락 68 내지 71 중 어느 하나의 생물반응기.
73. 하기로 이루어진 군: 스파징된 질소 기체 흐름을 억제하는 것, 활성인 경우에 요구에 따라 알칼리 제어를 억제하는 것, 활성인 경우에 요구에 따라 CO2 기체 흐름 제어를 억제하는 것, 활성인 경우에 공급물 부가를 억제하는 것, 활성이 아닌 경우에 헤드 스페이스 압력을 활성화시키는 것, 및 활성이 아닌 경우에 공기/O2의 헤드 스페이스 흐름을 활성화시키는 것으로부터 선택된 하나 이상의 작용에 의해 DOT를 추가로 유지할 수 있는, 단락 68 내지 72 중 어느 하나의 생물반응기.
74. 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 산물, 예를 들어, 안정화된 단백질을 생산할 수 있는 생물반응기이며, 여기서 생물반응기는
(i) 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차에서 산물, 예를 들어, 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포를 포함하는 생산 배양물, 예를 들어, 지수 성장 후 배양물을 제공할 수 있고, 예를 들어, 이를 확립할 수 있고;
(ii) 성장 후 배양 시기에 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고;
(iii) 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 비-안정화된 산물에서부터 안정화된 산물에 이르는 -10mV 내지 -1000mV, -20mV 내지 -800mV, -30mV 내지 -700mV, -40mV 내지 -600mV, -50mV 내지 -500mV, -50mV 내지 -400mV, -50mV 내지 -300mV, -50mV 내지 -200mV, 또는 -50mV 내지 -150mV, 예를 들어, -50mV 내지 -300mV 범위 내의 산화환원 전위차를 유지할 수 있고, 여기서 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리는 스파징 없이 또는 스파징이 생산 배양물 및 상청액 중에서의 산화환원 전위를 실질적으로 변경시키지 않을 만큼 충분히 적은 스파징 하에 실시되고,
여기서 생물반응기는 추가로
a. 지수 성장 시기가 발생된 후에 생산 배양물을, 세포주가 배양되었거나 또는 통상적으로 배양되는 온도보다 더 낮은 온도인 30℃ 내지 33℃의 온도로 냉각시킬 수 있거나;
b. 생산 시기의 시작부터 생산 시기의 종료까지 40% 초과 내지 70% 이하 공기 포화도의 용존 산소 장력 (DOT)이 되도록 생산 배양물에 산소공급할 수 있거나;
c. 생산 배양물 중에 또는 그에 전이 금속을 제공할 수 있고, 예를 들어, 부가할 수 있으며, 여기서 전이 금속은 Zn2 +, Mn4 +, Cu2 +, Fe3 +, Co2 +, Cr3 +, 및/또는 Ni2 +로부터 선택되거나;
d. 데히드로아스코르브산 또는 아스코르브산, 또는 데히드로아스코르브산 또는 아스코르브산 변형 구성성분을 상기 생산 배양물에 제공할 수 있고, 예를 들어, 부가할 수 있거나;
e. 글루타티온, 예를 들어, 산화된 및/또는 환원된 글루타티온, 또는 글루타티온 변형 구성성분을 상기 생산 배양물에 제공할 수 있고, 예를 들어, 부가할 수 있거나; 또는
f. 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리를 위해 생산 배양물을, T생산보다 더 낮은 온도인 12℃-18℃의 온도 T수거로 냉각시킬 수 있는 것인
생물반응기.
75. a, b, 및 f를 할 수 있는, 단락 74의 생물반응기.
76. a, c, 및 f를 할 수 있는, 단락 74의 생물반응기.
77. b 및 c를 할 수 있는, 단락 74의 생물반응기.
78. a, b, c, 및 f를 할 수 있는, 단락 74의 생물반응기.
79. 수거 용기와 작동적으로 커플링되는, 단락 68 내지 77 중 어느 하나의 생물반응기.
80. 수거 용기가 저장소 배양물 위에 헤드 스페이스를 포함하거나 또는 제공하도록 구성되며, 예를 들어, 여기서 헤드 스페이스는 기체, 예를 들어, 공기 또는 산소, 또는 기체들, 예를 들어, 공기 또는 공기 및 산소의 혼합물을 포함하는 것인, 단락 79의 생물반응기.
81. 헤드 스페이스 내로의 배양물의 순환을 허용하도록 구성되어 이러한 배양물이 수거 용기의 벽(들) 아래로 이동 또는 캐스케이드되는, 단락 80의 생물반응기.
82. 저장소 배양물로부터의 배양물이 생물반응기의 표면, 예를 들어, 헤드 스페이스 내의 벽 상에 전달되고, 표면을 따라, 저장소 배양물로 다시 흐르는 것인, 단락 81의 생물반응기.
83. 이동 또는 캐스케이드가 배양물 중의 산소공급 수준에 있어서의 증가를 유발하는 것인, 단락 82의 생물반응기.
84. 수거 용기가 표면 통기를 통하여 저장소 배양물의 DOT를 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 초과 내지 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500% 이하 공기 포화도, 예를 들어, 40% 초과 내지 500% 이하 공기 포화도의 범위로 유지할 수 있는 것인, 단락 79 내지 83 중 어느 하나의 생물반응기.
85. 수거 용기가 하기로 이루어진 군: 저장소 배양물을 5℃ 내지 8℃의 온도로 추가 냉각시키는 냉각 장치 및 메카니즘; 축방향 혼합할 수 있는 혼합기 장치 및 pH 적정제 부가 포트; 적어도 하나의 헤드 스페이스 기체 유입 포트 및 적어도 하나의 기체 배출 포트; 공기 및 O2 혼합물을 제공하는 적어도 하나의 공기 흐름 제어기 및 적어도 하나의 O2 흐름 제어기; 및 상청액의 DOT, 산화환원, 온도 및 pH를 검출하는 센서로부터 선택된 구성성분 중 하나 이상을 포함하는 것인, 단락 79 내지 84 중 어느 하나의 생물반응기.
86. DOT, 산화환원, 온도 및 pH 센서 출력이 스파징 속도, 헤드 스페이스, 및 분리에 앞서 생물반응기 생산 배양물 내로의 공급물 또는 보충물 부가에 있어서의 변화; 및 수거 용기 내로의 pH 적정제의 부가를 실시할 수 있는 것인, 단락 85의 생물반응기.
87. DOT, 산화환원, 온도 및 pH 센서 출력이 수거 용기 내로의 pH 적정제의 부가를 실시할 수 있는 것인, 단락 85의 생물반응기.
88. 폐색에 대해 저항성인 튜빙을 사용하여 수거 용기에 연결되는, 단락 79 내지 87 중 어느 하나의 생물반응기.
89. 폐색에 대해 저항성인 튜빙이 편조된 것인, 단락 88의 생물반응기.
90. 생물반응기와 수거 용기 사이의 흐름 경로가 DOT 및 산화환원 센서/프로브의 설치를 포함하는 것인, 단락 79 내지 88 중 어느 하나의 생물반응기.
91. 수거 용기의 헤드 스페이스를 규정하는 표면에 배양물을 전달하도록 구성된 요소, 예를 들어, 라인 또는 노즐을 포함하는, 단락 79 내지 90 중 어느 하나의 생물반응기.
92. 수거 용기의 헤드 스페이스를 규정하는 표면에 배양물을 전달하도록 구성된 제2 요소, 예를 들어, 라인 또는 노즐을 포함하는, 단락 79 내지 91 중 어느 하나의 생물반응기.
93. 일회용 생물반응기, 예를 들어, 세포 배양물의 인큐베이션을 허용하고, 그 후에, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 처분되도록 설계된 생물반응기인, 단락 68 내지 92 중 어느 하나의 생물반응기.
94. 바이오프로세스 컨테이너, 쉘, 적어도 하나의 진탕기, 적어도 하나의 스파저, 스파저(들) 및 헤드 스페이스 오버레이를 위한 적어도 하나의 기체 필터 유입 포트, 적어도 하나의 충전 포트, 적어도 하나의 수거 포트, 적어도 하나의 샘플 포트, 및 적어도 하나의 프로브를 포함하는, 단락 68 내지 93 중 어느 하나의 생물반응기.
95. 생물반응기가 적어도 4000 L의 용적 및 적어도 하나의 상부 임펠러 및 적어도 하나의 하부 임펠러를 갖는 자기-지지형 생체 적합성 탱크이며, 여기서 적어도 하나의 상부 임펠러는 히드로호일 임펠러이고, 여기서 상부 임펠러와 하부 임펠러 사이의 임펠러 간격 (Ds)은 적어도 1.229x하부 임펠러의 직경 (D하부)이고 최대 2xD하부이며, 여기서 상부 임펠러 위의 액체 높이 (Do)는 적어도 0.3x상부 임펠러의 직경 (D상부)이고 최대 2.5xD상부이며, 여기서 탱크 하부와 하부 임펠러의 중앙선 사이의 하부 클리어런스 (Dc)는 적어도 0.35xD하부인, 단락 68 내지 92 중 어느 하나의 생물반응기.
96. 산물이 이중특이적 항체를 포함하는 것인, 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법 또는 단락 68 내지 95 중 어느 하나의 생물반응기.
97. 산물이 표 1, 표 2, 표 3, 또는 표 4에 열거된 단백질인, 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법 또는 단락 68 내지 95 중 어느 하나의 생물반응기.
98. 산물이 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 예를 들어, IgG1 항체인, 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법 또는 단락 68 내지 95 중 어느 하나의 생물반응기.
99. 재조합 숙주 세포가 포유동물 세포, 예를 들어, 마우스, 래트, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 세포, 시리아 햄스터, 원숭이, 유인원, 개, 말, 흰족제비, 또는 고양이 세포로부터 유래되는 것인, 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법 또는 단락 68 내지 95 중 어느 하나의 생물반응기.
100. 재조합 숙주 세포가 비-포유동물 세포, 예를 들어, 오리, 앵무새, 어류, 곤충, 식물, 진균, 효모, 박테리아, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 예를 들어, 아르카에박테리아(Archaebacteria), 또는 악티노박테리아(Actinobacteria)로부터의 세포로부터 유래되는 것인, 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법 또는 단락 68 내지 95 중 어느 하나의 생물반응기.
101. 재조합 숙주 세포가 줄기 세포인, 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법 또는 단락 68 내지 95 중 어느 하나의 생물반응기.
102. 재조합 숙주 세포가 본원에 기재된 세포 중 임의의 것의 분화된 형태인, 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법 또는 단락 68 내지 95 중 어느 하나의 생물반응기.
103. 재조합 숙주 세포가 배양물 중의 임의의 1차 세포로부터 유래된 세포인, 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법 또는 단락 68 내지 95 중 어느 하나의 생물반응기.
104. 재조합 숙주 세포가 CHOK1SV, GS-KO, 또는 DUX-B11 세포인, 단락 1 내지 64 중 어느 하나의 방법 또는 단락 68 내지 95 중 어느 하나의 생물반응기.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 상세히 추가로 기재된다. 이들 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되며, 달리 명시되지 않는 한 제한하려는 것이 아니다. 따라서, 본 발명은 하기 실시예에 제한되는 것으로 해석되서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 전술한 설명 및 하기 예시적 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조 및 활용하고 청구된 방법을 실시할 수 있다고 여겨진다. 하기 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 구체적으로 지적하고, 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.
실시예
1. 세포를 냉각시키는 것은 세포 샘플의 수거 및 저장 관련
무산소상태를
완화시켜 준다
산소 고갈은 확인되고 문서화된 해리의 근본 원인이다. 고갈 속도는 온도에 따라 감소된다. 도 1은 O2 용해도가 온도에 반비례하여 증가된다는 것을 도시한다 (37℃, 15℃, 및 5℃를 비교함). 또한, 이들 3가지 온도 하에 3가지 다른 산소 관련 파라미터의 변화가 도시된다. 따라서, 생물반응기/샘플을 냉각시키는 것이 해리를 방지하는데 유사하게 도움을 줄 수 있는 것으로 가정되었다.
세포 냉각을 포함하는 완화 전략이 생물반응기, 1차 저장 챔버, 및 저장 백 또는 병에 대하여 도 2에 도시된다.
실시예
2. 수거 산소공급을 수반한 경우 및 수반하지 않는 경우 2개의 생물반응기
의
수거 프로파일
수거 산소공급을 수반한 경우 및 수반하지 않는 경우 2개의 생물반응기의 수거 프로파일이 도 3에 도시된다. 그 데이터는 수거 동안 배양물 중의 저산소상태 현상 (거의 0%)를 보여주며, 해리에 대한 가설에 부합한다. 반대로, 도시된 바와 같은 완화 전략을 수행함으로써 수거 동안 산소가 공급된 채로 유지되는 (가장 낮은 지점에서 ~20%) 배양물에 대한 프로필이 도시된다.
실시예
3. 완화를 수반한 경우 및 수반하지 않는 경우의 비-환원성 SDS
폴
리아크릴아미드 겔
도 4는 IgG1 모노클로날 항체에 대한 완화를 수반하지 않는 경우 (왼쪽 패널) 및 완화를 수반한 경우 (오른쪽 패널)에 제조된 비-환원성 SDS 폴리아크릴아미드 겔 샘플을 나타낸다. 완화를 수반하지 않는 경우에 제조된 샘플의 대해서는, 다수의 밴드가 관찰되는데, 이는 해리된 폴리펩티드 종을 표시한다. 반대로, 도 2에 도시된 완화 전략을 거친 샘플에 대해서는 해리의 명백한 증거가 없는 단일의 고분자량 밴드가 검출된다. 이러한 결과는 세포를 냉각시키는 것을 포함하는 완화 전략이 단백질 해리를 억제한다는 것을 입증해 준다.
단일 성장 특징 (최대 생육성 세포 농도, 수거 생육성 세포 농도, IVC, 수거 시의 생육력)과 해리 간에는 단순한 추세가 관찰되지 않았다. 추세가 없다면 성장 파라미터(들)와 해리와 함께 움직이는 또 다른 파라미터(들) 사이의 상호 작용의 가능성을 배제할 수 없다.
실시예
4: 산화환원 관리
이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 하기 표는 공기 흐름, 산소 흐름, 기체의 산소 함량, 및 DOT가 본 개시내용의 방법 및 생물반응기에 관계되는 방식을 나타낸다.
도 5는 60% 공기 포화도의 용존 산소 장력, DOT의 더 높은 프로세스 제어와, 세포 성장 시기 (전형적으로 제6일) 후 36.5℃의 제어점에서 33.0℃의 제어점으로의 프로세스 온도 변화의 조합을 이용하는 기준선 상류 프로세스 및 최적화된 상류 프로세스의 생산 배양물 산화환원 전위차 프로파일을 도시한다. 부가적으로, 생산 배양물에는 배양 제3일부터 배양 제10일까지 간헐적으로 미량 영양소, 예컨대 구리, 망가니즈 및 아연 염의 수준이 상승된 볼루스 공급물을 공급하였다. 최적화된 상류 프로세스의 또 다른 변동에서는, 미량 영양소를 배양 제15일에 수거될 때까지 배양 제3일부터 연속적으로 공급하였다. 제3일부터 산화 촉진제 미량 영양소의 증가된 적용은 대략 -50mV의 바람직한 산화환원 전위차를 부여하며, 이는 33.0℃로의 온도 변화 및 대략 -115mV까지의 산화 촉진제 미량 영양소의 연속적인 적용 후에 추가로 개선된다. 기준선 프로세스에서 생산된 산물은 기준선 세포 정화 절차 후에 더 큰 불안정성 움직임을 나타내었다. 그러나, 산화환원 전위차-최적화된 프로세스로 제조된 산물은 배양물이 수거 단계 동안 저산소상태 또는 무산소상태 환경에 노출될 수 있는 기준선 세포 정화 절차에 보다 탄력성이 있는 산물을 생산하였다. 이러한 상류 프로세스를 사용하여 만들어진 산물에 대한 불안정성 움직임은 다음과 같다:
- 단백질 A 수지 크로마토그래피로부터의 산물의 용출 후 또는 바이러스 불활성화를 위한 낮은 pH 처리 후 산물 단편의 존재량 증가.
- 제조 프로세스에서 바이러스를 불활성화시키기 위해 전형적으로 사용되고 있는 낮은 pH 홀드에 노출된 후 증가된 산물 응집.
산물의 생산 동안 더 산화적인 산화환원 전위차의 혜택이 유리하긴 하지만, 상청액의 수거 단계 및 저장 동안 유사하게 산화적인 산화환원 전위차를 보장하는 것이 동등하게 유리할 수 있다고 가정된다. 다른 산화 촉진제 세포 배양 영양소 및 세포성 대사물 (예를 들어, 철 III 염, 시스틴/시스테인, 데히드로아스코르브산/아스코르브산, 및 글루타티온/글루타티온-SH)이 상기 실시예에서 시험된 것과 유사한 방식으로 움직일 수도 있다고 추가로 예상된다.
실시예
5: 온도 관리
도 6은 생산 배양물에 의한 세포성 산소 흡수를 충족시키기 위해 수거 작업 및 요구에 따른 공기 및 산소 흐름 스파징 속도보다 빨리 냉각시킨 경우의 생산 배양물의 온도 프로파일을 도시한다. 스파징 속도가 프로세스 특이적 한계치 아래로 떨어지는 경우, 이들 스파징 속도는 수거 작업의 지속 기간 동안 고정된다. 이들 고정된 스파징 속도는 다음과 같을 수 있다:
- 최소 0에서부터 배양물의 냉각 시작 직전에 사용된 최대 흐름까지의 산소의 일정한 흐름.
- 배양물의 냉각 시작 직전의 흐름과 동일한 최소 흐름에서부터, 요구에 따른 공기 및 산소 흐름 둘 다로 냉각시키기 직전에 적용된 것과 유사한 산소 질량 전달 계수 kLa를 달성하기 위한 최대 흐름까지의 공기의 일정한 흐름.
실시예
6: 산소 관리
도 7a는 세포 배양물의 정화를 위하여 일회용 POD 심층 필터를 사용하여 1000 L 일회용 생물반응기로부터의 그의 수거 동안 생산 배양물 중에서의 주요 프로세스 파라미터의 예를 도시한다. 이러한 경우에는, 세포성 산소 요구를 충족시키기 위해 생산 배양물에 적용된 바와 동일한 진탕 (혼합) 및 통기 속도를 이용하여 생산 배양물을 혼합 및 통기시켰다. 생산 배양물의 냉각은 앞서 도 1에서 기재된 바와 같이 세포성 요구를 중지시켰다. 그러나, 유사한 혼합 및 통기 속도의 지속적인 적용은, 배양물 DOT가 스파징된 기체의 산소 농축 비율에 의해 제한된 수준까지 지속적으로 증가하도록 보장한다. 공기는 최대 100% 공기 포화도까지 배양물 중 용존 산소를 포화시킬 것이란 사실에 주목해야 한다. 순수한 산소는 최대 ~500% 공기 포화도까지 배양물 중 용존 산소를 포화시킬 것이다. 따라서, 임의의 소정의 수거를 위하여, 생산 배양물을 공기 또는 산소 또는 공기 및 산소의 블렌드로 통기시킬 수 있다. 사용된 공기 및 산소의 비에 따라서, 배양물 중 용존 산소는 가변적일 수 있고, 특별한 산물 또는 프로세스, 또는 생산 배양물을 수거하는데 사용된 생산 시설 및 장비 (예컨대, 필터 유형, 필터 면적, 생물반응기와 필터 하우징 사이의 흐름 경로, 및 필터 하우징과 상청액 수집 용기, 예를 들어, 수거 용기 사이의 흐름 경로) 및 상기 시설 내에서 사용된 정방향 프로세싱 작업 패턴 (예를 들어, 정제 프로세스가 개시되기 전에 상청액을 보유하는 지속 기간)에 대해 특이적일 수 있다. 본 실시예에서는 기재된 헤드 스페이스 압력이 사용되지는 않지만, 용기가 대기압보다 더 높은 헤드 스페이스 압력으로 작동될 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 파라미터는 또한, 배양물 중 용존 산소를 100% 이상 공기 포화도로 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 배양물은 생물반응기 내의 높은 압력 환경을 벗어날 때 탈기될 것이고 배양물의 DOT는 새로운 압력으로 평형을 이루기 위해 감소될 것으로 예상된다.
도 7b는 세포 배양물의 정화를 위하여 일회용 POD 심층 필터를 사용하여 50 L 일회용 생물반응기로부터의 그의 수거 동안 생산 배양물 중에서의 주요 프로세스 파라미터의 예를 도시한다. 이러한 경우에는, 생산 배양물에 적용된 바와 동일한 진탕 (혼합)을 이용하여 생산 배양물을 혼합하였다. 그러나 통기 속도는 수거에 대비하여 냉각되기 직전에 생산 배양물에 필요한 바와 유사한 산소 질량 전달 계수 kLa (h- 1)를 달성하기 위해 조정되었다. 스파징된 기체 중 산소의 조성은 또한, ~200% 공기 포화도의 최대 배양물 DOT를 달성하도록 증가되었다 (본 실시예에서는 40% 농축으로 증가됨).
수거하는 동안 생산 배양물 산소공급의 부가의 특징은 수거가 진행되기 전에 배양물이 높은 DOT로 유지되는 지속 기간에 의해 정의될 수 있다. 이는 수거를 위한 표적 온도에 도달하는 <1 h 이내로서 정의될 수 있거나 또는 수거를 위한 표적 온도에 도달하는 24 h 이하일 수 있다.
실시예
7: 생물반응기 특징
1000 L cGMP 생산 배양물의 수거 동안, 스파징된 공기 및 산소 유속은 작업의 규모, 본 경우에는 1000 L SUB에 좌우된다. 수거 작업의 성능에 관한 고찰 시, 생산 배양물의 용존 산소 장력 (DOT)은 ~400 L 배양물이 여전히 SUB에 남아있는 수거의 나중 시기 동안 감소하기 시작하였다. DOT 감소 속도의 외삽법은 배양물 DOT가 5분 기간 이내에 저산소상태 수준 (0% 공기 포화도 하의 DOT)으로 떨어진다는 것을 암시할 것이다. 이어서, 저산소상태 배양물은 추가의 산소공급이 불가능할 때 심층 필터 하우징으로 유입된다. 따라서, 필터 하우징으로 유입되는 세포 배양물 및 필터 정화의 초기 시기로부터 이전에 보유된 세포는 무산소상태가 될 것으로 예상된다. 이러한 세포 배양 프로세스와 산물에 대해서는, 수거 동안 저산소상태가 발생하면 비-환원성 SDS 전기영동 검정에 의하여, 단백질 A를 사용한 제1 크로마토그래피 단계 후에 분석될 때 '해리된' 것으로 보이는 산물이 유발될 수 있다는 증거가 있다 (도 4 참조).
기초가 되는 메카니즘은 수거 작업 동안 정화 필터에서 발생하는 세포 손상으로부터 세포성 인자가 방출되는 것으로 여겨지며, 이는 산물 서브유닛 (IgG 중쇄 및 경쇄)을 함께 유지 및 폴딩하는 디술피드 결합의 환원을 촉매한다. 이들 방출된 세포성 인자는 전형적으로, 그의 환원적 상태에서 활성이다 (그리고 산물에 대해 잠재적으로 손상을 입힌다). 그러나, 생물반응기에서 적정한 스파징 속도로 수거되는 동안 생산 배양물의 지속적인 산소공급을 통하여, 충분한 산소가 심층 필터로 운반되어 지고 정화된 상청액 내로 운반될 필요가 있게 된다. 정화된 상청액에 의해 운반되는 용존 산소는 세포성 인자가 그의 환원된 활성 상태로 활성화되는 것을 방지시키고, 이에 의해 단백질 디술피드 결합의 촉매적으로 구동된 해리 반응을 피하게 해준다. 그러나 현재에는, 일단 배양물의 작동 수준이 생물반응기 내의 DOT 센서 아래로 떨어지면 배양물의 DOT를 검출하는 직접적인 방법이 없고, 배양물이 POD 필터 하우징에 상주하는 동안 또는 정화된 상청액이 백에 수집될 때 이러한 배양물의 DOT를 검출하는 직접적인 방법이 없다. 이러한 제한으로 인해, 배양물이 수거 동안 감소되는 DOT 추세를 결코 나타내지 않는다는 것을 보장하기 위해 스파징된 공기 및 산소 기체가 연속적인 흐름으로 적용되는 대리 접근법이 적용되는데, 이는 배양물 세포성 산소 흡수 속도가 산소를 세포 배양물 내로 전달할 수 있는 생물반응기의 능력보다 더 크다는 것을 표시하고, 배양물 내로의 산소 전달과 배양물로부터의 용존 산소 손실 (감소되는 DOT 추세로서 표시됨)에 있어서의 이와 같은 불균형이 지속된다면, 세포성 인자의 활성화를 방지하기에 불충분한 산소가 정화된 상청액에서 이용 가능할 것이며, 산물 해리가 뒤따라 발생할 것이다.
따라서, 더 낮은 유속으로 고정되었던 스파징된 공기 및 산소 유속이 증가되는 것으로 제안된다. 변경된 스파징 조건 하에서 스파징 기체의 산소 조성 및 용적 유속은 배양물을 더 높은 DOT 공기 포화도로 포화시킬 수 있다. 부가적으로 총 용적 스파징 기체 유속 (공기 및 산소의 조합 흐름)은 생산 배양물에 의해 요구된 것과 등가의 증가된 산소 질량 전달 계수 kLa를 전달하여, 수거를 위한 제조에서 생산 배양물을 추가 냉각시키기 직전에 적어도 40% 공기 포화도의 프로세스 설정 값으로 배양물 DOT를 유지한다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 일상적인 실험을 이용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
본 발명이 열거된 청구항 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 절, 및 기술적 용어가 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변동, 조합 및 순열을 포괄한다. 요소들이 목록으로서, 예를 들어 마쿠쉬(Markush) 군 형식으로서 또는 특정 대안으로서 제시되는 경우에는, 이러한 요소들의 각각의 하위군이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)가 이러한 군으로부터 제거될 수 있다.
일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특별한 요소 및/또는 특징을 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 본 발명의 특정 실시양태 또는 본 발명의 측면은 이러한 요소 및/또는 특징으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방되도록 의도되었으며, 부가적인 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 것을 인지해야 한다. 범위가 제공되는 경우에는, 종말점이 포함된다. 더욱이, 달리 표시되지 않거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 맥락 및 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 값은 본 발명의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 구체적 값 또는 하위 범위을, 문맥상 달리 명확하게 표시되지 않는 한 그러한 범위의 하한치 단위의 1/10까지로 추정할 수 있다.
Claims (95)
- 재조합 숙주 세포에서 발현된, 안정화된 단백질을 생산하는 방법이며,
a) 배양 단계의 시작에서부터 세포의 수거 시간까지 생산 배양물의 평균 산화환원 전위를 유지하는 조건 하에 세포를 배양하고, 여기서 생산 배양물의 평균 산화환원 전위의 감소는 50 mV를 초과하지 않는 것이고,
b) 안정화된 단백질을 포함하는 세포를 수거하는 것
을 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 생산 배양물로부터의 세포의 분리 동안 40% 초과 내지 500% 미만 공기 포화도의 범위 내의 용존 산소 장력 (DOT)을 확립하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 생산 배양물 중에 또는 그에 전이 금속을 제공하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 전이 금속 이온은 Zn2+, Mn4+, Cu2+, Fe3+, Co2+, Cr3+, 및/또는 Ni2+로부터 선택되는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 활성인 경우에 스파징된 질소 기체 흐름을 억제하는 것, 활성인 경우에 요구에 따라 알칼리 제어를 억제하는 것, 활성인 경우에 요구에 따라 CO2 기체 흐름 제어를 억제하는 것, 활성인 경우에 공급물 부가를 억제하는 것, 활성이 아닌 경우에 헤드 스페이스 압력을 활성화시키는 것, 및 활성이 아닌 경우에 공기/O2의 헤드 스페이스 흐름을 활성화시키는 것로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용에 의해 DOT가 추가로 유지되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양 동안 10% 내지 100% 공기 포화도의 산소공급 수준을 유지하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 산소공급 수준이 40% 내지 70% 공기 포화도인 방법.
- 제3항에 있어서, 전이 금속이 Zn2+, Mn4+ 및 Cu2+이고, Zn2+이 200 내지 400 μM의 농도로 존재하고, Mn4+이 10 내지 100 μM의 농도로 존재하고, Cu2+가 10 내지 100 μM의 농도로 존재하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 생물반응기에서 배양되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 생물반응기가 수거 용기와 작동적으로 커플링되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 생물반응기와 수거 용기 사이의 흐름 경로가 DOT 및 산화환원 센서/프로브의 설치를 포함하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, DOT 및 산화환원 센서/프로브로부터의 출력이 스파징 속도, 헤드 스페이스, 및 수거에 앞서 생물반응기 생산 배양물 내로의 공급물 또는 보충물 부가에 있어서의 변화를 실시하기 위해 피드백 제어로서 사용되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 HeLa, HEK293, HT1080, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (새끼 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS, COS1, COS7, QC1-3, CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, 및 CHOZN, 또는 그로부터 유래된 임의의 세포인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 의해 생산된 안정화된 단백질.
- 제13항의 안정화된 단백질을 포함하는 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 방법을 사용하여 안정화된 단백질을 생산할 수 있는 생물반응기.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 세포의 산화환원 전위를 모니터링하여 모니터링된 산화환원 전위를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 모니터링된 산화환원 전위가 생산 배양물의 용존 산소 장력을 변형하는데 피드백으로서 사용되는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 생산 배양물의 용존 산소 장력이:
a) 모니터링된 산화환원 전위가 특이적 값 아래로 떨어지면 증가하거나; 또는
b) 모니터링된 산화환원 전위가 특이적 값 위로 상승하면 감소하는 것인
방법. - 제17항에 있어서, 생산 배양물의 용존 산소 장력이:
a) 모니터링된 산화환원 전위가 -300mV 아래로 떨어지면 증가하거나; 또는
b) 모니터링된 산화환원 전위가 -50mV 위로 상승하면 감소하는 것인
방법. - 제1항에 있어서, 온도가 생산 배양물 중의 온도와 비교하여 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안 감소하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 생산 배양물 및 상청액 수집물로부터의 세포의 분리 동안의 온도가 12 ℃ 내지 18 ℃인 방법.
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